KR101352222B1 - 의료용 제품에서 비-내독소 발열성 오염물을 보다 잘검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험 - Google Patents

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Abstract

폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함하는 검정 시스템에서 샘플을 단핵구-함유 반응물과 함께 인큐베이션시키는 것인, 의료용 제품에서 비-내독소 발열 물질을 보다 잘 검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험에 대하여 기술한다. 본 발명은 또한, 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 내부 표면을 갖고, 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 웰에서 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상을 갖는 1개 이상의 미량역가 웰을 포함하는, 본 시험에서 사용하기 위한 검정 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 샘플내 비-내독소 발열 물질의 존재에 관한 시험에 사용될 수 있는 진단용 키트에 관한 것이다.
비-내독소, 발열 물질, 단핵구, 의료용 제품, 검출 방법

Description

의료용 제품에서 비-내독소 발열성 오염물을 보다 잘 검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험{IMPROVED MONOCYTE ACTIVATION TEST BETTER ABLE TO DETECT NON-ENDOTOXIN PYROGENIC CONTAMINANTS IN MEDICAL PRODUCTS}
본 발명은 일반적으로, 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함하는 검정 시스템에서 샘플을 단핵구-함유 반응물과 함께 인큐베이션시키는 것인, 의료용 제품에서 비-내독소 발열 물질을 보다 잘 검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 갖고, 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 웰에서 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상을 갖는 1개 이상의 미량역가 웰을 포함하는, 본 시험에서 사용하기 위한 검정 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 샘플내 비-내독소 발열 물질의 존재에 관한 시험에 사용될 수 있는 진단용 키트에 관한 것이다.
특정의 화학적 화합물 또는 생물학적 화합물이 인간 또는 다른 포유동물의 순환계와 접촉하게 되는 경우, 이는 염증 반응 또는 염증으로 알려져 있는 전신 반 응을 일으킨다. 염증 반응은 감염 및/또는 손상으로부터 신체를 보호하는 방어 기전이며; 염증은 감염 또는 손상 부위로 혈류량을 증가시킴으로써 치유 과정에 도움이 되는 필요한 체액, 단백질, 및 백혈구(white blood cell)(백혈구(leukocytes))를 가져온다. 예를 들면, 염증 반응과 관련된 한가지 증상은 체온 증가 또는 열이며, 이는 과열을 유발하는 병원체에 대한 방어 기전으로서의 작용을 한다. 염증 반응은 열, 오한, 피로감, 두통, 식욕 감퇴, 및 근육 경직을 비롯한, 각종 "독감-유사" 증상과 관련될 수 있다. 열을 일으키는 화학적 화합물 또는 생물학적 화합물은 상기 화합물이 유발할 수 있는 열 반응을 지칭하면서, 역사적으로 "발열 물질" 또는 "발열성" 화합물로서 언급되어 왔다. 그러한, 몇몇 화학적 화합물 또는 생물학적 화합물은 일반적으로 전염증성이고, 그들이 유발하는 염증 반응의 일부로서 열을 유발할 수 있거나, 유발하지 않을 수 있다.
일부 경우, 개개의 감수성, 및 개개에 노출되는 발열 물질의 유형 및 농도에 따라 개개는 발열 물질에 노출된 이후 생명을 위협하는 쇼크-유사 증상을 발생시킬 수 있다. 흡입될 수 있거나, 주사될 수 있거나, 또는 주입될 수 있는 의료용 제품, 및 의료용 장치, 예로서, 막 또는 이식용 물질이 특정의 발열성 위험을 내포하고 있다. 의료용 제품 및 영양제에 함유되어 있는 발열 물질을 외인성 발열 물질로 지칭하고; 반대로, 내인성 발열 물질은 외인성 발열 물질에 대한 개개의 염증 반응을 매개하는 면역계의 메신저 화합물이다. 제품 그 자체 또는 제품 생산의 부산물의 발열 성질 이외에도, 제품의 오염이 종종 발열성을 유발할 수 있다. 제품 오염에 기인한 발열성은 세균, 바이러스, 진균으로부터 유래된 발열 물질이나, 심 지어는 숙주로부터 유래된 발열 물질과 같은 다양한 발열 물질 군들중 어느 하나에 의해 유발될 수 있다. 이러한 문제는 제품이 열 또는 화학적 방법에 의해 "멸균처리된" 경우에도 지속될 수 있다; 보편적으로 조우하게 되는 발열성 화합물인 세균 내독소 (대개 그램-음성 세균의 세포벽으로부터 유래된 지질다당류(LPS)로 구성됨)는 세균이 사멸된 이후에도 남아있을 수 있다. 따라서, 그러한 제품의 안전성을 확실하게 하기 위해서는 다양한 약제, 영양제, 및 비경구적으로 적용되는 의료용 제품의 발열 물질에 관해 시험하여야 한다.
보통, 발열 물질로서 작용하는 화합물은 조직, 세포, 또는 체액과 접촉한 후 단핵구에서 프로스타글란딘 및 전염증성 사이토카인과 같은 내인성 발열 물질의 생산을 자극시킴으로써 발열 물질로서 작용한다. 이것이 병에 걸린 유기체에서 염증 반응을 매개하는, 내인성으로 생산되는 발열 물질이다. 이들 내인성 발열 물질중 가장 중요하고, 잘 알려져 있는 것은 사이토카인 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8) 및 종양 괴사 인자(TNF) 및 저분자량 지질 매개 인자 프로스타글란딘 E2(PGE2)이다. 이들 화합물은 통상 ELISA, 또는 효소-결합 면역흡착 검정법(IL-1, IL-6, 또는 TNF에 대해), 및 EIA, 또는 효소 면역 검정법 (PGE2에 대해)에 의해 검정된다.
비경구적으로 투여되는 임의의 약물 또는 약제학적 제품의 발열 반응을 방지하고, 그의 안전성을 확보하기 위해 발열성 오염을 모니터하여 세균 오염물로 오염된 개개 로트(lots)를 확인하여야 한다. 대량-생산되는 약제학적 제품에서 발열 물질 오염을 모니터하기 위해 세균 내독소 시험(BET)으로도 지칭되는, 리물루스 암베오사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate)(LAL) 시험과 토끼 발열 물질 시험, 상기 2개의 동물-기초 약전 방법이 현재 통상적으로 사용된다.
토끼 시험은 통계학적으로 유의적인 마릿수의 토끼에 샘플 화합물을 주사하고, 시험 동물에서 유도된, 평균 체온 상승에 관해 관찰하는 것으로 구성된 생체내 시험이다. 토끼 시험은 비-내독소 발열 물질을 비롯한 광범위한 발열 물질에 대하여 반응을 나타내지만, 토끼 시험은 다른 발열 물질 시험 (LAL 시험의 경우 (pg 내독소/ml)에 비하여 상대적으로 감수성이 낮다 (ng 내독소/ml). 추가로, 종간의 화합물에 대한 발열 반응의 상관관계는 잘 해야 유사할 뿐이다. 예를 들면, 발열 반응을 유도하는 세균 내독소의 용량은 종간에 10,000배 만큼이나 차이가 날 수 있다고 상세히 보도된 바 있다. 상대적인 비감수성, 열등한 정량적 결과, 토끼 종간의 변이성, 및 동물 시험에 관여하는 윤리적 문제로 인하여 최근에는 토끼 시험이 냉대시 되었다.
광범위한 발열 물질을 검출하는 토끼 시험과는 대조적으로, LAL 시험은 오직 내독소 발열 물질만을 검출한다. 그램-음성 세균의 세포벽으로부터 유래된 지질다당류(LPS)와 같은 세균 내독소는 가장 잘 기재되어 있는 발열성 화합물들중 하나이다 (문헌 ([Moltz et al., Neurosci . Biobehav . Rev ., 1993, 17, 237-269]; [Tilders et al., Psychoneuroendocrinology. 1994, 19, 209- 232]; [Rothwell, Crit. Rev . Neurobiol 1994, 8, 1-10]; [Zeisberger and Roth, Neuropsychobiology, 1993, 28, 106-109])). 따라서, 일반적으로는 비용이 많이 들고, 시간이 많이 소비되는 토끼 실험을 세균 내독소에 대한 직접적인 LAL 시험으로 대체하는 것이 유용하다고 간주되었다. 이러한 접근법에는 뚜렷한 한계가 있다. LAL 시험은 매우 감수성인 시험관내 시험이지만; 오직 그램-음성 세균으로부터의 내독소만을 검출하고, 여전히 단핵구를 자극하여 발열성 사이토카인을 생성시킬 수 있는 특정 제품에 대하여 위 음성 결과를 나타낼 수 있다. 또한, LAL 시험은 예를 들면, 고단백질 수준의 시험 물질에 의한 또는 글루칸에 의한 간섭에 대하여 민감하다 (문헌 [Roslansky and Novitsky, J. Clin . Microbiol., 1991, 29, 2477]; [Fennrich et al., Dev . Biol . Stand. 1999, 101, 131])). 한편, 리물루스 시험은 감수성이 강하기 때문에 제품의 질과는 상관이 없는 불순물로 인하여 쉽게 위 양성 결과를 나타내는 경향이 있다 (문헌 [Fujiwara et al., Yakugaku Zasshi, 1990, 1 10, 332-340]).
따라서, 감수성이 높고, 특이성이 높으며, 광범위한 발열 물질을 검출할 수 있는 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 비-동물-기초 시험 시스템을 필요로 하였다. 이러한 의도로, 그리고, 인간 염증 반응에 관한 더 많은 이해를 통해 인간 단핵구의 시험관내 활성화에 기초한 시험 시스템이 개발되었다. 20년전 몇몇 연구자들은 발열성 사이토카인의 방출을 모니터하여 내독소를 검출하기 위해 말초 혈액 단핵 세포를 사용하였다 (문헌 ([Dinarello et al., J. Clin . Microbiol., 1984, 20, 323]; [Duff and Atkins, J. Immunol . Methods , 1982, 52, 323])). 그 이후로, 인간 말초 전혈 (WB), PBMCs, 또는 단핵구 세포주, 예로서, MONOMAC-6(MM6) (문헌 [Ziegler-Heitbrock et al., Int . J. Cancer, 1988, 41, 456]) 또는 THP-1 (문헌 [Tsuchiya et al., Int . J. Cancer, 1980, 26, 171])를 비롯한 상이한 기원의 인간 단핵구, 및 발열성 사이토카인 종양 괴사 인자 알파, TNF-α, IL-6, IL-1β, 및 비-발열성 대사 산물 네오프테린 (문헌 ([Hartung et al., The Report and Recommendations of ECVAM Workshop 43, 2001, 29, 99]; [Poole and Gaines Das. Eur J Parenteral Sciences, 2001, 6, 63]; [Poole et al., J. Immunol . Methods, 2003, 274, 209]; [Gaines Das et al., J Immunol Methods, 2004, 288, 165]))를 비롯한 다양한 정보판독물(readout)을 사용한 수개의 상이한 시험 시스템이 개발되었다. 최근 공동으로 수행된 유럽의 연구, 휴먼 스터디(Human(e) Study)에서는 각각이 상기 기술된 세포 기원 및 정보판독물의 상이한 조합물을 사용하는, 6개의 가장 탁월한 단핵구 활성화 시험을, 다양한 농도의 순수한 내독소가 스파이크된(spiked) 의료용 제품내 내독소를 검출할 수 있는 능력에 대하여 평가하였다.
6개의 시험중 5개에서는 바닥이 평평한 웰을 갖는 96-웰 폴리스티렌 플레이트 상에서 세포를 배양하였다 (문헌 [Hoffmann et al., J. Immunol . Methods , 2005, 298, 161]). 6번째 시험 (문헌 ([Fennrich et al., Dev . Biol . Stand., 1999]; [Fennrich et al., ALTEX, 1999]; [Hartung et al., 2001])에 기초)에서는, 폴리스티렌으로 제조되고, 바닥이 원뿔형인 에펜도르프(Eppendorf) 원심분리관 (1.2 ml)을 대부분의 평가에 사용하였고, 연구 도중, 바닥인 둥근형인 폴리프로필렌 관 (1.5 ml)은 본 연구에 사용된 엔도세이프® 인 비트로 피로젠 테스트(Endosafe® In vitro Pyrogen Test)(IPT)용 키트의 제조사인 찰스 리버 라보라토 리즈(Charles River Laboratories)에 의해 폴리프로필렌 관 대신 치환될 수 있다. 이러한 치환이 상기 시험에 대하여 임의의 유의적인 효과를 갖는다고 보고된 바는 없으며, 이후, 찰스 리버 라보라토리즈가 용량이 축소된 것을 위해 엔도세이프® IPT을 변형시켰을 때, 폴리프로필렌 관, 그 자체는 바닥이 평평한 폴리프로필렌 96-웰 플레이트로 대체하였다. 본 시험의 단핵구의 기원은 전혈이며, 정보판독물은 IL-1β이다. 상이한 농도의 내독소가 스파이크된 다양한 약물과 함께 전혈을 인큐베이션시켰다.
