KR101508699B1 - 적혈구에 의해 운반되는 항원 및 항-적혈구 항체의 검출 - Google Patents

적혈구에 의해 운반되는 항원 및 항-적혈구 항체의 검출 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적혈구에 의해 운반되는 복수의 항원성 분자 및/또는 복수의 항-적혈구 항체를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 적혈구에 의해 운반되는 복수의 항원성 분자는 적혈구 뿐 아니라, 하나 이상의 다른 세포 집단에 의해서도 운반되는 항원성 분자로 이루어진 것으로, 혈액군 항원 분자는 제외되며, 상기 방법은 a) 상기 항원에 특이적인 항체, 또는 b) 적혈구, 적혈구 막 단편을 부착하는 구별가능한 비드에 샘플을 접촉시키는 단계를 포함한다.

Description

적혈구에 의해 운반되는 항원 및 항-적혈구 항체의 검출{Detection of antigens carried by erythrocytes and of anti-erythrocyte antibodies}
본 발명은 적혈구상의 항원성 분자의 존재를 이용하여, 적혈구 및 다른 세포 집단 양자에 의해 운반되는 항원성 분자를 확인하는 것에 관한 것이다.
오늘날 혈액 수혈은 혈액 공여자로부터 수득된 적혈구 농축액(혈액세포 농축액) 제제를 정맥투여하는 것으로 이루어진다. 혈액 수혈의 경우, 주된 위험은 적혈구 항원 및 항체가 수령자(수혈을 받는 개체)의 체내에서 재연합될 가능성과 관련되어 있다. 실제로 적혈구 표면에는 막 항원, 특히 면역 시스템에 의해 인식되고 적혈구 용혈을 수반하는 면역반응을 유발할 수 있는 혈액군(또는 시스템) 항원이 존재한다. 이러한 면역반응은 임상적 증후의 수반없이 단지 수혈이 비효율적인 정도로부터, 약한 임상 반응(불안, 떨림), 심한 임상반응(쇼크, 혈색소뇨증, 신부전) 또는 치사에 이를 수 있는 심각한 임상 반응(쇼크, 파종성 혈관내 용혈)까지 다양하게 결과할 수 있다.
수령자가 공여자의 적혈구 항원에 대해 어떠한 순환 항체도 갖지 않는 경우, 공여자의 적혈구는 수령자의 혈액과 적합하다고 한다.
혈액군 항원이외에도, 프랑스 인구의 약 15%의 개체에서, 적혈구상에 HLA 항원 결정자가 검출되었다(de Villartay et al., Tissue Antigens, 1985, 26(1):12-9). 이 적혈구상의 HLA 항원결정자의 량은 다른 세포 타입에 비해서 소량이긴해도, 수혈위험의 측면에서 볼 때 상당히 중요하다(Everett et al., Transplantation, 1987, vol. 44, no. 1, pp. 123-129).
본 발명자들은, 수혈 위험에 대해 초기에 집중하면서, 혈액군 항원성 분자이외에, 어떠한 항원성 분자도, 이들의 적혈구상의 부수적인 존재를 이용하여 용이하게 검출될 수 있음을 발견하게 되었다.
적혈구 및 다른 세포 집단 양자에 의해 운반되는 항원성 분자를 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명은 생물학적 샘플내에서, 개체의 적혈구에 의해 운반되는 복수의 항원성 분자 및/또는 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 대한 복수의 항체를 확인하는 생체외 방법을 제공하며, 상기 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자는, 혈액군 분자를 제외한, 적혈구 및 하나 이상의 다른 세포 집단 양자에 의해 운반되는 항원성 분자들로 이루어지며, 상기 방법은
a) 하기 단계들에 의해 개체의 적혈구에 의해 운반되는 복수의 항원성 분자들을 확인하는 단계:
(i) 적혈구를 함유하는 샘플을, 단일 테스트 용기내 또는 수개의 별도 테스트 용기내에서, 구별가능한 비드 그룹들과 접촉시키는 단계, 이때 상기 구별가능한 비드들의 각 그룹은 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 특이적인, 각 비드군마다 서로 상이한, 특정 항체를 가지며, 상기 접촉은 적혈구가 응집없이 항체에 결합되는 조건하에서 이루어지며, 상기 적혈구는 상기 비드 그룹과 접촉전 또는 후에 라벨링된다;
(ii) 상기 항체에 결합되지 않은 적혈구를 제거하는 단계; 및
(iii) 라벨링된 적혈구와 결합된 비드의 그룹을 확인하여, 검출된 적혈구에 의해 운반되는 항원를 확인하는 단계; 및/또는
b) 하기 단계들에 의해, 생물학적 샘플내, 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자들에 대한 복수의 항체들을 확인하는 단계:
(iv) 상기 샘플을, 단일 테스트 용기내 또는 수개의 별도 테스트 용기내에서, 구별가능한 비드 그룹들과 접촉시키는 단계, 이때 상기 구별가능한 비드들의 각 그룹은, 각 비드군마다 서로 상이한, 알려진 표현형의 (1) 적혈구, (2) 적혈구 막 단편을 가지며, 상기 접촉은 샘플내 존재하는 항체 또는 활성화된 혈청 보체 분획이 적혈구 또는 적혈구 막 단편에 응집없이 결합되는 조건하에서 이루어진다;
(v) 상기 적혈구, 적혈구 막 단편과 결합하지 않은 항체 또는 활성화된 혈청 보체 분획을 제거하는 단계; 및
(vi) 결합된 항체 및/또는 결합된 활성화된 혈청 보체 분획을 라벨링하는 단계; 및
(vii) 라벨링된 항체 또는 라벨링된 활성화된 혈청 보체 분획과 결합한 비드의 그룹을 확인하여, 존재하는, 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 대한 항체를 확인하는 단계.
본 발명은 또한 상기 검출 방법을 실행하는데 사용되는 시약 세트에 관한 것으로, 이는 각각 하나 이상의 검출가능한 특정 물리적 파라미터를 가지며, 두개 이상의 상이한 그룹에 속하는 구별가능한 비드 그룹들을 포함하며, 이들 그룹 중 하나는 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 특이적인 포획 항체를 가지며, 다른 그룹은 (1) 적혈구, 또는 (2) 적혈구 막 단편을 가진다.
