BR112014007802B1

BR112014007802B1 - método para identificar anticorpos reativos atípicos

Info

Publication number: BR112014007802B1
Application number: BR112014007802-5A
Authority: BR
Inventors: Clark Zervos; JoAnn Hotta
Original assignee: Grifols, S.A.
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2020-10-20
Also published as: US20150132773A1; WO2013093671A1; MY185197A; CN103814296A; EP2739976B1; IL231053A; MX348498B; RU2014106616A; ZA201401235B; CN103814296B; BR112014007802A2; AU2012327185A1; ES2586422T3; SG2014014443A; JP6043807B2; PL2739976T3; NZ621582A; CA2845674C; AU2012327185B2; UY34471A

Abstract

MÉTODO PARA IDENTIFICAR ANTICORPOS REATIVOS ATÍPICOS, E, MÉTODO PARA AVALIAR OS RESULTADOS DE TESTE PIROGÊNICO POSITIVO FALSO POTENCIAL. Está descrito aqui um método para identificar anticorpos atípicos em processos de fabricação de sangue ou de produtos sanguíneos que pode produzir falsos positivos em testes de controle de qualidade em produtos intermediários ou finais.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] São descritos aqui métodos para identificar anticorpos atípicos em produtos sanguíneos e no sangue.

FUNDAMENTOS

[0002] Anticorpos humanos naturais foram identificados como causando respostas pirogênicas durante testes pirogênicos de USP. Alguns doadores humanos naturalmente produzem estes “anticorpos atípicos,” as vezes resultando da exposição a coelhos, roedores, ou insetos parasíticos predando sobre tais animais hospedeiros (isto é, pulgas). Os anticorpos atípicos são anômalos e incomuns, mas não são perigosos aos humanos. Anticorpos atípicos podem reagir de maneira cruzada com coelhos enquanto anticorpos de célula sanguínea e causar uma resposta pirogênica durante testes pirogênicos de coelho. A resposta pirogênica é, no entanto, um resultado "positivo falso" já que outros métodos, tais como os ensaios de lisado de amebócito de limulus (LAL), mostraram que amostras de plasma suspeitas que originam respostas pirogênicas no ensaio do coelho não contêm endotoxinas. Em adição, os resultados dos testes pirogênicos in vitro (também conhecidos como testes de ativação de monócito) indicam a ausência de pirogênicos diferentes de endotoxina. De maneira apropriada, anticorpos atípicos no sangue humano ou no plasma causam resultados de teste pirogênico de coelho errôneos e podem resultar na disposição de plasma ou sangue agrupado ou individual que testa positivo de maneira falsa como “pirogênico.”

[0003] Os métodos descritos aqui permitem a identificação de amostras de sangue ou de plasma contendo anticorpos atípicos que resultam em positivos falsos em ensaios pirogênicos. Este método é vantajoso pois amostras que contêm anticorpos atípicos podem ser eliminadas antes do agrupamento com outro sangue ou plasma e contaminando o agrupamento. De maneira apropriada, o método reduz o custo de fabricação evitando a contaminação desnecessária de agrupamentos de sangue ou de plasma com amostras que parecem “pirogênicas” devido à presença de anticorpos atípicos. Métodos de teste de alta capacidade descritos aqui permitem a identificação de amostras falsamente positivas suspeitas. Tais amostras podem ser descartadas antes do agrupamento com outras amostras e evitam contaminar o agrupamento com anticorpos atípicos.

SUMÁRIO

[0004] São descritos aqui métodos para identificar anticorpos atípicos em produtos sanguíneos e no sangue.

[0005] Um aspecto descrito aqui é o método para identificar anticorpos reativos atípicos em um processo de fabricação de produtos sanguíneos, o método compreendendo: (a) obter uma amostra de sangue ou de plasma; (b) testar a amostra e um controle usando qualquer um ou mais de aglutinação celular, microscopia de fluorescência, imunoprecipitação, imunodifusão, imunofluorescência, ELISA, citometria de fluxo, FACS, ou Western blotting; (c) comparar os resultados do teste da amostra e do controle; (d) determinar se a amostra contém anticorpos atípicos reativos; e; (e) interditar uma unidade de sangue ou de plasma que foi a fonte da amostra se a amostra contém anticorpos atípicos reativos.

[0006] Outro aspecto descrito aqui é um método para identificar anticorpos reativos atípicos em um processo de fabricação de produtos sanguíneos, o método compreendendo: (a) obter uma amostra de sangue ou de plasma; (b) testar a amostra e um controle usando um ensaio de aglutinação celular; (c) comparar os resultados do teste da amostra e do controle; (d) determinar se a amostra contém anticorpos atípicos reativos; e; (e) interditar uma unidade de sangue ou de plasma que foi a fonte da amostra se a amostra contém anticorpos atípicos reativos.

