KR101864763B1 - 인간 혈액에서의 비정형 항체 및 혈액 산물의 동정 - Google Patents
인간 혈액에서의 비정형 항체 및 혈액 산물의 동정 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 혈액 및 혈액 산물에서의 비정형 항체들의 동정에 관한 것이다.
혈액 또는 혈액 산물 제조 공정에서, 중간 또는 최종 생성물 상에서 질적 관리 시험에서 위양성을 나타낼 수 있는 비정형 항체들을 동정하는 방법이 개시된다.
혈액 또는 혈액 산물 제조 공정에서, 중간 또는 최종 생성물 상에서 질적 관리 시험에서 위양성을 나타낼 수 있는 비정형 항체들을 동정하는 방법이 개시된다.
Description
본 명세서에서 인간 혈액에서의 비정형 항체 및 혈액 산물을 동정하는 방법이 개시된다.
배경 기술
문헌 D1(WO2008/033164A1)은 관심이 없는 물질로부터 관심이 있는 물질을 분리하기 위해 상이한 밀도를 가지고 유체와 접촉하는 적어도 2개의 액체상을 사용하는 것에 기초하여 혈액에서 Rho(D), Kell(K), Duffy(Fya), 및 hr'(c)로서 비정형 항체들을 검출하기 위해 사용될 수 있는 방법을 개시한다.
배경 기술
문헌 D1(WO2008/033164A1)은 관심이 없는 물질로부터 관심이 있는 물질을 분리하기 위해 상이한 밀도를 가지고 유체와 접촉하는 적어도 2개의 액체상을 사용하는 것에 기초하여 혈액에서 Rho(D), Kell(K), Duffy(Fya), 및 hr'(c)로서 비정형 항체들을 검출하기 위해 사용될 수 있는 방법을 개시한다.
USP 발열인자 시험에서 발열원성 반응을 야기하는 천연 인간 항체들이 동정되었다. 일부 인간 공여자들은 천연적으로 이러한 "비정형 항체들"을 생성하는 데, 이것은 아마, 토끼, 설치류 또는 그러한 숙주 동물 상에 서식하는 기생 곤충 (예, 벼룩)에 노출된 결과일 수 있다. 상기 비정형 항체들은 변칙적이고 보기 드물지만, 인간에게 해롭진 않다. 비정형 항체들은 토끼 백혈구 항원과 교차반응할 수 있고, 및 토끼 발열인자 시험에서 발열원성 반응을 야기한다. 상기 발열원성 반응은, 그러나, "위양성(false positive)"인데 이는 생물학적 내독소 시험(LAL: limulus amoebocyte lysate assays)과 같은 다른 방법들에 따르면, 토끼 검정 시험에서 발열원성 반응을 보이는 의심되는 혈장 샘플이 내독소를 포함하고 있지 않다고 나타나기 때문이다. 또한, 시험관 내 발열인자 시험(aka 단핵구 활성화 시험)의 결과는 비-내독소 발열인자의 부재를 나타낸다. 따라서, 인간 혈액 또는 혈장 내의 비정형 항체들은 틀린 토끼 발열인자 시험 결과를 야기하고, "발열원성" 양성으로 오류 시험판정되는 개별 또는 수집된 혈액이나 혈장들을 폐기하는 결과를 낳게 될 수 있다.
본 발명에서 설명된 방법은 발열인자 시험에서 오류적 양성으로 나타나는 비정형 항체들을 포함하는 혈액 또는 혈장 샘플들을 확인할 수 있게 한다. 이러한 방법은, 비정형 항체-함유 샘플들이 다른 혈액이나 혈장과 합체되기 전 및 그 합체 풀을 오염시키기 전에 제거할 수 있기 때문에 유용하다. 따라서, 상기 방법은 비정형 항체들의 존재로 인하여 "발열원성"으로 나타나는 샘플로 혈액이나 혈장 합체 풀을 불필요하게 오염시키는 것을 예방함으로써 제조 원가를 낮춘다. 본 발명에서 설명된 고처리 시험 방법은 의심되는 오류적 양성 샘플들을 확인할 수 있게 한다. 그러한 샘플들은 다른 샘플들과 합체하기 전에 폐기될 수 있고 그러한 합체 풀을 비정형 항체들로 오염시키는 것을 예방할 수 있다.
요약
인간 혈액에서의 비정형 항체 및 혈액 산물을 동정하는 방법이 개시된다.
본 발명에서 설명된 일 관점은 혈액 산물 제조 공정에서 비정형 반응성 항체들을 동정하는 방법에 관한 것이고, 이러한 비정형 반응성 항체들은 토끼 발열인자 시험에서 위양성 결과를 나타내고, 상기 방법은: (a) 혈액 또는 혈장을 수득하는 단계; (b) 상기 샘플이 토끼 백혈구 항원과 교차반응하는 비정형 항체를 포함하고 있는지를 결정하기 위해, 세포성 응집반응, 면역 형광 현미경법, 면역침전법, 면역확산법, 면역형광법, ELISA, 유세포 분석법, FACS, 또는 웨스턴 블랏팅 중 하나 이상을 사용하여 샘플 및 대조군을 시험하는 단계; (c) 샘플과 대조군의 시험 결과를 비교하는 단계; (d) 상기 샘플이 반응성 비정형 항체들을 포함하는 것인지를 결정하는 단계; 및 (e) 상기 샘플이 반응성 비정형 항체들을 포함하면 상기 샘플이 유래한 혈액 또는 혈장 단위체의 사용을 금지하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 설명된 다른 관점은 혈액 산물 제조 공정에서 비정형 반응성 항체들을 동정하는 방법에 관한 것으로, 상기 비정형 반응성 항체들은 전술한 바와 같이, 토끼 발열인자 시험에서 위양성 결과를 나타내고, 상기 단계 (b)에서 상기 샘플 및 대조군은 세포성 응집반응 분석을 사용하여 시험한다.
본 발명에서 설명된 다른 관점은 혈액 산물 제조 공정에서 비정형 반응성 항체들을 동정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 비정형 반응성 항체들은 전술한 바와 같이, 토끼 발열인자 시험에서 위양성 결과를 나타내고, 상기 단계 (b)에서 상기 샘플 및 대조군은 유세포 분석법을 사용하여 시험한다.