정의
본 명세서에서, "적혈구" 또는 "적혈구 세포"는 서로 구별없이 동일한 혈액세포를 지칭하는데 사용된다.
"다중(multiplex)"은 단일 신호-판독 시스템을 사용하여 단일 용기내 단일 샘플에 대해 수개의 서로 다른 항원-항체 타입의 반응이 동시에 분석되는 것을 지칭한다.
"단일(simplex)"은 항원-항체 반응이 수개의 분리된 용기내에서 분석되는 것을 의미한다. 그럼에도 불구하고 분석은 바람직하게 동시에, 바람직하게 단일 신호-판독 시스템을 사용하여 수행된다.
"적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자(antigenic molecule carried by erythrocytes)"는 적혈구 및 하나 이상의 다른 세포집단 양자에 의해 운반되는 항원성 물질로 이루어지는, 적혈구에 의해 운반되는 항원성 물질을 지칭한다. 혈액군 분자(blood group molecules)는 배제된다. "혈액군 분자"는 A 항원, B 항원, 동시에 발현되는 A 및 B 항원 또는 H 항원의 ABD 시스템의 항원, D, E, e 및 C 또는 c항원의 알에이치(Rhesus) 시스템의 항원, K 또는 k의 켈(KEL)시스템 항원, 더피(FY)시스템의 항원(Fya 및 Fyb), 키드(JK) 시스템 항원(Jka, Jkb) 또는 그외 실무상 다소 연구가 덜 이루어졌지만 존재하는 MNS, 루이스(LE) 등의 기타 시스템 항원들을 의미한다.
관심의 대상이 되는 항원성 분자를 운반하는 세포 집단은 혈액세포(림포사이트), 혈소판 등이 포함된다.
적혈구 및 다른 세포 집단에 의해 운반되는 관심 항원성 분자들의 예로는, HLA 시스템의 분자들, 특히 HLA B-27, CD55 및/또는 CD29 (Terpos et al., Medical Science Monit. 2008, 14 276-280)를 들 수 있다. 관심 항원성 분자의 다른 예로는 적혈구 노화 마커, 예를 들면 포스파티딜세린(PS)을 들 수 있다.
생리학적으로 또는 비생리학적으로 적혈구 표면에서 및 다른 세포 타입 또는 집단의 표면에서 발견되는 적혈구 항원도 포함된다. 적혈구 항원으로 인한 면역반응에서 결과하는 적혈구 표면에 존재하는 항원 또한 포함된다. 이 경우, "적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자"는 생체내 감작된 적혈구에 의해 운반되는, 항체 또는 혈청 보체 분획의 인자들을 포함한다. 생리학적으로 발견되지 않는 항원성 분자로는, 예를 들면, 개체에 의해 흡수된 화학제품 또는 의약품, 또는 이들의 분해산물들을 포함한다.
또한 다른 세포 집단에서 유래되었으나 적혈구상에 흡착된 항원성 분자들도 포함된다.
"적혈구에 의해 운반된"은 막 발현, 흡착 또는 세포간 발현, 처리 또는 적혈구의 생리학적 과정(예, 적혈구의 노화 동안)에 의해 이용가능하게된 항원성 분자들을 지칭한다.
"적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자들에 대한 항체" 또는 "항-적혈구 항체"는 적혈구 및 하나 이상의 다른 세포 집단에 의해 운반되는 항원에 특이적으로 결합하는 항체들을 지칭한다. "결합된 항체 및/또는 결합된 혈청 보체 분획의 라벨링"은 가역적으로 결합되거나 또는 직접 적혈구막에 끼여진, 항체 또는 (임의로 활성화된) 혈청 보체 분획의 라벨링을 의미한다.
"개체"는 적혈구에 의해 운반되는 복수의 항원성 분자들을 갖는 동물들을 지칭한다. 동물의 예로는, 지금까지 8개의 서로다른 혈액군이 확인된 개, 3개가 확인된 고양이를 들 수 있다. 물론, "개체"는 태아 상태를 포함하는 인간도 포함한다.
"생물학적 샘플"은 생리적으로 또는 병리적으로 적혈구나 항-적혈구 항체를 포함하는 체액 분획 또는 조직 생검 등을 의미한다. 생물학적 샘플로서, 전체 혈액(전혈) 샘플 또는 혈액세포 펠렛 샘플(또는 혈액백), 또는 기타 다른 혈액제제와 같은 혈액 샘플, 또는 혈액을 포함하는 침, 땀, 눈물, 유즙 또는 소변을 예로 들 수 있다. 모드(a)에서 항원성 분자를 검출하기 위해 사용되는 샘플은 항체 검출을 위해 사용되는 샘플과 동일할수도 상이할수도 있다. 샘플이 동일한 경우, 모드 (a) 및 (b)는 동일한 용기내에서 동시에 수행될 수 있다. 생물학적 샘플은 전처리를 행하지 않는다.
"항체"는 항원성 화합물의 하나 이상의 항원성 결정자에 항체를 결합시키는 하나 이상의 항원 복합체 부위를 포함하거나 구성하는 전체 항체 또는 항체 기능 단편을 의미한다. 항체 단편으로서, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편, scFv 사슬(단쇄 가변 단편), dsFv 사슬(이중 가닥 가변 단편) 등을 예로 들 수 있다. 이러한 기능성 단편은 특히 유전공학에 의해 수득될 수 있다.
"포획항체"는 생물학적 샘플에 존재하는 항원성 화합물의 하나 이상의 항원성 결정자를 친화성 결합에 의해 보유할 수 있는, 고상에 부착된 항체 또는 항체 일부를 의미한다.
검출 도구로 사용되는 항체는 다클론 또는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 단클론 항체 또는 다클론 항체는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다.
단클론 항체는 Kohler 및 Milstein에 의해 기술된 통상적인 림포사이트 융합 및 하이브리도마 배양법에 따라 수득될 수 있다(Nature, 256, p. 495-497(1975)). 다른 단클론 항체 제조방법도 알려져 있다(Harlow et al. editors, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)). 단클론 항체는 포유동물을 면역시키고(예, 마우스, 래트, 토끼 또는 인간 등), 하이브리도마를 생성하는 림포사이트 융합술(전술한 Kohler 및 Milstein, 1975)을 사용하여 제조할 수 있다.