[0007] Outro aspecto descrito aqui é um método para identificar anticorpos reativos atípicos em um processo de fabricação de produtos sanguíneos, o método compreendendo: (a) obter uma amostra de sangue ou de plasma; (b) testar a amostra e um controle usando citometria de fluxo; (c) comparar os resultados do teste da amostra e do controle; (d) determinar se a amostra contém anticorpos atípicos reativos; e; (e) interditar uma unidade de sangue ou de plasma que foi a fonte da amostra se a amostra contém anticorpos atípicos reativos.

[0008] Outro aspecto descrito aqui é um método para identificar anticorpos reativos atípicos em um processo de fabricação de produtos de plasma sanguíneo, o método compreendendo: (a) obter uma amostra de sangue ou de plasma; (b) testar a amostra e um controle usando Western blotting; (c) comparar os resultados do teste da amostra e do controle; (d) determinar se a amostra contém anticorpos atípicos reativos; e; (e) interditar uma unidade de sangue ou de plasma que foi a fonte da amostra se a amostra contém anticorpos atípicos reativos.

[0009] Outro aspecto descrito aqui é um método para avaliar os resultados de teste pirogênico positivo falso potencial em um processo de fabricação de produtos sanguíneos, o método compreendendo: (a) obter uma amostra de sangue ou do produto de sangue; (b) testar a amostra e um controle usando microscopia de fluorescência, imunoprecipitação, imunodifusão, imunofluorescência, ELISA, citometria de fluxo, FACS, ou Western blotting; (c) testar a amostra e um controle usando o ensaio de Lisado de Amebócito de Limulus (LAL) ou um ensaio similar; (d) comparar os resultados do teste da amostra e do controle em ambos os ensaios; (e) avaliar se a amostra originou um resultado de teste pirogênico positivo falso; e (f) interditar uma unidade de sangue ou de plasma que foi a fonte da amostra se a amostra contém anticorpos atípicos reativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00010] Figura 1: Microscopia de Ensaios de Aglutinação de WBC de Coelho. O doador X e o plasma de controle foram incubados com WBCs de coelho e então observados usando o microscópio. Fotomicrografías de luz (A, B) e de contraste de fase (C, D) do coelho enquanto células sanguíneas incubadas com o plasma do Doador X (A, C) ou plasma de controle (B, D). A aglutinação foi observada com o plasma do Doador X (A, C), mas não com o plasma de controle (B, D).

[00011] Figura 2: Microscopia de Ensaios de Aglutinação de WBC de Humanos. O doador X e o plasma de controle foram incubados com WBCs de humanos e então observados usando o microscópio. Fotomicrografías de luz (A, B) e de contraste de fase (C, D) de humanos enquanto células sanguíneas incubadas com o plasma do Doador X (A, C) ou um controle plasma (B, D). Nenhuma aglutinação foi observada com o plasma do Doador X (A, C) ou o plasma de controle (B, D).

[00012] Figura 3: Microscopia de Fluorescência e Contraste de Fase da Aglutinação de WBC de Coelho de Doador X. O doador X e o plasma de controle foram incubados com WBCs de coelho, reagidos com anti-IgG humano marcado com fluorosceína, e então observados usando microscopia de fluorescência ou de contraste de fase. O painel (A) mostra uma fotomicrografia de contraste de fase de WBCs de coelho incubados com o plasma do Doador X. O painel (B) mostra uma fotomicrografia florescente de WBCs de coelho incubados com o plasma do Doador X e então tratados com anti-IgG humano marcado com fluorosceína. Forte florescência foi observada nos aglomerados de célula aglutinada que indicam IgG humano a partir do plasma do Doador X foi responsável por aglutinação celular.

[00013] Figura 4: Microscopia de Fluorescência de Ensaios de Aglutinação de WBC de Coelho. O doador X e o plasma de controle foram incubados com WBCs de coelho e então reagidos com anti-IgG humano marcado com fluorosceína. O painel (A) mostra florescência positiva de WBCs de coelho. O painel (B) mostra os resultados com plasma de controle.

[00014] Figura 5: Microscopia de Fluorescência de Ensaios de Aglutinação de WBC de Coelho. O doador X e o plasma de controle foram incubados com WBCs de coelho, reagidos com anti-IgG humano marcado com fluorosceína, e então observados usando microscopia de fluorescência. O painel (A) mostra florescência positiva de WBCs de coelho incubados com anti-IgG humano marcado com fluorosceína e uma imagem de 40x de aproximação das células aglutinadas (painel de fundo). Estes resultados indicam que plasma do Doador X contém IgGs reativos com antígenos de superfície celular de WBC de coelho. O painel (B) mostra a fraca florescência observada com o plasma de controle e uma fotomicrografia de contraste de fase dos WBCs de coelho que não mostram aglutinação (painel de fundo).

