KR102609257B1 - Abo 항체 검사 장치 및 그 검사 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 실시예에 따른 보체의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity)을 이용한 ABO 항체 검사 방법은,
피검 혈액의 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션하는, 혈구 혼합 단계; 상기 인큐베이션 후, 상기 혈청과 A형 또는 B형 혈구의 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션하는, 인간보체 첨가 단계; 상기 인간보체가 첨가되고 인큐베이션된 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리하는, 헤모글로빈 분리 단계; 상기 분리된 헤모글로빈 중 용혈 헤모글로빈 값을 분광계로 측정하는, 측정 단계; 및 측정된 용혈 헤모글로빈 값에 기초하여 ABO 항체 활성도를 산출하여 적합성을 분석하는, 분석 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 보체의존성 세포독성법(Complement dependent cytotoxicity: CDC)을 이용한 정량적 ABO 항체 측정을 통해 ABO 부적합 고형 장기이식의 생체 면역 반응 모니터링 또는 수혈을 위한 모니터링을 위한 ABO 항체 검사가 체외에서도 용이하고 경제적으로 수행되면서 실제 생체 내 활성을 정확성 높게 평가할 수 있게 되는 효과를 나타낸다.
피검 혈액의 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션하는, 혈구 혼합 단계; 상기 인큐베이션 후, 상기 혈청과 A형 또는 B형 혈구의 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션하는, 인간보체 첨가 단계; 상기 인간보체가 첨가되고 인큐베이션된 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리하는, 헤모글로빈 분리 단계; 상기 분리된 헤모글로빈 중 용혈 헤모글로빈 값을 분광계로 측정하는, 측정 단계; 및 측정된 용혈 헤모글로빈 값에 기초하여 ABO 항체 활성도를 산출하여 적합성을 분석하는, 분석 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 보체의존성 세포독성법(Complement dependent cytotoxicity: CDC)을 이용한 정량적 ABO 항체 측정을 통해 ABO 부적합 고형 장기이식의 생체 면역 반응 모니터링 또는 수혈을 위한 모니터링을 위한 ABO 항체 검사가 체외에서도 용이하고 경제적으로 수행되면서 실제 생체 내 활성을 정확성 높게 평가할 수 있게 되는 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 ABO 혈액형 항체 검사 방법으로서, 더욱 상세하게는 ABO 고형 장기이식을 위한 모니터링 지표로서 ABO 혈액형 항체 농도를 정량적으로 산출하여 내적 활성화를 측정할 수 있도록, 보체의존성세포독성 (complement-dependent cytotoxicity)를 이용한 ABO 항체 용혈 활성 측정을 통해 ABO 항체 농도를 검사하는 방법에 관한 것이다.
혈액형 검사는 수혈 또는 조직 이식과 관련하여 혈액 제공자와 수혈자인 환자 간의 혈액 세포 적합성(compatibility) 를 측정하기 위해 사용되며, 환자의 혈청에 함유된 항체와 혈액 제공자의 혈액에 존재하는 항원 사이에 면역학적 반응으로 응집이 발생하는지 여부를 기준으로 결정해왔다. 과거에는 기증자의 ABO 혈액형 항원에 대한 항체를 가지고 있는 혈액형 불일치 장기 이식과 같은 ABO 부적합 고형 장기 이식은 금기시되었으나, 최근에 이와 관련하여 다양한 탈감작(desensitization) 기법의 발전에 따라 현재 한국 및 일본을 중심으로 항체를 제거하고 성공적으로 이식을 수행되어 오고 있어 ABO 부적합 고형 장기 이식에 대한 연구가 활발하게 수행되고 있다. 이러한 경우 어떠한 방법의 탈감작 기법을 사용하더라도 이식 전/후 환자의 모니터링에서 가장 중요한 검사는 ABO 항체 검사이다.
적혈구 표면에 존재하고 Anti-A와 Anti-B가 각각 해당되는 A항원 및 B항원이 체내에서 혈액 혈장의 B항체와 A항체를 만나면 적혈구를 파괴시키는 용혈현상이 발생하지만, 체외에서 검사를 시행할 때에는 육안으로 관찰 가능한 적혈구의 응집현상이 일어난다. ABO 혈액형 체외 검사는 이러한 적혈구의 응집반응을 원리로 이용하여 이루어지는데, 혈구형 검사와 혈청형 검사 두 가지 방법으로 시행된다. 혈구형 검사에서는 검사 대상자의 적혈구를 Anti-A 및 Anti-B 시약과 반응을 시키고, 혈청형 검사에서는 검사 대상자의 혈청(혈액 내의 세포 구성물을 제외한 액체 성분)을 A형 및 B형 혈구 시약과 반응을 시켜 각각의 응집 여부를 확인하여 혈액형을 판정한다.
