DE60300580T2

DE60300580T2 - Trennverfahren und vorrichtung zur durchführung eines solchen verfahrens

Info

Publication number: DE60300580T2
Application number: DE60300580T
Authority: DE
Inventors: Anders Alderborn; David Peterson; Anna-Lotta Schiller; Björn INGEMARSSON
Original assignee: Biotage AB
Current assignee: Qiagen Instruments AG
Priority date: 2002-02-12
Filing date: 2003-02-12
Publication date: 2006-01-19
Anticipated expiration: 2023-02-13
Also published as: CN1628171A; JP2005517408A; WO2003068962A1; ATE294235T1; DE60300580D1; EP1474511A1; US20050019775A1; AU2003206347A1; CN100335629C; US8129174B2; JP4399266B2; EP1474511B1

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen von Trägern aus einer Lösung, wobei die Träger zur Anlagerung von Biomolekülen eingerichtet sind, insbesondere ein Verfahren zum Herstellen einsträngiger Proben von genetischem Material unter Verwendung eines solchen Trennverfahrens. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung derartiger Verfahren. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Einwegartikel, welcher an einer derartigen Vorrichtung angebracht werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Verfahren zum Analysieren genetischen Materials erfordern oft die Amplifikation der Nukleinsäureprobe als ersten Verfahrensschritt. Dies erfordert wiederum manchmal den Verfahrensschritt, die beiden Stränge der doppelsträngigen DNA-Probe (dsDNA) zu trennen. Dabei wird ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren verwendet, welches als Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) bekannt ist. Gemäß einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird die dsDNA-Probe amplifiziert, indem ein Primerpaar, von dem ein Primer biotinyliert ist, in ein Behältnis gegeben wird, das eine Lösung der dsDNA-Probe enthält. Dann werden mit Streptavidin beschichtete Partikel zu der Lösung gegeben, und durch weitere Zugabe eines Bindepuffers wird die amplifizierte dsDNA auf den Partikel immobilisiert.
Diese Partikel können aus Sepharose bestehen, und ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren zur Herstellung einzelsträngiger DNA (ssDNA) ist das Folgende: Zunächst wird das Behältnis mit der immobilisierten dsDNA auf eine Vakuumstation gesetzt. Der Boden des Behältnisses wird mit einem Filter versehen, dessen Porendurchmesser kleiner als die Größe der Sepharose-Partikel ist. Wenn ein Unterdruck an die Unterseite des Filters angelegt wird, bleiben die Partikel aus der Lösung auf dem Filter zurück, während die Lösung durch den Filter abgesaugt wird, bspw. in einen Flüssigkeitssammler. Im nächsten Schritt wird Natriumhydroxid in das Behältnis gegeben, wodurch die Stränge der dsDNA in ssDNA getrennt werden, worauf das Natriumhydroxid abgesaugt wird. Dabei werden die ssDNA-Stränge, die nicht an die Partikel gebunden sind, mit abgesaugt, während die gebundenen ssDNA-Stränge auf dem Filter aufgefangen werden. In einem weiteren Schritt wird das verbliebene Natriumhydroxid neutralisiert, indem ein- oder mehrmals ein Waschpuffer hinzugefügt wird, und in einem letzten Schritt, bei dem der Unterdruck weggenommen wird, wird eine Lösung zum Resuspendieren der aufgefangenen Partikel in der Lösung hinzugefügt. Diese Partikel mit den daran angelagerten ssDNA-Strängen können nun für die weitere Präparation oder für die Analyse der ssDNA aus diesem Behältnis in ein anderes Behältnis überführt werden.
Es ist jedoch schwierig, alle Partikel vollständig in der Lösung zu resuspendieren, weil die Partikel auf dem Filter aufgefangen sind und dort trotz der Versuche zur Resuspendierung haften bleiben. Es ist auch schwierig, alle Partikel durch Pipettieren zu erfassen. Dies wird zudem noch erschwert, wenn die Flüssigkeitssäulen in den Näpfen von geringer Höhe sind, was das Pipettieren noch schwieriger macht. Außerdem ist das erwähnte Behältnis in der Regel ein Multiwell-Behältnis mit zahlreichen Näpfen (wells), zum Beispiel eine Mikrotiterplatte (MTP) mit bspw. 96, 384, 1536 oder 6144 einzelnen Näpfen, und wiederholtes Pipettieren ist zudem wegen möglicher Beschädigung durch Belastung nachteilig.
Ein weiteres im Stand der Technik bekanntes Verfahren, welches in der GB 99 233 249 offenbart ist, nutzt magnetische Partikel anstelle von Sepharose-Partikeln. Gemäß diesem Verfahren wird ein Magnet in das Behältnis, bspw. in den Napf einer MTP, eingebracht, wobei die mit Streptavidin beschichteten magnetischen Partikel vom Magneten angezogen und festgehalten werden. So können die magnetischen Partikel ebenso wie die gebundene dsDNA aus diesem Behältnis entfernt und in ein anderes Behältnis überführt werden, welches zum Beispiel eine die Stränge trennende Lösung, bspw. Natriumhydroxid, enthält. Auf diese Weise wird die dsDNA in ssDNA getrennt, wobei die ersten Stränge in der Lösung suspendiert sind und gegebenenfalls abgesaugt werden, während die zweiten Stränge an den Partikel gebunden bleiben. Diese letzteren Stränge können nun für die weitere Präparation oder für die Analyse in ein anderes Behältnis überführt werden.
