CN107666961B - 血液分析系统和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了血液分型系统和方法。在一个实施方案中，所述方法可以通过以下方式实现：向在其上固定有一种或多种结合试剂的基底的表面施加样品，其中一种或多种结合试剂能够与样品中的一种或多种物质结合；从所述固定有结合试剂的基底的至少一部分中基本上移除未结合的材料；和检测与在基底上固定的一种或多种结合试剂结合的物质；其中所述向所述基底的表面施加所述样品的步骤与所述从所述基底的至少一部分中移除未结合的材料的步骤是同时的。还描述并且说明了系统和其他方法。

Description

血液分析系统和方法
技术领域
本公开总体上涉及患者样品如血液样品的分析。
背景
每年有数百万人献血。在可以将来自供体的血液向接受者输血之前，必须对血液进行分型。典型地，测试血液的ABO和RH1(恒河猴(Rhesus)D抗原)血型并且筛选具有临床显著性(clinical significance)的同种异体免疫抗体。为了确定血型，使红细胞(RBC或红血球(erythrocyte))分别与抗A、抗B、抗AB和抗D抗体反应。这种类型的试验被称为抗原分型(typing)(例如，分类(grouping)和表型确定(phenotyping))。还用代表大多数具有临床显著性的抗原的A型和型B试剂RBC和至少两种不同的O型试剂细胞单独测试了来自相同血液样品的血清/血浆。利用A型和B型试剂RBC的试验类型被称为反向分型(reverse typing)并且利用O型试剂细胞的试验类型被称为抗体筛选。
每年在血液中心中进行多于1.5亿次检测以确定血型以及血清/血浆中的具有临床显著性的抗体。通常，在紧急情况下需要输血，为此需要在尽可能短的时间内确定供体和接受者之间的相容性。因此需要可以一次测试多个样品并且可以提供快速试验结果的自动化高通量血液分型的系统和方法。此外，需要较少的来自患者的血液样品也是希望的。
概述
在一个实施方案中，公开了其中确定在样品中物质存在或不存在的方法。所述方法包括向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加样品，其中结合试剂能够与样品中的物质结合；从固定有结合试剂的基底的至少一部分中移除未结合的材料；和对应于检测到与在基底上固定的结合试剂结合的物质，确定在样品中存在该物质；并且对应于未检测到与在基底上固定的结合试剂结合的物质，确定在样品中不存在该物质；其中向基底的表面施加样品的步骤与从基底的至少一部分中移除未结合的材料的步骤是同时的。可以用流体动力流限制分配器(hydrodynamic flow confinement dispenser)进行向基底的表面施加样品的步骤和从基底的至少一部分中移除未结合的材料的步骤。在一个实施方案中，流体动力流限制分配器是微流体探针。在一个实施方案中，流体动力流限制分配器是具有多个微通道的微流体探针。在另一个实施方案中，流体动力流限制分配器是微流体探针阵列。
在一些实施方案中，用于确定在样品中物质存在或不存在的系统包括在分离(discreet)位置固定有结合试剂的基底，其中结合试剂能够与样品中的物质结合；配置成同时将样品分配至基底上并且从基底中移除未结合的材料的分配器；配置成照射基底的光源；和配置成检测与结合试剂结合的物质存在或不存在的检测器。
在本文中还公开了使用这些系统分析血液样品的血液分析系统和方法。更具体地，本公开涉及用于检测红细胞类型和表型(抗原分型)、用于筛选和鉴别典型的抗红细胞抗体(反向分型)和非典型的抗红细胞抗体(抗体筛选)、用于确定供体和接受者之间的相容性(交叉匹配(cross-matching))以及用于证明红细胞包被有抗体和/或包被有活化的血清补体级分(例如，直接抗球蛋白试验(Direct Antiglobulin Test))的系统和方法。
在一些实施方案中，流体动力流限制分配器包括用于将全血样品中血浆与红细胞分离的结构。在用于将红细胞与血浆分离的实施方案中，微通道具有小于6微米的直径。在一些实施方案中，直径小于4微米或小于2微米或1-2微米。微通道的横截面可以是任何适合的形状，包括矩形、正方形、圆形、卵形和椭圆形或它们的组合。
在一些实施方案中，基底的表面是湿的。在一个实施方案中，向基底的表面施加样品的步骤包括将一个或多个样品各自分配在至少一个分离的路径中。在某些实施方案中，路径是直线。在一些实施方案中，路径宽度是约25纳米至约500微米。在一个实施方案中，向基底的表面施加样品的步骤包括将一个或多个样品各自分配在至少一个分离的点中。在一些实施方案中，至少一个分离的点直径是约25纳米至约500微米。在一些实施方案中，样品选自下列各项组成的组：全血、红细胞、血浆、血清、和唾液。
在一个实施方案中，一种或多种结合试剂包括针对红细胞抗原的一种或多种抗体或其片段、或一些特异性凝集素，并且在样品中被检测的物质是红细胞抗原。
在另一个实施方案中，一种或多种结合试剂包括一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞、化学合成的多肽和多糖血型抗原、重组红细胞抗原或红细胞膜提取物，并且该物质是针对红细胞抗原、重组红细胞抗原或红细胞膜提取物的一种或多种抗体或其片段。
在又一个实施方案中，结合试剂是是多部分结合试剂。沉积在基底上的第一部分包含凝集素或针对红细胞抗原的一种或多种抗体或其片段。抗体是针对红细胞的通用抗体。沉积在基底上的结合试剂的第二部分是来自潜在血液供体的表型确定的或表型未确定的红细胞并且与结合试剂结合。该物质是来自需要输血的患者的血浆并且在患者血浆中的抗体或其片段与来自供体的红细胞结合。
在又一个实施方案中，一种或多种结合试剂包括针对人免疫球蛋白和/或活化的血清补体级分的一种或多种抗体或其片段，并且该物质是包被有抗体和/或包被有活化的血清补体级分的红细胞。
在一些实施方案中，一种或多种结合试剂固定在分离的线中。在一些实施方案中，一种或多种结合试剂固定在分离的点中。在一些实施方案中，1-100种结合试剂与基底的表面结合。
用于抗体筛选、抗原分型(包括直接抗球蛋白试验)和交叉匹配的系统，所述系统包括在分离位置固定有结合试剂的基底，其中结合试剂能够与样品中的物质结合；配置成同时将样品分配至基底上并且从基底中移除未结合的材料的分配器；配置成照射基底的光源；和配置成检测与结合试剂结合的物质存在或不存在的检测器。
在一些实施方案中，用于交叉匹配的系统包括在其上的分离位置固定有供体红细胞的基底；配置成将供体红细胞和/或患者血浆分配至基底上并且同时从基底中移除未结合的供体红细胞或患者血浆的未结合的部分的分配器；配置成照射基底的光源；和配置成检测与供体红细胞结合的抗体存在或不存在的检测器。
第1项.一种确定在样品中物质存在或不存在的方法，所述方法包括：
向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加样品，其中结合试剂能够与样品中的物质结合；
从固定有结合试剂的基底的至少一部分中移除未结合的材料；和
对应于检测到与固定在基底上的结合试剂结合的物质，确定在样品中存在该物质；
并且对应于未检测到与固定在基底上的结合试剂结合的物质，确定在样品中不存在该物质；
其中向基底的表面施加样品的步骤与从基底的至少一部分中移除未结合的材料的步骤是同时的。
第2项.第1项所述的方法，其中用流体动力流限制分配器进行向基底的表面施加样品的步骤和从基底的至少一部分中移除未结合的材料的步骤。
第3项.第2项所述的方法，其中分配器是微流体探针。
第4项.第3项所述的方法，其中分配器是具有多个微通道的微流体探针。
第5项.第3或4项所述的方法，其中分配器是微流体探针阵列。
第6项.前述第3至5项中任一项所述的方法，其中分配器是具有基于尺寸排除红细胞的微通道的微流体探针。
第7项.第6项所述的方法，其中微通道包括具有小于6微米的直径的横截面。
第8项.第6项所述的方法，其中微通道包括具有小于4微米的直径的横截面。
第9项.第6项所述的方法，其中微通道包括具有小于2微米的直径的横截面。
第10项.第6项所述的方法，其中微通道的直径包括具有1-2微米的直径的横截面。
第11项.前述第1至10项中任一项所述的方法，其中基底的表面是湿的。
第12项.前述第1至11项中任一项所述的方法，其中向基底的表面施加样品的步骤包括将一个或多个样品各自分配在至少一个分离的路径中。
第13项.第12项所述的方法，其中路径是直线。
第14项.第12或13项所述的方法，其中路径宽度在25纳米至500微米之间。
第15项.前述第1至14项中任一项所述的方法，其中向基底的表面施加样品的步骤包括将一个或多个样品各自分配在至少一个分离的点中。
第16项.前述第1至15项中任一项所述的方法，其中样品包含血液样品。
第17项.前述第1至16项中任一项所述的方法，其中样品包含选自由下列各项组成的组中的组分：全血、红细胞、血浆和血清。
第18项.前述第1至17项中任一项所述的方法，其中结合试剂包含一种或多种针对红细胞抗原的抗体。
第19项.前述第1至18项中任一项所述的方法，其中结合试剂包含一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞。
第20项.前述第1至19项中任一项所述的方法，其中结合试剂包含一种或多种重组抗原。