종래에는 수혈을 위해 수행되어 온 실온식염수법, 항글로불린법, 미세원주응집법 등과 같이 피검 혈액의 혈청에 혈구를 혼합하여 응집강도를 관찰하여 역가를 판정하는 방법이 ABO 부적합 고형 장기이식의 모니터링에도 통상적으로 사용되어 왔으나 이러한 방법들은 표준화가 되어 있지 않고 검사실/검사자 간 변이가 크다는 문제점이 존재한다. 또한, 이러한 ABO 부적합 고형 장기 이식 전/후의 모니터링을 위해서는 ABO 부적합 항체가 실제로 생체 내에서 어떠한 면역반응을 일으킬 수 있는지 항원/항체 반응의 체내의 활성화를 반영할 수 있는 것이 매우 중요하나 ABO 항체 검사에 대해서는 아직까지 ABO 항체가 체내에서 어떠한 면역반응을 일으키는지 측정할 수 있는 항체 검사법이 존재하지 않고 있다. 만의 하나 이러한 면역반응을 검사할 경우에도 어떠한 타입의 항체를 검사하여 체내 면역반응을 모니터링할 것인지에 대해서도 의견이 분분하여 검사에 있어서 통일된 프로토콜을 제시하기 어려운 문제점이 있어 왔다.
(특허문헌) 일본 등록특허공보 제6708558호
본 발명은 위와 같은 문제점들을 해결하기 위해 제안된 것으로서, 체외에서도 ABO항체의 실제 생체 내 활성을 정량적으로 평가할 수 있도록 하여 환자의 ABO 부적합 고형 장기이식의 생체 면역 반응 모니터링에 있어서 검사가 용이하고 경제적이면서 정확성 높은 ABO 항체 검사 시스템 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 이식 시 생체내 활성에 더 높은 영향을 미치는 항체를 사용하여 체외에서도ABO 부적합 고형 장기이식의 생체 면역 반응 모니터링을 위한 보다 정확성 높은 지표를 제공할 수 있는 ABO 항체 검사 시스템 및 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예에 따른 보체의존성 세포독성(Complement-Dependent Cytotoxicity)을 이용한 ABO 항체 검사 방법은, ,
피검 혈액의 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션하는, 혈구 혼합 단계; 상기 인큐베이션 후, 상기 혈청과 A형 또는 B형 혈구의 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션하는, 인간보체 첨가 단계; 상기 인간보체가 첨가되고 인큐베이션된 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리하는, 헤모글로빈 분리 단계; 상기 분리된 헤모글로빈 중 용혈 헤모글로빈 값을 분광계로 측정하는, 측정 단계; 및 측정된 용혈 헤모글로빈 값에 기초하여 ABO 항체의 활성도를 산출하여 적합성을 분석하는, 분석 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 상기 측정 단계는, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환하여 활성도를 도출하는 용혈도 산출 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값은 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환할 수 있다.
상기 용혈도 산출 단계는 상기 ABO 혈액형 항체 역가와 상기 헤모글로빈 용혈도 간의 관계에 기초하여, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 방법은, ABO 고형 장기이식을 위한 모니터링 지표로서 ABO 혈액형 항체 역가를 정량적으로 산출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 보체의존성 세포독성(Complement-Dependent Cytotoxicity)를 이용한 ABO 항체 검사 시스템은,
피검 혈액의 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션하는, 혈구 혼합 모듈; 상기 인큐베이션 후, 상기 혈청과 A형 또는 B형 혈구의 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션하는, 보체 첨가 모듈; 상기 인간보체를 첨가한 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리하는, 헤모글로빈 분리 모듈; 상기 분리된 헤모글로빈 중 용혈 헤모글로빈 값을 분광계로 측정하는, 측정 모듈; 및 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값에 기초하여 ABO 항체 활성도를 산출하여 적합성을 분석하는, 분석 모듈을 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 분석 모듈은, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환하여 활성도를 산출할 수 있다. 상기 용혈도로 변환하여 역가를 산출하는 것은, 상기 ABO 혈액형 항체 역가와 상기 헤모글로빈 용혈도 간의 관계에 기초하여 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환하여 행할 수 있다.