본 발명에서 설명되는 다른 관점은 혈액 산물 제조 공정에서 비정형 반응성 항체들을 동정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 비정형 반응성 항체들은 전술한 바와 같이, 토끼 발열인자 시험에서 위양성 결과를 나타내고, 상기 단계 (b)에서 상기 샘플 및 대조군은 웨스턴 블랏팅을 사용하여 시험한다.
본 발명에서 설명되는 다른 관점은 혈액 산물 제조 공정에서 비정형 반응성 항체들을 동정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 비정형 반응성 항체들은 전술한 바와 같이, 토끼 발열인자 시험에서 위양성 결과를 나타내고, 상기 방법은 상기 샘플 및 대조군을 생물학적 내독소 시험(LAL)을 사용하여 시험하는 단계를 더 포함한다.
도 1은 토끼 백혈구 응집 검정법의 현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 WBC와 배양한 후 현미경으로 관찰하였다. 공여자 X 혈장(A, C) 또는 대조군 혈장(B, D)과 배양된 토끼 백혈구의 광 현미경사진(A, B) 및 위상차 현미경사진(C, D). 응집은 공여자 혈장(A, C)에서 관찰되었으나, 대조군 혈장(B, D)에서는 관찰되지 않았다.
도 2는 인간 백혈구 응집 검정법의 현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 인간 WBC와 배양한 후 현미경으로 관찰하였다. 공여자 X 혈장(A, C) 또는 대조군 혈장(B, D)과 배양된 토끼 백혈구의 광 현미경사진(A, B) 및 위상차 현미경사진(C, D). 응집은 공여자 혈장(A, C)에서 관찰되었으나, 대조군 혈장(B, D)에서는 관찰되지 않았다.
도 3은 공여자 X 토끼 WBC 응집의 위상차 및 형광현미경 사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 WBC들과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후, 위상차 또는 형광현미경으로 관찰하였다. 패널 (A)는 공여자 X 혈장과 배양한 토끼 WBC의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 패널 (B)는 공여자 X 혈장과 배양된 후 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG로 처리된 토끼 WBC의 형광 현미경을 나타낸다. 응집된 세포 집단에서 강한 형광이 관찰되었고, 이는 공여자 X 혈장으로부터 나온 인간 IgG가 세포성 응집을 담당한다는 것을 나타낸다.
도 4는 토끼 WBC 응집 분석법의 형광현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 WBC와 배양한 후 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG과 반응시켰다. 패널 (A)는 토끼 WBC들의 양성 형광을 나타낸다. 패널 (B)는 대조군 혈장의 결과를 나타낸다.
도 5는 토끼 WBC 응집 분석법의 형광현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 WBC들과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 패널 (A)는 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 배양된 토끼 WBC의 양성 형광 및 응집된 세포(바닥)의 40x 배율 사진을 나타낸다. 이러한 결과들은 공여자 X의 혈장이 토끼 WBC 세포-표면 항원과 반응성인 IgG들을 포함하고 있다는 것을 나타낸다. 패널 (B)는 대조군 혈장으로 관찰된 약한 형광을 나타내고, 응집을 보이지 않는 토끼 WBC의 위상차 현미경사진을 나타낸다(바닥).
도 6은 인간 WBC 응집 분석법의 형광현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 인간 WBC와 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG과 반응시킨 후, 형광현미경으로 관찰하였다. (A, 공여자 X) 및 (B, 대조군 혈장) 어느 것도 강한 형광 또는 응집 (바닥 패널)을 가지지 않았고, 이는 공여자 X의 혈장이 인간 WBC 세포-표면 항원에 반응적이지 않은 IgG들을 포함한다는 것을 의미한다.
도 7은 형광 유세포 분석법 히스토그램으로서, 토끼 WBC를 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후, 유세포 분석법으로 분석하였다. 히스토그램은 관찰된 상대적 형광을 나타낸다. 패널 A 및 B는 2개의 개별 실험을 나타낸다. 공여자 X 혈장은 대조군 혈장보다 적어도 3배인 상대적 형광을 가지는 최대 신호를 보인다. 정량적 결과에 대하여는 표 4 및 표 5를 참조하라.
도 8은 형광 유세포 분석법 히스토그램으로서, 인간 WBC를 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응 후, 유세포 분석법으로 분석하였다. 히스토그램은 관찰된 상대적 형광을 나타낸다. 패널 A 및 B는 2개의 개별 실험을 나타낸다. 공여자 X 혈장은 대조군 혈장과 유의하게 다르지 않았다. 정량적 결과는 표 6과 표 7을 참조하라.
도 9는 공여자 X 혈장 분리물을 함유하는 발열원성 IVIG-C의 샘플의 전기영동 및 웨스턴 블랏팅 분석으로서, 레인 1: MW 마커; 레인 2: 발열원성 IGIV-C(공여자 X); 레인 3: 비- 발열원성 IGIV-C; 레인 4: 토끼 혈청; 레인 5: 우태아 혈청; 레인 6: 말 혈청. (A) Instant Blue 염색 젤. (B) 항-인간 IgG 알카라인 포스파타제 면역접합체(IgG-AP)로 탐지된 웨스턴 블랏 대조군(무 일차 항체). (C) 일차 항체로서 공여자 X 혈장 분리물 및 항-인간 IgG-AP을 포함하는 발열원성 IGIV-C을 사용하는 웨스턴 블랏. (D) 일차항체로서 비-발열원성 IGIV-C 및 항-인간 IgG-AP을 사용하는 웨스턴 블랏.
도 10은 혈장 분리물을 함유한 발열원성 IVIG-C의 샘플의 전기영동 및 웨스턴 블랏팅 분석으로서, 레인 1: MW 마커; 레인 2: 우태아 혈청; 레인 3: 토끼 혈청; 레인 4: 토끼 혈청, 1:5로 희석; 레인 5: 토끼 혈청, 1:10으로 희석; 레인 6: 토끼 혈청, 1:50로 희석. (A) 웨스턴 블랏 대조군(무 일차 항체), 항-인간 IgG 알카라인 포스파타제 면역접합체(IgG-AP)로 탐침됨. (B) 웨스턴 블랏, 일차항체로서 공여자 X 혈장 분리물을 포함하는 발열원성 IGIV-C, 및 항-인간 IgG-AP를 사용. (C) 웨스턴 블랏, 일차항체로서 비-발열원성 IGIV, 및 항-인간 IgG-AP를 사용. (D) Instant Blue 염색 젤.