이러한 통상 기술에 대한 대체 기술도 있다. 예를 들면 하이브리도마에서 클로닝된 핵산의 발현에 의해 단클론 항체를 제조할 수 있다. 항체 cDNAs를 통상 실모양의 파지인 벡터에 도입하는 파지 디스플레이 테크닉으로 항체를 제조할 수도 있다(예, 대장균에 대해서는 fUSE5 사용, Scott 등 (Science, 249, pp. 386-390 (1990)). 상기 벡터들은 라이브러리를 구성하고 그 표면에 scFv 단편을 갖고 있다. 이들 항체 라이브러리를 구축하는 프로토콜은 Marks 등에 기술되어 있다(1991) (J. Mol. Biol., 222, pp. 581- 597, (1991)).
다클론 항체는 항원, 특히 펩타이드성 항원으로 면역된 동물 혈청으로부터, 통상의 과정을 통해 수득될 수 있다.
일반적으로 폴리펩타이드, 특히 재조합 폴리펩타이드나 올리고펩타이드가, 예를 들면 면역원(immunogen)으로 사용될 수 있다. 통상적인 프로토콜에 따르면, Benoit 등. [PNAS USA, 79, pp. 917-921 (1982)]에 기재된 과정에 따라, 펩타이드 면역원 1　mg 동등량으로 토끼를 면역시킨다.
비드(Beads):
비드는 일반적으로 생물학적 샘플의 성분에 대해 불활성인 폴리머로 이루어진다; 이들은 고체이며 샘플에 불용성이다. 사용되는 폴리머는 폴리에스테르, 폴리에테르, 폴리올레핀, 폴리아미드, 폴리사카라이드, 폴리우레탄 또는 셀룰로스이다. 입자 통합성 및 구조를 위해 결합제를 사용할 수도 있다.
이들 폴리머에 기능기를 도입하여 생물학적으로 관심이 있는 마크로분자(단백질, 지질, 탄수화물, 핵산)들이 결합 또는 부착되게 할 수 있다. 이들 기능기는 본 기술분야의 당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 아민기(-NH2) 또는 암모늄기(-NH3 + 또는 -NR3 +), 알콜성 기능기(-OH), 카복실기(-COOH) 또는 이소시아네이트기(-NCO)를 들 수 있다. 폴리올레핀에 COOH기를 도입하는데 가장 자주 사용되는 모노머는 아크릴산 또는 메타크릴산이다.
시약의 비드 표면에의 부착은 정전기적 인력, 친화성 인력, 소수성 인력 또는 공유결합 등으로 수행될 수 있다. 바람직하게 공유결합으로 이루어진다.
본 발명에 사용되는 비드는 통상 구형의 입자로서, 그 크기는 0.5 내지 40　㎛, 바람직하게는 4 내지 9 ㎛, 가장 바람직하게는 5 내지 8　㎛이다.
본 발명에서 사용되는 비드들은 적합한 검출기에 의해 서로로부터 구별될 수 있는 상이한 마커들을 갖는 점에서 "구별가능하다(distinguishable)". 따라서 각 그룹의 비드들은 서로 다른 물리화학적 성질(크기, 밀도, 입자 크기, 거칠기, 흡수성, 형광성, 상자성 성분)을 가지며, 이로써 예를 들면 유세포 분석기(low cytometry)와 같은 적합한 검출기 또는 도구에 의해 서로로부터 구별될 수 있다.
입자들을 서로로부터 구별시키는 차등 파라미터로서, 입자 크기를 사용할 수 있으며, 즉 입자크기를 서로 중첩되지 않는 범위로 선택함으로써 차등화할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, 구별가능한 입자는 형광성 신호를 방출한다. 다양한 형광 라벨들을 삽입한 비드들은 그 형광 스펙트럼으로 구별될 수 있다. 이를 위해, 적절하게 다양한 농도의, 방사성동위원소 형태, 효소형태 등의 라벨을 갖는 하나 이상의 염색제(예, 형광, 발광 등)에 비드를 침지할 수 있다(Venkatasubbarao S. "Microarrays-Status and prospects" Trends in Biotechnology Dec 2004, 22(12):630-637　; Morgan et al, "Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology" Clin. Immunol. (2004) 100:252-266). 빛의 산란 또는 방출 또는 이들의 조합에 의해 입자들을 서로 구별되게 할 수 있다
바람직한 실시형태에서, 구별가능한 비드들은 발광성 또는 형광성 신호를 방출한다.
사용되는 비드들은 초상자성(superparamagnetic), 자성(magnetic) 또는 자화가능(magnetizable)할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 비드로서, US　6,872,578에 개시되어 있는 비드들을 예로 들 수 있다. 특히 바람직한 실시형태에 따라, 사용되는 비드들은 형광성이며 초상자성이다. 이러한 물리화학적 성질은, 생물학적 샘플과의 반응중에, 이들 마이크로입자들에 의해 포획된 분획을 결합되지 않은 것들로부터 분리할 수 있게 한다. 이러한 분리는 특히 원심분리, 여과 또는 자화에 의해 수행될 수 있다. 자화에 의한 분리가 바람직하며, 이를 위해, 상자성, 강자성, 강자성 및 준자성 성분을 함유하는 비드들이 사용될 수 있다. 상자성 성분이 바람직하게, 예를 들면 철, 코발트, 니켈 또는 Mn2O3, Cr2O or Fe3O4와 같은 금속 산화물을 들 수 있다. 자성 성분의 양은 2 중량% 내지 50 중량%, 바람직하게는 3 중량% 내지 25 중량%일 수 있다.
항체는 적합한 기술에 의해 비드에 부착될 수 있다. 이들은 직접적인 공유결합 또는 특히 수동적인 흡착 또는 친화성에 의한 비공유적 결합으로 부착될 수 있다. 직접적인 공유적 부착은 예를 들면 하이드록시숙신이미드 또는 카보디이미드와의 결합을 통해 비드의 표면에 존재하는 카복실기를 활성화시켜 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항-면역글로불린 항체를 먼저 공유결합에 의해 비드에 부착하고, 이후 상기 비드를 부착될 항체와 접촉시킨다.