[00015] Figura 6: Microscopia de Fluorescência de Ensaios de Aglutinação de WBC de Humanos. O doador X e o plasma de controle foram incubados com WBCs de humanos, reagidos com anti-IgG humano marcado com fluorosceína, e então observados usando microscopia de fluorescência. Nem (A, Doador X) e nem (B, plasma de controle) possuem forte florescência ou aglutinação (painéis de fundo) indicando que plasma do Doador X contém IgGs não reativos aos antígenos de superfície celular de WBC de humanos.

[00016] Figura 7: Histogramas de Citometria de Fluxo de Florescência. WBCs de Coelho foram incubados com o plasma de controle ou do Doador X, reagidos com anti-IgG humano marcado com fluorosceína, e então analisados por citometria de fluxo. Os histogramas mostram a florescência relativa observada. Os painéis A e B mostram dois experimentos separados. Plasma do Doador X originou o maior sinal com uma florescência relativa pelo menos três vezes aquela do plasma de controle. Ver as Tabelas 4 e 5 para os resultados quantitativos.

[00017] Figura 8: Histogramas de Citometria de Fluxo de Florescência. WBCs de Humanos foram incubados com o plasma de controle ou do Doador X, reagidos com anti-IgG humano marcado com fluorosceína, e então analisados por citometria de fluxo. Os histogramas mostram a florescência relativa observada. Os painéis A e B mostram dois experimentos separados. Plasma do Doador X não foi significativamente diferente do plasma de controle. Ver as Tabelas 6 e 7 para os resultados quantitativos.

[00018] Figura 9: Análise de Eletroforese e Western Blotting de Amostras de Isolados de Plasma de Doador X que contêm IV1G-C Pirogênico. Fileira 1: marcadores de MW; Fileira 2: IG1V-C Pirogênico (Doador X); Fileira 3: IGIV-C não Pirogênico; Fileira 4: Soro de Coelho; Fileira 5: Soro Fetal de Bovino; Fileira 6: Soro de Cavalo. (A) Gel manchado de Azul Instantâneo. (B) Controle de Western blot (sem anticorpo primário) sondado com imunoconjugado de fosfatase alcalina de anti-IgG humano (IgG-AP). (C) Western blot usando isolados Plasma do Doador X que contém IGIV-C Pirogênico como anticorpo primário e anti-IgG humano-AP. (D) Western blot usando IGIV-C não pirogênico como anticorpo primário e anti- IgG humano-AP.

[00019] Figura 10: Análise de Eletroforese e Western Blotting de Amostras de Isolados de Plasma de Doador X que contêm IVIG-C Pirogênico. Fileira 1: marcadores de MW; Fileira 2: Soro Fetal de Bovino; Fileira 3: Soro de Coelho; Fileira 4: Soro de Coelho, diluído em 1:5; Fileira 5: Soro de Coelho, diluído em 1:10; Fileira 6: Soro de Coelho, diluído em 1:50. (A) Controle de Western blot (sem anticorpo primário) sondado com imunoconjugado de fosfatase alcalina de anti-IgG humano (IgG-AP). (B) Western blot usando isolados Plasma do Doador X que contém IGIV-C Pirogênico como anticorpo primário e anti-IgG humano-AP. (C) Western blot usando IGIV-C não pirogênico como anticorpo primário e anti-IgG humano- AP. (D) Gel manchado de Azul Instantâneo.

[00020] Figura 11: Plasma do Doador X reage de maneira cruzada com WBCs de Camundongo: Microscopia de Fluorescência de Ensaios de Aglutinação de WBC de Camundongo. WBCs de Camundongo foram incubados com o plasma de controle ou do Doador X, reagidos com anti-IgG humano marcado com fluorosceína, e então observados usando microscopia de fluorescência. O painel (A) mostra florescência positiva e aglutinação de WBCs de Camundongo incubados com anti-IgG humano marcado com fluorosceína e uma imagem de 40x de aproximação das células aglutinadas (painel de fundo). Estes resultados indicam que plasma do Doador X contém IgGs reativos com antígenos de superfície celular de WBC de camundongo. O painel (B) mostra a fraca florescência observada com o plasma de controle e uma imagem de 40x de aproximação dos WBCs de Camundongo que não mostram aglutinação (painel de fundo).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00021] São descritos aqui métodos para identificar anticorpos atípicos em produtos sanguíneos e no sangue. Um indivíduo, referido aqui como “Doador X,” doou plasma que foi agrupado com outras unidades para a fabricação de produtos de proteína bioterapêuticos. Durante o processamento, o plasma agrupado foi ensaiado para a pirogenicidade usando o ensaio de pirogenicidade de USP de coelho. Inesperadamente, o plasma agrupado testou positivo como pirogênico no teste de USP de coelho. Ensaios adicionais buscaram o agente pirogênico para o plasma do Doador X. Ensaios de lisado de amebócito de limulus (LAL) mostraram que o Plasma do Doador X não foi contaminado com endotoxinas bacterianas. Em vez disso, os ensaios descritos aqui demonstraram que plasma do Doador X continha anticorpos atípicos que foram responsáveis pela resposta pirogênica. Especifícamente, exames de microscopia de florescência e de luz mostraram que o Plasma do Doador X aglutinou WBCs de Coelho e de Camundongo mas não WBCs de humanos. A reatividade cruzada do WBC de coelho foi específica do Doador X já que o plasma dos pais do Doador X, irmãos, e filhos não reagiu. Experimentos de citometria de fluxo florescente mostraram que o Plasma do Doador X continha anticorpos IgG reativos com antígenos de superfície celular de WBC de coelho e experimentos de Western blot confirmaram a reatividade dos IgGs com soros de coelho. Coletivamente, estes resultados sugerem que o Doador X pode ter sido exposto a roedores ou vetores de inseto de roedores que podem ter induzido imunidade humoral de reação cruzada com WBCs de coelho. Assim, plasma a partir de alguns indivíduos pode testar positivo em testes pirogênicos de USP de coelho, não pois eles estão contaminados com bactérias, mas pois eles contêm anticorpos atípicos que são reagidos de maneira cruzada com antígenos de WBC de coelho.