상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값은 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 모듈들 중 적어도 하나 이상의 동작을 자동으로 수행하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 보체의존성 세포독성법을 이용한 정량적 ABO 항체 측정을 통해 ABO 부적합 고형 장기이식의 생체 면역 반응 모니터링 또는 수혈을 위한 모니터링을 위한 ABO 항체 검사가 체외에서도 용이하고 경제적으로 수행되면서 실제 생체 내 활성을 정확성 높게 평가할 수 있게 되는 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 실시예에 따르면, 이식시 생체내 용혈 활성에 더 높은 영향을 미치는 항체인 면역글로블린 M을 더 사용하여 ABO 항체를 측정하도록 하여, ABO 부적합 고형 장기이식의 생체 면역 반응 모니터링을 위한 보다 정확성 높은 지표를 제공할 수 있는 ABO 항체 역가 검사 시스템 및 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도1은 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 개념도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 순서도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 시스템의 블록도이다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 결과를 기존의 역가법으로 검사한 Anti-A 또는 Anti-B 항체 면역글로블린 M 역가 또는 면역글로블린 G 역가와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법으로 산출한 용혈값 (Hemolysis values, %)과 Anti-A 또는 Anti-B 항체의 면역글로불린 M과 면역글로불린 G 역가 검사의 결과의 3차원 분포를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 순서도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 시스템의 블록도이다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 결과를 기존의 역가법으로 검사한 Anti-A 또는 Anti-B 항체 면역글로블린 M 역가 또는 면역글로블린 G 역가와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법으로 산출한 용혈값 (Hemolysis values, %)과 Anti-A 또는 Anti-B 항체의 면역글로불린 M과 면역글로불린 G 역가 검사의 결과의 3차원 분포를 나타내는 그래프이다.
이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결(접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 항체 역가는, 미국 혈액은행협회에서 발간하는 기술 매뉴얼에 따르면, 연속적으로 두 배 희석한 혈청과 혈구를 반응시킨 후 육안상 응집을 보인 최대 혈청희석 배수의 역수로 표현된다. 이와 같은 역가 측정은 혈청에 존재하는 항체의 상대적인 양이나 적혈구 항원표현의 상대적인 강도에 대한 정보를 제공할 수 있다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변경 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
이하, 본 발명의 실시예를 나타내는 첨부 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 개념도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에서, 우선 환자의 피검 혈액 샘플에서 획득한 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 (110) 인큐베이션(incubation)을 행한다. 그 후 상기 혼합 용액에 인간 보체(Human complement)를 첨가하여 실제 ABO 부적합 고형 장기가 환자에게 이식되었을 때 인간의 생체 내에서 일어나는 면역학적 반응, 즉 적혈구의 용혈 작용 여부 및 용혈 강도를 체외 환경에서 검사할 수 있도록 한다 (120).
보체계(complement system)는 면역과 염증 반응을 촉진하기 위해 작용하는 혈액내 순환하는 여러 단백들의 집합으로 구성되어 있으며 선천성 체내 면역 체계의 일부이다. 이러한 단백들의 주요 역할은 박테리아 또는 바이러스와 같이 체내에 침입한 이물질을 파괴하는 것이며, 기본적인 보체 단백은 C1 내지 C9으로 알려져 있으며 이러한 구성 성분들은 하위 구성 성분과 억제 물질에 의해 체내에서 조절된다. 특정 위협으로부터 보호하는 항체를 생성하는 획득 면역 체계와 달리, 선청성 면역 체계는 비특이적인 면역반응으로 신속하게 이물질에 반응할 수 있다. 따라서 선청성 면역 체계는 침입한 미생물이나 이물질에 대해 사전 노출이 필요하지 않고 이전 노출에 대한 기억을 유지하지 않는다. 보체 활성화는 여러 경로로 시작될 수 있으나 생성되는 최종 산물은 막공격복합체가 형성되며 보체 활성화로 인해 세포를 용해시키고 면역 복합체의 용해성을 증가시켜 혈청으로부터 제거하는 과정을 도와준다. 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에 사용되는 인간 보체는 상용화되어 시판되는 인간 보체 시약이 사용될 수도 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에 사용되는 인간 보체는 C1 내지 C9 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 혈청과 혈구의 혼합 용액에 인간 보체를 첨가한 후에는 다시 인큐베이션을 수행하고 나서 이를 원심분리하여 혼합용액으로부터 헤모글로빈을 분리해 낸다(130). 분리된 헤모글로빈은 ABO항체 생성 정도에 비례하여 용혈되며, 용혈된 헤모글로빈은 붉은 색상을 띄게 된다. 상기 분리해 낸 헤모글로빈을 분광계를 통해 분광광도법으로 측정하여 색상의 분포에 따라 어느 정도로 헤모글로빈이 용혈되었는지 측정한다(140). 그 이후, 미리 결정된 헤모글로빈의 용혈도(%)와 ABO 항체 역가 사이의 상관관계에 기초하여, 상기 측정된 헤모글로빈의 용혈도를 통해 ABO 항체 역가를 산출하고, 이에 따라 상기 피검 혈액이 이식된 환자의 생체 내에서 얼마나 면역반응을 활성화시키는지 정량적으로 측정할 수 있게 된다.
