JP6746059B2 - 血液分析の系および方法 - Google Patents
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Description
試料内の物質に結合し得る結合剤が固定された基板表面に試料を供するステップ、
結合剤が固定された基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップ、ならびに
基板上に固定された結合剤に結合した物質を検出したことに応答して、試料内に存在する物質を同定するステップ、
および基板上に固定された結合剤に結合した物質を検出しなかったことに応答して、物質が試料内に存在しないと判定するステップ
を含み、基板表面に試料を供するステップが、基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップと同時である、方法。
試料を基板上に同時に分配し、基板から未結合材料を除去するように構成されたディスペンサー、および
結合剤に結合した物質の有無を検出するように構成された検出器
を含む系。
結合剤が固定された基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップであって、基板表面にドナー赤血球を供するステップが、基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップと同時である、ステップ、
患者の血漿をドナー赤血球の上に載せるステップ、および
患者の血漿の未結合部分を除去するステップであって、患者の血漿を載せるステップが、患者の血漿の未結合部分を除去するステップと同時である、ステップ、
ドナー赤血球に結合した抗体を検出したことに応答して、抗体が患者の血漿内に存在すると判定するステップ、および
ドナーの赤血球に結合した抗体を検出しなかったことに応答して、抗体が患者の血漿内に存在しないと判定するステップ、
を含む、クロスマッチングの方法。
ドナー赤血球または患者の血漿を基板に同時に分配し、未結合のドナーRBCまたは患者の血漿の未結合部分を基板から除去するように構成されたディスペンサー、および
ドナー赤血球に結合した抗体の有無を検出するように構成された検出器
を含む、クロスマッチングのための系。
血液型を構成する赤血球膜抗原の全ての抗原変異体のうち、抗原A、B、およびHを有するABO系、特に抗原D(D抗原が存在しない場合はdと示される)、C、E、c、およびeを有するRhesus(RH)系、特に2つの抗原Kおよびkを有するKell(KEL)系、特に抗原FyaおよびFybを有するDuffy(FY)系、特に抗原JkaおよびJkbを有するKidd(JK)系、または、MNS系、Lewis(LE)系などの、あまり一般的に実施調査されていない他の系などの、30を超える赤血球抗原系がこれまでにヒトにおいて同定されている。
(i)典型的(または通常)と言われ、ABO系の抗原に対する抗体(例えば、B型の個体における抗A抗体)。
(ii)血清または血漿におけるその存在が偶然のものであり、より具体的には非ABO系抗原に対するものである、典型的ではない(または免疫)と言われる抗体。
「典型的な」または「通常の」抗体は、赤血球をインビトロで凝集させ得るMおよび/またはAアイソタイプの免疫グロブリンであることが、より多い。「典型的ではない」または「不規則な」または「免疫」抗体は、最も一般的には、例えば、輸血の間の、または母親の血液型に属さない胎児赤血球抗原に対する母親の免疫反応に起因する妊娠中の、特に出産時の、1つまたは複数の抗原に対する免疫化の後、外来赤血球による抗原刺激がある場合に現れるGアイソタイプのものである。
− フォワードグループ判定では、個体の赤血球を、ABO系の抗原に対する正確な抗体特異性をそれぞれが有する試験抗体(抗A、抗B、および抗AB抗体)と接触させる。
− リバースグループ判定では、典型的な循環抗体を含有する個体の血清または血漿を、ABO系の正確な抗原型にそれぞれが属する表現型判定された赤血球と接触させる。
図1を参照すると、血液を分析するための系100が示されている。一実施形態において、系100は、表現型判定(抗原型判定としても知られている)、抗体のスクリーニングおよび同定、または患者血漿とドナー赤血球とのクロスマッチングに用いられる。系100は、基板102、ディスペンサー104(例えばマイクロ流体プローブ)、光源106、および検出器108を含む。
系100は、抗原型判定、抗体のスクリーニング/同定、抗原型判定とクロスマッチングとの組み合わせを行うために使用することができる。さらに、系100は、グループ判定および表現型判定の検出、抗体のスクリーニングおよび/または同定、クロスマッチング、ならびに直接抗グロブリン試験に使用することができる。
[実施例]
[実施例1]
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体によって、ドナーまたは患者の赤血球の表面に存在する血液型抗原(血液型ABO、RH、Kell、Duffy、Kidd、Lewisなど)を同定することである。
