JP5800149B2 - 標的細胞の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、標的細胞の検出方法に関する。

血液、骨髄液、リンパ液などの細胞分散液である体液に含まれる細胞を検査して、該細胞分散液中に存在する可能性のある特定疾患に関連する細胞等の特定の細胞群をスクリーニングする検査が広く行われている。このようなスクリーニングの一種として、検査対象である細胞がその表面にマーカーとなる特定の分子（細胞表面マーカー、細胞表面抗原又はＣＤ抗原と呼ばれることがある。）を有していることを利用し、これら細胞表面マーカーを有する細胞群を検出する方法である、フローサイトメトリーその他の方法が知られている（特開２００８−１８７９３２号公報、特表２００８−５３８６０９号公報）。そして、細胞分散液が体液である場合などには、これらの解析結果は、たとえば、病気の診断などのためのデータとして利用されている。本明細書において、検査対象である細胞分散液に含まれる特定の細胞表面マーカーを有する細胞を「標的細胞」という。

フローサイトメトリーで用いられる装置は、フローサイトメーターと呼ばれる。フローサイトメーターは、検査対象となる細胞の細胞表面マーカーを、蛍光標識モノクローナル抗体（蛍光抗体法）や、酵素標識モノクローナル抗体（酵素抗体法）などの標識分子や、標識分子を結合した蛍光粒子や無機半導体の蛍光ナノ粒子（特開２００４−０７７３８９号公報）で標識し、該標識を利用して標的細胞を鑑別できる装置である。これらの標識されたモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＭｏＡｂ）は、リンパ系、単球系、骨髄系、巨核球系などの細胞の識別に利用されることができ、それらの細胞の分化や機能の解析を可能にすることができる。フローサイトメーターによれば、客観的かつ確定的に細胞分散液を特徴付けることができる。そのため、得られた結果は、医師等による病気の診断のためのより確実なデータとして利用することができる。

しかし、フローサイトメトリーは、用いるフローサイトメーターが血球計数装置に比較して高価であり、試薬として用いる標識モノクローナル抗体も未だ高価である。そのため、フローサイトメーターは、専門の検査機関に設置されることが多く、病院、医院などへの導入例は未だ少ない。よって現状では、フローサイトメトリーは、検査会社等の専門的な機関への委託によって行われ、結果を得るまでに時間がかかり、医師等による病気の診断のためのデータを迅速に提供するためには未だ不十分な状況となっている。

また、特開２００８−１８７９３２号公報に記載の、基板やプレート等に抗体を固定し、これに細胞を吸着させる方法は、標的細胞の分離や、標的細胞の有無の確認ができるにとどまり、この方法によって標的細胞の多寡や他の細胞に対する比率を求めるには、基板等に固定された抗体と標的細胞とを高い確率で接触させる必要があり、また標的細胞の計数も容易でないことが多い。

一方、臨床検査の目的に多用されている血液検査装置の中には、白血球を顆粒球、リンパ球及び単球の３分類又は好酸球、好中球、好塩基球、リンパ球及び単球の５分類に分類する血液検査装置（それぞれ、「白血球３分類血液検査装置」、「白血球５分類血液検査装置」ということがある。）に分類して各細胞数の比率を測定することができる装置がある。これらの装置は、試料にレーザー光を照射して前方散乱強度、側方散乱強度等の散乱光等を検出する機構を備えており、細胞の大きさ、細胞の内部構造を反映した情報を、血球数の計数と同時に得ることができる。この装置によれば、たとえば、白血球の種類ごとの存在比率を求めることなどができる。このような装置を用いることにより、たとえば、白血病において５種類の白血球の存在比率が異常になったり、未成熟な白血球（幼若型白血球）が出現したりする異常を検出することができるが、装置の性能に依るところが大きく、現状、必ずしもこれらの装置の測定結果のみによって血液試料を十分に特徴付けることができないとされている。

このような理由により、検査対象である細胞分散液に含まれる特定の細胞表面マーカーを有する細胞に関する各種情報を、簡易にかつ高精度で測定することにより標的細胞を検出する方法が求められていた。

本発明の目的は、簡易で精度の高い標的細胞の検出方法を提供することにある。本発明の方法によれば、フローサイトメトリーを用いなくても標的細胞の検出と標的細胞を構成する細胞群の大きさ等の分析が容易であり、臨床検査等における血液その他の細胞分散液の検査に有用である。

本発明は、上述の課題を解決するために為されたものであり、以下の態様または適用例として実現することができる。

（適用例１）
本発明にかかる標的細胞の検出方法の一態様は、
細胞表面に存在する特定の分子に特異的に結合する物質が固定された粒子（以下、「標識粒子」という。）及び検査対象である細胞を含む分散液について、光学的又は電磁的方法による測定（以下、「検査測定」という。）を行って測定結果１を得る工程、
前記標識粒子を含まず、前記検査対象である細胞を含む分散液について、前記検査測定と同一の測定を行って測定結果２を得る工程、及び
前記測定結果１と前記測定結果２とを比較する工程、を有する。

（適用例２）
適用例１において、
前記検査測定が、蛍光測定を含まない、標的細胞の検出方法。

（適用例３）
適用例１または適用例２において、
前記検査測定が、散乱光の測定を含む、標的細胞の検出方法。

（適用例４）
適用例１ないし適用例３のいずれか一例において、
前記検査測定が、電磁的方法による細胞数と細胞の大きさの測定を含む、標的細胞の検出方法。

（適用例５）
適用例１ないし適用例４のいずれか一例において、
前記標識粒子が、極性基を有する、標的細胞の検出方法。

（適用例６）
適用例５において、
前記極性基が、水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アルキレンオキシド基、ケト基、および、置換または非置換のアミノ基から選ばれる少なくとも一つの基である、標的細胞の検出方法。