상기 헤모글로빈의 용혈도(%)와 ABO 항체 역가 사이의 상관 관계의 한 예시는 다음의 결과를 통해 알 수 있다.
Hemolysis (%) = 23.2 X log2(Anti-A IgM titer) - 12.1 --- 식(1)
Hemolysis (%) = 19.9 X log2(Anti-A IgG titer) - 31.5 --- 식(2)
Hemolysis (%) = 23.2 X log2(Anti-B IgM titer) - 15.9 --- 식(3)
Hemolysis (%) = 23.3 X log2(Anti-B IgG titer) - 48.0 --- 식(4)
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 순서도이다. 도 2를 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 보체의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity)를 이용한 ABO 항체 검사 방법은, 피검 혈액의 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션하는, 혈구 혼합 단계 (210); 상기 인큐베이션 후 상기 혈청과 A형 또는 B형 혈구의 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션하는, 인간보체 첨가 단계 (220); 상기 인간보체를 첨가한 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리하는, 헤모글로빈 분리 단계(230); 상기 분리된 헤모글로빈에서 용혈 헤모글로빈 값을 분광계로 측정하는, 용혈도 측정 단계(240); 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값에 기초하여 혈액형 동종응집소인 ABO 항체의 역가를 산출하여 적합성을 분석하는, 적합성 분석 단계(250)를 포함할 수 있다.
종래에 항체결합반응을 관찰함으로서 검사하던 ABO 항체 검사 방식과 달리, 이러한 구성에 따르면, ABO 항체가 생체 내에서 실질적으로 어떠한 면역반응과 용혈반응을 일으킬 수 있는지 정량적으로 평가할 수 있는 ABO 항체 검사 방법을 제공할 수 있다.
상기 적합성 분석 단계(250)는, 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 상관관계가 미리결정된 헤모글로빈 용혈도(%)로 변환하여 ABO 항체의 역가를 산출하는 역가 산출 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 일실시예에 따른 보체의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity: CDC)를 이용한 ABO 항체 검사 방법은, ABO고형 장기이식을 위한 정확성 높고 경제적인 모니터링 지표로서 ABO 혈액형 항체 활성도를 정량적으로 산출하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 일실시예에 따른 보체의존성 세포독성을 이용한 ABO 항체 검사 방법은 수혈을 위한 혈액검사 지표로서도 효과적으로 사용될 수 있다.
이 방법을 이용하여 면역글로블린 M(IgM)이 면역글로블린 G(IgG) 보다 생물학적 활성도를 결정하는 데에 더 중요함을 확인할 수 있었다. 면역글로불린은 신체의 면역 체계에서 박테리아, 바이러스 및 다른 미생물뿐만 "자신이 아닌 이물질" 및 유해한 항원으로 인식 되는 물질에 대한 반응에서 형질세포라고 하는 특정 면역 세포에 의해 생산되는 단백질로서, 후속 노출된 면역 시스템은 노출되었던 항원을 기억하여 더 많은 항체 또는 면역글로불린의 신속한 생산을 가능하게 하고 재감염을 방지하도록 한다. 면역글로불린의 5개의 주요 클래스는 면역글로불린 G(IgG), 면역글로불린 A(IgA), 면역글로불린 M(IgM), 면역글로불린 D(IgD), 면역글로불린 E(IgE)를 포함하며, 이 중에서 고형장기 이식에 의미있는 영향을 주는 면역글로불린으로서 면역글로불린 M(IgM)과 면역글로불린 G(IgG)이 본 발명에 따른 ABO 항체 검사 방법에 사용될 수 있다. 다만, 본 발명의 발명자는 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에서 A 항원 용혈 측정 및 B 항원 용혈 측정 모두에서 헤모글로빈의 용혈도를 결정하는 데에 있어서, 생체 내 활성 측면에 있어서 IgM이 IgG보다 더 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 따라서, 역사 검사를 이용한 ABO 항체 검사 시에 면역글로불린 M(IgM)이 더 중요한 정보를 제공하는 것으로 이해할 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 시스템(300)의 블록도이다. 도 3을 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 보체의존성 세포독성(CDC)을 이용한 ABO 항체 검사 시스템(300)은, 혈구 혼합 모듈(310), 보체 첨가 모듈(320), 헤모글로빈 분리 모듈(330), 측정 모듈(340), 분석 모듈(350)을 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 시스템(300)은 데이터베이스(360), 제어 모듈(370)을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에 따른 ABO 항체 검사 시스템(300)에서는, 상기 혈구 혼합 모듈(310), 보체 첨가 모듈(320), 헤모글로빈 분리 모듈(330), 측정 모듈(340), 분석 모듈(350) 중 적어도 하나 이상이 시스템 외부에 존재할 수도 있다.
