JP2010529444A - 血液試料の複数分析 - Google Patents
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Abstract
Description
− (i)定型といわれ、そしてABO式の抗原に対する抗体(例えば、B型の個体における抗A抗体)
− (ii)非定型(または免疫)といわれ、血清または血漿におけるその存在は環境性であり、そしてより特定して非ABO式抗原に対する抗体。
− 患者の血清または血漿における非定型抗体の存在について体系的にスクリーニングし、そしてそのような抗体が存在する場合には、問題の抗原構造を欠く赤血球濃縮物を選択する(これは、フランスにおいて最も一般に遭遇する場合である)、
− または、レシピエントの血清または血漿の存在下でドナーの赤血球との直接的クロスマッチを行う。ここで、凝集および/または溶解反応は観察されないべきである。
− ABO型決定表現型(またはABO型決定)および標準的Rhesus表現型(D抗原の有無)の決定;
− Kell Rhesus表現型(C、E、c、eおよびK抗原の有無)の決定;および
− 拡張された(または拡大された)表現型の決定、すなわち、Duffy式の抗原、Kidd式のFyaおよびFyb、MNS式およびLewis式のJkaおよびJkb、ならびに、レシピエントの血清において明らかにされた危険性および/または非定型抗体の性質に従ってそれもまた研究されうる他の抗原の有無の決定。
本発明は、完全に自動化することができ、そして赤血球の型決定および表現型決定、非定型抗赤血球抗体についてのスクリーニング、ドナーとレシピエントとの間の適合性の決定、ならびに抗体または血清補体分画のいずれかでコートされた赤血球の実証を行うことを可能にする、迅速でそして簡単な方法であって、好ましくは単一の試料を用いて多重フォーマットで行われる方法を提供することによってこれらの問題を解決する。
a)
(i)赤血球を含む試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、赤血球が抗体に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な、所定の抗体を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること(ここで、赤血球はそれがビーズの群と接触させられる前または後に標識される)、
(ii)抗体に結合していない赤血球を除去すること、および
(iii)標識された赤血球に結合しているビーズの群を同定し、それにより、検出された赤血球によって保有される抗原の同定を可能にすること、
によって生物学的試料中の赤血球によって保有される複数の抗原性分子を同定すること;および/または
b)
(i)試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、試料中に存在する抗体または活性化血清補体分画が赤血球、赤血球膜フラグメントまたは血液型抗原に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる既知の表現型の、(1)赤血球、(2)赤血球膜フラグメントまたは(3)または血液型抗原を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、
(ii)赤血球または赤血球膜フラグメントまたは血液型抗原に結合していない抗体または活性化血清補体分画を除去すること、
(iii)結合している抗体および/または結合している活性化血清補体分画を標識すること、および
(iv)標識された抗体または標識された活性化血清補体分画に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する抗赤血球抗体の同定を可能にすること、
によって生物学的試料中の複数の抗赤血球抗体を同定すること、
を含む、方法である。
定義:
本明細書において、「赤血球(erythrocyte)」または「赤血球(red blood cell)」という用語は同じ血液細胞を示すために区別なく使用される。
ビーズは、一般に、生物学的試料の構成要素に関して不活性であるポリマーからなり;それは固体であり、そして試料に不溶性である。使用されるポリマーは、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリサッカリド、ポリウレタンまたはセルロースでありうる。粒子に完全性および構造を与えるために結合剤を使用してもよい。
検出可能に標識された赤血球(様式(a)における)を、当業者に公知の任意の技術によって標識することができる。例えば、それを、蛍光化合物、例えば細胞の膜中に挿入されるフルオロフォアで標識してもよい。それを、それ自体が蛍光標識で官能性付与されている、赤血球の表面の構造を認識することができるリガンドを使用して標識してもよい。これらのリガンドは、例えば、抗体または動物または植物レクチンでありうる。これらの型の標識を、試験の前に行ってもよく、または行わなくてもよい。
