RU2622984C2

RU2622984C2 - Определение атипичных антител в крови и продуктах крови человека

Info

Publication number: RU2622984C2
Application number: RU2014106616A
Authority: RU
Inventors: Кларк ЗЕРВОС; Джоанн ХОТТА
Original assignee: Грайфолз, С.А.
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2017-06-21
Also published as: HK1198205A1; BR112014007802B1; CN103814296A; AR089042A1; HUE029269T2; US9523694B2; MX2014002430A; US20150132773A1; ES2586422T3; MX348498B; PT2739976T; JP6043807B2; EP2739976B1; CL2014000542A1; JP2015504155A; AU2012327185B2; IL231053A; AU2012327185A1; BR112014007802A2; ZA201401235B

Abstract

Группа изобретений относится к медицине и касается способа определения атипичных реактивных антител, которые приводят к ложноположительному результату исследований на пирогенность на кроликах, в производственном процессе получения продуктов крови, включающего получение образца крови или плазмы, исследование образца и контроля с помощью одного или нескольких методов, выбранных из клеточной агглютинации, флуоресцентной микроскопии, иммунопреципитации, иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, ИФА, проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток и вестерн-блоттинга, для определения содержит ли образец атипичные реактивные антитела, сравнение результатов исследований образца и контроля, определение какой образец содержит реактивные атипичные антитела и изъятие единицы крови или плазмы, которая была источником образца, если образец содержит реактивные атипичные антитела. Группа изобретений также касается способа выявления результатов потенциального ложноположительного исследования на пирогенность на кроликах в производственном процессе получения продуктов крови. Группа изобретений обеспечивает предотвращение загрязнения пулов крови или плазмы образцами, которые проявляют пирогенность из-за присутствия атипичных антител. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 11 ил., 7 табл., 9 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Описанными в данном документе являются способы для определения атипичных антител в крови и продуктах крови.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Были идентифицированы естественные антитела человека, которые вызывают пирогенные реакции во время проведения исследований на пирогенность согласно USP. Некоторые люди-доноры естественно продуцируют данные "атипичные антитела," возможно, получая это в результате контактирования с кроликами, грызунами или насекомыми-паразитами, обитающими на таких животных-хозяевах (например, блохи). Атипичные антитела являются аномальными и редко встречающимися, но не являются вредными для людей. Атипичные антитела могут давать перекрестную реакцию с антигенами белых клеток крови кролика и вызывают пирогенный ответ во время проведения исследований на пирогенность на кроликах.

Пирогенный ответ, однако, представляет собой "ложноположительный" результат, потому что другие способы, такие как анализы лизата амебоцитов Limulus (LAL-тест), показали, что подозрительные образцы плазмы, дающие пирогенные ответы в анализе на кролике не содержат эндотоксины. Кроме того, результаты исследований на патогенность in vitro (aka исследования активации моноцитов) демонстрируют отсутствие неэндотоксиновых пирогенов. Соответственно, атипичные антитела в крови или плазме человека являются причиной ошибочных результатов исследований на пирогенность у кроликов и могут привести в результате к передаче индивидуальной или объединенной крови или плазме, которая ошибочно дает положительный результат, как "пирогенный."

Способы, описанные в данном документе, позволяют определение образцов крови или плазмы, которые содержат атипичные антитела, что в результате приводит к ложноположительным данным в анализах на пирогенность. Данный способ является преимущественным, потому что образцы, содержащие атипичные антитела, могут быть исключены перед объединением с другой кровью или плазмой, и что исключает загрязнение пула. Соответственно, способ уменьшает стоимость производства путем предотвращения излишнего загрязнения пулов крови или плазмы образцами, которые проявляют "пирогенность" из-за присутствия атипичных антител. Способы высокопроизводительного исследования, описанные в данном документе, дают возможность определить подозрительные ложноположительные образцы. Такие образцы могут быть забракованными перед объединением с другими образцами и предотвращают заражение пула атипичным антителами.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Одним аспектом, описанным в данном документе, является способ для определения атипичных реактивных антител в производственном процессе продуктов крови, где способ включает: (а) получение образца крови или плазмы; (b) исследование образца и контроля, используя какой-либо один или больше из клеточной агглютинации, флуоресцентной микроскопии, иммунопреципитации, иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, иммуноферментного анализа, проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток или вестерн-блоттинга; (с) сравнение результатов исследований образца и контроля; (d) определение какой образец содержит реактивные атипичные антитела; и; (е) изолирование единицы крови или плазмы, которая была источником образца, если образец содержит реактивные атипичные антитела.

Другим аспектом, описанным в данном документе, является способ для определения атипичных реактивных антител в производственном процессе продуктов крови, где способ включает: (а) получение образца крови или плазмы; (b) исследование образца и контроля, используя анализ клеточной агглютинации; (с) сравнение результатов исследований образца и контроля; (d) определение какой образец содержит реактивные атипичные антитела; и; (е) изолирование единицы крови или плазмы, которая была источником образца, если образец содержит реактивные атипичные антитела.