第21项.前述第1至20项中任一项所述的方法，其中结合试剂包含一种或多种针对红细胞抗原的抗体和一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞。
第22项.前述第1至21项中任一项所述的方法，其中结合试剂固定在分离的线中。
第23项.前述第1至21项中任一项所述的方法，其中结合试剂固定在分离的点中。
第24项.前述第1至23项中任一项所述的方法，其中结合试剂是1-50种结合试剂。
第25项.前述第1至24项中任一项所述的方法，其中该物质包含一种或多种针对红细胞抗原的抗体。
第26项.前述第1至25项中任一项所述的方法，其中该物质包含一种或多种红细胞抗原。
第27项.前述第1至26项中任一项所述的方法，其中基底由选自下列各项组成的组中的至少一种材料形成：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯、葡聚糖聚合物、树枝状聚合物、寡核苷酸、聚碳酸酯、塑料、玻璃、硅、氧化硅、金属和金属氧化物、和聚合物官能化的金属和金属氧化物、PVDF、硝酸纤维素、尼龙和聚砜。
第28项.一种系统，所述系统包括：
在分离位置固定有结合试剂的基底，其中结合试剂能够与样品中的物质结合；
配置成同时将样品分配至基底上并且从基底中移除未结合的材料的分配器；和
配置成检测与结合试剂结合的物质存在或不存在的检测器。
第29项.第28项所述的系统，其中分配器是微流体探针。
第30项.第28项所述的系统，其中分配器是微流体探针阵列。
第31项.第28项所述的方法，其中分配器是具有多个微通道的微流体探针。
第32项.前述第28至31项中任一项所述的系统，其中分配器是具有基于尺寸排除红细胞的微通道的微流体探针。
第33项.第32项所述的系统，其中微通道包括具有小于6微米的直径的横截面。
第34项.第32项所述的系统，其中微通道包括具有小于4微米的直径的横截面。
第35项.第32项所述的系统，其中微通道包括具有小于2微米的直径的横截面。
第36项.第32项所述的系统，其中微通道的直径包括具有小于1-2微米的直径的横截面。
第37项.前述第28至36项中任一项所述的系统，其中基底由选自下列各项组成的组中的至少一种材料形成：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯、葡聚糖聚合物、树枝状聚合物、寡核苷酸、聚碳酸酯、塑料、玻璃、硅、氧化硅、金属和金属氧化物、和聚合物官能化的金属和金属氧化物、PVDF、硝酸纤维素、尼龙和聚砜。
第38项.一种交叉匹配的方法，所述方法包括：
向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加供体红细胞，其中结合试剂能够与供体红细胞结合；
从固定有结合试剂的基底的至少一部分中移除未结合的供体红细胞；其中向基底的表面施加供体红细胞的步骤与从基底的至少一部分中移除未结合的供体红细胞的步骤是同时的；
将患者血浆放置在供体红细胞的顶部上；和
移除患者血浆的未结合的部分；其中放置患者血浆的步骤与移除患者血浆的未结合的部分的步骤是同时的；
对应于检测到与供体红细胞结合的抗体，确定在患者血浆中存在抗体；和
对应于未检测到与供体红细胞结合的抗体，确定在患者血浆中不存在抗体。
第39项.第38项所述的方法，其中用微流体探针进行施加供体红细胞的步骤、移除未结合的供体红细胞的步骤、放置患者血浆的步骤和移除患者血浆的未结合的部分的步骤。
第40项.第38或39项所述的方法，其中供体红细胞是天然的或溶血的表型确定的红细胞。
第41项.前述第38至40项中任一项所述的方法，其中结合试剂包含结合的凝集素或通用抗红细胞抗体。
第42项.一种用于交叉匹配的系统，所述系统包括：在其上的分离位置固定有供体红细胞的基底；
配置成同时将供体红细胞或患者血浆分配至基底上并且从基底中移除未结合的供体RBC或患者血浆的未结合的部分的分配器；和
配置成检测与供体红细胞结合的抗体存在或不存在的检测器。
附图简述
图1示出了根据本发明的一个实施方案的血液分析系统的示意图。
图2示出了根据本发明的一个实施方案的其中用微流体探针施加样品(例如，RBC)的在其上施加有结合试剂阵列的基底的顶视图。该实施方案可以用于抗原分型并且结合试剂是针对RBC的抗体。
图3示出了根据本发明的另一个实施方案的其中用微流体探针施加样品(例如，具有抗体的血浆)的在其上施加有结合试剂阵列的基底的顶视图。该实施方案可以用于抗体筛选和/或鉴别并且结合试剂是天然的或溶血的表型确定的RBC或重组血型抗原。
图4示出了根据本发明的另一个实施方案的其中用微流体探针施加样品(例如，具有抗体的RBC和/或血浆)的在其上施加有结合试剂阵列的基底的顶视图。该实施方案可以用于抗原分型以及抗体筛选和/或鉴别二者。
图5A和5B示出了现有技术的微流体探针。
图6示出了根据本发明的一个实施方案的微流体探针的顶视图。
图7示出了根据本发明的另一个实施方案的微流体探针的顶视图。
图8是示出根据本发明的一个实施方案的使用图1的系统向之前固定有天然的或溶血的表型确定的RBC和/或针对RBC的抗体的基底的表面施加样品的方法的流程图。
图9和10示出了根据本发明的一个实施方案的与单一样品或不同样品连接的多个平行的微流体探针。
图11示出了根据本发明的一个实施方案的具有可以与单一样品或多个样品连接的多个处理液微通道的微流体探针。
图12是示出根据本发明的一个实施方案的用潜在的供体的红细胞将患者血浆交叉匹配的方法的流程图。
图13A和13B示出了来自使用如在实施例5A中描述的微流体探针的单重抗原分型的结果。图13B是在图13A中所示的点中的一个的特写视图。
图14A-14D示出了来自使用如在实施例5B中描述的微流体探针的多重抗原分型的结果。
图15示出了来自使用如在实施例6中描述的微流体探针的直接抗球蛋白测试的结果。
图16示出了来自使用如在实施例7A中描述的微流体探针的抗体筛选的结果。
图17示出了来自使用如在实施例7B中描述的微流体探针的反向ABO分类的结果。
图18A-18B示出了来自使用如在实施例8中描述的微流体探针的交叉匹配的结果。图18A是在交叉匹配载玻片上的荧光点的图像，并且图18B是每个点的测量的荧光强度。
详细描述
概况
在构成血型的红细胞膜抗原的所有抗原变体中，至今已经在人类中确定了多于三十种红细胞抗原系统：具有抗原A、B和H的ABO系统，具有尤其是抗原D(不存在D抗原表示为d)、C、E、c和e的恒河猴(RH)系统，具有尤其是两种抗原K和k的Kell(KEL)系统，具有尤其是抗原Fya和Fyb的Duffy(FY)系统，具有尤其是抗原Jka和JRb的Kidd(JK)系统，或备选地，在实践中通常较少研究的其他系统，如MNS系统、Lewis(LE)系统等。
标准输血通常考虑ABO系统和恒河猴D系统(D+或d)中的血型。然而，在存在出现非典型凝集素的风险的情况中，考虑恒河猴系统的一定数量的其他抗原，尤其是C、c、E和e抗原，以及Kell或甚至其他系统。
针对红细胞抗原的抗体。在病理情况以外，如在自身免疫疾病的情况中，个体的血清可以含有两种类型的针对红细胞抗原的抗体：
(i)被称为典型(或常规)并且针对ABO系统的抗原的抗体(例如，在B型个体中的抗A抗体)。
(ii)被称为非典型(或免疫)的抗体，其在血清或血浆中的存在是视情况而定的，并且其更具体针对非ABO系统抗原。
“典型”或“常规”抗体更通常是能够使红细胞在体外凝集的M和/或A同种型的免疫球蛋白。“非典型”、或“非常规”、或“免疫”抗体最常见的是G同种型的，其在存在由外源红细胞引起的抗原刺激时出现，例如在输血期间针对一种或多种抗原进行免疫之后，或者在怀孕期间，归因于针对不属于母体血型的胎儿红细胞抗原的母体免疫反应，尤其是在出生时。
在分析血液中使用的各种测试包括：
ABO分类：这个分析是两种类型的分析的组合和解释的结果：利用血浆或血清的血清分析以及使用血液细胞球粒的细胞分析(分别为反向和正向分类)。
-在正向分类中，将个体的红细胞与各自具有精确的抗体特异性、针对ABO系统的抗原的测试抗体(抗A、抗B和抗AB抗体)接触。
-在反向分类中，将个体的含有典型循环抗体的血清或血浆与各自属于ABO系统的精确的抗原类型的表型确定的红细胞接触。
表型确定测定：通常用于表型确定的技术通常由使用特异性抗体筛选在所研究的红细胞表面的抗原的存在或不存在组成。
非典型抗红细胞抗体的筛选和/或鉴别：这种测试用于检测个体的血液中针对各种红细胞抗原的抗体的存在或不存在。为此，需要证明这些抗体(IgG和/或IgM)与抗原已知的表型确定的红细胞或/和与重组血型抗原的结合。当在表型确定的红细胞或重组抗原上结合时，通过抗免疫球蛋白抗体揭示这些非典型抗红细胞抗体。在第一步中，使用一组“筛选”红细胞(选择两种或三种红细胞从而包含用于检测(但是不鉴别)非典型抗体的存在或不存在的所有在输血中重要的抗原)。当筛选是阳性时，之后借助通常包含10至15或甚至20种在大多数已知血型系统中表型确定的不同红细胞的至少一组“鉴别”红细胞来鉴别所存在的一种或多种非典型抗体的特异性。
