WO2017130829A1 - マイクロアレイ、マイクロアレイの製造方法、検査方法、及び検査キット - Google Patents

マイクロアレイ、マイクロアレイの製造方法、検査方法、及び検査キット Download PDF

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WO2017130829A1
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microarray
antibody
antigen
blood sample
red blood
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PCT/JP2017/001724
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和男 鉢村
亮 長塩
佐藤　雄一
大谷　慎一
有作 狩野
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学校法人北里研究所
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Publication date
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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a microarray, a microarray manufacturing method, an inspection method, and an inspection kit.
  • This application claims priority on January 25, 2016 based on Japanese Patent Application No. 2016-011762 filed in Japan, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • Allogeneic anti-hemocyte antibodies produced by transfusion or maternal immunity during childbirth can cause serious side effects or miscarriages in later transfusions or pregnancy. Therefore, at present, examination by the indirect antiglobulin test (IDAT), which can detect most of the irregular antibodies clinically relevant to the antibody screening method, is essential (see, for example, Non-Patent Document 1). .
  • ITT indirect antiglobulin test
  • a physiological saline method, an enzyme method, an albumin method, etc. can be used for irregular antibody screening.
  • these methods are supported in combination with IDAT. Should be used in the future.
  • the test tube method is widely used as a daily inspection for IDAT.
  • the column agglutination method is employed in IDAT for irregular antibody screening (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • the inspection can be automated, the reproducibility of the results is good, and the judgment is objective.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and can simultaneously react a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes in the same reaction phase, and can detect irregular antibodies easily and with high sensitivity.
  • a microarray that allows identification is provided.
  • a microarray for detecting and identifying irregular antibodies in a blood sample in which a set of erythrocytes or erythrocyte ghosts presenting a known antigen on a cell surface is regularly immobilized on a substrate
  • a method for producing a microarray for detecting and identifying irregular antibodies in a blood sample comprising a set of solutions containing red blood cells or red blood cell ghosts presenting a known antigen on a cell surface on a substrate
  • a method for producing a microarray comprising a step of individually dropping and drying at a predetermined position.
  • [4] A method for examining irregular antibodies in a blood sample, wherein the microarray according to [1] or [2] is contacted with a blood sample collected from a subject, and a first antigen-antibody reaction And a step of washing the microarray, bringing the labeled anti-human antibody into contact with each other, performing a second antigen-antibody reaction, and detecting the labeled anti-human antibody. Inspection method.
  • the test method according to [4] wherein the blood sample is blood, serum, or plasma.
  • a kit for examining irregular antibodies in a blood sample comprising the microarray according to [1] or [2] and a labeled anti-human antibody. kit.
  • a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and irregular antibodies can be easily detected and identified.
  • a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and irregular antibodies can be made easier and more sensitive than conventional methods. Can be detected and identified.
  • the present invention is a microarray for detecting and identifying irregular antibodies in a blood sample, wherein the set of red blood cells or red blood cell ghosts presenting a known antigen on a cell surface on a substrate is regular.
  • An immobilized microarray is provided.
  • a set of red blood cells or red blood cell ghosts is regularly immobilized on the cell surface on the substrate, and the antigen presented on the cell surface of the red blood cells or red blood cell ghosts maintains the antigenicity. . Therefore, according to the microarray of this embodiment, a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and irregular antibodies can be easily detected and identified. Further, by using a labeled antibody described later, it is possible to detect and identify irregular antibodies in a blood sample more easily and with higher sensitivity than conventional methods.
  • the present inventors have found that various types of red blood cells are arrayed, and have completed the present invention.
  • Conventionally there has been a problem that the reagent red blood cells are hemolyzed over time during storage and must be discarded with the expiration date as the limit, but the microarray of this embodiment has the immobilized red blood cells in a dry state. Therefore, freezing allows long-term storage and does not waste reagent red blood cells.
  • microarray means an antigen (in this specification, an erythrocyte displaying an antigen on a cell membrane) that specifically binds to an antibody of interest (in this specification, an irregular antibody). (Or erythrocyte ghost) is spotted in an array on a support such as a slide glass or a membrane. By reacting the antigen on the spot with a sample containing the antibody of interest, the antibody bound to the spot can be detected and quantified.
  • An array on which such an antigen is immobilized may be called a “microchip”.
  • agent erythrocytes mean erythrocytes that present on the cell membrane an antigen that specifically binds to known irregular antibodies.
  • Reagent erythrocytes may be in a state where erythrocytes are suspended in a solvent such as sodium chloride solution (for example, 0.9% (w / v) NaCl), and further frozen in a state suspended in the above-mentioned solvent. It may be in a state of being made.
  • Erythrocyte ghost means a cell membrane that lyses red blood cells and is empty.
  • an erythrocyte ghost indicates a cell membrane having an empty content in a state where an antigen on the cell membrane is presented.
  • “irregular antibody” means an antibody against blood group antigens other than ABO blood group such as anti-D antibody and anti-E antibody.
  • irregular antibodies may be naturally born (IgM type) or immunized by transfusion or pregnancy (IgG type). In this specification, irregular antibodies are IgM type. And both IgG and IgG types.
  • Known antigens presented on the cell surface of erythrocytes or erythrocyte ghosts may be those that are generally used in conventional irregular antibody screening, such as C, c, D, E, e, K or the like may be mentioned, and these antigens may be modified or purified in order to optimize the binding with an antibody.
  • blood group antigens by blood group classification methods such as Rh formula, Kell formula, Duffy formula, Kidd formula, Xg formula, Lewis formula, MNS formula, P formula, Lutheran formula, and Diego formula Etc. These blood group antigens are shown in the following table along with their blood group classification methods.
  • the substrate used for the microarray is not particularly limited, and examples thereof include glass, metal, and plastic.
  • the substrate of the present embodiment may be a plastic from the viewpoint of surface treatment ease and mass productivity.
  • An example of the plastic is a thermoplastic resin.
  • the thermoplastic resin polycarbonate, polyethylene, polypropylene, polystyrene, saturated cyclic polyolefin, polypentene, polyamide, and copolymers thereof from the viewpoint of low fluorescence generation and easy to obtain a high signal-to-noise ratio (S / N ratio). Etc.
  • the saturated cyclic polyolefin means a polymer having a cyclic olefin structure or a saturated polymer obtained by hydrogenating a copolymer of a cyclic olefin and an ⁇ -olefin.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, and examples thereof include a slide glass shape, a multiwell plate shape, and a disk shape.
  • the substrate may constitute a microchannel device having a fine channel.
  • the size of the substrate may be in a range applicable to the apparatus to be used.
  • the present invention relates to a method for producing a microarray for detecting and identifying irregular antibodies in a blood sample, comprising a red blood cell or red blood cell ghost presenting a known antigen on a cell surface on a substrate.
  • a method for producing a microarray which comprises a step of individually dropping a set of a solution containing the solution at a predetermined position and drying the solution.
  • a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and a microarray capable of easily detecting and identifying irregular antibodies can be obtained. .
  • FIG. 1 is a schematic view showing a method for manufacturing a microarray in the present embodiment. The manufacturing method of this embodiment is demonstrated in detail below, referring FIG.
  • a set of red blood cells or a solution containing red blood cell ghosts 1 is dropped onto a predetermined position on the substrate.
  • the method of dripping and fixing can be determined by a person skilled in the art according to a known method according to the material of the substrate 4 or the like.
  • a solution containing red blood cells or red blood cell ghosts can be dropped using a commercially available spotter.