分析工程を行う前に、接触および試薬のインキュベーションの間に結合していない試薬を除去すべきである。バックグラウンドノイズを低下させ、それゆえ試験の良好な特異性を得るために、できるだけ多くのの非結合試薬を除去することが望ましいが、徹底的過ぎる条件は前記試験の感度を低下させうる。それゆえ、非結合試薬の残存する存在は一般に容認できる。方法の感度と特異性との間の許容されうる妥協を得るための条件は、日常的な実験により当業者によって容易に決定されうる。
上記で規定するように、本発明による方法は、(a)により抗原を同定すること、または抗体を同定すること、あるいは結合している活性化血清補体画分を同定することを可能にする。それはまた、いくつかの型の同定の組み合わせを使用することを可能にする。従って、(a)による抗原の同定および(b)による抗体の同定を、同時にまたは別々に行うことができる。(b)による抗体の同定を、抗体および活性化血清補体画分の両方を明らかにすることによって行うことができる。
方法は、多重フォーマットで、赤血球の表現型決定および/または型決定を行うことを可能にする。
実施例1:表現型決定および型決定
この分析の目的は、ドナーまたは患者由来の赤血球の表面に存在する血液型抗原を、特異的モノクローナル抗体によって、同定することである(ABO、RH、Duffy、Kidd、Lewis式など)。
− ビーズ:
使用するビーズはLuminex(Luminex Corp., Austin Texas, United States)によって製造されている。それは、ポリスチレンおよびメタクリル酸(COOH官能基)から構成される、直径8μmの超常磁性ビーズである。
この実施例において、種々のビーズ領域19、21、32、34(内部標準ビーズ(ISB))、71および98(ブランクビーズ(BB))を有する蛍光超常磁性ビーズを使用する。
ビーズ領域34を有するビーズ(ISB)にローダミン誘導体で官能性付与し、そしてそれを内部蛍光対照として使用する。このビーズは5000〜15000RFIの蛍光値を生じるはずである。
領域98 BBビーズをウシアルブミンを用いて飽和させる。このビーズは、抗原にも抗体にも結合することができず、それゆえ非特異的結合の非存在を確認するために使用される。このビーズは1000RFI未満の蛍光値を生じるはずである。
− 抗ヒト免疫グロブリンモノクローナルIgG抗体、クローン125A15(Bio-Rad)。
− 抗ヒトIgM(μ)ポリクローナル抗体(Bio-Rad)。
− 抗D IgG(クローンH2D5D2F5)、抗Fya IgG(クローン5T72A13F5A93)および抗S IgM(クローンMS94)モノクローナル抗体(Bio-Rad, Millipore)。
− PKH26細胞標識キット(Sigma)。
− 企業Bio-Radによって「ScanLiss」コード86442および「Stabiliss」コード86550の名称の下に販売されている希釈媒質。
− 非定型抗体スクリーニング用に「ScanGel Coombs」コード86432の名称の下に販売されているゲルカード(Bio-Rad)。
− 「ScanGelRhK」コード86428および「ScanGel Neutral」コード86430の名称の下に販売されているゲルカード(Bio-Rad)。
− ゲルカード技術による非定型抗体スクリーニング用に「ScanPanel」コード86593および「ScanCell」コード86595の名称の下に販売されている表現型決定された赤血球(Bio-Rad)。
− SAG−MAN培地中に保存された濃縮され表現型決定された血液細胞ペレット(EFS Nord de France)。
− 患者試料起源の直接クームス陽性および/または陰性赤血球。
− コーティング液または緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%(v/v)プロクリン。
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Millipore)。
− PBS緩衝液、pH7.4(7mMリン酸ナトリウム、2.7mM KCl、136mM NaCl)。
1.2.1.血液型抗体でのビーズの感受性化
ビーズの表面での抗体の固定化を2つの異なる原理に従って行うことができる。第1の場合、抗体をビーズ上に直接的に共有結合によって固定化する(図1)。第2のアプローチは、親和性によって、非共有結合的に抗赤血球抗体の固定化を行うことにある。この場合、結合は、第1工程においてビーズに共有結合により結合された抗免疫グロブリン抗体により行われる(図2)。このアプローチを、示す実施例において選択した。
蛍光化合物での赤血球の標識を、種々の原理を使用して行うことができる。示す実施例において、赤血球をPKH26(これは赤血球膜中に挿入されるフルオロフォアである)を使用して標識する。このようにして、種々の表現型の赤血球を、同一のプロトコルに従って標識することができる(図3)。
本発明による技術に従う型決定の実行可能性を実証し、そしてその特異性を確認するために、本発明者らは単体(unitary)様式で反応を行った。この場合、血液型抗体で官能性付与されたビーズを、種々の表現型の赤血球とともに個別にインキュベートする。
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を185μlの「コーティング液」媒質で希釈する。各々の試験について、25μlの懸濁液を自動的に装置中に注入する。領域当たり250ビーズの捕獲によって測定を行う。