交叉匹配测定：这个分析的目的是在用供体血液输入接受者之前预测供体-接受者相容性。这用于确认超越供体血液的完成的基本分型的相容性。将来源于潜在供体的红细胞与潜在的被输血的接受者的血清/血浆放在一起。如果潜在接受者样品含有针对潜在供体红细胞的抗体，则揭示它们具有抗免疫球蛋白抗体。这样的分析的结果仅是确定抗体的存在或不存在，并且不能确定其特异性。在被称为“次侧(minor)”交叉匹配的另一种类型的交叉匹配中，将来源于潜在供体的血浆与潜在的被输血的接受者的红细胞放在一起。如果潜在供体样品含有针对潜在接受者红细胞的抗体，则揭示抗体具有抗免疫球蛋白抗体。
直接抗球蛋白试验：例如，在患有溶血性贫血或自身免疫疾病的特定的新生儿或患者中，红细胞被抗体或/和被血清补体级分在体内致敏。在体内致敏的红细胞的表面存在的这些抗体或活化的血清补体级分本身能够构成由红细胞携带的抗原并且通过抗免疫球蛋白抗体和/或抗补体抗体直接检测。
在本文中描述了包括上述测试的用于血液分析的系统和方法。这些系统和方法有助于血液分析的自动化。这些系统和方法可以用于分类和表型确定的检测，用于抗体的筛选和/或鉴别、交叉匹配和直接抗球蛋白试验。
在本文中所述的系统和方法的优点包括，但不限于：(1)提供递送纳升至微升体积的试剂和患者样品的尺寸紧凑的系统；(2)提供使反应化学局部化并且减少反应时间的系统；(3)提供能够进行多重测定的系统(例如，测试来自多名患者的样品和/或对于多个分析物测试单一样品)；(4)提供能够同时进行表型确定(例如，正向血液分型)和抗体筛选/鉴别(例如，反向血液分型)的系统；(5)提供能够将天然的或溶血的红细胞放置到基底上同时维持天然的或溶血的红细胞的抗原性的系统；(6)提供能够对可以输入患者的红细胞进行交叉匹配的系统和/或(7)提供其中可以同时进行样品的施加的步骤和未结合的材料的洗涤的步骤的系统，这相应减少了测定时间。
如在本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”、和“所述”包括复数的所指对象，除非内容明确地另外指示。因此，例如，提及包含“一种结合试剂”的系统包括包含一种或多种结合试剂的系统。同样地，提及“一种物质”包括一种或多种物质。如在本文中所使用的，术语“约”是指所叙述的数字和在所叙述的数字10％范围内的任何值。因此，“约25”是指在22.5至27.5之间的任何值，包括22.5和27.5。
系统
参照图1，图示了用于分析血液的系统100。在一个实施方案中，系统100用于表型确定(也被称为抗原分型)，用于抗体筛选和鉴别，或者用于患者血浆与供体红细胞的交叉匹配。系统100包括基底102、分配器104(例如，微流体探针)、光源106和检测器108。
基底102提供了将结合试剂110(在图2中示出)固定或结合在其上的表面。基底102通常形状是平面形状的并且可以由包括但不限于下列各项的一种或多种材料形成：聚对苯二甲酸乙二醇酯(例如，Mylar)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、塑料、玻璃、硅、氧化硅、和/或裸露的或用聚合物或活化基团如羧基、胺、甲苯磺酰基等官能化的金属和金属氧化物。在一些实施方案中，基底是由包括但不限于下列各项的一种或多种材料形成的载玻片：聚对苯二甲酸乙二醇酯(例如，Mylar)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、塑料、玻璃、硅、氧化硅、和/或裸露的或用聚合物官能化的金属和金属氧化物。基底102可以含有微米孔(microwell)或纳米孔(nanowell)。用于使由金属或金属氧化物形成的底物的表面官能化的聚合物实例包括环氧丙氧基丙基三乙氧基硅烷、聚-L赖氨酸、聚凝胺(polybrene)、聚乙二醇聚合物、葡聚糖聚合物、氨基丙基硅烷、羧基硅烷、水凝胶和聚合物刷、和/或例如官能化的烷基硫醇的自组装的单层、树枝状聚合物或寡核苷酸。在一个实施方案中，基底102包被有金。在一个实施方案中，基底102是具有可以将结合试剂固定在其中的多个孔的微量滴定板。在一些实施方案中，基底102是由包括例如硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、尼龙或聚砜的材料形成的膜。
基底102的表面可以是湿的。在其中结合试剂需要水合以保持活性的一些实施方案中，湿表面是理想的。用于润湿基底102的表面的示例性液体包括，但不限于，缓冲液、水、盐水和/或油(例如，矿物油)。
在一些实施方案中，将基底102固定在可以在X-Y和/或Z方向上移动的平台上。
在图2-4中图示的实施方案中，一种或多种结合试剂110在线阵列中与基底102的表面结合。在一个实施方案中，线的宽度是约25纳米至约500微米。在某些实施方案中，线的宽度是约50纳米至约200微米。在一些实施方案中，1-100种结合试剂与基底102的表面结合。在一个实施方案中，线阵列跨越基底102的宽度。在另一个实施方案中，线阵列跨越基底102的长度。在一些实施方案中，一种或多种结合试剂110以点(spot)和/或圆点(dot)的图案与基底102结合。在一个实施方案中，点/圆点的宽度是约25纳米至约500微米。在某些实施方案中，点/圆点的宽度是约50纳米至约200微米。在一个实施方案中，点和/或圆点的阵列覆盖基底的表面。
在一些实施方案中，结合试剂110与基底102的整个表面结合。例如，在其中基底102是载玻片的实施方案中，可以用结合试剂110(例如，红细胞或抗体)包被载玻片的整个表面。
结合试剂110能够与血液样品(例如，全血、血浆、血清或RBC样品)或唾液样品中的一种或多种物质结合。在一些实施方案中，结合试剂110是针对在红细胞的表面结合的抗原的抗体、或针对人免疫球蛋白的抗体、或/和针对补体级分的抗体(包被的，例如在红细胞上吸附的)，并且该物质是抗原。在一些实施方案中，结合试剂是天然的或溶血的表型确定的红细胞或重组抗原，并且该物质是针对在红细胞的表面上结合的抗原的抗体。在一些实施方案中，结合试剂是凝集素或通用抗红细胞抗体(例如抗血型糖蛋白A抗体)，并且该物质是红细胞。
在一些实施方案中，用作结合试剂110或物质的抗体是与具有特征为特定血型的各种抗原决定簇特异性反应的那些免疫球蛋白。抗体可以是IgA抗体、IgM抗体、IgG抗体或它们的混合物。在一些实施方案中，抗体可以与表征各种主要和次要血型系统的红细胞抗原特异性反应。这样的血型系统包括，但不限于，ABO系统，具有尤其是抗原D(不存在D抗原表示为d)、C、E、c、e和Cw的恒河猴(RH)系统，具有尤其是四种抗原K、k、Kpa和Kpb的Kell(KEL)系统，具有尤其是抗原Fya和Fyb的Duffy(FY)系统，具有尤其是抗原Jka和Jkb的Kidd(JK)系统，具有尤其是抗原M、N、S和s的MNS系统，以及来自P系统的抗原P1，具有尤其是抗原Lua和Lub的Lutheran系统，和具有尤其是抗原Lea和Leb的路易斯(LE)系统。
抗体可以是多克隆的和/或单克隆的或者单克隆抗体或其功能性片段的混合物，所述片段包括F(ab′)2片段、Fab片段、scFv、和VHH纳米抗体的结构域。功能性抗体片段可以(i)来源于来源(例如，转基因小鼠)；或(ii)是嵌合的，其中可变结构域来源于例如非人来源，并且恒定结构域来源于例如人来源，或者(iii)是接枝的互补决定区(CDR)，其中可变结构域的CDR来自例如非人来源，而可变结构域的一个或多个框架是例如人来源并且恒定结构域(如果存在的话)是例如人来源的。抗体可以从天然来源，即活生物或细胞培养物中分离，或可以是完全或部分合成的抗体。合成的抗体是具有利用计算机全部或部分衍生自基于已知抗体序列的分析的合成序列的序列的抗体。例如，通过分析抗体或抗体片段序列的数据库并且使用从其中获得的数据设计多肽序列，可以获得抗体序列或其片段的计算机设计。
在一些实施方案中，用作结合试剂110的红细胞是具有已知血型表面抗原的天然的表型确定的红细胞。在其它实施方案中，可以使用溶血的表型确定的红细胞或“血影(ghost)”作为结合试剂110或物质。血影是轻微溶血并且移除其血红蛋白的、保持全部其抗原性的红细胞。在一些实施方案中，可以使用酶处理的红细胞作为结合试剂110。在一些实施方案中，可以使用从膜分离的血型表面抗原作为结合试剂110。在另外其他实施方案中，可以使用化学合成的多肽和多糖血型抗原以及重组血型抗原作为结合试剂110。
可以通过如但不限于流体动力液体限制、喷墨打印、喷雾沉积、微点样(microspotting)和/或微接触打印的技术将结合试剂110沉积到基底102的表面上。在沉积期间或之后，可以通过例如静电吸引、亲和力相互作用、疏水/亲水相互作用、或共价偶联将结合试剂110固定至基底102的表面上。
在一些实施方案中，可以用阻断剂如，例如在缓冲液中的脱脂乳汁蛋白、酪蛋白、和/或牛血清白蛋白处理未固定有结合试剂110并且可以提供非特异性结合位点的基底102的区域。
在可以用于抗原分型或表型确定的图2中所图示的实施方案中，固定在基底102的表面上的结合试剂110是各自针对不同抗原的一种或多种抗体的阵列。在一些实施方案中，将针对单一抗原的多种抗体固定在基底102的表面上。每个垂直的线可以代表不同的抗体，例如抗A、抗B、抗AB、抗D、抗C、抗c、抗Cw、抗K、抗k、抗Kpa、抗Kpb、抗Fya、抗Fyb、抗Jka、抗Jkb、抗Lea、抗Leb、抗P1、抗M、抗N、抗S、抗s、抗Lua或抗Lub。
在可以用于抗体筛选和/或鉴别的图3中所图示的实施方案中，固定在基底102的表面上的结合试剂110是一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞、膜提取物或/和重组血型抗原的阵列。每个垂直的线可以代表不同的红细胞，例如红细胞RBCI、RBCII、RBCIII...RBCXX。