Другим аспектом, описанным в данном документе, является способ для определения атипичных реактивных антител в производственном процессе продуктов крови, где способ включает: (а) получение образца крови или плазмы; (b) исследование образца и контроля, используя проточную цитометрию; (с) сравнение результатов исследований образца и контроля; (d) определение какой образец содержит реактивные атипичные антитела; и; (е) изолирование единицы крови или плазмы, которая была источником образца, если образец содержит реактивные атипичные антитела.

Другим аспектом, описанным в данном документе, является способ для определения атипичных реактивных антител в производственном процессе продуктов плазмы крови, где способ включает: (а) получение образца крови или плазмы; (b) исследование образца и контроля, используя вестерн-блоттинг; (с) сравнение результатов исследований образца и контроля; (d) определение какой образец содержит реактивные атипичные антитела; и; (е) изолирование единицы крови или плазмы, которая была источником образца, если образец содержит реактивные атипичные антитела.

Другим аспектом, описанным в данном документе, является способ оценки результатов исследования потенциальной ложноположительной пирогенности в производственном процессе продуктов крови, где способ включает: (а) получение образца крови или продукта крови; (b) исследование образца и контроля, используя флуоресцентную микроскопию, иммунопреципитацию, иммунодиффузию, иммунофлуоресценцию, иммуносорбентный ферментный анализ, проточную цитометрию, сортировку флуоресцентно-активированных клеток или вестерн-блоттинг; (с) исследование образца и контроля, используя анализ лизата амебоцитов Limulus (LAL) или аналогичный анализ; (d) сравнение результатов исследований образца и контроля в обоих анализах; (е) оценивание какой образец дал ложноположительный результат исследования на пирогенность; и (f) изолирование единицы крови или плазмы, которая была источником образца, если образец содержит реактивные атипичные антитела.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: Микроскопия реакций агглютинации белых кровяных клеток кроликов. Плазму Донора X и плазму контроля инкубировали с кроличьими белыми кровяными клетками, и затем наблюдали, используя микроскопию. Свет (А, В) и фазовый контраст (С, D) микрофотографии белых кровяных клеток кролика инкубировали с плазмой Донора X (А, С) или плазмой контроля (В, D). Агглютинацию наблюдали с плазмой Донора X (А, С), но не с плазмой контроля (В, D).

Фигура 2: Микроскопия реакций агглютинации белых кровяных клеток человека. Плазму Донора X и плазму контроля инкубировали с белыми кровяными клетками человека и затем наблюдали, используя микроскопию. Свет (А, В) и фазовый контраст (С, D) микрофотографии белых кровяных клеток человека инкубировали с плазмой Донора X (А, С) или плазмой контроля (В, D). Агглютинацию не наблюдали с плазмой Донора X (А, С) или с плазмой контроля (В, D).

Фигура 3: Фазово-контрастная и флуоресцентная микроскопия агглютинацию белых кровяных клеток кролика Донора X. Плазму Донора X и плазму контроля инкубировали с белыми кровяными клетками кролика, подвергали реакции с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG, и затем наблюдали, используя фазово-контрастную или флуоресцентную микроскопию. Панель (А) показывает фазово-контрастную микрофотографию белых кровяных клеток кролика, инкубированных с плазмой Донора X. Панель (В) показывает флуоресцентную микрофотографию белых кровяных клеток кролика, инкубированных с плазмой Донора X, и которую потом обрабатывали флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG. В кластерах агглютинированных клеток наблюдали сильную флуоресцентную, демонстрировавшую, что IgG человека из плазмы Донора X были ответственными за клеточную агглютинацию.

Фигура 4: Флуоресцентная микроскопия реакций агглютинации белых кровяных клеток кроликов. Плазму Донора X и плазму контроля инкубировали с белыми кровяными клетками человека и затем подвергали реакции с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG. Панель (А) показывает положительную флуоресценцию белых кровяных клеток кролика. Панель (В) показывает результаты с плазмой контроля.

Фигура 5: Флуоресцентная микроскопия реакций агглютинации белых кровяных клеток кроликов. Плазму Донора X и плазму контроля инкубировали с белыми кровяными клетками кролика, подвергали реакции с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG, и затем наблюдали, используя флуоресцентную микроскопию. Панель (А) показывает положительную флуоресценцию белых кровяных клеток кролика, инкубированных с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG и 40 × изображение агглютинированных клеток (нижняя панель). Данные результаты показывают, что плазма Донора X содержит IgGs, реактивный к антигенам клеточной поверхности белых кровяных клеток кролика. Панель (В) показывает слабую флуоресценцию, наблюдаемую с плазмой контроля, где фазово-контрастная микрофотография белых кровяных клеток кролика показывает отсутствие агглютинации (нижняя панель).

Фигура 6: Флуоресцентная микроскопия реакций агглютинации белых кровяных клеток человека. Плазму Донора X и плазму контроля инкубировали с белыми кровяными клетками человека, подвергали реакции с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG, и затем наблюдали, используя флуоресцентную микроскопию. Ни (А, Донор X) ни (В, плазма контроля) не показали сильной флуоресценции или агглютинации (нижние панели), демонстрируя, что плазма Донора X содержит IgGs не реактивный к антигенам клеточной поверхности белых кровяных клеток человека.

