DE69926218T2

DE69926218T2 - Vorrichtung und verfahren zur übertragung magnetischer partikel

Info

Publication number: DE69926218T2
Application number: DE69926218T
Authority: DE
Inventors: Matti Korpela
Original assignee: Bio Nobile Oy
Current assignee: BioControl Systems Inc
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2019-02-20
Also published as: EP1548441B1; EP1058851A1; JP2002504685A; DE69941437D1; EP1058851B1; ATE443258T1; DE69926218D1; FI102906B; EP1548441A1; FI980399A; DK1058851T3; ATE300046T1; AU2524299A; FI980399A0; FI102906B1; ES2245088T3; US6468810B1; WO1999042832A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Übertragung einer Substanz, die an einem magnetischen oder magnetisierbaren Material immobilisiert ist, mit Hilfe eines Magneten. Die Erfindung ist dadurch charakterisiert, dass der zur Übertragung verwendete Magnet durch eine dehnbare Membran aus elastomerem Material von dem zu übertragenden Material getrennt ist.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Beim traditionellen Verfahren zum Abtrennen von magnetisierbarem Material wird ein Magnet, der außerhalb des Gefäßes ist, verwendet. Das magnetisierbare Material wird in dem Gefäß gelassen und die umgebende Lösung wird aus dem Gefäß entfernt.
Durch Einführen des Magneten in die Lösung werden im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren große Vorteile erzielt, wenn magnetisierbares Material gesammelt wird. Es ist besonders bemerkenswert, dass das magnetisierbare Material in diesem Fall in einfacher Weise und in effizienter Weise aus dem Gefäß entfernt werden kann. Wenn der Magnet in die Lösung eingeführt wird, ist der Abstand des Magneten von dem magnetisierbaren Material kürzer als bei Verwendung eines außen angebrachten Magneten. Infolge der Oberflächenspannung von Fluid wird eine Sammlung von magnetisierbarem Material, das an der Lösungsgrenzfläche zurückgeblieben ist, wirksamer erreicht, wenn der Magnet in die Lösung eingeführt wird.
Die Patentliteratur präsentiert zahlreiche Vorrichtungen zum Abtrennen von magnetisierbarem Material. Die Internationale Patentpublikation WO 87/05536 offenbart eine Trennvorrichtung, in der ein Permanentmagnet, der sich im Inneren einer Kunststoffhülse bewegt, verwendet werden kann, um magnetisierbares Material von einem Gefäß zu einem anderen zu transferieren. Die Finnischen Patentpublikationen ( FI 86 05002 , FI 95 03669 , FI 97 01665 , FI 97 01666 , FI 97 01667 und FI 97 01668 ) offenbaren in ähnlicher Weise verschiedene Verfahren, die auf der Verwendung eines Permanentmagneten zur Übertragung bzw. zum Transfer von magnetisierbarem Material aus einem Gefäß in ein anderes basieren. Die Patentpublikationen US 4 272 510 , US 4 649 116 und US 4 751 053 offenbaren Übertragungen von magnetischem Material, basierend auf der Verwendung eines Elektromagneten, hauptsächlich in RIA- und EIA-Assays. Die Patentpublikation US 5 567 326 offenbart eine Apparatur zur Abtrennung von magnetischen Partikeln aus der nicht-magnetischen Reaktionslösung mit Hilfe eines Stahlstifts, der mit einem Permanentmagneten magnetisierbar ist. Typischerweise würde die Apparatur eine Reaktionsplatte mit vielen Vertiefungen umfassen, wobei magnetische Partikel gleichzeitig in vielen benachbarten Reaktionsvertiefungen abgetrennt werden können, wobei eine Übertragungsvorrichtung mit vielen magnetisierbaren Stiften verwendet wird. Das in der Patentpublikation US 5 567 326 beschriebene Verfahren ist sehr langwierig zu verwenden. Die ungeschützten Stahlstifte müssen zwischen jedem Verwendungsmal gewaschen oder sterilisiert werden. Sollte das Waschen nicht ausreichend sein, so besteht in dem vorstehend genannten Verfahren eine ernste Gefahr der Kontamination.
Verfahren und/oder Vorrichtungen zur Übertragung magnetischer Partikel wurden auch in WO 95/00247, WO 96/12959 und EP 0 687 505 offenbart.
Magnetische Partikel wurden in zahlreichen Patentpublikationen beschrieben, z. B. in den US-Publikationsnummern 3 970 518; 4 018 886; 4 230 685; 4 267 234; 4 452 773; 4 554 088; 4 659 678; 4 978 610; 5 200 048; und 5 705 628. Technologie unter Verwendung von Partikeln wurde z. B. in Immunoassays sehr populär. Eine Verwendung magnetisierbarer Partikel zur Abtrennung eines gebundenen Antigen-Antikörper-Komplexes von der ungebundenen Fraktion in Immunoassays bot sowohl bezüglich der Reaktionsgeschwindigkeit als auch bezüglich der Durchführung der Abtrennung sehr große Vorteile.
Magnetische Partikel in Reaktionslösung mit gebundenem biologischen Material, z. B. Zellen oder ein Antikörper, wurden nach Reaktionsablauf mit Hilfe des Magneten außerhalb des Gefäßes an eine bestimmte Stelle verbracht, wonach die Lösung entfernt werden konnte, ohne dass magnetische Partikel das Gefäß verließen.
Die Verwendung magnetischer Partikel ist günstig, da bei der Probenhandhabung keine teuren oder Raum beanspruchenden Instrumente, z. B. Zentrifugen, Vakuumpumpen oder chromatographische Säulen, benötigt werden. Anwendungen magnetischer Partikel sind einfach durchzuführen und die dabei verwendeten Volumina können entsprechend der Verwendung von klein bis groß variieren.
Derzeit werden magnetische Partikel unter anderem in Immunoassays zur Abtrennung von Zellen und Bakterien, Isolierung von Nucleinsäuren, wie auch in der Reinigung von Proteinen eingesetzt.
In der Molekularbiologie bereiten viele Arbeitsgänge, z. B. Isolierung und/oder Übertragung von Nucleinsäuren wie auch die Verwendung von Restriktionsenzymen oder Nucleinsäure modifizierenden Enzymen Probleme. Von diesen treten Inaktivierung von Enzymen, Extraktion mit Lösungsmitteln und Star-Activity auf.