この実施例において、結合剤110は抗赤血球抗体である。基板102の表面は、ポリスチレン96ウェル平底プレートである。抗体を、インクジェットプリンターまたはコンタクトプリンターを用いて、ウェルの底上のスポットとして載せる。各ウェルは、各抗体特異性の少なくとも1つのスポットを含有する。この実施例において、抗体を、PBS緩衝液(pH7.4)内に10から500μg/mLの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によって基板102の表面に結合させる。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAを補ったPBSと接触させることによって飽和させ、その後、空気乾燥する。
− 抗A IgMクローン15750F7(Bio−Rad)
− 抗D IgGクローンBRAD3(IBGRL)
− 抗K1 IgGクローンMID11G4(Bio−Rad)
本技術に従ったグループ判定の実現可能性を実証し、特異性を検証するために、各スポットを個別に試験する。適切な緩衝液(処理液)を、ウェル表面全体を覆うようにウェル内に分配する。マイクロ流体プローブを次いで抗体スポットの上に位置させる。第1のステップにおいて、RBCまたは全血の懸濁液をスポットの上に流して、RBCおよび抗体を接触させる。第2のステップにおいて、流れを洗浄緩衝液に切り替えて、未結合のRBCを除去する。最後に、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を視覚的にまたは分光光度的に検出する。
[実施例2]
本発明の技術を使用する抗体のスクリーニングおよび同定の可能性を実証するために、基板102の表面を、ポリ−L−リジン(PLL)を介して非変性または溶血表現型の赤血球を固定するために用いる。この適用では、マイクロ流体プローブ200は、加熱および連続的化学を行うように設計されている。プローブを、患者の血漿、血清、または全血試料を載せるため、非特異的抗体を除去するため、および標識された抗Fc抗体コンジュゲートを分配して結合抗体を検出するために使用する。
2.1.1.PLLでの基板102の表面の感作
この実施例において、基板102の表面は、ポリスチレン96ウェル平底プレートである。PBS(pH7.4)内の25μg/mlの分子量7万〜13万のPLLを各ウェルに分配し、18時間、周囲温度でインキュベートする。このステップの最後に、ウェルを、0.05%Tween−20を補ったPBS(pH7.4)内で洗浄し、次いで、細胞を固定するために使用する。
この実施例において、結合剤110は、非変性または溶血表現型の赤血球である。細胞を、インクジェットプリンターまたはコンタクトプリンターを用いて、PLLで被覆したウェル底上のスポットとして載せる。各ウェルは、各表現型の少なくとも1つのスポットを含有する。この実施例において、防腐成分を補った、緩衝液内で20から50%の細胞懸濁液。載せた後、基板を洗浄して未結合の細胞を除去し、次いで、試料成分および細胞防腐剤の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAおよび1Mデキストロースを補ったPBSと接触させることによって飽和させる。一晩インキュベーションした後、飽和緩衝液を除去し、表面を空気乾燥する。
各細胞スポットを個別に試験する。適切な緩衝液(処理液)を、ウェル表面全体を覆うようにウェル内に分配する。マイクロ流体プローブを次いでスポットの上に位置させる。第1のステップにおいて、患者の血漿、血清、または全血をスポットの上に流して、試料およびRBCを接触させる。プローブは、反応区域を37℃に加熱するようにセットアップする。第2のステップにおいて、連続的なプロセスを適用する:非特異的抗体を除去するための洗浄、標識された抗Fc抗体コンジュゲートの分配、および未結合の標識された抗グロブリン抗体を除去するための最終洗浄。最後に、非変性または溶血表現型の赤血球に付着した抗体の有無を、発色、蛍光、または発光によって検出する。
[実施例3]
本発明の技術を使用するクロスマッチングを行う可能性を実証するために、マイクロ流体プローブ200を、ポリ−L−リジン(PLL)を介するドナー赤血球の固定から最終的な反応検出までの全てのステップを行うために用いる。このマイクロ流体プローブ200は、加熱および連続的化学を行うように設計されている。プローブはまた、患者の血漿、血清、または全血試料を載せるため、および非特異的抗体を除去するために使用する。標識された抗Fc抗体コンジュゲートを用いて、結合した抗体を検出する。
3.1.1.PLLでの基板102の表面の感作
この実施例において、基板102の表面は、ポリスチレン96ウェル平底プレートである。PBS(pH7.4)内の25μg/mlの分子量7万〜13万のPLLを各ウェルに分配し、18時間、周囲温度でインキュベートする。このステップの最後に、ウェルを、0.05%Tween−20を補ったPBS(pH7.4)内で洗浄し、次いで、細胞を固定するために使用する。