도 11은 공여자 X의 혈장의 래트 WBC와의 교차 반응으로서, Rat WBC 응집 분석법의 형광현미경 사진. 래트 WBC를 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다. 패널 (A)는 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG과 배양된 래트 WBC의 양성 형광과 응집, 및 응집된 세포의 40x 이미지(바닥 패널)을 나타낸다. 이러한 결과들은 WBC 세포-표면 항체들과 반응성인 IgG들을 포함한다는 것을 나타낸다. 패널 (B)는 대조군 혈장으로 관찰된 약한 형광, 및 아무런 응집을 나타내지 않는 래트 WBC의 40x 이미지(바닥 패널)를 나타낸다.
도 2는 인간 백혈구 응집 검정법의 현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 인간 WBC와 배양한 후 현미경으로 관찰하였다. 공여자 X 혈장(A, C) 또는 대조군 혈장(B, D)과 배양된 토끼 백혈구의 광 현미경사진(A, B) 및 위상차 현미경사진(C, D). 응집은 공여자 혈장(A, C)에서 관찰되었으나, 대조군 혈장(B, D)에서는 관찰되지 않았다.
도 3은 공여자 X 토끼 WBC 응집의 위상차 및 형광현미경 사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 WBC들과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후, 위상차 또는 형광현미경으로 관찰하였다. 패널 (A)는 공여자 X 혈장과 배양한 토끼 WBC의 위상차 현미경 사진을 나타낸다. 패널 (B)는 공여자 X 혈장과 배양된 후 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG로 처리된 토끼 WBC의 형광 현미경을 나타낸다. 응집된 세포 집단에서 강한 형광이 관찰되었고, 이는 공여자 X 혈장으로부터 나온 인간 IgG가 세포성 응집을 담당한다는 것을 나타낸다.
도 4는 토끼 WBC 응집 분석법의 형광현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 WBC와 배양한 후 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG과 반응시켰다. 패널 (A)는 토끼 WBC들의 양성 형광을 나타낸다. 패널 (B)는 대조군 혈장의 결과를 나타낸다.
도 5는 토끼 WBC 응집 분석법의 형광현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 WBC들과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후, 형광현미경으로 관찰하였다. 패널 (A)는 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 배양된 토끼 WBC의 양성 형광 및 응집된 세포(바닥)의 40x 배율 사진을 나타낸다. 이러한 결과들은 공여자 X의 혈장이 토끼 WBC 세포-표면 항원과 반응성인 IgG들을 포함하고 있다는 것을 나타낸다. 패널 (B)는 대조군 혈장으로 관찰된 약한 형광을 나타내고, 응집을 보이지 않는 토끼 WBC의 위상차 현미경사진을 나타낸다(바닥).
도 6은 인간 WBC 응집 분석법의 형광현미경사진으로서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 인간 WBC와 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG과 반응시킨 후, 형광현미경으로 관찰하였다. (A, 공여자 X) 및 (B, 대조군 혈장) 어느 것도 강한 형광 또는 응집 (바닥 패널)을 가지지 않았고, 이는 공여자 X의 혈장이 인간 WBC 세포-표면 항원에 반응적이지 않은 IgG들을 포함한다는 것을 의미한다.
도 7은 형광 유세포 분석법 히스토그램으로서, 토끼 WBC를 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후, 유세포 분석법으로 분석하였다. 히스토그램은 관찰된 상대적 형광을 나타낸다. 패널 A 및 B는 2개의 개별 실험을 나타낸다. 공여자 X 혈장은 대조군 혈장보다 적어도 3배인 상대적 형광을 가지는 최대 신호를 보인다. 정량적 결과에 대하여는 표 4 및 표 5를 참조하라.
도 8은 형광 유세포 분석법 히스토그램으로서, 인간 WBC를 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응 후, 유세포 분석법으로 분석하였다. 히스토그램은 관찰된 상대적 형광을 나타낸다. 패널 A 및 B는 2개의 개별 실험을 나타낸다. 공여자 X 혈장은 대조군 혈장과 유의하게 다르지 않았다. 정량적 결과는 표 6과 표 7을 참조하라.
도 9는 공여자 X 혈장 분리물을 함유하는 발열원성 IVIG-C의 샘플의 전기영동 및 웨스턴 블랏팅 분석으로서, 레인 1: MW 마커; 레인 2: 발열원성 IGIV-C(공여자 X); 레인 3: 비- 발열원성 IGIV-C; 레인 4: 토끼 혈청; 레인 5: 우태아 혈청; 레인 6: 말 혈청. (A) Instant Blue 염색 젤. (B) 항-인간 IgG 알카라인 포스파타제 면역접합체(IgG-AP)로 탐지된 웨스턴 블랏 대조군(무 일차 항체). (C) 일차 항체로서 공여자 X 혈장 분리물 및 항-인간 IgG-AP을 포함하는 발열원성 IGIV-C을 사용하는 웨스턴 블랏. (D) 일차항체로서 비-발열원성 IGIV-C 및 항-인간 IgG-AP을 사용하는 웨스턴 블랏.
도 10은 혈장 분리물을 함유한 발열원성 IVIG-C의 샘플의 전기영동 및 웨스턴 블랏팅 분석으로서, 레인 1: MW 마커; 레인 2: 우태아 혈청; 레인 3: 토끼 혈청; 레인 4: 토끼 혈청, 1:5로 희석; 레인 5: 토끼 혈청, 1:10으로 희석; 레인 6: 토끼 혈청, 1:50로 희석. (A) 웨스턴 블랏 대조군(무 일차 항체), 항-인간 IgG 알카라인 포스파타제 면역접합체(IgG-AP)로 탐침됨. (B) 웨스턴 블랏, 일차항체로서 공여자 X 혈장 분리물을 포함하는 발열원성 IGIV-C, 및 항-인간 IgG-AP를 사용. (C) 웨스턴 블랏, 일차항체로서 비-발열원성 IGIV, 및 항-인간 IgG-AP를 사용. (D) Instant Blue 염색 젤.
도 11은 공여자 X의 혈장의 래트 WBC와의 교차 반응으로서, Rat WBC 응집 분석법의 형광현미경 사진. 래트 WBC를 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양하고, 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG와 반응시킨 후 형광현미경으로 관찰하였다. 패널 (A)는 플루오레세인-표지된 항-인간 IgG과 배양된 래트 WBC의 양성 형광과 응집, 및 응집된 세포의 40x 이미지(바닥 패널)을 나타낸다. 이러한 결과들은 WBC 세포-표면 항체들과 반응성인 IgG들을 포함한다는 것을 나타낸다. 패널 (B)는 대조군 혈장으로 관찰된 약한 형광, 및 아무런 응집을 나타내지 않는 래트 WBC의 40x 이미지(바닥 패널)를 나타낸다.