카린(Carlin) 및 비이타넨(Viitanen)은 단핵구 공급원으로서의 전혈 또는 MONOMAC-6 세포와 정보판독물로서의 IL-6에 기초하여, 각종 비-내독소 발열 물질, 즉, 디프테리아(Diphtheria) 톡소이드, 백일해(Pertussis) 톡소이드, 및 파상풍(Tetanus) 톡소이드를 비롯한 그램-양성 및 그램-음성 항원을 함유하는 백신 인판릭스(Infanrix)의 고유 발열성을 평가하는 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Pharmeuropa , 2003, 15, 3, 418-423]). 내독소-무함유의, 미공개 조성물의 에펜도르프 바이오-퓨어(Eppendorf Bio-Pure) 등급 튜브에서 세포를 낮은 세포 밀도로 배양하였다. 백신의 발열성은 그의 제조 또는 저장시의 백신 오염에 따른 결과가 아니었다. 아르퉁(Hartung) 및 헨델(Wendel)은 단핵구 공급원으로서의 전혈과 바람직한 정보판독물로서의 IL-1β에 기초하여, 순수한 형태의 내독소 및 비-내독소 발열 물질, 즉, 살모넬라 아보르투스 에쿠이(Salmonella abortus equi)로부터의 LPS, 스트렙토코커스 피로겐스(Streptococcus pyrogenes)로부터의 스트렙토라이신 O(SLO), 및 뮤라밀 디펩티드(MDP)를 검출하는 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Hartung and Wendel, In Vitro Toxicology. 1996, 9, 4, 353-359]; 미국 특허 번호 제5,891,728호). 세포를 폴리프로필렌 관에서 배양하였다.
야마모토(Yamamoto) 등은 단핵구/단핵구 세포 공급원으로서 상이한 인간 세포주로부터 유래된 전혈 또는 세포 (여기서, 단핵구/단핵구 세포가 바람직하다)와 바람직한 정보판독물로서의 IL-6에 기초하여, 내독소 발열 물질을 검출하기 위한 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Jpn . J. Infect . Dis., 2003, 56, 93-100]). 약물이 내독소의 발열성 효과를 증강시키는, 내독소와 비경구용 약물, 특히, 인터페론 사이의 생체내 상승작용의 가능성을 내독소 시험이 예측한다고 보고되었다. 세포를 순수한 형태의 내독소, 또는 순수한 형태의 내독소와 인간 인터페론의 혼합물과 함께 배양하였다. 세포주 세포를 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 구체적으로 명시되지 않는 물질을 포함하는 관에서 혈액 세포를 배양하였다.
나카가와(Nakagawa) 등은 단핵구 공급원으로서 전혈 또는 MM6-CA8 세포 (MONOMAC-6의 서브클론)와 바람직한 정보판독물로서의 IL-6에 기초하여, 순수한 형태의 내독소 및 비-내독소 발열 물질, 즉, E. 콜라이(E. coli) O55:B5로부터의 LPS 및 S. 아우레우스(S. aureus)로부터 유래된 불용성 펩티도글리칸(PG)을 검출하기 위한 단핵구 활성화 시험을 개시하였다 (문헌 [Clinical and Diagnostic Laboratory Immunol ., 2002, 9, 3, 588-597]). MM6-CA8 세포를 폴리스티렌 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 혈액 세포를 폴리프로필렌 관에서 배양하였다; 사용량 (225 ㎕의 혈액, 25 ㎕의 시험 용액, 750 ㎕의 염수)에서 표준 96-웰 플레이트의 사용량 (250 ㎕/웰)은 배제하였다.
최근에는 다양한 출처를 통해 폴리프로필렌이 발열 물질 시험에 삼가되어야 한다고 제안되었다. 예를 들면, 찰스 리버 라보라토리즈는, LPS의 지질 A 성분과 관련된 수소성 도메인에 기인하여 폴리프로필렌 표면의 수소성 성질이 상기 표면 상에 내독소를 흡착시킬 수 있기 때문에 폴리프로필렌을 삼가할 것을 권고했다 (문헌 [Charles River Laboratories, Endosafe Times, Sept. 2004]). 생물학적 안전성 시험의 제작사인 할란 세라-랩(Harlan Sera-Lab)은 폴리프로필렌 관이 LAL 검정법을 간섭할 수 있다고 언급하였다 (문헌 [Harlan Sera-Lab, 2004 Catalogue]). 또한, 유럽 투석 이식 간호사 협회(European Dialysis and Transplant Nurses Association) 뿐만 아니라, 유럽 신장 관리 협회(European Renal Care Association)는, 폴리스티렌이 보통은 내독소를 흡착하지 않기 때문에 내독소 시험에서 폴리프로필렌을 삼가하고, 폴리스티렌을 사용할 것을 권고하고 있다 (EDTNA/ERCA 가이드라인).
따라서, 고도한 감수성, 고도한 특이성, 및 의료용 제품에서 광범위한 발열성 오염물을 검출할 수 있는 능력을 특징으로 하는, 비-동물-기초 발열 물질 시험이 요구되고 있다.
본 발명의 요약
출원인들은 의료용 제품에 존재하는 발열성 오염물에 감수성이고, 이를 검출하는 시험관내 발열 물질 시험을 개발하게 되었다. 일반적으로, 본 발명은 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함하는 제1 검정 시스템에서 단핵구, 즉, 단핵구-함유 반응물 형태의 단핵구와 시험하고자 하는 샘플을 조합하여 단핵구가 상기 표면과 접촉하도록 하는, 샘플 내의 비-내독소 발열 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 단핵구 및 샘플을 인큐베이션시켜 단핵구가 인큐베이션시에 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자를 생산할 수 있도록 한다. 제1 검정 시스템의 내용물을, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자 또는 마커에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제2 검정 시스템으로 옮긴다. 제2 검정 시스템을 표면 상의 항체에 결합한 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 검정한다. 본 방법에서 사용된 단핵구가 PBMCs 또는 단핵구 세포주 세포일 때, 단핵구는 검정 시스템내 고도한 세포 밀도로 존재한다.
본 발명은 또한 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함하는 제1 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물로서 전혈과 시험하고자 하는 의료용 제품을 조합하여 혈액이 상기 표면과 접촉하도록 하는, 비경구적으로 투여되는 의료용 제품 내의 비-내독소 발열 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다. 혈액 및 의료용 제품을 인큐베이션시켜 혈액이 인큐베이션시에 사이토카인 IL-6을 생산할 수 있도록 한다. 제1 검정 시스템의 내용물을, IL-6에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제2 검정 시스템으로 옮긴다. 제2 검정 시스템을 표면 상의 항체에 결합한 IL-6의 존재에 관하여 검정한다.
본 발명은 추가로 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함하는 검정 시스템에서 단핵구 및 시험하고자 하는 샘플을 조합하여 단핵구가 상기 표면과 접촉하도록 하는, 비-내독소 발열 물질 시험에서 사용하기 위한, 단핵구, 즉, 단핵구-함유 반응물 형태의 단핵구를 배양하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된, 1개 이상의 미량역가 웰을 포함하고, 상기 웰의 표면이 폴리프로필렌을 포함하는 검정 시스템에서 단핵구와 샘플을 조합하여 단핵구가 상기 표면과 접촉하도록 하는, 비-내독소 발열 물질 시험의 일부로서 단핵구를 배양하는 방법에 관한 것이다. 이들 배양 방법에 사용되는 단핵구가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 단핵구 세포주 세포일 때, 단핵구는 검정 시스템내 고도한 세포 밀도로 존재한다.
본 발명은 또한 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면과, IL-6에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물로서 전혈과 시험하고자 하는 의료용 제품을 조합하여 혈액이 폴리프로필렌을 포함하는 상기 표면과 접촉하도록 하고, 표면 상의 항체에 결합한 IL-6의 존재에 관하여 검정 시스템을 검정함으로써, 비경구적으로 투여되는 의료용 제품 내의 비-내독소 발열 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 각 웰내 함유된 배양 배지가 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 여러 개의 미량역가 웰을 포함하되, 상기 각 웰의 표면이 폴리프로필렌을 포함하는 것인 미량역가 플레이트, 및 상기 미량역가 플레이트의 웰에 함유되어 있되, 상기 웰의 표면과 접촉하는 것인 냉동 보관된 단핵구, 즉, 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물 형태의 냉동 보관된 단핵구를 함유하는 진단용 키트를 제공한다. 키트내 단핵구가 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 단핵구 세포주 세포일 때, 단핵구는 웰내 고도한 세포 밀도로 존재한다.
본 발명은 또한 비경구적으로 투여되는 의료용 제품에서 비-내독소 발열 물질을 검출하기 위한 것으로, 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 각 웰내 함유된 배양 배지가 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 여러 개의 미량역가 웰을 포함하되, 상기 웰의 표면이 폴리프로필렌을 포함하는 것인 미량역가 플레이트를 포함하는 검정 시스템, 상기 미량역가 플레이트의 웰에 함유되어 있되, 상기 웰의 표면과 접촉하는 것인 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물로서의 냉동 보관된 전혈, 및 IL-6에 대한 항체를 포함하는 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 특징은 이하에서 부분적으로 자명하게 될 것이며, 부분적으로 지시될 것이다.
도 1은 정보판독물로서 IL-6과 함께, 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 4개의 상이한 세포 밀도를 갖는 (250 ㎕ 웰당 100만개, 50만개, 25만개 및 13만개의 PBMC) 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 내독소 표준 (1 내독소 단위/ml) 및 엑스트라니얼(Extraneal)® 양성 대조군 (즉, 비-내독소 발열 물질로 오염된 이 제품의 1개의 배취)에 대한 것이다.
도 2는 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 전혈을 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 엑스트라니얼® 음성 대조군 (즉, 이 제품의 1개의 깨끗한 배취), 엑스트라니얼® 양성 대조군, 헤모글로빈(Hb) 음성 대조군 (즉, 이 제품의 1개의 깨끗한 배취), 및 헤모글로빈(Hb) 양성 대조군 (즉, 비-내독소 발열 물질로 오염된 이 제품의 1개의 배취)에 대한 것이다.
도 3은 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군 및 Hb 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 4는 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 MONOMAC-6 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군 및 Hb 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 5는 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 THP-1 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군 및 Hb 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 6은 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 THP-12A9 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 TNF-α 반응을 도시한 그래프이다. TNF-α 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군 및 Hb 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 7은 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 MONOMAC-6-CA8 클론 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 및 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 8은 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 28SC 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS 및 덱스트란 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 9는 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 고도한 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군 및 덱스트란 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 10은 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 플레이트 상에서 전혈을 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 11A는 말초 혈액 단핵 세포 (웰당 100만개의 세포)를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 폴리프로필렌 플레이트 (검은색 칼럼) 및 폴리스티렌 플레이트 (회색 칼럼)에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군 및 Hb 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 11B는 말초 혈액 단핵 세포 (웰당 100만개의 세포)를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 폴리프로필렌 플레이트 (검은색 칼럼) 및 폴리스티렌 플레이트 (회색 칼럼)에 대한 IL-1β 반응을 도시한 그래프이다. IL-1β 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군 및 Hb 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 12A는 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 고도한 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS 및 엑스트라니얼® 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 12B는 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 낮은 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS 및 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 13A는 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 고도한 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS 및 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 13B는 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 고도한 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS 및 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 14A는 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 고도한 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS 및 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 14B는 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 말초 혈액 단핵 세포를 사용하여 수행된 단핵구 활성화 시험에서 고도한 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-6 반응을 도시한 그래프이다. IL-6 반응은 LPS 및 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군에 대한 것이다.