Magnetische Partikel sind jedoch teurer als Sepharose-Partikel, und die Verwendung von Sepharose-Partikeln führt zu einer besseren Qualität von Sequencing-by-Synthesis-Verfahren.
Ein anderes im Stand der Technik bekanntes Verfahren, welches in der US 6 156 550 offenbart ist, betrifft das Überführen von Partikel aus einer Lösung in eine andere Lösung. Dieses Verfahren beschreibt, wie Sepharose-Partikel an die Oberfläche eines Polymers angelagert werden können. Das Problem mit an ein Trägermaterial gebundenen Partikeln besteht darin, dass an eine Oberfläche gebundene Partikel sich biochemisch oder physikalisch nicht wie Partikel in einer Lösung verhalten, so dass die weitere Analyse der ssDNA schwierig ist.
Bei einem weiteren im Stand der Technik bekannten Verfahren, welches in der JP 58223759 offenbart ist, werden Partikel zwischen zwei Röhrchen bewegt. Eine Kanüle 16 wird in ein erstes Röhrchen 17 getaucht, wo sie durch Anlegen eines Vakuums einen Partikel B anzieht. Dann wird die Kanüle 16 zu einem zweiten Röhrchen 18 verbracht, wo durch Beaufschlagen mit ei nem Gegendruck der Partikel B im zweiten Teströhrchen freigegeben wird. Während der ganzen Bewegung wird das Vakuum in der Kanüle aufrechterhalten. Die Kanüle kann jedoch nur große Partikel bewegen, die an die Spitze der Kanüle gezogen werden und dort haften bleiben. Kleine Partikel würden zusammen mit der in den Teströhrchen enthaltenen Flüssigkeit weggesaugt werden.
AUFGABE DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zum Abtrennen von Trägern wie bspw. Sepharose-Partikel aus Lösungen bereit zu stellen, wobei die Träger als Träger für Biomoleküle dienen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wird gemäß der vorliegenden Erfindung gelöst mit einem Verfahren zum Abtrennen von Trägern aus einer Lösung, wobei die Träger zur Anlagerung von Biomolekülen wie DNA, RNA, Proteinen, Polypeptiden oder Kohlehydraten eingerichtet sind, welches Verfahren die folgenden Schritte aufweist: Einführen eines röhrenförmigen Objekts in ein Behältnis, welches eine Lösung mit den darin enthaltenen Trägern enthält; Eintauchen eines Endbereichs des röhrenförmigen Objekts in die Lösung; Anziehen und Festhalten der Träger an diesem Endbereich; Entfernen des röhrenförmigen Objekts zusammen mit den daran gehaltenen Trägern aus der Lösung. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass der Schritt des Anziehens und Festhaltens das Erzeugen eines Unterdrucks in dem röhrenförmigen Objekt vorsieht, so dass die Träger an einem im Endbereich des röhrenförmigen Objekts angeordneten Filter angezogen und daran festgehalten werden.
Diese Aufgabe wird ferner gelöst mit einer Vorrichtung zum Bewegen von Trägern zwischen verschiedenen Behältnissen, wobei die Träger zur Anlagerung von Biomolekülen wie DNA, RNA, Proteinen, Polypeptiden oder Kohle hydraten eingerichtet sind, enthaltend mindestens ein röhrenförmiges Objekt zum Einführen in ein Behältnis, welches eine Lösung mit den darin enthaltenen Trägern enthält, wobei das röhrenförmige Objekt einen Endbereich zum Eintauchen in die Lösung aufweist; sowie Mittel zum Anziehen und Festhalten der Träger an diesem Endbereich. Die Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass dieses Mittel einen im Endbereich angeordneten Filter aufweist.
Diese Aufgabe wird ebenfalls gelöst mit einem Verfahren zum Herstellen von einzelsträngiger DNA (ssDNA) aus doppelsträngiger DNA (dsDNA), enthaltend die Schritte: Immobilisieren eines der beiden Stränge der dsDNA auf Trägern in einem ersten Behältnis, welches eine erste Lösung enthält, wobei die Lösung die Träger und das dsDNA enthält; Anziehen und Festhalten dieser Träger an einem röhrenförmigen Objekt, welches in die erste Lösung eingetaucht ist; Bewegen des röhrenförmigen Objekts mit den daran festgehaltenen Trägern von dem ersten Behältnis zu einem zweiten Behältnis; Aufspalten der dsDNA in ssDNA im zweiten Behältnis; Entfernen des röhrenförmigen Objekts aus dem zweiten Behältnis, wodurch Träger mit immobilisierter ssDNA aus dem zweiten Behältnis entfernt werden. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass der Schritt des Anziehens und Festhaltens das Erzeugen eines Unterdrucks in dem röhrenförmigen Objekt vorsieht, so dass die Träger an einem im röhrenförmigen Objekt angeordneten Filter angezogen und daran festgehalten werden.