この一連の試験の目的は、単体および/または多重化様式での赤血球の表現型決定/型決定の実行可能性を実証することである。D、FyaおよびS抗原をモデルとして選択する。抗ヒト免疫グロブリンまたは抗μ鎖抗体で感受性化したビーズを使用して、抗D、抗Fyaおよび抗S抗体を固定化する。
抗D抗体で感受性化したビーズを、PKH26で標識したRh D陽性およびRh D陰性赤血球とともに、150の赤血球数/ビーズ数比率を使用してインキュベートした。
多重化表現型決定の原理を図5A〜5Dにまとめる。
マイクロビーズを用いる多重化アプローチの使用は、図6に記載の原理に従って同時にCD+性質を同定し、そして赤血球を表現型決定することを可能にする。
非定型抗体スクリーニング(AAS)は、一般に、最も高感度な方法に従って行われる(「Diamed ID」の名称の下に企業Diamedによって販売されている、「ScanGel」範囲の企業Bio-Radによって販売されているゲルを通したろ過、または、企業Immucorによって販売されているCapture(登録商標)範囲のマイクロプレートフォーマットの免疫接着方法よる)。最初の2つの場合、それは、その表現型が既知である赤血球を使用し、そしてこの赤血球は検討しようとする血清または血漿試料とインキュベートされる。存在する可能性のある特異的抗体は、赤血球の表面に結合する。それらは、続いて、抗ヒト免疫グロブリン抗体を含む試薬を使用して明らかにされる。陽性反応の場合、赤血球凝集物が形成される。反応が陰性である場合、赤血球は遊離しており、そして凝集物は形成されない。次いで、種々の抗原を有するかまたは有さない赤血球のパネルを使用することによって、試料中に存在する抗体の特異性を決定することが可能である。
− ビーズ領域17、21、32、および36を有する蛍光超常磁性ビーズ
ビーズを+4℃でPBS緩衝液、pH7.4中で貯蔵する。
領域34(内部標準ビーズ(ISB))および領域98(ブランクビーズ(BB))対照蛍光ビーズ。
分子量70000〜130000のポリ−L−リジン(PLL)。
− PE当量当たり2抗体当量の比率でフィコエリトリン(PE)に結合された、抗ヒト免疫グロブリンモノクローナルIgG抗体、クローン125A15(Bio-Rad)。
− 抗D(クローンH2D5D2F5)および抗Fya(クローン5T72A13F5A93)モノクローナルIgG抗体(Bio-Rad)。
− 抗RH1 National Standard(Centre de Reference pour les Groupes Sanguins [Blood Group Reference Centre], France)。
− 非定型抗体スクリーニングの用に「ScanCell」および「ScanPanel」の名称の下に販売されている表現型決定された赤血球(Bio-Rad)。
− コーティング液または緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%(v/v)プロクリン)。
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Millipore)。
− PBS緩衝液、pH7.4(7mMリン酸ナトリウム、2.7mM KCl、136mM NaCl)。
2.2.1.PLLでのビーズの感受性化
領域17、21、32および36中性ビーズを、18時間周囲温度で撹拌しながらPBS、pH7.4中25μg/mlのPLLとともにインキュベートする。この工程の終りに、ビーズをPBS、pH7.4中で洗浄し、次いで赤血球を固定化するために使用する。
ビーズ−赤血球試薬を、100に等しい赤血球数/ビーズ数比率でPLLコートビーズと赤血球とを混合することによって調製する。インキュベーションを、PBS、pH7.4中で撹拌しながら5分間周囲温度で行う。各々のビーズ領域を使用して、既知のそして異なる表現型の赤血球の単一の型を固定化する。この工程の終りに、ビーズ−PLL−赤血球試薬を、PBS、pH7.4で、次いで蒸留水で洗浄する。このようにして調製したビーズ−赤血球試薬を、PBS、pH7.4中+4℃で貯蔵する。
単体反応の場合、反応の特異性を確認するために、ビーズ−赤血球試薬を個別に使用し、そして異なる抗体とともにインキュベートする。
ビーズ−PLL−赤血球−抗体複合体を検出するために、PEで標識された、ヒト免疫グロブリンのFcフラグメントに特異的な抗体を使用する。この抗体コンジュゲートをPBS、pH7.4中60μg/mlの濃度で使用し、そして15分間37℃で撹拌しながら複合体とともにインキュベートする。次いで、複合体を蒸留水で洗浄する。
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を185μlのコーティング液を用いて取る。各々の試験について、25μlの懸濁液を装置中に注入する。領域当たり250ビーズの捕獲によって測定を行う。
2.3.1.タンパク質リッチ媒質における抗Dモノクローナル抗体の多重化検出
抗体を、既知の表現型の赤血球で感受性化した、種々のビーズ領域のビーズの混合物を使用して検出した。