Фигура 7: Гистограммы флуоресцентной проточной цитометрии. Белые кровяные клетки кролика инкубировали с плазмой Донора X или плазмой контроля, подвергали реакции с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG, и затем анализировали, используя проточную цитометрию. Гистограммы показывают наблюдаемую относительную флуоресценцию. Панели А и В показывают два отдельных эксперимента. Плазма Донора X давала наибольший сигнал относительной флуоресценцией, по меньшей мере, в три раза, чем плазма контроля. Смотри таблицы 4 и 5 для количественных результатов.

Фигура 8: Гистограммы флуоресцентной проточной цитометрии. Белые кровяные клетки человека инкубировали с плазмой Донора X или плазмой контроля, подвергали реакции с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG, и затем анализировали, используя проточную цитометрию. Гистограммы показывают наблюдаемую относительную флуоресценцию. Панели А и В показывают два отдельных эксперимента. Плазма Донора X значительно не отличались от плазмы контроля. Смотри таблицы 6 и 7 для количественных результатов.

Фигура 9: Электрофорез и вестерн-блоттинг анализ образцов пирогенного IVIG-C, содержащего изоляты плазмы Донора X. Линия 1: MW маркеры; Линия 2: Пирогенный IGIV-C (Донор X); Линия 3: Непирогенный IGIV-C; Линия 4: кроличья сыворотка; Линия 5: фетальная бычья сыворотка; Линия 6: лошадиная сыворотка. (А) Быстрорастворимый голубой окрашивающий гель. (В) Вестерн-блоттинг контроль (непервичное антитело), исследованный с иммуноконъюгатом античеловеческого IgG щелочной фосфатазы (IgG-AP). (С) Вестерн-блоттинг, используя пирогенный IGIV-C, содержащий изоляты плазмы Донора X, как первичное антитело и античеловеческое IgG-AP. (D) Вестерн-блоттинг, исследованный непирогенный IGIV-C, как первичное антитело и античеловеческое IgG-AP.

Фигура 10: Электрофорез и вестерн-блоттинг анализ образцов пирогенного IVIG-C, содержащего изоляты плазмы Донора X. Линия 1: MW маркеры; Линия 2: фетальная бычья сыворотка; Линия 3: кроличья сыворотка; Линия 4: кроличья сыворотка, разбавленная 1:5; Линия 5: кроличья сыворотка, разбавленная 1:10; Линия 6: кроличья сыворотка, разбавленная 1:50. (А) Вестерн-блоттинг контроль (непервичное антитело), исследованный с иммуноконъюгатом античеловеческого IgG щелочной фосфатазы (IgG-AP). (В) Вестерн-блоттинг, используя пирогенный IGIV-C, содержащий изоляты плазмы Донора X, как первичное антитело и античеловеческое IgG-AP. (С) Вестерн-блоттинг, используя непирогенный IGIV-C, как первичное антитело и античеловеческое IgG-AP. (D) Быстрорастворимый голубой окрашивающий гель.

Фигура 11: Плазма Донора X перекрестно реагирует с белыми кровяными клетками крысы: флуоресцентная микроскопия реакций агглютинации белых кровяных клеток крысы. Белые кровяные клетки крысы инкубировали с плазмой Донора X или плазмой контроля, подвергали реакции с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG, и затем наблюдали, используя флуоресцентную микроскопию. Панель (А) показывает положительную флуоресценцию и агглютинацию белых кровяных клеток крысы, инкубированных с флуоресцеин-меченым античеловеческим IgG и 40 × изображение агглютинированных клеток (нижняя панель). Данные результаты демонстрируют, что плазма Донора X содержит IgGs, реактивный к антигенам клеточной поверхности белых кровяных клеток крысы. Панель (В) показывает слабую флуоресценцию, наблюдаемую с плазмой контроля и 40 × изображение белых кровяных клеток крысы, показывающее отсутствие агглютинации (нижняя панель).

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Описанными в данном документе являются способы для определения атипичных антител в крови и продуктах крови. Каждый конкретный, называемый в данном документе как "Донор X," отдавал плазму, которую собирали с другими единицами для производства биотерапевтических протеиновых продуктов. Во время технологического процесса, собранную плазму анализировали на пирогенность, используя анализ на пирогенность на кролике согласно USP. Неожиданно, собранная плазма дала положительный результат, как пирогенная в исследовании на кролике согласно USP. Дополнительные анализы проследили пирогенный агент к плазме Донора X. Анализы лизата амебоцитов Limulus (LAL) показали, что плазма Донора X не была зараженной бактериальными эндотоксинами. На самом деле, анализы, описанные в данном документе, продемонстрировали, что плазма Донора X содержала атипичные антитела, которые были ответственными за пирогенный ответ.Особенно, исследования световой и флуоресцентной микроскопией показали, что плазма Донора X агглютинировала с белыми кровяными клетками кролика и крысы, но не с белыми кровяными клетками человека. Перекрестная реактивность белых кровяных клеток кролика была специфической к плазме Донора X, потому что плазма от родителей, родных сестер, братьев и детей Донора X не вызывала реакцию. Эксперименты флуоресцентной проточной цитометрии показали, что плазма Донора X содержала IgG антитела, реактивные к антигенам клеточной поверхности белых кровяных клеток кролика, и эксперименты вестерн-блоттинг подтвердили реактивность IgGs кроличьей сыворотки. В совокупности, данные результаты предполагают, что Донор X возможно подвергался воздействию грызунов или насекомых переносчиков инфекции, обитающих на грызунах, что могло бы индуцировать гуморальный иммунитет перекрестно реактивный с белыми кровяными клетками кролика. Таким образом, плазма от некоторых индивидуумов может дать положительную реакцию в исследования на патогенность на кролике согласно USP, не потому что они заражены бактериями, а потому что они содержат атипичные антитела, которые являются перекрестно реактивными с антигенами белых кровяных клеток кролика.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Анализ на пирогенность согласно Фармакопеи Соединенных Штатов (USP)