在可以用于抗原分型和抗体筛选和/或鉴别(例如，“套餐(combo)”试验)的图4中图示的实施方案中，也可以将多于一个结合试剂110阵列(即，针对红细胞抗原的抗体的阵列和红细胞的阵列)固定至基底102上。例如，抗A、抗B、抗AB、抗D、抗C、抗c、抗Cw、抗K、抗k、抗Kpa、抗Kpb、抗Fya、抗Fyb、抗Jka、抗Jkb、抗Lea、抗Leb、抗P1、抗M、抗N、抗S、抗s、抗Lua或抗Lub抗体中的每一个的垂直的线可以与基底102的表面结合，并且红细胞RBCI、RBCII、RBCIII...RBCXX中的每一个的垂直的线可以与基底102的表面结合。
再次参照图1，分配器104被配置成在基底102的表面上的分离的路径中分配微流体或亚微流体的体积的一种或多种样品。在一些实施方案中，该路径跨越基底102的长度。在其它实施方案中，该路径跨越基底102的宽度。在某些实施方案中，路径宽度是约25纳米至约500微米。在一个实施方案中，分配器104还被配置成在基底102的表面上分配一种或多种结合试剂110。
在一些实施方案中，分配器104可以在X-Y-和/或Z方向上移动。分配器104的运动和功能可以是计算机控制的。
在一些实施方案中，分配器104是流体动力流限制分配器。在一个实施方案中，流体动力流限制分配器是如在结合在本文中的美国专利申请13/881,989中描述的微流体探针200(或垂直MFP)。在图5A和5B中图示的实施方案中，微流体探针200可以包括基底层220，其中与浸渍液体微通道323、324一起设置处理液微通道223、224。每个通道与孔221、222、321、322流体连通，每个孔位于基底层的表面上(并非必须是相同的表面)，并且优选紧密靠近。通道223、224、323、324还提供了在机动泵和孔221、222、321、322之间的连接。如在图5B中通过弯(粗)箭头符号表示的，当在表面附近移动微流体探针200时，通过孔221提供的处理液将会与浸渍液体组合并且优选插入至通过孔321和322提供的浸渍液体中。为了理解而提供后者；有意将它们的尺寸扩大。就此而言，装置优选被配置成，如获得层流(laminarflow)。在一些实施方案中，孔尺寸可以是数十微米。孔可以以五十微米隔开或者以多至数百微米隔开。因为在本文中使用成对的处理通道/孔，可以将处理液在孔222处连同浸渍液体中的一些再吸出。注意，孔221和222之间的流路可以是相反的，即可以从孔222注入处理液而孔221可以吸出液体。处理液基本上位于孔221和222附近并且被基本上存在于头部200附近的浸渍液体包围。如描绘的，覆盖层210将在基底层的上表面上通道开口关闭。
此外，优选将处理液微通道的部分设置为基底层220的层厚度中的在其上表面开口的槽223′、224′。这样，容易实现形成微通道，而无需考虑其横向尺寸(可能是小的，例如数十微米)。在组装之后，槽被覆盖层210的一部分封闭。可以通过工具直接在基底层220的上表面上将槽铭刻。其可以具有任何适合的截面形状，例如，圆形、正方形、U或V截面。所需的工具通常根据基底层220的材料选择。在变体中，可以考虑激光消蚀(laser ablation)。然而最有利地，将深反应离子蚀刻(deep reactive ion etching，DRIE)用于微通道的制造。
如在图5B中描绘的，槽223′、224′向上延伸至相应的孔221、222。类似地，浸渍通道223、224到达相应的孔321、324。在这个实例中，通道和孔是在头部的上表面的主轴周围对称排列的。孔以基底层220的前表面320的边缘310的水平在槽的末端直接形成，其在这里同样是容易加工的。通常使所述前末端320尖锐，这允许在目标表面上致密的液体沉积，并且为容易的光学监测留出空间。
参照图5A，在覆盖层210上设置通孔211、212。示出了另外的通孔311，其允许向浸渍通道323、324传递流体连通(在这里仅提供一个通孔，其对两个浸渍通道进料)。可以提供与通孔连接的相应的管道端口(未示出)。通道具有如面对通孔排列的末端。
如在图5A和5B中描绘的，微流体探针200包括两个处理液微通道。在一些实施方案中，微流体探针200包括多于两个处理液微通道。在一些实施方案中，微流体探针200可以包括2-50个处理液微通道(参见图11)。在一些实施方案中，微流体探针200可以在至少一个处理液微通道中包括加热元件。加热样品可以增加抗原和抗体反应的速度，这可以减少试验时间。
示例性的处理液包括缓冲液、全血、RBC、血浆、血清、或油(例如，矿物油)。示例性的浸渍液体包括矿物油、缓冲液、水、和/或盐水。
在一些实施方案中，微流体探针包括用于将全血样品中血浆与红细胞分离的结构。在一些实施方案中，可以通过尺寸和/或通过毛细管力实现分离。图6图示了具有至少两个不同尺寸的处理液微通道的微流体探针600的实施方案。探针被配置成使得其可以与全血样品或与含RBC样品(即，血浆中的RBC)一起使用而不堵塞。将第一微通道602尺寸设置为排除全血样品中的红细胞。将第二微通道604尺寸设置为允许来自样品的红细胞通过其流动。在其中处理液微通道具有圆形横截面的实施方案中，第一微通道602具有小于6微米的直径。在一些实施方案中，第一微通道的直径小于4微米或小于2微米或小于1-2微米。在一些实施方案中，第二微通道604具有大于约7微米的直径。红细胞的直径是约6-8微米。在具有更大直径的情况下，第二微通道604将会允许红细胞通过其流动。微通道的横截面可以是任何适合的形状，包括圆形、卵形和椭圆形。在一些实施方案中，处理液微通道602和604的内表面可以涂布有防止血液组分与内表面结合的材料，例如肝素。也可以用例如肝素、柠檬酸盐或EDTA使全血样品抗凝固以防止血液凝固。
图7图示了具有与第一孔704流体连通的弯曲微通道702的微流体探针700的实施方案。将弯曲微通道702的直径尺寸设置为保留来自全血样品的RBC。较小直径的毛细管706使弯曲微通道702分岔并且与第二孔708流体连通。毛细管706允许无红细胞的血浆通过其流动。
微流体探针可以由与流经通道的液体相容的材料形成。示例性的相容材料包括，但不限于，硅、二氧化硅、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、砷化镓、玻璃、陶瓷、石英、聚合物如氯丁橡胶(neoprene)、特氟隆(Teflon)TM、聚乙烯弹性体、聚丁二烯/SBR、亚硝酸盐、尼龙、和/或金属。通道的内表面也可以涂布有适合的材料以降低液体组分和通道本身之间的亲和力。
再次参照图1，光源106被配置成照射基底102的表面。取决于待检测的信号，光源106可以提供在可见范围到近红外范围的范围内的光。示例性的光源包括激光器和发光二极管。
检测器108被配置成检测从基底102的表面发射的光。在一些实施方案中，通过比色、荧光或发光检测来实现检测。在一些实施方案中，通过成像如通过照相或者通过电子检测器来实现检测。示例性的电子检测器包括光电二极管、电荷耦合装置(CCD)检测器，或互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器。
通过模拟-数字转换器110将来自检测器108的模拟信号数字化。通过微处理器112处理数字化的信号以获得在存储器114中储存和/或在任选的显示器116上显示的检测的光的至少一个值或强度。
通过使用适合的电子器件和软件，可以对系统100编程以知晓与基底102的表面上的结合试剂110结合的特定物质的身份标识(identity)和位置。物质的身份标识和位置可能与产生的信号有关，从而可以对测试者确定和鉴别具体的血型。此外，可以包括统计学软件从而将来自在基底102上设置的结合试剂110的各种重复和/或稀释的结果组合并且公式表示(formulate)。以这种方式，可以将从多种物质获得的信号包括(factor)在一起，并且对测试者显示统计学上显著的结果。
方法
系统100可以用于进行抗原分型、抗体筛选/鉴别、组合的抗原分型和交叉匹配。另外，系统100用于分类和表型确定的检测，抗体的筛选和/或鉴别，交叉匹配和直接抗球蛋白试验。
参照图8，现在将描述用于抗原分型和/或抗体筛选和/或鉴别的方法800。例如，方法800可以利用在图1中图示的前述系统进行。
在示例性的步骤810中，向在其上固定有一种或多种结合试剂110的湿或干的基底102施加样品，其中一种或多种结合试剂110能够与样品中的一种或多种物质结合。在图2中所示的抗原分型实施方案中，样品和物质是被酶处理或未被酶处理的患者或供体RBC，并且在基底102的表面上固定的结合试剂110是针对红细胞(RBC)抗原的抗体。可以通过借助例如离心将全血分离为RBC和血浆来提供RBC样品。所得的RBC可以“按原样”使用或者可以被稀释。在一些实施方案中，将RBC稀释为约0.1至50％。在一些实施方案中，将RBC稀释为约0.5-20％之间。在某些实施方案中，将RBC稀释为约0.6至5％之间。在一些实施方案中，将RBC稀释为大于50％。
在图3中所示的抗体筛选和/或鉴别实施方案中，样品是患者或供体血浆，在基底102的表面上固定的结合试剂110是天然的或溶血的表型确定的RBC、化学合成的多肽、天然或合成的多糖血型抗原、或重组血型抗原，并且一种或多种物质是针对RBC抗原、重组红细胞抗原或红细胞膜提取物的抗体。