（適用例７）
適用例１ないし適用例６のいずれか一例において、
前記検査測定が、各標的細胞と標識粒子の結合量を測定し、該結合量に対する標的細胞数の分布を求める工程を含む、標的細胞の検出方法。

（適用例８）
適用例１ないし適用例７のいずれか一例において、
前記検査測定を複数の測定項目について行う、標的細胞の検出方法。

（適用例９）
適用例１ないし適用例８のいずれか一例において、
前記細胞分散液が体液を含む、標的細胞の検出方法。

（適用例１０）
適用例１ないし適用例９のいずれか一例において、
前記検査対象である細胞は、白血球を含む血液細胞であり、
前記検査測定は、白血球を顆粒球、リンパ球及び単球の３分類又は好酸球、好中球、好塩基球、リンパ球及び単球の５分類に分類する血液検査装置を用いて行われる、標的細胞の検出方法。

（適用例１１）
適用例１ないし適用例１０のいずれか一例において、
前記標識粒子は、第１の抗原に対して特異的に結合する物質が固定された標識粒子１と第１の抗原とは異なる第２の抗原に対して特異的に結合する物質が固定された標識粒子２とを含んでなる、標的細胞の検出方法。

本発明にかかる方法によれば、標的細胞の検出や標的細胞を構成する細胞群の大きさ等の分析を簡便かつ迅速に行うことができる。これにより、細胞分散液が血液等である場合には、各種の疾患を診断するためのデータを簡便かつ迅速に提供することができる。また、本発明にかかる標的細胞の検出方法によれば、従来はフローサイトメトリーを用いて行っていた測定を、白血球５分類血液検査装置または白血球３分類血液検査装置等を用いて行うことができ、より簡便に細胞分散液中の標的細胞の解析を行うことができる。

図１は、血液の解析工程の一例を示す散布図である。 図２は、実施例の細胞解析方法の解析工程の一例を示す散布図である。

以下に本発明の好適な実施形態のいくつかについて説明する。なお、本発明は、下記の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において実施される各種の変形例も含む。

１． 標的細胞の検出方法
本発明にかかる標的細胞の検出方法は、細胞表面に存在する特定の分子に特異的に結合する物質が固定された粒子（以下、「標識粒子」という。）及び検査対象である細胞を含む分散液について光学的又は電磁的方法による測定（以下、「検査測定」という。）を行って測定結果１を得る工程１、標識粒子を含まず、前記検査対象である細胞を含む分散液について工程１と同一の検査測定を行って測定結果２を得る工程２、及び測定結果１と測定結果２を比較する工程３を有する。

１．１． 細胞分散液及びその調製方法
本実施形態で準備される細胞分散液は、液体中に少なくとも標的細胞が分散（懸濁）されているものであるかぎり限定されない。このような細胞分散液としては、たとえば、人間等の動物の体液、すなわち、血液、リンパ液、組織液、体腔液などを挙げることができる。また、体液を等張緩衝液等の適当な分散媒で希釈して調製した細胞分散液を調製しても良い。また、本実施形態にかかる細胞分散液としては、生体由来のものに限定されず、試験、研究等のために人工的に細胞を分散させて調製された各種の細胞の分散体であってもよい。また、細胞の分散媒についても限定されず、典型的には水、血しょう等であり、グリセリン、アルコールなどの有機溶剤であってもよい。さらに、溶質として、食塩、緩衝剤、その他の薬剤が含まれていてもよい。

本実施形態の標的細胞の具体例としては、白血球、赤血球、血小板、人工的な細胞（遺伝子操作された細胞など）や、がん細胞など、表面に抗原を有する細胞などを挙げることができる。標的細胞が有する細胞表面マーカーとしては、タンパク質、糖鎖、複合糖質、および脂質の少なくとも一種が挙げられる。また、１つの標的細胞は、複数種の細胞表面マーカーを有していてもよい。細胞表面マーカーの種類については、特に制限はなく、たとえば、タンパク質としては、各種の受容体（レセプター）、ＣＤ抗原（国際的クラスターＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）表示に基づく）などが挙げられる。また、糖鎖としては、たとえば糖タンパク質系糖鎖、糖脂質系糖鎖、グリコサミノグリカン系糖鎖、および多糖類由来オリゴ糖鎖の少なくとも一種が挙げられる。また、複合糖質としては、糖鎖を持つ生体内高分子を挙げることができる。たとえば、複合糖質としては、糖タンパク質（糖ペプチドも含む）、プロテオグリカン、および糖脂質の少なくとも一種が挙げられる。

細胞分散液には、標的細胞と標的細胞以外の他の細胞のいずれが含まれてもよい。この場合、たとえば、細胞分散液が血液である場合であって、白血球が標的細胞である場合には、赤血球や血小板が他の細胞に該当する。また、同様に、細胞分散液が血液である場合であって、赤血球が標的細胞である場合には、白血球や血小板が他の細胞に該当する。特定の疾患を検査する場合に、例えばその疾患の原因であるウイルスに感染したことにより特定の細胞表面マーカーを有する細胞が標的細胞である場合には、そのウイルスに感染した細胞が含まれていない正常細胞の検体については標的細胞を含んでいない場合がある。

細胞分散液中に分散される細胞の濃度は、特に限定されない。細胞分散液中に分散される細胞の濃度は、たとえば、細胞分散液が血液であって、標的細胞が白血球である場合には、１０００（個／μｌ）以上、２００００（個／μｌ）以下とすることが好ましい。このため、血液その他の体液を必要に応じて希釈して用いることができる。また、人工的に細胞分散液を作成する場合には、細胞分散液中に分散される標的細胞の濃度は、たとえば、１０（個／μｌ）以上、１×１０^７（個／μｌ）以下程度とすることができる。

１．２． 標識粒子及びその調製方法
本発明で用いられる標識粒子は、以下に説明するベース粒子に、細胞表面に存在する特定の分子に特異的に結合する物質を固定して調製される。