  • the size of the spot 3 onto which red blood cells or red blood cell ghosts are dropped may be, for example, about 0.2 to 1 mm in diameter.
  • the same substrate as the above-mentioned “microarray” can be mentioned.
  • the predetermined position is a position where other kinds of red blood cells or solutions containing red blood cell ghosts 1 are uniformly arranged at equal intervals without being mixed with each other.
  • the dropped substrate is placed in an environment with a relative humidity of 40% or less, such as 10% or more and 40% or less, such as 20% or more and 35% or less. It is allowed to stand for 20 hours or less, for example 0.5 hours or more and 16 hours or less. Thereby, the solvent of the solution containing red blood cells or red blood cell ghosts 1 can be removed and dried. You may implement the temperature in drying at about 4 degreeC or more and 37 degrees C or less.
  • the dripping drying process may include a substrate preparation process, a solution preparation process, a blocking process, a spot inspection process, and the like.
  • a step of preparing the substrate may be provided before the solution containing red blood cells or red blood cell ghosts is dropped onto the substrate.
  • the surface of the substrate may be coated with a polymer having a functional group for immobilizing red blood cells or red blood cell ghosts.
  • the functional group may be a chemically active group, and more specifically, an aldehyde group, an active ester group, an epoxy group, a vinyl sulfone group, a thiol group, an amino group, an isocyanate group, an isothiocyanate group, Examples thereof include a hydroxyl group, an acrylate group, a maleimide group, a hydrazide group, an azide group, an amide group, a sulfonate group, and a carboxyl group.
  • the polymer may further have a group capable of forming a covalent bond with a functional group on the substrate surface to bond the polymer onto the substrate.
  • a group may be a chemically active group, and more specifically, an alkoxysilane group, an aldehyde group, an active ester group, an epoxy group, a vinylsulfone group, a thiol group, an amino group, an isocyanate group. , Isothiocyanate group, hydroxyl group, acrylate group, maleimide group, hydrazide group, azide group, amide group, sulfonate group and the like.
  • a functional group that reacts with the above group is required on the substrate surface.
  • functional groups include a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, an alkynyl group, and the like.
  • the hydroxyl group can be easily formed by oxidation of the substrate surface.
  • the oxidation of the substrate surface can be performed, for example, by plasma treatment, corona treatment, radiation irradiation treatment, or the like.
  • the polymer coating is performed by applying the polymer dissolved in an organic solvent at a concentration of 0.05% by mass or more and 10% by mass or less to the substrate by dipping, spraying, spin coating, or the like, and then performing the process at 20 ° C. It can be carried out by drying at room temperature of about °C or less or under heating.
  • organic solvent include 2-butanone, ethanol, methanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, acetone, methyl ethyl ketone, and the like.
  • the binding between the surface of the substrate and the polymer may be any type of binding, such as covalent bonding, electrostatic interaction, hydrogen bonding, binding due to hydrophobic effects, etc., so that the polymer does not flow out of the substrate during the assay. In order to do so, it is preferable that they are covalently bonded.
  • a solution preparation step Before the solution containing red blood cells or red blood cell ghosts 1 is dropped on the substrate 4, a solution preparation step may be provided.
  • a solvent 2 such as water is added and suspended to prepare a solution containing red blood cells or red blood cell ghosts 1.
  • the red blood cells or red blood cell ghosts 1 already suspended in the solvent may be further diluted by adding a solvent, or the solvent may be replaced.
  • the amount of the solvent added can be determined according to the amount of antigen necessary to detect the amount of antibody expected to be contained in the blood sample used for the test.
  • Examples of the solvent 2 to be used include water, sodium chloride solution (for example, 0.9% (w / v) NaCl), glucose solution (for example, 5% glucose), surfactant-containing solution (for example, 0.01 % Polysorbate 20), pH buffer solution (for example, phosphate buffer solution) and the like, and further, animal-derived protein may be dissolved in these.
  • sodium chloride solution for example, 0.9% (w / v) NaCl
  • glucose solution for example, 5% glucose
  • surfactant-containing solution for example, 0.01 % Polysorbate 20
  • pH buffer solution for example, phosphate buffer solution
  • animal-derived protein may be dissolved in these.
  • the solution may be replaced with the above buffer solution or the like.
  • the erythrocyte ghost used in the microarray can be prepared using a known method. Specifically, erythrocyte ghosts are obtained by lysing red blood cells with a hypotonic solution or the like to release intracellular substances and leaving an empty cell membrane. The obtained erythrocyte ghost may be fragmented by slicing methods such as sonication, freezing and thawing, and spanning. The fragment size may be 1 ⁇ m or less, or 0.1 ⁇ m or more and 0.5 ⁇ m or less.
  • Blocking process It is preferable to perform a blocking step after the dropping drying step.
  • the substrate after the dripping and drying step is immersed in a blocking agent to deactivate the functional group, or blocking is performed with a surfactant or animal protein.
  • the blocking agent include alkaline solutions such as ethanolamine and sodium hydroxide, surfactants such as Tween 20, animal proteins such as bovine serum albumin, and the like.
  • the blocking step is preferably performed within 1 hour after the completion of the above [Drip drying step]. Thereby, there exists a tendency which can suppress further the dispersion
  • the substrate may be washed with a washing solution after the blocking is completed.
  • the cleaning can be performed, for example, by immersing the substrate in a cleaning solution and then drying the substrate at about 4 ° C. or higher and 37 ° C. or lower.
  • a general buffer solution such as a phosphate buffer solution, a Tris buffer solution, or a physiological saline solution can be used.
  • the substrate may be treated with a protective solution after completion of blocking or after cleaning with a cleaning solution.
  • the treatment with the protective liquid can be performed, for example, by immersing the substrate in the protective liquid and then drying it at room temperature or under heating.
  • the operations such as blocking and washing of the microarray surface can be performed not only by manual operation using a tray or the like, but also by a fully automatic or semi-automatic processing system using a hybridization apparatus or the like.
  • spot inspection process After the blocking step, a step (spot inspection step) for inspecting from the shape that the spot has been reliably performed may be performed. It is easier to check the spot shape if the spot inspection step is performed before the blocking step. However, as described above, by performing the blocking step promptly after the drying step, it is possible to further suppress the variation in the detection signal between the production lots of the produced microarray.
  • the spot inspection process after the blocking process, the time until the blocking process is performed after the dropping drying process may be shortened.
  • the spot inspection process can be performed, for example, by observing the substrate with a microscope.
  • the present invention is a method for examining irregular antibodies in a blood sample, wherein a blood sample collected from a subject is brought into contact with the microarray, and a first antigen-antibody reaction is performed.
  • an inspection method comprising: a step, a step of washing the microarray, contacting a labeled anti-human antibody to perform a second antigen-antibody reaction, and a step of detecting the labeled anti-human antibody. To do.
  • a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and irregular antibodies are detected and identified more easily and with higher sensitivity than conventional methods. be able to. Furthermore, by using a labeled anti-human antibody, irregular antibodies contained in a sample such as blood can be quantified, and the presence or absence of irregular antibodies can be determined more clearly than in conventional methods.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing a method for examining irregular antibodies in a blood sample in the present embodiment. The inspection method of this embodiment will be described in detail below with reference to FIG.
  • the microarray includes the polymer 5, but may not include the polymer 5.
  • ⁇ First antigen-antibody reaction step> a blood sample collected from a subject is dropped on each spot 3 of the microarray 10 on which the red blood cell or red blood cell ghost 1 is immobilized, and the antigen 6 presented on the cell surface of the red blood cell or red blood cell ghost 1 and blood Contact the irregular antibody 7 in the sample.