Traditionell werden Nucleinsäuren durch verschiedene Präzipitationen und durch Lösungsmittelsextraktion isoliert und übertragen bzw. transferiert. Einige kompensierende Verfahren wurden als Unterstützung bei der Nucleinsäurebehandlung präsentiert. Allerdings sind diese Verfahren im Allgemeinen teuer und erfordern Zentrifugationsschritte. Außerdem ist es bei einigen dieser Verfahren schwierig, die Nucleinsäure in ausreichend geringem Volumen nach dem Arbeitsgang wieder zu gewinnen.
In Verfahren der Molekularbiologie, in denen DNA oder RNA manipuliert wird, wird von Restriktionsenzymen, wie auch von DNA- und/oder RNA-mofizierenden Enzymen Gebrauch gemacht. Die Verwendung dieser Enzyme ist in fast allen Arbeiten auf dem Gebiet der Molekularbiologie von essentieller Bedeutung. Die am stärksten hervorstechenden Enzyme in Molekularbiologie-Laboren sind die Restriktionsenzyme. Diese Enzyme haben bedeutende Ent wicklungen auf diesem Gebiet möglich gemacht. Die Verwendung von Restriktionsenzymen oder Nucleinsäure-modifizierenden Enzymen in molekularbiologischen Anwendungen ist im Wesentlichen Routinearbeit, die in vielen Fällen umfangreiche Zwischenstufen involviert. Ein gutes Beispiel wird durch die Arbeitsgänge bereitgestellt, die zur Eliminierung einer Restriktionsenzymaktivität nach ihrer Verwendung benötigt werden. Viele Restriktionsenzyme erfordern eine Phenolextraktion, um sie nach der Verwendung zu inaktivieren. Phenolextraktionen sind sehr langwierig und vom Standpunkt des Verwenders unangenehme Verfahren. Darüber hinaus wird bei diesen Extraktionen eine Menge an gefährlichem Abfall erzeugt. Kommerzielle Hersteller schlagen für viele Restriktionsenzyme eine Inaktivierung durch Hitzebehandlung vor, wohingegen die Verwender in der Praxis oft eine Phenolextraktion durchführen, um eine Inaktivierung des Enzyms sicherzustellen. Nach einer Hitzebehandlung kann noch ein großer prozentualer Anteil der Enzymaktivität bestehen bleiben. Da man nicht fähig war, Restriktionsenzyme mit derzeit bekannten Techniken zu entfernen, wurde das Problem durch Inaktivierung von Enzymen, z. B. durch Hitze oder Phenolextraktion, gelöst. Ein weiterer Nachteil ist der, dass das verwendete teure Enzym nicht wieder verwendet werden kann. Weniger zeitaufwändig, aber in anderer Weise problematisch sind verschiedene Spin-Säulen zur Aufreinigung von DNA aus einer Reaktionslösung. Die Verwendung dieser Säulen ist sehr teuer und sie sind zur Entfernung vieler Enzyme aus DNA-Lösung nicht anwendbar. Auch in diesem Fall kann das zurückgenommene Enzym nicht wieder verwendet werden.
Eine Phenolextraktion ist für eine Inaktivierung vieler anderer Enzyme, die üblicherweise auf dem Gebiet der Molekularbiologie verwendet werden, notwendig. Als Beispiele können CIP (Calf Intestinal Phosphatase = Phosphatase aus Kälberdarm) und Proteinase K genannt werden.
Zum Transferieren bzw. Übertragen und Waschen von Restriktionsenzymen oder Nucleinsäure-modifizierenden Enzymen wurden keine unproblematischen Mittel präsentiert. Als Beispiel für ein Problem könnte die „Star-Activity" genannt werden, die durch das in der Restriktionsenzym-Lagerungslösung verwendete Glycerin verursacht wird. Damit ist die Fähigkeit von Restriktionsenzymen gemeint, DNA unspezifisch zu schneiden, d.h. an Stellen, wo ein Schneiden nicht erwünscht ist. Im Handel verfügbare Restriktionsenzyme werden im Allgemeinen als 50% Glycerin-enthaltende Lösung bereitgestellt. Im Normalfall wird eine sehr geringe Menge an Restriktionsenzym der Reaktion zugesetzt, sogar weniger als 1 μl. Wenn der Glyceringehalt im Reaktionsgemisch zu hoch ist, so führt dies in vielen Fällen zu einem großen Problem, hauptsächlich infolge des Auftretens von „Star-Activity". Diese setzt für viele Molekularbiologieanwendungen bezüglich einer Restriktionsenzymverwendung Grenzen. Eine andere wichtige Tatsache ist, dass es empfehlenswert ist, das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches möglichst niedrig zu halten, um eine ausreichend schnelle Enzymreaktion zu haben. Im Handel verfügbare Restriktionsenzyme sind im Allgemeinen in einer oder höchstens zwei Standardkonzentratinen (U/ml) verfügbar. Wenn in der Reaktion eine große Menge an Restriktionsenzym erwünscht ist, erreicht der Glyceringehalt in einer Reaktionslösung einen zu hohen Level. Als Resultat gibt es „Star-Activity" und die Reaktionskinetik ist deutlich verlangsamt.
Die Patentliteratur schlägt Präparationen vor, in denen Restriktionsenzyme oder andere in der Molekularbiologie üblicherweise verwendete Enzyme an einem festen Träger immobilisiert wurden. Die Internationale Patentpublikation WO 92 15674 schlägt vor, Restriktionsenzyme wie auch Nucleinsäure-modifizierende Enzyme an einer Oberfläche, die aus Polymer oder Glasfaser besteht, zu immobilisieren. US 4 342 833 beschreibt auch immobilisierte Restriktionsenzyme, die CNBr-aktivierte Agarose als festen Träger verwenden. Auf allgemeiner Ebene ist die Verwendung von magnetischen Partikeln bei der Enzymimmobilisierung in der Patentpublikation US 4 698 302 beschrieben, obgleich in dieser Patentpublikation keine Enzyme genannt werden, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie eingesetzt werden. In der vorstehend genannten Patentpublikation wurde die Abtrennung magnetischer Partikel traditionell mit einem außen angeordneten Magneten erreicht.