在图4中所示的实施方案中，将在图2中所示的抗原分型实施方案与在图3中所示的抗体筛选和/或鉴别实施方案组合。在这个实施方案(例如，“套餐”测定)中，基底的第一部分具有可以为天然或溶血的固定的表型确定的RBC并且第二部分具有针对RBC抗原的固定的抗体。
在一个实施方案中，用一个或多个微流体探针施加一个或多个样品。在另一个实施方案中，对于每个样品来说，使用一个微流体探针(图2-3)。在与结合试剂110的线垂直的方向上向涂布有结合试剂110的基底102施加每个样品，从而向涂布在基底102上的结合试剂110中的每一个施加样品。在又一个实施方案中，平行的探针阵列，探针阵列900，与相同的或不同的样品连接(图9-10)。探针阵列900一次向所有结合试剂110施加相同的或不同的样品。对于新样品来说，例如，将在探针阵列900中的通道冲洗以移除第一样品，将探针阵列900一起移动至另一组结合试剂110并且向新一组结合试剂110施加新样品。对于每个新样品来说，重复冲洗和移动探针阵列900的过程。在一些实施方案中，一次使用多个探针阵列900测试分别针对多个结合试剂110的多个样品。
在图11中所示的实施方案中，微流体探针1100包括多个处理液微通道。可以使用多个处理液微通道将一个或多个样品(即，相同的或不同的样品)和/或结合试剂110放置到基底102的表面上。在一些实施方案中，微流体探针包括2-100个处理液微通道。在其它实施方案中，在探针阵列900(图9-10中所示)中的探针中的每一个包括多个微通道。在“套餐”测定实施方案中，使用在图6中所示的微流体探针600将一个或多个样品放置到在图4中所示的实施方案上，其中基底的第一部分具有可以为固定的表型确定的RBC(其是天然或溶血的)并且第二部分具有针对RBC抗原的固定的抗体。
在示例性的步骤820中，将未结合的材料例如红细胞和/或抗体从在其上固定有结合试剂的基底102的至少一部分中移除。可以通过用例如缓冲液、水或盐水洗涤基底102的表面来移除未结合的材料。在一个实施方案中，可以使用微流体探针以与步骤810同时通过将洗涤溶液(例如，浸渍液体)泵送通过一个或多个处理液微通道来移除未结合的材料。
在示例性的步骤830中，检测与在基底102上固定的一种或多种结合试剂110结合的物质并且鉴别在样品中存在的该物质。也可以确定与结合试剂结合的物质不存在。在抗原分型实施方案中，可以视觉或通过分光光度法检测与RBC抗体结合的RBC的红色。也可以通过包括例如比色、荧光或化学发光缀合的抗体的二次标记检测来检测与RBC抗体结合的RBC。在抗体筛选和/或鉴别实施方案中，可以通过特异性二次标记检测来检测与RBC抗原结合的抗体。
参照图12，现在将描述用于交叉匹配的方法1200，其中使用微流体探针放置供体红细胞和患者血浆。这种方法检测供体的RBC与患者的血浆的相容性。例如，方法1200可以利用在图1中图示的前述系统进行。
在示例性的步骤1210中，用微流体探针向基底的湿的预处理的表面施加供体的红细胞。供体的红细胞可以是天然的或溶血的。在一些实施方案中，供体的红细胞还是表型确定的。在一些实施方案中，向在浸渍液体中的基底的表面施加这些RBC以保持红细胞的抗原性。在一些实施方案中，用结合试剂如，例如凝集素、化学试剂或者通用抗RBC抗体如，例如抗血型糖蛋白A抗体预处理基底的表面。
在示例性的步骤1220中，通过用例如缓冲液、水或盐水洗涤基底102的表面将未结合的供体红细胞移除。在一个实施方案中，可以使用微流体探针以与步骤1210同时通过将洗涤(浸渍)溶液泵送通过一个或多个处理液微通道来移除未结合的供体红细胞。
在示例性的步骤1230中，将患者血浆样品放置在向步骤1210中的预处理基底的表面施加的供体RBC的顶部。在一个实施方案中，使用与在步骤1210中使用的相同的探针放置患者血浆。可以使用与在步骤1210中相同的微通道或不同的微通道放置患者血浆。如果使用与在步骤1210中相同的微通道，可以在使用之间用例如缓冲液冲洗微通道，或者可以使用缓冲液、油或空气的“团块(slug)”将供体RBC与患者样品分离。在另一个实施方案中，在这个步骤和步骤1210之间使用不同的微流体探针以防止交叉污染。
在示例性的步骤1240中，通过用例如缓冲液、水或盐水洗涤基底102的表面将来自患者血浆样品的未结合的抗体移除。在一个实施方案中，可以使用微流体探针以随步骤1230一起通过将洗涤溶液泵送通过一个或多个处理液微通道来移除未结合的抗体。
在示例性的步骤1250中，对应于检测到与供体红细胞结合的抗体，检测到在患者血浆中存在抗体(例如，通过第二标记的抗体)。并且对应于未检测到与供体红细胞结合的抗体，确定在患者血浆中不存在抗体。
在另一种交叉匹配方法(例如，次侧交叉匹配方法)中，使用微流体探针放置患者RBC和供体血浆。这种方法检测患者的血浆与供体的RBC的相容性，并且在向患者输全血而不仅仅是RBC的情况中或者在将在分离的RBC中剩余的医学相关量的供体血浆输给患者的情况中是重要的。例如，次侧交叉匹配方法可以利用在图1中图示的前述系统进行。
微流体探针的一个优点是其在生理浸渍液体中放置的能力，这允许维持红细胞的抗原性。这为探针提供了另外的可能的用途。在一些实施方案中，用于血液分型的系统包括在分离位置固定有一种或多种结合试剂的基底，其中一种或多种结合试剂能够与天然的或溶血的红细胞结合；配置成将这些天然的或溶血的表型确定的红细胞分配至基底上并且从基底中移除未结合的红细胞的分配器；配置成将患者血浆样品放置在向表面施加的红细胞的顶部上并且移除未结合的抗体的分配器；以及配置成检测抗体的检测器。之前描述的交叉匹配是一个实例。
抗体筛选是另一个实例。与在交叉匹配测定中一样，通过探针将表型确定的RBC放置在预处理表面上。进行洗涤并且之后放置并且鉴别含有抗体的血浆。
实施例
实施例1：抗原分型
这个分析的目的是借助特异性单克隆或多克隆抗体鉴别在来自供体或患者的红细胞的表面存在的血型抗原(ABO、RH、Kell、Duffy、Kidd、Lewis等血型)。
为了证明利用本发明的技术对红细胞进行分型/表型确定的可能性，使用基底102的表面固定抗红细胞抗体并且使用微流体探针200分配患者红细胞或全血样品并且移除未结合的红细胞。之后视觉检测与抗红细胞抗体结合的RBC的红色。
1.1-材料
在本实施例中，结合试剂110是抗红细胞抗体。基底102的表面是聚苯乙烯96孔平底板。用喷墨或接触打印机将抗体作为点放置在孔底部上。每个孔含有每种抗体特异性的至少一个点。在本实施例中，将抗体在PBS缓冲液(pH 7.4)中以在10至500μg/mL范围内的浓度稀释并且通过被动吸收与基底102的表面结合。在将抗体放置在表面上之后，通过与补充有1％BSA的PBS接触将基底饱和以防止样品组分的非特异性结合并且随后风干。
在本实施例中，所使用的抗体是：
-抗A IgM克隆15750F7(伯乐实验室公司(Bio-Rad))。
-抗D IgG克隆BRAD3(IBGRL)
-抗K1 IgG克隆MID11 G4(伯乐实验室公司)
1.2-试验描述
为了证明可行性并且确认根据该技术分类的特异性，单独测试每个点。将足够的缓冲液(处理液)分配至孔中，从而覆盖全部孔的表面。之后使微流体探针位于抗体点上方。在第一步中，使RBC或全血的悬浮液流经该点并且使RBC和抗体接触。在第二步中，将该流动切换为洗涤缓冲液从而移除未结合的RBC。最后，视觉或通过分光光度法检测与点状抗体连接的红细胞的存在或不存在。
实施例2：抗体筛选/鉴别
为了证明利用本发明的技术进行抗体筛选和鉴别的可能性，使用基底102的表面通过聚-L赖氨酸(PLL)固定天然的或溶血的表型确定的红细胞。对于本申请来说，设计微流体探针200以进行加热和连续的化学反应。使用探针放置患者血浆血清或全血样品，以移除非特异性抗体并且分配标记的抗Fc抗体缀合物以检测结合的抗体。
2.1-材料和试剂
2.1.1.用PLL将基底102的表面致敏
在本实施例中，基底102的表面是聚苯乙烯96孔平底板。将在pH7.4的PBS中的25μg/ml的分子量70000-130000的PLL分配至每个孔中并且在环境温度下温育18小时。在这个步骤的最后，将孔在补充有0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS中洗涤，并且之后用于固定细胞。
2.1.2.在表面上的细胞的固定
在本实施例中，结合试剂110是天然的或溶血的表型确定的红细胞。用喷墨或接触打印机将细胞作为点放置在涂布有PLL的孔底部上。每个孔含有每种表型的至少一个点。在本实施例中，在补充有防腐剂组分的缓冲液中的20至50％的细胞悬浮液。在放置之后，将基底洗涤以移除未结合的细胞并且之后通过与补充有1％BSA和1M葡萄糖的PBS接触而被饱和以防止样品组分的非特异性结合，和细胞保存。在过夜温育之后，移除饱和缓冲液并且将表面风干。
在本实施例中，所使用的结合试剂是通常用于抗体筛选的三种天然的或溶血的表型确定的红细胞。
2.2.试验描述
单独测试每个点的细胞。将足够的缓冲液(处理液)分配至孔中，从而覆盖全部孔表面。之后使微流体探针位于点上方。在第一步中，使患者血浆血清或全血流经该点并且使样品和RBC接触。设置探针以将反应区域在37℃加热。在第二步中，进行连续的过程：洗涤从而移除非特异性抗体，分配标记的抗Fc抗体缀合物，并且最后洗涤以移除未结合的标记的抗球蛋白抗体。最后，通过比色、荧光或发光来检测与天然的或溶血的表型确定的红细胞连接的抗体的存在或不存在。