  • This antigen-antibody reaction is preferably performed at 4 ° C. or higher and 37 ° C. or lower. About reaction time, it can adjust suitably with the quantity of the antigen 6, and the antibody titer of the irregular antibody 7 in a blood sample.
  • blood sample examples include blood, serum, plasma, and the like.
  • Dispensing of blood samples to each spot 3 of the microarray 10 is not only a manual operation using, for example, a micropipette, but also a fully automatic or semi-automatic dispensing process using a contact or non-contact type sample dispensing mechanism or the like. You can build a system.
  • ⁇ Second antigen-antibody reaction step> Subsequently, the blood sample is removed, and the spot 3 is washed with a washing solution.
  • the cleaning can be performed, for example, by removing the cleaning liquid after dispensing the cleaning liquid into the spots.
  • the cleaning liquid for example, the same one as in the above [Blocking Step] can be used.
  • a position recognition mark is set in advance on the substrate, and a position capturing device (for example, a CCD camera) on the sample dispensing device is set. Etc.), the spot position can be stored and indexed by recognizing the mark on the microarray.
  • a solution containing the labeled anti-human antibody 8 is dropped, and the labeled anti-human antibody 8 and the irregular antibody 7 in the blood sample are brought into contact with each other.
  • This antigen-antibody reaction is also preferably performed at 4 ° C. or higher and 37 ° C. or lower. About reaction time, it can adjust suitably with the antibody titer of the anti-human antibody 8 to be used.
  • Examples of the solvent for dissolving the labeled anti-human antibody 8 include the same as those in the above [solution preparation step].
  • anti-human antibody examples include anti-human IgG antibody and anti-human IgM antibody.
  • antibodies against the above-mentioned human immunoglobulin subclasses may be used.
  • Examples of the substance that labels the anti-human antibody include stable isotopes, radioactive isotopes, fluorescent substances, enzymes, magnetic substances, etc. Among them, since they are easy to detect and highly sensitive, they must be fluorescent substances. Is preferred. By providing the labeling substance, whether or not the target irregular antibody is bound can be confirmed easily and with high sensitivity.
  • Examples of stable isotopes include 13 C, 15 N, 2 H, 17 O, and 18 O.
  • Examples of the radioisotope include 3 H, 14 C, 13 N, 32 P, 33 P, and 35 S.
  • fluorescent substance examples include cyanine dyes (for example, Cy3, Cy5, etc.), rhodamine 6G reagents, and other known fluorescent dyes (for example, GFP, FITC (Fluorescein), TAMRA, etc.) and the like.
  • the enzyme examples include alkaline phosphatase and peroxidase (HRP).
  • the labeling substance is an enzyme
  • an enzyme substrate in the case of alkaline phosphatase, p-nitropheny phosphatase (NPP) or the like can be used.
  • NPP p-nitropheny phosphatase
  • the enzyme is peroxidase, 3,3′-diaminobenzidine (DAB), 3,3 ′, 5,5′- Tetramethylbenzidine (TMB), o-phenylenediamine (OPD), or the like can be used.
  • magnétique material examples include gadolinium, Gd-DTPA, Gd-DTPA-BMA, Gd-HP-DO3A, iodine, iron, iron oxide, chromium, manganese, or a complex or chelate complex thereof.
  • the type and presence of the irregular antibody 7 are determined by detecting the labeled anti-human antibody 8. Furthermore, by detecting the labeled anti-human antibody 8, the irregular antibody 7 contained in the blood sample can be quantified.
  • the detection method can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of labeling substance. For example, when detecting an anti-human antibody labeled with a fluorescent substance, it can be detected by a fluorescent scanner or a two-photon excitation scanner.
  • the test method in this embodiment is a fully automatic or semi-automatic test system for irregular antibodies in a blood sample by combining the microarray and peripheral devices necessary for analysis such as a detection mechanism and a sample dispensing mechanism. Can be offered as. According to this inspection system, the type and presence of irregular antibodies contained in a blood sample can be easily and fully automatically or semi-automatically tested. Furthermore, irregular antibodies contained in a blood sample can be quantified, and the presence or absence of irregular antibodies can be determined more clearly than in the conventional method.
  • the present invention provides a kit for testing for irregular antibodies in a blood sample, comprising the above-described microarray and a labeled anti-human antibody.
  • a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and irregular antibodies are detected and identified more easily and with higher sensitivity than conventional methods. be able to. Furthermore, by using a labeled anti-human antibody, irregular antibodies contained in a blood sample can be quantified, and the presence or absence of irregular antibodies can be determined more clearly than in the conventional method.
  • examples of the anti-human antibody include an anti-human IgG antibody and an anti-human IgM antibody.
  • antibodies against the above-mentioned human immunoglobulin subclasses may be used.
  • Examples of the substance that labels the anti-human antibody include the same as those described in the above ⁇ Method for examining irregular antibodies in blood samples >>. Among them, a fluorescent substance is preferable because it is easy to detect and has high sensitivity. By providing the labeling substance, whether or not the target irregular antibody is bound can be confirmed easily and with high sensitivity.
  • the test kit of the present embodiment may further include reagents and devices necessary for testing irregular antibodies.
  • the reagent include a solvent, an enzyme reaction stop solution, and the like.
  • the apparatus include a microplate reader, a fluorescence scanner, and a two-photon excitation scanner.
  • Example 1 Production of microarray 500 microliters of 11 kinds of blood cells of Resolve (registered trademark) panel A (manufactured by Ortho-Clinical Diagnostics, # 156007) were placed in 11 microtubes, and 10 Centrifuged at 1,000 rpm for 15 seconds. Subsequently, the supernatant was removed, and 250 ⁇ L of physiological saline was added to replace the buffer.
  • Resolve registered trademark
  • panel A manufactured by Ortho-Clinical Diagnostics, # 156007
  • Anti-D Serum Dilution Solution Anti-D serum (manufactured by Ortho Clinical Diagnostics, # 120011) was diluted 32-fold with 0.1% Tween20-containing physiological saline.
  • Second antigen-antibody reaction step Subsequently, anti-D serum was removed, and 2 mL of 0.1% Tween 20-containing physiological saline was added dropwise and washed. This operation was repeated three times. Subsequently, the moisture behind the slide glass was wiped off, the slide glass was tilted, and the surface moisture was removed as much as possible. Subsequently, 750 ⁇ L of an anti-IgG-Cy3 fluorescently labeled antibody (Jackson Immuno Research, # 1052235) diluted 100-fold with physiological saline containing 0.1% Tween 20 was added dropwise and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • an anti-IgG-Cy3 fluorescently labeled antibody Jackson Immuno Research, # 1052235
  • the detection result is (3+), when it is 16 to 64 times, it is (1+), and when it is 128 times, it is (-) (negative). It was. (3+) is a positive in which several large erythrocyte aggregates are formed and the background of the solution is transparent, and (1+) is a positive in which a number of small aggregates are formed and the solution background is red and cloudy. is there. Therefore, the minimum detection sensitivity by the test tube method was 64 times.
  • Example 2 Production of microarrays Using the same method as (1) of Example 1, six microarrays were produced.
  • Second antigen-antibody reaction step Using the same method as in (4) of Example 1, the anti-IgG-Cy3 fluorescent label was obtained by washing the microarray and diluting 100 times with 0.1% Tween20-containing physiological saline. 750 ⁇ L of an antibody (Jackson Immuno Research, # 1052235) was added dropwise and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • the mean + 3SD of the blank is 2525, while the mean-3SD when the dilution factor of the anti-D serum is 64 times is 8002, and the mean-3SD is 4991, 256 times when the dilution factor is 128 times The mean-3SD at that time was 2850. Therefore, the minimum detection sensitivity was 256 times.
