JPWO2017130829A1 - マイクロアレイ、マイクロアレイの製造方法、検査方法、及び検査キット - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年1月25日に、日本に出願された特願2016−011762号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
また、カラム凝集法では、この問題を回避することができるが、凝集反応の応用であるため、例えば「weak D」や「partial D」等の抗原性が弱い亜型の場合において、微弱な凝集から判定が陰性や疑陽性になってしまう症例が報告されている(例えば、非特許文献3及び4参照。)。さらに、カラム凝集法では、使用試薬赤血球種の少ない抗体スクリーニングや血液型の検査には使用されているが、赤血球を同時に10数種類用いる不規則性抗体同定用には実用化されていない。
[1]血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイであって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されたことを特徴とするマイクロアレイ。
[2]前記既知の抗原が、D、C、E、c、e、f、Cw、V、K、k、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Xga、Lea、Leb、S、s、M、N、P1、Lua、Lub、Dia、Dibからなる群から選ばれる少なくとも1つである、[1]に記載のマイクロアレイ。
[3]血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイの製造方法であって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液のセットを、予め定められた位置に個別に滴下し、乾燥する工程を備えることを特徴とするマイクロアレイの製造方法。
[4]血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法であって、[1]又は[2]に記載のマイクロアレイに、被験者から採取した血液試料を接触させ、第1の抗原抗体反応を行う工程と、前記マイクロアレイを洗浄し、標識された抗ヒト抗体を接触させ、第2の抗原抗体反応を行う工程と、前記標識された抗ヒト抗体を検出する工程と、を備えることを特徴とする検査方法。
[5]前記血液試料が、血液、血清、又は血漿である、[4]に記載の検査方法。
[6]血液試料中の不規則性抗体を検査するためのキットであって、[1]又は[2]に記載のマイクロアレイと、標識された抗ヒト抗体と、を備えることを特徴とする検査キット。
一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイであって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されたマイクロアレイを提供する。
一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイの製造方法であって、基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液のセットを、予め定められた位置に個別に滴下し、乾燥する工程を備える、マイクロアレイの製造方法を提供する。
まず、赤血球又は赤血球ゴースト1を含む溶液のセットを、基板上の予め定められた位置に滴下する。滴下し、固定化する方法は、基板4の材質等に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。例えば、市販のスポッターを使用して赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液を滴下することができる。赤血球又は赤血球ゴーストが滴下されたスポット3のサイズは、例えば、直径0.2〜1mm程度であってよい。
赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液を基板上に滴下する前に、基板を準備する工程を備えていてもよい。
基板の表面は、赤血球又は赤血球ゴーストを固定化するための官能基を有するポリマーでコーティングされていてもよい。上記官能基としては、化学的に活性な基であればよく、より具体的には、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、カルボキシル基等が挙げられる。
上記ポリマーは、更に、基板表面の官能基と共有結合を形成してポリマーを基板上に結合させることができる基を有していてもよい。このような基としては、化学的に活性な基であればよく、より具体的には、アルコキシシラン基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基等が挙げられる。
赤血球又は赤血球ゴースト1を含む溶液を基板4上に滴下する前に、溶液調製工程を備えていてもよい。凍結乾燥された赤血球又は赤血球ゴースト1を使用する場合には、水等の溶媒2を適宜の量添加して、懸濁し、赤血球又は赤血球ゴースト1を含む溶液を調製する。また、すでに溶媒に懸濁された赤血球又は赤血球ゴースト1についても、さらに溶媒を添加し、希釈してもよく、又は、溶媒を置換してもよい。溶媒の添加量は、検査に用いる血液試料中に含まれることが予想される抗体の量を検出するのに必要な抗原の量に応じて決定することができる。
滴下乾燥工程後にブロッキング工程を行うことが好ましい。滴下乾燥工程後の基板をブロッキング剤に浸漬し、官能基を失活させることや、界面活性剤や動物タンパクによりブロッキングを行う。ブロッキング剤としては、例えば、エタノールアミン、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液、Tween20等の界面活性剤、ウシ血清アルブミン等の動物タンパク等が挙げられる。