CNRGS[National Blood Group Reference Centre]抗D national reference standardを使用して、血漿に似せたタンパク質リッチ媒質中の抗D抗体の単体検出を行った。
この場合、領域17ビーズを表現型D、CC、ee、Fya−b+の赤血球で感受性化し、領域32ビーズを表現型dd、cc、ee、Fya+b−の赤血球で感受性化し、そして領域21ビーズを表現型D、cc、EE、Fya−b+の赤血球で感受性化した。
この分析の目的は、ドナーからの1つ以上の血液細胞濃縮物のレシピエントへの輸血に関して、完全なドナー−レシピエント適合性が存在することを確実にすること、および、適切な場合、ドナーの赤血球によって保有される血液型構造に対する、レシピエントの血漿中の抗体の存在に結び付けられる不適合性を実証することである。
− ビーズ領域38を有する蛍光超常磁性ビーズ
ビーズを+4℃でPBS緩衝液、pH7.4中で貯蔵する。
領域34(内部標準ビーズ(ISB))および領域98(ブランクビーズ(BB))対照蛍光ビーズ。
− 分子量70000〜130000のポリ−L−リジン(PLL)。
− PE当量当たり2抗体当量の比率でフィコエリトリン(PE)に結合された、抗ヒトIgGマウスIgGモノクローナル抗体、クローン125A15(Bio-Rad)
− SAG−MAN培地(EFS Nord de France)中で保存された表現型決定された血液細胞濃縮物。
− 企業Bio-Radによって「ScanLiss」コード86442の名称の下に販売されている希釈媒質
− コーティング液または緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%(v/v)プロクリン)。
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Millipore)。
− PBS緩衝液、pH7.4(7mMリン酸ナトリウム、2.7mM KCl、136mM NaCl)。
3.2.1.PLLでのビーズの感受性化
ビーズ−PLL試薬を、18時間周囲温度で撹拌しながらPBS、pH7.4中50μg/mlのPLLとともに領域38中性ビーズをインキュベートすることによって調製する。この工程の終りに、ビーズ−PLL試薬をPBS緩衝液、pH7.4で洗浄し、次いでドナー赤血球を固定化するために使用する。
ビーズ−PLL試薬を、各々が別々に処置されている種々のドナーの赤血球と接触させる。
25μlのビーズ−PLL−赤血球複合体を、試験しようとする患者の血漿または血清50μlと混合し、そして15分間撹拌しながら37℃でインキュベートする。インキュベーション後、複合体をPBS緩衝液、pH7.4で数回洗浄する。
ビーズ−PLL−赤血球−抗体複合体を検出するために、ヒト免疫グロブリンFcフラグメントに特異的なPE標識抗体を使用する。この抗体コンジュゲートをPBS、pH7.4中5μg/mlの濃度で使用し、そして15分間37℃で撹拌しながら複合体とともにインキュベートする。次いで、複合体をPBS緩衝液、pH7.4で数回洗浄する。
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を35μlのコーティング液を用いて取る。各々の試験について、25μlの懸濁液を装置中に注入する。領域当たり250ビーズの捕獲によって測定を行う。
PLLでコートした領域38ビーズを使用して、3つの異なるドナーからの赤血球を固定化した:表現型D、cc、kk、SSの1つのドナー、表現型dd、CC、kkの1つのドナー、および表現型dd、cc、K+、ssの1つのドナー。各々のドナー−レシピエント対を別々に試験した。
この分析の目的は、血液試料における、Aおよび/またはB血液型抗原に対する天然抗体の有無を示すことである。この分析の結果は、直接試験において得られる結果との組み合わせで、試料のABO型を確立することを可能にする。裏ABO型決定試験において使用する試料は、血清、血漿、または全血試料でありうる。
− ビーズ領域38および71を有する蛍光超常磁性ビーズ
ビーズを+4℃でPBS緩衝液、pH7.4中で貯蔵する。
領域34(内部標準ビーズ(ISB))および領域98(ブランクビーズ(BB))対照蛍光ビーズ。
− 分子量70000〜130000のポリ−L−リジン(PLL)。
− フィコエリトリン(PE)に結合された、抗ヒトIgMヤギポリクローナル抗体、7374V(Bio-Rad)。
− EDTAに取られた試料からのA型およびB型赤血球(EFS-Rungis)。
− EDTAに取られた試料からの血漿および全血試料(EFS-Rungis)。
− 企業Bio-Radによって「ScanLiss」コード86442の名称の下に販売されている希釈媒質。
− コーティング液または緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%(v/v)プロクリン)。
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Millipore)。
− PBS緩衝液、pH7.4(7mMリン酸ナトリウム、2.7mM KCl、136mM NaCl)。
4.2.1.PLLでのビーズの感受性化