적혈구 또는 적혈구 막 단편은 폴리-L-리신을 통한 비공유성 결합, 또는 염색제 타입의 폴리양이온과 같은 리간드에 의해 비드에 부착될 수 있다. 적혈구 또는 적혈구 막 단편은 특히 소듐 페리오데이트(sodium periodate)를 사용한 공유결합에 의해 비드에 부착될 수도 있다. 놀랍게도 적혈구 또는 막 단편의 부착은, 공유적이든 비공유적이든, 유세포 분석기에 의해 구별가능한 비드들의 성질을 손상시키지 않음이 주목되었다.
비드들은 유세포 분석기와 같은 검출기에 의해, 예를 들어 루미넥스 특허 출원 WO　97/14028에 개시된 바와 같이 측정될 수 있다. 따라서 반응물(항체 또는 적혈구 또는 적혈구막)을 갖는 비드 서브그룹들은 생물학적 샘플에 노출되며, 이들 각 서브그룹은 서로 다른 서브그룹으로부터 각 서브그룹의 비드들을 구별짓게 하는 하나 이상의 분류 파라미터를 갖고 있다. 따라서 샘플에 노출된 비드들은 시험 영역(예, 유세포 분석기)에 들어가, 분류 파라미터에 관련된 데이타(예, 형광 방출 강도)를 수집하고, 바람직하게 반응물과 관심 분석물간(즉, 본 발명의 방법에서 상기 (a)에 따른 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자 또는 (b)에 따른 항체와 비드간에)에 형성된 복합체의 존재 또는 부재에 관련된 데이타를 수집한다.
라벨링(Labelling):
검출가능하게 라벨링된 적혈구는 본 기술분야에 알려진 기술에 의해서 라벨링될 수 있다. 예를 들면, 형광성 화합물, 예를 들면 세포의 막내로 삽입되는 형광단(fluorophore)으로 라벨링될 수 있다. 또한 그 자체가 형광성 라벨로 기능화된 리간드로 라벨링될 수 있으며, 이 리간드는 적혈구 표면의 구조를 인식할 수 있다. 이들 리간드는, 예를 들면, 항체 또는 동물 또는 식물 렉틴이다. 이러한 타입의 라벨링은 테스트 전에 수행될 수도 아닐수도 있다.
항체 확인의 경우에서, 라벨링되는 것은 항체 또는 임의로 활성화된 혈청 보체 분획이다. 이 또한 공지된 라벨링 기술을 사용할 수 있다. 여러 타입의 라벨링을 혼합할 수도 있다.
특정 실시형태에 따라, 항체들은 형광성, 발광성 또는 방사성 라벨을 갖는 항-인간 면역글로불린 항체와 접촉된다.
다른 특이적, 임의로 가중적인 실시형태에 따라, 활성화된 혈청 분획은 특이적으로 활성화된 혈청 분획을 인식하는 항체와 접촉하며, 상기 항체는 예를 들면, 형광성, 발광성 또는 방사성 라벨을 갖는다. 이러한 항체들은 단클론성이거나 다클론성일 수 있으며, 본 기술분야에 잘 공지되어 있다.
미결합된 시약의 제거:
분석단계를 수행하기 전에, 접촉 및 시약의 인큐베이션동안 결합되지 않은 시약들은 제거되어야 한다. 배경 노이즈를 감소시키고, 양호한 특이성을 갖는 테스트 결과를 얻기 위해서는, 가능한 한 많은 미결합 시약을 제거하는 것이 요망되나. 지나치게 격렬한 조건은 테스트의 민감도를 감소시킬 수 있다. 따라서 미결합 시약의 잔류는 일반적으로 용인되고 있다. 방법의 민감도 및 특이성간의 수용가능한 타협을 얻기위한 조건은 통상적인 실험을 통해 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
미결합 시약의 제거는, 원심분리를 반복하여 세척하거나, 비드의 초상자성 성질 및 자석을 이용하는 것과 같이, 본 기술분야에 알려진 기술들을 사용하여 수행될 수 있다.
바람직한 실시형태:
상기 정의된 바와 같이, 본 발명에 따른 방법은 항원의 확인, 또는 항체 또는 결합된 활성화된 혈청 보체 분획의 확인을 가능하게 한다. 또한 몇가지 형태의 확인의 조합을 사용할 수 있게 한다. 따라서 항원의 확인 및 항체의 확인은 동시에 또는 분리되어 수행될 수 있다. 항체의 확인은 항체 및 활성화된 혈청 보체 분획 양자를 밝힘으로써 수행될 수 있다.
용기는 어떠한 고체 용기도 사용할 수 있으며, 예를 들면 시험관, 마이크로플레이트 웰 또는 자동화된 시스템으로 반응이 가능한 어떠한 용기도 사용가능하다. 상기 용기를 원심분리하는 것이 요구되지 않는다.
반응물 및 분석대상물의 혼합은 적혈구에 의해 운반되는 항원이, 응집없이, 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 조건(특히 pH, 온도, 이온강도 등)에서 수행된다. 실질적인 응집 부재는 특히 유세포 분석기의 사용을 가능하게 한다. 응집반응을 피하기 위해, 비드의 양 및 크기, 및 샘플 농도를 조정하는 것이 유리하다. 응집 반응은 특히 H.E. Hart의 간행물 Bulletin of mathematical biology, vol 42, 17-36, by K.C. Chak, Bulletin of mathematical biology, vol 42, 37-56 및 C. DeLisi의 Journal of Theoretical Biology, 1974, vol 45, pages 555-575에 개시된 바와 같은 수학적 법칙을 만족한다. 이러한 법칙들은 특히 시약의 크기 및 수에 의한 이들의 비율과 같은 몇개의 파라미터를 포함한다. 따라서 당업자는 사용하는 시약들에 대해 이들 수학법칙을 적용함으로써, 실질적인 응집이 일어나지 않도록 반응 조건을 결정할 수 있다. 예를 들면, 적혈구와 적혈구와 유사한 크기 즉 7 ㎛의 비드가 사용되는 경우, 당업자는 적혈구수와 비드수의 비율이 30 내지 150이 되도록 선택한다.
유용하게, 용혈(hemolysis)과 같은 헤모글로빈에 대한 화학적 또는 효소적 분해 단계를 바람직하게 항원 또는 항체의 확인전 및 부착후에 제공하는 것이 바람직하다.
용혈은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들면 혼합물을 낮은 몰삼투압 농도를 갖는 매질내에 인큐베이션할 수 있다. "낮은 몰삼투압 농도의 매질"은 통상 100 mosmol/L 이하의 몰삼투압을 갖는 매질을 의미한다. 적합한 낮은 몰삼투압 매질로서는, 40　mM 이하의 농도를 갖는 암모늄 클로라이드 용액, 또는 증류수를 들 수 있다. 초음파에 의해 용혈이 수행될 수도 있다.