適切な緩衝液(処理液)を、ウェル表面全体を覆うように、PLLで被覆したウェル内に分配する。マイクロ流体プローブ200を次いで表面の上に位置させ、以下の連続的なプロセスを適用する:事前に洗浄したドナー赤血球を載せること、未結合の細胞を除去するための洗浄ステップ、患者の血漿、血清、または全血を37℃で流すこと、非特異的抗体を除去するための洗浄、標識された抗Fc抗体コンジュゲートの分配、および未結合の標識された抗グロブリン抗体を除去するための最終的な洗浄。最後に、ドナー赤血球に付着した抗体の有無を、発色、蛍光、または発光によって検出する。
[実施例4]
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体によって、インビボで感作されたRBCに被覆されたIgGおよび/またはC3d補体画分を同定することである。
この実施例において、結合剤110は、抗IgGおよび抗C3d抗体である。基板102の表面は、ポリスチレン96ウェル平底プレートである。抗体を、インクジェットプリンターまたはコンタクトプリンターを用いて、ウェル底上のスポットとして載せる。各ウェルは、各抗体特異性の少なくとも1つのスポットを含有する。この実施例において、抗体を、PBS緩衝液(pH7.4)内に10から500μg/mLの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によって基板102の表面に結合させる。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAを補ったPBSと接触させることによって飽和させて、その後、空気乾燥する。
− ポリクローナルウサギ抗ヒトIgG(Bio−Rad)
− 抗C3d IgGクローン053A714(Bio−Rad)
試験の実現可能性を実証し、特異性を検証するために、反応を一体的な様式で行う。このケースにおいて、各スポットを個別に試験する。適切な緩衝液(処理液)を、ウェル表面全体を覆うようにウェル内に分配する。マイクロ流体プローブを次いで抗体スポットの上に位置させる。第1のステップにおいて、RBCの懸濁液をスポットの上に流して、RBCおよび抗体を接触させる。第2のステップにおいて、流れを洗浄緩衝液に切り替えて、未結合のRBCを除去する。最後に、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を視覚的にまたは分光光度的に検出する。
[実施例5]
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いることによって、ドナーまたは患者の赤血球の表面に存在する血液型抗原(血液型ABO、RH、Kell、Duffy、Kidd、Lewisなど)を同定することである。
材料
この実施例において、結合剤は抗赤血球抗体であり、特に、マウスIgM抗A mAb(Bio−Radクローン15750F7)であった。この実験および全てのその後の実験では、基板はポリスチレンスライド(TED PELLA,INC.、製品番号260225)であった。抗体を、インクジェットプリンターを用いて、スライド上のスポットの列として載せた。各スポットを、X、Y座標によって明らかに同定した。スポットのサイズは約250μmの直径であった。スポットを互いにアラインし、約50〜60μm離した。精製した抗A IgM抗体をPBS緩衝液(pH7.4)内に10から500μg/mLの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によって基板102の表面に結合させた。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、PBS内の1%BSAで処理した。こうして調製されたスライドを空気乾燥し、使用するまで4℃で保存した。この実施例およびその後の実施例で使用したマイクロ流体プローブは、100μm×100μmの寸法をそれぞれ有する4つのチャネルを有するプローブであった。適切な流体力学的流動閉じ込めを得るために、チャネル2を用いて試料を分配し、チャネル1および3を用いて試料を吸引した。異なる表現型(A陽性およびO陽性赤血球)を有する赤血球懸濁液を試料として用いた。
本技術に従ったグループ判定の実現可能性を実証し、特異性および再現性を検証するために、各スポットを同一の赤血球溶液(例えば、2つのA陽性赤血球および2つのA陰性赤血球(O赤血球))を用いて次々に試験した。この実施例において、赤血球を0.9%等張生理食塩水で洗浄し、生理食塩水内に50%で懸濁した。マイクロ流体プローブのチャネル2を用いて、2μlの希釈した赤血球懸濁液を1.6μl/分で吸引した。スライドを湿らせるために、十分な緩衝液(処理液)を、表面全体を覆うようにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブを次いでスライドの上に位置させ、流体力学的流動閉じ込めを次いでセットアップした。流体力学的流動閉じ込めが安定したら、マイクロ流体プローブの動きを、0.02mm/秒の速度で動くように、かつアラインされたスポットを通る直線をなぞるようにプログラムした。プローブが動く間、分配された赤血球は、飽和した基板102の表面と接触するか、またはスポットされた抗体と接触していた。正確な抗原特異性を有する赤血球は、固定された抗体にすぐに結合した。細胞および緩衝処理流体の連続的に載せ吸引したため、未結合の赤血球を赤血球の結合と同時に除去した。赤血球を載せ/吸引した後、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を、カメラ画像キャプチャによって検出した。基板上の各スポットの位置を知ることで、抗原が試験対象の赤血球の表面に存在しているかを確認すること、ひいては、試験対象の赤血球の血液型特異性を同定することが可能となった。