１．２．１． ベース粒子
ベース粒子の形状は、特に限定されない。たとえば、ベース粒子の形状は、球、回転楕円体、円柱等の形状、および不定形の形状であることができる。また、粒子全体として、形状が揃っている必要はなく、また例示した形状の粒子の混合物であってもよい。これらのうち、球状のポリマー粒子は、たとえば、エマルション重合等によって製造することができるため、製造を容易化することができる。また、粒子の形状を揃えることにより、たとえば、レーザー照射による散乱光に特徴を付与すること、および光学的な観察による粒子の特定を容易化すること、などの機能を付与することができる。

ベース粒子の大きさは、数平均粒子径として、０．０４〜１０μｍであることが好ましく、０．５〜１０μｍであることがさらに好ましく、１〜５μｍであることが特に好ましい。数平均粒子径（直径）が０．０４μｍ未満では、該粒子を標的細胞に吸着させた際に、前記測定結果を明確に変化させることが出来ない場合がある。また細胞分散液が血液であって、白血球が標的細胞である場合は、数平均粒子径が１０μｍを超えると、該粒子は、標的細胞の大きさと同等以上の大きさとなるため、標的細胞に吸着していない該粒子と標的細胞との区別を付けにくくなること、および標的細胞に吸着した場合は、前記測定結果が、過剰に変化して、測定工程における情報の取得に支障を来たす場合がある。また、数平均粒子径が０．５μｍ以上である場合には、光散乱法による検査測定が容易になる。

数平均粒子径は、光散乱法若しくは光遮断法によりポリスチレン粒子換算の数平均粒子径として求めるか、又は電子顕微鏡法により求める。これらの測定方法のいずれを用いてもよく、いずれかの測定方法で求めた数平均粒子径が上記範囲にあれば本発明に好適に用いることができる。測定精度との関係からは、粒子径が０．０４〜１μｍ程度の場合には光散乱法が好ましく、粒子径が１〜５μｍ程度の場合には光遮断法が好ましく、５μｍ程度以上の場合には、電子顕微鏡法が好ましい。

ベース粒子の材質としては、特に限定されるものではないが、有機粒子や無機粒子を挙げることができる。有機粒子としては、たとえば、ポリスチレン、ポリ乳酸、アクリル、ポリエチレンイミン、アガロース、イミノ二酢酸キレート、磁性ラテックス、磁性ポリ乳酸、磁性デキストラン、磁性キトサン、磁性アガロース、磁性ポリエチレンイミン等が挙げられる。無機粒子としては、たとえば、シリカ、磁性シリカ、酸化鉄、無機半導体粒子等が挙げられる。また、ベース粒子は、異なる材質の粒子を混合したものであってもよく、具体的には、１種若しくは２種以上の有機粒子若しくは無機粒子、又は有機粒子と無機粒子を併用してもよい。

また、ベース粒子は、極性基を有していることが好ましく、さらに好ましくは粒子表面に極性基を有していることが好ましい。ここで、極性基としては、水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アルキレンオキシド基、ケト基、置換または非置換のアミノ基から選ばれる少なくとも一種の基であることが好ましい。粒子表面に極性基を導入することで粒子が親水性になり、細胞分散液中の細胞の非特異的な吸着を抑制することができ、測定結果の信頼性を向上させることができる。

このような親水性の基を有するベース粒子は、親水性の基を有するモノマー（親水性モノマー）を原料の一部としてエマルジョン重合する方法、粒子を親水性モノマーを含有するモノマー部で被覆し該モノマー部を重合する方法等により調製することができる。

親水性モノマーとしては、例えば、グリセロールアクリレート、グリセロールメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、メトキシエチルアクリレート、メトキシエチルメタクリレート、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールモノメタクリレートなどの親水性官能基を有する（メタ）アクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−メチロールメタクリルアミド、ダイアセトンアクリルアミド、アリルグリシジルエーテル、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレートなどを例示することができる。なお、グリシジルアクリレート、グリシジルメタクリレートなどのエポキシ基を有するモノマーを重合すると加水分解されて極性基である水酸基を生成するため、これらのモノマーも好適に用いることができる。

ベース粒子は、赤、青、緑等の、可視光領域における色を呈するように着色されていてもよい。着色することにより、たとえば、粒子を光学顕微鏡で観察する際の視認性を高めることができる。これにより、細胞分散液中の標的細胞（粒子が結合された細胞）の数が少ない場合などに、顕微鏡による標的細胞の検索を容易化することができる。

１．２．２． 細胞表面に存在する特定の分子に特異的に結合する物質
細胞表面に存在する特定の分子に特異的に結合する物質としては、特に限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などの抗体その他のタンパク質分子またはその集合体、および抗体のＦａｂ’フラグメントその他のポリヌクレオチド等が挙げられる。また、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤなどのサブクラスを有するが、いずれであってもよい。

細胞表面マーカーがＣＤ抗原である場合には、そのＣＤ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体（抗ＣＤ抗原抗体）が固定されることが好ましい。抗ＣＤ抗原抗体の具体例としては、抗ＣＤ３抗原抗体（ＣＤ３抗体と略記することがある）、抗ＣＤ４抗原抗体（ＣＤ４抗体と略記することがある）、抗ＣＤ８抗原抗体（ＣＤ８抗体と略記することがある）などを例示することができる。これらの抗ヒトＣＤ抗原モノクローナル抗体が抗ヒトＣＤ抗原モノクローナル抗体である場合には、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジなどを用いて好適に調製することができる。

１．２．３． 標識粒子の調製方法
ベース粒子に上記細胞表面に存在する特定の分子に特異的に結合する物質を固定する方法としては、特に限定されず、吸着等によって物理的に固定する方法、および、共有結合、水素結合等によって化学的に固定する方法などが挙げられる。さらに、ベース粒子に上記抗体等の物質を固定する方法としては、ベース粒子に直接、上記抗体等の物質を固定する方法（以下、直接法と称することがある）、およびベース粒子と上記抗体等の物質との間に他の物質を介在させて固定する方法（以下、間接法と称することがある）を挙げることができる。