상세한 설명
인간 혈액에서의 비정형 항체 및 혈액 산물을 동정하는 방법이 개시된다. "공여자 X"로 지칭되는 개인은 혈장을 공여하고 이는 다른 단위물들과 합체되어 생체치료성 단백질 생성물을 제조한다. 가공 중에, 상기 합체된 혈장은 발열원성 토끼 분석법을 사용하여 발열원성에 대하여 분석하였다. 예상치 못하게, 상기 합체된 혈장이 상기 USP 토끼 시험에서 발열성 양성으로 시험되었다. 추가 분석으로 상기 발열원성 인자를 추적하여 공여자 X의 혈장을 찾았다. 생물학적 내독소 시험 (LAL)은 공여자 X 혈장이 박테리아 내독소로 오염되지 않은 것을 보였다. 대신에, 여기서 설명된 분석법들은 공여자 X의 혈장이 발열원성 반응에 책임이 있는 비정형 항체들을 포함한다고 증거하였다. 특히, 광 및 형광 현미경 조사는 공여자 X 혈장이 토끼 및 래트 WBC들을 응집하게 하나 인간 WBC들은 그렇지 않다고 보였다. 상기 토끼 WBC 교차 반응성은 공여자 X에 특이적인데, 이는 공여자 X의 부모, 동기 및 자녀들로부터의 혈장이 반응하지 않았기 때문이다. 형광 유세포 분석법 실험에 따르면, 공여자 X 혈장은 토끼 WBC 세포-표면 항체와 반응성인 IgG 항체를 포함하고 있었고, 웨스턴 블랏 실험은 상기 IgG들과 토끼 혈청과의 반응성을 확인하였다. 종합적으로, 이러한 결과들은 공여자 X가 토끼 WBC와 교차 반응성인 체액 면역성을 유도할 수 있었던 설치류 또는 설치류의 곤충 매개물에 노출되었을 수 있었다는 것을 제시한다. 따라서, 특정 개인의 혈장은 USP 토끼 발열인자 시험에서 양성으로 시험될 수 있는 데, 이는 박테리아에 감염되었기 때문이 아니라 비정형 항체들 토끼 WBC 항체와 교차 반응되는 비정형 항체들을 포함하고 있기 때문이다.
실시예
실시예 1
미국 약전(USP) 발열인자 분석법
현재 미국 약전 §151항은 발열인자 분석법을 개시하고 있다. 상기 시험은 시험 용액을 정맥내 주사 후 토끼의 체온의 상승을 측정하는 것을 포함한다. 이러한 분석법은 생성물이 10분 이내의 기간 동안 kg당 10mL 이하로 정맥내 투여된 양에서 시험 토끼에 의해 허용될 수 있는 것인가를 결정하기 위한 것이다. 처음에는 세 마리 토기가 주사된다. 임의의 토끼가 개별 온도 상승 = 0.5℃을 보인다면, 시험을 5마리 추가 토끼를 사용하여 계속한다. 여덟 마리 토끼 중 세 마리 이상이 개별 온도 상승 = 0.5℃을 보이고 및/또는 8 마리 개별 온도 상승의 합이 3.3℃를 넘기면, 시험 물질은 발열원성으로 간주된다.
공여자 X 혈장의 샘플 또는 임의의 공여자 X 혈장이 없는 합체된 샘플을 1:100으로 염화 나트륨 용액(0.9% NaCl) 10mL에 희석시키고, 세 마리 건강한 성체 토끼의 귀 정맥으로 투여하였다. 토끼의 체온을 주사 후 10 분 내에 항문에서 측정하였다. 체온 데이터는 표 1에 나타나 있다. 무 공여자 X 혈장 샘플은 아무 토끼에서 체온 상승을 유도하지 않았다. 반면, 공여자 X 혈장 시험시, 1.1~1.2℃의 체온 상승이 측정되었다. 3 마리 토끼들에 대한 총 체온 상승이 3.4℃이기 때문에, 공여자 X 혈장은 발열원성으로 간주되었고, 5 마지 토끼들에 시험을 연장할 필요가 없었다.
0% 또는 10% 공여자 X 혈장을 포함하는 풀 내의 면역글로불린을 단백질 A 컬럼을 사용하여 포획하고 발열원성에 대하여 시험하였다. 무 공여자 X 혈장 샘플은 체온 상승을 유발하지 않았지만, 공여자 X 혈장을 포함하는 샘플은 높은 발열원성이었다. 이러한 결과는 토끼에서의 발열원성 반응이 공여자 X 혈장에서의 면역글로불린과 관계될 수 있다는 것을 나타낸다.
| 표 1: 공여자 X 혈장은 토끼에서 발열원성 반응을 야기한다 | ||||
| 샘플 | USP 발열인자 Max 체온 상승 (℃) | 총 ΔT | ||
| 토끼 1 | 토끼 2 | 토끼 3 | ||
| 혈장 공여자 X (1:100) | 1.1 | 1.1 | 1.2 | 3.4 |
| 합체된 혈장 w/o 공여자 X (1:100) | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 합체된 Mab 용출물 w/ 10% 공여자 X | 2.0 | 2.4 | 1.6 | 6.0 |
| 합체된 Mab 용출물 w/o 공여자 X | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 0.1 |
실시예 2
발열원성의 성질을 더 잘 이해하고자, 공여자 X 혈장을 사용하여 일련의 실험을 수행하였다.
백혈구 응집 및 현미경 실험
응집 실험을 수행하여 공여자 X 혈장 및 토끼나 인간 백혈구(WBC) 사이의 상호작용을 평가하였다. WBC를 Histopaque®(Sigma-Aldrich)를 사용하여 토끼 및 인간 전혈을 밀도 구배 원심분리하여 얻었고, BSA가 보충된 정상 완충 생리액에 현탁하였다. 다음, 토끼 및 인간 WBC를 공여자 X 및 대조군 혈장과 96-웰 마이크로플레이트에서 배양하였다. 배양 및 세척 후, 형광-표지된 항-인간 IgG를 첨가하였고, 마이크로플레이트를 항온처리하고, 세척하고 및 현미경으로 관찰하였다. 가시광 및 위상차 현미경으로 각각의 웰을 응집에 대하여 관찰하고 다음 형광현미경으로 관찰하였다(후속 단원에서 결과 논의).