Современная Фармакопея Соединенных Штатов §151 описывает анализ на пирогенность. Исследование включает измерение повышения температуры кроликов следующее после внутривенной инъекции испытуемого раствора. Данный анализ предназначен для определения того, какие продукты могут быть допустимыми путем исследования на кролике, где дозу, которая не должна превышать 10 мл на кг, вводили внутривенно в течение не больше 10 минут. Первоначально вводят трем кроликам. Если какой-либо кролик показывает индивидуальный рост температуры ≥0,5°С, то исследование продолжают, используя пять дополнительных кроликов. Если три или более из восьми кроликов показывают индивидуальный рост температуры ≥0,5°С, и/или сумма восьми повышений индивидуальных температур превышает 3,3°С, то исследуемое вещество материал считается пирогенным.

Образец плазмы Донора X или объединенный образец без какой-либо плазмы Донора X разбавляли 1:100 в 10 мл раствора хлорида натрия (0,9% NaCl) и инъекционно вводили в вены уха трех здоровых взрослых кроликов. Температуры кроликов измеряли ректально в пределах 10 минут после инъекции. Температурные данные показаны в Таблице 1. Донор Х-образец свободный от плазмы не вызывал возрастания температуры у какого-либо из кроликов. В отличие от этого, когда исследовали плазму Донора X, измеряли возрастание температуры, которое составляло 1,1-1,2°С. В связи с тем, что общее возрастание температуры для 3 кроликов составляло 3,4°С, плазма Донора X была признанной пирогенной, и не было никакой необходимости, чтобы расширить исследование до еще 5 кроликов.

Иммуноглобулины в пуле, содержащем 0% или 10% плазмы Донора X были получены, используя белок А колонки, и проверены на пирогенность. Донор Х - образец свободный от плазмы не вызывает возрастание температуры, но образцы, содержащие плазму Донора X были высоко пирогенными. Данные результаты продемонстрировали, что пирогенный ответ у кроликов мог бы быть связанным с иммуноглобулинами в плазме Донора X.

Пример 2

Серию экспериментов проводили, используя плазму Донора X для лучшего понимания природы его пирогенности.

Эксперименты агглютинации белых кровяных клеток и микроскопия

Эксперименты агглютинации выполняли, чтобы оценить взаимодействия между плазмой Донора X и белыми кровяными клетками (WBC) кролика или человека. Белые кровяные клетки собирали из цельной крови кролика и человека, применяя центрифугирование в градиенте плотности, используя Histopaque® (Sigma-Aldrich) и суспендировали в нормальном буферном солевом растворе с добавлением BSA. Белые кровяные клетки кролика и человека затем инкубировали с плазмой Донора X и плазмой контроля в 96-лунковом микропланшете. После инкубации и промывания, добавляли флуоресцентно-меченное античеловеческое IgG, и микропланшеты инкубировали, промывали и исследовали под микроскопом. Каждыйую лунку исследовали на агглютинацию, используя микроскопию видимого света и фазово-контрастную микроскопию, а затем наблюдали, используя флуоресцентную микроскопию (результаты обсуждаются в следующем разделе).

Значительная агглютинация наблюдалась в исследуемых лунках, содержащих плазму Донора X и белые кровяные клетки кролика (Фигуры 1А и 1С), но не в исследуемых лунках, содержащих плазму Донора X и белые кровяные клетки человека (Фигуры 2А и 2С). Агглютинация не наблюдалась в лунках, содержащих плазму контроля и белые кровяные клетки кролика (Фигуры 1В и 1D) или плазму контроля и белые кровяные клетки человека (Фигуры 2В и 2D). Данные результаты воспроизводились в неоднократных анализах и демонстрируют, что Донор X IgG связывается с белыми кровяными клетками кролика, но не с белыми кровяными клетками человека. Смотри Фигуру 2.