領域38および領域71中性ビーズを、18時間周囲温度で撹拌しながらPBS、pH7.4中50μg/mlのPLLとともにインキュベートする。この工程の終りに、ビーズをPBS緩衝液、pH7.4で洗浄し、次いで赤血球を固定化するために使用する。
ビーズ−赤血球試薬を、100に等しいビーズ数に対する赤血球数の比率で、PLLコートビーズとScanLiss中で希釈した赤血球とを混合することによって調製する。インキュベーションを、撹拌しながら5分間周囲温度で行う。各々のビーズ領域を使用して、既知の型の赤血球の単一の型を固定化する。この工程の終りに、ビーズ−PLL−赤血球試薬を蒸留水で数回洗浄する。このようにして調製したビーズ−赤血球試薬を、PBS−BSA 10g/l、pH7.4中+4℃で貯蔵する。
試験しようとする試料は、この場合、血漿または全血のいずれかである。
ビーズ−PLL−赤血球−抗体複合体を検出するために、ヒト免疫グロブリンに特異的なPE標識抗体を使用する。この抗体コンジュゲートを、PBS、pH7.4中5μg/mlの濃度で使用し、そして15分間37℃で撹拌しながら複合体とともにインキュベートする。次いで、複合体をPBS緩衝液、pH7.4で数回洗浄する。
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を35μlのコーティング液を用いて取る。各々の試験について、25μlの懸濁液を装置中に注入する。
抗体を、既知のそして異なる型の赤血球で感受性化した異なる領域のいくつかのビーズを使用して検出した。PLLでコートした領域38ビーズを使用して、A型赤血球を固定化した。PLLでコートした領域71ビーズを使用して、B型赤血球を固定化した。
本発明の技術を用いて赤血球の型決定を行うことの可能性を、実施例1において、抗赤血球抗体を固定化するために蛍光ビーズを使用することによって、そして「Bioplex 200」装置(Bio-Rad)のレポーターレーザーの波長と適合性の蛍光化合物で試料の赤血球を標識することによって実証した。
− ビーズ領域36および52を有する蛍光超常磁性ビーズ
ビーズを+4℃でPBS緩衝液、pH7.4中で貯蔵する。
領域34(内部標準ビーズ(ISB))および領域98(ブランクビーズ(BB))対照蛍光ビーズ。
− 抗マウスIgGヤギポリクローナル抗体、コード115−005−164(Jackson Imm. Lab.)
− 抗マウスIgMヤギポリクローナル抗体、コード115−005−020(Jackson Imm. Lab.)
− 抗BモノクローナルIgG抗体、クローンX9(Bio-Rad)。
− 抗AモノクローナルIgM抗体、クローン15750F7(Bio-Rad)。
− EDTAに取られた血液細胞ペレットおよび全血の試料(EFS-Rungis)。
− PKH26細胞標識キット(Sigma)。
− 企業Bio-Radによって「ScanLiss」コード86442および「Stabiliss」コード86550の名称の下に販売されている希釈媒質。
− コーティング液または緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%(v/v)プロクリン)。
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Millipore)。
− PBS緩衝液、pH7.4(7mMリン酸ナトリウム、2.7mM KCl、136mM NaCl)。
5.2.1.血液型に対する抗体でのビーズの感受性化
ビーズの表面での抗体の固定化の原理を図2にまとめる。
赤血球の標識を、PKH26を使用して実施例1におけるように行う(図3)。
試験しようとする試料は、この場合、血液細胞ペレットまたは全血のいずれかであり、赤血球含量は40%までになる。
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を35μlのコーティング液を用いて取る。各々の試験について、25μlの懸濁液を装置中に注入する。領域当たり250ビーズの捕獲によって測定を行う。
多重化型決定の原理を図11にまとめる。
非定型抗体スクリーニング(AAS)を一般に2つの工程で行う:第1の工程は赤血球の制限されたパネルに対して行われ、その目的は、それらが同定されることを可能にすることなしに血液型抗原に対する非定型抗体の有無を示すことである。抗体の存在が検出される場合、問題の抗体(単数または複数)の特異性を同定するために、第2の工程が行われる。この第2の工程は、同定しようとする抗体の混合物の複雑さに依存して、10個またはそれ以上の赤血球のパネルを用いて行われる。2つの工程を行うために、少なくとも350μlの試料容積が必要とされる。この試験の目的は、試料中に存在する可能性のある非定型抗体を、直接的に単一の試験において、そして試験しようとする血漿または血清の単一の試験試料(50〜100μl)を用いて同定することの実行可能性を示すことである。
− ビーズ領域6、8、36、38、52、71、79、81、94および96を有する蛍光超常磁性ビーズ
ビーズを+4℃でPBS緩衝液、pH7.4中で貯蔵する。
領域34(内部標準ビーズ(ISB))および領域98(ブランクビーズ(BB))対照蛍光ビーズ。
− 分子量70000〜130000のポリ−L−リジン(PLL)。
− フィコエリトリン(PE)に結合された、抗ヒト免疫グロブリンマウスIgGモノクローナル抗体、クローン125A15(Bio-Rad)。
