JPH02165052A

JPH02165052A - 免疫学的測定方法

Info

Publication number: JPH02165052A
Application number: JP31964788A
Authority: JP
Inventors: Tomohito Tanaka; 智史田中
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1988-12-20
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1990-06-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、免疫学的凝集反応により抗原又は抗体の存在
を検出し判定するための方法に関する。

〔従来の技術及び課題〕

免疫学的な凝集反応に基づいて凝集又は非凝集粒子の分
布パターンを形成し分析する方法においては、サンプル
中の抗原又は抗体を特定の指標粒子に固定された抗原又
は抗体と混合して結合させると共に、これら反応成分を
反応容器の壁面に移動させ、かつ未結合の指標粒子を同
壁面の一部に集めて分離している。このような方法は、
一般に混合凝集法（ｍ１ｘｅｄ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔ
ｉｏｎ　）と呼ばれ、ν１ｅｎｅｒ、　　Ａ、９．とＩ
ｌｅｒｍａｎ、　　Ｍ、、　　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。！
。

２５５　　（１９３９）において報告されて以来、Ｃｏ
ｏｍｂｓ。

Ｒ、Ｉ？　、　Ａ　、とＢｅｄｆ’ｏｒｄ　、　　Ｄ、
、　　Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、、５　、　１１１（１９５５
）及びＣｏｏｍｂｓ、　Ｒ，Ｒ，Ａ、ら、　Ｌａｎｃｅ
ｔ、　１　。

４８１　　（１９５６）の報告により血液型の判定を行
なうまでに発展確立された。例えば、各種血液型につい
て応用したものに米国特許第４，６０８．２４８号明細
書、米国特許第４，２７５．０５３号明細書（特公昭６
２−４４２２１号）や米国特許第４，３２８，１８３号
明細書がある。また、固体表面で血液型の判定を行なっ
て感度の向上を図ったものに米国特許第２，７７０，５
７２号明細書がある。更に、Ｒｏｓｅｎｆ’１ｅｌｄ　
Ｒ，Ｅ、ら。

Ｐａｒｉｓ　、　Ｐｒｏｃ、　１５Ｔｈ　Ｃｏｎｇ、１
ｎＬ１．　Ｓｏｃ、ＢｌｏｏｄＴｒａｓｆｕｓｉｏｎ、
　２７　（１９７Ｂ）では混合凝集法の原理を利用して
固体表面で赤血球抗原と抗体との反応を行っている。

ところで、従来の混合凝集法では反応容器壁面に対して
酵素で処理された赤血球か、又は未処理の赤血球のいず
れか一方を固定して分析される。

従って、１つの反応容器では単一の反応しか行われてい
ない。

このような酵素による赤血球の処理は、該赤血球のゼー
タ電位を低下させることによって目的とするＩｇＧ性抗
体による血球抗体との凝集を可能にさせるためになされ
る。しかし、この酵素処理においては特定の抗原系が消
失されるため、該抗原系に対する抗体の検出は不可能と
なる。また、前記酵素処理された血球による抗体の分析
手順は生食法とも、Ｃｏｏｍｂｓ法とも同様な処理で進
められるにも拘らず、これら通常の生食法、Ｃｏｏｍｂ
ｓ法とは別の反応容器で行なわれている。その結果、反
応容器、サンプル、試薬等を多量必要となる。更に、サ
ンプルとして酵素によって消失とない抗原に対する抗体
と、酵素によって消失する抗原に対する抗体の両方を含
む場合にはいずれの容器においても陽性反応となるが、
かかる反応容器を分ける方法では必ずしも血球の固定量
、サンプル試薬等の分注量が同一と言い切れないウェル
間で濃度差等を比較することは極めて困難である。

本発明は、上記従来の課題を解決するためになされたも
ので、同一の反応容器で酵素法と生食法、又は酵素法と
Ｃｏｏｍｂｓ法を実施し、得る、つまりサンプル中の２
種の抗体の存在を検出判定し得る免疫学的測定方法を提
供しようとするものである。

〔課題を解決するための手段及び作用〕本発明は、反応
容器の壁面に酵素処理された抗原及び未処理の抗原を固
定した後、この容器内に測定すべき物質と該物質に特異
的に反応するかもしくは競合する粒子とからなる反応液
を入れ、前記物質の分布パターン（凝集パターン）を形
成し、前記抗原と物質との結合状態を測定することを特
徴とする免疫学的測定方法である。