공여자 X 혈장 및 토끼 WBC를 함유한 시험 웰에서 유의한 응집이 관찰되었으나(도 1(a) 및 1(c)) 공여자 X 혈장 및 인간 WBC를 함유한 시험 웰에서는 관찰되지 않았다(도 2(a) 및 도 2(c)). 대조군 혈장 및 토끼 WBC(도 1(b) 및 도 1(d)) 또는 대조군 혈장 및 인간 WBC(도 2(b) 및 도 2(d))를 함유한 웰에서는 아무런 응집이 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 많은 분석법으로 재현되었고, 이는 공여자 X IgG가 토끼 WBC에 결합하나, 인간 WBC에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 도 2 참조.
상기 몇몇의 응집 실험 동안, 세포독성이 토끼 WBC 및 공여자 X 혈장을 포함하는 샘플에서 관찰되었으나, 대조군 혈장 및 토끼 WBC을 포함하는 웰에서도, 공여자 X나 대조군 혈장를 가지는 인간 WBC를 포함하는 어떤 웰에서도 관찰되지 않았다. 공여자 X 혈장이 토끼 WBC에 독성이라는 관찰은 공여자 X 면역글로불린이 이러한 세포에 특이적으로 결합한다는 것을 제시한다. 도 1 내지 도 3 참조.
형광 현미경 실험
형광 현미경 실험을 상기 설명된 응집 및 광 현미경 연구와 함께 수행하였고, 그 결과를 표 2에 제시한다. 토끼 WBC들은 공여자 X 혈장과 배양된 샘플에서 강하게 형광을 나타냈고(도 4(a) 및 도 5(a)), 이에 비해 대조군 혈장(도 4(b)) 또는 형광-표지된 항-인간 IgG와 배양된 샘플에 대해서는 상대적으로 약한 정도의 형광이 나타났다. 도 4 및 도 5를 참조하라. 이러한 결과는 토끼 WBC들에 대해 관찰된 형광이 공여자 X에 존재하는 IgG에 특이적이라는 것을 나타낸다. 약한 형광이 공여자 X 및 대조군 혈장 둘 다(도 6) 또는 오로지 형광-표지 항-인간 IgG(공여자 X 또는 대조군 혈장이 첨가되지 않은)과 배양된 인간 WBC에 대해 관찰되었다. 도 6(b). 이러한 발견은 인간 WBC들로 관찰된 형광이 공여자 X 또는 대조군 IgG와는 무관하게, 비특이적 결합을 보이는 것을 나타낸다.
| 표 2: 형광 현미경 결과들 | |||
| 혈장 출처 | 숙주 WBC | 형광 표지된 항-인간 IgG | 형광 점수 (0-4) |
| 공여자 X | 토끼 | 존재 | 3-4 |
| 대조군 | 토끼 | 존재 | 0-2 |
| 없음 | 토끼 | 존재 | 0-1 |
| 공여자 X | 인간 | 존재 | 0-1 |
| 대조군 | 인간 | 존재 | 0-1 |
| 없음 | 인간 | 존재 | 0-1 |
실시예
3
유세포
분석법 실험
항체 결합, 및 현미경으로 관찰된 형광을 정량화하기 위해, 유세포 분석법 연구를 실시하였다. 이러한 실험에서, 토끼 및 인간 WBC들을 공여자 X 및 대조군 혈장과 배양하고, 세척한 후, 형광-표지된 항-인간 IgG을 첨가하고 배양하였다. 세포 샘플을 세척하고, 정상 완충 생리액에 재현탁하여 약 3 x 106 내지 5 x 106 세포/mL 범위의 농도로 만들고 유세포 분석법으로 분석하였다.
도 7은 히스토그램 오버레이를 포함하는 것으로서, 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양된 2개의 상이한 토끼 WBC 샘플의 상대적인 형광 강도를 나타낸다. 분석 대조군으로서 2개의 추가 샘플이 포함되어 있는 데, 미염색된 토끼 WBC(세포 대조군) 및 형광 표지된 항-인간-IgG로만 처리된 토끼 WBC이다. 공여자 X 혈장과 배양된 토끼 WBC의 중간 형광은 실험 1에서는 3264, 및 실험 2에서는 922였고, 토끼 WBC를 대조군 혈장과 배양 후 관측된 것보다 유의하게 높았다(실험 1 및 2에 대한 각각의 중간 형광 499 및 175). 표 3 및 표 4를 참조하라. 따라서, 공여자 X와 대조군 혈장과 배양된 토끼 WBC들 간에 일부 중첩이 있다고 하더라도, 형광 강도에서 뚜렷한 차이가 있다. 이러한 결과들은, WBC들은 공여자 X 혈장과 반응하고 대조군 혈장과 배양된 것보다 유의하게 강한 형광을 생성한다는, 상기에서 논의한 현미경 결과와 잘 연관된다.
| 표 3: 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양된 토끼 WBC의 상대적 형광을 나타내는 유세포 분석법 히스토그램 데이터 | |||||
| 실험 1 | 상대적 형광(N = 20,0000) | ||||
| 세포 유형 | 평균 | 중간 | 모드 | 모드 수 | 표준 편차 |
| 공여자 X 혈장 | 4,507.4 | 3,263.8 | 10,000.1 | 1,632 | 3,688.4 |
| 대조군 혈장 | 1,508.9 | 498.9 | 9,003.1 | 509 | 2,404.3 |
| 항-IgG 유일 | 13.4 | 5.7 | 3.7 | 400 | 176.3 |
| 세포 대조군 | 4.3 | 3.0 | 3.4 | 630 | 49.7 |
| 표 4: 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양된 토끼 WBC의 상대적 형광을 나타내는 유세포 분석법 히스토그램 데이터 | ||
| 실험 2 | 상대적 형광 (N = 20,0000) | |
| 세포 유형 | 평균 | 중간 |
| 공여자 X 혈장 | 1752 | 922 |
| 대조군 혈장 | 501 | 175 |
| 항-IgG 유일 | 13 | 1 |
| 세포 대조군 | 1 | 1 |
상기 유세포 분석법 실험을 인간 WBC를 사용하여 반복하였고, 결과를 도 8과, 표 5 및 표 6에 제시하였다. 공여자 X 혈장 및 대조군 혈장과 배양된 인간 WBC들은 유사한 히스토그램을 가졌고, 이는 형광 강도에서 유의한 차이가 없다는 것을 나타낸다. 이러한 결과들은 공여자 X 및 대조군 혈장으로 처리된 인간 WBC들이 유사한 정도의 형광을 생성한다는, 이전에 논의된 현미경 연구 결과와 상호 연관된다. 플루오로크롬-표지된 항-인간-IgG로만 염색된 인간 WBC 샘플은 또한 공여자 X 및 대조군 혈장 샘플과 상당한 중첩을 나타냈고, 따라서, 상당한 정도의 이차 항체에 의한 비특이적 결합을 가리킨다.