도 15는 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 플레이트 상에서 전혈을 사용하여 수행된 상업적으로 이용가능한 IPT 시험에서 고도한 세포 밀도를 갖는 시험 샘플에 대한 IL-β 반응을 도시한 그래프이다. IL-β 반응은 LPS, 엑스트라니얼? 양성 및 음성 대조군, 헤모글로빈 양성 및 음성 대조군, 염수 대조군 및 그램 양성 대조군에 대한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
발열 물질은 혈액 단핵구 (뿐만 아니라, 기타 백혈구) 및 대식 세포를 자극시켜 사이토카인 (예컨대, TNF-α, IL-1β, 및 IL-6)을 비롯한, 염증 반응의 내인성 발열성 매개 인자 다수를 생산하고 방출하도록 한다. 이러한 발열성 매개 인자가 순환에 방출됨으로써 일련의 단계적 이벤트를 유발하여 병에 걸린 개개에서 염증 반응을 일으킨다. 본 발명의 단핵구 활성화 시험은 염증 반응에 대한 마커로서 이들 내인성 발열 물질의 측정치에 의존한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 따라, 샘플을, 폴리프로필렌으로 구성된 표면을 포함하는 제1 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물과 함께 인큐베이션시키되, 상기 단핵구-함유 반응물은 고도한 세포 밀도로 검정 시스템에 존재한다. 이어서, 제1 검정 시스템의 내용물을, 항-사이토카인 항체로 코팅된 표면을 포함하는 제2 검정 시스템으로 옮기고, 제2 검정 시스템을, 항체에 의해 표면에 결합한 사이토카인의 존재에 관하여 검정한다.
본 발명의 발열 물질 시험을 사용하여 비-내독소 발열 물질, 즉, 그램-양성 세균 (예컨대, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 그의 성분들 (예컨대, 뮤로펩티드, 리포테이콘산, 장독소, 스트렙토라이신), 면역 자극제, 예로서, 피토헤마글루티민 또는 포르볼 에스테르 뿐만 아니라, 내독소를 검출한다. 본 시험은 그램-음성 세균 내독소에 특이적인 반응보다는 다양한 발열 물질에 대한 단핵구의 사이토카인 반응을 이용하기 때문에 본 발명의 시험을 사용하여 광범위한 발열 물질을 검출할 수 있다.
본 발명의 발열 물질 시험은 종래 시험과 비교하여 의료용 제품의 오염된 로트에서 비-내독소 발열 물질을 검출하는데 더욱 효과적이라고 밝혀졌다. 본원의 실시예에서 이들 종래 시험은 동일의 비경구적인 음성 대조군 샘플로부터 엑스트라니얼® 복막 투석액, 헤모글로빈, 또는 덱스트란의 양성 대조군 샘플을 식별할 수 없는 것으로 나타났다. 엑스트라니얼? 양성 대조군 샘플은 비-내독소 발열 물질로 오염된 제품 로트로부터 수득하였는데; 오염된 로트는 인간에서는 부작용을 일으켰지만, 오직 내독소 발열 물질에 대해서만 시험하는 LAL 시험에 따른 발열 물질 존재에 대해서는 음성인 시험 결과가 나왔다 (문헌 [Martis, et al., Lancet, 365(9459), 588]). 헤모글로빈 양성 대조군 샘플 또한 비-내독소 발열 물질로 오염된 제품 로트로부터 수득하였는데; 오염된 로트는 토끼에서는 열 반응을 일으켰지만, LAL 시험에 따른 발열 물질 존재에 대해서는 음성인 시험 결과가 나왔다. 덱스트란 양성 대조군은, 인간에서는 열을 유발한 것으로 밝혀졌지만, LAL 시험에 따른 발열 물질 존재에 대해서는 음성인 시험 결과가 나온 덱스트란 시료였다. 본 시험이 의료용 제품에서 비-내독소 오염물을 검출할 수 있는 능력은, 로트가 환자 사용을 위해 방출되기 앞서 오염된 의료용 제품 로트를 확인할 수 있다는 점에서 매우 가치가 큰 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 나가와(Nakagawa) 등에 의해 개시된 바, 공지된 시험은 비-내독소 및 내독소 발열 물질, 즉, S. 아우레우스로부터의 펩티도글리칸(PG) 및 E. 콜라이로부터의 LPS를 검출하는 것과 관련하여 기능을 잘 발휘하거나, 내독소가 스파이크된 제품, 즉, 상기 논의된 바와 같이, 휴먼 스터디의 6개의 시험에서 다양한 약물이 상이한 농도의 내독소로 스파이크된 경우에 공지된 시험은 기능을 잘 발휘한다. LAL 시험은, 단, 의료용 제품이 내독소로 오염된 경우에만, 효과적으로 기능을 한다 (문헌 ([Mascoli, CC, Weary, M. E., J Parenter Drug Assoc. 2003, 33, 81]; [Mascoli, CC, Weary, M.E., Prog Clin Biol Res. 2003, 29, 387])). 그러나, 의료용 제품이 비-내독소 발열 물질로 오염되었을 때에 상기 시험들은 발열 물질을 검출하지 못했다. 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 비-내독소 발열 물질은 의료용 제품과 상호작용하여 발열 물질을 "차폐"시키고, 비-내독소 오염물을 검출하지 못하게 할 수 있다고 여겨진다.
본 발명의 발열 물질 시험은 이러한 차페 효과를 극복하였고, 의료용 제품 내의 비-내독소 오염물을 검출할 수 있다; 예를 들면, 바람직한 실시태양에서, 바닥이 둥근 폴리프로필렌 웰에서 PBMCs를 고도한 세포 밀도로 배양하였을 때, 본 발명의 발열 물질 시험은 엑스트라니얼® 용액 및 덱스트란의 양성 및 음성 대조군 샘플 사이를 식별할 수 있었다 (도 9 참조). 이용가능한 키트로서 시험된 키트중 어 느 것도 양성 및 음성 엑스트라니얼® 또는 헤모글로빈 대조군 사이를 식별하지 못했다 (도 1-8 참조). 다시, 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 고도한 세포 밀도는 더 많은 세포가 더 많이 세포 대 세포로 접촉할 수 있게 한다고 여겨진다. 세포 대 세포의 접촉이 증가함으로써 세포 간의 더 많은 의사소통이 이루어지도록 촉진되고, 이로써, 발열성 오염물에 대한 염증 반응은 증진된다. 세포는 가용성 매개 인자, 예로서, 사이토카인을 통해, 및 세포 대 세포 접촉을 통해 서로서로 의사 소통을 하는데, 여기서, 사이토카인은 세포 대 세포 접촉에 있어서도 참여할 수 있다. 바닥이 평평한 웰과 비교하여 바닥이 둥근 웰, 또는 일반적으로 세포가 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 웰이 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어질 수 있도록 한다. 그리고, 폴리프로필렌이 비-내독소 발열 물질의 생체이용가능성을 증가시키는 것으로 여겨진다. 다시, 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 종래에 세포 배양에 사용되었던 것과 같은 폴리스티렌 플레이트를 표면 처리함으로써 상기 표면의 소수성을 작게 하고, 상기 표면이 세포와 더 잘 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 비-내독소 발열 물질과 더 잘 결합하여 그를 더 잘 중화시킬 수 있게 한다고 여겨진다. 폴리프로필렌 플레이트는 표면-처리되지 않기 때문에 폴리스티렌 플레이트보다 더 소수성인 상태로 유지되고, 비-내독소 발열 물질을 중화시킬 수 있는 가능성은 보다 작다.
1. 발열 물질 시험 성분
상기 기술된 바와 같은 3가지 요소, 고도한 세포 밀도, 둥근형-바닥 (또는 다르거나 적절한 형상), 및 폴리프로필렌의 몇몇 조합, 즉, PBMCs가 고도한 세포 밀도로 바닥이 둥근 폴리스티렌 웰에 존재하는 것을 특징으로 하는 발열 물질 시험을 통해 의료용 제품 내의 비-내독소 오염 검출을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 발열 물질 시험을 사용하여, 혈액용 제품, 비경구적 투여용의 의료 제품, 투석액, 백신, 정맥내 투여용 용액, 및 신체와 접촉하는 임의의 액체 또는 체액을 비롯한 각종 의료용 제품을 비-내독소 오염 존재에 관하여 시험할 수 있다.
A. 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자
검출될 수 있는 것으로, 단핵구-함유 반응물에 의해 분비되는, 염증 반응의 임의의 내인성 매개 인자를 본 발명의 발열 물질 시험의 기초로서 사용할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 사이토카인 또는 엔도텔린이 사용되는데, 이는 본 발명의 방법에 의해 용이하게 검출되기 때문이다. 내독소 또는 비-내독소 발열 물질과 함께 인큐베이션된 전혈내 단핵구는, 전-염증성 사이토카인 (TNF-α, IL-1, IL-6), 항-염증성 사이토카인(IL-4, IL-10, IL-13, IL-1ra, TGF), Th1(IL-2, IFN, IL-12), Th2(IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13), IL-1β, IL-1ra, IL-8 및 PGE2를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 여러 부류의 사이토카인을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 사이토카인 마커는 TNF-α, IL-1β, IL-1ra, IL-6, IL-8 및 PGE2를 포함한다. IL-6이 본 발명에서의 검정하는데 특히 바람직한 사이토카인 마커이다. IL-6은 상대적으로 짧은 인큐베이션 시간 이내에 검출가능한 양으로 생산된다. 면역반응성 IL-1β 및 TNF-α와는 달리, 다량의 면역반응성 IL-6은 세포- 조건화 배지/혈액 내로 완전히 분비됨으로써 그의 완전한 추정을 가능케 한다. 대조적으로, 면역반응성 TNF-α 및 IL-1β는 대개 세포내 남아 있는데, 이는 세포 투과성에 영향을 주는 시험 시료는 시험에서 IL-6보다는 정보판독물로서 (면역반응성) TNF-α 또는 IL-1β를 보다 쉽게 방해할 수 있는 가능성을 증가시킨다. 그럼에도 불구하고, TNF-α 또는 IL-1β 또한 본 발명에서 사이토카인 마커로서 사용될 수 있다. TNF-α는 단핵구 발열 물질 반응에서 IL-6보다 더 빨리 생산된다. 따라서, TNF-α를 검정하는 본 발명의 실시태양은 IL-6를 검정하는 실시태양보다 더 짧은 인큐베이션 시간 (~1 내지 2시간)을 사용하게 될 것이다. 상이한 발열성 오염물이 세포 배양에 있어서 상이한 사이토카인 반응을 유도할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 특정 사이토카인의 분비를 유발하는 특정 발열 물질에 의한 오염이 약제학적 제품에 대해 충분한 가능성이 존재할 때에 특정 사이토카인 형성을 검출하도록 적합화될 수 있다.
B. 사이토카인 또는 내인성 매개 인자에 대한 항체
일단 검정하고자 하는 사이토카인을 결정하였다면, 본 발명에 사용하기 위한 것으로 상기 사이토카인에 대한 항체를 제조하여야 한다. 미국 특허 번호 제6,696,261호 (본원에서 그의 전문이 참고로 인용됨)의 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 엄격한 조건하에서 정제된 다중클론 항체가 발열 물질 시험에서 잘 작용한다. 다중클론 항체가 단리되는 동물 혈액에는 천연적으로 발열 물질이 함유되어 있지 않기 때문에 (단, 건강한 동물로부터 채취한 경우), 발열 물질-무함유 제품을 수득하기 위해서는 정제하는 동안 간단하게 원료가 발열 물질에 의해 오염되 지 못하도록 막아야 한다. 미국 특허 번호 제6,696,261호의 실시예 1에 기재되어 있는 바와 같이, 발열 물질-무함유 완충액 및 고체상을 친화성 크로마토그래피 칼럼에 사용하여 발열 물질-무함유 다중클론 항체를 수득한다. 별법으로, 하이브리도마 배양물로부터의 단일클론 항체를 사용할 수 있다. 그러나, 단일클론 항체를 사용할 경우, 하이브리도마 세포 배양물내 존재할 수 있는 임의의 오염성 하이브리도마 배양물로부터 항체를 단리시키는데 주의를 기울여야 한다.