상기 모듈들은 하드웨어, 소프트웨어, 또는 하드웨어와 소프트웨어의 결합에 의해 구현될 수 있다. 도 1 및 도 2의 ABO 항체 검사 방법은 도 3에 따른 ABO 항체 검사 시스템에 의해 수행될 수도 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 시스템(300)은 상기 포함된 모듈들 중 적어도 하나 이상의 일부 또는 전부의 동작을 자동으로 수행하도록 구성될 수도 있다. 이러한 시스템의 자동화는 상기 데이터베이스(36)에 저장되거나 외부에서 입력된 명령어들, 또는 소프트웨어 프로그램에 의해 수행될 수도 있으며, 이 경우 상기 데이터베이스(360)에 저장되거나 외부에서 입력된 명령어들, 또는 소프트웨어 프로그램이 제어 모듈(370)를 통해 상기 모듈들을 제어하여 동작의 자동화를 구현할 수도 있다.
구체적으로, 상기 혈구 혼합 모듈(310)은 피검 혈액의 혈청을 수신하여 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션을 수행할 수 있다.
상기 보체 첨가 모듈(320)은, 상기 인큐베이션된 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션을 수행할 수 있다. 상기 인간 보체는 C1 내지 C9 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에 사용되는 인간 보체는 상용화되어 시판되는 인간 보체 시약이 사용될 수도 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에 사용되는 인간 보체는 C1 내지 C9 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 헤모글로빈 분리 모듈(330)은, 상기 인간 보체가 첨가되고 인큐베이션된 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리할 수 있다.
상기 측정 모듈(340)은 상기 분리된 상청물질 중 용혈 헤모글로빈 값을 분광계를 사용하여 분광광도법으로 측정할 수 있다. 헤모글로빈은 용혈시 적색을 나타내기 때문에 그 생체 내 면역반응의 활성화 지표로서 헤모글로빈 용혈 정도를 분광광도법으로 정량적으로 측정하는 것이 가능하다.
상기 분석 모듈(350)은, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 상관관계가 미리결정된 헤모글로빈 용혈도(%)로 변환하여 ABO 항체의 역가를 산출하여 상기 피검 혈액의 ABO 부적합 고형 장기 이식의 적합성을 분석할 수 있다.
상기 분석 모듈(350)은, 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 상관관계가 미리결정된 헤모글로빈 용혈도(%)로 변환하여 ABO 항체의 역가를 산출하는 역가를 산출할 수도 있다. 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환할 수 있다.
실험예
발명자는 2019년 1월부터 2021년 5월까지 ABO 부적합 고형 장기 이식을 받은 93명이 O형 혈액형 환자에 대하여 본 발명의 일실시예에 따른 보체의존성 세포독성(CDC)을 이용한 ABO 항체 검사 방법을 시험하였다. 피검 환자의 혈청을 ABO 항원인 A1 혈구세포 또는 B 혈구세포와 혼합하여 함께 배양한 후 이에 인간 보체 용액을 첨가하고 다시 배양하였다. 이를 원심분리하여 상청물질(Supernatant)을 수집하여 분리된 헤모글로빈 획득하였다. 분리된 헤모글로빈을 분광계를 통해 분광광도법으로 용혈 헤모글로빈의 값을 측정하고, 용혈 헤모글로빈 값을, ABO 항체 역가와 상관관계화되어 있는 용혈도(%)로 변환하여 ABO 항체 활성도를 산출하였다.