上記ブロッキング工程の後に、更にスポットが確実に実施できていることをその形状から検査する工程(スポット検査工程)を実施してもよい。スポット検査工程は、ブロッキング工程の前に行った方がスポットの形状を確認しやすい。しかしながら、上記のとおり、ブロッキング工程を、乾燥工程後速やかに実施することにより、製造されるマイクロアレイの、検出シグナルの製造ロット間におけるばらつきを、更に抑制することができる。
一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法であって、上記のマイクロアレイに、被験者から採取した血液試料を接触させ、第1の抗原抗体反応を行う工程と、前記マイクロアレイを洗浄し、標識された抗ヒト抗体を接触させ、第2の抗原抗体反応を行う工程と、前記標識された抗ヒト抗体を検出する工程と、を備える、検査方法を提供する。
なお、図2において、マイクロアレイは、ポリマー5を備えているが、備えていなくてもよい。
まず、上記の赤血球又は赤血球ゴースト1が固定化されたマイクロアレイ10の各スポット3に、被験者から採取した血液試料を滴下し、赤血球又は赤血球ゴースト1の細胞表面上に提示された抗原6と、血液試料中の不規則性抗体7とを接触させる。この抗原抗体反応は、4℃以上37℃以下にて行うことが好ましい。反応時間については、抗原6の量及び血液試料中の不規則性抗体7の抗体価によって、適宜調整することができる。
続いて、血液試料を取り除き、スポット3を洗浄液で洗浄する。洗浄は、例えば、スポットに洗浄液を分注後、洗浄液を取り除くことにより行うことができる。洗浄液としては、例えば、上記の[ブロッキング工程]と同様のものを用いることができる。
続いて、標識された抗ヒト抗体8を検出することにより、不規則性抗体7の種類及び有無を判断する。さらに、標識された抗ヒト抗体8を検出することにより、血液試料中に含まれる不規則性抗体7を定量化することができる。検出方法としては、標識物質の種類により、当業者が適宜選択することができる。例えば、蛍光物質で標識した抗ヒト抗体を検出する場合、蛍光スキャナー又は2光子励起スキャナー等により検出することができる。
一実施形態において、本発明は、血液試料中の不規則性抗体を検査するためのキットであって、上述のマイクロアレイと、標識された抗ヒト抗体と、を備える、検査キットを提供する。
試薬としては、例えば、溶媒、酵素反応停止液等が挙げられる、装置としては、マイクロプレートリーダー、蛍光スキャナー、2光子励起スキャナー等が挙げられる。
(1)マイクロアレイの作製
11本のマイクロチューブにリゾルブ(登録商標)パネルA(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、#156007)の11種の血球それぞれ500μLずつ入れて、微量遠心機で10,000rpm、15秒遠心分離した。続いて、上清を取り除き、生理食塩水を250μLずつ加えて、バッファーを置換した。続いて、MAS−GP TypeAコートスライドガラス(松浪硝子社製、#S9902)上にマイクロシリンジを用いて、上記バッファーを置換した血球を含む11種の溶液をそれぞれ1μLずつ滴下し、冷風で15分間乾燥させた。保存は−30℃で行った。また、リゾルブ(登録商標)パネルAは11種の血球のセットであり、それぞれの血球細胞表面上のD抗原の有無を下記表2に示す。+はD抗原を有し、−はD抗原を有さないことを表す。
また、実施例1〜3の第1の抗体抗原反応工程において、抗D血清を滴下したマイクロアレイ上のスポットは、各々表2における同一No.のCellが固定化されたスポットである。
抗D血清(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、#120011)を、0.1%Tween20含有生理食塩水を用いて、32倍に希釈した。
(2)で調製した抗D血清750μLを、(1)のマイクロアレイに滴下し、37℃で30分間反応させた。
続いて、抗D血清を取り除き、0.1%Tween20含有生理食塩水2mLを滴下し、洗浄した。この操作を3回繰り返した。続いて、スライドガラスの裏の水分を拭き取り、スライドガラスを傾け、表面の水分もできるだけ取り除いた。続いて、0.1%Tween20含有生理食塩水で100倍希釈した抗IgG−Cy3蛍光標識抗体(Jackson Immuno Research社製、#1052235)750μLを滴下し、37℃で30分間反応させた。
続いて、(4)と同様に、0.1%Tween20含有生理食塩水2mLを滴下し、3回繰り返し洗浄した。続いて、マイクロアレスキャナGenePix4000B(マイクロダイアノスティック社製)を用いて、検出波長530nmにて蛍光強度(RFU)を測定した。16重測定から算出した変動係数(CV)より同時再現性を評価した。また、(2)〜(5)の操作を3日間行い、日差再現性を評価した。
(1)抗D血清の希釈系列の調製
抗D血清(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、#120011)を、生理食塩水を用いて、8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍の希釈系列を調製した。
6本の試験管それぞれにリゾルブ(登録商標)パネルA(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、#156007)中のD抗原陽性Cell(No.1)を25μLずつ予め分注した。続いて、6本のカラムそれぞれに、(1)で調製した8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍に希釈した抗D血清を50μLずつ加えた。続いて、37℃30分間反応後、生理食塩水を用いて、4回遠心洗浄した。続いて、クームス血清(オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス社製、#141003)を50μLずつ加えて、赤血球凝集反応が陽性となる最大希釈倍率を試験管法の検出感度とした。