Diese Aufgabe wird auch gelöst mit einem Einwegartikel, welcher zur Befestigung an dem röhrenförmigen Objekt einer Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 9 eingerichtet ist, wobei dieser Einwegartikel mit einem Filter (25) zum Festhalten dieser Träger versehen ist.
Mit einem derartigen Verfahren und einer derartigen Vorrichtung können Träger wie zum Beispiel mit Streptavidin beschichtete Sepharose-Partikel zwischen verschiedenen Behältnissen, die verschiedene Lösungen enthalten, transferiert werden. Hiermit wird das gesamte Verfahren zur Herstellung von bspw. ssDNA oder zu einer anderen Probenherstellung von Hand sowohl einfacher als auch weniger arbeitsintensiv im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Sepharoseverfahren, aber auch preisgünstiger, weil die Verwendung magnetischer Partikel vermieden wird. Natürlich ist es immer noch möglich, die erfindungsgemäßen Verfahren und die erfindungsgemäße Vorrichtung zusammen mit magnetischen Partikeln zu verwenden, die als Träger für Biomoleküle dienen.
In geeigneter Weise enthalten diese Verfahren den Schritt, diese Träger durch Entfernen des Unterdrucks oder Erzeugen eines Überdrucks in dem röhrenförmigen Objekt vom Filter freizusetzen. Hierdurch wird die Freisetzung der Träger vom Filter verbessert.
Vorzugsweise wird jeder der vorstehend erwähnten Schritte gleichzeitig an einer Mehrzahl von Orten ausgeführt. Hierzu werden die Verfahren zur Verwendung mit Multiwell-Behältnissen, wie bspw. Mikrotiterplatten (MTR) mit 96, 384, 1536 oder 6144 Näpfen (wells) angepasst.
Das Verfahren wird bevorzugt zum Reinigen von Proteinen verwendet, besonders bevorzugt zum Reinigen von markierten Proteinen und ganz besonders bevorzugt zum Reinigung von mit Histidin markierten (His-markierten) Proteinen. Damit kann eine Reinigung im Multiwell-Format zum Screenen rekombinanter Bakterien auf Proteinherstellung verwendet werden.
In geeigneter Weise weist die Vorrichtung ein Gehäuse mit einem abgedichteten Innenraum auf, der mit einer Vakuumquelle zum Erzeugen eines Unterdrucks in dem Innenraum verbindbar ist, wobei das röhrenförmige Objekt in Fließverbindung mit dem Innenraum steht und wobei in besonders geeigneter Weise das röhrenförmige Objekt in den Innenraum ragt. Dies bewirkt, dass die Lösung nicht zurückfließt, wenn der Unterdruck aus dem Innenraum entfernt wird, wodurch verhindert wird, dass sich verschiedene Lösungen vermischen.
Vorzugsweise enthält die Vorrichtung eine Mehrzahl röhrenförmiger Objekte, die eine Anordnung relativ zueinander aufweisen, welche der Anordnung eines Multiwell-Behältnisses mit zahlreichen Näpfen (wells) entspricht. Damit kann die Vorrichtung mit Mikrotiterplatten (MTP) verwendet werden.
Vorzugsweise sind alle röhrenförmigen Objekte in eine separate Trägereinheit (23) integriert, die vom Gehäuse abnehmbar ist. Damit steht ein Einwegartikel zur Verfügung. Außerdem können die Röhren und Filter einfacher gereinigt werden.
In geeigneter Weise weist die Vorrichtung Mittel zum Erzeugen eines Überdrucks im Innenraum auf. Damit wird das Freisetzen der im Filter festgehaltenen Träger vereinfacht.
Die Vorrichtung weist vorzugsweise Mittel zur Steuerung des Unterdrucks und/oder des Überdrucks auf. Die Vorrichtung kann somit an verschiedene Anwendungen angepasst werden.
In vorteilhafter Weise werden die Verfahren und/oder die Vorrichtung in einem automatischen Robotersystem verwendet. Die Durchführung wird hierdurch verbessert, weil wenige Eingriffe durch den Menschen erforderlich sind. Dementsprechend kann ein Roboterarm die Vorrichtung tragen, so dass er automatisch und nicht durch Menschen kontrolliert Träger zwischen Lösungen und/oder Näpfen transferiert. Diesbezüglich kann der Schritt der Freisetzung auch durch Schütteln, Vibrieren oder Abkratzen durchgeführt werden, so dass die Träger vom Filter abgelöst werden, wenn der Unterdruck entfernt wurde.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben.
1a zeigt eine perspektivische Darstellung einer Vorrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung;
1b zeigt eine Explosionsdarstellung der Vorrichtung gemäß 1;
2a zeigt eine Draufsicht auf die Vorrichtung;
2b zeigt eine Draufsicht auf die Vorrichtung, wobei eine obere Abdeckung entfernt ist;
2c zeigt eine Ansicht entlang der Linie B-B in 2a;
2d zeigt eine Ansicht entlang der Linie C-C in 2a;
3 zeigt eine Vorderansicht eines Einwegartikels gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung;