Auf dem Gebiet der Molekularbiologie bereitet das Einfangen von Partikeln infolge der geringen Volumina an Fluid in diesen Anwendungen Probleme. Eine anerkannte Technik auf den Gebieten der Zellbiologie oder Immunchemie ist auf die Molekularbiologie nicht anwendbar, und zwar aufgrund der extrem kleinen Flüssigkeitsmengen, die auf diesem Gebiet eingesetzt werden, z. B. 10–100 μl, wohingegen entsprechende Mengen auf dem Gebiet der Immunchemie in der Größenorndung von einigen Millilitern liegen und auf dem Gebiet der Zellbiologie typischerweise 10–100 ml sind.
Die Bearbeitung von trüben Proben oder Proben, die festes Material enthalten, mit Magneten, die traditionell außerhalb des Reaktiongefäßes angeordnet sind, bereitet ebenfalls Probleme, da Magnetpartikel schwer von Trübung zu reinigen sind, welche feine Partikel erzeugt.
Wenn magnetische Partikel unter Verwendung traditioneller äußerer Magneten nicht verarbeitet werden können, indem sie von einem Reaktionsgefäß in ein anderes übertragen werden, müssen sie allerdings indirekt bearbeitet werden, indem die Partikel an der Reaktionsgefäßwand befestigt werden und die umgebende Lösung mit Hilfe einer Pipette ausgetauscht wird.
Auf dem Fachgebiet besteht ein Bedarf für ein Verfahren, das für die Handhabung kleiner Volumina gut geeignet ist, das einfach durchzuführen ist, einfach automatisiert wird und leicht auf verschiedenen Gebieten anwendbar ist.
ZWECK DER ERFINDUNG
Der Zweck der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu erreichen, um die Handhabung von Zielmaterialien, die spezifisch oder unspezifisch an ein magnetisches oder magnetisierbares Material gebunden sind, zu vereinfachen. Die Erfindung zielt insbesondere darauf ab, eine einfach miniaturisierte Vorrichtung und Verfahren, die zur Handhabung kleiner Probenvolumina geeignet sind, bereitzustellen.
Die Vorrichtung und das Verfahren werden für viele umfangreich variierende Anwendungen, z. B. Immunoassays, Zell- und Virus-Abtrennungen, zur Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren wie auch zur Proteinreinigung, verwendet. Das Verfahren ist besonders zur Isolierung, Übertragung oder Reinigung von Nucleinsäuren geeignet.
Außerdem werden die Vorrichtung und das Verfahren, die hierin beschrieben werden, zur Handhabung schwieriger Probenmaterialien, z. B. trüber Proben oder Proben, die festes Material enthalten, verwendet werden.
Darüber hinaus ist die Erfindung bestrebt, eine Übertragungsvorrichtung zu vollenden, mit der magnetische oder magnetisierbare Mikropartikel einschließlich des daran angehefteten Zielmaterials einfach eingefangen und gegebenenfalls freigesetzt werden. Die Übertragungsvorrichtung kann zu einem beliebigen Typ gehören, der gleichzeitig nur eine oder aber mehrere Proben behandelt. Das Verfahren kann insgesamt ein Produkt sein, das die Übertragungsvorrichtung mit begleitender Trennmembran oder Beschichtung, benötigte Reagentien, mit welchen eine Dosierung, ein Waschen und ein Wiedereinfangen magnetischer oder magnetisierbarer Mikropartikel in einfacher Weise erreicht wird, umfassen.
Die Erfindung zielt insbesondere darauf, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem das Restriktionsenzym oder das andere Enzym, das auf dem Gebiet der Molekularbiologie verwendet wird und das an Mikropartikeln immobilisiert ist, dosiert werden kann und aus dem Enzymenthaltenden Gefäß in das Reaktionsgefäß transferiert werden kann und gegebenenfalls aus dem Reaktionsgefäß entfernt und wieder eingefangen werden kann. Die vorliegende Erfindung ist unter anderem bestrebt, die Einfachheit einer Verwendung von Enzymen, die in molekularbiologischen Verfahren und Anwendungen eingesetzt werden, zu erhöhen und teure Enzyme wieder zu verwenden. Durch das aktuelle Verfahren kann das immobilisierte Enzym von Glycerin oder einer anderen Substanz, die mit der Reaktion wechselwirkt bzw. diese stört, freigewaschen werden, bevor es in das Reaktionsgefäß abgegeben wird.
Der Zweck besteht auch in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Proteinreinigung. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist die Reinigung von Proteinen ausgesprochen einfach und Proteine können gleichzeitig aufkonzentriert werden. Bei der Proteinreinigung kann entweder von einer unspezifischen oder spezifischen Proteinbindung an ein magnetisches oder magnetisierbares Trägermaterial Gebrauch gemacht werden.
Mit diesem Verfahren wird die Dosierung von Mikropartikeln in ein Gefäß, Sammeln und Übertragen dieser daraus in einfacher Weise in den genannten Anwendungen automatisiert.
Die vorliegende Erfindung macht es möglich, Verfahrensschritte willkürlich zu kombinieren, die aus der Handhabung von Nucleinsäuren (Isolierung, Übertragung, Reinigung) bestehen und gebundene Enzyme verwenden; sie erlaubt entsprechend den Erfordernissen der bevorstehenden Anwendung eine Kombination mit traditionellen Verfahren.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Charakteristika der Erfindung werden aus den beigefügten Ansprüchen deutlich.
Somit ist der Gegenstand der Erfindung eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Übertragung einer an Mikropartikeln immobilisierten Substanz aus einem ersten Gefäß in ein zweites Gefäß. Die Mikropartikel sind aus magnetischem oder magnetisierbarem Material oder die Mikropartikel wurden an einen magnetischen oder magnetisierbaren Körper angeheftet. Mikropartikel mit der immobilisierten Substanz werden mit Hilfe eines Magneten, der in das erste Gefäß getaucht wird, gesammelt, der Magnet wird zusammen mit den eingefangenen Mikropartikeln in das zweite Gefäß transferiert und die Mikropartikel werden aus dem Einfluss des Magneten befreit. Es ist ein Merkmal der Erfindung, dass die Magnetoberfläche mit Hilfe einer dehnbaren Membran aus elastomerem Material von den Mikropartikeln getrennt ist, so dass die Membran oder die Beschichtung das Magnetfeld, das auf die Mikropartikel gerichtet ist, nicht wesentlich schwächt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist speziell auf Gebiete anwendbar, in denen kleine Volumina gehandhabt werden.