以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。

まず、反応容器壁面に固定すべき抗原（例えば０型赤血
球）をブロメリナ、パパイン等の酵素で処理する。つづ
いて、酵素処理された赤血球と未処理の抗原（例えばＯ
型赤血球）を一定の割合で混和し、これを反応容器内に
固定するか、もしくは前記各赤血球を別々の領域に固定
することによって、第１図に示すように反応容器１の壁
面に酵素処理した赤血球２及び未処理の赤血球３が固定
される。この固定化方法は、種々の公知の方法が適用で
きる。

次いで、サンプルを反応容器中で反応させた後、サンプ
ル中の測定すべき物質と特異的に結合する粒子（例えば
広範囲抗ヒトＩｇＧ感作Ｏ型赤血球）を反応容器内に入
れる。この時、サンプル中の測定すべき物質が酵素処理
によって消失する抗原に対する抗体である場合、第２図
（Ａ）に示すように反応容器ｌの壁面に引き寄せられた
粒子４は該容器ｌ壁面に固定された未処理のＯ型赤血球
３に前記物質（抗体）５を介して結合し、凝集塊を生成
して壁面に一様に広がった分布パターンを形成する。サ
ンプル中の測定すべき物質が酵素処理によって消失しな
い抗原に対する抗体である場合、第２図（Ｂ）に示すよ
うに反応容器１の壁面に引き寄せられた粒子４は該容器
１壁面に固定された未処理のＯ型赤血球３と酵素処理Ｏ
型光血球２に前記物質（抗体）５．５′を介して結合し
、凝集塊を生成して壁面に一様に広がった分布パターン
を形成する。なお、サンプル中の測定すべき物質に結合
しなかった粒子４は、第３図に示すように反応容器ｌの
壁面に沿って移動し、該壁面の一部に収束して集められ
る。

従って、反応容器の壁面に固定した酵素処理した抗原及
び未処理の抗原の配置状態を予め特定化すれば、該容器
の少なくとも一部の壁面に移動した粒子の分布パターン
を用いることによって、前記各抗原に対応するサンプル
中の測定すべき物質による粒子間の結合状態がわかり、
同一の反応容器でサンプル中の２種の測定すべき物質に
ついて存在の有無をＵ＋定することが可能となる。

〔実施例〕

以下、本発明を抗グロブリン試験（Ｃｏｏｍｂｓ法）及
び酵素法による不規則抗体の検出に適用した例について
詳細に説明する。

実施例１くＯ型赤血球固相プレートの作製〉まず、Ｕ字底マイクロプレート（ＮＵＮＣ社、製造番号
４６４３９４）に０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐ
Ｈ７，０で１０Ｍｇ／■ｐに調製した小麦胚芽レクチン
（ＷＧＡ）　　［生化学社製コを各ウェルに１００μｇ
ずつ添加し、室温で３０分間処理した。つづいて、０．
０１Ｍ　ＰＢＳ　、　ｐＨ７，０を３００μｇずつ用い
て５回洗浄し室温で乾燥することによりＷＧＡ処理プレ
ートを得た。

次いで、下記第１表の各血液型抗原を有するヒトＯ型赤
血球であるサージスクリーン（ｏｒＬｈｏ社、製造番号
３Ｓ３８３７）を生理食塩水で０．３に調製し、これを
５０Ｍｇ／ウェル前記ＷＧＡ処理したマイクロプレート
に添加し、室温で１０分間静置することによりサージス
クリーンをマイクロプレートの壁面に吸着、固定した。

サージスクリーンを排出した後、各ウェルの半分に相当
する面積が浸漬されるようにマイクロプレートを傾けて
からブロメリンを分注して酵素処理を行ない、更に生理
食塩水で十分に洗浄を行なった。酵素による処理方法は
、従来の公知の方法で行なった。ひきつづき、０．１％
のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．０１Ｍ　Ｐ
ＢＳ　、　ｐｌ＋７．０を２００μｇずつ用いて洗浄し
た。