4a–b zeigen eine SDS-PAGE-Analyse eluierter Proteine, wobei 4a die CBB-Färbung und 4b die Silberfärbung zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die 1a–b zeigen perspektivische Ansichten einer Vorrichtung 10 gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Vorrichtung weist eine obere Abdeckung 1 und eine untere Abdeckung 2 auf, die zusammen ein Gehäuse 5 bilden. Zwischen der oberen und der unteren Abdeckung ist eine Dichtung 7 angeordnet. Eine Leitung 9 ist mit einem Ende über ein Verbindungsstück 11 mit dem Gehäuse verbunden und mit einem anderen Ende bspw. mit einer nicht dargestellten Vakuumquelle, einer Flüssigkeitsabschei devorrichtung und/oder einer Druckquelle verbindbar. Eine Mehrzahl röhrenförmiger länglicher Mittel in Form von Hülsen 13 sind jeweils mit Öffnungen 15 verbunden, welche an der Unterseite 17 der unteren Abdeckung 3 angeordnet sind. In jeder Öffnung sind Dichtungsringe 19 zum gegen die Hülsen vorgesehen. Die Hülsen sind in parallelen Reihen und Spalten entsprechend zur Anordnung der Näpfe (wells) eines Multiwell-Behältnisses, bspw. einer Mikrotiterplatte (MTP) angeordnet. Eine Trägerplatte 21 ist mittels einer Schraube 22 an der Unterseite der unteren Abdeckung befestigt, wobei die Trägerplatte mit einer Mehrzahl von an die Hülsen angepassten Löchern 23 versehen ist, die an den Öffnungen in der unteren Abdeckung ausgerichtet sind. Ein Filter 25 ist in einem Querschnitt in einem Endbereich jeder Hülse 13 aufgenommen.
Wie aus 2c ersichtlich ist, wird ein Innenraum 27 zwischen der oberen Abdeckung 1 und der unteren Abdeckung 3 gebildet, wenn die obere und untere Abdeckung zusammengefügt werden. Dieser Innenraum steht über eine in einem Wandbereich des Gehäuses angeordnete Aussparung 29 in Fließverbindung mit der Leitung 9 und demgemäß auch in Fließverbindung mit bspw. der oben erwähnten Vakuumquelle. Die Öffnungen 15 in der unteren Abdeckung erstrecken sich in den Innenraum, wobei jede Hülse in Fließverbindung mit dem Innenraum steht (dies ist in 2c an einer der Hülsen dargestellt). 2b–c kann entnommen werden, dass jede Hülse über einen kleinen Bereich in den Innenraum hineinragt und so schornsteinartige Vorsprünge 31 bildet.
BEDIENUNG
Die Bedienung der Vorrichtung wird ausschließlich anhand eines Ausführungsbeispiels betreffend die Herstellung einzelsträngiger DNA-Proben mit typischerweise 50 bis 2000 Nukleotiden beschrieben. Der Fachmann wird jedoch erkennen, dass die Vorrichtung nicht auf diese Verwendung beschränkt ist, sondern vielfältig verwendet werden kann, wenn Träger von Biomolekülen aus einer Lösung abgetrennt oder zwischen verschiedenen Behältnissen bewegt werden müssen. Obwohl Streptavidin-Biotin in dem oben erwähnten Ausführungsbeispiel als bindendes Molekülpaar verwendet wurde, sind bspw. andere Bindungsmoleküle vorstellbar.
Im Ausführungsbeispiel ist ein Multiwell-Behältnis, wie bspw. eine MTP, mit zahlreichen Näpfen vorgesehen (nicht dargestellt), wobei jeder Napf eine Lösung enthält, die amplifizierte doppelsträngige, auf Partikeln, bspw. auf mit Streptavidin beschichteten Sepharose-Partikeln immobilisierte DNA-Proben enthält. Die Vorrichtung 10 wird über der MTP positioniert und anschließend abgesenkt, so dass die Hülsen 13 der Vorrichtung in die Näpfe der MTP eingeführt und dann in die Lösung eingetaucht werden. Die Vakuumquelle wird in Betrieb genommen, so dass ein Unterdruck im Innenraum 27 des Gehäuses 5 und demnach auch in jeder Hülse auf einer ersten Seite des Filters 25 erzeugt wird. Durch Einstellen eines geeigneten Unterdrucks wird die Lösung in die Hülsen und durch die Filter gesaugt. Die Lösung tritt in den Innenraum ein und wird anschließend durch die Leitung 9 in eine Flüssigkeitsabscheidevorrichtung abgesaugt. Die Träger mit den immobilisierten Partikeln werden ebenfalls zum Filter gesaugt, aber auf einer zweiten Seite aufgefangen, d.h. entgegengesetzt zur ersten Seite des Filters, während die Lösung durch den Filter abgesaugt wird. Der Filter ist vorzugsweise aus einem gesinterten Material hergestellt, bspw. aus gesintertem Polypropylen-Kunststoff, obwohl auch andere Materialien vorstellbar sind, und wenn die Partikel aus Sepharose mit einem Durchmesser von etwa 38 μm hergestellt sind, muss der Durchmesser der Filterporen etwa 10 μm betragen.
Die Vorrichtung 10 kann nun angehoben werden, wobei der Unterdruck aufrechterhalten wird, so dass die Hülsen mit den an den Filtern festgehaltenen Trägern entfernt werden. Die Vorrichtung wird zu einem anderen Behältnis bewegt, welches eine Lösung enthält, in der bspw. eine strangtrennende Lösung wie Natriumhydroxid enthalten ist. Folglich wird die dsDNA in ssDNA aufgespalten, wenn die Hülsen in die Lösung eingetaucht werden, wobei die ersten Stränge in der Lösung suspendiert werden, während die zweiten Stränge an die Partikel gebunden bleiben. Die Vorrichtung wird dann zu einer anderen MTP bewegt, deren Näpfe alle eine Lösung enthalten. Die Hülsen werden in die in den Näpfen enthaltene Lösung eingetaucht, und die Vakuumquelle wird deaktiviert, wodurch die Träger vom Filter freigesetzt und in der Lösung resuspendiert werden. Die schornsteinartigen Vorsprünge 31 verhindern, dass im Innenraum enthaltene Lösung zu einem Behältnis zurückfließt, wenn die Vakuumquelle deaktiviert wird. Ein solcher Rückfluss könnte eine Kontamination der in einem bestimmten Behältnis enthaltenen Lösung verursachen.