EXAMPLOS Exemplo 1 Ensaios Pirogênicos de Farmacopeia dos Estados Unidos da América (USP)

[00022] O § 151 da Farmacopeia dos Estados Unidos da América atual destaca o ensaio pirogênico. O teste envolve medir o crescimento na temperatura de coelhos seguindo a injeção intravenosa de uma solução de teste. Este ensaio é projetado para determinar se produtos podem ser tolerados pelo coelho de teste em uma dose para não exceder 10 mL por Kg injetados de maneira intravenosa dentro de um período de não mais do que 10 minutos. Inicialmente, três coelhos são injetados. Se qualquer coelho mostra um aumento na temperatura individual >0,5°C, o teste é continuado usando cinco coelhos adicionais. Se três ou mais dos oito coelhos mostram aumentos individuais na temperatura de >0,5°C e/ou a soma das oito elevações de temperatura individuais excede 3,3 °C o material sob exame é considerado como pirogênico.

[00023] Uma amostra de Plasma do Doador X ou uma amostra agrupada sem qualquer Plasma do Doador X foi diluída em 1:100 em 10 mL de solução de cloreto de sódio (0,9% de NaCl) e injetada nas veias da orelha de três coelhos adutos saudáveis. As temperaturas dos coelhos foram medidas de maneira retal dentro de 10 minutos depois da injeção. Os dados de temperatura são mostrados na Tabela 1. A amostra de plasma livre do Doador X não induziu um aumento de temperatura em qualquer um dos coelhos. Em contraste, quando Plasma do Doador X foi testado, aumentos de temperatura de entre 1,1 e 1,2 °C foram medidos. Já que o aumento de temperatura total para os 3 coelhos foi 3,4 °C, o Plasma do Doador X foi considerado pirogênico e não houve necessidade de estender o teste para outros 5 coelhos.

[00024] As imunoglobulinas em um Agrupamento contendo 0% ou 10% Plasma do Doador X foram capturadas usando uma coluna de proteína A e testadas para a pirogenicidade. A amostra de plasma livre do Doador X não induziu um aumento na temperatura mas as amostras contendo Plasma do Doador X foram altamente pirogênicas. Estes resultados indicam que a resposta pirogênica em coelhos pode estar relacionada a imunoglobulinas no Plasma do Doador X.

Exemplo 2

[00025] Uma série de experimentos foi realizada usando o Plasma do Doador X para entender melhor a natureza da sua pirogenicidade.

Experimentos de Microscopia e Aglutinação de Célula Sanguínea Branca

[00026] Experimentos de aglutinação foram realizados para avaliar as interações entre Plasma do Doador X e coelhos ou humanos enquanto células sanguíneas (WBC). WBCs foram coletados sangue total de humano e de coelhos por centrifugação de gradiente de densidade usando Histopaque® (Sigma-Aldrich) e suspensos em solução salina tamponada normal suplementada com BS A. Os WBCs de coelhos e de humanos então foram incubados com o doador X e o plasma de controle em uma microplaca de 96 poços. Seguindo a incubação e a lavagem, anti-IgG humano rotulado florescente foi adicionado, e microplacas foram incubadas, lavadas e examinadas de maneira microscópica. Cada poço foi examinado em busca de aglutinação usando microscopia de contraste de fase e de luz visível, e então observados usando microscopia de fluorescência (resultados discutidos na seção subsequente).