く不規則抗体の検出〉前記Ｏ型赤血球固柑プレートに対しＬｌｓｓ液を６０Ｍ
ｇずつとサンプルとして抗Ｋ、抗Ｋ、抗Ｆｙａ抗Ｃ１抗
ｒｙ　　、抗Ｅ、抗Ｊｋ　　、抗ノｋｂの８個の抗し血清（ｏｒｔｈｏ社製）及び陰性コントロールとして０
．０１Ｍ　ＰＢＳを３０Ｍｇずつ各ウェルに添加した後
、３７℃で３０分間反応させた。つづいて、Ｏ，ＯＬＭ
　ＰＢＳ　。

ｐＨ７，０の２００μｇを用いて各ウェルを４回洗浄し
た後、粒子として１．５％の広範回航ヒトＩｇＧ感作０
型赤血球を２５μｇ／ウェル添加した。この後、室温で
１時間反応させた。

しかして、サンプルが添加された各ウェルでの広範囲抗
ヒトＩｇＧ感作Ｏ型赤血球の分布パターンから抗原の存
在を検出したところ、下記第２表に示す結果を得た。な
お、第２表中の反応パターンはウェル底面に広範回航ヒ
トＩｇＧ感作０型赤血球が一様に広がったものを（＋）
、ウェル底面のほぼ半分の面積だけ広範回航ヒトＩｇＧ
感作０型赤血球が一様に広がったものを（＋）、ウェル
中心に広範回航ヒトＩｇＧ感作０型赤血球が集まったも
のを（−）として判定した結果である。

上記第２表から明らかなように判定した抗血清の結果は
、固相化抗原の表現型と一致していることがわかる。

実施例２前記ＷＧＡ処理プレートに酵素処理及び未処理サージス
クリーンを１　：１に混合したものを２５μｇ／ウェル
加え、ウェルに吸着、固定し、前記０．１％のウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）を含む０、ＯＩＭ　ＰＢＳ　、　
ｐｌ＋７．０にて洗浄を行なった。このようにプレート
を用いることにより、酵素処理によって消失しない抗原
に対する抗体の存在下では−様に濃く、一方消失する抗
原に対する抗体の存在下では−様に薄いパターンを形成
する。また、本実施例２では予め２種類のサージスクリ
ーンを混合し、コーティングするのでコーティングの操
作が極めて簡単となる。

実施例３第４図に示すように前記ＷＧＡ処理プレートの各ウェル
８に酵素未処理のＯ型赤血球３を２５μｇ／ウェル分注
して各ウェル６全面にコーティングし、洗浄を行なった
。つづいて、前記コーティング面積のほぼ半分の量に相
当する酵素液で下半分の血球面を処理して酵素処理のＯ
型赤血球２とし、これを生理食塩水で十分に洗浄し、更
に前記０．０ＩＭ　ＰＢＳ　、　ｐＨ７，０にて洗浄を
行なった。このようにしてウェル壁面の高さを異ならせ
て処理された面と未処理の面の２面が同心円状に形成さ
れた。

このプレートを用いることにより、酵素処理によって消
失する抗原に対する抗体の存在下では外側にリング状の
パターンを形成し、一方消失しない抗原に対する抗体の
存在下では全体に−様なパターンを形成する。この実施
例３によれば、上記いずれの抗体を夫々異なるパターン
形状により判別できる。

実施例４第５図に示すように前記ＷＧΔ処理プレートの各ウェル
６にコーティングすべき面積のほぼ半分の量に相当する
酵素未処理のＯ型赤血球３を分注してウェル６の下半面
をコーティングし、洗浄後コーティングすべき面積に相
当する量の酵素処理された０型寿命球２を各ウェル６に
分注することによりウェル６の上半面のコーティングさ
れない部分にコーティングした。ひきつづき、前記０．
０１Ｍ　ＰＢＳ　、　ｐＨ７，０にて洗浄を行なった。

このようなプレートを用いると、酵素処理によって消失
しない抗原に対する抗体の存在下では血球固定面の全体
に−様なパターンを形成する。一方、酵素処理によって
消失する抗原に対する抗体の存在下ではウェル６の上半
面で反応せず、この未反応の抗体骨も含めてサンプル中
の抗体がウェル６した半面で反応するので、ウェル６の
中心全体の半分に相当する小円形の濃いパターンを形成
する。

なお、上記実施例４では始めにウェルの下半面をコーテ
ィングした後、上半面をコーティングしたが、これに限
定されない。例えば、ウェル全面を処理サージスクリー
ンでコーティングした後、新たに下半面をレクチン等を
介して未処理サージスクリーンをコーティングしてもよ
い。