Um die Suspendierung zu erleichtern, kann der Filter am Boden der Näpfe abgekratzt werden. Die Vorrichtung kann auch geschüttelt oder vibriert werden, um die Freisetzung des Trägers weiter zu verbessern. Als Alternative kann eine Druckquelle in Betrieb genommen werden, wodurch im Innenraum des Gehäuses und somit auch auf der ersten Seite jedes Filters ein Überdruck aufgebaut wird. Diese Druckumkehr verbessert zusätzlich die Freisetzung von Trägern von der zweiten Seite des Filters, indem der Filter durchgeblasen wird, aber auch indem eine turbulente Bewegung in der Lösung entsteht, wodurch der Filter gespült wird. Wenn die Träger in der Lösung suspendiert sind, wird die Druckquelle deaktiviert, und die Vorrichtung wird angehoben, so dass die Hülsen aus den Näpfen entfernt werden. Nun ist die Herstellung der ssDNA abgeschlossen, und eine geeignete Analyse der in der Lösung enthaltenen ssDNA kann beginnen. Diese Analyse kann eine Sequenzierung oder Sequencing-by-Synthesis sein, wie es in der US 5 405 746 bzw. in der WO98/13523 beschrieben ist.
Nach dem Benutzen der Vorrichtung kann es erforderlich sein, die Filter zu reinigen. Die Hülsen werden einfach bspw. in Wasser oder Ethanol getaucht, so dass die Filter gespült werden, obwohl die Vorrichtung auch auseinandergebaut werden kann, um sie vollständig zu reinigen. Um den Reinigungseffekt weiter zu verstärken, kann die Vakuumquelle und/oder die Druckquelle in Betrieb genommen werden. In diesem Fall kann wechselweise ein Unterdruck und ein Überdruck angelegt werden, wodurch der Reinigungseffekt verstärkt wird.
Es ist selbstverständlich vorstellbar, die Trägerplatte mit integrierten Hülsen und Filtern auszubilden, so dass ein Einwegartikel erhalten wird, welcher nach der Benutzung verworfen wird. Ein solcher Artikel kann nötigenfalls einfach ausgetauscht werden.
Es ist auch vorstellbar, die Filter in einem kurzen Abstand vom äußersten Endbereich jeder Hülse anzuordnen. Damit kann die Beladungskapazität für die Träger erhöht werden, wenn Lösungen mit einer hohen Trägerdichte vorhanden sind oder wenn in den Näpfen hohe Flüssigkeitssäulen vorhanden sind.
Es ist auch möglich, dass die Träger durch Behandlung mit Ultraschall von den Filtern in den röhrenförmigen Objekten entfernt werden, bspw. indem sie in ein Ultraschall-Wasserbad eingebracht werden. So können die röhrenförmigen Objekte und die Filtern vor dem nächsten Gebrauch gereinigt werden.
Darüber hinaus ist es auch vorstellbar, die röhrenförmigen Objekte 13 mit Einwegspitzen 50 zu versehen. Eine solche Einwegspitze ist in 3 darstellt und weist ein erstes Ende 52 zur Verbindung mit dem röhrenförmigen Objekt 13 und ein zweites Ende 54 zum Eintauchen in eine in einem Behältnis enthaltene Lösung auf. Die Einwegspitze 50 hat eine spitz zulaufende Form und ist mit einem Filter 25 versehen, um die Träger wie oben beschrieben festzuhalten, so dass es nicht notwendig ist, die röhrenförmigen Objekte selbst mit Filtern zu versehen. Diese Einwegspitzen können weggeworfen werden und werden nach Gebrauch üblicherweise verworfen.
AUSFÜHRUNGSBEISPIEL
Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, um zu ermitteln, ob ein mit Histidin markiertes Protein (HisKlenow) aus einem bakteriellen Lysat mit guter Selektivität und Ausbeute gereinigt werden konnte. In der folgenden Beschreibung wird die Benutzung der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung nur allgemein erläutert und nur als die erfindungsgemäße Vorrichtung bezeichnet. Der Fachmann wird jedoch in Zusammenschau mit den obigen Absätzen AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG und BEDIENUNG erkennen, wie bei der Reinigung His-markierter Proteine die einzelnen Schritte mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden.
His-Klenow ist das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase mit einem N-terminal gebundenen Hexahistidinrest. Zur Herstellung wird das Protein in E. coli überexprimiert. Die eingeführte Modifizierung ermöglicht es, das Protein mittels der Metallchelatchromatographie (Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie, IMAC) unter Verwendung kommerziell erhältlicher Matrices zu reinigen. Das Verfahren beinhaltet die Bindung des Proteins an immobilisierte Ni²⁺-Ionen, das Auswaschen nicht gebundener Substanzen und schließlich das Eluieren des gebundenen Proteins mit einem Puffer, der 0,2 M Imidazol enthält.