In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck „Substanz" eine beliebige Substanz, die an Mikropartikeln immobilisiert ist, die auf den Anwendungsgebieten der Erfindung auftreten kann.
„Substanz" kann daher z. B. für ein Protein, Polypeptid oder Hapten stehen. Das Protein kann z. B. ein Enzym, Antikörper oder Rezeptor sein. Das Polypeptid kann z. B. ein Polypeptidhormon sein. Mit Hapten sind niedermolekulare Verbindungen, wie z. B. Lectine, Hormone, Arzneimittel, Pestizide oder Toxine, gemeint. So werden auch die in Immunoassays verwendeten Bioaffinitätskomponenten (ein Antikörper oder Antigen oder ein Komplex davon) beispielsweise und die Bioaffinitätskomponenten, die bei der Proteinreinigung verwendet werden (z. B. ein biotinyliertes Protein oder Streptavidin oder ein Komplex davon), in dem Ausdruck „Substanz" eingeschlossen sein.
„Eine Substanz" kann somit auch ein Restriktionsenzym, ein modifizierendes Enzym oder ein anderes Enzym, das in der Molekularbiologie verwendet wird, z. B. eine Protease, wie Proteinase K, sein. Als Beispiele für DNA- und/oder RNA-modifizierende Enzyme können die Folgenden genannt werden: CIP (Phosphatase aus Kälberdarm), alkalische Phosphatase aus Escherichia coli, Exonukleasen (z. B. P1-Nuklease, S1-Nuklease), Ribonukleasen, RNasen (z. B. Pankreas-RNase, RNase H, RNase T1, RNAse M, RNase T2), DNA-Ligasen, RNA-Ligasen, DNA-Polymerasen, das Klenow-Enzym, RNA-Polymerasen, DNA-Kinasen; RNA-Kinasen, terminale Transferasen, reverse AMV-Transkriptase und die Phosphodiesterasen. Die Anwendung dieser und anderer DNA- und/oder RNA-modifizierender Enzyme ist sowohl bei der Forschung in der Molekularbiologie als auch in Anwendungen der Molekularbiologie extrem mannigfaltig. „Eine Substanz" kann eine Nucleinsäure, eine einsträngige oder zweisträngige Nucleinsäure und speziell DNA, RNA, mRNA oder cDNA sein. Eine Nucleinsäure kann auch PNA (Polyamid-Nucleinsäure) sein.
Eine „Substanz" kann auch eine Zelle sein, z. B. eine T-Zelle, ein Leukozyt, ein Parasit (z. B. Giardia lamblia) und ein Bakterium (z. B. Salmonella sp., E. coli 0157:H7, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis).
„Eine Substanz" kann sogar ein Virus sein, z. B. HIV, Rotavirus, Hunde-Rotavirus, Arabis-Mosaikvirus oder Sojabohnen-Mosaikvirus.
Das Ausdruck „Mikropartikel" bezeichnet in diesem Zusammenhang eher kleine Partikel, vorzugsweise im Bereich von 1,0–10 μm. Das Mikropartikel, an welchem eine Substanz immobilisiert ist, kann aus magnetischem oder magnetisierbarem Material bestehen. Nach einer anderen Alternative kann das Mikropartikel, an dem die Substanz immobilisiert ist, selbst nicht magnetisch sein. In diesem Fall wird das Mikropartikel geeigneterweise an einen anderen Körper angeheftet, der aus einem magnetischen oder magnetisierbaren Material besteht.
Im Kontext mit der Diskussion von Substanzen, die an Mikropartikeln immobilisiert sind, bedeutet der Begriff „immobilisiert" alle solche Wege, bei denen die umgebende Lösung mit der Substanz, die an das Partikel angeheftet wird, in Kontakt gebracht wird, der Anheftung oder Bindung der Substanz, die zu übertragen ist, an Mikropartikel für die Dauer des erfindungsgemäßen Verfahrens oder zumindest der Übertragungsstufen davon. Die immobilisierte Substanz kann z. B. an die Oberfläche der Partikel angeheftet sein oder sie kann in einem käfigartigen Körper eingefangen sein. „Immobilisiert" kann somit auch eine reversible Immobilisierung in solchen Fällen, in denen die zu übertragende Substanz für einige Stufen an Mikropartikel geheftet ist, z. B. für Übertragungsstufen, und daraus am Ende dieser Stufen freigesetzt wird, bezeichnen.
„Anheften" bzw. „Binden" einer Substanz an Mikropartikel kann durch kovalente Bindung, z. B. unter Verwendung der Amino- oder Carboxylgruppen, die an dem Träger vorhanden sind, erreicht werden. Alternativ kann eine „Anheftung" unter Verwendung eines Bioaffinitätspaars, z. B. des Biotin/Streptavidin-Paars, erreicht werden. Ein zu beschreitender Weg besteht in der Produktion der zu immobilisierenden Substanz, z. B. eines Enzyms, durch DNA-Rekombinationstechniken, z. B. in Escherichia coli-Bakterienzellen, die an einen speziellen Affinitätsschwanz am Enzym bilden. Dieser Affinitätsschwanz wird an die Mikropartikel binden, die geeigneterweise darin eine gewisse Komponente gebunden haben, die begierig den betreffenden Affinitätsschwanz binden wird. Der Affinitätsschwanz kann eine Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht, ein Polypeptid oder ein Protein sein. Mit dieser Anordnung könnte eine effiziente Verwendung von Mikropartikeln bei der Reinigung des gewünschten Enzyms durchgeführt werden und gleichzeitig würde das Mikropartikel-gebundene Enzym an der Mikropartikeloberfläche gebunden werden und wäre somit in dem in der Erfindung beschriebenen Verfahren einsatzbereit.
„Anheften" bzw. „Binden" einer Substanz an die Mikropartikel kann auch ein unspezifisches, nicht-covalentes Ereignis, z. B. eine Adsorption, sein. Als Beispiel kann eine direkte Anheftung bzw. Bindung von DNA an eine Glasoberfläche genannt werden.
Der Begriff „Magnet", durch den die Partikel eingefangen werden, bezeichnet in diesem Kontext ein Material, das entweder permanent magnetisch ist oder das magnetisierbar ist, oder eine Kombination der genannten ist. Ferromagnetisches Material kann geeigneterweise mit ei nem Permanentmagnet und/oder mit einem Elektromagneten kombiniert werden. Eine Magnetisierung kann entweder durch ein elektrisches Feld oder einen Permanentmagneten durchgeführt werden, das/der mit dem zu magnetisierenden Material in Kontakt gebracht wird. Gemäß der Erfindung können die Gestalt und die Größe des Magneten variieren.