たとえば、ベース粒子に抗体を直接に固定する方法としては、粒子表面の官能基に抗体のＦｃ部位をカップリング剤によって共有結合させる方法などが挙げられる。カップリング剤としては、たとえば、ＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）などのカルボジイミド類等を用いることができる。カップリング剤としてＥＤＣを用いると、カルボジイミドカップリング反応によって、ベース粒子に共有結合によって抗体を直接固定することができる。また、このとき、ブロッキング剤を併用してもよい。ブロッキング剤としては、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ゼラチン、スキムミルク、卵白アルブミンなどを用いることができる。

ベース粒子に、抗体を直接結合させる場合の抗体の量は、ベース粒子の重量に対して、０．１〜１００μｇ／ｍｇ粒子であることが好ましい。

一方、ベース粒子に間接的に抗体を固定する方法としては、ベース粒子に二次抗体を介して一次抗体を結合させる方法が挙げられる。この場合、細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体が一次抗体であり、一次抗体に対して特異的に結合する抗体が二次抗体である。他の間接法としては、ベース粒子にプロテインＧ、プロテインＡなどのＩｇＧのＦｃ部位に対して特異的に結合する性質を有するタンパク質またはその誘導体を結合させて、このタンパク質またはその誘導体に、細胞表面マーカーに特異的に結合する抗体を結合させる方法などが挙げられる。

前記一次抗体と二次抗体を用いる方法の場合、二次抗体には、一次抗体の免疫グロブリンが由来する動物種に対応する抗体が選択されることが好ましい。たとえば、一次抗体が、抗ヒトＣＤ抗原モノクローナル抗体であって、これがマウス由来である場合（以下これを抗ヒトＣＤ抗原マウス抗体と称することがある）には、二次抗体は、抗マウス免疫グロブリン抗体（抗マウスＩｇＧ抗体等）を選択することが好ましい。より具体的には、たとえば、一次抗体が抗ヒトＣＤ抗原マウスＩｇＧ抗体である場合、二次抗体は、抗マウスＩｇＧ抗体を選択することが好ましい。この場合の抗マウスＩｇＧ抗体の由来動物種は、ラット、ウサギ、ヒツジなどとすることが好ましい。

二次抗体として、ベース粒子に、抗マウスＩｇＧ抗体を結合させる場合の抗マウスＩｇＧ抗体の量は、ベース粒子の重量に対して、０．１〜１０μｇ／ｍｇ粒子であることが好ましい。粒子に、プロテインＡまたはプロテインＧを結合させる場合の量は、ベース粒子の重量に対して、０．１〜１００μｇ／ｍｇ粒子であることが好ましい。そしてこれらの場合において、一次抗体の量は、粒子の重量に対して、０．１〜１００μｇ／ｍｇ粒子であることが好ましい。

また、一次抗体を、ベース粒子にプロテインＧまたはプロテインＡを介して高率に結合させた後、非特異的な吸着を抑制させるために、抗マウスＩｇＧ抗体等をマスキング剤として、プロテインＧまたはプロテインＡに結合させることができる。この場合の抗マウスＩｇＧ抗原抗体等の量は、粒子の粒子径やプロテインＡ、プロテインＧの結合量にも依存するが、０．１〜１００μｇ／ｍｇ粒子であることが好ましい。

標識粒子は、生理食塩水、緩衝液（ホウ酸バッファー、ＥＤＴＡバッファー、トリスバッファー、リン酸バッファーなど）等の分散媒に分散して使用される。

１．３． 工程１
工程１は、標識粒子及び検査対象である細胞を含む分散液について検査測定を行って測定結果を得る工程である。工程１で得られる測定結果を測定結果１という。細胞分散液の中に標的細胞が存在していた場合には、標識粒子と標的細胞が抗原抗体反応等により特異的に結合する。一方、標識粒子と標的細胞以外の細胞は特異的に結合することはできない。このため、工程１において、標的細胞だけが１個又は２個以上の標識粒子と結合することになる。

１．３．１． 細胞等の分散液
本工程で用いられる分散液中における標識粒子の配合量は、細胞分散液の種類にもよるが、１×１０^２個／μｌ〜９×１０^１０個／μｌであることが好ましい。細胞分散液が血液であって標的細胞が特定の細胞表面マーカーを有する白血球である場合には、標識粒子濃度が１×１０^２個／μｌ未満であると、一般的な血液の白血球数の十分の一レベルになり、十分なインキュベーション時間を与えても、標的細胞に粒子が結合する確率が非常に小さくなってしまうことがある。また細胞分散液が血液であって標的細胞が特定の細胞表面マーカーを有する白血球である場合、粒子濃度が９×１０^１０個／μｌを超えると、粒子数が白血球数に比べ大過剰となり、標的細胞に結合していない粒子が細胞分散液に大量に存在することになるため、検査測定が阻害されて標的細胞の正確な測定が実施できなくなる場合がある。また、たとえば、細胞分散液が血液である場合であって、標識粒子が１ｇ／ｌ程度の濃度で分散された分散体として供給される場合には、血液１００μｌに対して、１０μｌ程度の粒子分散体を添加することが好ましい。

なお、着色された標識粒子を使用する場合には、異なる色の粒子ごとに、種類の異なる抗体等を該標識粒子にそれぞれ固定することができる。このようにすれば、標的細胞を異なる色の標識粒子によって多重に修飾することができ、標的細胞が有する抗原を、たとえば、光学顕微鏡による観察すること、または分光的な測定を行うことによって、容易に識別することができるようになる。これにより、標的細胞の鑑別をより容易に行うことができる。