본 발명에 사용하기 위해, 사이토카인에 대한 항체를 검정 시스템내 표면에 가한다. 예로서, 코팅법과 같이, 검정 시스템, 예로서, 미량역가 웰내 표면 상에 항체를 결합시키는 방법은 생화학 분야에서 잘 알려져 있다. 다수의 검정 시스템이 상업적으로 이용가능하며, 제조사는 보통 재료, 및 항체를 시스템의 표면 상에 코팅시키는 것에 관한 설명서를 제공한다. 미량역가 웰은 해독이 용이하고, 소량의 샘플이 요구되기 때문에, 본 발명의 바람직한 실시태양에서는 웰의 내부 표면중 일부가 항체에 의해 코팅된 미량역가 웰이 사용된다. 본 발명의 잇점을 충분히 이용하기 위해서는 미량역가 웰이 미량역가 플레이트의 일부인 것이 바람직한데, 여기서, 미량역가 플레이트는 웰의 어레이가 자동화 면역 검정법 플레이트 판독 장치 (예컨대, 미국 특허 번호 제5,281,540호 (본원에서 참고로 인용됨)의 사용으로 판독될 수 있도록 배치된, 유사한 웰들의 평면 어레이다. ELISA 플레이트 판독기 (예컨대, 바이오-래드 라보라토리즈 인코포레이티드(Bio-Rad Laboratories, Inc.)로부터 이용가능한, 울트라마크 마이크로플레이트 리더(Ultramark Microplate Reader))와 같은 자동화 장치는 검정 평가 과정을 자동화하고, 시간당 비용을 현저 히 감소시켜 준다. 원하는 경우에는, 발열 물질-무함유 완충액을 사용하여 철저하게 세척하여 미량역가 웰 플레이트에는 발열 물질이 함유되어 있지 않도록 할 수 있다 (이미 발열 물질-무함유인 것으로 공급되지 않은 경우에). 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 항-IL-6 다중클론 항체를 ELISA 플레이트의 웰에 코팅한다. 그러한, 다른 면역-진단학적 시험 포맷 (예컨대, 항체가 딥스틱 또는 비드에 코팅된 경우)도 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 미량역가 플레이트 시스템 제조시, "포획" 항체 이외에도, 사이토카인 검정에 사용하기 위한 기타 항체 및 반응물을 가할 수 있다. 예를 들면, 포획 항체를 미량역가 플레이트에 가한 후, 플레이트의 남아있는 결합 부위를 또다른 단백질로 "차단"시킬 수 있다. 차단시킨 이후, 보호용 글레이징 화합물과 함께, 표지된 검출용 항체 (예로서, 비오틴화된 또는 효소-표지된 항체)를 미량역가 플레이트에 가할 수 있다. 따라서, 하기 기술하는 바와 같이, 샘플을 미량역가 웰에서 인큐베이션시킬 때, 방출된 사이토카인은 샘플 인큐베이션 기간 동안 동시에 웰에 결합되어 있는 포획 항체에 의해 포획되고, 검출용 항체에 의해 표지된다.
C. 단핵구-함유 반응물
본 발명의 발열 물질 시험중 제1 단계로서, 검정 시스템에서 시험하고자 하는 샘플과 단핵구-함유 반응물을 조합하여 단핵구-함유 반응물내 함유된 세포를 배양한다. 본 발명의 단핵구-함유 반응물은 이들 수용체가 유도되거나, 그로 클로닝되는 세포도 비롯하여, PBMCs, 단핵구 세포주 세포, 전혈, 또는 전-염증성 및 발열 물질에 대한 반응을 매개하는 것에 관여하는 톨(Toll)-유사 수용체(TLR)를 발현시키거나, 발현시키도록 할 수 있는 임의의 세포주로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 단핵구 세포주는 MONOMAC-6(MM6), THP-1, 및 28SC로 구성된 군으로부터 선택된다. 단핵구-함유 반응물중 단핵구는 시험되는 제품이 투여되는 것과 동일한 종 (즉, 약제학적 제품의 경우 인간; 수의학용 제품의 경우, 고양이, 개, 말 등)으로부터 유래된 단핵구이다. 그러나, 원하는 발열 물질 반응성을 갖는 다른 종으로부터 유래된 단핵구도 사용될 수 있다. 특정의 바람직한 실시태양에서, 단핵구-함유 반응물은 PBMCs를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 단핵구-함유 반응물은 전혈이고, 검정 시스템은 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함하며, 상기 단핵구-함유 반응물이 표면과 접촉하게 된다.
또다른 실시태양에서, 단핵구-함유 반응물은 고도한 세포 밀도로 존재하는 PBMCs이고, 검정 시스템은 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 또는 PBMCs와 접촉하게 되는 또다른 유사 물질을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함한다.
단핵구-함유 반응물이 PBMCs 또는 세포주 세포일 때, 반응물은 상기에 상세히 설명한 바와 같이, 검정 시스템내 고도한 세포 밀도로 존재함으로써 더욱더 많은 세포 대 세포 접촉이 이루어지도록 촉진시킨다. 특정 실시태양에서, 단핵구-함유 반응물은 웰당 약 125,000개 이상의 세포, 약 250,000개 이상, 약 500,000개 이상, 약 600,000개 이상, 약 700,000개 이상, 약 800,000개 이상, 약 900,000개 이상, 약 1,000,000개 이상, 약 1,100,000개 이상, 약 1,200,000개 이상, 약 1,300,000개 이상, 약 1,400,000개 이상, 약 1,500,000개 이상, 약 1,600,000개 이상, 약 1,700,000개 이상, 약 1,800,000개 이상, 약 1,900,000개 이상 또는 약 2,000,000개 이상의 세포의 세포 밀도로 검정 시스템내 존재한다. 당업계의 숙련인은, 웰 내의 세포를 적절하게 유지시키는데 필요한 세포 영양분이 웰내 반응물 용량내 불충분하게 존재하는 경우에는 최대 세포 밀도가 초과할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
단핵구-함유 반응물이 전혈일 때, 반응물은 PBMCs 또는 세포주 세포보다 낮은 세포 밀도로 검정 시스템내 존재한다. 단핵구-함유 반응물이 혈액인 특정 실시태양에서, 반응물은 웰당 약 100,000개 이상의 말초 혈액 단핵 세포, 웰당 약 200,000개 이상, 약 210,000개 이상, 약 220,000개 이상, 약 230,000개 이상, 약 240,000개 이상, 약 250,000개 이상, 약 260,000개 이상, 약 270,000개 이상, 약 280,000개 이상, 약 290,000개 이상, 약 300,000개 이상, 약 310,000개 이상, 약 320,000개 이상, 약 330,000개 이상, 약 340,000개 이상, 약 350,000개 이상, 약 360,000개 이상, 약 370,000개 이상, 약 380,000개 이상, 약 390,000개 이상 또는 약 400,000개 이상의 PBMC인 세포 밀도로 검정 시스템에 존재한다. 특정 이론으로 제한하지 않으면서, 전혈은 PBMCs 또는 세포주 세포와 비교하여 더 낮은 세포 밀도로 사용될 수 있는데, 이는 단핵구가 그의 천연 환경하에 존재하고, 발열 물질에 대한 그들의 반응에 영향을 줄 수 있는 모든 혈청 성분이 용액내 존재하기 때문인 것으로 여겨진다. 추가로, 단핵구-함유 반응물이 전혈을 포함할 때, 발열 물질 시험에 사용되는 정보판독물은 IL-6이다.
바람직하게, 혈액이 단핵구-함유 반응물로서 사용되는 경우, 혈액은 신선하거나, 24시간 미만, 및 더욱 바람직하게는 4시간 미만이 경과한 것이다. 또한, 전혈이 사용될 때, 혈액 응고를 지연 또는 막기 위하여 항응고제가 포함될 수 있으며; 적합한 항응고제는 시트르산염 (예를 들면, 최종 농도 0.38%), 헤파린 (헤파린 나트륨염), 또는 프래그민 (저분자량 헤파린)을 포함한다. 항응고제 첨가제는 시험 샘플내 발열 물질에 대한 단핵구의 반응에 영향을 주지 않으면서 사용될 수 있다. 전혈은 또한 적절한 완충액 또는 기타 희석제, 예로서, RPMI 세포 배양 배지 또는 생리 식염수로 희석될 수 있다. 전혈은 바람직하게 인큐베이션을 위한 최종 용량의 50% 이상으로, 더욱 바람직하게는 약 5% 내지 약 25%로, 및 더욱 바람직하게는 약 20%로 희석된다 (미국 특허 번호 제6,696,261호의 도 1 참조). 전혈을 희석시킴으로써, 기증자의 대다수의 IL-6 반응 곡선은 광범위한 발열 물질 오염 농도를 정량하는데 사용될 수 있는 조밀한 범위 안에 주어질 수 있다 (미국 특허 번호 제6,696,261호의 도 3 참조).
2. 2개의 검정 시스템
본 발명의 특정 실시태양에서, 발열성 시험은 2개의 검정 용기 시스템에서 수행되는데, 단핵구-함유 반응물과 샘플의 인큐베이션 단계, 및 단핵구-함유 반응물에 의해 생산된 사이토카인(들)의 포획 단계는 2개의 상이한 검정 용기 시스템에서 일어난다. 인큐베이션 단계는 상기 기술된 배양 단계를 따르며; 시험 샘플과 단핵구-함유 반응물 (예로서, PBMCs)의 인큐베이션은 배양 단계와 동일한 검정 시스템에서 실시된다. 본 발명의 발열 물질 시험에 사용하는데 최적의 인큐베이션 시간은 검정 조건에 따라, 즉, 검정하는 사이토카인에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 전혈이 내독소와 함께 인큐베이션되고, 정보판독물이 IL-6인 경우, 최소한의 추가 사이토카인은 6시간 동안 인큐베이션시킨 후에 단핵구-함유 반응물에 의해 생산되며; 4시간의 인큐베이션 후에는 충분량의 IL-6이 반응물에 의해 분비되는 바, 발열 물질 오염물을 정량할 수 있게 된다. 전혈이 발열성 물질과 함께 인큐베이션되고, 임의 정보판독물이 사용되는 경우, 약 16-24시간의 인큐베이션 후에 충분량의 IL-6이 반응물에 의해 분비되는 바, 발열 물질 오염물을 정량할 수 있게 된다. IL-6 생산을 검정하는 본 발명의 실시태양의 경우, 인큐베이션 시간은 약 6 내지 약 24시간이 바람직하고, 약 12 내지 약 24시간인 것이 더욱 바람직하며, 및 16 내지 약 24시간인 것이 가장 바람직하다. 또다른 사이토카인을 검정한다면, 인큐베이션 기간은 특정 사이토카인의 생산에 대하여 최적화되어야 한다. 그러한 최적화는 당업계의 숙련자의 능력 범위 내에 있다. 검정하고자 하는 사이토카인이 단핵구에 의해 방출되지 않는다면, 세포를 동결 해동에 의해 또는 인큐베이션 기간 종결시 항체에 대한 리간드의 결합을 붕괴시키지 않을 정도의 농도로 세정제를 가함으로써 용해시킬 수 있다.
일단 인큐베이션 단계가 끝나면, 검정 시스템 (제1 검정 시스템)의 내용물, 즉, 단핵구-함유 반응물과 시험 샘플을 제2 검정 시스템으로 옮기는데, 여기서 상기 제2 검정 시스템은 사이토카인 또는 염증성 반응의 내인성 매개 인자, 예컨대, 엔도텔린에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함한다. 제2 검정 시스템은 항-사이토카인 또는 항-내인성 매개 인자 항체로 코팅된 표면 상에 있는 사이토카 인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 검정된다. 항체 코팅된 표면을 결합된 사이토카인에 관하여 검정하기 이전에 본 방법의 모든 시점에서는 엄격한 멸균 조건이 유지되는 것이 바람직하다. 포획 항체로 코팅된 ELISA 플레이트를 본 발명의 실시태양으로서 사용한다면, 플레이트를 세척하고, 효소에 접합된 2차 항-사이토카인 항체를 ELISA 플레이트에 가한다 (2차 항체가 표지되지 않았다면, "검출용" 항체는 초기에 글레이징 이전에, 또는 제1 검정 시스템의 내용물과 함께 첨가될 수 있다). ELISA 플레이트를 다시 세척하고, ELISA 플레이트에 기질을 첨가하여 발색시킬 것이다. 짧은 인큐베이션 시간 이후, 반응은 종결되고, ELISA 플레이트 판독기 상에서 용액의 광학 밀도를 측정한다. 이러한 과정은 미국 특허 번호 제6,696,261호의 실시예 2에 추가 기재되어 있다. 별법으로, 비-효소적 면역검정 기법이 사용될 수 있다. 예를 들면, "샌드위치" 면역검정법의 제2 항체는 형광 부분 또는 방사성 동위원소로 표지될 수 있다. 세척 후, 웰에 존재하는 형광 또는 방사능의 양을 검출함으로써 웰에 포획된 사이토카인의 양을 정량할 수 있다. 수개의 효소적 및 비-효소적 기초 검정 시스템이 상업적으로 이용가능하며, 본 발명에 사용될 수 있도록 당업자에 의해 용이하게 변형될 수 있다.