この実施例において、同一の赤血球アリコート(したがって試料が少ない)を用いて、固定されたマウスIgM抗Aモノクローナル抗体(mAb)および固定されたヒトIgG抗D mAbと別々に反応させた。
結合剤は、抗赤血球抗体:マウスIgM抗A(クローン157 50 F7)およびヒトIgG抗D mAb(クローンBrad3)であった。抗体を、ポリスチレンスライド上のスポットとして手動で載せた。各スポットを、X、Y座標によって明らかに同定した。このケースにおいて、スポットのサイズは約1.5mmの直径であった。同一の抗体特異性を有するスポットを互いにアラインし、互いに約200μm離した。用いた抗体は精製されており、PBS緩衝液(pH7.4)内に10から500μg/mLの範囲の濃度で希釈されていた。希釈した抗体を受動吸収によって基板表面に結合させた。抗体を表面上に載せた後、基板を、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAを補ったPBSで飽和させた。スライドを空気乾燥し、使用するまで4℃で保存した。適切な閉じ込めを得るために用いた条件は、以下の通りである:チャネル1:吸引、チャネル2:分配、およびチャネル3:吸引。異なるAおよびD表現型(A+、A−、O+、およびO−)を有する赤血球懸濁液を試料として用いた。
マイクロ流体プローブ技術を用いるグループ判定/表現型判定の実現可能性を実証し、特異性を検証するために、各スポットを同一の赤血球溶液を用いて次々に試験した。この実施例において、赤血球をまず0.9%等張生理食塩水で洗浄し、生理食塩水内に50%で懸濁した。1.5μlの赤血球懸濁液を1.5μl/分で吸引した。スライドを湿らせるために、十分なPBS緩衝液(処理液)を、表面全体を覆うようにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブをスライドの上に位置させ、流体力学的流動閉じ込めを次いでセットアップした。流体力学的流動閉じ込めが安定したら、X軸またはY軸に従うマイクロ流体プローブの動きを、アラインされたスポットを通る直線を描くように、0.02mm/秒でプログラムした。プローブが動く間、分配された赤血球は、飽和した基板表面と接触するか、またはスポットされた抗体の1つと接触していた。正確な抗原特異性を有する赤血球は、固定された抗体にすぐに結合した。細胞および緩衝処理流体の連続的に載せ吸引したため、未結合の赤血球を赤血球の結合と同時に除去した。赤血球を載せ/吸引した後、スポットした抗体に付着した赤血球の有無を、カメラ画像キャプチャによって検出した。基板上の各特異的抗体の位置を知ることで、抗原が試験対象の赤血球の表面に存在しているかを同定すること、ひいては、試験対象の赤血球の血液型特異性を同定することが可能となった。
[実施例6]
この分析の目的は、特異的モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いることによって、インビボで感作された赤血球に吸着されたヒトIgGおよび/またはC3d補体画分を同定することであった。
この実施例において、結合剤は抗ヒトグロブリン抗体(マウスIgG mAb)であった。ポリスチレンスライドの表面全体を、抗体を用いて手動で官能化した。精製した抗体をPBS緩衝液(pH7.4)内に10から500μg/mLの範囲の濃度で希釈し、受動吸収によってポリスチレンスライドの表面に結合させた。抗体をスライドの表面上に載せた後、スライドを、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAを補ったPBSと接触させることによって飽和させた。これらのスライドを乾燥させ、使用するまで4℃で保存した。適切な閉じ込めを得るために用いた条件は、以下の通りである:チャネル1:吸引、チャネル2:分配、およびチャネル3:吸引。感作された赤血球懸濁液および非変性の赤血球懸濁液を試料として用いた。
インビボで感作された赤血球を模倣するために、ヒト抗D IgGを用いて赤血球を感作した。0.9%等張生理食塩水で洗浄したD陽性赤血球を、生理食塩水内に2%で懸濁した。並行して、20μg/mlのヒト抗D mAb溶液を調製した。洗浄したD陽性RBC溶液をヒト抗D mAb溶液と混合し、45分、37℃でインキュベートした。未結合の抗体を除去するために、抗D感作されたRBCを0.9%等張生理食塩水で洗浄し、10%で懸濁した。抗D感作されたRBCを直接クームスカード(IgG+C3d)で試験し、強力な陽性反応を得た。2μlの感作されたRBC懸濁液を次いで、マイクロ流体プローブのチャネル2を用いて1.8μl/分で吸引した。スライドの表面全体をPBSで湿らせた。プローブを次いでスライドの上に位置させた。マイクロ流体プローブの流動閉じ込めが安定した後、マイクロ流体プローブを、X軸に沿った直線を速度0.02mm/秒でなぞるようにプログラムした。