また、たとえば、表面に複数種の細胞表面マーカーを有する標的細胞を含む細胞分散液の場合、複数種の細胞表面マーカーのうちの第１の細胞表面マーカーに特異的に結合する第１の物質が固定された第１の標識粒子を添加すること、および、複数種の細胞表面マーカーのうちの第２の細胞表面マーカーに特異的に結合する第２の物質が固定された第２の標識粒子を添加することができる。これにより、各細胞表面マーカー毎に検査測定を行うことができる。

１．３．２． 検査測定
検査測定は、細胞分散液を光学的又は電磁的な方法等により行う測定である。ここで電磁的方法とは、電子的方法、磁気的方法その他の人の知覚によって認識することができない方法をいう。検査測定の具体的方法としては、例えば、光散乱法、光遮断法、蛍光法等の光学的方法、下記のベックマン・コールター社の呼称であるいわゆるコールター原理等による電磁気的方法等による細胞数と細胞の大きさの測定が挙げられる。これらのうち、蛍光法以外の光学的方法や電磁気的方法またはこれらの組合せが好ましく、蛍光法以外の光学的方法としては、光散乱法が好ましい。蛍光法を用いた場合には、蛍光を発することのできる標識粒子を用いる必要があり、また、フローサイトメトリー等の方法が必要となるため、設備と試薬が高価となる等の問題を生じるためである。

検査測定の方法は、１種類の検査測定方法を用いてもよいし、複数の検査測定項目について行うこともできる。複数の検査測定項目について検査測定を行った場合、得られた測定結果を組み合わせて用いることもできる。例えば、光散乱法等により細胞の大きさを測定すると共に、細胞の個数を測定した場合、細胞の大きさと細胞の個数の相関関係を知ることができるため、より多くの情報を得ることができる。あるいは、各標的細胞と標識粒子の結合量を測定し、該結合量に対する標的細胞数の分布を求める方法で行ってもよい。

光散乱法としては、前方散乱光強度測定法、側方散乱光強度測定法が挙げられる。

（１）前方散乱光強度測定法
前方散乱光は、レーザー光が細胞に当たって周囲に散乱した光のうち、レーザー光軸に対して前方に散乱される光である。前方散乱光の強度は細胞の投影面積に比例する。すなわち、大きな細胞に対してレーザー光を照射した場合は大きな前方散乱光強度が得られ、小さな細胞に対しては小さな前方散乱光強度が得られる。そのため、前方散乱光強度の測定によって、細胞のサイズなどを見積もることができる。

標的細胞に標識粒子が結合した場合、前方散乱光強度は、修飾前の標的細胞の前方散乱光強度よりも大きくなる場合がある。そのため、前方散乱光強度の測定からは、修飾された標的細胞は、修飾前の標的細胞よりも見かけ上の大きさが大きくなったように観測される。すなわち、前方散乱光強度の測定により、標的細胞の見かけの大きさを見積もることができる。これにより、標的細胞への標識粒子の結合の有無や結合数などを評価することができる。

また、前方散乱光のうち、レーザー光軸に対して、より広角の方向に散乱される光を測定することもできる。前方散乱光の広角側の強度は、たとえば、細胞の内部の顆粒の有無および顆粒の数、細胞内の密度などの情報を含んでいる。広角散乱光強度が大きければ細胞の内部構造は複雑であり、広角散乱光強度が小さければ細胞の内部構造は単純である傾向がある。そのため、広角散乱光強度の測定によって、細胞内の顆粒の有無および多寡、細胞内の密度や構造の情報を見積もることができる。

前方散乱光強度の測定で白血球の解析を行う場合には、標識粒子の数平均粒子径は、２〜５μｍであることがより好ましい。

（２）側方散乱光強度測定法
側方散乱光は、レーザー光が細胞に当たって周囲に散乱した光のうち、レーザー光軸に対して直交する方向に散乱される光である。側方散乱光の強度は、細胞よりも小さいスケールの散乱体の存在により変化する。そのため、側方散乱光は、前方散乱光の広角側の光と同様に、たとえば、細胞の内部の核の分葉度などの情報を含んでいる。すなわち、側方散乱光強度が大きければ細胞の内部構造は複雑であり、側方散乱光強度が小さければ細胞の内部構造は単純である傾向がある。そのため、通常は側方散乱光強度の測定によって、分葉度の小さい幼弱な細胞の有無および多寡の情報を見積もることができる。

標的細胞に標識粒子が結合した場合、側方散乱光強度は、修飾前の標的細胞の側方散乱光強度よりも大きくなる場合がある。そのため、側方散乱光強度の測定からは、修飾された標的細胞の、修飾前の標的細胞に対する相対的な、細胞内の構造の変化が観測される。すなわち、側方散乱光強度の測定により、標的細胞の見かけ上の細胞内の核の分葉度等の構造を見積もることができる。これにより、標的細胞への標識粒子の結合の有無、結合数、細胞内の構造の複雑さなどを評価することができる。

側方散乱光強度の測定で解析を行う場合には、標識粒子の数平均粒子径は、３００ｎｍ〜５μｍであることがより好ましい。

（３）側方蛍光強度測定法
側方蛍光は、レーザー光が細胞の蛍光物質に当たって周囲に発せられた蛍光のうち、レーザー光軸に対して直交する方向に現れる蛍光である。側方蛍光の強度は、細胞に含まれるまたは細胞に結合した蛍光物質の量によって変化する。側方蛍光強度は、たとえば、以下のようにして測定することができる。

細胞内のＤＮＡやＲＮＡに特異的に結合する蛍光物質で細胞成分を染色すると、染色された細胞がレーザー光を吸収することにより、蛍光物質が蛍光を発する。この場合は、側方蛍光強度は、蛍光物質で染色されたＤＮＡまたはＲＮＡの量に依存するため、細胞に含まれるＤＮＡやＲＮＡの量の情報を含んでいる。