实施例3：交叉匹配
为了证明利用本发明的技术进行交叉匹配的可能性，使用微流体探针200进行从供体红细胞通过聚-L赖氨酸(PLL)固定到最后的反应检测的所有步骤。设计这种微流体探针200以进行加热和连续的化学反应。还使用探针放置患者血浆血清或全血样品，并且移除非特异性抗体。使用标记的抗Fc抗体缀合物检测结合的抗体。
3.1-材料和试剂
3.1.1.用PLL将基底102的表面致敏
在本实施例中，基底102的表面是聚苯乙烯96孔平底板。将在pH 7.4的PBS中的25μg/ml的分子量70 000-130 000的PLL分配至每个孔中并且在环境温度下温育18小时。在这个步骤的最后，将孔在补充有0.05％Tween-20的pH 7.4的PBS中洗涤，并且之后用于固定细胞。
3.1.2.试验描述
将足够的缓冲液(处理液)分配至涂布有PLL的孔中，从而覆盖全部孔表面。之后使微流体探针200位于表面上方并且进行连续过程：放置预洗的供体红细胞，移除未结合的细胞的洗涤步骤，使患者血浆血清或全血在37℃下流动，洗涤以移除非特异性抗体，分配标记的抗Fc抗体缀合物，并且最后洗涤以移除未结合的标记的抗球蛋白抗体。最后，通过比色、荧光或发光来检测与供体红细胞连接的抗体的存在或不存在。
实施例4：直接抗球蛋白试验
这个分析的目的是借助特异性单克隆或多克隆抗体鉴别包被在体内致敏的RBC上的IgG和/或C3d补体级分。
为了证明利用本发明的技术检测致敏的RBC的可能性，使用基底102的表面固定抗IgG和抗C3d抗体。使用微流体探针200分配预洗的患者红细胞并且移除未结合的红细胞。之后视觉检测与特异性抗体结合的RBC的红色。
4.1-材料
在本实施例中，结合试剂110是抗IgG和抗C3d抗体。基底102的表面是聚苯乙烯96孔平底板。用喷墨或接触打印机将抗体作为点放置在孔底部上。每个孔含有每种抗体特异性的至少一个点。在本实施例中，将抗体在PBS缓冲液(pH 7.4)中以在10至500μg/mL范围内的浓度稀释并且通过被动吸附与基底102的表面结合。在将抗体放置在表面上之后，通过与补充有1％BSA的PBS接触将基底饱和以防止样品组分的非特异性结合并且随后风干。
在本实施例中，所使用的抗体是：
-多克隆兔抗人IgG(伯乐实验室公司)
-抗C3d IgG克隆053A714(伯乐实验室公司)
4.2-试验描述
为了证明可行性并且确认试验的特异性，以单一方式进行反应。在这种情况中，单独测试每个点。将足够的缓冲液(处理液)分配至孔中，从而覆盖全部孔表面。之后使微流体探针位于抗体点上方。在第一步中，使RBC的悬浮液流经该点并且使RBC和抗体接触。在第二步中，将该流动切换为洗涤缓冲液从而移除未结合的RBC。最后，视觉或通过分光光度法检测与点状抗体连接的红细胞的存在或不存在。
实施例5：抗原分型-单重和多重分类/表型确定
这个分析的目的是通过使用特异性单克隆或多克隆抗体鉴别在来自供体或患者的红细胞的表面存在的血型抗原(ABO、RH、Kell、Duffy、Kidd、Lewis等血型)。
为了证明利用本发明的技术对红细胞进行表型确定/分类的可能性，将抗红细胞抗体固定在基底的表面并且与移除未结合的红细胞同时使用微流体探针分配患者红细胞。之后视觉检测与抗红细胞抗体结合的红细胞的红色，并且用于确定抗原特异性。
A.A阳性红细胞的单重分类
材料
在本实施例中，结合试剂是抗红细胞抗体，并且更具体地，是鼠IgM抗A mAb(伯乐实验室公司，克隆15750F7)。对于这个实验和所有后续实验来说，基底是聚苯乙烯载玻片(TED PELLA，INC.；产品#260225)。用喷墨打印机将抗体作为多排点放置在载玻片上。每个点清楚地通过X、Y坐标确定。点尺寸为直径约250μm。点彼此对齐并且以约50-60μm隔开。将纯化的抗A IgM抗体在PBS缓冲液(pH7.4)中以在10至500μg/mL范围内的浓度稀释并且通过被动吸附与基底102的表面结合。在将抗体放置在表面上之后，用在PBS中的1％BSA处理基底以防止样品组分的非特异性结合。将由此制备的载玻片风干并且在4℃储存直到使用。在这个和后续实施例中使用的微流体探针是具有4个通道的探针，每个通道具有100μm x100μm的尺寸。为了获得足够的流体动力流限制，使用通道2分配样品并且使用通道1和3吸出样品。使用具有不同表型的红细胞悬浮液(A阳性和O阳性红细胞)作为样品。
方法
为了证明可行性并且确认根据该技术进行分类的特异性以及再现性，用相同的红细胞溶液(例如，两种A阳性红细胞以及两种A阴性红细胞(O红细胞))对每个点一个接一个地进行测试。在本实施例中，将红细胞在0.9％等渗盐水溶液中洗涤并且在生理水中以50％悬浮。利用微流体探针的通道2，以1.6μl/min将2μl的稀释的红细胞悬浮液吸出。为了润湿载玻片，将足够的缓冲液(处理液)分配至载玻片上以覆盖整个表面。之后使微流体探针位于载玻片上方并且之后设置流体动力流限制。当使流体动力流限制稳定时，对微流体探针的运动编程从而以0.02mm/s的速率移动并且跟随经过对齐的点的直线。在探针运动期间，被分配的红细胞与基底102的饱和的表面接触或者与点状抗体接触。具有正确抗原特异性的红细胞立刻与固定的抗体结合。归因于细胞和缓冲处理液的连续放置和吸出，在红细胞结合同时移除未结合的红细胞。在红细胞的放置/吸出之后，通过相机图像捕获来检测与点状抗体连接的红细胞的存在或不存在。在知道在基底上的每个点的位置的情况下，可能确认在被测试的红细胞的表面是否存在抗原，并且因此鉴别被测试的红细胞的血型特异性。
为了确定在A阳性和A阴性RBC的表面是否存在抗原，通过将RBC放置在20个点上来测试两种A阳性红细胞和两种A阴性红细胞。具有结合的A阳性红细胞的20个点中的四个的测试结果在图13A中示出。第四个点的特写视图在图13B中示出。A阳性红细胞与整个点表面牢固结合，而A阴性红细胞根本不结合(未示出)。这些结果证明所观察到的结合是特异性的：仅当包括抗原-抗体对时才发生红细胞结合。结果还证明A阳性红细胞可以与A阴性红细胞明显不同，从而可以鉴别在红细胞的表面的A抗原。此外，这些结果显示，可以在单重抗原分型方法中使用微流体探针，其中使用微流体探针向在固体基底上的抗红细胞抗体施加RBC，同时移除未结合的RBC。
申请人还发现，当评价具有较低抗原密度的红细胞时，被红细胞覆盖的点表面密度较低。
B.A和D阳性红细胞的多重分类
在本实施例中，使用相同试样量的红细胞(以及因此较少的样品)分别与固定的鼠IgM抗A单克隆抗体(mAb)以及固定的人IgG抗D mAb反应。
材料
结合试剂是抗红细胞抗体：鼠IgM抗A(克隆15750F7)和人IgG抗DmAb(克隆Brad3)。将抗体作为点手动放置在聚苯乙烯载玻片上。每个点清楚地通过X、Y坐标确定。在这种情况中，点尺寸为直径约1.5mm。具有相同抗体特异性的点彼此对齐并且以约200μm彼此隔开。将所使用的抗体纯化并且在PBS缓冲液(pH 7.4)中以在10至500μg/mL范围内的浓度稀释。将稀释的抗体通过被动吸附与基底的表面结合。在将抗体放置在表面上之后，用补充有1％BSA的PBS将基底饱和以防止样品组分的非特异性结合。将载玻片风干并且在4℃储存直到使用。用于获得足够限制的条件如下：通道1：吸出，通道2：分配，和通道3：吸出。使用具有不同的A和D表型的红细胞悬浮液(A+、A-、O+和O-)作为样品。
方法
为了证明可行性并且确认使用微流体探针技术的分类/表型确定的特异性，用相同的红细胞溶液对每个点一个接一个地进行测试。在本实施例中，首先将红细胞在0.9％等渗盐水溶液中洗涤并且在生理水中以50％悬浮。以1.5μl/min将1.5μl的红细胞悬浮液吸出。为了润湿载玻片，将足够的PBS缓冲液(处理液)分配至载玻片上以覆盖整个表面。使微流体探针位于载玻片上方并且之后设置流体动力流限制。当使流体动力流限制稳定时，以0.02mm/s对微流体探针跟随X轴或Y轴的运动编程从而画出经过对齐的点的直线。在探针运动期间，被分配的红细胞与基底的饱和的表面接触或者与点状抗体中的一个接触。具有正确抗原特异性的红细胞立刻与固定的抗体结合。归因于细胞和缓冲处理液的连续放置和吸出，在红细胞结合的同时移除未结合的红细胞。在红细胞的放置/吸出之后，通过相机图像捕获来检测与点状抗体连接的红细胞的存在或不存在。在知道在基底上的每个特异性抗体的位置的情况下，可以鉴别在被测试的红细胞的表面存在哪种抗原，并且因此鉴别被测试的红细胞的血型特异性。
将A阳性红细胞(A+、A-)和D阳性红细胞(A+、O+)以及A阴性(O-和O+)和D阴性红细胞(O-和A-)用作样品并且放置在2点一个的线中。A阳性红细胞与点表面的抗A mAb被固定的扫描区域强烈结合(图14A)，而A阴性红细胞根本不结合(图14B)。D阳性红细胞也与点表面的抗D mAb被固定的扫描区域强烈结合(图14C)，而D阴性红细胞根本不结合(图14D)。这些结果证明所观察到的结合是特异性的：仅当包括抗原-抗体对时才发生点/红细胞结合。这些结果还证明了使用本发明的微流体探针技术的红细胞的二参数多重分类/表型确定的可行性。此外，这些结果显示，可以在多重抗原分型方法中使用微流体探针，其中使用微流体探针向在固体基底上的抗红细胞抗体施加RBC，同时移除未结合的RBC。这些结果还显示，可以使用相同的样品进行多重反应，即可以向所有点施加相同的样品。