Die Untersuchung wurde durchgeführt, indem ein im Stand der Technik bekanntes Verfahren zur chromatographischen Reinigung von His-Klenow für die erfindungsgemäße Vorrichtung übernommen wurde. Da alle kritischen Parameter wie Bindungs- und Eluierungsbedingungen bekannt sind, war es nicht notwendig, diese weiter zu untersuchen. Die einzige Variable war die Menge des Gels, welche in jeden Napf gegeben wurde, da es denkbar war, dass dies die Wiedergewinnung beeinflussen könnte. Materialien

HiTrap Chelatisierungssäule (1 ml)

Amersham Biosciences

His-Klenow Lysat, batch 1012
PCR-Platten, 96-well	Millipore
NaH₂PO₄	Merck
NaCl	Merck
Imidazol	USB
Erfindungsgemäße Vorrichtung	Pyrosequencing
Phast Electrophoreseausrüstung	Amersham Biosciences
Phast 10–15% Gele	Amersham Biosciences
SDS Pufferstreifen	Amersham Biosciences
Kalibrierungskit für geringe
Molekulargewichte	Amersham Biosciences
Commassie Brilliant Blue Farbstoff	Amersham Biosciences
Phast Silberfärbekit	Amersham Biosciences
EDTA	Merck
Deionisiertes Wasser
NiCl₂ × 6 (H₂O)	Sigma

Puffer

Bindungs- und Waschpuffer:	10 mM NaP_j, 0,5 M NaCl, 10 mM Imidazol, pH 7,4
Eluierungspuffe:	10 mM NaP_j, 0,5 M NaCl, 0,2 M Imidazol, pH 7,4

Herstellung des Gels
Das Gel wurde nach den Vorschriften des Herstellers hergestellt.