도 4a 내지 도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법의 결과를 기존의 역가법으로 검사한 Anti-A 또는 Anti-B 항체 면역글로블린M 역가 또는 면역글로블린G 역가와 비교하여 용혈값 (Hemolysis values)의 관계를 2차원 분포를 나타낸 그래프이다.
구체적으로, 도 4a는 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에서 A 항원에 대한 면역글로불린M(IgM) 역가에 따른 용혈값(Hemolysis value)을 나타낸 것으로서, y축은 용혈 정도를 백분율로 나타낸 것이며 x축은 Anti-A 항체 역가이다. 두 값의 관계는 이하 식 (1)로 나타낼 수 있다.
Hemolysis (%) = 23.2 X log 2 (Anti-A IgM titer)-12.1 ---- 식(1)
도 4b는 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에서 A 항원에 대한 면역글로불린 G(IgG) 역가에 따른 용혈값(Hemolysis value)을 나타낸 것으로서, y축은 용혈 정도를 백분율로 나타낸 것이며 x축은 Anti-A 항체 역가이다. 두 값의 관계는 다음 식 (2)로 나타낼 수 있다.
Hemolysis (%) = 19.9 X log 2 (Anti-A IgG titer) - 31.5 --- 식(2)
도 4c는 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에서 B 항원에 대한 면역글로불린M(IgM) 역가에 따른 용혈값(Hemolysis value)을 나타낸 것으로서, y축은 용혈 정도를 백분율로 나타낸 것이며 x축은 Anti-B 항체 역가이다. 두 값의 관계는 다음 식 (3)로 나타낼 수 있다.
Hemolysis (%) = 23.2 X log 2 (Anti-B IgM titer) - 15.9 --- 식(3)
도 4d는 본 발명의 일실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법에서 B 항원에 대한 면역글로불린G(IgG) 역가에 따른 용혈값(Hemolysis value)을 나타낸 것으로서, y축은 용혈 정도를 백분율로 나타낸 것이며 x축은 Anti-B 항체 역가이다. 두 값의 관계는 다음 식(2)로 나타낼 수 있다.
Hemolysis (%) = 23.3 X log 2 (Anti-B IgG titer) - 48.0 --- 식(4)
이와 관련하여, 도 4a 내지 도 4d에 대하여 단순선형회귀 분석을 수행한 경우, ABO 항체 역가에 관련된 용혈도(%)의 단순선형회귀 분석 결과는 이하의 [표 1]과 같다.
| 변수 | 이식 전 | |||
| Slope | 95% CI | P | R2 | |
| Anti-A IgM | 23.2 | 15.4 to 31.0 | <0.0001 | 0.4267 |
| Anti-A IgG | 19.9 | 11.7 to 28.0 | <0.0001 | 0.3660 |
| Anti-B IgM | 23.2 | 16.2 to 30.1 | <0.0001 | 0.4968 |
| Anti-B IgG | 23.3 | 15.0 to 31.5 | <0.0001 | 0.4439 |
상기 [표 1]에서, 95% CI는 95% 신뢰구간(confidence interval)을 나타내며, P는 회귀 모델의 유의성, R2는 단순선형회귀 분석에서 그어진 회귀 직선의 설명력을 평가하는 결정계수이다. 즉 본 발명에서는 ABO 혈액형 항체 역가가 상기 헤모글로빈 용혈도를 얼마나 설명할 수 있는지를 나타내는 지표이다. [표 1]에서 볼 수 있듯이, 단순회귀분석을 행하는 경우 결정계수(R2)는 0.3660~0.4968 (p<0.0001) 이내였다. 따라서 ABO 항체 역가는 항체의 체내 활성도(즉, 용혈 정도)를 어느 정도는 반영하지만 모두 설명할 수는 없음을 알 수 있다.
또한, 도 4a 내지 도 4d과 관련하여 이식 전과 이식 후의 ABO 항체 역사에 따른 용혈도 범위(%)를 산출한 결과는 다음의 [표 2]과 같이 나타났다.