Der Begriff „magnetisches oder magnetisierbares Material" beinhaltet paramagnetische, superparamagnetische oder ferromagnetische Materialien. Als Partikelmaterial ist ein beliebiges der superparamagnetischen Materialien besonders geeignet. Die superparamagnetischen Partikel bilden sich durch Einfluss eines äußeren Magnetfeldes, eines Magnetfeldes, das verschwindet, wenn das äußere Magnetfeld entfernt wird, selbst. Daher bleiben die Partikel getrennt und präzipitieren nicht, was für ihre Verwendung günstig ist. Viele kommerzielle Hersteller liefern magnetische Partikel (sowohl paramagnetische als auch superparamagnetische Partikel), z. B. Bangs Laboratories Inc., Dynal A.S., Advanced Magnetics Inc., Scipac Limited, Paesel + Lorei und CPG Inc. Es kann unter magnetischen Partikeln verschiedener Größen ausgewählt werden, die vorher und auf verschiedenen Wegen aktiviert wurden. Es sind auch magnetische Partikel verfügbar, die auf vielen verschiedenen Wegen modifiziert wurden. Als Beispiele können magnetische Partikel genannt werden, die entweder Carboxy- oder Amino-modifiziert sind. Im Allgemeinen ist Magnetit an einen polymeren Träger, z. B. Latex oder Cellulose, gebunden. CPG Inc. stellt magnetische Partikel her, die aus porösem Glas bestehen. In allen vorher genannten magnetischen Partikeln wurden kleine Magnetitkristalle (1–20 nm) in Polymer und/oder Glas dispergiert, das polymerisiert wird, wodurch ein magnetisierbares Partikel produziert wird. Unter anderem produziert Prolabo magnetische Partikel,. die Magnetit in kontrollierbarer Weise nur im Kern der Partikel haben. Dies ist wichtig, da Eisen in vielen molekularbiologischen Anwendungen, z. B. in einer PCR-Reaktion, nicht in die Reaktionslösung freigesetzt werden darf. In die Lösung freigesetztes Eisen inhibiert das Fortschreiten der Reaktion bei PCR-Reaktionen. Ein magnetisches oder magnetisierbares Material kann auch in einer gelartigen Substanz eingeschlossen sein.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Oberfläche des verwendeten Magneten durch eine getrennte „Membran" von den Mikropartikeln abgetrennt. „Die Membran" kann eine dehnbare Membran aus elastomerem Material sein. Wenn der Magnet in das Gefäß eingetaucht wird, um die Mikropartikel einzufangen, werden sich die Letztgenannten an der Oberfläche der Membran sammeln. Der Magnet wird danach zusammen mit den an der Membran akkumulierten Mikropartikeln in ein zweites Gefäß gegeben. In dem zweiten Gefäß wird der Permanentmagnet von der Membran weggezogen – dies wird die Mikropartikel infolge des geschwächten Magnetfeldes freisetzen. Im Fall eines Elektromagneten wird ein magnetisches Feld für das Sammlungsereignis gebildet und zur Freisetzung der magnetischen Partikel wird das Magnetfeld entfernt. Im Fall eines magnetisierbaren Magneten wird der Magnet magnetisiert, indem ein Permanentmagnet mit dem magnetisierbaren Magneten verbunden wird, um die magnetischen Partikel zu sammeln und zu übertragen; und der Permanentmagnet wird von dem magnetisierbaren Magnet gelöst, um die magnetischen Partikel freizusetzen.
Die „Membran", die in der Erfindung beschrieben wird, bezeichnet z. B. eine Membranfolie, -walze oder vorgeformte Membran. Die Membran kann geeigneterweise damit verbundene Verstärkungs- oder Trägerelemente zur Handhabungserleichterung haben. Das Membranmaterial kann flexibel und dehnbar sein, solange es geformt werden kann, um an den gemäß der Erfindung verwendeten Magnet zu passen. Die Membran ist vorzugsweise dünn oder kann durch Dehnung dünn gemacht werden. Das Membranmaterial ist vorzugsweise ein elastomeres Material, z. B. Silikonkautschuk, Polyurethan, Fluorelastomer, Polychloropren oder chlorsulfoniertes Polyethylen.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Übertragungsvorrichtung, die zum Einfangen von Mikropartikeln und Freisetzen derselben geeignet ist. Die Übertragungsvorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Magneten durch eine dehnbare Membran aus elastomerem Material von den Mikropartikeln abgetrennt ist, so dass eine Membran oder Beschichtung, die dicht bzw. fest an der Magnetoberfläche haftet, den Magnet von den Mikropartikeln abtrennt, das auf die Mikropartikel gerichtete Magnetfeld jedoch schwächt.
Es ist essentiell, das bei Einführung der Übertragungsvorrichtung in das Fluid, um die magnetischen Partikel in Lösung zu sammeln, ein Magnetfeld daran angelegt wird, so dass die magnetischen Partikel infolge des angelegten Magnetfelds an der Übertragungsvorrichtung akkumulieren bzw. sich sammeln. Die erfindungsgemäße Übertragungsvorrichtung kann so realisiert sein, dass sich die Mikropartikel geeigneterweise an der äußeren Oberfläche der Membran sammeln. Der Magnet kann so konzipiert sein, dass die Mikropartikel sich entweder in einem kleinen Bereich (z. B. an der Vorrichtungsspitze) oder in einem wesentlich größeren Bereich sammeln.
Die magnetischen Partikel akkumulieren nicht direkt an der metallischen Oberfläche des Magneten, sondern um die schützende Membran, die den Magneten umgibt. Es ist äußerst bevorzugt, dass die schützende Membran eine äußerst dünne Schutzschicht ist, die fest an dem Magneten oder um denselben sitzt, wodurch in der Lösung die höchst mögliche magnetische Feldstärke erzeugt wird. Im Fall einer Sammlung von Mikropartikeln kann die schützende Membran sogar gedehnt werden, wodurch die Membrandicke verringert wird und das Magnetfeld verstärkt wird. Mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung können Mikropartikel aus kleinen Fluidvolumina unter Verwendung eines extrem kleinen Magnets in kleine Gefäße übertragen werden.