  • the detection limit of the anti-D serum dilution rate up to 64 times was the detection limit in the test tube method, but the detection method of the present invention was capable of detection up to 256 times. Therefore, it was revealed that the detection method of the present invention has a detection sensitivity at least four times that of the test tube method.
  • Example 3 (1) Production of microarray A microarray was produced using the same method as in (1) of Example 1.
  • First antigen-antibody reaction step 750 ⁇ L of the anti-D serum prepared in (2) is dropped onto 11 spots on which microarray blood cells of (1) are immobilized, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. I let you.
  • Second antigen-antibody reaction step The microarray was washed using the same method as in Example 1, (4). Subsequently, 750 ⁇ L each of anti-IgG-Cy3 fluorescently labeled antibody (Jackson Immuno Research, # 1052235) diluted 100-fold with physiological saline containing 0.1% Tween 20 was placed on 11 spots on which blood cells were immobilized. The solution was added dropwise and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Example 4 Fabrication of microarray Using the same method as (1) of Example 1, the same No. 1 in Table 2 was used. Microarrays having 2, 3, 5, and 6 cells immobilized thereon were prepared. Then, after freezing at ⁇ 30 ° C., it was stored for 92 days.
  • Anti-D serum was diluted 64-fold using the same method as in Example 1 (2).
  • the anti-D serum prepared in (2) is prepared on the four spots prepared in (1) and on which the microarray blood cells in the frozen storage period shown in Table 4 are immobilized. 750 ⁇ L was added dropwise and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and irregular antibodies can be easily detected and identified.
  • the immobilized red blood cells are in a dry state, they can be stored for a long time by freezing, and reagent red blood cells are not wasted.
  • a blood sample and a plurality of types of reagent erythrocytes can be reacted simultaneously in the same reaction phase, and irregular antibodies can be made easier and more sensitive than conventional methods. Can be detected and identified.
  • erythrocyte or erythrocyte ghost 1 ... erythrocyte or erythrocyte ghost, 2 ... solvent, 3 ... spot, 4 ... substrate, 5 ... polymer, 6 ... antigen, 7 ... irregular antibody, 8 ... labeled anti-human antibody, 10 ... microarray.

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Abstract

本発明は、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、簡便且つ高感度に不規則性抗体の検出及び同定を可能とするマイクロアレイを提供する。本発明のマイクロアレイは、血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイであって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されたことを特徴とする。本発明の検査方法は、血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法であって、前記マイクロアレイに、被験者から採取した血液試料を接触させ、第１の抗原抗体反応を行う工程と、前記マイクロアレイを洗浄し、標識された抗ヒト抗体を接触させ、第２の抗原抗体反応を行う工程と、前記標識された抗ヒト抗体を検出する工程と、を備える。

Description

マイクロアレイ、マイクロアレイの製造方法、検査方法、及び検査キット
　本発明は、本発明は、マイクロアレイ、マイクロアレイの製造方法、検査方法、及び検査キットに関する。に関する。
　本願は、２０１６年１月２５日に、日本に出願された特願２０１６－０１１７６２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　輸血や出産時の母子免疫により産生される同種抗血球抗体（不規則性抗体）は、後の輸血や妊娠で重篤な副作用や流産等を惹起する可能性がある。そのため、現在、抗体スクリーニング法に臨床的に意義のある不規則性抗体のほとんどを検出できる間接抗グロブリン法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ａｎｔｉｇｌｏｂｕｌｉｎ　ｔｅｓｔ；ＩＤＡＴ）による検査を必須としている（例えば、非特許文献１参照。）。
　不規則性抗体スクリーニングには、ＩＤＡＴの他に、生理食塩液法、酵素法、アルブミン法等を用いることができるが、検出できる抗体が限られているため、これらの方法はＩＤＡＴと組み合わせて補助的に使用すべきであるとされている。
　ＩＤＡＴには試験管法が日常検査として広く用いられている。また、多くの病院や検査センターでは、不規則性抗体スクリーニングのＩＤＡＴにおいてカラム凝集法を採用している（例えば、非特許文献２参照。）。カラム凝集法では、検査の自動化も可能であり、結果の再現性が良好で、判定も客観的である。
厚生労働省医薬食品局血液対策課、「輸血療法の実施に関する指針（改定版）」、２００５。 小黒博之、「ゲルカラム凝集法による輸血検査」、検査と技術、Ｖｏｌ．４０（Ｎｏ．１２）、ｐ．１３３６－１３４４、２０１２。 西山由加李ほか、「カラム凝集法での抗Ｄ反応が弱いためｐａｒｔｉａｌ　Ｄを疑い、遺伝子検査でｐａｒｔｉａｌ　Ｄ（ＤＢＴ－１）と判明した一例」、日本輸血細胞治療学会誌、Ｖｏｌ．５７（Ｎｏ．４）、ｐ．２６７－２７３、２０１１。 佐竹伊津子、「Ｍｉｃｒｏ　Ｔｙｐｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍゲルカラム凝集法でＲｈＤ陰性と判定されＲｈＤ変異型が疑われた１症例」、日本輸血細胞治療学会誌、Ｖｏｌ．５７（Ｎｏ．２）、ｐ３５６、２０１１。
　ＩＤＡＴにおいて、試験管法では、凝集反応を目視判定するため、主観的で、検者の熟練度により結果が異なるという問題が指摘されている。
　また、カラム凝集法では、この問題を回避することができるが、凝集反応の応用であるため、例えば「ｗｅａｋ Ｄ」や「ｐａｒｔｉａｌ　Ｄ」等の抗原性が弱い亜型の場合において、微弱な凝集から判定が陰性や疑陽性になってしまう症例が報告されている（例えば、非特許文献３及び４参照。）。さらに、カラム凝集法では、使用試薬赤血球種の少ない抗体スクリーニングや血液型の検査には使用されているが、赤血球を同時に１０数種類用いる不規則性抗体同定用には実用化されていない。
　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、簡便且つ高感度に不規則性抗体の検出及び同定を可能とするマイクロアレイを提供する。
　すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイであって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されたことを特徴とするマイクロアレイ。
［２］前記既知の抗原が、Ｄ、Ｃ、Ｅ、ｃ、ｅ、ｆ、Ｃｗ、Ｖ、Ｋ、ｋ、Ｋｐａ、Ｋｐｂ、Ｊｓａ、Ｊｓｂ、Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｊｋａ、Ｊｋｂ、Ｘｇａ、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｎ、Ｐ１、Ｌｕａ、Ｌｕｂ、Ｄｉａ、Ｄｉｂからなる群から選ばれる少なくとも１つである、［１］に記載のマイクロアレイ。
［３］血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイの製造方法であって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液のセットを、予め定められた位置に個別に滴下し、乾燥する工程を備えることを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
［４］血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法であって、［１］又は［２］に記載のマイクロアレイに、被験者から採取した血液試料を接触させ、第１の抗原抗体反応を行う工程と、前記マイクロアレイを洗浄し、標識された抗ヒト抗体を接触させ、第２の抗原抗体反応を行う工程と、前記標識された抗ヒト抗体を検出する工程と、を備えることを特徴とする検査方法。
［５］前記血液試料が、血液、血清、又は血漿である、［４］に記載の検査方法。
［６］血液試料中の不規則性抗体を検査するためのキットであって、［１］又は［２］に記載のマイクロアレイと、標識された抗ヒト抗体と、を備えることを特徴とする検査キット。
　本発明のマイクロアレイによれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を簡便に検出及び同定することができる。また、本発明のマイクロアレイを用いた検査方法によれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を従来法より簡便且つ高感度で、検出及び同定することができる。
本実施形態におけるマイクロアレイの製造方法を示す概略図である。 本実施形態における血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法を示す概略図である。 実施例３における抗Ｄ抗体の検出結果を示す画像である。 実施例３における抗Ｄ抗体の検出結果を示すグラフである。
　以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
≪マイクロアレイ≫
　一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイであって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されたマイクロアレイを提供する。
　本実施形態のマイクロアレイは基板上に細胞表面上に赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されており、赤血球又は赤血球ゴーストの細胞表面上に提示された抗原は抗原性を維持している。よって、本実施形態のマイクロアレイによれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を簡便に検出及び同定することができる。また、後述の標識された抗体を用いることで、血液試料中の不規則性抗体を、従来法より簡便且つ高感度で、検出及び同定することができる。
本発明者らは、多種の赤血球をアレイ化することを見出し、本発明を完成するに至った。従来では、試薬赤血球が保存中、経時的に溶血し、使用期限日を限界として破棄せざるを得ないという問題があったが、本実施形態のマイクロアレイは、固定化された赤血球が乾燥状態であるため、冷凍することで長期保存が可能となり、試薬赤血球に無駄は生じない。
　本明細書において、「マイクロアレイ」とは、目的の抗体（本明細書においては、不規則性抗体）と特異的に結合する抗原（本明細書においては、抗原を細胞膜上に掲示している赤血球又は赤血球ゴースト）をスライドガラスやメンブレン等の支持体の上にアレイ（配列）状にスポットしたものを意味する。スポット上の抗原と目的の抗体を含むサンプルとを反応させ、スポットに結合した抗体を検出及び定量することができる。また、このような抗原を固定化したアレイは「マイクロチップ」と呼んでもよい。
　本明細書において、「試薬赤血球」とは、市販されている、既知の不規則性抗体と特異的に結合する抗原を細胞膜上に提示する赤血球を意味する。試薬赤血球は、赤血球が塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）等の溶媒に懸濁された状態であってもよく、さらに上述の溶媒に懸濁された状態で凍結された状態のものでもよい。
「赤血球ゴースト」とは、赤血球を溶血させ、中身が空の細胞膜を意味する。中でも、本明細書において、赤血球ゴーストは、細胞膜上の抗原が提示された状態で中身が空の細胞膜を示す。
　本明細書において、「不規則性抗体」とは、抗Ｄ抗体や抗Ｅ抗体等ＡＢＯ式血液型以外の血液型抗原に対する抗体を意味する。また、不規則性抗体は生まれつき自然に持っている場合（ＩｇＭ型）と、輸血や妊娠で免疫されて作られる場合（ＩｇＧ型）とがあり、本明細書では、不規則性抗体はＩｇＭ型及びＩｇＧ型の両方を含む。
　赤血球又は赤血球ゴーストの細胞表面上に提示される既知の抗原としては、一般的に従来の不規則性抗体スクリーニングで使用されるものであればよく、例えば、Ｃ、ｃ、Ｄ、Ｅ、ｅ、Ｋ等が挙げられ、抗体との結合を最適化するために、これらの抗原が修飾又は精製されたものであってもよい。
既知の抗原として、より具体的には、Ｒｈ式、Ｋｅｌｌ式、Ｄｕｆｆｙ式、Ｋｉｄｄ式、Ｘｇ式、Ｌｅｗｉｓ式、ＭＮＳ式、Ｐ式、Ｌｕｔｈｅｒａｎ式、及びＤｉｅｇｏ式といった血液型分類法による血液型抗原等が挙げられる。これらの血液型抗原をその血液型分類法とともに、以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本実施形態において、マイクロアレイに用いる基板としては、特に制限はなく、ガラス、金属、プラスチック等が挙げられる。本実施形態の基板は、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックであってもよい。プラスチックとしては、例えば熱可塑性樹脂が挙げられる。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量が少なく、高い信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を得やすい観点から、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリペンテン、ポリアミド、これらの共重合体等が挙げられる。飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独、又は環状オレフィンとα－オレフィンとの共重合体に水素添加した飽和重合体を意味する。
　基板の形状には、特に制限はなく、例えばスライドガラス状、マルチウェルプレート状、円盤状等が挙げられる。基板は、微細な流路を備えたマイクロ流路デバイスを構成していてもよい。基板のサイズは、使用する装置に適用できる範囲であれば構わない。
≪マイクロアレイの製造方法≫
　一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイの製造方法であって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液のセットを、予め定められた位置に個別に滴下し、乾燥する工程を備える、マイクロアレイの製造方法を提供する。
　本実施形態の製造方法によれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を簡便に検出及び同定可能なマイクロアレイを得ることができる。
　図１は、本実施形態におけるマイクロアレイの製造方法を示す概略図である。本実施形態の製造方法を、図１を参照しながら、以下に詳細に説明する。
＜滴下乾燥工程＞
　まず、赤血球又は赤血球ゴースト１を含む溶液のセットを、基板上の予め定められた位置に滴下する。滴下し、固定化する方法は、基板４の材質等に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。例えば、市販のスポッターを使用して赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液を滴下することができる。赤血球又は赤血球ゴーストが滴下されたスポット３のサイズは、例えば、直径０．２～１ｍｍ程度であってよい。
　用いる基板としては、上記の≪マイクロアレイ≫と同様のものが挙げられる。
　予め定められた位置としては、他の種類の赤血球又は赤血球ゴースト１を含む溶液同士が混じり合うことなく、等間隔で均一に配置される位置であることが好ましい。
　続いて、滴下後の基板を、相対湿度４０％以下、例えば１０％以上４０％以下、例えば２０％以上３５％以下の環境下で、例えば０．１時間以上２５時間以下、例えば０．２時間以上２０時間以下、例えば０．５時間以上１６時間以下放置する。これにより、赤血球又は赤血球ゴースト１を含む溶液の溶媒を除去して乾燥させることができる。乾燥における温度は、４℃以上３７℃以下程度で実施してもよい。
　本実施形態の製造方法において、滴下乾燥工程は、基板準備工程、溶液調製工程、ブロッキング工程、スポット検査工程等を備えていてもよい。