[実施例7A]
典型的ではない抗赤血球抗体のスクリーニングは、ドナーとレシピエントとの間の適合性の輸血を可能にするために必要である。目的は、レシピエントの血漿が、輸血されなくてはならないドナー赤血球に対する抗体を含有していないことを検証することである。スクリーニングは、表面上の血液型抗原の分布によって特徴付けされるいくつかの赤血球を用いる必要がある。このようなスクリーニングは以下の通りである:表現型が分かっている赤血球を試験対象の血清または血漿試料とインキュベートする。存在する場合、特異的抗体は赤血球の表面に結合し、抗ヒトグロブリン抗体を含有する試薬で検出される。様々な抗原を有するまたは有さない赤血球のパネルを用いることによって、試料内に存在する抗体の特異性を判定することが可能である。本発明の技術を使用する抗体のスクリーニングおよび同定の可能性を実証するために、基板表面を、ユニバーサル抗体を介して非変性または溶血表現型の赤血球を固定するために用いた。マイクロ流体プローブを次いで、抗Dモノクローナル抗体を分配するために用いて、患者の血漿を模倣した。抗Dモノクローナル抗体を分配している間、プローブは、非特異的に結合した材料を同時に除去した。プローブはまた、10μg/mlのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリン抗体(二次抗体)を分配して、結合した抗Dモノクローナル抗体を検出するために用いた。
この実施例において、ポリスチレンスライドの表面全体を、ユニバーサル抗赤血球抗体を用いて手動で官能化した。用いた抗赤血球抗体を精製し、PBS緩衝液(pH7.4)内に100μg/mLの濃度で希釈し、受動吸収によってスライドの表面に結合させた。スライドを次いで、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAを補ったPBSと接触させることによって飽和させた。空気乾燥の後、スライドを使用するまで4℃で保存した。表現型判定された赤血球を0.9%等張生理食塩水で洗浄し、次いで、0.5%で懸濁した。この赤血球懸濁液を次いで、20分間、37℃で、湿潤室内で、スライドとインキュベートした。次いで、スライドを0.9%等張生理食塩水で洗浄して、未結合の赤血球を除去した。マイクロ流体プローブを次いで、低イオン強度緩衝液内に希釈した4μg/mlのモノクローナル抗D mAb(一次抗体)および10μg/mlのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンmAb(二次抗体)の試料混合物を載せるために用いた。試料混合物は何らかの標識がないと検出不可能であったため、マイクロ流体プローブは二重の流動閉じ込めモードでランし、このことは、試料混合物が、それ自体が浸水液(PBS)内に閉じ込められている別の形状の液体の内部に入れ子状になっていたことを意味する。このケースにおいて、第2の閉じ込めは可視的なフルオレセイン溶液で行い、試料混合物の適切な閉じ込めを保証した。マイクロ流体プローブを用いて、試料混合物はチャネル2で分配し、チャネル3で吸引し、フルオレセイン溶液はチャネル1で分配し、チャネル4で吸引した。
モノクローナル抗D mAbと10μg/mlのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンmAbとの混合物(3μl)を、マイクロ流体プローブのチャネル2を用いて3.5μl/分で吸引した。適切な量のPBS緩衝液(処理液)を分配して、スライドの表面全体を湿らせた。マイクロ流体プローブを次いでスライドの上に位置させ、二重の流動閉じ込めモードをセットアップした。二重の流動閉じ込めが安定した後、プローブを、30秒から180秒の間、同一の位置に留まるようにセットアップした。試料の供給および未結合材料の除去は同時であった。抗ヒトグロブリンmAbによって標識され、非変性の赤血球に付着した抗体の有無を、蛍光マイクロアレイ分析器SensoSpot(Sensovation AG、Radolfzell、GE)で蛍光を読み取ることによって検出した。
[実施例7B]
この分析の目的は、血液試料におけるAおよび/またはB血液型抗原に対する天然の抗体の有無を示すことであった。この分析の結果は、直接試験で得られた結果と組み合わせると、試料のABO血液型の確立を可能にする。リバースABOグループ判定試験において用いられる試料は、血清、血漿、または全血試料であり得る。本発明の技術を使用するリバースABOグループ判定の可能性を実証するために、基板表面を、ユニバーサル抗体を介して非変性表現型の赤血球を固定するために用いた。この適用では、マイクロ流体プローブを、患者の血漿血清を載せ、未結合材料を除去するために用いた。
先の実施例にあるように、ポリスチレンスライド全体の表面をユニバーサル抗赤血球抗体で完全に官能化した。ユニバーサル抗赤血球抗体をスライド表面上に載せた後、スライドを、試料の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAを補ったPBSと接触させることによって飽和させた。これらのスライドを空気乾燥し、使用するまで4℃で保存した。表現型判定されたA陽性赤血球を0.9%等張生理食塩水で洗浄し、懸濁して最終濃度0.5%とした。この赤血球懸濁液を次いで、20分、37℃で、湿潤室内で、スライドとインキュベートした。次に、スライドを0.9%等張生理食塩水で洗浄して、未結合の赤血球を除去した。マイクロ流体プローブを次いで、B血液型の人の血漿を載せるために用いた。血漿は何らかの標識がないと検出不可能であったため、先の実施例におけるように、マイクロ流体プローブをここでも二重の流動閉じ込めモードで用いた。