1. Die Säule wurde mit 2 ml 50 mM EDTA gewaschen
2. Waschen mit 5 ml Wasser
3. Beladen mit 2 ml 0,1 M NiCl₂
4. Waschen mit 5 ml Wasser
5. Waschen mit 5 ml Bindungspuffer

Anschließend wurde die Säule geöffnet, das Gel herausgenommen und damit durch Zugabe von Bindungspuffer eine 50% Aufschlämmung hergestellt. SDS-PAGE und Färben

SDS-PAGE: Verfahren „SDS 10–15"

CBB-Färbung Verfahren „SDS"

Silberfärbung Verfahren „Ag"
Die Verfahren beziehen sich auf Verfahren gemäß der Phast Elektrophoreseausrüstung.
Reinigung mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung

1. 25 μl Lysat wurden auf 7 Näpfe in einer PCR-Platte verteilt (Spalte A)
2. 25 μl Bindungspuffer wurden zu jedem Napf hinzugefügt
3. 10, 5, 4, 3, 2, 1 und 0,5 μl Gelaufschlämmung wurden jeweils in die Näpfe A–G gegeben
4. Die Platte wurde 5 min auf einem Rüttler inkubiert
5. Die erfindungsgemäße Vorrichtung wurde verwendet, um das Gel aus den verwendeten Näpfen abzusaugen
6. Das Gel wurde durch Transferieren der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu einem Behälter mit Bindungspuffer für 10–20 s gewaschen
7. Gebundene Proteine wurden durch Transferieren der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu einer frischen PCR-Platte mit 50 μl Eluierungspuffer eluiert
8. Aus jedem Napf wurde eine Probe für die Analyse entnommen. Eine Probe des Ausgangsmaterials, d.h. des Lysats, wurde ebenfalls entnommen
9. SDS-PAGE wurde durchgeführt, gefolgt von Färben mit CBB oder Silber

Ergebnisse
Die Analyse mit SDS-PAGE zeigt, dass HisKlenow an das Gel bindet und durch Behandlung mit Eluierungspuffer wiedergewonnen werden kann, vgl.
4a–b. Beide Abbildungen wurden bearbeitet, um die eingescannten Bilder besser sichtbar zu machen. Die Zahlen zeigen die Menge (μl) des Gels (50% Aufschlämmung) an, die in jeden Napf gegeben wurde. „lys" zeigt das Ausgangsmaterial an.
Diskussion
In einem ersten Versuch wurde eine normale 96-well Platte mit wesentlich größeren Näpfen für das Binden und Eluieren verwendet. Dieser Versuch ergab, dass nicht viel Gel aus diesen viel größeren Näpfen abgesaugt werden konnte, weil verbleibendes Gel in den Näpfen beim Trocknen gut sichtbar war.
Der folgende Versuch wurde dann mit einer PCR-Platte durchgeführt, wobei die Menge des zugefügten Gels gleichmäßig variiert wurde. Wie aus 4a–b ersichtlich ist, verbessert sich die Wiedergewinnung mit abnehmender Menge des zugefügten Gels (vgl. 4a, CBB-Färbung). Dies spiegelt vermutlich die Tatsache wider, dass der Anteil des wiedergewonnenen Gels größer ist, wenn geringe Mengen an Gel verwendet werden, was zur Wiedergewinnung einer größeren Menge von Protein führt. Daher ist die Bindungskapazität des Gels in diesem Versuch anscheinend unproblematisch.
Die Reinigungswirkung ist sehr gut, da in den eluierten Fraktionen im Vergleich zum Ausgangsmaterial keine Kontaminationen gefunden werden konnten (vgl. 4b, Silberfärbung).
Schlussfolgerungen
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann erfolgreich zur Isolierung von Proteinen aus komplexen Mischungen, in diesem Fall aus einem bakteriellen Lysat, eingesetzt werden. In dieser Untersuchung wurde ein His-markiertes Protein zusammen mit einem Metallaffinitätsgel als Modell verwendet, aber das Prinzip sollte auch mit anderen Systemen funktionieren, bspw. mit Affinitätsgelen, Protein-Protein- oder Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen.
Das verwendete System war nicht in irgendeiner Weise optimiert, was vermuten lässt, dass Verbesserungen in Bezug auf Wiedergewinnung und Geschwindigkeit möglich sind.