3. 하나의 검정 시스템
본 발명의 특정 실시태양에서, 발열성 시험은 1개의 검정 용기 시스템에서 수행되는데, 단핵구-함유 반응물과 샘플의 인큐베이션 단계, 및 단핵구-함유 반응물에 의해 생산된 사이토카인(들)의 포획 단계는 동일한 검정 용기 시스템에서 일어난다. 검정 시스템은 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면과, 사이토카인 또는 염증성 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함한다. 인큐베이션 단계는 상기 기술된 배양 단계를 따르며; 배양 단계와 동일한 검정 시스템에서 실시된다. 2개의 검정 용기 시스템과 관련하여 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 발열 물질 시험에 사용하는데 최적의 인큐베이션 시간은 검정 조건에 따라, 즉, 검정하는 사이토카인에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 2개의 검정 용기 시스템과 관련하여 논의된 인큐베이션 단계에 관한 교시를 1개의 검정 용기 시스템에도 마찬가지로 적용시킨다. 인큐베이션 기간은 특정 사이토카인의 생산에 대하여 최적화되어야 하며, 그러한 최적화는 당업계의 숙련자의 능력 범위 내에 있다. 검정하고자 하는 사이토카인이 단핵구에 의해 방출되지 않는다면, 세포를 동결 해동에 의해 또는 인큐베이션 기간 종결시 항체에 대한 리간드의 결합을 붕괴시키지 않을 정도의 농도로 세정제를 가함으로써 용해시킬 수 있다.
일단 인큐베이션 단계가 끝나면, 사이토카인 또는 염증성 반응의 내인성 매개 인자, 예컨대, 엔도텔린에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 검정 시스템을 항-사이토카인 또는 항-내인성 매개 인자 항체로 코팅된 표면 상의 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 검정한다. 항체 코팅된 표면을 결합된 사이토카인에 대하여 검정하기 이전에 본 방법의 모든 시점에서는 엄격한 멸균 조건이 유지되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 2개의 검정 용기 시스템의 검정 단계에 관한 논의, 즉, ELISA 플레이트 및 비-효소적 면역검정 기법의 논의를 1개의 검정 용기 시스템에도 마찬가지로 적용시킨다.
일반적으로, 1개의 검정 용기 시스템 및 2개의 검정 용기 시스템은 상호교환 가능하다.
4. 검정 용기
본 발명의 검정 시스템은 단핵구-함유 반응물과 접촉하는 1개 이상의 표면을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 검정 시스템(들)은 1개 이상의 미량역가 웰을 포함하고, 표면은 미량역가 웰의 내부 중 적어도 일부분이다. 특정 실시태양에서, 미량역가 웰의 표면이 폴리프로필렌 코팅물을 포함하거나, 전체 미량역가 웰이 폴리프로필렌로 구성되어 있다. 검정 시스템이 사이토카인 또는 염증성 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 특정 실시태양에서, 항체가 가해지는 표면은 미량역가 웰의 내부 중 적어도 일부분이다. 바람직하게, 미량역가 웰은 바닥이 평평한 웰과 비교하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된다.
특정 실시태양에서, 미량역가 웰(들)은 개방형 상단부, 상기 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부, 및 최저점 위쪽의 위치부터 최저점까지의 직경이 점점 줄어드는 바닥벽을 포함한다.
특정 실시태양에서, 미량역가 웰(들)은 개방형 상단부, 상부 단부 및 바닥 단부를 갖는, 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부, 및 상부 단부 및 최저점을 갖고, 상부의 바닥 단부로부터 확장되어 있으며, 바닥부의 상부 단부로부터 최저점 방향으로 상부에서보다 더욱 급격하게 직경이 줄어드는 바닥부를 포함한다.
특정 실시태양에서, 상기 미량역가 웰의 바닥 벽은 비-평면형이고, 바람직하게, 곡선형이며, 종종 파라볼릭형이다. 특정 실시태양에서, 바닥 벽이 하향 확장 형이거나, 미량역가 웰 측면은 내향으로 경사져 있다.
5. 진단용 키트
상기 기술된 실시태양중 어느 하나를 발열 물질 시험을 실시하기 위한 진단용 키트내로 도입시킬 수 있다. 키트를 사용하여, 혈액용 제품, 비경구적 투여용의 의료 제품, 예로서, 투석액, 백신, 및 정맥내 투여용 용액을 비롯한 각종 의료용 제품에서 그램-양성 세균 (예컨대, 스타필로코커스 아우레우스) 또는 그의 성분 (예컨대, 뮤로펩티드, 리포테이콘산, 장독소, 스트렙토라이신)을 비롯한 비-내독소 발열 물질 뿐만 아니라, 내독소 발열 물질을 검출할 수 있다. 일반적으로, 상기 키트는 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 각 웰내 함유된 배양 배지가 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 것으로, 폴리프로필렌을 포함하는 1개 이상의 표면을 포함하는, 여러 개의 미량역가 웰을 포함하는 미량역가 플레이트를 포함한다. 미량역가 플레이트 웰은 냉동 보관된 전혈, 냉동 보관된 말초 혈액 단핵 세포 또는 냉동 보관된 단핵구 세포주 세포를 포함하는 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물을 함유하는데, 이는 웰의 표면과 접촉하게 된다. 특정 실시태양에서, 미량역가 플레이트의 웰은 폴리프로필렌을 포함한다. 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물이 냉동 보관된 말초 혈액 단핵 세포 또는 냉동 보관된 단핵구 세포주 세포를 포함할 경우, 반응물은 고도한 세포 밀도로 웰에 존재한다. 단핵구-함유 반응물로서 냉동 보관된 전혈을 함유하는 키트는 또한, IL-6이 바람직한 정보판독물인 바, IL-6에 대한 항체를 함유한다.
특정 실시태양에서, 웰은 단핵구에 불투과성인 장벽을 포함한다. 장벽은 발 열 물질-무함유 물질로 구성된 1개 이상의 표면을 포함하고, 이는 전형적으로는 막, 그리드, 시브, 또는 시프터이다. 장벽은 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 미량역가 플레이트에 사용하기에 적합한 장벽 물질은 당업계에 알려져 있다. 유체 투과성인 장벽은 냉동 보관된 세포가 웰로부터 제거되지 않고 세척될 수 있도록 한다; 냉동 보관된 세포를 세정하고, 보존제로서의 역할을 하는 디메틸 설폭시드(DMSO)는 시험을 방해하지 않고 제거될 수 있다. 시험 샘플은 장벽 위에 가해지고, 이는 장벽을 통과하여 장벽 아래에 있는 세포와 접촉하게 되고, 잠재적으로 이들 세포를 자극하여 사이토카인이 생산될 수 있도록 한다. 세포에 의해 방출된 사이토카인은 장벽 위쪽의 배지로 확산된다. 전형적으로, 장벽 위아래의 용액은 흡인시킴으로써 완전히 혼합한다. 이어서, 분취량의, 장벽 위쪽으로부터의 잘-혼합된 배지를 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 검정한다.
6. 사이토카인 생산 데이타 해석
A. 표준 곡선 방법
본 발명의 발열 물질 시험에서 생성된 사이토카인 생산 데이타를 적절하게 해석하기 위하여 단핵구-함유 반응물을 USP 표준 내독소와 함께 인큐베이션시켜 내독소 표준 곡선을 작성한다. 상기 목적은 공지된 발열 물질에 대하여 관찰된 반응을 통하여 시험 샘플에 대하여 측정되는 사이토카인 생산 반응을 정량하고자 하는 것이다. 표준 최적의 데이타 분석 소프트웨어를 사용함으로써 유의적으로 다양한 농도의 표준 내독소를 이용하여 생성된, 임의의 통계학적으로 유의적인 갯수의 데 이타 점으로부터 표준 곡선을 작성할 수 있다. 그러한 표준 곡선 작성법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 본 출원인은 10, 4, 1, 0.25, 0.06, 0.03, 및 0 EU/ml의 내독소의 데이타 지점이 표준 곡선 작성에 적합하지만, 유사 범위를 통한 임의의 통계학적으로 유의적인 갯수의 농도가 적합할 것이라는 것을 발견하게 되었다. 일단 표준 곡선을 작성하고 나면, 등가의 비-내독소 농도 (내독소 단위-등가물에서 정량됨)는 표준 곡선을 사용하여 사이토카인 반응으로부터 보간될 수 있다. 전혈-기초 단핵구-함유 반응물의 반응은 매 기증자마다 유의적으로 달라질 수 있기 때문에 단핵구-함유 반응물의 특정 로트로 실시된 각 검정법 세트에 대하여 표준 곡선을 작성하는 것이 중요하다. 그러나, 본 발명의 바람직한 ELISA 플레이트 실시태양은 극소량의 인간 혈액 (약 40 ㎕/웰)을 사용하기 때문에, 수백 개의 웰에 대하여 단일 단위의 기증된 혈액을 사용할 수 있다. USP 내독소를 사용하여 작성된 표준 곡선은 내독소 단위 (EU, 이는 USP/FDA에 의해 정의된 것으로, WHO에 의해 정의된 국제 단위인 IU와 동일한 것이다)에 관하여 환산함으로써 데이타를 정규화하는데 도움을 주며, 이는 내독소/발열 물질 오염이 명시된 산업 표준이 된다.
B. 기준 로트 방법
별법으로, 본 발명의 발열 물질 시험에서 생성된 사이토카인 생산 데이타는 제품의 시험 로트에 의해 유도된 사이토카인 반응을 제품의 기준 로트인, 오염된 기준 로트 및 오염되지 않은 기준 로트에 의해 유도된 것과 비교함으로써 해석될 수 있다. 먼저, 2개의, 의료용 제품의 기준 로트를 확인하고; 기준 로트를 발열 물질 시험하고, 이들 로트에 의해 유도된 사이토카인 반응을 측정한다. 이어서, 시험 로트를 발열 물질 시험하고, 이들 로트로부터 유도된 반응을 기준 로트의 것과 비교한다. 일반적으로, 시험 로트가 오염된 기준 로트보다 더 작은 반응을 유도하고, 오염되지 않는 기준 로트의 것과 유사한 반응을 유도한다면, 이는 오염되지 않은 것으로 간주될 것이다. 각 시험 로트를 1회, 또는 수회에 걸쳐 시험할 수 있다. 예를 들어, 하나의 기준 로트 방법에 따라, 제품이 4명의 기증자중 4명에서, 또는 8명의 기증자중 7명에서 오염되지 않은 기준 로트에서의 IL-6만큼의 2배 이하로 방출을 유도한다면 상기 제품은 오염되지 않은 것으로 간주되었고; 시험은 4명의 상이한 기증자의 혈액을 사용하여 4회에 걸쳐 수행되었다. 바람직한 기준 로트 방법은 문헌 [Gaines-Das et al., 2004]에 기재되어 있는데, 여기서, 시험 샘플은 기준보다 더 적은 IL-6의 방출을 자극시켜야 한다. 상기 논문에서 시험 시료는 4명의 상이한 기증자로부터 얻은 PBMNC를 사용한 시험에 통과하여야 한다. 시험 시료가 4명중 3명으로부터 얻은 PBMNC를 사용한 시험에 통과하였다면, 추가 4명의 기증자로부터 얻은 PBMNC를 사용하여 시험을 계속하는데, 이들 4명중 어느 누구도 1차 시험에서는 PBMNC를 제공하지 않으며, 시험 시료는 8명의 상이한 기증자중 7명으로부터 얻은 PBMNC를 사용한 시험에 통과하여야 한다.
이롭게는, 본 발명의 단핵구 활성화 시험은 예로서, 혈액용 제품, 정맥내 투여용 용액, 및 백신과 같은 의료용 제품에서 비-내독소 발열 물질을 비롯한, 광범위한 발열 물질의 존재를 보다 잘 검출할 수 있다.
정의
본원에서 사용되는 바, 용어 "순수한" 내독소 또는 비-내독소 발열 물질, 또 는 "순수한 형태"의 발열 물질은 그에 결합된 단백질이 제거된 내독소를 지칭한다. 순수한 내독소는 또한 지질다당류(LPS)로도 알려져 있다.
용어 "단핵구-함유 반응물"은 면역계의 단핵세포 백혈구 세포의 임의 용액을 의미한다. 바람직하게, 이들 세포는 시험하고자 하는 제품이 투여되는 유기체로부터 유래된다 (즉, 약제학적 제품의 경우 인간; 수의학용 제품의 경우, 고양이, 개, 말 등). 단핵구-함유 반응물의 일례는 인간 전혈이다.