| 표 5: 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양된 인간 WBC의 상대적 형광을 나타내는 유세포 분석법 히스토그램 데이터 | |||||
| 실험 3 | 상대적 형광(N = 20,0000) | ||||
| 세포 유형 | 평균 | 중간 | 모드 | 모드 수 | 표준 편차 |
| 공여자 X 혈장 | 1004.9 | 47.7 | 16.1 | 304 | 1739.0 |
| 대조군 혈장 | 820.9 | 37.0 | 11.3 | 294 | 1472.1 |
| 항-IgG 유일 | 381.8 | 17.4 | 9.4 | 332 | 785.5 |
| 세포 대조군 | 5.6 | 2.8 | 2.9 | 695 | 2663.1 |
| 표 6: 공여자 X 또는 대조군 혈장과 배양된 인간 WBC의 상대적 형광을 나타내는 유세포 분석법 히스토그램 데이터 | ||
| 실험 4 | 상대적 형광(N = 20,0000) | |
| 세포 유형 | 평균 | 중간 |
| 공여자 X 혈장 | 174 | 7 |
| 대조군 혈장 | 274 | 16 |
| 항-IgG 유일 | 76 | 4 |
| 세포 대조군 | 1 | 1 |
요약하면, 상기 유세포 분석결과는 공여자 X 면역글로불린(예, IgG)이, 대조군 혈장에 비해 토끼 WBC에 유의한 결합을 나타내고, 인간 WBC에 최소 결합을 나타낸다.
실시예
4
토끼
발열인자
보충 시험
공여자 X 면역글로불린에 대한 가능한 유전적 연관 및 이의 토끼 발열원성에 대한 효과를 평가하기 위해, USP 발열인자 분석을 공여자 X의 인척에 의해 제공된 혈청에 대하여 실시하였다. 공여자 X 혈청의 샘플을 또한 대조군으로서 시험하였다. 이전의 연구가 공여자 X 혈장이 1:100의 희석에서 유의한 발열인자 반응을 생성한 것을 나타냈기 때문에, 모든 시험 샘플들을 토끼 발열인자 시험 전에 멸균된 정상 생리액(0.9% NaCl, USP, 주사용)에 1:100으로 희석하였다. 각 샘플의 분주액을 또한 LAL 분석에 사용하여 발열인자 반응 원으로서 내독소 오염을 조사하였다. 발열인자 및 LAL 결과를 표 7에 제시한다.
| 표 7: 공여자 X 및 근친에 대한 USP 발열인자 시험 결과 | ||||
| USP 토끼 발열인자 결과(최대 체온 증가, ℃) | ||||
| 혈청 샘플 (1:100 희석) |
토끼 1 | 토끼 2 | 토끼 3 | 총 ΔT |
| 공여자 X | 1.0 | 0.3 | 0.6 | 1.9 |
| 부 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 0.1 |
| 모 | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 0.2 |
| 여자 형제 1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 남자 형제 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | 0.0 |
| 여자 형제 2 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 0.1 |
| 딸 1 | 0.0 | 0.1 | 0.1 | 0.2 |
| 딸 2 | 0.0 | 0.2 | 0.0 | 0.2 |
| 아들 | 0.0 | 0.1 | 0.0 | 0.1 |
공여자 X의 혈청은 3마리 토끼 중 2마리에서 유의한 체온 상승을 나타냈고, 총 1.9 ℃의 체온 증가가 있었다. 이러한 반응은 공여자 X 혈장에 대한 이전의 시험과 일치하는 것이다. 부모, 동기들 및 자녀를 위시한 공여자 X의 인척의 혈청은 유의한 체온 증가를 나타내지 않았다. 모든 샘플에 대한 생물학적 내독소 시험(LAL) 결과는 음성이었고, 이는 내인성 내독소가 토끼 발열원성 반응에 관여하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예
5
적혈구 응집 연구
공여자 X 혈장을 토끼 적혈구에 대하여 일련의 응집 실험에서 시험하여 공여자 X 혈장이 토끼 RBC 상의 항원에 대하여 특이적 면역글로불린을 포함하고 있는 지를 결정하였다. 공여자 X 혈장 면역글로불린 및 토끼 RBC 간의 부적합성은 잠재적으로 용혈 및 발열원성을 야기할 수 있다. 이러한 연구를 위해, 공여자 X 및 대조군 혈장을 토끼 RBC의 현탁액에 대하여 적정하였다. 상기 현탁액을 3가지 시점에서 관찰하였다: (1) 즉시; (2) 37℃에서 30분 배양 후; 및 (3) 항-인간-글로불린 혈청을 첨가 후.
공여자 X 및 대조군 혈장 둘 다는 모든 시점에서 토끼 RBC의 강한 응집을 유발하였고, 공여자 X 및 상기 양성 대조군에 대하여 동등한 적정치가 관찰되었다. 용혈은 공여자 X 및 양성 대조군 둘 다의 낮은 희석물에서 관찰되었다.
공여자 X 및 대조군 혈장에 항-A, 및/또는 항-B 면역글로불린이 존재하면, 인간 A 및 B 항원에 대한 유사 에피토프들(epitopes)을 가진 토끼 RBC 항원과 잠재적으로 교차 반응시킬 수 있다. 따라서, 공여자 X 및 대조군 혈장을 인간 A 및/또는 B RBC로 예비 흡수하여 교차반응하는 항-A 및 항-B 항체를 제거하였다. 다음 상기 예비 흡수된 혈장을 전술한 바와 같이 토끼에 대하여 시험하였다. 공여자 X 및 대조군 혈장은 강한 응집을 유발하였고, 처음 결과와 유사하였다. 공여자 X와 대조군 혈장 사이의 반응성에서의 아무런 차이를 발견하지 못하였다. 이러한 결과들은 토끼 RBC 상의 항원/에피토프에 광범위한 교차 반응성을 가진 공여자 X 혈장에서 항체의 존재를 나타내고 있다. 또한, 이러한 결과들은 RBC-매개 과정이 토끼에서 발열원성 반응에 대하여 관계하지 않는다는 것을 제시한다.