| 변수 | 이식 전 | 이식 후 | |||
| 역가 | 용혈도 범위 (%) | 중간값 (%) | 용혈도 범위 (%) | 중간값 (%) | |
| Anti-A IgM |
2 | 0.11-1.11 | 0.73 | 0-2.79 | 0.71 |
| 4 | 0.80-3.93 | 2.14 | 0.10-13.02 | 1.77 | |
| 8 | 2.94 | 2.94 | 1.11-23.40 | 3.28 | |
| 16 | 1.30-24.31 | 10.58 | 7.25-9.16 | 7.25 | |
| Anti-B IgM |
1 | 0.89 | 0.89 | 0.20-1.28 | 0.74 |
| 2 | 0.391 | 0.39 | 0.15-1.52 | 0.87 | |
| 4 | 0-3.72 | 0.83 | 0-2.34 | 1.42 | |
| 8 | 0-10.01 | 4.01 | 1.20-1.26 | 1.23 | |
| 16 | 4.13 | 4.13 | 0-2.20 | 1.10 | |
| 32 | 0-28.25 | 11.00 | 2.85 | 2.85 | |
| Anti-A IgG |
8 | 0.61 | 0.61 | 2.79 | 2.79 |
| 32 | 0.73-3.93 | 1.11 | 1.30-10.31 | 5.41 | |
| 64 | 0.74-2.14 | 0.80 | 0-1.89 | 0.81 | |
| 256 | 1.30-36.34 | 10.51 | 1.11 | 1.11 | |
| Anti-B IgG |
128 | 0-10.01 | 0.89 | 0.00 | 0.00 |
| 256 | 0-3.72 | 0.68 | 2.20 | 2.20 | |
| 512 | 4.13-58.38 | 11.16 | 0.00 | 0.00 | |
| 1024 | 0-43.20 | 28.25 | 2.85 | 2.85 | |
상기 [표 2]에서 볼 수 있듯이, 실제 환자 검체에 적용해 보았을 때 이식 전에는 ABO 항체의 활성도가 높았으나 이식 후에는 전반적으로 같은 역가 수준에도 낮은 것으로 나타나 이식 후 장기가 거부반응없이 잘 기능하는 것을 설명할 수 있다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법으로 산출한 용혈값 (Hemolysis values, %)과 Anti-A 또는 Anti-B 항체의 면역글로불린 M과 면역글로불린 G 역가 검사의 결과의 3차원 분포를 나타내는 그래프이다.
구체적으로, 도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법으로 산출한 용혈값 (Hemolysis values, %)과 면역글로불린 M Anti-A 항체 (IgM Anti-A)와 면역글로불린 G Anti-A항체(IgG Anti-A)의 3차원 분포를 나타내는 그래프이고, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 ABO 항체 검사 방법으로 산출한 용혈값 (Hemolysis values, %)과 면역글로불린 M Anti-A 항체 (IgM Anti-A)와 면역글로불린 G Anti-A항체(IgG Anti-A)의 3차원 분포를 나타내는 그래프이다.
또한, 도 5a 내지 도 5d의 결과에 관련하여 다중선형회귀분석을 수행한 경우, ABO 항체 역가에 관련된 용혈도(%)의 다중선형회귀 분석 결과를 나타낸다.
| 변수 | 다중선형회귀 분석 | |||
| 계수 | t | P | R2 | |
| Anti-A IgM | 12.9 | 3.282 | 0.0018 | 0.5216 - |
| Anti-A IgG | -3.4 | -0.894 | 0.3752 | |
| Anti-B IgM | 8.7 | 2.631 | 0.0110 | 0.5114 - |
| Anti-B IgG | 0.0 | -0.014 | 0.9889 | |
상기 [표 2]에서 계수는 회귀 곡선의 기울기를 나타내고, t는 t-검정 통계값, P는 t-검정 통계의 유의확률, R2는 결정계수를 나타낸다. 상기 [표 2]에 따르면, A 항원 용혈도(%)는 면역글로불린 G(IgG)(β=-3.4)(R2=0.5216)보다 면역글로불린 M(IgM)(β=12.9)에서 더 높았다. 또한, B항원 용혈도(%) 역시 IgG(β=0.0)(R2=0.5114)보다 IgM(β=8.7)에서 더 높았다. 즉 ABO 항체 중에서 체내 활성도(즉 용혈 능력)을 결정하는 주요한 항체는 IgG 보다 IgM 임을 알 수 있다. 기존의 역가 검사로는 이러한 차이를 알아낼 수 없으나 본 기술로서는 이러한 정보를 추가로 획득할 수 있는 장점이 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
300: ABO 항체 검사 시스템 310: 혈구 혼합 모듈
320: 보체 첨가 모듈 330: 헤모글로빈 분리 모듈
340: 측정 모듈 350: 분석 모듈
360: 데이터베이스 370: 제어 모듈
320: 보체 첨가 모듈 330: 헤모글로빈 분리 모듈
340: 측정 모듈 350: 분석 모듈
360: 데이터베이스 370: 제어 모듈
Claims (10)
- 피검 혈액의 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션하는, 혈구 혼합 단계;