용어 "검정 시스템"은 단핵구 활성화 시험에 사용될 수 있는 임의의 용기 및 표면을 의미하며, 이는 세포가 배양되고, 시험 샘플과 함께 인큐베이션되는 용기 뿐만 아니라, 면역검정법에 사용될 수 있는, 항체가 결합되어 있는 표면과 용기를 포함한다. 바람직하게, 면역검정법을 실시하는 것과 관련하여 상기 용기는 웰중 표면에 항체가 결합되어 있는 미량역가 웰 플레이트이며, 웰에서 다수의 비색 효소-결합 면역흡착 검정법을 동시에 수행할 수 있고, 이는 ELISA 플레이트 판독기에 의해 자동으로 평가될 수 있다. 그러나, 기타 면역검정 시스템, 특히, 코팅된 표면이 반드시 용기 벽의 일부분일 필요는 없는 것도 기대된다. 예를 들면, 항체에 의해 코팅된 폴리스티렌 비드 또는 딥스틱을 함유하는 보다 큰 시험관도 본 발명에 사용될 수 있다.
용어 "단핵구 세포주"는 내인성 CD14 및/또는 톨-유사 수용체(TLRs)를 갖거나, CD14 및/또는 TLRs, 및 염증성/발열성 매개 인자에 대한 리포터 유전자로 형질감염된 임의의 세포주를 포함한다. 단, 세포주가 단핵구 상에 존재하는 "발열 물질 수용체"의 성분을 갖거나, 그로 형질감염되어 있다면, 세포주는 단핵세포일 필 요는 없으며: 이들 성분은 TLRs 및 CD14를 포함한다. 예를 들면, 인간 배아 신장(HEK) 세포는 이미 TLRs 대부분을 갖고 있고, 그들이 갖고 있는 않은 TLRs - TLR2 및 TLR4로, 및 CD14로도 안정적으로 형질감염시켜 단핵구와 충분히 유사하도록 만듦으로써 본 발명의 방법에서 기능을 발휘하도록 할 수 있다.
실시예 1
PBMC 제조 . PBMCs는 피콜 파크 플러스(Ficoll Paque Plus) (파마시아(Pharmacia) #17-1440-02)를 사용하여 밀도-구배 원심분리에 의해 4시간 이상 경과하지 않은 인간 헤파린화된 말초 혈액으로부터 단리시켰다. 칼슘 및 마그네슘을 함유하지 않는 둘베코스(Dulbecco's) 인산염 완충처리된 염수 (기브코(Gibco) #14190))로 2회에 걸쳐 세포를 세척하고, 최소 필수 배지(MEM) (기브코 #11090), HEPES 완충액 (기브코 #15630), 및 5 ㎕의 기증자 자신의 열-불활성화된 혈장 (즉, 최종 농도 2%)에 재-현탁시켰다. PBMCs를 필요한 세포 밀도로 희석시켰다 (1 ml당 800만개, 400만개, 200만개, 및 100만개의 PBMCs).
세포 배양 . 하기 미량역가 플레이트 상에서 4회에 걸쳐 세포 배양을 수행하였다: 코닝 코스타(Corning Costar) #3790, #3359. 100만개, 50만개, 25만개, 또는 13만개의 세포를 함유하는, 125 ㎕의 세포 현탁액을 각 웰에 가한 후, 125 ㎕의 시험 샘플 또는 표준 내독소 (0.0064-20 EU/mL)를 가하였다. 250 ㎕의 혼합물을 완만히 혼합하고, 37 ± 1℃, 5% CO2의 습윤 대기하에서 인큐베이션시켰다. 16 내지 24시간의 배양 기간 이후에, 분취량의 배양액을 수득하고, 1 대 2로, 및 1 대 50의 비율로 희석시키고, IL-6에 대하여 검정하였다.
IL -6에 대한 ELISA . 96-웰 플레이트 (임뮤론(Immulon) 4, 디넥스(Dynex) #011-010-3855)를 2-8℃에서 밤새도록 인큐베이션시켜 150 ㎕의 3 ㎍/mL 마우스 단일클론 IgG (중탄산염 완충액 (pH 9.5)에 용해된 R&D 시스템즈(R&D Systems) #MAB206)로 코팅시켰다. 300 ㎕ 세척 완충액 (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 사용하여 3회에 걸쳐 플레이트를 세척하였다. 200 ㎕의 차단 용액 (0.02 g/L 소 혈청 알부민, 분획 V, 프로테아제-무함유)을 가하여 플레이트 상의 비-특이적인 결합 부위를 차단시켰다. 300 ㎕의 동일한 세척 완충액을 사용하여 3회에 걸쳐 플레이트를 다시 세척하고, 100 ㎕의 샘플 (앞서, 샘플 희석액중 1 대 2로, 및 1 대 50의 비율로 희석됨) 또는 표준 (7.8-1000 pg/mL의, IL-6에 대한 WHO 국제 표준, #89/548)을 각 웰에 가하였다. 100 ㎕의 샘플 희석제를 각각의 미사용 웰에 가하였다. 플레이트를 실러 (팔콘(Falcon) #3073)로 도포하고, 1시간 ± 5분 동안 진탕시키면서 (대략 300 rpm) 인큐베이션시켰다.
이어서, 플레이트를 흡인시키고, 300 ㎕의 세척 완충액으로 5회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 100 ㎕의 0.2 ㎍/mL 비오틴화된 염소 항-인간 IL-6 항체 (R&D 시스템즈, #BAF206)를 각 웰에 가하고, 다시 플레이트를 실러로 도포하고, 1시간 ± 5분 동안 진탕시키면서 (대략 300 rpm) 인큐베이션시켰다.
이어서, 플레이트를 흡인시키고, 300 ㎕의 세척 완충액으로 5회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 100 ㎕의 0.2 ㎍/mL 알칼리성 포스파타제 (로크랜드(Rockland) #S000-05)를 각 웰에 가하고, 다시 플레이트를 실러로 도포하고, 1시간 ± 5분 동안 진탕시키면서 (대략 300 rpm) 인큐베이션시켰다.
플레이트를 흡인시키고, 300 ㎕의 세척 완충액으로 5회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 0.5 mM MgCl2를 포함하는 디에탄올아민 완충액중 200 ㎕의 1 mg/mL pNPP를 각 웰에 가하였다. 다시 플레이트를 실러로 도포하고, IL-6 표준 곡선에서 가장 큰 농도 (1000 pg/mL)가 405 nm에서 약 2.5 내지 3.0의 광학 밀도를 가질 때까지 실온에서 진탕시키면서 (대략 300 rpm) 인큐베이션시켰는데, 상기 지점에서 50 ㎕의 2M NaOH를 각 웰에 가함으로써 반응을 종결시켰다. 405 nm으로 설정된 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 반응 종결 후 30분 이내에 각 웰의 광학 밀도를 측정하였다.
도 1은 세포 밀도가 내독소 표준 (1 EU/ml) 및 엑스트라니얼® 양성 대조군에 대한 IL-6 반응에 미치는 효과를 나타낸다. 엑스트라니얼? 양성 대조군은 비-내독소 발열 물질로 오염되었고, 이러한 약물의 상기 로트의 인간 수혜자에서 약물 부작용을 유발하였지만, 이는 LAL 시험에서는 음성 반응을 나타내었다 (문헌 [Martis et al. 2005]). 값은 4개의 복제 웰의 평균의 평균 ± 표준 오차이다. 웰당 25만개 내지 100만개의 세포 밀도로 1 EU/ml 내독소 표준에 유사하게 반응하였다. 웰당 100만개 > 50만개 > 25만개 > 13만개의 세포를 사용함으로써 양성 대 조군 샘플이 가장 잘 검출되었다.
실시예 2 - 비교 발열 물질 시험
당업계의 현 상태와 같이 본원에 기술된 방법을 반복하였다. 이들 방법들 중 어느 것도 음성 제품 대조군으로부터 엑스트라니얼? 복막 투석액, 헤모글로빈, 및/또는 덱스트란의 양성 제품 대조군을 식별하지 못했다.
문헌 [Hoffman et al., 2005]의 검정법은 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이 바닥이 평평한 웰과 IL-6 정보판독물과 함께 폴리스티렌 미량역가 플레이트를 사용하여 반복되었다. 단핵구-함유 반응물은 낮은 세포 밀도로 사용되었고, 이는 각각 도 2-5에서 전혈 (웰당 75,000개의 세포), PBMCs (웰당 100,000개의 세포), MONOMAC-6 (웰당 250,000개의 세포), 또는 THP-1 (웰당 250,000개의 세포)이었다. 도 5에서는 IL-6이 본 발명의 방법에서 내인성 발열 물질 (네오프테린과 대조를 이룸)이고, 보다 강력한 정보판독물이기 때문에 네오프테린을 대신하여 IL-6 정보판독물로 치환하였음에 주의한다. 도 6에서, 낮은 세포 밀도의 THP-12A9 세포 (웰당 250,000개의 세포)를 단핵구-함유 반응물로서 사용하였고, TNF가 정보판독물이었다.
문헌 [Nakagawa et al.]의 검정법은 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, 단핵구-함유 반응물로서 1 ml당 1,000,000개의 MONOMAC-CA8 클론 세포, IL-6 정보판독물, 및 바닥이 평평한 웰을 포함하는 폴리스티렌 미량역가 플레이트를 사용하여 반복되었다. 도 7을 참조할 수 있다.
문헌 [Yamamoto et al.]의 검정법은 상기 문헌에 기술되어 있는 바와 같이, 단핵구-함유 반응물로서 1 ml당 1,000,000개의 28C 세포, IL-6 정보판독물, 및 바닥이 평평한 웰을 포함하는 폴리스티렌 미량역가 플레이트를 사용하여 반복되었다. 도 8을 참조할 수 있다. 그러나, 28C 세포는 인터페론 감마보다는 칼시트리올 (100 ng/nl)으로 초회감작시켰는데, 이는 후자가 내독소 표준에 대한 용량-반응 곡선을 제공하지 못했기 때문이다.
실시예 3 - 본 발명의 발열 물질 시험
20% 인간 전혈 (40 ㎕ = 대략 60,000개의 PBMC/웰 = 대략 300,000개의 PBMC/ml)의 배양물 (200 ㎕)의 배양을 96-웰의, 바닥이 둥근 폴리프로필렌 플레이트 (코스타 #3790, 미국에 소재하는 코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated)) 상에서 4회에 걸쳐 수행하였다. 웰당 MEM-HEPES (60 ㎕), 1명의 기증자로부터 얻은 혈액 (40 ㎕), 내독소 표준 또는 MEM-HEPES로 1:1로 희석된 엑스트라니얼® 샘플 (100 ㎕, 즉, 엑스트라니얼? 용액은 웰중 최종적으로는 1:4로 희석됨)을 가하였다. 웰의 내용물을 완만히 와류시키면서 혼합시키고 (오염 웰은 교차시키지 않는다), 공기중 5% CO2 대기하에 16-24시간 동안 37℃에서 (세포가 침전될 수 있도록 하기 위해) 진동없이 인큐베이션시켰다. 조직 배양물의 인큐베이션이 끝나면, ELISA에 의해 IL-6을 검정하기 위하여 각 웰로부터 100 ㎕ 분취량의 투명한 상등액을 채취하였다.
덱스트란 샘플에 대하여 사용된 방법은 상기 실시예 1에 기재되어 있는 것과 유사하였다. 세포 단리 및 배양은 유사하였는데, 단, 세포 밀도는 웰당 400,000개의 세포였고, ELISA에 사용된 샘플 희석율은 1:10이었다. IL-6 ELISA는, 클론(Clone)16 단일클론 항체 (IL-6의 포획을 위해), 및 검출용 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 양 다중클론 항체로 코팅된 플레이트를 사용하였다는 점에서 상이하였다. ELISA는 2005년 호프만(Hoffmann) 등의 논문에 기재되어 있는 바와 같이, 전혈/IL-6 시험 (NIBSC)에서 및 PBMC/IL-6 시험 (노바티스(Novartis))에서 사용된다.
도 9는 엑스트라니얼? 음성 대조군 샘플 및 엑스트라니얼? 양성 대조군 샘플, 및 덱스트란 음성 대조군 샘플 및 덱스트란 양성 대조군 샘플에 대한 비교 결과를 도시한다. 본 발명의 발열 물질 시험이 이들 양성과 음성 대조군 사이를 용이하게 식별할 수 있음을 알 수 있다. 1명의 기증자로부터 얻은 혈액을 사용하여 상기 기술된 프로토콜에 따라 4회에 걸쳐 시험을 수행하였다. 값은 4개의 복제 웰의 평균의 평균 ± 표준 오차이다.