Во время нескольких экспериментов агглютинации, в образцах, содержащих белые кровяные клетки кролика и плазму Донора X, наблюдалась цитотоксичность, но ни в лунках, содержащих плазму контроля и белые кровяные клетки кролика, ни каких-либо лунках, содержащих белые кровяные клетки человека с плазмой Донора X или плазмой контроля. Наблюдения, что плазма Донора X является токсичной к белым кровяным клеткам кролика, наталкивали на специфическое связывание иммуноглобулинов Донора X с данными клетками. Смотри фигуры 1-3.

Эксперименты флуоресцентной микроскопии

Эксперименты флуоресцентной микроскопии проводили параллельно с агглютинацией и исследования световой микроскопии описаны выше, и результаты представлены в Таблице 2. Белые кровяные клетки кролика были сильно флуоресцирующими в образцах, инкубированных с плазмой Донора X (Фигуры 4А и 5А), по сравнению с относительно слабой степенью флуоресценции для образцов, инкубированных с плазмой контроля (Фигура 4В) или только с флуоресцентно-меченной античеловеческой IgG. Смотри Фигуры 4 и 5. Данные полученные результаты продемонстрировали, что флуоресценция, наблюдаемая для белых кровяных клеток кролика, была специфической к IgG, присутствующему в Доноре X. Слабая степень флуоресценции наблюдалась для белых кровяных клеток человека, инкубированных как с плазмой Донора X, так и плазмой контроля (Фигура 6), или только с флуоресцентно-меченным античеловеческим IgG (без добавленной плазмы Донора X или плазмы контроля). Фигура 6В. Данные полученные результаты продемонстрировали, что флуоресценция, наблюдаемая для белых кровяных клеток человека, представляла собой неспецифическое связывание, независящее от присутствия Донора X или контроля IgG.

Пример 3

Эксперименты проточной цитометрии

Для того, чтобы количественно определить связывание антитела и флуоресценцию, наблюдаемую с помощью микроскопии, проводили исследования проточной цитометрии. В данных эксперименты, белые кровяные клетки кролика и человека инкубировали с плазмой Донора X и плазмой контроля и промывали перед добавлением и инкубированием с флуоресцентно-меченным античеловеческим IgG. Образцы клеток промывали, снова суспендировали в нормальном буферном солевом растворе до концентрации в диапазоне от приблизительно 3×10⁶ до 5×10⁶ клеток/мл и анализировали, используя проточную цитометрию.

Фигура 7 представляет гистограмму, которая показывает наложение относительной интенсивности флуоресценции двух различных образцов белых кровяных клеток кролика, инкубированных с плазмой Донора X или плазмой контроля. Два дополнительных образца инкубировали как контроли анализа, неокрашенные белые кровяные клетки кролика (клеточный контроль) и белые кровяные клетки кролика обработанные только флуоресцентно-меченным античеловеческим-IgG.

Медианное значение флуоресценции образца белых кровяных клеток кролик, инкубированных с плазмой Донора X составляло 3264 в эксперименте 1 и 922 в эксперименте 2 и, значительно выше, чем те, которые наблюдались после инкубирования белых кровяных клеток кролика с плазма контроля (медианное значение флуоресценции 499 и 175 для экспериментов 1 и 2, соответственно). Смотри Таблицы 3 и 4. Таким образом, несмотря на то, что существовало некоторое перекрывание между белыми кровяными клетками кролика, инкубированными с плазмой Донора X и плазмой контроля, существовало четко выраженное различие в интенсивности флуоресценции. Данные результаты хорошо коррелировали с результатами микроскопического исследования, которые обсуждались выше, где белые кровяные клетки реагировали с плазмой Донора X и продуцировали значительно более сильную флуоресценцию, чем те которые инкубировали с плазмой контроля.

Эксперименты проточной цитометрии повторяли с белыми кровяными клетками человека, и результаты показаны на Фигуре 8 и Таблицах 5 и 6. Белые кровяные клетки человека, инкубированные с плазмой Донора X и плазмой контроля, имели подобные гистограммы, демонстрирующие незначительные различия в флуоресцентной интенсивности. Данные результаты коррелировали с результатами микроскопического исследования, которые обсуждались ранее, в которых белые кровяные клетки человека, обработанные плазмой Донора X и плазмой контроля, продуцировали аналогичной степени флуоресценцию. Образец белых кровяных клеток человека, окрашенный только флуорохром-меченым античеловеческим-IgG также показывал значительное перекрывание образцов плазмы Донора X и плазмы контроля, и, таким образом, указывала на значительную степень неспецифического связывания посредством вторичного антитела.

Подводя итог вышесказанному, анализы проточной цитометрии показали значительное связывание иммуноглобулинов Донора X (то есть, IgGs) с белыми кровяными клетками кролика по сравнению с плазмой контроля и минимальное связывание с белыми кровяными клетками человека.

Пример 4

Дополнительное исследование на пирогенность на кролике

Для того, чтобы оценить возможную генетическую ассоциацию для иммуноглобулинов Донора X и их действие на пирогенность на кролике, анализы на пирогенность согласно USP проводили на сыворотках, переданных родственниками Донора X. Образец сыворотки Донора X также исследовали как контроль. Ввиду того, что предыдущие исследования продемонстрировали, что плазма Донора X вызывала значительный пирогенный ответ при разбавлениях 1:100, все исследуемые образцы разбавляли 1:100 в стерильном нормальном солевом растворе (0,9% NaCl, USP, для инъекций) перед тем, как исследовать пирогенность на кролике. Аликвоту каждого образца также использовали в LAL анализе, чтобы исследовать заражение эндотоксином, как источником пирогенного ответа. Пироген и результаты LAL представлены в Таблице 7.