응용:
본 방법은 다중 형식으로 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자들을 확인할 수 있다.
또한 본 방법은 예컨대 형광신호의 분석을 통해, 샘플내 적혈구 표면의 항원들의 비율을 정량적으로 측정할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 가능한 항체의 정량을 가능하게 한다. 따라서 수득된 결과는 숫자 형태로 되어 있으며, 전자 데이타프로세싱 시스템에 의해 그 번역을 촉진시킬 수 있다.
유용하게 본 방법은 단지 수분내에 완전하고 신뢰성있는 결과를 수득할 수 있다. 특히 1시간 이내, 심지어 30분 이내, 완전한 결과를 산출할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 채취되는 테스트 샘플의 부피를 감소시킬 수 있게 한다. 지금까지 각 테스트에 대해 25㎕의 테스트 샘플로 수행되어 왔다. 그러나 본 발명의 방법을 수행하는데는 예를 들어 단지 50 내지 100 ㎕로 충분하다.
하기 실시예 및 도면을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하나, 이들은 본 발명을 제한하지 않는다.
본 발명의 방법은 적은 량의 테스트 샘플로 신속하고 신뢰성있게 적혈구 및 다른 세포 집단 양자에 의해 운반되는 항원성 분자를 확인할 수 있다.
도 1은 루미넥스® 비드상의 항체의 직접 고정화를 도시한 것이다.
도 2는 루미넥스® 비드상에 친화성에 의한 항체의 고정화를 도시한 것이다.
도 3은 형광성 막내 화합물로 다양한 표현형의 적혈구 세포를 라벨링한 것을 도시한 것이다.
도 4는 폴리-L-리신으로 루미넥스® 비드상에 적혈구를 고정하는 과정을 도시한 것이다.
도 5a 내지 5d는 적혈구의 다중 표현형 결정을 도시한 것이다.
도 6은 "직접 쿰즈-양성" 환자에서 온 적혈구의 동시 확인 및 다중 표현형 결정을 도시한 것이다.
실시예 1: 항원 확인
본 분석의 목적은 특정 단클론 항체를 사용하여, 공여자 또는 환자에서 온 적혈구 표면에 존재하는 항원들을 확인하는 것이다.
형광 비드를 사용하여 항-적혈구 항체들을 고정하였다. 서로다른 항원 특이성을 갖는 항체들은 서로 다른 색을 갖는 다양한 비드 영역에 결합된다.
적혈구들은 바이오-라드사에 의해 상품명 "바이오플렉스 200"으로 시판되는 장비의 리포터 레이저 파장에 적합한 형광성 화합물로 라벨링하였다.
라벨링후 적혈구들을 감작된 비드와 인큐베이션하였다. 따라서 비드에 부착된 적혈구들을 검출할 수 있고, 그 항원 특이성을 결정할 수 있었다.
1.1 - 물질 및 시약
- 비드:
사용된 비드는 루미넥스사에 의해 제조된 것이다(루미넥스사, 미국, 텍사스, 오스틴). 이들은 폴리스티렌 및 메타크릴산(COOH기)으로 구성되며, 직경 8㎛인 초상자성 비드이다.
본 실시예에서, 다양한 비드 영역 19, 21, 32, 34 (내부표준비드 (ISB)), 71및 98 (블랭크 비드 (BB)) 을 갖는 형광성 초상자성 비드들을 사용하였다.
비드 영역 34를 갖는 비드(ISB)들은 로다민 유도체로 기능화되며, 내부 형광 대조로 사용되었다. 이들 비드들은 5000 내지 15　000 RFI의 형광값을 생성한다.
영역-98 BB 비드들은 소 알부민으로 포화된다. 이들 비드들은 항원도 항체도 결합할 수 없으며, 따라서 비-특이성 결합의 부재를 입증하는데 사용된다. 이러한 비드들은 1000 RFI 미만의 형광값을 나타낸다.
- 항-인간 면역글로불린 단클론 IgG 항체, 클론 125A15 (바이오-라드).
- 항-인간 IgM (mu) 다클론 항체(바이오-라드).
- 항-D IgG (클론 H2D5D2F5), 항-Fya IgG (클론 5T72A13F5A93) 및 항-S IgM (클론 MS94) 단클론 항체 (바이오-라드, 밀리포어).
- PKH26 세포 라벨링 키트 (시그마).
- 바이오-라드사 시판 상품명 "ScanLiss" 코드 86442 및 "Stabiliss" 코드 86550 로 시판되는 희석 매질.
- 비전형 항체 스크리닝용 상품명 "ScanGel Coombs" 코드 86432로 시판되는 겔카드(바이오-라드).
- 상품명 "ScanGelRhK" 코드 86428 및 "ScanGel Neutral" 코드 86430로 시판되는 겔카드(바이오-라드).
- 겔 카드 기술에 의한 비전형 항체 스크리닝용 상품명 "ScanPanel" 코드 86593 및 "ScanCell" 코드 86595로 시판되는 표현형이 결정된 적혈구(바이오-라드).
- SAG-MAN 매질에 보존된 농축 표준형이 결정된 혈액세포 펠렛(EFS Nord de France).
- 환자 샘플에서 유래된 직접 쿰즈-양성 및/또는 -음성 적혈구.
- 코팅 액체 또는 버퍼(10　mM 소듐 포스페이트, 150　mM NaCl, 0.1% (v/v) 프로클린.
- 소 혈청 알부민(BSA) (밀리포어).
- PBS 버퍼, pH 7.4 (7　mM 소듐 포스페이트, 2.7　mM KCl, 136　mM NaCl).
1.2-프로토콜
1.2.1 비드의 혈액군 항체로의 감작
두개의 상이한 원리에 따라 비드 표면에 항체를 고정화하였다. 첫번째는 비드에 직접 공유결합에 의해 항체를 고정하는 것이다(도 1). 두번째 접근은 비공유적으로 친화성에 의해 항-적혈구 항체를 고정화하는 것이다. 이 경우, 상기 부착은 제1단계에서 비드에 공유결합으로 항-면역글로불린 항체를 부착한다(도 2). 본 실시예에서는 이 접근이 선택되었다.