− SAG−MAN培地中に保存された表現型決定された血液細胞濃縮物(EFS Nord de France)。
− 企業Bio-Radによって「ScanLiss」コード86442の名称の下に販売されている希釈媒質。
− コーティング液または緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%(v/v)プロクリン)。
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Millipore)。
− PBS緩衝液、pH7.4(7mMリン酸ナトリウム、2.7mM KCl、136mM NaCl)。
− EDTAに取られた血漿試料(EFS-Rungis)。
− 以下の特異性の非定型血液型抗体を有する血清試料:抗D、抗Jka、抗Kell。
6.2.1.PLLでのビーズの感受性化
領域6、8、36、38、52、71、79、81、94または96中性ビーズを、18時間周囲温度で撹拌しながらPBS、pH7.4中50μg/mlのPLLとともにインキュベートすることによって、ビーズ−PLL試薬を調製する。この工程の終りに、ビーズ−PLL複合体をPBS緩衝液、pH7.4で洗浄し、次いでドナー赤血球を固定化するために使用する。
ビーズ−PLL−赤血球試薬を、100に等しい赤血球数/ビーズ数比率で、PLLコートビーズとScanLiss中で希釈したパネルの赤血球とを混合することによって調製する。インキュベーションを、撹拌しながら5分間周囲温度で行う。既知のそして異なる表現型の10の赤血球を使用して、同定パネルを構成する。各々のビーズ領域を使用して、このパネルからの赤血球の単一の型を固定化する。
異なる赤血球から個別に調製したビーズ−PLL−赤血球試薬の混合物は、抗体を同定するためのパネルを構成する。このパネルの25μlを試験しようとする試料(血漿または血清)100μlと混合し、そして15分間撹拌しながら37℃でインキュベートする。
ビーズ−PLL−赤血球−抗体複合体を検出するために、ヒト免疫グロブリンFcフラグメントに特異的なPE標識抗体を使用する。この抗体コンジュゲートをPBS、pH7.4中1μg/mlの濃度で使用し、そして15分間37℃で撹拌しながら複合体とともにインキュベートする。次いで、複合体をPBS緩衝液、pH7.4で数回洗浄する。
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を35μlのコーティング液を用いて取る。各々の試験について、25μlの懸濁液を装置中に注入する。領域当たり250ビーズからの蛍光シグナルの捕獲によって測定を行う。
異なる領域のPLLコートビーズを使用して、既知のそして異なる表現型の10個の赤血球を固定化した:表現型D、kk、Jka+b+の赤血球を領域6ビーズ上に、表現型D、Kk、Jka+b−の赤血球を領域8ビーズ上に、表現型D、kk、Jka+b−の赤血球を領域36ビーズ上に、表現型D、kk、Jka+b−の赤血球を領域38ビーズ上に、表現型D、Kk、Jka+b+の赤血球を領域52ビーズ上に、表現型dd、Kk、Jka−b+の赤血球を領域71ビーズ上に、表現型dd、kk、Jka−b+の赤血球を領域79ビーズ上に、表現型dd、Kk、Jka+b+の赤血球を領域81ビーズ上に、表現型dd、kk、Jka−b+の赤血球を領域94ビーズ上に、そして表現型dd、kk、Jka+b+の赤血球を領域96ビーズ上に固定化した。
本発明の技術を用いて赤血球上の抗原のスクリーニングを行うことの可能性を、実施例1および3において、抗赤血球抗体を固定化するために蛍光ビーズを使用することによって、そして「Bioplex 200」装置(Bio-Rad)のレポーターレーザーの波長と適合性の蛍光化合物で試料の赤血球を標識することによって実証した。同様に、本発明の技術を用いて定型および非定型抗体を検出することの可能性を、実施例2、4および6において、ポリ−L−リジン(PLL)を介して赤血球を固定化するために蛍光ビーズを使用することによって、そしてフィコエリトリン(PE)で標識した抗ヒト免疫グロブリン抗体コンジュゲートを使用して、提示された赤血球に対する試料中の抗体の存在を検出することによって実証した。これらの試験の目的は、本発明の技術が、1つのそして同じ容器中で抗原についてスクリーニングしそして抗体についてスクリーニングすることを可能にすることを示すことである。
− ビーズ領域6、56、71、81および94を有する蛍光超常磁性ビーズ
ビーズを+4℃でPBS緩衝液、pH7.4中で貯蔵する。
領域34(内部標準ビーズ(ISB))および領域98(ブランクビーズ(BB))対照蛍光ビーズ。
− 抗マウスIgGヤギポリクローナル抗体、コード115−005−164(Jackson Imm. Lab.)
− 抗マウスIgMヤギポリクローナル抗体、コード115−005−020(Jackson Imm. Lab.)
− 抗BモノクローナルIgG抗体、クローンX9(Bio-Rad)。
− 抗AモノクローナルIgM抗体、クローン15750F7(Bio-Rad)。
− フィコエリトリン(PE)に結合された、抗ヒトIgMヤギポリクローナル抗体、コード709−116−073(Jackson Imm. Lab.)