实施例6：直接Coombs阳性红细胞的表型确定：直接抗球蛋白试验
这个分析的目的是通过使用特异性单克隆或多克隆抗体鉴别吸附在体内致敏的红细胞上的人IgG和/或C3d补体级分。
在这里，为了证明利用本发明的技术检测致敏的红细胞的可能性，将抗人球蛋白mAb(鼠IgG mAb)固定在基底的表面上。使用微流体探针分配人IgG致敏的红细胞并且移除未结合的红细胞。之后通过相机图像捕获来视觉检测与特异性抗体结合的红细胞的红色。
材料
在本实施例中，结合试剂是抗人球蛋白抗体(鼠IgG mAb)。用抗体将聚苯乙烯载玻片的整个表面手动官能化。将纯化的抗体在PBS缓冲液(pH7.4)中以在10至500μg/mL范围内的浓度稀释并且通过被动吸附与聚苯乙烯载玻片的表面结合。在将抗体放置在载玻片的表面上之后，通过与补充有1％BSA的PBS接触将载玻片饱和以防止样品组分的非特异性结合。将这些载玻片干燥并且在4℃储存直到使用。用于获得足够限制的条件如下：通道1：吸出，通道2：分配，和通道3：吸出。使用致敏的红细胞悬浮液以及天然的红细胞悬浮液作为样品。
方法
为了模拟体内致敏的红细胞，使用人抗D IgG使红细胞致敏。将已经用0.9％等渗盐水溶液洗涤的D阳性红细胞在生理水中以2％悬浮。平行制备20μg/ml的人抗D mAb的溶液。将洗涤的D阳性RBC溶液与人抗D mAb的溶液在37℃温育45min。为了移除未结合的抗体，将抗D致敏的RBC用0.9％等渗盐水溶液洗涤并且以10％悬浮。在直接Coombs卡(IgG+C3d)中测试抗D致敏的RBC，并且获得强烈的阳性反应。之后利用微流体探针的通道2以1.8μl/min将2μl的致敏的RBC悬浮液吸出。用PBS将载玻片的整个表面润湿。之后使探针位于载玻片上方。在使微流体探针流动限制稳定之后，对微流体探针编程从而以0.02mm/s的速度跟随沿着X轴的直线。
用微流体探针将抗D致敏的红细胞和没有任何致敏的相同红细胞(即，天然的RBC)放置在具有抗人球蛋白抗体的结合试剂的载玻片上。与向结合试剂施加样品同时，通过探针移除未结合的材料。通过相机图像捕获来检测与抗体连接的红细胞的存在或不存在。抗D致敏的RBC应当与抗人球蛋白抗体结合，而未经历致敏的RBC不应与抗人球蛋白抗体结合。
结果显示，在整个扫描区域中仅抗D致敏的红细胞与抗人球蛋白mAb强烈结合(图15)，而天然的红细胞根本不结合(未示出)。这些结果证明所观察到的结合是特异性的。此外，这些结果显示，可以在直接抗球蛋白试验中使用微流体探针，其中使用微流体探针向在固体基底上的抗人球蛋白单克隆抗体施加人IgG致敏的红细胞，同时移除未结合的RBC。
实施例7A：抗体筛选/鉴别
需要对非典型的抗红细胞抗体进行筛选以允许供体和接受者之间的相容性输血。目的是确认接受者的血浆不含针对必须输血的供体红细胞的抗体。筛选需要使用特征在于在其表面上分布血型抗原的多种红细胞。这样的筛选如下：用待测试的血清或血浆样品温育其表型已知的红细胞。如果存在的话，特异性抗体与红细胞的表面结合并且用含有抗人球蛋白抗体的试剂检测。通过使用具有或不具有各种抗原的红细胞组，之后可能确定在样品中存在的抗体的特异性。为了证明利用本发明的技术进行抗体筛选和鉴别的可能性，使用基底的表面通过通用抗体固定天然的或溶血的表型确定的红细胞。之后使用微流体探针将抗D单克隆抗体分配至模拟的患者血浆。在分配抗D单克隆抗体的同时，探针同时移除非特异性结合的材料。还使用探针分配10μg/ml藻红蛋白标记的抗人球蛋白抗体(二抗)以检测结合的抗D单克隆抗体。
材料
在本实施例中，用通用抗红细胞抗体将聚苯乙烯载玻片的整个表面手动官能化。将所使用的抗红细胞抗体纯化并且在PBS缓冲液(pH 7.4)中以100μg/mL的浓度稀释，并且通过被动吸附与载玻片的表面结合。之后通过与补充有1％BSA的PBS接触将载玻片饱和以防止样品组分的非特异性结合。在风干之后，将载玻片在4℃储存直到使用。将表型确定的红细胞用0.9％等渗盐水溶液洗涤，并且之后以0.5％悬浮。之后在20min期间，在37℃，在湿润房间中，用载玻片温育该红细胞悬浮液。之后，将载玻片用0.9％等渗盐水溶液洗涤以移除未结合的红细胞。之后使用微流体探针放置在低离子强度缓冲液中稀释的4μg/ml单克隆抗D mAb(一抗)和10μg/ml藻红蛋白标记的抗人球蛋白mAb(二抗)的样品混合物。因为在不使用任何标记的情况下样品混合物是不可检测的，以双流动限制方式运行微流体探针，这意味着样品混合物嵌套在其本身被限制在浸渍液体(PBS)内的另一种成形液体(shapedliquid)内部。在这种情况中，用荧光素溶液进行第二限制，其是可见的并且确保样品混合物的适合的限制。利用微流体探针，将样品混合物用通道2分配并且用通道3吸出，并且将荧光素溶液用通道1分配并且用通道4吸出。
方法
用微流体探针的通道2以3.5μl/min将单克隆抗D mAb与10μg/ml藻红蛋白标记的抗人球蛋白mAb的混合物(3μl)吸出。分配足够量的PBS缓冲液(处理液)以将载玻片的整个表面润湿。之后使微流体探针位于载玻片上方并且设置双流动限制方式。在使双流动限制稳定之后，设置探针以在相同位置保持30s至180s之间。样品施加和未结合的材料的移除是同时的。通过用荧光微阵列分析仪SensoSpot(Sensovation AG，Radolfzell，GE)对荧光进行读数来检测被抗人球蛋白mAb标记的并且与天然的红细胞连接的抗体的存在或不存在。
如在图16中所示，无论抗D mAb与D阳性RBC结合多长时间，探针都保持在相同位置。当向D阳性RBC分别施加单克隆抗D mAb和标记的抗人球蛋白mAb时，获得类似的结果。这个实验证明可以在其中与未结合的材料的移除同时施加样品的抗体筛选/鉴别方法中使用微流体探针。
实施例7B：反向ABO分类试验
这个分析的目的是显示血液样品中针对A和/或B血型抗原的天然抗体的存在或不存在。结合在直接试验中得到的结果，这个分析的结果将使得能够建立样品的ABO血型。在反向ABO分类试验中使用的样品可以是血清、血浆或全血样品。为了证明利用本发明的技术进行反向ABO分类的可能性，使用基底的表面通过通用抗体固定天然的表型确定的红细胞。对于本申请来说，使用微流体探针放置患者血浆血清并且移除未结合的材料。
材料
与在前述实施例中一样，用通用抗红细胞抗体将整个聚苯乙烯载玻片的表面完全官能化。在将通用抗红细胞抗体放置到载玻片的表面上之后，通过与补充有1％BSA的PBS接触将载玻片饱和以防止样品的非特异性结合。将这些载玻片风干并且在4℃储存直到使用。将表型确定的A阳性红细胞用0.9％等渗盐水溶液洗涤，并且悬浮至0.5％的最终浓度。之后在37℃，在湿润房间中，用载玻片温育该红细胞悬浮液20min。接下来，将载玻片用0.9％等渗盐水溶液洗涤以移除未结合的红细胞。之后使用微流体探针放置来自B血型的人的血浆。因为在不使用任何标记的情况下血浆是不可检测的，与在前述实施例中一样再次以双流动限制方式使用微流体探针。
方法
用微流体探针的通道2以3.2μl/min将血浆样品吸出。将足够的缓冲液(处理液)分配至载玻片上以润湿整个表面。使微流体探针位于载玻片上方并且之后设置双流动限制方式。当使双流动限制稳定时，设置探针以在相同位置保持30s至180s之间。同样地，样品施加和未结合的材料的移除同时进行。之后在具有10μg/ml藻红蛋白标记的抗人H+L Ab的浴中将载玻片在37℃温育15min。通过用荧光微阵列分析仪SensoSpot(Sensovation AG，Radolfzell，GE)对荧光进行读数来检测被抗人H+L Ab标记的并且与天然的红细胞结合的血浆抗体的存在或不存在。
如在图17中所示，抗D mAb与A阳性RBC结合，结合的强度随着时间而增加，其中探针保持在相同位置。这个实验证明可以在其中与移除未结合的血浆材料同时的向表型确定的红细胞施加患者血浆的反向分类方法中使用微流体探针。
实施例8：交叉匹配
这个分析的一个目的是确保在一种或多种血细胞浓缩物从供体到接受者的输送的情况下中，存在完全的供体-接受者相容性。另一个目的是为了证明与在接受者的血浆中针对由供体的红细胞携带的血型结构的抗体的存在有关的不相容性。使用微流体探针进行供体红细胞通过通用抗体的固定，以放置患者血浆，并且移除非特异性结合的患者血浆材料。用标记的抗人球蛋白Ab进行与红细胞结合的血浆抗体的存在或不存在的检测。
材料
与在实施例7A中一样，用通用抗红细胞抗体将整个聚苯乙烯载玻片的表面完全官能化。在将通用抗红细胞抗体放置在载玻片的表面上之后，通过与补充有1％BSA的PBS接触将载玻片饱和以防止样品组分的非特异性结合。将载玻片风干并且在4℃储存直到使用。将A+供体红细胞用0.9％等渗盐水溶液洗涤，并且以50％的浓度悬浮。为了分配A+供体RBC，以流体动力流限制方式如下操作微流体探针：通道1：吸出，通道2：分配，和通道3：吸出。之后使用双限制方式如下分配A+或O+患者血浆：将血浆用通道2分配并且用通道3吸出，并且将荧光素溶液用通道1分配并且用通道4吸出。
方法