標的細胞の表面に蛍光物質を含む標的粒子を結合させた場合は、修飾された標識細胞にレーザー光を照射することにより、蛍光物質が蛍光を発する。この場合は、側方蛍光強度は、標的細胞に結合した標識粒子の量の情報を含んでいる。

蛍光物質としては、たとえば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、およびアクリジンオレンジ等を使用することができ、複数の蛍光物質を併用することもできる。粒子に蛍光物質を付与する方法としては、たとえば、粒子の表面に蛍光物質を結合させる方法、粒子の合成時にモノマーと共に添加して粒子内に蛍光物質を取り込ませる方法などを挙げることができる。

側方蛍光強度の測定は、白血球５分類血液検査装置等において、必要に応じて付加的に行われることができる。

細胞と標識粒子とを混合して分散液を調製してから検査測定を行うまでの時間は、特に限定されないが、好ましくは、３０秒〜６０分である。細胞分散液が血液である場合、この範囲を超えると、血液の凝固等を生じることがある。フローサイトメーターは、蛍光法を中心とする光学的方法を用いる測定装置である。いわゆるコールター原理を用いた血球計数装置は、電界中の細孔を細胞が通過する際に、電解質溶液と細胞とが置き替わり、電気抵抗、インピーダンス、電磁界などが変化することを利用して、細孔を通過した細胞の数を計数するというものである。この装置によれば、細胞分散液に分散されている多数の細胞を原理的には一つずつ測定することができる。そして、細孔を通過する細胞が大きいほど、抵抗値の変化が大きくなるため、血球計数装置を用いた測定では、細胞分散液中の細胞の数、大きさ、体積などを迅速に測定することができる。血球計数装置によって、個数等を測定され得る細胞の大きさとしては、典型的には、直径１〜３０μｍ程度である。

白血球３分類血液検査装置および白血球５分類血液検査装置は、たとえば、血球計数装置に、レーザー照射装置および散乱光受光装置などを付加して構成される。白血球３分類血液検査装置または白血球５分類血液検査装置によれば、細胞分散液に分散されている多数の細胞一つずつについて、レーザー散乱光の強度を測定することができる。検出される散乱光強度としては、前方散乱光強度、側方散乱光強度、側方蛍光強度などを挙げることができる。

工程１の測定結果は、光散乱強度等の数値として得てもよく、複数の検査測定法を併用した場合には、各検査測定法により得られた測定値の相関関係を、たとえば散布図（スキャッタグラム）に表してもよい。たとえば、細胞分散液中の細胞の個数に関する数値と、細胞の大きさに関する数値を散布図に表すことや、細胞分散液中の細胞の大きさに関する数値と、細胞の内部情報（たとえば顆粒の多寡）に関する数値とを散布図に表すことなどが挙げられる。このような散布図は、３次元以上の散布図とすることもできる。このような散布図は、細胞分散液の特徴の表現力が高いため、たとえば、医師等による診断のためのデータとして、より有用である。

工程１の測定結果から、細胞分散液中の標的細胞の有無、標的細胞の個数などの情報を得ることができる。これにより、たとえば、標的細胞を修飾の程度に応じて分類することができ、細胞分散液をこの分類に基づいて特徴付けることができる。

また、解析工程で行われる解析としては、修飾工程で修飾された標的細胞および修飾されていない標的細胞に関する測定結果を比較することを含むことができる。これにより、たとえば、標的細胞の表面に存在する抗原の多寡を把握することができ、この解析に基づいて細胞分散液を特徴付けることができる。

さらに、解析工程で行われる解析としては、修飾工程の前後で測定された情報の比較を行うことを含むことができる。これにより、たとえば、標的細胞の特定と、標的細胞の分類を同時に行うことができ、細胞分散液をこれに基づいて鑑別することができる。

以上のような解析工程を経ることによって、細胞分散液中に含まれる細胞の表面に存在する抗原の種類によって、細胞を分類することができ、これに基づいて細胞分散液を特徴付けることができる。

１．４． 工程２
工程２は、標識粒子を含まず、前記検査対象である細胞を含む分散液について工程１と同一の検査測定を行って測定結果を得る工程である。工程２で得られる測定結果を測定結果２という。ここで、検査測定と同一の測定とは、たとえば、測定項目、および測定条件の少なくとも一種が同一である検査測定のことをいう。

工程２は、分散液中に標識粒子を含まない点でのみ工程１と異なる工程であって、工程２で用いられる細胞分散液は、工程１で用いられるものと同一である。なお、工程２は、工程１の前に行っても後に行ってもよい。

１．５． 工程３
工程３は、測定結果１と測定結果２を比較する工程である。比較する方法としては、特に限定されないが、例えば、得られた測定結果を数値データとして比較する方法、数値データを散布図等に表して比較する方法等が挙げられる。比較は定量的に行ってもよいし、散布図を目視で比較するなど定性的に行ってもよい。複数の測定項目について検査測定を行い、得られた各測定項目についての相関関係を解析し、測定結果１と測定結果２を比較することもできる。工程３は、工程１および工程２の検査測定と共に、血球計数装置、白血球３分類血液検査装置、白血球５分類血液検査装置、又はフローサイトメーターを用いて行うことができる。

１．６． その他の工程
本発明の標的細胞の検出方法は、工程１〜工程３の他に、他の工程を有していてもよい。他の工程としては、たとえば、細胞分散液を光学顕微鏡によって観察する観察工程が挙げられる。観察工程は、細胞分散液の塗抹標本を作成して、これを光学顕微鏡で観察する工程である。塗抹標本は、公知の方法で作成することができる。細胞分散液がヒトの血液である場合、抗体が固定された粒子を添加した後、血液塗抹標本を作製するまでのインキュベーション時間は３０秒〜６０分であることが好ましいがこれに限らない。

観察工程は、たとえば、上述の測定工程で得られた情報の確認を行うために付加されることができる。この場合、観察工程では、修飾された標的細胞の種類等が、目的とした細胞であるか否か等の確認を行うことができる。