RBC 항체-동정 패널을 사용하여 공여자 X 혈장을 인간 RBC 항원에 대한 항체에 대하여 또한 시험하였다. 모든 패널 세포에 대하여 음성적 결과가 수득되었고, 이는 공여자 X 혈장이 임상적으로 유의한 동종항체를 포함하고 있지 않다는 것을 확인하는 것이다.
항원 표현형 분석을 공여자 X RBC상에서 또한 실시하였는데, Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, MNS, P, 및 루터란 혈액 군 시스템에 속하는 RBC 항원에 대한 분석을 포함하였다. 공여자 X RBC는 공통적인 RBC 표현형이고, 비일상적인 결과는 없었다.
실시예
6
공여자 X 혈장을 포함하는 하류 혈장 생성물을 분석하여 발열원성-반응을 야기하는 것을 담당하는 인자를 동정하였다. 공여자 X 혈장을 함유하는 혈장 풀로부터 생성된, 10% 카프릴레이트를 함유하고/크로마토그래피 정제된, 인간 면역글로불린인, Globulin, Intravenous(예, IGIV-C 10%, 즉, Gamunex® Grifols Therapeutics Inc., 이전에는 Talecris Biotherapeutics, Inc.이었음)을 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다.
웨스턴
블랏팅
공여자 X-함유 혈장 풀들로부터 생성된 "발열원성" IGIV-C의 샘플, 비- 무 공여자 X 혈장 풀들로부터 생성된 발열원성 IGIV-C의 샘플, 토끼 혈청의 샘플, 우태아 혈청의 샘플 및 말 혈청의 샘플을 4개의 4 - 20% 환원 SDS-PAGE 젤 상에서 전개하였다. 하나의 젤을 Instant Blue로 염색하고(도 9(a)) 다른 3개를 PVDF 막으로 전이하였다(도 9(b) 내지 도 9(d)). 하나의 막을 알칼라인 포스파타제와 접합된 항-인간 IgG 만으로 반응시켰다(도 9(b)). 나머지 막들을 발열원성 IGIV-C 또는 비-발열원성 IGIV-C과 반응시킨 후, 항-인간 IgG 알칼라인 포스파타제 접합체와 반응시켰다(도 9(c) 내지 도 9(d)). 레인 1: MW 마커들; 레인 2: 발열원성 IGIV-C(공여자 X); 레인 3: 비-발열원성 IGIV-C; 레인 4: 토끼 혈청; 레인 5: 우태아 혈청; 레인 6: 말 혈청.
상기 Instant Blue-염색된 젤은 비견할만한 양의 토끼 혈청, 우태아 혈청 및 말 혈청들이 젤에 적재되고 있음을 나타낸다. 도 9(a)에서의 레인 4 내지 레인 6. 항-인간 IgG 만으로 염색된 막은 이차 항체(항-인간 IgG)가 특이적이며 오직 인간 IgG(발열원성 및 비-발열원성 IGIV-C)과 반응한다는 것을 나타낸다. 도 9(b)에서의 레인 2 및 레인 3. 발열원성 IGIV-C 및 항-인간 IgG 알칼라인 포스파타제 접합체와 반응한 막은 발열원성 IGIV-C가 강력하게 토끼 혈청과 반응하고 우태아 및 말 혈청과는 약하게 반응한다는 것을 나타낸다. 도 9(c)에서의 레인 4 내지 레인 6. 비-발열원성 IGIV-C 및 상기 항-인간 IgG 알칼라인 포스파타제 접합체와 반응한 막은 비-발열원성 IGIV-C가 토끼 혈청을 포함한 상기 3개의 시험 혈청들과 약하게 반응한다는 것을 나타낸다. 도 9(d)에서의 레인 4 내지 레인 6. 총체적으로, 이러한 결과들은 발열원성 IGIV-C가 토끼 혈청과 강하게 반응하나, 비-발열원성 IGIV-C는 그렇지 않다는 것을 가리킨다.
우태아 혈청의 샘플 및 다양한 농도의 토끼 혈청을 4개의 4 내지 20% SDS-PAGE 젤 상에서 전개하였다. 3개의 젤을 PVDF 막에 전이하였고(도 10(a) 내지 도 10(c)), 1개의 젤을 Instant Blue로 염색하였다(도 10(d)). 1개의 막을 알칼라인 포스파타제에 접합된 항-인간 IgG와만 반응시켰다(도 10(a)). 나머지 막은 발열원성 IGIV-C 또는 비-발열원성 IGIV-C와 반응시킨 후 항-인간 IgG 알카라인 포스파타제 면역접합체와 반응시켰다(도 10(b) 및 도 10(c)). 레인 1: MW 마커들; 레인 2: 우태아 혈청; 레인 3: 토끼 혈청; 레인 4: 토끼 혈청, 1:5로 희석; 레인 5: 토끼 혈청, 1:10로 희석; 레인 6: 토끼 혈청, 1:50로 희석.
막을 항-인간 IgG로만 탐침하였을 때 웨스턴 블랏이 없었다. 도 10(a). 그러나, 발열원성 IGIV-C을 일차 Ab로 사용할 경우, 미희석 토끼 혈청, 및 1:5와 1:10으로 희석된 토끼 혈청에 특이적으로 반응하였다. 도 10(b)에서의 레인 3 내지 레인 5 참조. 토끼 혈청의 1:50은 반응하지 않았다(레인 6). 비-발열원성 IGIV-C를 일차항체로서 사용할 때는 비희석 토끼 혈청만이 검출되었다. 도 10(c)에서의 레인 4. Instant Blue-염색된 젤은 젤에 적재된 우태아 혈청 및 토끼 혈청의 상대적 양을 나타낸다. 도 10D에서의 레인 2 및 레인 3. 전체적으로, 상기 결과는 발열원성 IGIV-C가 비-발열원성 IGIV-C보다 토끼 혈청에 대한 항체를 ~10배 더 많이 포함하고 있다는 것을 가리킨다.