［基板準備工程］
　赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液を基板上に滴下する前に、基板を準備する工程を備えていてもよい。
（ポリマー）
　基板の表面は、赤血球又は赤血球ゴーストを固定化するための官能基を有するポリマーでコーティングされていてもよい。上記官能基としては、化学的に活性な基であればよく、より具体的には、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、カルボキシル基等が挙げられる。
　上記ポリマーは、更に、基板表面の官能基と共有結合を形成してポリマーを基板上に結合させることができる基を有していてもよい。このような基としては、化学的に活性な基であればよく、より具体的には、アルコキシシラン基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基等が挙げられる。
　上記の基を用いてポリマーを基板に結合させるには、基板表面に上記の基と反応する官能基が必要となる。このような官能基としては、例えば、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、アルキニル基等が挙げられる。例えば、水酸基は、基板表面の酸化により容易に形成することができる。基板表面の酸化は、例えば、プラズマ処理、コロナ処理、放射線照射処理等により行うことができる。
　ポリマーのコーティングは、例えば、０．０５質量％以上１０質量％以下の濃度で有機溶媒に溶解した上記ポリマーを、上記基板上に、浸漬、スプレー、スピンコーティング等により塗布した後、２０℃以上１２０℃以下程度の室温下又は加温下で乾燥させることにより行うことができる。上記有機溶媒としては、例えば、２－ブタノン、エタノール、メタノール、ｔ－ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。
　基板の表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であってもよいが、アッセイ中にポリマーが基板から流出しないようにするためには、共有結合で結合していることが好ましい。
［溶液調製工程］
　赤血球又は赤血球ゴースト１を含む溶液を基板４上に滴下する前に、溶液調製工程を備えていてもよい。凍結乾燥された赤血球又は赤血球ゴースト１を使用する場合には、水等の溶媒２を適宜の量添加して、懸濁し、赤血球又は赤血球ゴースト１を含む溶液を調製する。また、すでに溶媒に懸濁された赤血球又は赤血球ゴースト１についても、さらに溶媒を添加し、希釈してもよく、又は、溶媒を置換してもよい。溶媒の添加量は、検査に用いる血液試料中に含まれることが予想される抗体の量を検出するのに必要な抗原の量に応じて決定することができる。
使用する溶媒２としては、例えば、水、塩化ナトリウム溶液（例えば、０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）、グルコース溶液（例えば、５％グルコース）、界面活性剤含有溶液（例えば、０．０１％ポリソルベート２０）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝溶液）等が挙げられ、さらに、これらに動物由来のタンパク質が溶解されたものであってもよい。溶液に拡散した状態である市販の赤血球を使用する場合においては、上記の緩衝液等に溶液を置換してもよい。
　赤血球又は赤血球ゴーストの細胞表面上に提示された既知の抗原の種類については、上記の≪マイクロアレイ≫と同様のものが挙げられる。
　マイクロアレイに用いる赤血球ゴーストは、公知の方法を用いて作製することができる。具体的には、赤血球を低張液等で溶血させ、細胞内の物質を放出させて空の細胞膜を残すことで、赤血球ゴーストが得られる。得られた赤血球ゴーストは、超音波処理、冷凍及び解凍、スパニング等の寸断方法でフラグメント化してもよい。フラグメントのサイズは、１μｍ以下であってもよく、０．１μｍ以上０．５μｍ以下であってもよい。
［ブロッキング工程］
　滴下乾燥工程後にブロッキング工程を行うことが好ましい。滴下乾燥工程後の基板をブロッキング剤に浸漬し、官能基を失活させることや、界面活性剤や動物タンパクによりブロッキングを行う。ブロッキング剤としては、例えば、エタノールアミン、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤、ウシ血清アルブミン等の動物タンパク等が挙げられる。
ブロッキング工程は、上記の［滴下乾燥工程］の終了後１時間以内に実施することが好ましい。これにより、製造されるマイクロアレイの、検出シグナルの製造ロット間におけるばらつきを、更に抑制することができる傾向がある。
　ブロッキングの終了後に、基板を洗浄液で洗浄してもよい。洗浄は、例えば、基板を洗浄液に浸漬した後、４℃以上３７℃以下程度で乾燥させることにより行うことができる。洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水等の一般的な緩衝液を用いることができる。
　ブロッキングの終了後又は洗浄液による洗浄後に、基板を保護液で処理してもよい。保護液による処理は、例えば、基板を保護液に浸漬した後、室温下又は加温下で乾燥させることにより行うことができる。
　マイクロアレイ表面のブロッキング、洗浄等の操作は、例えば、トレイ等を用いた手作業だけでなく、ハイブリダイゼーション装置等による全自動あるいは半自動の処理システムを構築できる。
［スポット検査工程］
　上記ブロッキング工程の後に、更にスポットが確実に実施できていることをその形状から検査する工程（スポット検査工程）を実施してもよい。スポット検査工程は、ブロッキング工程の前に行った方がスポットの形状を確認しやすい。しかしながら、上記のとおり、ブロッキング工程を、乾燥工程後速やかに実施することにより、製造されるマイクロアレイの、検出シグナルの製造ロット間におけるばらつきを、更に抑制することができる。
　そこで、スポット検査工程を、ブロッキング工程の後に実施することにより、滴下乾燥工程後ブロッキング工程を実施するまでの時間を短縮してもよい。スポット検査工程は、例えば、基板を顕微鏡で観察することにより実施することができる。
≪血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法≫
　一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法であって、上記のマイクロアレイに、被験者から採取した血液試料を接触させ、第１の抗原抗体反応を行う工程と、前記マイクロアレイを洗浄し、標識された抗ヒト抗体を接触させ、第２の抗原抗体反応を行う工程と、前記標識された抗ヒト抗体を検出する工程と、を備える、検査方法を提供する。
　本実施形態の検査方法によれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を従来法より簡便且つ高感度で、検出及び同定することができる。さらに、標識された抗ヒト抗体を用いることにより、血等試料中に含まれる不規則性抗体を定量化することができ、従来法より明確に不規則性抗体の有無を判断することができる。
　図２は、本実施形態における血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法を示す概略図である。本実施形態の検査方法を、図２を参照しながら、以下に詳細に説明する。
　なお、図２において、マイクロアレイは、ポリマー５を備えているが、備えていなくてもよい。
＜第１の抗原抗体反応工程＞
　まず、上記の赤血球又は赤血球ゴースト１が固定化されたマイクロアレイ１０の各スポット３に、被験者から採取した血液試料を滴下し、赤血球又は赤血球ゴースト１の細胞表面上に提示された抗原６と、血液試料中の不規則性抗体７とを接触させる。この抗原抗体反応は、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、抗原６の量及び血液試料中の不規則性抗体７の抗体価によって、適宜調整することができる。
　本明細書において、「血液試料」としては、例えば、血液、血清、血漿等が挙げられる。
　血液試料のマイクロアレイ１０の各スポット３への分注は、例えば、マイクロピペッター等を用いた手作業だけでなく、接触型又は非接触型のサンプル分注機構等による全自動又は半自動の分注処理システムを構築できる。
＜第２の抗原抗体反応工程＞
続いて、血液試料を取り除き、スポット３を洗浄液で洗浄する。洗浄は、例えば、スポットに洗浄液を分注後、洗浄液を取り除くことにより行うことができる。洗浄液としては、例えば、上記の［ブロッキング工程］と同様のものを用いることができる。
　マイクロアレイ上の同一スポットへ繰り返し洗浄液等を分注する必要がある場合は、例えば、予め基板上に位置認識用の印を設定しておき、サンプル分注装置上の位置捕捉装置（例えば、ＣＣＤカメラ等）でマイクロアレイ上の印を認識することにより、スポット位置の記憶と割り出しを行うことができる。
　続いて、標識された抗ヒト抗体８を含む溶液を滴下し、標識された抗ヒト抗体８と、血液試料中の不規則性抗体７とを接触させる。この抗原抗体反応についても、４℃以上３７℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、使用する抗ヒト抗体８の抗体価によって、適宜調整することができる。また、２次抗原抗体反応後に、上記の＜１次抗原抗体反応工程＞後と同様に、洗浄液でスポット３を洗浄することが好ましい。
　標識された抗ヒト抗体８を溶解する溶媒としては、上記の［溶液調製工程］と同様のものが挙げられる。
　使用する抗ヒト抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体等が挙げられる。また、上記ヒト免疫グロブリンのサブクラスに対する抗体を用いてもよい。