도 10은 엑스트라니얼? 음성 대조군 샘플 및 엑스트라니얼? 양성 대조군 샘플에 대한 비교 결과를 도시한다. 본 발명의 발열 물질 시험이 이들 양성과 음성 대조군 사이를 용이하게 식별할 수 있음을 알 수 있다. 1명의 기증자로부터 얻은 혈액을 사용하여 상기 기술된 프로토콜에 따라 4회에 걸쳐 시험을 수행하였다. 값은 4개의 복제 웰의 평균의 평균 ± 표준 오차이다. 전혈이 단핵구-함유 반응물이고, 바닥이 둥근 폴리프로필렌 웰이 사용되었을 때에는 음성 엑스트라니얼 대조군 으로부터 양성 엑스트라니얼 대조군을 식별하기에는 낮은 세포 밀도도 충분하였다는 것에 주목한다.
실시예 4 - 본 발명의 발열 물질 시험: 1명의 기증자에 대하여
폴리프로필렌 플레이트 대 폴리스티렌 플레이트, 및 IL -6 대 IL -1 β 에 관한 비교 결과
시험 샘플은 실시예 1의 방법에 따라 제조하였는데, 단, 예외적으로, 웰당 100만개의 세포의 세포 밀도를 사용하였고, 몇몇 샘플은 IL-1β 정보판독물에 시험되었고, 몇몇 샘플은 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 미량역가 플레이트에 배치되었다. 도 11A는 양성 대조군에 대한 IL-6 반응이 폴리프로필렌 플레이트에서 수행된 시험에 대한 음성 대조군으로부터 뚜렷히 식별되었지만, 폴리스티렌 플레이트에서 수행된 시험에 대한 것에 대해서는 식별되지 못했음을 나타낸다. 값은 4개의 복제 웰의 평균의 평균 ± 표준 오차이다. 도 11B는 양성 대조군에 대한 IL-1β 반응이 폴리프로필렌 플레이트에서 수행된 시험에 대한 음성 대조군으로부터 뚜렷히 식별되었지만, 폴리스티렌 플레이트에서 수행된 시험에 대한 것에 대해서는 식별되지 못했음을 나타낸다. 그러나, 도 11B에서의 반응 크기는 도 11A의 것보다 훨씬 작았는데, 이는 IL-1β가 IL-6와 비교하여 열악한 정보판독물이라는 것을 지시하는 것이다. 값은 4개의 복제 웰의 평균의 평균 ± 표준 오차이다.
실시예 5 - 본 발명의 발열 물질 시험: 여러 명의 기증자에 대하여
폴리프로필렌 플레이트 대 폴리스티렌 플레이트에 관한 비교 결과
시험 샘플은 실시예 1의 방법에 따라 제조하였는데, 단, 예외적으로, 웰당 88만개 및 100만개의 세포의 세포 밀도를 사용하였고, 3명의 기증자를 사용하였으며, 몇몇 샘플은 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 미량역가 플레이트에 배치되었고, IL-6 ELISA는 2005년 호프만 등의 논문에 기재되어 있는 바와 같이, 클론 16 단일클론 항체, 및 검출용 항체로서 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 양 다중클론 항체로 코팅된 플레이트를 사용하였다. 도 12A 및 12B는 각각 기증자 A의 경우, 웰당 88만개의 세포의 PBMC 세포 밀도에 대한, 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 미량역가 플레이트, 및 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 미량역가 플레이트에 관한 IL-6 반응을 도시한다. 기증자 A의 경우, 발열 물질 시험은 폴리스티렌 플레이트가 사용된 경우에는 양성과 음성 대조군을 식별하지 못했지만, 폴리프로필렌 플레이트가 사용된 경우에는 이들 대조군 사이를 식별하였다. 도 13A 및 13B는 각각 기증자 B의 경우, 웰당 100만개의 세포의 PBMC 세포 밀도에 대한, 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 미량역가 플레이트, 및 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 미량역가 플레이트에 관한 IL-6 반응을 도시한다. 기증자 B의 경우, 2개의 발열 물질 시험 모두 양성과 음성 대조군 사이를 식별하였지만, 폴리프로필렌 플레이트를 사용한 경우에는, 양성 대조군에 대한 IL-6 반응이 음성 대조군의 것의 약 6배였지만, 폴리스티렌 플레이트를 사용한 경우에는, 단지 약 2배 정도였다. 도 14A 및 14B는 각각 기증자 C의 경우, 웰당 88만개의 세포의 PBMC 세포 밀도에 대한, 바닥이 둥근 웰을 갖는 폴리프로필렌 미량역가 플레이트, 및 바닥이 평평한 웰을 갖는 폴리스티렌 미량역가 플레이트에 관한 IL-6 반응을 도시한다. 기증자 B의 경우, 2개의 발열 물질 시험 모두 양성과 음성 대조군 사이를 식별하였지만, 양성 대조군에 대한 IL-6 반응이 폴리프로필렌 플레이트 대 폴리스티렌 플레이트 사용할 때의 약 2배 정도였다. 폴리프로필렌에서 엑스트라니얼? 양성 대조군에 대한 반응은 최대량의 LPS 표준, 즉 0.4 EU/ml에 대한 반응을 초과하는 반면, 폴리스티렌에서 엑스트라니얼? 양성 대조군에 대한 반응은 최소량의 LPS 표준, 즉 0.1 EU/ml에 대한 반응보다 작다는 것에 주목한다.
실시예 6 - 비교 발열 물질 시험: IPT (찰스 리버 라보라토리즈 )
IL-1β 및 폴리스티렌 미량역가 플레이트를 사용하는 전혈 자극에 관한 검정법을 사용하는 본 시험을 실시할 때 사용한 방법은 엔도세이프® 인 비트로 피로젠 테스트 사용 설명서 (찰스 리버 라보라토리즈로부터 상업적으로 이용가능(PIIPT10002))에 기재되어 있다. 도 15는, 키트가 LPS 표준에 반응하고, 그램-양성 세균으로부터의 리포테이콘산의 키트 양성 대조군에 반응하지만, IPT 시험은 엑스트라니얼® 및 헤모글로빈 양성과 음성 대조군 사이를 식별하지 못했음을 나타낸다.
실시예 7 - 냉동 보관된 세포를 사용한
본 발명의 발열 물질 시험
혈장 및 디메틸 설폭시드 (또는 전혈 및 디메틸 설폭시드)중 세포 현탁액 (예컨대, 100만개의 PBMC 또는 단핵구 세포)을 바닥이 둥근, 250 ㎕ 웰을 갖는 96-웰 폴리프로필렌 플레이트의 각 웰에 가한 후, 실링하고, 냉동 보관한다.
시험 당일, 플레이트를 해동시키고, 실온으로 하고, 실을 제거하고, 96-웰 인서트를 위치 내로 단단히 밀어넣었다. 인서트는 폴리프로필렌의 벽과, 세포에는 투과성이지만 액체에는 비투과성인 장벽인 평평한 바닥을 갖는다.
세포-장벽 위쪽의 용액을 흡인시키고, 버리기 앞서, 인서트를 새로운 배지로 충진시키고, 배지를 상하로 흡인시켜 세포-장벽 위아래의 용액을 혼합함으로써 DMSO를 세척해 낸다. 세척 단계를 5회 반복하여 세포에는 본질적으로 DMSO가 존재하지 않도록 하고, 세포는 용량을 아는 새로운 배지내 유지된다.
시험 샘플 또는 표준, 및 추가의 새로운 배지를 인서트에 가하고, 이러한 용액을 상하로 흡인시켜 세포-장벽 위아래의 용액을 혼합함으로써 샘플 또는 (발열 물질) 표준 내의 발열 물질이 세포로 접근할 수 있도록 한다.
플레이트를 16-24 시간 동안 습윤 대기중 5% 이산화탄소 기체하에 37±1℃에서 인큐베이션시킨다. 인큐베이션시, 세포가 서로 접촉하여 발열 물질-자극성 IL-6 방출을 촉진시킬 수 있도록 세포를 침전시킨다. 인큐베이션 기간이 끝나면, IL-6을 검정하기 위해 분취량의 세포-조건화 배지를 채취하기 앞서, 세포-장벽 위쪽 용액을 상하로 흡인시켜 세포-장벽 위아래의 용액을 완벽하게 혼합한다.
냉동 보관된 PBMCs는 전세계에 걸쳐 드라이아이스 상에서 쉽게 배송될 수 있기 때문에 이롭다. 폴리스티렌과는 달리, 폴리프로필렌은 갈라짐 없이 액체 질소에 대한 내구성을 갖는다. 도착시 PBMCs를 해동하고 DMSO 없이 세척만 하면, 제공되는 플레이트 인서트와 함께 시험에 사용할 수 있는 준비가 완료된다. 웰당 최적 갯수로 세포를 배송하고, 플레이트 인서트와 함께 세포를 사용함으로써 최종-사용 자에게 개선된 시험 키트를 제공한다. 종래 키트의 경우, 관 내에 있는 세포가 배송되고, 일단 해동되면, 원심분리에 의해 세척되며, 이를 통해 세포는 펠릿화되고, 이로써 깨끗한 배지에 분산될 수 있다. 이러한 방식으로 보통 세포는 2 또는 3회 세척된다. 이어서, 세포를 웰에 분산시키기 이전에 계수하고, 원하는 세포 밀도로 재-현탁시켜야 한다. 세포 손실, 활성화, 및 세포 사멸을 일으킬 수 있는 종래 시험과 비교하여 본 발명의 발열 물질 시험은 노동 집약성이 더 낮고, 시간이 덜 소비되며, 세포에 대한 손상이 더 작다.
본 발명의 요소 또는 그의 바람직한 실시태양(들)을 소개할 때, 조사 "하나(a),", "하나(an)," "그" 및 "상기"는 하나 이상의 요소가 존재한다는 것을 의미하고자 한다. "포함하는(comprising)," "포함하는(including)" 및 "갖는(have)"이라는 용어는 포괄적인 것을 의도하며, 이는 열거한 요소들 이외의 추가 요소도 존재할 수 있음을 의미한다. 본 발명의 범주를 벗어나지 않으면서 상기 방법과 조성물을 다양하게 변경할 수 있는 바, 상기 명세서에 포함된 모든 사항은 예시적인 것이지, 제한적 의미로 해석되서는 안된다.

Claims (57)

  1. 샘플 내의 비-내독소 발열 물질을 검출하는 방법이며,
    바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물(reagent)이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 복수의 미량역가 웰을 포함하는 미량역가 플레이트를 포함하는 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물과 시험하고자 하는 샘플을 조합하는 단계 - 여기서 미량역가 웰의 표면은 폴리프로필렌 코팅을 포함하거나 또는 전체 미량역가 웰은 폴리프로필렌으로 구성됨 -;
    단핵구-함유 반응물 및 샘플을 인큐베이션시키는 단계 - 여기서 샘플이 발열 물질을 포함하는 경우, 단핵구-함유 반응물은 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자를 생성하고, 검정 시스템은 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 더 포함하거나 또는 상기 방법은 검정 시스템의 내용물을, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제2 검정 시스템으로 옮기는 단계를 더 포함함 -; 및
    표면 상의 항체에 결합한 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 검정 시스템 또는 제2 검정 시스템을 검정하는 단계 - 여기서 표면에 결합한 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 수준 증가는 시험된 샘플 내 발열 물질의 존재를 표시함 - 를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 미량역가 웰이 개방형 상단부, 상기 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부, 및 최저점 위쪽의 위치부터 최저점까지의 직경이 점점 줄어드는 바닥벽을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 미량역가 웰이 개방형 상단부; 상부 단부 및 바닥 단부를 갖는, 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부; 및 상부 단부 및 최저점을 갖고, 상부의 바닥 단부로부터 확장되어 있으며, 바닥부의 상부 단부로부터 최저점 방향으로 상부에서보다 더욱 급격하게 직경이 줄어드는 바닥부를 포함하는 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 미량역가 웰의 바닥 벽이 비-평면형, 곡선형, 파라볼릭형, 또는 하향 확장형인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 미량역가 웰 측면이 내향으로 경사져 있는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 상기 미량역가 웰의 내부의 적어도 일부에 적용되는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 내인성 매개 인자가 엔도텔린인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 사이토카인이 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-1ra(IL-1ra), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 사이토카인이 IL-6인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 검정 시스템(들)이 비색 효소-결합 면역흡착 검정법(ELISA), 방사성-표지 면역검정법, 또는 형광-표지 면역검정법인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 또는 단핵구 세포주 세포를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단핵구 세포주가 인간 단핵구 세포주를 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단핵구 세포주가 MONOMAC-6, THP-1 및 28SC로 구성된 군으로부터 선택된 인간 단핵구 세포주를 포함하는 것인 방법.