[00027] Aglutinação significativa foi observada em poços de teste contendo Plasma do Doador X e WBCs de coelho (Figuras IA e 1C) mas não em poços de teste contendo Plasma do Doador X e WBCs de humanos (Figuras 2A e 2C). Nenhuma aglutinação foi observada em poços contendo plasma de controle e WBCs de coelho (Figuras IB e 1D) ou plasma de controle e WBCs de humanos (Figuras 2B e 2D). Estes resultados foram reproduzidos em vários ensaios e indicam que o IgG do Doador X se liga a WBCs de coelho, mas não a WBCs de humanos. Ver a Figura 2.

[00028] Durante vários dos experimentos de aglutinação, citotoxicidade foi observada em amostras contendo WBCs de coelho e Plasma do Doador X mas não em poços contendo plasma de controle e WBCs de coelho, nem quaisquer poços contendo WBCs de humanos com o plasma de controle ou do Doador X. A observação de que o Plasma do Doador X é tóxico a WBCs de coelho sugeriu ligação específica de imunoglobulinas do Doador X a estas células. Ver as Figuras 1 a 3.

Experimentos de Microscopia Florescente

[00029] Experimentos de microscopia florescente foram realizados em paralelo com os estudos de microscopia de luz e de aglutinação descritos acima e os resultados são apresentados na Tabela 2. WBCs de Coelho foram fortemente florescentes em amostras incubadas com o plasma do Doador X (Figuras 4A e 5A), se comparados a um grau relativamente fraco de florescência para as amostras incubadas com plasma de controle (Figura 4B) ou com apenas anti-IgG humano rotulado florescente. Ver as Figuras 4 e 5, Estas descobertas indicam que a florescência observada para WBCs de coelho foi específica para o IgG presente no Doador X. Um fraco grau de florescência foi observado para WBCs de humanos incubados tanto com o doador X quanto com o plasma de controle (Figura 6) ou com apenas o anti- IgG humano rotulado florescente (no Doador X ou plasma de controle adicionado). Figura 6B. Estas descobertas indicam que a florescência observada com WBCs de humanos representou ligação não específica, independente da presença de Doador X ou IgG de controle.

Exemplo 3 Experimentos de Citometria de fluxo

[00030] De maneira a quantificar a ligação de anticorpos e a florescência observada por microscopia, estudos de citometria de fluxo foram realizados. Nestes experimentos, WBCs de coelhos e de humanos foram incubados com o doador X e o plasma de controle e lavados antes de adicionar e de incubar com anti-IgG humano rotulado florescente. As amostras de célula foram lavadas, ressuspensas em solução salina tamponada normal até uma concentração que varia a partir de aproximadamente 3 x 10 a 5 x 10b células/mL e analisadas por citometria de fluxo.

[00031] A Figura 7 contém sobreposições de histograma que mostram intensidade florescente relativa de duas diferentes amostras de WBC de coelho incubados com o plasma de controle ou do Doador X. Duas amostras adicionais foram incubadas como controles de ensaio, WBCs de coelho não manchados (controle de célula) e WBCs de coelho tratados com anti-IgG humano marcado florescente apenas. A florescência mediana da amostra de WBC de coelho incubada com o plasma do Doador X foi 3264 no experimento 1 e 922 no experimento 2 e, significativamente maior do que aquela observada após incubar WBCs de coelho com plasma de controle (florescência mediana de 499 e 175 para os experimentos 1 e 2, respectivamente). Ver as Tabelas 3 e 4. Assim, mesmo que existisse alguma sobreposição entre os WBCs de coelho incubados com o doador X e o plasma de controle, existiu uma diferença distinta na intensidade de florescência. Estes resultados se correlacionam bem com os resultados de estudo microscópico, discutidos acima, onde WBCs reagidos com o plasma do Doador X e produziram florescência significativamente mais forte do que aqueles incubados com plasma de controle.

[00032] Os experimentos de citometria de fluxo foram repetidos com WBCs de humanos e os resultados são mostrados na Figura 8 e nas Tabelas 5 e 6. WBCs de Humanos incubados com o plasma do Doador X e plasma de controle tiveram histogramas similares, não indicando diferença significativa na intensidade de florescência. Estes resultados se correlacionaram com resultado de estudo microscópico, discutidos anteriormente, nos quais os WBCs de humanos tratados com o doador X e o plasma de controle produziram um grau de florescência similar. A amostra de WBC de humanos marcada com apenas anti-IgG humano marcado de fluorocromo também mostrou sobreposição significativa com as amostras do doador X e do plasma de controle, e assim indicou um grau significativo de ligação não específica pelo anticorpo secundário.

[00033] Em sumário, as análises de citometria de fluxo mostraram ligação significativa de imunoglobulinas do Doador X (isto é, IgGs) com WBCs de coelho se comparadas ao plasma de controle e ligação mínima com WBCs de humanos.