− PKH26細胞標識キット(Sigma)。
− 分子量70000〜130000のポリ−L−リジン(PLL)。
− EDTAに取られた全血試料(EFS-Rungis)。
− 企業Bio-Radによって「ScanLiss」コード86442および「Stabiliss」コード86550の名称の下に販売されている希釈媒質。
− コーティング液または緩衝液(10mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、0.1%(v/v)プロクリン)。
− ウシ血清アルブミン(BSA)(Millipore)。
− PBS緩衝液、pH7.4(7mMリン酸ナトリウム、2.7mM KCl、136mM NaCl)。
7.2.1.試薬の調製
7.2.1.1 抗原を検出するための試薬の調製:血液型に対する抗体でのビーズの感受性化
ビーズの表面での抗体の固定化の原理を図2にまとめる。
領域71、領域81および領域94中性ビーズを、18時間周囲温度で撹拌しながらPBS、pH7.4中の50μg/mlのPLLとともにインキュベートする。この工程の終りに、ビーズをPBS緩衝液、pH7.4で洗浄し、次いで赤血球を固定化するために使用する。
赤血球の標識を、PKH26を使用して実施例1におけるように行う(図3)。
試験しようとする試料は全血である。
ビーズ−抗赤血球抗体試薬が結合している赤血球(ビーズ−抗体−赤血球複合体)の検出を、試料の赤血球の事前標識によって提供する。
最終洗浄の後、測定の前に、複合体を35μlのコーティング液を用いて取る。各々の試験について、25μlの懸濁液を装置中に注入する。領域当たり250ビーズの捕獲によって測定を行う。
PLLでコートした領域94ビーズを使用してA1型赤血球を固定化し、PLLでコートした領域71ビーズを使用してB型赤血球を固定化し、そしてPLLでコートした領域81ビーズを使用してO型赤血球を固定化した。既知の表現型の赤血球で感受性化したこれらのビーズを混合した。
ビーズ−抗Aおよびビーズ−抗B試薬は、それぞれA陽性赤血球およびB陽性赤血球と反応する:陽性試料は28000RFIより高い陽性シグナルを生じ、一方、陰性試料は1800〜8300RFIのずっと低いシグナルを与える。
提示された赤血球に対する抗体を含まない試料は1800RFI未満の値を生じ、平均陰性値は1020RFIである。
Claims (21)
- 個体の赤血球によって保有される抗原性分子および/または抗赤血球抗体を同定するためのインビトロ方法であって、
a)
(i)赤血球を含む試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、赤血球が抗体に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な、所定の抗体を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること(ここで、赤血球はそれがビーズの群と接触させられる前または後に標識される)、
(ii)抗体に結合していない赤血球を除去すること、および
(iii)標識された赤血球に結合しているビーズの群を同定し、それにより、検出された赤血球によって保有される抗原の同定を可能にすること、
によって生物学的試料中の赤血球によって保有される複数の抗原性分子を同定すること;および/または
b)
(i)試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、試料中に存在する抗体または活性化血清補体分画が赤血球または赤血球膜フラグメントに結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる既知の表現型の、(1)赤血球または(2)赤血球膜フラグメントを各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、
(ii)赤血球または赤血球膜フラグメントに結合していない抗体または活性化血清補体分画を除去すること、
(iii)結合している抗体および/または結合している活性化血清補体分画を標識すること、および
(iv)標識された抗体または標識された活性化血清補体分画に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する抗赤血球抗体の同定を可能にすること、
によって生物学的試料中の複数の抗赤血球抗体を同定すること、
を含む、方法。 - 個体の赤血球によって保有される抗原性分子および抗赤血球抗体を同定するためのインビトロ方法であって、
a)
(i)赤血球を含む試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、赤血球が抗体に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な所定の抗体を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること(ここで、赤血球はそれがビーズの群と接触させられる前または後に標識される)、
(ii)抗体に結合していない赤血球を除去すること、および
(iii)標識された赤血球に結合しているビーズの群を同定し、それにより、検出された赤血球によって保有される抗原の同定を可能にすること、
によって生物学的試料中の赤血球によって保有される複数の抗原性分子を同定すること;および
b)
(i)試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、試料中に存在する抗体または活性化血清補体分画が赤血球、赤血球膜フラグメントまたは血液型抗原に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる、既知の表現型の(1)赤血球、(2)赤血球膜フラグメントまたは(3)血液型抗原を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、
(ii)赤血球または赤血球膜フラグメントまたは血液型抗原に結合していない抗体または活性化血清補体分画を除去すること、
(iii)結合している抗体および/または結合している活性化血清補体分画を標識すること、および
(iv)標識された抗体または標識された活性化血清補体分画に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する抗赤血球抗体の同定を可能にすること、
によって生物学的試料中の複数の抗赤血球抗体を同定すること、
を含む、方法。 - 個体の抗赤血球抗体を同定するためのインビトロ方法であって、
(b)
(i)試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、試料中に存在する抗体または活性化血清補体分画が血液型抗原に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる既知の表現型の血液型抗原を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、によって生物学的試料中の複数の抗赤血球抗体を同定すること;