在本实施例中，用微流体探针以1.5μl/min将2.5μl的A+供体红细胞悬浮液(50％的稀释悬浮液)吸出。将PBS缓冲液(处理液)分配至载玻片中以润湿整个表面。之后使微流体探针位于载玻片上方并且之后设置流动限制。当使流动限制稳定时，以0.03mm/s对微流体探针的运动编程以画出沿着X轴的直线。线的长度是约12mm。在探针的运动期间，A+供体红细胞立刻结合至与载玻片的表面结合的通用抗红细胞抗体。归因于连续流动，在分配红细胞时，同时移除未结合的红细胞。如之前描述的，之后使用微流体探针以双流动限制方式放置A+或O+患者血浆。利用微流体探针，以3μl/min将2μl的血浆吸出。将微流体探针设置为在A+血浆的情况下保持在相同位置60秒，并且在O+血浆的情况下保持在相同位置30或60秒。与向之前施加的RBC施加血浆同时，用探针移除未结合的材料。之后在具有10μg/ml藻红蛋白标记的抗人球蛋白Ab的浴中将载玻片在37℃温育15min。最后，通过用荧光微阵列分析仪SensoSpot(Sensovation AG，Radolfzell，GE)对荧光进行读数来检测被藻红蛋白标记的抗人球蛋白Ab标记的并且与天然的红细胞结合的抗体的存在或不存在。
如在图18A和18B中所示，A+血浆不与A+红细胞结合(例如，仅检测到微弱的点)。然而，在O+血浆的情况下，甚至在30秒的温育时间下，也观察到结合。这个实验证明可以在其中与移除未结合的血浆材料同时的向固定的红细胞施加供体血浆的交叉匹配方法中使用微流体探针。
如在本说明书中和在所附权利要求中(以及在本文的各项中)使用的，术语“包含(comprise)”及其变体如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”，当位于对步骤或要素的提及之前时，意在表示另外的步骤或要素的添加是任选的并且是不被排除的。在本说明书中引用的所有专利、专利申请、和其他公布的参考材料通过整体引用结合在本文中。在本文中引用的任何参考材料或任何一般的现有技术与本说明书的明确教导之间的任何矛盾意在借助本说明书中的教导解决。这包括在词语或短语的本领域所理解的定义与相同的词语或短语在本说明书中明确给出的定义之间的任何矛盾。
美国专利申请13/881,989的文本结合在下文中。

Claims (34)

1.一种确定在样品中物质存在或不存在的方法，所述方法包括：
向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加所述样品，其中所述结合试剂能够与所述样品中的所述物质结合并且所述结合试剂包含针对在红细胞的表面结合的抗原的一种或多种抗体，一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞，一种或多种重组抗原，或一种或多种针对红细胞抗原的抗体和一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞；
从所述固定有结合试剂的基底的至少一部分中移除未结合的材料；和
对应于检测到与固定在所述基底上的所述结合试剂结合的所述物质，确定在所述样品中存在所述物质；
并且对应于未检测到与固定在所述基底上的所述结合试剂结合的所述物质，确定在所述样品中不存在所述物质；
其中所述向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加所述样品的步骤与所述从所述固定有结合试剂的基底的至少一部分中移除未结合的材料的步骤是同时的；
其中用流体动力流限制分配器进行所述向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加所述样品的步骤和所述从所述固定有结合试剂的基底的至少一部分中移除未结合的材料的步骤，其中所述分配器是微流体探针。
2.权利要求1所述的方法，其中所述分配器是具有多个微通道的微流体探针。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述分配器是微流体探针阵列。
4.前述权利要求1或2所述的方法，其中所述分配器是具有基于尺寸排除红细胞的微通道的微流体探针。
5.权利要求4所述的方法，其中所述微通道包括具有小于6微米的直径的横截面。
6.权利要求4所述的方法，其中所述微通道包括具有小于4微米的直径的横截面。
7.权利要求4所述的方法，其中所述微通道包括具有小于2微米的直径的横截面。
8.权利要求4所述的方法，其中所述微通道的直径包括具有1-2微米的直径的横截面。
9.权利要求1或2所述的方法，其中所述基底的表面是湿的。
10.权利要求1或2所述的方法，其中所述向所述基底的表面施加样品的步骤包括将一个或多个样品各自分配到至少一个分离的路径中。
11.权利要求10所述的方法，其中所述路径是直线。
12.权利要求10所述的方法，其中所述路径宽度在25纳米至500微米之间。
13.权利要求1或2所述的方法，其中所述向所述基底的表面施加样品的步骤包括将一个或多个样品各自分配到至少一个分离的点中。
14.权利要求1或2所述的方法，其中所述样品包含血液样品。
15.权利要求1或2所述的方法，其中所述样品包含选自由下列各项组成的组中的组分：全血、红细胞、血浆、血清、和唾液。
16.权利要求1或2所述的方法，其中所述结合试剂固定在分离的线中。
17.权利要求1或2所述的方法，其中所述结合试剂固定在分离的点中。
18.权利要求1或2所述的方法，其中所述结合试剂是1-50种结合试剂。
19.权利要求1或2所述的方法，其中所述物质包含一种或多种针对红细胞抗原的抗体。
20.权利要求1或2所述的方法，其中所述物质包含一种或多种红细胞抗原。
21.权利要求1或2所述的方法，其中所述基底由选自下列各项组成的组中的至少一种材料形成：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯、葡聚糖聚合物、树枝状聚合物、寡核苷酸、聚碳酸酯、塑料、玻璃、硅、氧化硅、金属和金属氧化物、和聚合物官能化的金属和金属氧化物、PVDF、硝酸纤维素、尼龙和聚砜。
22.一种系统，所述系统包括：
在分离位置固定有结合试剂的基底，其中所述结合试剂能够与样品中的物质结合并且所述结合试剂包含针对在红细胞的表面结合的抗原的一种或多种抗体，一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞，一种或多种重组抗原，或一种或多种针对红细胞抗原的抗体和一种或多种天然的或溶血的表型确定的红细胞；
配置成同时将所述样品分配至所述基底上并且从所述基底中移除未结合的材料的流体动力流限制分配器；
配置成照射所述基底的光源；和
配置成检测与所述结合试剂结合的所述物质存在或不存在的检测器，其中所述分配器是微流体探针。
23.权利要求22所述的系统，其中所述分配器是微流体探针阵列。
24.权利要求22所述的系统，其中所述分配器是具有多个微通道的微流体探针。
25.前述权利要求22至24中任一项所述的系统，其中所述分配器是具有基于尺寸排除红细胞的微通道的微流体探针。
26.权利要求25所述的系统，其中所述微通道包括具有小于6微米的直径的横截面。
27.权利要求25所述的系统，其中所述微通道包括具有小于4微米的直径的横截面。
28.权利要求25所述的系统，其中所述微通道包括具有小于2微米的直径的横截面。
29.权利要求25所述的系统，其中所述微通道的直径包括具有小于1-2微米的直径的横截面。
30.前述权利要求22至24中任一项所述的系统，其中所述基底由选自下列各项组成的组中的至少一种材料形成：聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丙烯、聚苯乙烯、葡聚糖聚合物、树枝状聚合物、寡核苷酸、聚碳酸酯、塑料、玻璃、硅、氧化硅、金属和金属氧化物、和聚合物官能化的金属和金属氧化物、PVDF、硝酸纤维素、尼龙和聚砜。
31.一种交叉匹配的方法，所述方法包括：
向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加供体红细胞，其中所述结合试剂能够与所述供体红细胞结合；
从所述固定有结合试剂的基底的至少一部分中移除未结合的供体红细胞；其中所述向在其上固定有结合试剂的基底的表面施加所述供体红细胞的步骤与所述从所述基底的至少一部分中移除未结合的供体红细胞的步骤是同时的；
将患者血浆放置在所述供体红细胞的顶部上；和
移除所述患者血浆的未结合的部分；其中所述将患者血浆放置在所述供体红细胞的顶部上的步骤与所述移除所述患者血浆的未结合的部分的步骤是同时的；
对应于检测到与所述供体红细胞结合的抗体，确定在所述患者血浆中存在所述抗体；和
对应于未检测到与所述供体红细胞结合的所述抗体，确定在所述患者血浆中不存在所述抗体；
其中用流体动力流限制分配器进行所述施加供体红细胞的步骤、移除未结合的供体红细胞的步骤、放置患者血浆的步骤和移除患者血浆的所述未结合的部分的步骤，其中所述分配器是微流体探针。
32.权利要求31所述的方法，其中所述供体红细胞是天然的或溶血的表型确定的红细胞。
33.前述权利要求31至32中任一项所述的方法，其中所述结合试剂包含结合的凝集素或通用抗红细胞抗体。
34.一种用于交叉匹配的系统，所述系统包括：
在其上的分离位置固定有供体红细胞的基底；
配置成同时将供体红细胞或患者血浆分配至所述基底上并且从所述基底中移除未结合的供体RBC或所述患者血浆的未结合的部分的流体动力流限制分配器，其中所述分配器是微流体探针；
配置成照射所述基底的光源；和
配置成检测与所述供体红细胞结合的抗体存在或不存在的检测器。
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