血漿試料をマイクロ流体プローブのチャネル2を用いて3.2μl/分で吸引した。適切な緩衝液(処理液)を、表面全体を湿潤させるためにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブをスライドの上に位置させ、二重の流動閉じ込めモードを次いでセットアップした。二重の流動閉じ込めが安定したら、プローブを、30秒から180秒の間、同一の位置に留まるようにセットアップした。ここでも、試料の供給および未結合材料の除去は同時に生じた。スライドを次いで、15分、37℃で、10μg/mlのフィコエリトリン標識された抗ヒトH+L Abと浴内でインキュベートした。抗ヒトH+L Abによって標識され、非変性の赤血球に結合した血漿抗体の有無を、蛍光マイクロアレイ分析器SensoSpot(Sensovation AG、Radolfzell、GE)で蛍光を読み取ることによって検出した。
[実施例8]
この分析の一目的は、ドナーからレシピエントへの1つまたは複数の血球濃縮物の輸血の背景において、完全なドナー−レシピエント適合性があることを確実にすることであった。別の目的は、ドナーの赤血球によって運ばれる血液型構造に対するレシピエント血漿内の抗体の存在に関連する不適合性を実証することであった。マイクロ流体プローブを、ユニバーサル抗体を介してドナー赤血球を固定し、患者の血漿を載せ、かつ非特異的に結合した患者の血漿材料を除去するために用いた。赤血球に結合した血漿抗体の有無の検出を、標識された抗ヒトグロブリンAbで行った。
ポリスチレンスライド全体の表面を、実施例7Aにおけるように、ユニバーサル抗赤血球抗体で完全に官能化した。ユニバーサル抗赤血球抗体をスライド表面上に載せた後、スライドを、試料成分の非特異的な結合を防ぐために、1%BSAを補ったPBSと接触させることによって飽和させた。スライドを空気乾燥し、使用するまで4℃で保存した。A+ドナー赤血球を0.9%等張生理食塩水で洗浄し、50%の濃度で懸濁した。A+ドナーRBCを分配するために、マイクロ流体プローブを流体力学的流動閉じ込めモードで以下のように操作した:チャネル1:吸引、チャネル2:分配、およびチャネル3:吸引。次いで、二重の閉じ込めモードを用いて、A+またはO+患者血漿を以下のように分配した:血漿はチャネル2で分配し、チャネル3で吸引し、フルオレセイン溶液はチャネル1で分配し、チャネル4で吸引した。
この実施例において、2.5μlのA+ドナー赤血球懸濁液(50%の希釈懸濁液)を、マイクロ流体プローブを用いて1.5μl/分で吸引した。PBS緩衝液(処理液)を、表面全体を湿潤させるためにスライド上に分配した。マイクロ流体プローブを次いでスライドの上に位置させ、流動閉じ込めを次いでセットアップした。流動閉じ込めが安定したら、マイクロ流体プローブの動きを、X軸に沿った直線を描くように0.03mm/秒でプログラムした。線の長さは約12mmであった。プローブが動く間、A+ドナーの赤血球は、スライド表面に結合したユニバーサル抗赤血球抗体にすぐに結合した。連続的な流れのため、赤血球が分配されると、未結合の赤血球は同時に除去された。マイクロ流体プローブを次いで、A+またはO+患者の血漿を先に記載したように二重の流動閉じ込めモードで載せるために用いた。マイクロ流体プローブを用いて、2μlの血漿を3μl/分で吸引した。マイクロ流体プローブを、A+血漿では60秒、O+血漿では30または60秒、同一の位置に留まるようにセットアップした。事前に供されたRBCへの血漿の供給と同時に、未結合材料をプローブで除去した。スライドを次いで、15分、37℃で、10μg/mlのフィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンAbと浴内でインキュベートした。最後に、フィコエリトリン標識された抗ヒトグロブリンAbによって標識され、非変性の赤血球に結合した抗体の有無を、蛍光マイクロアレイ分析器SensoSpot(Sensovation AG、Radolfzell、GE)で蛍光を読み取ることによって検出した。
102 基板
104 ディスペンサー
106 光源
108 検出器
110 ADC、結合剤
112 マイクロプロセッサ
114 ディスプレイ
116 メモリ
200 マイクロ流体プローブ
210 被覆層
211 バイアス
212 バイアス
220 基底層
221 開口部
222 開口部
223 処理液マイクロチャネル
223’ 溝
224 処理液マイクロチャネル
224’ 溝
310 エッジ
311 通路
320 正面
321 開口部
322 開口部
323 浸水液マイクロチャネル
324 浸水液マイクロチャネル
600 マイクロ流体プローブ
602 マイクロチャネル
604 マイクロチャネル
700 マイクロ流体プローブ
702 マイクロチャネル