また、上記実施例１．３．４においてサンプルとして酵
素処理によって消失する抗原に対する抗体と消失しない
抗原に対する抗体の両方を含むものを用いてウェル内で
反応を行ない、反応後のウェルを上方から観察した。そ
の結果を、第６図に模式的に示す。第６図（ａ）は、実
施例１のウェルのパターン、同図（ｂ）は実施例３のウ
ェルのパターン、同図（Ｃ）は実施例４のウェルのパタ
ーン、を夫々示す。実施例１．３のウェルのパターンを
示す第６図（ａ）、（ｂ）のいずれにおいても、酵素処
理した血球面と未処理の血球面とでは結合する抗体の数
が異なるので、これら２つの面の間のパターンの濃度差
が生じる。しρ）しながら、かかる濃度差は明瞭でない
ことが多い６そこで、実施例４のようにウェルの上半面
を酵素処理した血球とし、下半面を未処理の血球とする
ことによって、第６図（ｃ）に示すように上半面で結合
しなかった抗体が下半面に移行してその分だけ多く下半
面に結合して一層濃いパターンを形成する。このように
実施例４によれば、サンプルが酵素によって消失する抗
原に対する抗体と消失しない抗原に対する抗体の両方を
含む場合にも特徴ある明瞭なパターンが形成される。

なお、上記実施例においてはＯ型光血球を用いて反応を
行なったが、必要に応じて他の血液型を有する赤血球等
の粒子を使用することができる。

また、酵素の種類も目的に応じて適宜変更したり、組合
わせてもよい。

〔発明の効果〕

以上詳述した如（、本発明の免疫学的測定方法によれば
酵素処理された抗原と未処理の抗原を同一反応容器の壁
面に固定することによって測定すべき物質との反応パタ
ーンから測定すべき物質の予測が可能となり、しかも複
数の、反応様式を同一の反応容器内で反応させることが
可能となり、ひいては少ないサンプル量で迅速に測定す
べき物質の存在の判定、検出を行なうことができる等顕
著な効果を奏する。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応容器の壁面に酵素処理されたＯ型光血球（
抗原）及び未処理のＯ型光血球（抗原）を固定した状態
を示す模式図、第２図（Ａ）、（Ｂ）は反応容器にサン
プルと広範囲抗ヒトＩｇＧ感作Ｏ型赤血球（粒子）を添
加、反応させた時の該粒子の分布パターンを示し、同図
（Ａ）はサンプル中の測定すべき物質が酵素処理によっ
て消失する抗原に対する抗体である場合の前記粒子の分
布パターンを示す模式図、同図（Ｂ）はサンプル中の測
定すべき物質が酵素処理によって消失する抗原に対する
抗体と酵素処理によって消失しない抗原に対する抗体で
ある場合の前記粒子の分布パターンを示す模式図、第３
図はサンプル中の測定すべき物質に結合しなかった粒子
の反応容器内での状態を示す模式図、第４図及び第５図
は、夫々実施例３．４のウェル内での酵素処理、酵素未
処理のＯ型光血球の分布を示す模式図、第６図（ａ）〜
（ｃ）は酵素処理によって消失する抗原に対する抗体と
消失しない抗原に対する抗体の両方を含むサンプルを用
いてウェル内で反応を行ない、反応後のウェルを−Ｌ方
から観察したものを示し、同図（ａ）は実施例１のウェ
ルのパターンを示す模式図、同図（ｂ）は実施例３のウ
ェルのパターンを示す模式図、同図（ｃ）は実施例４の
ウェルのパターンを示す模式図である。 ■・・・反応容器、２・・・酵素処理されたＯ型赤血球
（抗原）、３・・・未処理のＯ型赤血球（抗原）、４・
・・広範囲抗ヒト１ｇＧ感作０型赤血球（粒子）、５．
５″・・・測定すべき物質（抗体）、６・・・ウェル。

Claims

【特許請求の範囲】

反応容器の壁面に酵素処理された抗原及び未処理の抗原
を固定した後、この容器内に測定すべき物質と該物質に
特異的に反応するかもしくは競合する粒子とからなる反
応液を入れ、前記物質の分布パターンを形成し、前記抗
原と物質との結合状態を測定することを特徴とする免疫
学的測定方法。