Die Übertragungsvorrichtung und das Probenverarbeitungssystem, beide erfindungsgemäß, werden detaillierter in den folgenden Zeichnungen präsentiert, wobei:
1A eine axiale Querschnittsansicht einer Übertragungsvorrichtung gemäß der Erfindung zeigt, die mit einer dehnbaren Membran ausgestattet ist und auf der Verwendung eines Permanentmagneten basiert, wobei der Magnet in der Partikelfreisetzungsposition ist;
1B eine Übertragungsvorrichtung nach 1A als axiale Querschnittsansicht zeigt, wobei der Magnet zur Sammlung und Übertragung von Partikeln positioniert ist;
1C eine Übertragungsvorrichtung nach 1A und 1B zeigt, wobei die Spitze, die eine Membrangrundlage umfasst, abgelöst ist;
1D den unteren Teil der Übertragungsvorrichtung als partielle Vergrößerung von 1A darstellt;
1E den unteren Teil der Übertragungsvorrichtung als partielle Vergrößerung von 1A darstellt;
2A eine Übertragungsvorrichtung zur Behandlung vieler Proben gleichzeitig zeigt;
2B den unteren Teil der Übertragungsvorrichtung als partielle Vergrößerung von 2A zeigt, wobei die Magneten der Übertragungsvorrichtung eine gemeinsame vorgeformte Membran haben;
2C den unteren Teil der Übertragungsvorrichtung als partielle Vergrößerung von 2A zeigt, wobei die Magnete der Übertragungsvorrichtung Hülsen und eine gemeinsame Membran haben;
2D den unteren Teil der Übertragungsvorrichtung als partielle Vergrößerung von 2A zeigt, wobei die Magnete der Übertragungsvorrichtung getrennte Nasen mit einer Membrangrundlage haben;
3A einen Pipettenkörper und eine Übertragungsvorrichtung zeigt, die während des Betriebs mit dem Pipettenkörper verbunden ist;
3B die Übertragungsvorrichtung gemäß 3A als vergrößerte axiale Querschnittsansicht zeigt;
4A eine Ausführungsform der Erfindung zeigt, die eine pinzettenartige, vereinfachte Übertragungsvorrichtung darstellt;
4B eine Vergrößerung einer Nase mit einer Membrangrundlage zeigt, die an die Ausführungsform von 4A angepasst ist;
4C eine Querschnittsansicht einer Übertragungsvorrichtung gemäß 4A zeigt, wobei der Magnet in der Mikropartikel-freisetzenden Position ist;
4D eine Querschnittsansicht der Übertragungsvorrichtung gemäß 4A zeigt, wobei der Magnet in der Mikropartikel-sammelnden Position ist;
5A–5E eine Übertragungsvorrichtung auf der Basis der Verwendung eines magnetisierbaren Magneten zeigen;
6A ein Probenverarbeitungssystem gemäß der Erfindung zeigt.
1A–1E zeigen eine Übertragungsvorrichtung 2, die zum Einfangen und Freisetzen von Mikropartikeln geeignet ist. Ein Stab 6, der axial vor und zurück bewegt werden kann und als Befestigungsarm für einen Magneten 8 dient, ist in einem rohrartigen Gehäuseteil 4 angeordnet. Der Stab 6 mit dem Magneten 8 an einem Ende kann mit Hilfe von Hebel 10 nach unten zu der Partikel 12-Sammelposition gepresst werden, von welcher die Federkraft der Feder 14 ihn zu der Partikel 12-Freisetzungsposition bringt, wenn Hebel 10 nicht gedrückt ist. In dieser Lösung kann der Magnet 8 ein kräftiger NdFeB(Neodym, Eisen, Bor)-Permanentmagnet sein und der Stab 6 kann aus Magnetismus leitendem Material bestehen. Ein Ende des Gehäuseteils 4 kann mit einer Nase 16 mit einer Membrangrundlage 18 ausgestattet sein. In dieser Lösung kann die Nase 16 als Material dehnbaren Siliconkautschuk mit einer Dicke von 0,1–1,0 mm haben. Die Oberfläche des Magnets 8 kann gegen die Membran 18 der Nase 16 gepresst werden, um die Mikropartikel 12 an der Membrangrundlage 18 (1B und 1A) anzuheften. Die Mikropartikel 12 werden sich ablösen, wenn der Magnet von der Membran 18 weg bewegt wird (1A und 1D).
Der Hebel 10, der durch Pressen mit einem Finger in Betrieb gesetzt wird, ist mit dem Stab 6 verbunden, der sich im Inneren des Gehäuseteils 4 (1A und 1B) bewegt. Er kann in Sammel- und Übertragungsposition blockiert werden. Der Hebel wird durch eine nach oben wirkende Rückholfeder 14 beeinflusst. Wenn der Hebel 10 gegen die äußerste nach unten gerichtete Position gedrückt wird, werden der Stab 6 und an seinem Ende der Magnet 8 gegen die Nase 16 gepresst, so dass die Membrangrundlage 18 der Nase 16 sich dehnen wird und eng bzw. fest gegen den Magneten drücken wird (1B und 1E) um so die Mikropartikel 12 unter den Einfluss eines magnetischen Flusses zu bringen, der möglichst stark ist. Der Gehäuseteil ist auch mit einem Hebel 20 ausgestattet (1A bis 1C), wobei ein Stab 22 damit verbunden ist, mit dessen Hilfe die Nase 16, die gegen den unteren Teil der Übertragungsvorrichtung 2 gepresst ist, vom Gehäuse 4 der Übertragungsvorrichtung 2 losgelöst werden kann (1C). Sobald die Mikropartikel 12 zu dem gewünschten Gefäß übertragen wurden, kann die Nase 16 gelöst werden.
Die oben beschriebene Übertragungsvorrichtung kann nach den Konstruktionsprinzipien realisiert werden, die oben beschrieben wurden, wobei Modifikationen bezüglich der Lage verschiedener Teile, der Geometrie und Materialien ermöglicht werden, z. B. wie sie aus ergonomischen Betrachtungen bei verschiedenen Arbeitspositionen und unter verschiedenen Umständen notwendig sind.
In den 2A–2D ist eine Ausführungsform einer Übertragungsvorrichtung 2' gezeigt, die viele Proben gleichzeitig handhaben kann. Funktionell kann die Übertragungsvorrichtung in gleicher Weise wie die Übertragungsvorrichtung 2 gemäß den 1A–1E realisiert werden, solange berücksichtigt wird, dass Bewegungen von Kontrollorganen, z. B. Hebel 10' und Hebel 20', für jeden Magneten 8 und/oder dazu gehörige Strukturelemente übertragen werden.