Exemplo 4 Testes Pirogênicos de Coelho Suplementares

[00034] De maneira a avaliar uma associação genética possível para imunoglobulinas do Doador X e seu efeito na pirogenicidade do coelho, ensaios pirogênicos de USP foram realizados em soros doados do Doador X. Uma amostra de soro de Doador X também foi testada como um controle. Já que estudos anteriores demonstraram que o Plasma do Doador X produziu uma resposta pirogênica significativa em diluições de 1:100, todas as amostras de teste foram diluídas em 1:100 em solução salina normal estéril (0,9% de NaCl, USP, para a injeção) antes dos testes pirogênicos de coelho. Uma alíquota de cada amostra também foi usada em um ensaio de LAL para examinar contaminação de endotoxina como uma fonte de resposta pirogênica. Resultados pirogênicos e de LAL são apresentados na Tabela 7.

[00035] O soro a partir do Doador X produziu um aumento de temperatura significativo em dois dos três coelhos de teste, com um aumento de temperatura total de 1,9 °C. Esta resposta foi consistente com testes anteriores com o plasma do Doador X. Soro a partir dos parentes do Doador X, incluindo pais, irmãos, e crianças não produziu aumentos de temperatura significativos. Resultados de ensaio de Lisado de Amebócito de Limulus (LAL) para todas as amostras foram negativos, indicando que endotoxina exógena não contribuiu para as respostas pirogênicas do coelho.

Exemplo 5 Estudos de Aglutinação de Célula Sanguínea Vermelha

[00036] O plasma do Doador X foi testado com células sanguíneas vermelhas de coelho em uma série de experimentos de aglutinação para determinar se o Plasma do Doador X contém imunoglobulinas específicas para antígenos em RBCs de coelho. Incompatibilidade entre imunoglobulinas do Plasma do Doador X e RBCs de coelho potencialmente podem causar hemólise e pirogenicidade. Para estes estudos, o doador X e o plasma de controle foram titulados contra uma suspensão de RJBCs do coelho. A suspensão foi observada em três pontos de tempo: (1) imediatamente; (2) após uma incubação de 30 minutos em 37 °C; e (3) após soro de anti globulina humana ser adicionado.

[00037] Tanto o doador X quanto o plasma de controle produziram forte aglutinação de RBCs do coelho em todos os pontos de tempo, e um título equivalente foi observado para o Doador X e o controle positivo. A hemólise foi observada em baixas diluições tanto de Doador X quanto do controle positivo.

[00038] A presença de imunoglobulinas anti A, e/ou anti B presentes no doador X e o plasma de controle potencialmente pode reagir de maneira cruzada com antígenos de RBC de coelho com epítopos similares para antígenos de A e B de humanos. De maneira apropriada, o doador X e o plasma de controle foram pré-absorvidos com RBCs de A e/ou B de humanos para remover a reação cruzada anticorpos anti A e anti B. O plasma pré- absorvido foi então testado contra RBCs de coelho como foi descrito acima. Tanto o doador X quanto o plasma de controle produziram forte aglutinação, similares aos resultados iniciais. Nenhuma diferença na reatividade foi observada entre o Doador X e o plasma de controle. Estes resultados mostraram a presença de anticorpos no Plasma do Doador X com bastante reação cruzada com antígenos/epitopos em RBCs de coelho. Em adição, estes resultados sugerem que um processo mediado por RBC não é responsável pela resposta pirogênica em coelhos.

[00039] O plasma do Doador X também foi testado para anticorpos para antígenos de RBC de humanos usando um painel de identificação de anticorpos de RBC. Resultados negativos foram obtidos com todas as células de painel, confirmando que o Plasma do Doador X não contém aloanticorpos clinicamente significativos.

[00040] Fenotipagem de antígeno também foi realizada em RBCs de Doador X, digitação incluída para os antígenos de RBC que pertencem a sistemas de grupo sanguíneo de Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, MNS, P, e Luterano. RBCs de Doador X foram de um fenótipo de RBC comum, e não existiram resultados incomuns.

Exemplo 6

[00041] Produtos de plasma a jusante contendo Plasma do Doador X foram testados para identificar o fator responsável para a geração de resposta pirogênica. Intravenosa de Imunoglobulina Globulina de humanos contendo 10% caprilato/purificado por cromatografía (por exemplo, IGIV-C 10%, isto é, Gamunex®, Grifols Therapeutics Inc., formalmente Talecris Biotherapeutics, Inc.) que foi produzido a partir de agrupamentos de plasma contendo Plasma do Doador X foi ensaiado usando Western blotting.