  15. 제12항에 있어서, 단핵구 세포주가 내인성 CD14 또는 톨-유사 수용체를 갖는 세포주 및 CD14, 톨-유사 수용체 및, 염증성 또는 발열성 매개 인자에 대한 리포터 유전자 중 1종 이상으로 형질감염된 세포주를 포함하는 것인 방법.
  16. 제12항에 있어서, PBMC가 인간 PBMC인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 상기 검정 시스템 내 웰당 250,000개 이상, 500,000개 이상, 600,000개 이상, 700,000개 이상, 800,000개 이상, 900,000개 이상, 1,000,000개 이상, 1,100,000개 이상, 1,200,000개 이상, 1,300,000개 이상, 1,400,000개 이상, 1,500,000개 이상, 1,600,000개 이상, 1,700,000개 이상, 1,800,000개 이상, 1,900,000개 이상 또는 2,000,000개 이상 세포의 세포 밀도로 존재하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 전혈을 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 전혈이 인간 전혈인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 희석제, 항응고제, 또는 희석제와 항응고제 둘 다를 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액용 제품, 투석액, 백신 및 혈장 확장제로 구성된 군으로부터 임의로 선택된, 비경구적으로 투여되는 의료용 제품인 방법.
  22. 단핵구-함유 반응물, 및
    바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 복수의 미량역가 웰을 포함하는 미량역가 플레이트를 포함하고,
    여기서 미가역가 웰의 표면은 폴리프로필렌 코팅을 포함하거나 또는 전체 미량역가 웰은 폴리프로필렌으로 구성되고, 검정 시스템은 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 더 포함하거나 또는 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제2 검정 시스템을 포함하고, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자는 발열 물질을 포함하는 샘플에 노출될 때 단핵구-함유 반응물에 의해 생성되는 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자인, 발열 물질 존재 진단 또는 약제, 영양제 및 의료용 제품의 안전성 확인용 진단용 키트.
  23. (a) 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 1개 이상의 미량역가 웰을 포함하는 제1 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물과 시험하고자 하는 샘플을 조합하는 단계 - 여기서 미량역가 웰의 표면은 폴리프로필렌 코팅을 포함하거나 또는 전체 미량역가 웰은 폴리프로필렌으로 구성됨 -;
    (b) 단핵구-함유 반응물 및 샘플을 인큐베이션시키는 단계;
    (c) 제1 검정 시스템의 내용물을, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제2 검정 시스템으로 옮기는 단계; 및
    (d) 표면 상의 항체에 결합한 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 제2 검정 시스템을 검정하는 단계
    를 포함하는, 발열 물질 존재 진단 또는 약제, 영양제 및 의료용 제품의 안전성 확인용 시험관 내 시험.
  24. (a) (i) 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 1개 이상의 미량역가 웰 - 여기서 미량역가 웰의 표면은 폴리프로필렌 코팅을 포함하거나 또는 전체 미량역가 웰은 폴리프로필렌으로 구성됨 -, 및 (ii) 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제1 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물과 시험하고자 하는 샘플을 조합하는 단계;
    (b) 단핵구-함유 반응물 및 샘플을 인큐베이션시키는 단계; 및
    (c) 표면 상의 항체에 결합한 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 검정 시스템을 검정하는 단계
    를 포함하는, 발열 물질 존재 진단 또는 약제, 영양제 및 의료용 제품의 안전성 확인용 시험관 내 시험.
  25. 복수의 미량역가 웰을 포함하는 미량역가 플레이트를 포함하는 검정 시스템 - 각 웰은, 단핵구-함유 반응물이 미량역가 웰 내에 존재할 때, 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화됨 - 을 포함하고, 여기서 웰의 표면은 폴리프로필렌 코팅을 포함하거나 또는 전체 웰은 폴리프로필렌으로 구성되고, 검정 시스템은 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 더 포함하거나 또는 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제2 검정 시스템을 포함하고, 사이토카인 또는 내인성 매개 인자는 단핵구-함유 반응물에 의해 생성된 것인 발열 물질 존재 진단 또는 약제, 영양제 및 의료용 제품의 안전성 확인용 진단용 키트.
  26. 제22항 또는 제25항에 있어서, 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물을 포함하고, 상기 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물이 미량역가 플레이트와는 별도로 최종-사용자에게 공급되는 것인 진단용 키트.
  27. 제26항에 있어서, 상기 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물이 드라이 아이스 상에서 배송됨으로써 최종-사용자에게 공급되는 것인 진단용 키트.
  28. 제26항에 있어서, 상기 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물이 웰 당 100,000개 이상의 세포로 분취되어 최종-사용자에게 공급되는 것인 진단용 키트.
  29. 제26항에 있어서, 상기 냉동 보관된 단핵구-함유 반응물이 냉동 보관된 말초 혈액 단핵 세포, 냉동 보관된 단핵구 세포주 세포 또는 냉동보관된 전혈을 포함하는 것인 진단용 키트.
  30. 제29항에 있어서, 상기 냉동 보관된 단핵구 세포주가 MONOMAC-6, THP-1, 28SC, CD14 또는 톨-유사 수용체를 갖는 세포주, 및 CD14, 톨-유사 수용체 또는 염증성 또는 발열성 매개 인자에 대한 리포터 유전자로 형질감염된 세포주로 구성된 군으로부터 선택된 인간 단핵구 세포주를 포함하는 것인 진단용 키트.
  31. 제22항 또는 제25항에 있어서, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체를 추가로 포함하는 것인 진단용 키트.
  32. 제31항에 있어서, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자가 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-1ra(IL-1ra), 인터루킨-6(IL-6), 인터루킨-8(IL-8), 종양 괴사 인자-α(TNF-α) 및 엔도텔린으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 진단용 키트.
  33. 제31항에 있어서, 미량역가 플레이트의 미량역가 웰 중 1 이상의 표면이 항체로 처리된 것인 진단용 키트.
  34. 제31항에 있어서, 항체로 처리된 1 이상의 표면을 포함하는 제2 미량역가 플레이트를 추가로 포함하는 것인 진단용 키트.
  35. 제22항 또는 제25항에 있어서, 다수의 미량역가 웰 각각이 개방형 상단부, 상기 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부, 및 최저점 위쪽의 위치부터 최저점까지의 직경이 점점 줄어드는 바닥벽을 포함하는 것인 진단용 키트.
  36. 제22항 또는 제25항에 있어서, 다수의 미량역가 웰 각각이 개방형 상단부; 상부 단부 및 바닥 단부를 갖는, 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부; 및 상부 단부 및 최저점을 갖고, 상부의 바닥 단부로부터 확장되어 있으며, 바닥부의 상부 단부로부터 최저점 방향으로 상부에서보다 더욱 급격하게 직경이 줄어드는 바닥부를 포함하는 것인 진단용 키트.
  37. 제22항 또는 제25항에 있어서, 다수의 미량역가 웰 각각의 바닥 벽이 비-평면형, 곡선형, 파라볼릭형, 또는 하향 확장형이거나 미량역가 웰의 측면이 내향으로 경사져 있는 것인 진단용 키트.
  38. 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 1개 이상의 미량역가 웰을 포함하는 제1 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물과 시험하고자 하는 샘플을 조합하는 단계 - 여기서 미량역가 웰의 표면은 폴리프로필렌 코팅을 포함하거나 또는 전체 미량역가 웰은 폴리프로필렌으로 구성됨 -;
    단핵구-함유 반응물 및 샘플을 인큐베이션시키는 단계;
    제1 검정 시스템의 내용물을, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 제2 검정 시스템으로 옮기는 단계; 및
    표면 상의 항체에 결합한 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 제2 검정 시스템을 검정하여 샘플을 검사하는 단계
    를 포함하는, 발열 물질 존재 진단 또는 약제, 영양제 및 의료용 제품의 안전성 확인용 샘플 시험 방법.
  39. 제38항에 있어서, 샘플이 약제, 영양제 및 의료용 제품인 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자가 전염증성 사이토카인 또는 Th1 사이토카인인 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자가 TNF-α, IL-2, IFN 또는 IL-8인 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 미량역가 웰이 개방형 상단부, 상기 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부, 및 최저점 위쪽의 위치부터 최저점까지의 직경이 점점 줄어드는 바닥벽을 포함하는 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 미량역가 웰이 개방형 상단부; 상부 단부 및 바닥 단부를 갖는, 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부; 및 상부 단부 및 최저점을 갖고, 상부의 바닥 단부로부터 확장되어 있으며, 바닥부의 상부 단부로부터 최저점 방향으로 상부에서보다 더욱 급격하게 직경이 줄어드는 바닥부를 포함하는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 미량역가 웰의 바닥 벽이 비-평면형, 곡선형, 파라볼릭형, 또는 하향 확장형이거나 미량역가 웰의 측면이 내향으로 경사져 있는 것인 방법.
  45. 제38항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 말초 혈액 단핵 세포 또는 단핵구 세포주 세포를 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 단핵구 세포주가 MONOMAC-6, THP-1, 28SC, CD14 또는 톨-유사 수용체를 갖는 세포주, 및 CD14, 톨-유사 수용체 및 염증성 또는 발열성 매개 인자에 대한 리포터 유전자 중 1 종 이상으로 형질감염된 세포주로 구성된 군으로부터 선택된 인간 단핵구 세포주를 포함하는 것인 방법.
  47. 제38항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 제1 검정 시스템 내 웰당 125,000개 이상의 세포를 공급하기에 충분한 수의 세포를 포함하는 것인 방법.
  48. (i) 바닥이 평평한 미량역가 웰과 비교하여 세포 대 세포 접촉이 더 많이 이루어지게 하기 위하여 단핵구-함유 반응물이 한 곳으로 모일 수 있도록 하는 형상으로 성형화된 1개 이상의 미량역가 웰 - 여기서 미량역가 웰의 표면은 폴리프로필렌 코팅을 포함하거나 또는 전체 미량역가 웰은 폴리프로필렌으로 구성됨 -, 및 (ii) 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자에 대한 항체로 처리된 1개 이상의 표면을 포함하는 검정 시스템에서 단핵구-함유 반응물과 시험하고자 하는 샘플을 조합하는 단계;
    단핵구-함유 반응물 및 샘플을 인큐베이션시키는 단계; 및
    표면 상의 항체에 결합한 사이토카인 또는 내인성 매개 인자의 존재에 관하여 검정 시스템을 검정하여 샘플을 검사하는 단계
    를 포함하는, 발열 물질 존재 진단 또는 약제, 영양제 및 의료용 제품의 안전성 확인용 샘플 시험 방법.
  49. 제48항에 있어서, 샘플이 약제, 영양제 및 의료용 제품인 것인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자가 전염증성 사이토카인 또는 Th1 사이토카인인 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 사이토카인 또는 염증 반응의 내인성 매개 인자가 TNF-α, IL-2, IFN 또는 IL-8인 것인 방법.
  52. 제48항에 있어서, 미량역가 웰이 개방형 상단부, 상기 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부, 및 최저점 위쪽의 위치부터 최저점까지의 직경이 점점 줄어드는 바닥벽을 포함하는 것인 방법.
  53. 제48항에 있어서, 미량역가 웰이 개방형 상단부; 상부 단부 및 바닥 단부를 갖는, 개방형 상단부로부터 하향으로 확장된 상부; 및 상부 단부 및 최저점을 갖고, 상부의 바닥 단부로부터 확장되어 있으며, 바닥부의 상부 단부로부터 최저점 방향으로 상부에서보다 더욱 급격하게 직경이 줄어드는 바닥부를 포함하는 것인 방법.
  54. 제52항에 있어서, 상기 미량역가 웰의 바닥 벽이 비-평면형, 곡선형, 파라볼릭형, 또는 하향 확장형이거나 미량역가 웰의 측면이 내향으로 경사져 있는 것인 방법.
  55. 제48항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 말초 혈액 단핵 세포 또는 단핵구 세포주 세포를 포함하는 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 단핵구 세포주가 MONOMAC-6, THP-1, 28SC, CD14 또는 톨-유사 수용체를 갖는 세포주, 및 CD14, 톨-유사 수용체 및 염증성 또는 발열성 매개 인자에 대한 리포터 유전자 중 1 종 이상으로 형질감염된 세포주로 구성된 군으로부터 선택된 인간 단핵구 세포주를 포함하는 것인 방법.
  57. 제48항에 있어서, 단핵구-함유 반응물이 검정 시스템 내 웰당 125,000개 이상의 세포를 공급하기에 충분한 수의 세포를 포함하는 것인 방법.
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