2B zeigt eine Ausführungsform, in der die Magnete 8 eine gemeinsame Membran 18' haben, die so vorgeformt ist, dass jeder Magnet 8 seine eigene vorgeformte Vertiefung oder Rille 24 an der Membran 18' hat. Dann können diese Rillen 24 in das Gefäß hängen gelassen werden, in welches die Mikropartikel übertragen werden und/oder in welches die Membran 18' und/oder Mikropartikel, die daran haften können, gewaschen werden, sogar wenn die Magnete 8 in der Mikropartikel-freisetzenden Position sind. Der für Magnet 8 vorgeformte Bereich 24 kann speziell für jede Anwendung konzipiert werden und dementsprechend eine andere Form als die der Rille 24 haben.
2C zeigt eine Ausführungsform, in der Magnete 8 aus Hülsen 26 in eine Mikropartikel-Sammel- und -Übertragungsposition geschoben werden und dann für eine Mikropartikelfreisetzende Position zu den Hülsen 26 zurückgezogen werden. Auf diese Weise kann die Membran 18' mit Hilfe der Hülsen 26 nach unten ausgedehnt werden, wenn es erwünscht ist, Mikropartikel und/oder andere Substanzen, die an der Membran 18' haften könnten, davon in die Fluide in den Gefäßen mit den Magneten 8 in der Mikropartikel-freisetzenden Position zu spülen.
2D zeigt eine Ausführungsform, in der jeder Magnet 8 der Übertragungsvorrichtung 2' seine eigene Nase 16, die mit einer Membrangrundlage 18 ausgestattet ist, wie in dem einen Magnet 8, der für die Übertragungsvorrichtung 2 nach den 1A–1E ausgestattet ist, hat. Die Nasen 16 können dem Wunsch, in fixierter Weise oder mit Hilfe einer getrennten Platte, die z. B. mit Löchern geeigneter Größe ausgestattet ist, miteinander verbunden zu sein, entsprechen.
Die Ausführungsformen gemäß den 2A–2D können so eingestellt werden, dass die Anzahl der Proben, die gleichzeitig gehandhabt wird, wie auch die wechselseitige Positionierung und Größe der Magnete für die Apparat gemäß Standards, die auf die bevorstehende Anwendung angewendet werden, geeignet sind, z. B. für Platten mit 96 oder 384 Vertiefungen geeignet sind.
Die Ausführungsformen gemäß den 1A–2D sind manuell bedienbar, sie können aber so modifiziert werden, dass sie einen Teil eines automatisierten Geräts oder Systems bilden.
Die Ausführungsform einer Übertragungsvorrichtung 2'' gemäß den 3A und 3B ist, um zu funktionieren, mit einem Schaft 32 einer Pipette 30 verbunden. Das Gehäuse 4'' der Übertragungsvorrichtung 2'' ist in geeigneter Weise mit dem Schaft 32 einer Pipette 30 verbunden, z. B. durch Schraubmontage, so dass es bei Betrieb nicht losgelöst wird. Der Schaft 32 der Pipette 30 und die Übertragungsvorrichtung 2'', die miteinander verbunden sind, werden als Übertragungsvorrichtung so bedient, dass der Magnet 8 der Übertragungsvorrichtung 2'' nach unten zu der magnetischen Partikel-Sammelposition gegen den Bodenteil der Nase gedrückt wird (die in den 3A und 3B nicht gezeigt ist, aber der Nase 16, die in den 1A bis 1E gezeigt ist, entspricht), indem der Knopf 10'' an der Pipette 30 gedrückt wird. Dies wird bewirken, dass der Kolben 34 der Pipette 30 den Stab 6'' der Übertragungsvorrichtung 2'' gegen die Feder 14'' drückt, so dass der Magnet 8 am unteren Ende des Stabs 6'' gegen die Membrangrundlage der Nase stoßen wird. Die Feder 14'' wird den Stab 6'' mit dem Magneten 8, der daran befestigt ist, in die magnetische Partikel-freisetzende Position zurückbringen, wenn der Hebel 10'' nicht gedrückt wird. Die in den 3A und 3B gezeigte Ausführungsform kann durch Modifizierung struktureller Elemente so realisiert werden, dass sie zu vielen Arten von Pipettenschäften passt.
Eine vereinfachte Ausführungsform der Übertragungsvorrichtung 2''' ist in den 4A–4D gezeigt. Das Gehäuse 4''' der Übertragungsvorrichtung ist dahingehend pinzettenartig, dass es aus zwei verlängerten Armen 36, 38 besteht, die an ersten Enden verbunden sind und aus einem Material hergestellt sind, das sie flexibel macht, so dass eine Federkraft bestrebt ist, die zweiten Enden der Arme 36, 38 beabstandet zu halten. Ein Stab 6''' ist an dem zweiten Ende des obersten Arms 36 befestigt, wobei der Stab wiederum an seinem Ende einen Magneten 8 befestigt hat. Am zweiten Ende des unteren Arms 38 ist ein Loch 40, in dem Nase 16 platziert ist. Eine Nase 16 mit einer Membrangrundlage 18 ist in 4B gezeigt. In dieser Ausführungsform entspricht die Nase 16 den 1A–1E. In 4C ist die Übertragungsvorrichtung 2''' in der magnetische Partikel-freisetzenden Position; wenn die „Pinzetten"-Arme 36 und 38 zusammengedrückt sind (4D), wird der Stab 6''', der an einem Ende Magnet 8 befestigt hat, in die Nase 16 vorstehen und gegen seine Membrangrundlage 18 drücken, wobei dieselbe ausgedehnt wird, so dass die Membrangrundlage 18 verdünnt wird und fest gegen die Oberfläche des Magneten 8 drückt.
Die Ausführungsform, die in den 4A–4D beschrieben ist, kann auch derart realisiert werden, dass die Arme des pinzettenartigen Körpers, die nach der vorherigen Ausführungsform an ihren Enden verbunden sind, sich zwischen dem ersten und zweiten Ende kreuzen, so dass der Stab und der Magnet an ihrem einen Ende durch die Federkraft gegen die Membran an der Nase gedrückt werden, wodurch die Übertragungsvorrichtung in ihrem Relaxationsmodus in der Partikel-Sammel- und -Übertragungsposition ist. Wenn die Arme demnach an ihren Enden gedrückt werden, werden ihren zweiten Enden auseinander gehen und der Stab mit dem an einem Ende befestigten Magnet wird sich von der Nase nach oben bewegen und zu der Mikropartikel-freisetzenden Position verschoben werden.