19, 21 및 32 비드 영역을 갖는 비드들을 항-인간 면역글로불린의 공유적 고정화에 사용하였다. 비드 영역 71을 갖는 형광성 비드를 항-인간 IgM의 공유적 고정화에 사용하였다. 비드 표면에 존재하는 카복실기는 하이드록시숙시니미드 및 카보디미드를 사용하는 기술에 따라 활성화하였다. 이후 단백질들은 아민기를 통해 고정화될 수 있었다.
제조된 비드들은 10% (w/v)의 BSA, 0.5% (v/v)의 트윈 20 및 0.09% (w/v)의 소듐 아자이드를 함유하는 pH　7.4의 PBS 내 3 mg/ml의 농도로 4℃에서 보관하였다.
고정된 항-인간 면역글로불린을 갖는 비드들은 항-D IgG 또는 항-Fya IgG 혈액군 항체로 감작시킬 수 있다. 실제 항-면역글로불린은 IgG들이 Fc 단편을 통해 결합할 수 있게 한다. 따라서 혈액군 항체들은 이 원리를 사용하여 비드상에 비-공유적으로 고정화된다. 각 비드 영역은 상이한 특이성을 갖는 항체로 감작된다. 선택된 항-면역글로불린은 인간 면역글로불린에 높은 친화성을 가지고 있어, 시간이 지나도 안정하게 결합될 수 있다.
비정제 항-D 및 항-Fya는 각각 최종 농도 30 및 10　㎍/ml로, 80　㎍/mg에서 항-Fc로 기능화된 비드들에 사용된다.
혈액군 항체로의 감작은 PBS(pH　7.4)내에서, 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 수행된다. 감작후 상기 비드를 수회 세척하고 +4℃ PBS(pH　7.4)내에서 보관한다.
고정된 항-mu를 갖는 비드는 항-S IgM로 감작될 수 있다. 항-mu는 실제 IgM들의 결합을 허용한다. 이 항-mu 다클론 혈청의 친화성은 시간에 따른 결합안정성을 보증하기에 충분하다. 비정제 항-S는 40　㎍/mg 항-mu로 기능화된 비드상에 고정화된다. 감작은 PBS (pH　7.4)내에서, 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 수행된다. 감작후 상기 비드를 수회 세척하고 +4℃ PBS(pH　7.4)내에서 보관한다.
적혈구와의 인큐베이션 전에(테스트 그 자체), 혈액군 항체로 감작된 비드는 대조 영역-34비드(ISB) 및 대조 영역-98 비드(BB)와 혼합되었다.
1.2.2 적혈구의 라벨링
형광성 화합물을 사용한 적혈구의 라벨링은 다양한 원리를 사용하여 수행될 수 있다. 본 실시예들에서는, 적혈구 세포막내에 삽입되는 형광단인 PKH26로 적혈구들을 라벨링하였다. 다양한 표현형의 적혈구가 동일한 프로토콜에 따라 라벨링될 수 있다(도 3).
PKH26는 시그마사에서 시판하는 형광성 프로브이다. 상기 프로브는 551　nm에서 최대 여기되며 567　nm에서 최대방출된다.
상기 키트는 긴 지방족 사슬을 가지고 있어 세포막의 지질층내로 들어갈 수 있는 형광성 라벨을 포함하며, 또한 염이나 버퍼 또는 유기 용매를 포함하지 않는 등장성 수성 희석제를 포함한다. 이 희석제는 세포 생존성, 라벨 용해성 및 고수준의 라벨링 효율성을 유지할 수 있게 한다.
PKH26로의 적혈구 라벨링은 제조자 지시에 따라 프로토콜에 의해 수행된다. 이후 라벨링된 적혈구는 Stabiliss 버퍼에 희석하고 암소에서 +4℃에서 보관한다.
겔 테크닉에 따른 표현형 분석을 수행하여, 시간에 따른 라벨링된 적혈구의 품질, 생존성 및 안정성을 분석한다. 라벨링된 적혈구의 항원 통합성을, 라벨링되지 않은 적혈구의 항원 통합성과 비교한다. 형광 라벨링의 품질 및 안정성은 바이오라드사의 "바이오플렉스 200" 장비를 사용한 형광 측정을 수행하여 조사하였다.
1. 2. 3. 혈액군 항체-비드 및 적혈구의 인큐베이션
본 발명에 따른 기술에 의한 군결정의 가능성 및 특이성을 입증하기 위해, 본 발명자들은 일원적 방식으로 반응들을 수행하였다. 이 경우, 관심 항체로 기능화된 비드들은 다양한 표현형의 적혈구들과 개별적으로 인큐베이션하였다.
다중 반응의 경우, 상이한 혈액 샘플들이 상이한 비드 영역들을 가지며 상이한 특이성을 갖는 항체들로 감작된 비드들과 개별적으로 접촉된다. 이러한 형태의 실험을 통해 동일한 테스트 샘플내에서 수개의 항원성 혈액군 특이성의 검출 가능성을 입증할 수 있다.
감작된 비드들은 약 50 내지 150의 적혈구/비드 비율이 되도록 적혈구와 혼합하였다. 상기 혼합물을 진탕하면서 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다.
인큐베이션후, 비드-적혈구 복합체를 증류수로 수회 세척하였다.
1. 2. 4. 바이오라드사의 "바이오플렉스 200" 자동화 기기를 사용한 유세포 분석에 의한 측정
최종세척후, 측정하기전에 상기 복합체는 185㎕의 "코팅 액체" 매질로 희석하였다. 각 테스트에 대해, 25㎕의 현탁액이 기기에 자동 주입되었다. 측정은 영역당 250개의 비드를 포획함으로써 수행되었다. 각 군/표현형 결정 시리즈에 대해, 체계적인 조절을 수행하여 연구된 반응들의 특이성을 분석하였다.
1. 3. 단일/다중 표현형/군결정 실시예
본 시리즈의 테스트는 단일 및/또는 다중 모드로의 적혈구의 표현형/군 결정의 실현가능성을 입증하는 것이다. 모델로서, D, Fya 및 S 항원들이 선택되었다. 항-인간 면역글로불린 또는 항-mu 사슬 항체로 감작된 비드들이 항-D, 항-Fya 및 항-S 항체를 고정화하는데 사용되었다.