よって、試験管法による最小検出感度は64倍であった。
(1)マイクロアレイの作製
実施例1の(1)と同様の方法を用いて、6枚のマイクロアレイを作製した。
比較例1の(1)と同様の方法を用いて、抗D血清の希釈系列を調製した。
(2)の8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍に希釈した抗D血清750μLずつを、それぞれ別の(1)で作製したマイクロアレイに滴下し、37℃で30分間反応させた。
実施例1の(4)と同様の方法を用いて、マイクロアレイを洗浄し、0.1%Tween20含有生理食塩水で100倍希釈した抗IgG−Cy3蛍光標識抗体(Jackson Immuno Research社製、#1052235)750μLを滴下し、37℃で30分間反応させた。
続いて、実施例1の(5)と同様の方法を用いて、マイクロアレイを洗浄し、マイクロアレスキャナGenePix4000B(マイクロダイアノスティック社製)を用いて、検出波長530nmにて蛍光強度(relative fluorescence units:RFU)を15重測定し、RFUの平均値(mean)±3×標準偏差(Standard Deviation:SD)を算出し、最小検出感度を求めた。結果を表3に示す。表3は、各希釈倍率の抗D血清と反応させた6枚のマイクロアレイにおいて、D抗原陽性Cell(No.1)が固定化されたスポットでの蛍光強度を示している。
よって、最小検出感度は256倍であった。
(1)マイクロアレイの作製
実施例1の(1)と同様の方法を用いて、マイクロアレイを作製した。
実施例1の(2)と同様の方法を用いて、抗D血清を32倍に希釈した。
(2)で調製した抗D血清を750μLずつ、(1)のマイクロアレイの血球が固定化された11個のスポット上に滴下し、37℃で30分間反応させた。
実施例1の(4)と同様の方法を用いて、マイクロアレイを洗浄した。続いて、0.1%Tween20含有生理食塩水で100倍希釈した抗IgG−Cy3蛍光標識抗体(Jackson Immuno Research社製、#1052235)を750μLずつ、血球が固定化された11個のスポット上に滴下し、37℃で30分間反応させた。
続いて、(4)と同様に、0.1%Tween20含有生理食塩水2mLを滴下し、3回繰り返し洗浄した。続いて、マイクロアレスキャナGenePix4000B(マイクロダイアノスティック社製)を用いて、検出波長530nmにて蛍光強度(RFU)を測定した。また、実施例2の結果から、抗D抗体の検出陰性の上限RFU値を2525とした。結果を図3及び図4に示す。
反応陽性血球のD抗原はすべて陽性であり、反応陰性血球のD抗原はすべて陰性であり、陽性及び陰性血球の反応性の強弱の差も明瞭で、抗D抗体が正しく同定された。
(1)マイクロアレイの作製
実施例1の(1)と同様の方法を用いて、表2における同一No.2、3、5、及び6のCellが固定化されたマイクロアレイを作製した。次いで、−30℃の冷凍後で、92日間保存した。
実施例1の(2)と同様の方法を用いて、抗D血清を64倍に希釈した。
(1)で作製し、表4に示す冷凍保存期間のマイクロアレイの血球が固定化された4個のスポット上に、(2)で調製した抗D血清を750μLずつ滴下し、37℃で30分間反応させた。
実施例1の(4)と同様の方法を用いて、各マイクロアレイを洗浄した。続いて、0.1%Tween20含有生理食塩水で100倍希釈した抗IgG−Cy3蛍光標識抗体(Jackson Immuno Research社製、#1052235)を750μLずつ、各マイクロアレイの血球が固定化された4個のスポット上に滴下し、37℃で30分間反応させた。
続いて、(4)と同様に、0.1%Tween20含有生理食塩水2mLを滴下し、3回繰り返し洗浄した。続いて、マイクロアレスキャナGenePix4000B(マイクロダイアノスティック社製)を用いて、検出波長530nmにて蛍光強度(RFU)を測定した。結果を以下の表4に示す。
以上のことから、本発明のマイクロアレイは長期冷凍保存しても、基板上の赤血球(D抗原)が安定していることが示された。
Claims (6)
- 血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイであって、
基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストのセットが規則的に固定化されたことを特徴とするマイクロアレイ。 - 前記既知の抗原が、D、C、E、c、e、f、Cw、V、K、k、Kpa、Kpb、Jsa、Jsb、Fya、Fyb、Jka、Jkb、Xga、Lea、Leb、S、s、M、N、P1、Lua、Lub、Dia、Dibからなる群から選ばれる少なくとも1つである、請求項1に記載のマイクロアレイ。
- 血液試料中の不規則性抗体を検出及び同定するためのマイクロアレイの製造方法であって、
基板上に細胞表面上に既知の抗原を提示する赤血球又は赤血球ゴーストを含む溶液のセットを、予め定められた位置に個別に滴下し、乾燥する工程を備えることを特徴とするマイクロアレイの製造方法。 - 血液試料中の不規則性抗体を検査するための方法であって、
請求項1又は2に記載のマイクロアレイに、被験者から採取した血液試料を接触させ、第1の抗原抗体反応を行う工程と、
前記マイクロアレイを洗浄し、標識された抗ヒト抗体を接触させ、第2の抗原抗体反応を行う工程と、
前記標識された抗ヒト抗体を検出する工程と、
を備えることを特徴とする検査方法。 - 前記血液試料が、血液、血清、又は血漿である、請求項4に記載の検査方法。
- 血液試料中の不規則性抗体を検査するためのキットであって、
請求項1又は2に記載のマイクロアレイと、
標識された抗ヒト抗体と、
を備えることを特徴とする検査キット。
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