Сыворотка от Донора X вызывала значительное повышение температуры у двоих из трех исследуемых кроликов, с общим повышением температуры 1,9°C. Данный ответ находился в соответствии с предыдущим исследованием с плазмой Донора X. Сыворотка от родственников Донора X, включая родителей, родных братьев и сестер, и детей, вызывала незначительные повышения температуры. Результаты анализа лизата амебоцитов Limulus (LAL) для всех образцов были отрицательными, демонстрируя, что экзогенный эндотоксин не вносил вклад в пирогенные ответы у кролика.

Пример 5

Исследование агглютинации красных кровяных клеток

Плазму Донора X исследовали с красными кровяными клетками кролика в сериях экспериментов агглютинации, чтобы определить содержит ли плазма Донора X иммуноглобулины специфические для антигенов красные кровяные клетки кролика. Несовместимость между иммуноглобулинами плазмы Донора X и красными кровяными клетками кролика могла бы потенциально вызывать гемолиз и пирогенность. Для данных исследований, плазму Донора X и плазму контроля титровали против суспензии красных кровяных клеток кролика. Суспензию наблюдали в трех точках: (1) немедленно; (2) через 30-минут инкубации при 37°C; и (3) после того, как сыворотка античеловеческого глобулина была добавленной.

Как плазма Донора X так и плазма контроля вызывала агглютинацию красных кровяных клеток кролика во всех точках времени, и эквивалентный титр наблюдали для Донора X и положительного контроля. Гемолиз наблюдали при низких разбавлениях как Донора X так и положительного контроля.

Присутствие анти-А, и/или присутствие иммуноглобулинов анти-В в Доноре X и плазме контроля мог бы потенциально перекрестно реагировать с антигенами красной кровяной клетки кролика с подобными эпитопами к антигенам А и В человека. Соответственно, Донор X и плазма контроля были предварительно абсорбированными с красными кровяными клетками человека А и/или В, чтобы устранить перекрестное реагирование анти-А и анти-В антитела. Предварительно абсорбированную плазму затем исследовали против красных кровяных клеток кролика, как описано выше. Как Донор X так и плазма контроля вызывали сильную агглютинацию, аналогичную к исходным результатам. Никакого различия в реактивности не наблюдали между Донором X и плазмой контроля. Данные результаты показали присутствие антитела в плазме Донора X с широкой перекрестной реактивностью к антигенам/эпитопам красных кровяных клеток кролика. К тому же, данные результаты позволяют предположить, что процесс, опосредованный красными кровяными клетками не несет ответственности за пирогенный ответ у кроликов.

Плазму Донора X, кроме того, исследовали на антитела к антигенам красной кровяной клетки человек, используя панель определения антитела красной кровяной клетки. Отрицательные результаты получали со всеми панелями клеток, подтверждая, что плазма Донора X не содержит клинически значительных аллогенных антител.

Антигенное фенотипирование также проводили на красных кровяных клетках Донора X, которое включало типирование антигенов красной кровяной клетки, принадлежащих к Rh, системы группы крови Келла, Даффи, Кидда, Льюиса, MNS, Р и Лютерана. Красные кровяные клетки Донора X были из общего фенотипа красной кровяной клетки, не привело к необычным результатам.

Пример 6

Уменьшение продуктов плазмы, содержащих плазму Донора X, анализировали, чтобы идентифицировать фактор, ответственный за генерирование пирогенного ответа. Глобулин иммуноглобулина человека, внутривенный, содержащий 10% каприлата/хроматографически очищенного (например, IGIV-C 10%, то есть, Gamunex®, Grifols Therapeutics Inc., в прошлом Talecris Biotherapeutics, Inc.), который был получен из пулов плазмы, содержащих плазму Донора X, анализировали, используя вестерн-блоттинг.

Вестерн-блоттинг

Образцы "пирогенного" IGIV-C, полученного из пулов плазмы, содержащих плазму Донора X, непирогенного IGIV-C, полученного из пулов плазмы, не содержащих плазму Донора X, кроличьей сыворотки, фетальной бычьей сыворотки, и лошадиной сыворотки проводили на четырех 4-20% восстанавливающих ДСН-ПААГ гелях. Один гель был окрашен быстрорастворимым голубым (Фигура 9А), в то время как три другие переносили на ПВДФ мембраны (Фигуры 9B-D). Одну мембрану подвергали реакции с только античеловеческим IgG, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Фигура 9 В). Оставшиеся мембраны подвергали реакции с пирогенным IGIV-C или с непирогенным IGIV-C, и потом с конъюгатом античеловеческого IgG со щелочной фосфатазой (Фигуры 9C-D). Линия 1: MW маркеры; Линия 2: Пирогенный IGIV-C (Донор X); Линия 3: Непирогенный IGIV-C; Линия 4: Кроличья сыворотка; Линия 5: Фетальная бычья сыворотка; Линия 6: Лошадиная сыворотка.