실시예
7
래트
WBC
형광현미경 분석 및 응집
Histopaque®을 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 전혈로부터 래트 WBC를 분리하였다. 래트 WBC를 실시예 2와 같이 공여자 X 혈장과 반응시켰다. 공여자 X 혈장은 래트 WBC과 독특한 응집 및 형광을 나타냈다. 도 11을 참조하라.
실시예
8
결과의 요약
현미경(도 1-6) 및 유세포 분석법 실험(도 7-8)의 결과는 공여자 X IgG가 토끼 WBC와 쉽게 결합했다는 것을 나타낸다. 항체 결합은 응집 및 형광 밀도 둘 다에 의해 증명되었다. 비록 대조군 혈장이 토끼 WBC와 일부 형광을 발생한다고 하더라도, 형광의 정도는 공여자 X로 관측된 것보다 유의하게 낮았다. 대조군 혈장은 어떠한 실험에서도 토끼 WBC의 응집을 초래하지 않은 반면, 공여자 X 혈장은 일관적으로 응집을 발생시켰다. 공여자 X 혈장(IgG)은 어떤 실험에서도 인간 WBC과 응집하지 않았고, 이는 공여자 X IgG는 인간 WBC에 결합하지 않는다는 것을 의미한다.
공여자 X IgG의 토끼 WBC로의 결합은 토끼 WBC의 활성화 및 내인성(백혈구성) 발열인자의 방출에 대한 가능성 있는 개시자이고, 이는 관찰된 발열 반응을 야기하였다.
공여자 X의 근친(즉, 부모, 동기 및 자녀) 상에 행한 토끼 발열인자 분석은 균일하게 음성이었다. 표 7. 이러한 결과는 토끼 체온반응에 대하여, 공여자 X IgG의 독특한 성질이 우성적 대립인자 기반인 것이 아니고, 공여자 X에 대한 항체 특이적이라는 것을 나타낸다.
토끼 RBC를 사용한 실험에서 공여자 X 및 대조군 혈장 둘 다 토끼 RBC 상의 항체에 넓은 교차 반응성을 가진 항체를 포함한다는 것이 증명되었다. 공여자 X 및 대조군 혈장은 토끼 RBC과의 매우 유사한 반응을 나타냈고, 이는 RBC-매개 반응이 토끼에서의 발열원성 반응을 담당하는 것이 아니라는 것을 제시한다.
웨스턴 블랏팅 실험은 발열원성 IGIV-C(공여자 X 혈장 분리물 함유) 토끼 혈청과 강하게 반응하지만, 비-발열원성 IGIV-C는 그렇지 않다는 것을 나타냈다. 이것은 발열원성 IGIV-C에 공여자 X의 비정형 IgG가 존재한다는 것이, USP 발열인자 시험에서, 발열원성 반응을 이끌어 내는 데 역할을 한다는 것을 나타낸다. 또한, 웨스턴 블랏팅 실험은 발열원성 IGIV-C가 비-발열원성 IGIV-C보다 토끼 혈청에 대한 항체를 ~10배 더 많이 함유한다는 것을 나타냈다. 이는 발열원성 반응을 야기한 공여자 X 비정형 항체들로부터 있음직한 확률론적 효과를 가리킨다.
래트 백혈구를 사용한 실험은 공여자 X 혈장이 래트 WBC와 교차반응하고 응집을 야기할 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 토끼에 대하여 직접적인 노출 또는 설치류의 곤충 매개체(예, 벼룩)에 의한 간접적 노출이 래트 및 토끼 세포 둘 다에 대한 교차 반응성을 가진 "비정형적" IgG-면역글로불린 면역성으로 이끌 수 있었다는 것을 제시한다.
실시예
9
고처리
분석(
High
-
Throughput
Assays
)
시험 샘플을 96-웰, 192-웰, 또는 384-웰 플레이트 또는 막에서 배양하고, 세척하고, 차단하고, 및 상기 샘플을 효소- 또는 형광단-면역접합체로 탐침한 후 결과를 다른 검출 방법 중에서 형광, 발광, 농도, 비색, 또는 UV/가시광 흡광법으로 분석함으로써 고처리 ELISA, 형광 또는 웨스턴 블랏 실험을 수행하였다. 그러한 고처리 분석법은 가공전, 중 및 후에 혈액 또는 혈장 샘플이나 생성물의 연속적 분석을 가능케 하고, 및 분석에서 오류-양성적 발열인자 결과를 나타낼 수도 있는 비정형 면역글로불린을 함유하는 것과 같은 반응성 샘플을 제거할 수 있다.
Claims (5)
- 혈액 산물 제조 공정에서 비정형 반응성 항체를 동정하는 방법으로서,
상기 비정형 반응성 항체는 토끼 발열인자 시험에서 위양성을 나타내고,
상기 방법은;
(a) 혈액 또는 혈장 샘플을 얻는 단계;
(b) 상기 샘플이 토끼 백혈구 항원과 교차반응하는 비정형 항체를 포함하는지를 결정하기 위해, 세포성 응집반응, 면역 형광 현미경법, 면역침전법, 면역확산법, 면역형광법, ELISA, 유세포 분석법, FACS, 또는 웨스턴 블랏팅 중 하나 이상을 사용하여 상기 샘플 및 대조군을 시험하는 단계;
(c) 상기 샘플과 대조군의 시험 결과를 비교하는 단계;
(d) 상기 샘플이 반응성 비정형 항체를 포함하고 있는지를 결정하는 단계; 및;
(e) 상기 샘플이 반응성 비정형 항체를 포함하면 상기 샘플이 유래한 혈액 또는 혈장 단위체의 사용을 금지하는 단계를 포함하고,
상기 비정형 반응성 항체는 토끼 백혈구 항원과 교차반응할 수 있고, 토끼 발열인자 시험에서 발열원성 반응을 야기하는 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 상기 샘플과 대조군은 세포성 응집반응 분석을 사용하여 시험하는 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 상기 샘플과 대조군은 유세포 분석법을 사용하여 시험하는 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 단계 (b)에서, 상기 샘플과 대조군은 웨스턴 블랏팅을 사용하여 시험하는 방법. - 제1 항에 있어서,
상기 샘플과 대조군을 생물학적 내독소 시험(LAL: : Limulus Amebocyte Lysate assays)을 사용하여 시험하는 단계를 더 포함하는 방법.
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