また、観察工程は、上述の測定工程で得られる測定結果とは異なる種類の情報を得るために付加することができる。たとえば、上述のように、標的細胞の表面の抗原に対応して着色された粒子を適用した際に、観察工程では、細胞の種類に関する情報を、より直接的に得ることができる。すなわち、この場合は、細胞の表面の抗原に基づき、細胞のより詳細な分類を行うことができる。また、血液塗抹標本を顕微鏡下で観察する場合、このような複数マーカー（複数カラー）によるマルチカラー解析を行うことにより、たとえば形態学的検査の客観性を向上させることができる。

たとえば、標識粒子として、それぞれ、可視光領域において互いに異なる色に着色された、第１の標識粒子および第２の標識粒子を用い、観察工程において、第１の標識粒子および第２の標識粒子を標識として標的細胞を特定するとともに、第１の標識粒子および第２の標識粒子の標的細胞への結合数に基づいて、標的細胞を鑑別することができる。

以上説明した本発明の標的細胞の検出方法は、細胞分散液中の標的細胞を極めて簡便に分類することができる。また、この方法によれば、簡便かつ迅速に標的細胞を検出することができる。これにより、たとえば、細胞分散液が血液である場合、医師等による病気の診断のためのデータを簡便かつ迅速に提供することができる。

２． 実施例
次に、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。

２．１． 標識粒子の調製例
２．１．１． ベース粒子
ベース粒子として、ＭＳ３００／Ｔｏｓｙｌ（ＪＳＲ株式会社製）を準備した。この粒子は、光散乱法で測定した数平均粒子径３μｍの磁性ラテックスであり、リン酸バッファーに分散され、１０ｍｇ／ｍｌの濃度の分散液となっている。この粒子を各実施例のベース粒子として使用した。

２．１．２． 標識粒子の調製例１ （直接法）
前記ベース粒子の分散液をＶｏｒｔｅｘミキサーでよく分散し、ベース粒子分散液１．０ｍｌ（粒子１０ｍｇ分に相当する）をマイクロチューブに取った。次いで、このマイクロチューブを、磁気スタンドに約１分間セットし、上清を除去し、ベース粒子を濃縮した。次に、濃縮されたベース粒子に、ホウ酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）（以下、反応バッファーという）を０．５ｍｌ加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで粒子を分散させた。この濃縮操作と、反応バッファーによる分散操作を２回繰り返した。その後、さらに反応バッファーを０．５ｍｌ加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで粒子を分散し、ベース粒子分散体Ａを得た。

粒子分散体Ａに、２ｍｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ４抗原抗体溶液（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社）を２５μｌ加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで撹拌後、３７℃で１時間転倒混和した。次いで、ブロッキング剤として、アルドリッチ社から入手したＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の１０％溶液を２μｌ加え、３７℃で２４時間転倒混和した。

磁気スタンドに設置し、１分間静置し上清を除去した。生理的トリス緩衝液ＴＢＳ−Ｔ（以下、洗浄バッファーと称する）を０．５ｍｌ加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで攪拌、分散させた。そして、上清の除去と、洗浄バッファーの添加を３回繰り返した。

次いで、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（以下、保存バッファーと称する）を１．０ｍｌ加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで攪拌、分散させた。以上により得られた標識粒子の分散体を「ＰＣＤ４」という。粒子分散体ＰＣＤ４中の標識粒子の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。

２．１．３． 標識粒子の調製例２ （間接法）
抗ヒトＣＤ４抗原抗体に替えて、二次抗体である抗マウスＩｇＧ抗体を用いた以外は、標識粒子の調製例１と同様にして抗マウスＩｇＧ抗体をベース粒子に固定した。以上により得られた粒子分散体を「ＰＩＭ」という。

次いで、粒子分散体ＰＩＭに、一次抗体である抗ヒトＣＤ４抗原抗体（２ｍｇ／ｍｌ、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）を１０μｌ加えて、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで撹拌後、室温で３０分間転倒混和した。その後、磁気スタンドに設置し、１分間静置し上清を除去した。次いで、洗浄バッファーを０．５ｍｌ加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで粒子を分散した。上清の除去と、洗浄バッファーの添加を３回ずつ繰り返し実施したあと、洗浄バッファーを１．０ｍｌを加え、Ｖｏｒｔｅｘミキサーで粒子を分散した。以上により得られた標識粒子の分散体を「ＰＩＭＣＤ４」という。

２．１．４． 標識粒子の調製例３ （間接法）
抗ヒトＣＤ４抗原抗体に替えて、プロテインＡを用いた以外は、標識粒子の調製例１と同様にしてプロテインＡをベース粒子に固定した。以上により得られた粒子分散体を「ＰＰＡ」という。

次いで、粒子分散体ＰＰＡに、抗ＣＤ４ウサギモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｍａｒｑｕｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を、標識粒子の調製例２における一次抗体の結合工程と同様にして固定した。以上により得られた標識粒子の分散体を「ＰＰＡＣＤ４」という。

２．１．５． 標識粒子の調製例４ （間接法）
プロテインＡに替えてプロテインＧを用いた他は標識粒子の調製例３と同様にして、標識粒子の分散体「ＰＰＧＣＤ４」を得た。

２．２． 分散液の調製例
健常人の静脈からＥＤＴＡ添加採血管を用いて採血した血液２ｍｌをマイクロチューブに採り、標識粒子の調製例１〜４で得られた標識粒子の分散体２００μｌを加えて、各実施例で用いる分散液とし、マイクロチューブを２０回転倒混和した後、室温（１５−２５℃）で２０分静置して保存して各実施例に使用した。分散液中における標識粒子の濃度は、５×１０^７個／μｌである。比較対象では、上記血液１００μｌを分散液とした他は、実施例と同様とした。