Гель, окрашенный быстрорастворимым голубым, показал, что сопоставимые количества кроличьей сыворотки, фетальной бычьей сыворотки и лошадиной сыворотки загружали на гель. Линии 4-6 на фигуре 9А. Мембрана, окрашенная только античеловеческим IgG, показала, что вторичное антитело (античеловеческий IgG) было специфическим и реагировало только с человеком IgG (пирогенным и непирогенным

IGIV-C). Линии 2 и 3 на Фигуре 9 В. Мембрана реагировала с пирогенным IGIV-C и конъюгатом античеловеческого IgG со щелочной фосфатазой показала, что пирогенный IGIV-C сильно реагировал с кроличьей сывороткой и слабо с фетальной бычьей и лошадиной сывороткой. Линии 4-6 на Фигуре 9С.Мембрана реагировала с непирогенным IGIV-C и конъюгатом античеловеческого IgG со щелочной фосфатазой показала, что непирогенный IGIV-C слабо реагировал с тремя исследуемыми сыворотками, включая кроличью сыворотку. Линии 4-6 на Фигуре 9D. В совокупности, данные результаты демонстрируют, что пирогенный IGIV-C сильно реагирует с сыворотками кролика, в то время как непирогенный IGIV-C нет.

Образцы фетальной бычьей сыворотки и различные концентрации кроличьей сыворотки проганялись на четырех 4-20% ДСН-ПААГ гелях. Три геля переносили на ПВДФ мембраны (Фигуры 10А-С), и один гель окрашивали быстрорастворимым голубым (Фигура 10D). Одну мембрану подвергали реакции только с античеловеческим IgG, конъюгированным со щелочной фосфатазой (Фигура 10А). Оставшиеся мембраны подвергали реакции с пирогенным IGIV-C или с непирогенным IGIV-C, и затем с иммуноконъюгатом античеловеческого IgG со щелочной фосфатазой (Фигуры 10 В-С). Линия 1: MW маркеры; Линия 2: Фетальная бычья сыворотка; Линия 3: Кроличья сыворотка; Линия 4: Кроличья сыворотка, разбавленная 1:5; Линия 5: Кроличья сыворотка, разбавленная 1:10; Линия 6: Кроличья сыворотка, разбавленная 1:50.

Вестерн-блоттинг был отрицательным, когда мембрану исследовали только с античеловеческим IgG. Фигура 10А. Однако, когда пирогенный IGIV-C использовали, как первичный АЬ, он специфически реагировал с неразбавленной кроличьей сывороткой и разбавленной кроличьей сывороткой 1:5 и 1:10. Смотри линии 3-5 на Фигуре 10 В. Разбавление 1:50 кроличьей сыворотки не были реактивными (Линия 6). Только неразбавленная кроличья сыворотка была детектирована, когда использовали непирогенный IGIV-C, как первичное антитело. Линия 4 на Фигуре ЮС.Гель, окрашенный быстрорастворимым голубым, показал относительные количества фетальной бычьей сыворотки и кроличьей сыворотки, которые были загружены на гели. Линии 2-3 на Фигуре 10D. В основном, данные результаты демонстрируют, что пирогенный IGIV-C содержит в ~10-раз больше антитела на кроличью сыворотку, чем непирогенный IGIV-C.

Пример 7

Флуоресцентная микроскопия и агглютинация белых кровяных клеток крысы

Белые кровяные клетки крысы выделяли из цельной крови, применяя центрифугирование в градиенте плотности, используя Histopaque®. Белые кровяные клетки крысы подвергали реакции с плазмой Донора X, как описано для примера 2 выше. Плазма Донора X вызывала четко выраженную агглютинацию и флуоресценцию с белыми кровяными клетками крысы. Смотри фигуру 11.

Пример 8

Заключение о результатах

Результаты экспериментов микроскопии (Фигуры 1-6) и проточной цитометрии (Фигуры 7-8) продемонстрировали, что Донор X IgG легко связывается с белыми кровяными клетками кролика. Связывание антител было продемонстрировано с помощью, как агглютинации, так и интенсивности флуоресценции. Хотя, плазма контроля вызывала некоторую флуоресценцию с белыми кровяными клетками кролика, степень флуоресценции была значительно меньшей, чем та, что наблюдалась с Донором X. Плазма контроля не вызывала агглютинацию белых кровяных клеток кролика в каком-либо из экспериментов, в то время как плазма Донора X соответственно вызывала агглютинацию. Плазма Донора X (IgG) не вызывала агглютинацию с белыми кровяными клетками человека в каком-либо из экспериментов, демонстрируя, что Донор X IgG не связывается с белыми кровяными клетками человека.

Связывание Донора X IgG с белыми кровяными клетками кролика является, скорее всего, инициирующим фактором для активации белых кровяных клеток кролика и высвобождает эндогенные (лейкоцитарные) пирогены, которые вызывали наблюдаемую температурную реакцию.