(ii)血液型抗原に結合していない抗体または活性化血清補体分画を除去すること、
(iii)結合している抗体および/または結合している活性化血清補体分画を標識すること、および
(iv)標識された抗体または標識された活性化血清補体分画に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する抗赤血球抗体の同定を可能にすること、を含み、
ここで、ビーズは超常磁性または磁性または磁化可能なビーズである、方法。 - 個体の抗赤血球抗体を同定するためのインビトロ方法であって、
(b)
(i)試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、試料中に存在する抗体または活性化血清補体分画が血液型抗原に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる既知の表現型の血液型抗原を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、によって生物学的試料中の複数の抗赤血球抗体を同定すること;
(ii)血液型抗原に結合していない抗体または活性化血清補体分画を除去すること、
(iii)結合している抗体および/または結合している活性化血清補体分画を標識すること、および
(iv)標識された抗体または標識された活性化血清補体分画に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する抗赤血球抗体の同定を可能にすること、を含み、
ここで、区別可能なビーズは発光または蛍光シグナルを発する、方法。 - 個体の抗赤血球抗体を同定するためのインビトロ方法であって、
(b)
(i)試料を、単一の試験容器中で、またはいくつかの分離した試験容器中で、凝集なしに、試料中に存在する抗体または活性化血清補体分画が血液型抗原に結合することを可能にする条件下で、ビーズの群ごとに互いに異なる既知の表現型の血液型抗原を各々が保有する区別可能なビーズの群と接触させること、によって生物学的試料中の複数の抗赤血球抗体を同定すること;
(ii)血液型抗原に結合していない抗体または活性化血清補体分画を除去すること、
(iii)結合している抗体および/または結合している活性化血清補体分画を標識すること、および
(iv)標識された抗体または標識された活性化血清補体分画に結合しているビーズの群を同定し、それにより、存在する抗赤血球抗体の同定を可能にすること、を含み、
ここで、抗赤血球抗体は非定型抗体である、方法。 - 赤血球によって保有される抗原性分子が、血液型を構成する赤血球膜抗原、赤血球によって保有される活性化血清補体分画、および感受性化された赤血球の表面に存在する抗体からなる群より選択される、請求項1および2のいずれか一項記載の方法。
- (a)による抗原の同定および(b)による抗体の同定が同時にそして同じ容器中で行われる、請求項1または2記載の方法。
- 混合物の分析がフローサイトメトリーによって行われる、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 溶血のような、ヘモグロビンの化学的または酵素的分解の工程も含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 区別可能なビーズが超常磁性または磁性または磁化可能なビーズである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
- 区別可能なビーズが発光または蛍光シグナルを発する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- 検出可能に標識された赤血球(aによる)が蛍光化合物で標識される、請求項1または2、または6〜10のいずれか一項記載の方法。
- 抗体(bによる)が、蛍光、発光または放射性標識を保有する抗ヒトグロブリン抗体と接触させることによって標識される、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 活性化血清補体分画(bによる)が、蛍光、発光または放射性標識を保有する抗血清補体分画抗体と接触させることによって標識される、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- 複数の抗赤血球抗体を同定することを含み(bによる)、抗体が非定型抗体である、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 生物学的試料が、全血、血漿、血清、血液細胞ペレットおよび任意の他の血液調製物からなる群より選択される、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 生物学的試料が、抗体によってインビボで感受性化された、および/または血清補体分画でコートされた赤血球を有する個体起源である、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
- 赤血球の表面に、および/または個体起源の生物学的液体中に存在する免疫グロブリンのアイソタイプを決定する、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
- (b)により同定された抗体の定量化も含む、請求項1〜18のいずれか一項記載の方法。
- 患者中に輸血されなければならない赤血球をクロスマッチングするための方法であって、
(i)患者由来の血清または血漿の試料を、単一の試験容器中で、存在する可能な抗体が赤血球に結合することを可能にする条件下で、輸血されなければならない赤血球を保有する区別可能なビーズの群と、同時に接触させること、
(ii)赤血球に結合していない抗体を除去すること、
(iii)結合している抗体を標識すること、および
(iv)混合物を分析して、ビーズの群が抗体に結合しているかどうかを決定すること(ここで、ビーズの群の結合は輸血されなければならない赤血球が患者に対して完全な適合ではないことを示す)、
を含む、方法。 - 請求項1または2、または6〜20のいずれか一項記載の検出方法を実施するための一組の試薬であって、各々が、検出されることのできる少なくとも1つの特定の物理的パラメーターを保有し、そして、群の1つは赤血球によって保有される抗原性分子に特異的な捕獲抗体を保有し、そして他の群は(1)赤血球、(2)赤血球膜フラグメントまたは(3)捕獲抗原(これは、血液型抗原である)を保有する少なくとも2つの異なる群に属する、区別可能なビーズの群を含む、一組の試薬。
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