　抗ヒト抗体を標識する物質としては、例えば、安定同位体、放射性同位体、蛍光物質、酵素、磁性体等が挙げられる、中でも、検出が容易且つ高感度であることから、蛍光物質であることが好ましい。上記標識物質を備えることで、目的の不規則性抗体が結合しているか否かを簡便且つ高感度に確かめることができる。
安定同位体としては、例えば１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏ等が挙げられる。放射性同位体としては、例えば３Ｈ、１４Ｃ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ等が挙げられる。
　蛍光物質としては、例えばシアニン色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、その他公知の蛍光色素（例えば、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ＴＡＭＲＡ等）等が挙げられる。
　酵素としては、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等が挙げられる。標識物質が酵素である場合、酵素基質を使用することが好ましい。酵素基質としては、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ　ｐｈｏｓｐｈａｓｅ（ＮＰＰ）等を用いることができ、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができる。
　磁性体としては、例えばガドリニウム、Ｇｄ－ＤＴＰＡ、Ｇｄ－ＤＴＰＡ－ＢＭＡ、Ｇｄ－ＨＰ－ＤＯ３Ａ、ヨード、鉄、酸化鉄、クロム、マンガン、又はその錯体若しくはキレート錯体等が挙げられる。
＜検出工程＞
　続いて、標識された抗ヒト抗体８を検出することにより、不規則性抗体７の種類及び有無を判断する。さらに、標識された抗ヒト抗体８を検出することにより、血液試料中に含まれる不規則性抗体７を定量化することができる。検出方法としては、標識物質の種類により、当業者が適宜選択することができる。例えば、蛍光物質で標識した抗ヒト抗体を検出する場合、蛍光スキャナー又は２光子励起スキャナー等により検出することができる。
　本実施形態における検査方法は、上記のマイクロアレイと、検出機構やサンプル分注機構等の解析に必要な周辺装置とを組み合わせることによって、全自動又は半自動の血液試料中の不規則性抗体の検査システムとして提供することができる。この検査システムによれば、血液試料中に含まれる不規則性抗体の種類及び有無を全自動又は半自動で簡便に検査することができる。さらに、血液試料中に含まれる不規則性抗体を定量化することができ、従来法より明確に不規則性抗体の有無を判断することができる。
≪血液試料中の不規則性抗体を検査するためのキット≫
　一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検査するためのキットであって、上述のマイクロアレイと、標識された抗ヒト抗体と、を備える、検査キットを提供する。
　本実施形態の検査キットによれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を従来法より簡便且つ高感度で、検出及び同定することができる。さらに、標識された抗ヒト抗体を用いることにより、血液試料中に含まれる不規則性抗体を定量化することができ、従来法より明確に不規則性抗体の有無を判断することができる。
　本実施形態の検査キットにおいて、抗ヒト抗体としては、例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体等が挙げられる。また、上記ヒト免疫グロブリンのサブクラスに対する抗体を用いてもよい。
　抗ヒト抗体を標識する物質としては、上述の≪血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法≫と同様のものが挙げられる。中でも、検出が容易且つ高感度であることから、蛍光物質であることが好ましい。上記標識物質を備えることで、目的の不規則性抗体が結合しているか否かを簡便且つ高感度に確かめることができる。
　本実施形態の検査キットは、さらに、不規則性抗体を検査するために必要な試薬及び装置を備えていてもよい。
　試薬としては、例えば、溶媒、酵素反応停止液等が挙げられる、装置としては、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、２光子励起スキャナー等が挙げられる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
（１）マイクロアレイの作製
　１１本のマイクロチューブにリゾルブ（登録商標）パネルＡ（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、＃１５６００７）の１１種の血球それぞれ５００μＬずつ入れて、微量遠心機で１０，０００ｒｐｍ、１５秒遠心分離した。続いて、上清を取り除き、生理食塩水を２５０μＬずつ加えて、バッファーを置換した。続いて、ＭＡＳ－ＧＰ　ＴｙｐｅＡコートスライドガラス（松浪硝子社製、＃Ｓ９９０２）上にマイクロシリンジを用いて、上記バッファーを置換した血球を含む１１種の溶液をそれぞれ１μＬずつ滴下し、冷風で１５分間乾燥させた。保存は－３０℃で行った。また、リゾルブ（登録商標）パネルＡは１１種の血球のセットであり、それぞれの血球細胞表面上のＤ抗原の有無を下記表２に示す。＋はＤ抗原を有し、－はＤ抗原を有さないことを表す。
また、実施例１～３の第１の抗体抗原反応工程において、抗Ｄ血清を滴下したマイクロアレイ上のスポットは、各々表２における同一Ｎｏ．のＣｅｌｌが固定化されたスポットである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）抗Ｄ血清の希釈液の調製
　抗Ｄ血清（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、＃１２００１１）を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水を用いて、３２倍に希釈した。
（３）第１の抗原抗体反応工程
　（２）で調製した抗Ｄ血清７５０μＬを、（１）のマイクロアレイに滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（４）第２の抗原抗体反応工程
　続いて、抗Ｄ血清を取り除き、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水２ｍＬを滴下し、洗浄した。この操作を３回繰り返した。続いて、スライドガラスの裏の水分を拭き取り、スライドガラスを傾け、表面の水分もできるだけ取り除いた。続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で１００倍希釈した抗ＩｇＧ－Ｃｙ３蛍光標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、＃１０５２２３５）７５０μＬを滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（５）検出工程
　続いて、（４）と同様に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水２ｍＬを滴下し、３回繰り返し洗浄した。続いて、マイクロアレスキャナＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（マイクロダイアノスティック社製）を用いて、検出波長５３０ｎｍにて蛍光強度（ＲＦＵ）を測定した。１６重測定から算出した変動係数（ＣＶ）より同時再現性を評価した。また、（２）～（５）の操作を３日間行い、日差再現性を評価した。
　同時再現性は５．４～６．８％であり、日差再現性は１１．７～１４．１％であった。
［比較例１］
（１）抗Ｄ血清の希釈系列の調製
　抗Ｄ血清（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、＃１２００１１）を、生理食塩水を用いて、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、２５６倍の希釈系列を調製した。
（２）試験管法による検出感度の評価
　６本の試験管それぞれにリゾルブ（登録商標）パネルＡ（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、＃１５６００７）中のＤ抗原陽性Ｃｅｌｌ（Ｎｏ．１）を２５μＬずつ予め分注した。続いて、６本のカラムそれぞれに、（１）で調製した８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、２５６倍に希釈した抗Ｄ血清を５０μＬずつ加えた。続いて、３７℃３０分間反応後、生理食塩水を用いて、４回遠心洗浄した。続いて、クームス血清（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、＃１４１００３）を５０μＬずつ加えて、赤血球凝集反応が陽性となる最大希釈倍率を試験管法の検出感度とした。
　抗Ｄ血清の希釈倍率が８倍であるとき、検出結果は（３＋）であり、１６～６４倍であるとき、（１＋）であり、１２８倍であるとき、（－）（陰性）であった。（３＋）とは、数個の大きな赤血球凝集塊が形成され、溶液の背景は透明となる陽性であり、（１＋）とは、小凝集塊がいくつも形成され、溶液背景は赤く濁る陽性である。
よって、試験管法による最小検出感度は６４倍であった。
［実施例２］
（１）マイクロアレイの作製
　実施例１の（１）と同様の方法を用いて、６枚のマイクロアレイを作製した。
（２）抗Ｄ血清の希釈系列の調製
　比較例１の（１）と同様の方法を用いて、抗Ｄ血清の希釈系列を調製した。