Western Blotting

[00042] Amostras de IGIV-C “pirogênico” produzidas a partir de agrupamentos de plasma que contêm Doador X, IGIV-C não pirogênico produzido a partir de agrupamentos de plasma livres de Doador X, soro de coelho, soro fetal de bovino, e soro de cavalo foram corridos em quatro géis SDS-PAGE redutor de 4 a 20%. Um gel foi marcado com Azul instantâneo (Figura 9A) enquanto os outros três foram transferidos para membranas de PVDF (Figuras 9B-D). Uma membrana foi reagida com apenas anti-IgG humano conjugado com fosfatase alcalina (Figura 9B). As membranas remanescentes foram reagidas com IGIV-C pirogênico ou com IGIV-C não pirogênico, e então com o conjugado de fosfatase alcalina de anti-IgG humano (Figuras 9C-D). Fileira 1: marcadores de MW; Fileira 2: IGIV-C Pirogênico (Doador X); Fileira 3: IGIV-C não Pirogênico; Fileira 4: Soro de Coelho; Fileira 5: Soro Fetal de Bovino; Fileira 6: Soro de Cavalo.

[00043] O gel marcado de azul instantâneo mostrou que quantidades comparáveis do soro de coelho, soro fetal de bovino e soro de cavalo foram carregados em gel. As fileiras 4 a 6 na Figura 9A. A membrana marcada com apenas anti-IgG humano mostraram que o anticorpo secundário (anti-IgG humano) foi específico e reagido apenas com IgG humano (IGIV-C pirogênico e não pirogênico). As fileiras 2 e 3 na Figura 9B. A membrana reagida com IGIV-C pirogênico e o conjugado de fosfatase alcalina de anti- IgG humano mostraram que IGIV-C pirogênico reagido fortemente com soro de coelho e fracamente com soro fetal de bovino e de cavalo. As fileiras 4 a 6 na Figura 9C. A membrana reagida com IGIV-C não pirogênico e o conjugado de fosfatase alcalina de anti-IgG humano mostraram que IGIV-C não pirogênico reagidos fracamente com os três soros de teste, incluindo soro de coelho. As fileiras 4 a 6 na Figura 9D. Coletivamente, estes resultados indicam que IGIV-C pirogênico reage fortemente com soros de coelho, enquanto IGIV-C não pirogênico não.

[00044] Amostras de soro fetal de bovino e várias concentrações do soro de coelho foram corridas em quatro géis de SDS-PAGE de 4 a 20%. Três géis foram transferidos para membranas de PVDF (Figuras 10A-C), e um gel foi marcado com Azul Instantâneo (Figura 10D). Uma membrana foi reagida com apenas anti-IgG humano conjugado com fosfatase alcalina (Figura 10A). As membranas remanescentes foram reagidas com IGIV-C pirogênico ou com IGIV-C não pirogênico, e então com o imunoconjugado de fosfatase alcalina e anti-IgG humano (Figuras 10B-C). Fileira 1: marcadores de MW; Fileira 2: Soro Fetal de Bovino; Fileira 3: Soro de Coelho; Fileira 4: Soro de Coelho, diluído em 1:5; Fileira 5: Soro de Coelho, diluído em 1:10; Fileira 6: Soro de Coelho, diluído em 1:50.

[00045] O Western blot foi negativo quando a membrana foi sondado com apenas anti-IgG humano. Figura 10A. No entanto, quando IGIV-C pirogênico foi usado como o Ab primário, ele reage especificamente com soro de coelho não diluído e soro de coelho diluído em 1:5 e 1:10. Ver as fileiras 3 a 5 na Figura 10B. A diluição de 1:50 do soro de coelho não foi reativo (Fileira 6). Apenas soro de coelho não diluído foi detectado quando IGIV-C não pirogênico foi usado como o anticorpo primário. A fileira 4 na Figura 10C. O gel marcado com Azul Instantâneo mostrou as quantidades relativas de soro fetal de bovino e de soro de coelho que foram carregados nos géis. As fileiras 2 a 3 na Figura ÍOD. Em geral, estes resultados indicam que IGIV-C pirogênico contém aproximadamente 10 vezes mais anticorpos contra soro de coelho do que IGIV-C não pirogênico.

Exemplo 7 Aglutinação e Microscopia de Florescência de WBC de Camundongo

[00046] WBCs de Camundongo foram isolados a partir de sangue total por centrifugação de gradiente de densidade usando Histopaque®. WBCs de Camundongo foram reagidos com o plasma do Doador X como descrito para o Exemplo 2 acima. Plasma do Doador X produziu florescência e aglutinação distintas com WBCs de Camundongo. Ver a Figura 11.