1.3.1. RH D-양성 적혈구의 단일 표현형 결정
항-D 항체로 감작된 비드를 PKH26로 라벨링한 Rh D-양성 및 D-음성 적혈구들과 인큐베이션하였으며, 이때 적혈구수/비드수 비율은 150이었다.
두 RH D-양성 적혈구 및 두 RH D-음성 적혈구를 사용하였다. 각 샘플은 두세트로 기기에 주입하였다.
RH D-양성 적혈구들은 21　000 내지 25　000　RFI의 강한 양성 신호를 나타낸 반면, RH D-음성 적혈구들은 40 내지 400 RFI의 음성 신호를 나타내었다.
6500 RFI의 신호를 나타내는 ISB　34 대조 비드 및 1000 미만을 나타내는 BB 98 대조 비드로 상기 결과를 검증하였다. 다양한 음성 대조를 수행한 결과 15 내지 400 RFI의 신호를 나타내었으며, 이는 상기 반응의 특이성을 확인해준다. RH D-양성 및 RH D-음성 적혈구는 실제 항-D 항체의 부재시 비드에 결합하지 않는다.
이러한 결과는 매우 분명하게 RH D-양성 및 RH D-음성 적혈구들을 구별할수 있는 가능성을 나타내며 따라서 적혈구 표면상의 D 항원의 확인 가능성을 입증한다.
Fya 및 S 적혈구의 일원적 표현형 결정 또한 동일한 원리에 따라, 이소형 G-특이적 또는 이소형 M-특이적 항체들을 사용하여 수행될 수 있다.
1.3.2. D, Fya 및 S 적혈구의 다중 표현형 결정
다중 표현형 결정의 원리를 도 5a 내지 5d에 요약하였다.
이 경우, 항-D 항체로 감작한 영역-19 비드들과, 항-Fya 항체로 감작한 영역-21 비드들 및 항-S-항체로 감작한 영역-71 비드들을 혼합하였다.
이 비드 혼합물들을 상이한 D, Fya 및 S 표현형을 갖는 적혈구들과 인큐베이션하였다: D+Fya+S+ / D+Fya-S- / D-Fya+S- / D-Fya-S- / D-Fya-S+ / D-Fya+S+ / D+Fya-S+ / D+Fya+S-. 적혈구수/비드수의 비율은 50으로 하였다.
주어진 항체로 감작된 비드가 상응하는 항원 특이성을 갖는 적혈구와 결합하는 경우, 13　000 내지 29　000 RFI의 양성 신호가 얻어진다.
측정된 형광 신호와 테스트 수행에 사용된 적혈구의 표현형간에 완벽한 상호관계가 관찰되었다.
항체로 감작된 비드를 상응하는 항원을 갖지 않는 적혈구와 접촉시키는 경우에는, 1000 RFI 미만의 신호가 얻어진다.
또한 항체-감작되지 않은 비드로 수행된 대조는 사용된 적혈구에 관계없이 음성 신호를 나타내었다.
이러한 결과는 측정된 신호가 특이적임을 입증한다: 비드-적혈구 결합은 오직 항원-항체 쌍이 관련되었을때 일어난다.
대조 비드 ISB 34 (11　000 RFI) 및 BB 98 (1000 RFI 미만)를 사용하여 얻은 결과로 상기 분석을 검증하였다.
테스트내 변동계수는 1% 내지 10%이었으며, 이는 테스트내 재현성이 만족스러움을 입증한다.
본 결과로부터 본 발명에 따른 기술에 따라 3-파라미터 다중 적혈구의 표현형 결정이 실행가능함이 입증되었다.
1.3.3. 직접 쿰즈-양성(CD +)적혈구의 다중 표현형 결정
마이크로비드를 사용한 다중적인 접근은 CD+ 성질의 확인 및 동시에 도 6에 개시된 원리에 따른 적혈구의 표현형 결정이 가능하게 한다.
항-Fc 항체로 감작한 영역-32 비드를 각각 항-D, 항-Fya 및 항-S 항체로 감작한 영역-19, -21 및 -71 비드들과 혼합하였다. 항체로 생체내 감작된 CD+ 적혈구는 영역-32 비드에 의해 운반되는 항-인간 면역글로불린과 결합할 수 있고, 따라서 CD+ 특성을 확인할 수 있다. 또한 이들 적혈구들은, 적혈구 막에 존재하는 특이성에 따라, D, Fya 및 S 항원에 특이적인 항체를 갖는 영역-19, -21 및 -71 비드들과 결합할 수 있다.
이러한 접근은 적혈구수/비드수 비율을 40으로 하여 입증하였다.
ISB 34 및 BB 98 대조 비드는 예상된 신호, 즉 각각 13　000 RFI, 및 1000 RFI 미만을 나타내었으며, 결과를 검증하였다.
두 CD+ 적혈구는 항-인간 면역글로불린 항체로 감작된 영역-32 비드와 함께 30　000 RFI 이상의 양성 신호를 나타내었다. 두 CD-음성 적혈구는, 동일한 비드 영역을 사용하였을때 500 RFI 미만의 음성 신호를 나타내었다. 이러한 결과는 미리 항-글로불린이 결합된 주어진 비드 영역을 갖는 비드를 사용하는 경우 그 특이적인 결합으로 인해 CD+ 적혈구를 확인할 수 있는 가능성을 입증하였다.
또한 상기 결과는 CD+ 적혈구의 적혈구 항원의 다중 표현형 결정이, CD+ 성질의 확인과 동시에 수행될 수 있음을 입증하였다. 실제, CD+ 적혈구 중 하나는 D+Fya-S-로 다른 것은 D+Fya+S+로 표현형결정되었다.
두 샘플의 S 표현형은 IgM 타입의 항-S 항체를 사용하는 통상의 기술에 따라 검증되었다. 얻어진 결과는 본 발명의 새로운 기술에 의해 얻어진 결과와 완전히 일치하였다.
한편, 항-Fya 표현형에 대해서는 이와 동일한 분석이 수행될 수 없었다. 실제 적혈구 표현형 분석을 위한 IgM 타입의 시약이 없다.
그러나 분석된 CD+ 적혈구에 따른 Fya 표현형에 대해 차이가 관찰되었는데, 이는 상기 결과를 검증해주며, 비특이적 결합 현상을 배제시킬 수 있게 하였다.