（３）第１の抗原抗体反応工程
　（２）の８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１２８倍、２５６倍に希釈した抗Ｄ血清７５０μＬずつを、それぞれ別の（１）で作製したマイクロアレイに滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（４）第２の抗原抗体反応工程
　実施例１の（４）と同様の方法を用いて、マイクロアレイを洗浄し、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で１００倍希釈した抗ＩｇＧ－Ｃｙ３蛍光標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、＃１０５２２３５）７５０μＬを滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（５）検出工程
　続いて、実施例１の（５）と同様の方法を用いて、マイクロアレイを洗浄し、マイクロアレスキャナＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（マイクロダイアノスティック社製）を用いて、検出波長５３０ｎｍにて蛍光強度（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｕｎｉｔｓ：ＲＦＵ）を１５重測定し、ＲＦＵの平均値(ｍｅａｎ)±３×標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＳＤ）を算出し、最小検出感度を求めた。結果を表３に示す。表３は、各希釈倍率の抗Ｄ血清と反応させた６枚のマイクロアレイにおいて、Ｄ抗原陽性Ｃｅｌｌ（Ｎｏ．１）が固定化されたスポットでの蛍光強度を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
表３から、ブランクのｍｅａｎ＋３ＳＤは２５２５であるのに対し、抗Ｄ血清の希釈倍率が６４倍であるときのｍｅａｎ－３ＳＤは８００２、１２８倍であるときのｍｅａｎ－３ＳＤは４９９１、２５６倍であるときのｍｅａｎ－３ＳＤは２８５０であった。
　よって、最小検出感度は２５６倍であった。
　比較例１及び実施例２の結果から、試験管法では抗Ｄ血清の希釈倍率が６４倍までが検出限界であるのに対し、本発明の検出方法では、２５６倍まで検出可能であった。よって、本発明の検出方法は、試験管法の最低でも４倍以上の検出感度を有することが明らかとなった。
［実施例３］
（１）マイクロアレイの作製
　実施例１の（１）と同様の方法を用いて、マイクロアレイを作製した。
（２）抗Ｄ血清の希釈液の調製
　実施例１の（２）と同様の方法を用いて、抗Ｄ血清を３２倍に希釈した。
（３）第１の抗原抗体反応工程
　（２）で調製した抗Ｄ血清を７５０μＬずつ、（１）のマイクロアレイの血球が固定化された１１個のスポット上に滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（４）第２の抗原抗体反応工程
　実施例１の（４）と同様の方法を用いて、マイクロアレイを洗浄した。続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で１００倍希釈した抗ＩｇＧ－Ｃｙ３蛍光標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、＃１０５２２３５）を７５０μＬずつ、血球が固定化された１１個のスポット上に滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（５）検出工程
　続いて、（４）と同様に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水２ｍＬを滴下し、３回繰り返し洗浄した。続いて、マイクロアレスキャナＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（マイクロダイアノスティック社製）を用いて、検出波長５３０ｎｍにて蛍光強度（ＲＦＵ）を測定した。また、実施例２の結果から、抗Ｄ抗体の検出陰性の上限ＲＦＵ値を２５２５とした。結果を図３及び図４に示す。
　図３及び図４から、Ｃｅｌｌ　Ｎｏ．１～４及び１１が陽性であり（平均ＲＦＵ値：１４，８０８）、Ｎｏ．５～１０が陰性であった（平均ＲＦＵ値：２，０３８）。
反応陽性血球のＤ抗原はすべて陽性であり、反応陰性血球のＤ抗原はすべて陰性であり、陽性及び陰性血球の反応性の強弱の差も明瞭で、抗Ｄ抗体が正しく同定された。
［実施例４］
（１）マイクロアレイの作製
　実施例１の（１）と同様の方法を用いて、表２における同一Ｎｏ．２、３、５、及び６のＣｅｌｌが固定化されたマイクロアレイを作製した。次いで、－３０℃の冷凍後で、９２日間保存した。
（２）抗Ｄ血清の希釈液の調製
　実施例１の（２）と同様の方法を用いて、抗Ｄ血清を６４倍に希釈した。
（３）第１の抗原抗体反応工程
　（１）で作製し、表４に示す冷凍保存期間のマイクロアレイの血球が固定化された４個のスポット上に、（２）で調製した抗Ｄ血清を７５０μＬずつ滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（４）第２の抗原抗体反応工程
　実施例１の（４）と同様の方法を用いて、各マイクロアレイを洗浄した。続いて、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水で１００倍希釈した抗ＩｇＧ－Ｃｙ３蛍光標識抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、＃１０５２２３５）を７５０μＬずつ、各マイクロアレイの血球が固定化された４個のスポット上に滴下し、３７℃で３０分間反応させた。
（５）検出工程
　続いて、（４）と同様に、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有生理食塩水２ｍＬを滴下し、３回繰り返し洗浄した。続いて、マイクロアレスキャナＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（マイクロダイアノスティック社製）を用いて、検出波長５３０ｎｍにて蛍光強度（ＲＦＵ）を測定した。結果を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から、マイクロアレイを９２日間冷凍保存しても、Ｄ抗原陽性及びＤ抗原陰性赤血球と抗Ｄ血清との反応性に変化は認められなかった。また、日差再現性も８～１５％と良好な成績であった。
　以上のことから、本発明のマイクロアレイは長期冷凍保存しても、基板上の赤血球（Ｄ抗原）が安定していることが示された。
本発明のマイクロアレイによれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を簡便に検出及び同定することができる。また、本発明のマイクロアレイは、固定化された赤血球が乾燥状態であるため、冷凍することで長期保存が可能となり、試薬赤血球に無駄は生じない。また、本発明のマイクロアレイを用いた検査方法によれば、血液試料と複数種類の試薬赤血球とを同一反応相にて同時に反応させることができ、不規則性抗体を従来法より簡便且つ高感度で、検出及び同定することができる。
　１…赤血球又は赤血球ゴースト、２…溶媒、３…スポット、４…基板、５…ポリマー、６…抗原、７…不規則性抗体、８…標識された抗ヒト抗体、１０…マイクロアレイ。

Claims (6)

  1. 　血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイであって、
    　基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されたことを特徴とするマイクロアレイ。
  2. 　前記既知の抗原が、Ｄ、Ｃ、Ｅ、ｃ、ｅ、ｆ、Ｃｗ、Ｖ、Ｋ、ｋ、Ｋｐａ、Ｋｐｂ、Ｊｓａ、Ｊｓｂ、Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｊｋａ、Ｊｋｂ、Ｘｇａ、Ｌｅａ、Ｌｅｂ、Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｎ、Ｐ１、Ｌｕａ、Ｌｕｂ、Ｄｉａ、Ｄｉｂからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載のマイクロアレイ。
  3. 　血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイの製造方法であって、
    　基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液のセットを、予め定められた位置に個別に滴下し、乾燥する工程を備えることを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
  4. 　血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法であって、
    　請求項１又は２に記載のマイクロアレイに、被験者から採取した血液試料を接触させ、第１の抗原抗体反応を行う工程と、
    　前記マイクロアレイを洗浄し、標識された抗ヒト抗体を接触させ、第２の抗原抗体反応を行う工程と、
    　前記標識された抗ヒト抗体を検出する工程と、
    を備えることを特徴とする検査方法。
  5. 　前記血液試料が、血液、血清、又は血漿である、請求項４に記載の検査方法。
  6. 　血液試料中の不規則性抗体を検査するためのキットであって、
    　請求項１又は２に記載のマイクロアレイと、
    　標識された抗ヒト抗体と、
    を備えることを特徴とする検査キット。
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