704 開口部
706 毛細管
708 開口部
800 方法
900 プローブアレイ
1100 マイクロ流体プローブ
1200 クロスマッチング方法
Claims (37)
- 試料内の物質の有無を判定する方法であって、前記方法が、
前記試料内の物質に結合し得る結合剤が固定された基板表面に前記試料を供するステップ、
結合剤が固定された前記基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップ、ならびに
前記基板上に固定された前記結合剤に結合した物質を検出したことに応答して、前記試料内に存在する前記物質を同定するステップ、および
前記基板上に固定された前記結合剤に結合した物質を検出しなかったことに応答して、前記物質が前記試料内に存在しないと判定するステップ
を含み、
前記基板表面に前記試料を供するステップが、前記基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップと同時であり、
前記基板表面に前記試料を供するステップおよび前記基板の少なくとも一部分から未結合材料を除去するステップが、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーで行われ、
前記ディスペンサーが、複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、方法。 - 前記ディスペンサーが、前記マイクロ流体プローブのアレイである、請求項1に記載の方法。
- 前記マイクロチャネルは、赤血球をサイズに基づいて排除する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記マイクロチャネルが、6マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記マイクロチャネルが、4マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記マイクロチャネルが、2マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記マイクロチャネルの直径が、1〜2マイクロメートルの直径を有する断面を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記基板表面が湿っている、請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基板表面に試料を供するステップが、1つまたは複数の試料を少なくとも1つの別々のパスにそれぞれ分配するステップを含む、請求項1から6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記パスが直線である、請求項9に記載の方法。
- 前記パスが25ナノメートルから500マイクロメートルの幅である、請求項9または10に記載の方法。
- 前記基板表面に試料を供するステップが、1つまたは複数の試料を少なくとも1つの別々のスポットにそれぞれ分配するステップを含む、請求項1から11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が血液試料を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記試料が、全血、赤血球、血漿、血清、および唾液からなる群から選択される成分を含む、請求項1から12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が、赤血球の表面に結合した抗原に対する1つまたは複数の抗体を含む、請求項1から14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が、1つまたは複数の非変性または溶血表現型の赤血球を含む、請求項1から15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が、1つまたは複数の組換え抗原を含む、請求項1から16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が、赤血球抗原に対する1つまたは複数の抗体、および1つまたは複数の非変性または溶血表現型の赤血球を含む、請求項1から17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が別々の線上に固定されている、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が別々のスポットに固定されている、請求項1から18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合剤が1〜50の結合剤である、請求項1から20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記物質が、赤血球抗原に対する1つまたは複数の抗体を含む、請求項1から21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記物質が、1つまたは複数の赤血球抗原を含む、請求項1から22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記基板が、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、デキストランポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、金属および金属酸化物、ならびにポリマー官能化された金属および金属酸化物、PVDF、ニトロセルロース、ナイロン、ならびにポリスルホンからなる群から選択される少なくとも1つの材料で形成される、請求項1から23のいずれか1項に記載の方法。