변동계수는 대부분의 샘플에서 1% 내지 5%이었으며, 이는 테스트내 재현성이 만족스러움을 나타낸다.
실시예 2: 적혈구 노화 마커인, 포스파티딜세린의 검출
적혈구 노화마크의 입증은 수혈시 적혈구 집단의 연구(Cardo L J et al Transfus Apher Sci, 2008 Apr; 38(2): 141-7) 및 탈라세미아(thalassaemia)와 같은 특정 혈액병리에 관여된 현상의 연구에 매우 귀중하다(Basu S et al Br J Haematol, 2008 Apr; 141(1): 92-9).
적혈구 노화는 특히 적혈구 표면의 포스파티딜세린(PS)으로 불리는 구조의 출현에 의해 반영된다.
본 발명의 테스트는 적혈구의 표면상의 상기 분자의 검출에 쉽게 시행될 수 있다.
이를 위해, 형광 비드가 사용되어, 폴리-L-리신을 통해, 테스트될 적혈구를 고정하는데 사용된다.
이들 비드들은 인큐베이션 단계에서, 항-포스파티딜세린 항체와 접촉된다.
세척후, 피코에리쓰린(PE)로 라벨링된 항-Fc(IgG)이차 항체와 비드-적혈구 세포 복합체의 인큐베이션에 의해 적혈구에의 항-포스파티딜세린의 결합을 검출한다.
미결합 항Fc(IgG)-PE를 제거하기 위한 최종 세척 단계가 수행되었다. 비드-적혈구 세포 복합체를 바이오플렉스 200 기기를 사용하여 판독하였다. 혈액백에서 수득된 상이한 나이의 적혈구를 표준 범위로 사용하였다.

Claims (15)

  1. 하기 단계를 포함하는, 생물학적 샘플내 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 대한 복수의 항체를 확인하는 생체외 방법으로서,
    상기 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자는 HLA 시스템의 분자, 포스파티딜세린, 개체에 의해 흡수된 화학제품 또는 의약품, 또는 이의 분해산물인 방법:
    (i) 상기 샘플을, 단일 테스트 용기내 또는 수개의 별도 테스트 용기내에서, 구별가능한 비드 그룹들과 접촉시키는 단계, 이때 상기 구별가능한 비드들의 각 그룹은, 각 비드 그룹마다 서로 상이한, 알려진 표현형의 적혈구를 가지며, 상기 접촉은 샘플내 존재하는 항체 또는 활성화된 혈청 보체 분획이 적혈구에 응집없이 결합되는 조건하에서 이루어짐;
    (ii) 상기 적혈구와 결합하지 않은 항체 또는 활성화된 혈청 보체 분획을 제거하는 단계;
    (iii) 결합된 항체 또는 결합된 활성화된 혈청 보체 분획을 라벨링하는 단계; 및
    (iv) 라벨링된 항체 또는 라벨링된 활성화된 혈청 보체 분획과 결합한 비드의 그룹을 확인하여, 존재하는, 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 대한 항체를 확인하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    하기의 단계에 의해 개체의 적혈구에 의해 운반되는 복수의 항원성 분자를 확인하는 것을 더 포함하는 방법으로서,
    상기 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자는 HLA 시스템의 분자, 포스파티딜세린, 개체에 의해 흡수된 화학제품 또는 의약품, 또는 이의 분해산물인 방법:
    (i) 적혈구를 함유하는 샘플을, 단일 테스트 용기내 또는 수개의 별도 테스트 용기내에서, 구별가능한 비드 그룹들과 접촉시키는 단계, 이때 상기 구별가능한 비드들의 각 그룹은 각 비드 그룹마다 서로 상이한, 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 특이적인 항체를 가지며, 상기 접촉은 적혈구가 응집없이 항체에 결합되는 조건하에서 이루어지며, 상기 적혈구는 상기 비드 그룹과 접촉전 또는 후에 라벨링됨;
    (ii) 상기 항체에 결합되지 않은 적혈구를 제거하는 단계; 및
    (iii) 라벨링된 적혈구와 결합된 비드의 그룹을 확인하여, 검출된 적혈구에 의해 운반되는 항원을 확인하는 단계.
  3. 제2항에 있어서,
    항원 확인 및 항체 확인이 동일한 용기내에서 동시에 수행되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    혼합물의 분석이 유세포 분석에 의해 수행되는 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 비드에 결합된 적혈구에 용혈이 수행되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 구별가능한 비드가 초상자성 또는 자성 또는 자화가능한 비드인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 구별가능한 비드가 발광성 또는 형광성 신호를 방출하는 것인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 검출가능하게 라벨링된 적혈구는 형광성 화합물로 라벨링된 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항체는 형광성, 발광성 또는 방사성 라벨을 갖는 항-인간 글로불린 항체와 접촉시켜 라벨링되는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    활성화된 혈청 보체 분획은 형광성, 발광성 또는 방사성 라벨을 갖는 항-혈청 보체 분획 항체와 접촉시켜 라벨링되는 것인 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 전체 혈액, 혈장, 혈청, 혈액세포 펠렛 및 기타 혈액 제제로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 항체에 의해 생체내 감작되거나 또는 항체 보체 분획으로 코팅된 적혈구를 갖는 개체에서 유래한 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 확인된 항체를 정량하는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 생물학적 샘플 내에서 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 대한 복수의 항체를 확인하기 위해 제1항 또는 제2항에 따른 방법을 실행하기 위한 시약 세트로서,
    상기 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자는 HLA 시스템의 분자, 포스파티딜세린, 개체에 의해 흡수된 화학제품 또는 의약품, 또는 이의 분해산물이고;
    상기 시약 세트는 하나 이상의 검출가능한 특정 물리적 파라미터 및 적혈구를 갖는 구별가능한 비드를 포함하는 것;인 시약 세트.
  15. 제1항 또는 제2항에 따른 검출 방법을 실행하기 위한 시약 세트로서,
    상기 시약 세트는 각각 하나 이상의 검출가능한 특정 물리적 파라미터를 가지며 두개 이상의 상이한 그룹에 속하는 구별가능한 비드 그룹들을 포함하며; 이들 그룹 중 하나는 적혈구에 의해 운반되는 항원성 분자에 특이적인 포획 항체를 가지며; 다른 그룹은 적혈구를 갖는 것;인 시약 세트.
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