Анализы на пирогенность на кролике проводились на ближайших родственниках Донора X (то есть, родителях, родных братьях и сестрах, и детях) были однородно отрицательными. Таблица 7. Данные результаты продемонстрировали, что уникальные свойства Донора X IgG, с точки зрения температурной реакции кролика, не были преобладающими на основании аллеля, но до некоторой степени антитело-специфичными к Донору X.

Эксперименты с красными кровяными клетками кролика продемонстрировали, что как Донор X, так и плазма контроля содержали антитела с широкой перекрестной реактивностью к антигену на красные кровяные клетки кролика. Донор X и плазма контроля вызывали очень сходные реакции с красными кровяными клетками кролика, предполагая, что процесс, опосредованный красными кровяными клетками не являются ответственными за пирогенный ответ у кроликов.

Эксперименты вестерн-блоттинг показали, что такой пирогенный IGIV-C (содержащий изоляты плазмы Донора X) сильно реагирует с сыворотками кролика, в то время как непирогенный IGIV-C нет. Это демонстрирует, что присутствие атипичного IgGs от Донора X в пирогенном IGIV-C, были ответственными за вызывание пирогенного ответа в исследовании на пирогенность согласно USP. Кроме того, эксперименты вестерн-блоттинга показали, что пирогенный IGIV-C содержит в ~10-раз больше антитела на кроличью сыворотку, чем непирогенный IGIV-C. Это демонстрирует вероятный стохастический эффект от атипичных антител Донора X, что вызывало пирогенные ответы.

Эксперименты с белыми кровяными клетками крысы показывают, что плазма Донора X является способным перекрестно реагировать и вызывать агглютинацию белых кровяных клеток крысы. Данные результаты предполагали, что непосредственное подвергание воздействию крыс или опосредованное подвергание воздействию через насекомых-переносчиков инфекции, которые обитают на грызунах (например, блох), может привести к "атипичному" IgG-иммуноглобулиновому иммунитету с перекрестной реактивностью к клеткам, как крыс, так и кроликов.

Пример 9

Анализы с высокой производительностью

Эксперименты с высокой производительностью ИСФА, флуоресценция или вестерн-блоттинг следует выполнять, используя инкубирование исследуемых образцов в 96-лунковых, 192-лунковых или 384-лунковых планшетах или мембранах, промывание, блокирование и исследование образцов, используя фермент - или флуорофор-иммуноконъюгаты и, затем анализируя результаты с помощью флуорометрии, люминометрии, денситометрии, калориметрии или УФ/видимой спектрометрии поглощения, наряду с другими способами детектирования. Такие анализы с высокой производительностью позволяют постоянный анализ образцов крови, или плазмы, или продуктов перед, во время и посля обработки и может исключать реактивные образцы, такие как те, которые содержат атипичные иммуноглобулины, которые могут вызывать ложноположительные результаты пирогенности в анализах.

Claims

1. Способ определения атипичных реактивных антител, которые приводят к ложноположительному результату исследований на пирогенность на кроликах, в производственном процессе получения продуктов крови, включающий:

(a) получение образца крови или плазмы;

(b) исследование образца и контроля с помощью одного или нескольких методов, выбранных из клеточной агглютинации, флуоресцентной микроскопии, иммунопреципитации, иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, ИФА, проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток и вестерн-блоттинга, для определения, содержит ли образец атипичные реактивные антитела, которые обладают перекрестной реактивностью с антигенами белых кровяных клеток кролика;

(c) сравнение результатов исследований образца и контроля;

(d) определение, какой образец содержит реактивные атипичные антитела; и

(e) изъятие единицы крови или плазмы, которая была источником образца, если образец содержит реактивные атипичные антитела.

2. Способ по п. 1, где на этапе (b) для исследования образца и контроля используют клеточную агглютинацию.

3. Способ по п. 1, где на этапе (b) для исследования образца и контроля используют проточную цитометрию.

4. Способ по п. 1, где на этапе (b) для исследования образца и контроля используют вестерн-блоттинг.

5. Способ выявления результатов потенциального ложноположительного исследования на пирогенность на кроликах в производственном процессе получения продуктов крови, где способ включает:

(a) получение образца крови или продукта крови;

(b) исследование образца и контроля с помощью одного или нескольких методов, выбранных из клеточной агглютинации, флуоресцентной микроскопии, иммунопреципитации, иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, ИФА, проточной цитометрии, сортировки флуоресцентно-активированных клеток и вестерн-блоттинга для определения, содержит ли образец атипичные реактивные антитела, которые обладают перекрестной реактивностью с антигенами белых кровяных клеток кролика;

(c) исследование образца и контроля, используя анализ лизата амебоцитов Limulus (LAL);

(d) сравнение результатов исследований образца и контроля в обоих анализах;

(e) оценку какого-либо из образцов, который дал ложноположительный результат в исследовании на пирогенность; и

(f) изъятие единицы крови или продукта крови, который был источником образца, содержащего реактивные атипичные антитела, которые приводят к ложноположительному результату исследований на пирогенность на кроликах.