Exemplo 8 Sumário dos Resultados

[00047] Os resultados de experimentos de microscopia (Figuras 1-6) e de citometria de fluxo (Figuras 7-8) indicam que o IgG do Doador X prontamente ligado a WBCs de coelho. A ligação de anticorpos foi demonstrada tanto por aglutinação e intensidade florescente. Apesar de o plasma de controle produzir alguma florescência com WBCs de coelho, o grau de florescência foi signifícativamente menor do que aquele observado com o Doador X. O plasma de controle não causa a aglutinação de WBCs de coelho em qualquer um dos experimentos, enquanto o Plasma do Doador X produziu aglutinação de maneira consistente. O plasma do Doador X (IgG) não produziu aglutinação com WBCs de humanos em qualquer um dos experimentos, indicando que o IgG do Doador X não ligou com os WBCs de humanos.

[00048] A ligação de IgG do Doador X com WBCs de coelho é provavelmente um gatilho para a ativação de WBC de coelho e liberação de pirogênicos endógenos (leucócitos), que causam a resposta de febre observada.

[00049] Ensaios pirogênicos de coelho conduzidos na família imediata de Doador X (isto é, pais, irmãos, e crianças) foram uniformemente negativos. Tabela 7. Estes resultados indicam que as únicas propriedades de IgG de Doador X, com relação à resposta de temperatura do coelho, não foram baseados em alelo dominante, mas em vez de anticorpo específico ao Doador X.

[00050] Experimentos com RBCs de coelho demonstraram que tanto o doador X e o plasma de controle continham anticorpos com vasta reatividade cruzada com um antígeno em RBCs de coelho. O doador X e o plasma de controle produziram várias reações similares com RBCs de coelho, sugerindo que um processo mediado por RBC não é responsável pela resposta pirogênica em coelhos.

[00051] Experimentos de Western Blotting mostraram que aquele IGIV-C pirogênico (contendo isolados de Plasma do Doador X) reage fortemente com soros de coelho, enquanto IGIV-C não pirogênico não reage. Isto indica que a presença de IgGs atípicos a partir do Doador X no IGIV-C pirogênico, foram responsáveis para induzir uma resposta pirogênica no teste pirogênico de USP. Em adição, os experimentos de Western Blotting mostraram que IGIV-C pirogênico contém aproximadamente 10 vezes mais anticorpos contra soro de coelho do que IGIV-C não pirogênico. Isto indicou um efeito estocástico provável a partir dos anticorpos atípicos do Doador X que causaram respostas pirogênicas.

[00052] Experimentos com camundongos enquanto células sanguíneas mostram que o Plasma do Doador X é capaz de reagir de maneira cruzada com e causando a aglutinação de WBCs de Camundongo. Estes resultados sugerem que a exposição direta a camundongos ou exposição indireta por vetores de inseto de roedores (por exemplo, pulgas), podem levar a imunidade de imunoglobulina de IgG “atípica” com reatividade cruzada tanto para células de camundongos e de coelho.

Exemplo 9 Ensaios de alta capacidade

[00053] Experimentos de ELISA de alta capacidade, florescência, ou de Western blot devem ser realizados através da incubação de amostras de teste em membranas ou placas de 96 poços, de 192 poços, ou de 384 poços, lavagem, bloqueio, e sondando a amostras usando imunoconjugados de enzima ou fluoróforo e então analisando os resultados através de fluorometria, luminometria, densitometria, calorimetria, ou absorvância de UV/visível, dentre outros métodos de detecção. Tais ensaios de alta capacidade permitem a análise em linha de amostras de sangue ou de plasma ou produtos antes, durante, e após o processamento e podem eliminar amostras reativas, tais como aqueles contendo imunoglobulinas atípicas, que podem produzir resultados pirogênicos positivos falsos em ensaios.

Claims

1. Método para identificar anticorpos reativos atípicos em um processo de fabricação de produtos sanguíneos, em que os anticorpos reativos atípicos resultam em falso positivo no teste pirogênico de coelho, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) obter uma amostra de sangue ou de plasma; (b) testar a amostra e um controle usando qualquer um ou mais de aglutinação celular, microscopia de fluorescência, imunoprecipitação, imunodifusão, imunofluorescência, ELISA, citometria de fluxo, FACS, ou Western blotting para determinar se a amostra contém anticorpos atípicos que são reagidos de maneira cruzada com antígenos de células brancas de coelho; (c) comparar os resultados do teste da amostra e do controle; (d) determinar se a amostra contém anticorpos reativos atípicos; e; (e) interditar uma unidade de sangue ou de plasma que foi a fonte da amostra se a amostra contém anticorpos atípicos reativos; e em que os anticorpos reativos atípicos são reagidos de maneira cruzada com antígenos de células brancas de coelho e causam uma resposta pirogênica durante o teste pirogênico de coelho.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (b) a amostra e um controle são testados usando um ensaio de aglutinação celular.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (b) a amostra e um controle são testados usando citometria de fluxo.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que na etapa (b) a amostra e um controle são testados usando Western blotting.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda testar a amostra e um controle usando o ensaio de Lisado de Amebócito de Limulus (LAL).