상기 인큐베이션 후, 상기 혈청과 A형 또는 B형 혈구의 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션하는, 인간보체 첨가 단계;
상기 인간보체가 첨가되고 인큐베이션된 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리하는, 헤모글로빈 분리 단계;
상기 분리된 헤모글로빈 중 용혈 헤모글로빈 값을 분광계로 측정하는, 측정 단계; 및
측정된 용혈 헤모글로빈 값에 기초하여 ABO 항체 활성도를 산출하여 적합성을 분석하는, 분석 단계를 포함하는, 보체의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity)을 이용한 ABO 항체 검사 방법. - 제1항에 있어서,
상기 분석 단계는, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 용혈도(%)로 변환하여 활성도를 도출하는 용혈도 산출 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제2항에 있어서,
상기 용혈도 산출 단계는 ABO 혈액형 항체 역가와 헤모글로빈 용혈도 간의 미리 결정된 관계에 기초하여, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 역가와 비교한 용혈도(%)로 변환하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 방법은,
ABO고형 장기이식을 위한 모니터링 지표로서 ABO 혈액형 항체 역가를 정량적으로 산출하기 위해 사용되는 것 임을 특징으로 하는, 방법. - 피검 혈액의 혈청에 A형 혈구 또는 B형 혈구를 혼합하고 인큐베이션하는, 혈구 혼합 모듈;
상기 인큐베이션 후, 상기 혈청과 A형 또는 B형 혈구의 혼합 용액에 인간 보체(complement)를 첨가하고 인큐베이션하는, 보체 첨가 모듈;
상기 인간 보체를 첨가한 용액에서 원심분리에 의해 헤모글로빈을 분리하는, 헤모글로빈 분리 모듈; 및
상기 분리된 헤모글로빈 중 용혈 헤모글로빈 값을 분광계로 측정하는, 측정 모듈; 및
측정된 용혈 헤모글로빈 값에 기초하여 ABO 항체 활성도를 산출하여 적합성을 분석하는, 분석 모듈을 포함하는, 보체의존성 세포독성 (complement-dependent cytotoxicity)를 이용한 ABO 항체 검사 시스템. - 제5항에 있어서,
상기 분석 모듈은, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 활성도와 비교한 용혈도(%)로 변환하여 역가를 산출하는 것을 특징으로 하는, 시스템. - 제6항에 있어서,
상기 용혈도로 변환하여 역가를 산출하는 것은, ABO 혈액형 항체 역가와 헤모글로빈 용혈도 간의 미리 결정된 관계에 기초하여, 상기 측정된 용혈 헤모글로빈 값을 ABO 혈액형 항체 활성도와 비교한 용혈도(%)로 변환하는 것을 특징으로 하는, 시스템. - 제5항에 있어서, 상기 시스템은,
상기 혈구 혼합 모듈, 상기 보체 첨가 모듈, 상기 헤모글로빈 분리 모듈, 상기 측정 모듈 및 상기 분석 모듈 중 적어도 하나 이상의 동작을 자동으로 수행하도록 구성되는 것을 특징으로 하는, 시스템. - 제5항에 있어서, 상기 시스템은,
ABO고형 장기이식을 위한 모니터링 지표로서 ABO 혈액형 항체 역가를 정량적으로 산출하기 위해 사용되는 것임을 특징으로 하는, 시스템. - 컴퓨터로 판독가능한 저장매체로서, 제1항에 따른 방법을 자동으로 구현하는 명령어들이 저장된, 컴퓨터 판독가능한 저장 매체.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210153695A KR102609257B1 (ko) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | Abo 항체 검사 장치 및 그 검사 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210153695A KR102609257B1 (ko) | 2021-11-10 | 2021-11-10 | Abo 항체 검사 장치 및 그 검사 방법 |
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| KR20230067939A KR20230067939A (ko) | 2023-05-17 |
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-
2021
- 2021-11-10 KR KR1020210153695A patent/KR102609257B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ELISABETH M. MEULENBROEK et al., Blood Cells. J. Vis. Exp., 2014, Vol. 83, pp 1-6. |
| LILIAN CASTILHO et al., REV BRAS HEMATOL HEMOTER, 2015, Vol. 37, pp 215-216. |
Also Published As
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|---|---|
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