２．３． 測定
ベックマン・コールター社製血液分析装置（型式：ＬＨ７５０）（白血球５分類血液検査装置に該当する）を用いて、広角前方散乱光強度、およびコールター原理による電気抵抗を測定し、それぞれの値を、２つの軸にとり、各血球についての二次元プロットを行った。そして、血球の大きさの分布と、血球の内部構造の複雑さの分布の相関をとり、各血球のプロットされる位置（集団）により血球を分類した。分類された各集団に属する血球の数および全血球の数から、リンパ球比率（ＬＹＭＰ％）、好中球比率（ＮＥＵＴ％）、単球比率（ＭＯＮＯ％）、好酸球比率（ＥＯＳ％）、および好塩基球比率（ＢＡＳＯ％）のデータを採取した。ここで、各血球の比率とは、測定した血液中の白血球全体の個数に対する該当する血球の個数の比である。これらの結果を表１に記載した。変化率（％）とは、各実施例における各血球の比率÷比較対象における同血球の比率×１００（％）である。

表１によると、各実施例において、比較対象に比較して、リンパ球および単球の比率が減少し、顆粒球である好中球および好酸球の比率が増大した。

この傾向は、抗ヒトＣＤ４抗原抗体が固定された標識粒子が、ヘルパーＴ細胞（リンパ球）や単球の表面に普遍的に存在するＣＤ４抗原に特異的に結合（免疫複合体の形成）した結果によって生じたと考えられる。すなわち、各実施例の抗ヒトＣＤ４抗原抗体が固定された粒子が、リンパ球の一部に特異的に結合することによって、血液分析装置が、該粒子を、細胞の内部の顆粒として認識したものと考えられる。換言すると、この結果は、血球分析装置が、細胞の大きさおよび顆粒の有無から、各実施例の抗ヒトＣＤ４抗原抗体が固定された粒子が特異的に結合したリンパ球の一部を、顆粒球（好酸球または好中球）として認識したために生じていると考えることができる。

図１は、比較対象について得られたスキャッタグラムであり、図２は、実施例２について得られたスキャッタグラムである。図１および図２は、ベックマン・コールター社製血液分析装置（型式：ＬＨ７５０）を用いて得られた。図１および図２によると、リンパ球（図中ＬＹＭＰと記載）に粒子が吸着した細胞集団は、細胞の大きさ（縦軸の値）はそのままで、顆粒が増大（横軸の値）したと認識された結果、スキャッタグラム上では好中球に分類される集団（図中ＮＥＵＴと記載）の下方部（符号Ａを付した）に移行している。なお、単球に分類される集団（図中ＭＯＮＯと記載）から好酸球に分類される集団（図中ＥＯＳと記載）への移行も見られた。

以上のように、各実施例は、細胞表面の抗原に特異的に結合する抗体が固定された粒子を用いているため、白血球５分類血液検査装置を用いて、細胞分散液の特徴付けを迅速に行うことができた。

本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。たとえば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（たとえば、機能、方法および結果が同一の構成、あるいは目的および効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成または同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。

本発明によれば、細胞分散液中の標的細胞を極めて簡便に分類することができ、迅速に細胞分散液の特徴付けを行うことができる。また、この方法によれば、フローサイトメーター以外の装置も利用可能なため、簡便かつ迅速に細胞分散液の特徴付けを行うことができる。また、本発明は、各種の血液検査機器に対する応用も容易である。

Claims (10)

1. 細胞表面に存在する特定の分子に特異的に結合する物質が、０．０４μｍ以上１０μｍ以下の数平均粒子径のベース粒子に固定されている標識粒子であって、前記細胞に結合した場合に前記細胞の見かけの大きさを増大させる標識粒子、及び検査対象である細胞、を含む分散液について、光学的及び電磁的方法による測定（以下、検査測定という。）を行って測定結果１を得る工程、
   前記標識粒子を含まず、前記検査対象である細胞を含む分散液について前記検査測定と同一の測定を行って測定結果２を得る工程、及び
   前記測定結果１と前記測定結果２とを比較する工程、を有し、
   前記検査測定が、蛍光測定を含まない、
   前記特定の分子を有する細胞（以下、「標的細胞」という。）の検出方法。
2. 請求項１において、
   前記検査測定が、散乱光の測定を含む、標的細胞の検出方法。
3. 請求項１または請求項２において、
   前記検査測定が、電磁的方法による細胞数と細胞の大きさの測定を含む、標的細胞の検出方法。
4. 請求項１ないし請求項３のいずれか一項において、
   前記標識粒子が、極性基を有する、標的細胞の検出方法。
5. 請求項４において、
   前記極性基が、水酸基、エポキシ基、カルボキシル基、アルキレンオキシド基、ケト基、および、置換または非置換のアミノ基から選ばれる少なくとも一つの基である、標的細胞の検出方法。
6. 請求項１ないし請求項５のいずれか一項において、
   前記検査測定が、各標的細胞と標識粒子の結合量を測定し、該結合量に対する標的細胞
   数の分布を求める工程を含む、標的細胞の検出方法。
7. 請求項１ないし請求項６のいずれか一項において、
   前記検査測定を複数の測定項目について行う、標的細胞の検出方法。
8. 請求項１ないし請求項７のいずれか一項において、
   前記細胞分散液が体液を含む、標的細胞の検出方法。
9. 請求項１ないし請求項８のいずれか一項において、
   前記検査対象である細胞は、白血球を含む血液細胞であり、
   前記検査測定は、白血球を顆粒球、リンパ球及び単球の３分類又は好酸球、好中球、好塩基球、リンパ球及び単球の５分類に分類する血液検査装置を用いて行われる、標的細胞の検出方法。
10. 請求項１ないし請求項９のいずれか一項において、
    前記標識粒子は、第１の抗原に対して特異的に結合する物質が固定された標識粒子１と第１の抗原とは異なる第２の抗原に対して特異的に結合する物質が固定された標識粒子２とを含んでなる、標的細胞の検出方法。