- 試料内の物質に結合し得る結合剤が別々の場所に固定された基板と、
前記試料を前記基板上に分配しつつ同時に前記基板から未結合材料を除去するように構成された流体力学的流動閉じ込めディスペンサーであって、前記ディスペンサーは複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、前記ディスペンサーと、
前記基板を照らすように構成された光源と、
前記結合剤に結合した前記物質の有無を検出するように構成された検出器と
を含む系。 - 前記ディスペンサーが、前記マイクロ流体プローブのアレイである、請求項25に記載の系。
- 前記マイクロチャネルは、赤血球をサイズに基づいて排除する、請求項25または26に記載の系。
- 前記マイクロチャネルが、6マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項27に記載の系。
- 前記マイクロチャネルが、4マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項27に記載の系。
- 前記マイクロチャネルが、2マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項27に記載の系。
- 前記マイクロチャネルの直径が、1〜2マイクロメートル未満の直径を有する断面を含む、請求項27に記載の系。
- 前記基板が、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリスチレン、デキストランポリマー、デンドリマー、オリゴヌクレオチド、ポリカーボネート、プラスチック、ガラス、シリコン、酸化シリコン、金属および金属酸化物、ならびにポリマー官能化された金属および金属酸化物、PVDF、ニトロセルロース、ナイロン、ならびにポリスルホンからなる群から選択される少なくとも1つの材料で形成される、請求項25から31のいずれか1項に記載の系。
- ドナーの赤血球に結合し得る結合剤が固定された基板表面にドナーの赤血球を供するステップ、
結合剤が固定された前記基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップであって、前記基板表面に前記ドナー赤血球を供するステップが、前記基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップと同時である、ステップ、
患者の血漿を前記ドナー赤血球の上に載せるステップ、
患者の前記血漿の未結合部分を除去するステップであって、患者の血漿を載せるステップが、患者の前記血漿の未結合部分を除去するステップと同時である、ステップ、
前記ドナー赤血球に結合した抗体を検出したことに応答して、前記抗体が患者の前記血漿内に存在すると判定するステップ、および
前記ドナーの赤血球に結合した抗体を検出しなかったことに応答して、前記抗体が患者の前記血漿内に存在しないと判定するステップ、
を含む、クロスマッチングの方法であって、
前記基板表面に前記ドナー赤血球を供するステップと前記基板の少なくとも一部分から未結合のドナー赤血球を除去するステップは、流体力学的流動閉じ込めディスペンサーで行われ、
前記ディスペンサーは複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、前記方法。 - ドナーの赤血球を供するステップ、未結合のドナー赤血球を除去するステップ、患者の血漿を載せるステップ、および患者の血漿の未結合部分を除去するステップが、マイクロ流体プローブで行われる、請求項33に記載の方法。
- 前記ドナー赤血球が非変性または溶血表現型の赤血球である、請求項33または34に記載の方法。
- 前記結合剤が、結合型レクチンまたはユニバーサル抗赤血球抗体を含む、請求項33から35のいずれか1項に記載の方法。
- ドナー赤血球が別々の場所に固定された基板と、
ドナー赤血球または患者の血漿を前記基板上に分配しつつ同時に未結合のドナーRBCまたは患者の前記血漿の未結合部分を前記基板から除去するように構成された流体力学的流動閉じ込めディスペンサーであって、前記ディスペンサーは複数のマイクロチャネルを有するマイクロ流体プローブである、前記ディスペンサーと、
前記基板を照らすように構成された光源と、
前記ドナー赤血球に結合した抗体の有無を検出するように構成された検出器と
を含む、クロスマッチングのための系。
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