Claims

Verfahren zum Abtrennen von Trägern aus einer Lösung, wobei die Träger zur Anlagerung von Biomolekülen wie DNS, RNA, Proteinen, Polypeptiden oder Kohlehydraten eingerichtet sind, enthaltend die folgenden Schritte: – Einführen eines röhrenförmigen Objekts (13) in ein Behältnis, welches eine Lösung mit den darin enthaltenen Trägern enthält; – Eintauchen eines Endbereichs des röhrenförmigen Objekts in die Lösung; – Anziehen und Festhalten der Träger an dieser Endbereich; – Entfernen des röhrenförmigen Objekts zusammen mit den daran gehaltenen Trägern aus der Lösung; dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Anziehens und Festhaltens folgenden Schritt enthält: – Erzeugen eines Unterdrucks in dem röhrenförmigen Objekt, so dass die Träger an einen im Endbereich des röhrenförmigen Objekts angeordneten Filter (25) angezogen und daran festgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, enthaltend den weiteren Schritt: – Freisetzen der Träger vom Filter durch Entfernen des Unterdrucks oder Erzeugen eines Überdrucks in dem röhrenförmigen Objekt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend den weiteren Schritt: – Freisetzen der Träger vom Filter durch Schütteln.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, enthaltend den weiteren Schritt: – Freisetzen der Träger vom Filter durch Abkratzen.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, bei dem jeder Schritt gleichzeitig an einer Mehrzahl von Orten ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei das Verfahren zum Reinigen von Proteinen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verfahren zum Reinigen von markierten Proteinen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Verfahren zum Aufbereiten von mit Histidin markierten Proteinen verwendet wird.
Vorrichtung zum Bewegen von Trägern zwischen verschiedenen Behältnissen, wobei die Träger zur Anlagerung von Biomolekülen wie DNA, RNA, Proteinen, Polypeptiden oder Kohlehydraten eingerichtet sind, enthaltend: – mindestens ein röhrenförmiges Objekt (13) zum Einführen in ein Behältnis, welches eine Lösung mit den darin enthaltenen Trägern enthält, wobei das röhrenförmige Organ einen Endbereich zum Einführen in die Lösung aufweist; – Mittel zum Anziehen und Festhalten der Träger an diesem Endbereich; dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel einen im Endbereich angeordneten Filter (25) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, welche ferner ein Gehäuse (5) mit einem abgedichteten Innenraum (27) aufweist, der mit einer Vakuumquelle zum Erzeugen eines Unterdrucks im Innenraum verbindbar ist, wobei das röhrenförmige Objekt in Fließverbindung mit dem Innenraum steht.
Vorrichtung nach Anspruch 10, bei der das röhrenförmige Objekt in den Innenraum ragt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, welche ferner eine Mehrzahl röhrenförmiger Objekte aufweist, die relativ zueinander eine Anordnung aufweisen, die der Anordnung eines Multiwell-Behältnisses mit zahlreichen Näpfen (wells), zum Beispiel einer Mikrotiterplatte (MTP), entspricht.
Vorrichtung nach Anspruch 12, bei der alle röhrenförmigen Objekte in eine separate Trägereinheit (23) integriert sind, die vom Gehäuse abnehmbar ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, welche Mittel zum Erzeugen eines Überdrucks im Innenraum aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 14, welche Mittel zur Steuerung des Unterdrucks und/oder des Überdrucks aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, bei der der Filter aus einem Sintermaterial hergestellt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 16, bei der der Filter aus gesintertem Polypropylen-Kunststoff hergestellt ist.
Verfahren zum Herstellen von einzelsträngiger DNA (ssDNA) aus doppelsträngiger DNA (dsDNA) enthaltend die Schritte: – Immobilisieren eines der beiden Stränge der dsDNA auf Trägern in einem ersten Behältnis, welches eine erste Lösung enthält, wobei die Lösung die Träger und das dsDNA enthält; – Anziehen und Festhalten dieser Träger an einem röhrenförmigen Objekt (13), welches in die erste Lösung eingetaucht ist; – Bewegen des röhrenförmigen Objekts mit den daran festgehaltenen Trägern von dem ersten Behältnis zu einem zweiten Behältnis; – Aufspalten der dsDNA in ssDNA im zweiten Behältnis; – Entfernen des röhrenförmigen Objekts aus dem zweiten Behältnis, wodurch Träger mit immobilisierter ssDNA aus dem zweiten Behältnis entfernt werden; dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Anziehens und Festhaltens folgenden Schritt enthält: – Erzeugen eines Unterdrucks in dem röhrenförmigen Objekt, so dass die Träger an einen in dem röhrenförmigen Objekt angeordneten Filter (25) angezogen und daran festgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 18, bei dem jeder Schritt gleichzeitig an einer Mehrzahl von Orten ausgeführt wird.
Einwegartikel, welcher zur Befestigung an dem röhrenförmigen Objekt einer Vorrichtung gemäß dem Oberbegriffs des Anspruchs 9 eingerichtet ist, dadurch gekennzeichnet, dass dieser Einwegartikel mit einem Filter (25) zum Festhalten der Träger versehen ist.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 und/oder 18 und 19 und/oder der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 9 bis 17 in einem automatischen Robotersystem.