Die in den 4A–4D beschriebene Ausführungsform kann außerdem auch in anderer Weise realisiert werden, z. B. so, dass der erste und der zweite Arm Teile eines gebogenen Körpers bilden oder dass die Struktur scherenartig ist. Die Federkraft kann durch das Material der Arme oder durch eine getrennte Feder erzeugt werden. Eine Federkraft, die bestrebt ist, die Arme enger zusammen zu bringen oder weiter voneinander entfernt zu bringen, wird in keiner der Ausführungsformen notwendigerweise auf die Arme angewendet, allerdings kann das enge Zusammenbringen oder das weiter weg Bringen durch den Bediener auf der Basis anderer struktureller Charakteristika, z. B. der scherenartigen Struktur der Übertragungsvorrichtung, kontrolliert werden.
Ein System zur DNA-Reinigung dient als Beispiel für ein System zur Bearbeitung von Proben auf Mikropartikel-Basis. 5 zeigt eine Platte mit vielen Vertiefungen (multiwell-Platte), die in dem Reinigungssystem enthalten ist. Platte 56 hat Vertiefungen 60, 62, 64, 66 und 68, in denen verschiedene Stufen des Reinigungsverfahrens durchgeführt werden können. Bei dem Reinigungsverfahren nach diesem Beispiel sind die Mikropartikel, die in dem Verfahren benötigt werden, in Vertiefung 60, woraus sie mit Hilfe der Übertragungsvorrichtung zu der Waschflüssigkeit in Vertiefung 62 übertragen werden und nach dem Waschen in die Vertiefung 64 übertragen werden, in welche die zu reinigende DNA gegeben wird, welche selbst an den Mikropartikeln angeheftet ist. Als nächstes werden die Partikel zusammen mit der daran gebundenen DNA zweimal in den Vertiefungen 64 und 66 gewaschen. Die Übertragungen von einer Vertiefung zu einer anderen werden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung durchgeführt. Nach den Waschgängen werden die Partikel zusammen mit der noch daran gebundenen DNA in Vertiefung 68 transferiert, die das Elutionsmittel enthält. Sobald die gereinigte DNA sich selbst von den Mikropartikeln abgelöst hat, werden die Letztgenannten mit Hilfe der Übertragungsvorrichtung aus der Vertiefung 68 transferiert, wobei die gereinigte DNA zurückgelassen wird. In dem Reinigungsverfahren nach diesem Beispiel können Mikropartikel sogar direkt aus einem getrennten Lagerungsgefäß in die Waschflüssigkeit in Vertiefung 62 übertragen werden. In anderen Verfahren zur Bearbeitung von Proben können nach jedem Verfahren verschiedene Arbeitsgänge in den Vertiefungen der Platte 56 durchgeführt werden, z. B. Stufen zum Erwärmen, Abkühlen, Mischen, Messen (analytische Verfahren) und Dosieren von Reagentien.
Die Platte 56 kann aus Reihen von Vertiefungen bestehen, z. B. Streifen 58, so dass jeder Streifen die Vertiefungen hat, die benötigt werden, um eine angeordnete Probe zu behandeln. Die Vertiefungen 60, 62, 64, 66 und 68 auf jedem Streifen 58 bilden eine Reihe von Vertiefungen, die die Vertiefungen gut umfassen können, welche benötigt werden, um jede Stufe eines mehrstufigen Bearbeitungsverfahrens durchzuführen. Die Platte 56 kann mehrere angeordnete Streifen 58 umfassen, die optional miteinander verbunden sein können.
Mit diesem System kann eine Dosierung in einfacher Weise automatisiert werden. Die Übertragungsvorrichtung für Partikel wird z. B. zuerst in eine erste Vertiefung 60 eingeführt, aus der die Gesamtmenge an darin dosierten Mikropartikeln gesammelt wird. Dann wird die Übertragungsvorrichtung zusammen mit den daran gebundenen Mikropartikeln bei Bedarf in eine zweite Vertiefung 62 oder direkt in eine dritte Vertiefung 64 eingeführt. Die Vertiefungen 60, 62, 64, 66 und 68 können sich sogar auf getrennten Platten befinden.
Die Übertragungsvorrichtung und die Platte 56, die oben beschrieben wurden, können Hauptkomponenten einer automatisierten Vorrichtung bilden. Die Vorrichtung kann sogar mehrere Übertragungsvorrichtungen umfassen, die mit einem Roboter verbunden sein können, der ihre Funktion entsprechend den durch Verfahren vorgegebenen Umständen kontrolliert.
ANWENDUNGEN DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Übertragung von magnetischem oder magnetisierbarem Material in allen Anwendungen anwendbar, wo es notwendig ist, die zu isolierende oder zu bestimmende Substanz von einem Gefäß in ein anderes zu bringen. Diese Fälle werden unter anderem durch alle Verfahren repräsentiert, in denen die zu isolierende Substanz (Zelle, Bakterien, Protein, Hapten) in einer Probenmatrix ist, die eine Menge partikelförmigen Materials enthält. Auch Fälle, in denen Bestimmungen infolge der Trübung oder Verfärbung der Probenmatrix nicht durchgeführt werden können, sind bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Lebensmittel- oder Bodenproben können als Beispiele für problematische Probenmatrices genannt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird sogar in Fällen angewendet, in denen die Substanz konzentriert werden muss oder von einem Gefäß zu einem anderen übertragen werden muss. Bei Proteinreinigungen gibt es einen großen Bedarf für ein Verfahren, durch welches zusätzlich zur Reinigung die Konzentration des Proteins in einfacher und effizienter Weise erhöht werden könnte. In Anwendungen der Molekularbiologie, die üblicherweise viele Stufen enthalten, besteht ein großer Bedarf für ein einfaches Verfahren zum Übertragen von Material (z. B. DNA-Fragment von einem Gefäß zu einem anderen).
Das Verfahren ist auch auf Immunoassays anwendbar.
Unter Verwendung der Erfindung ist es möglich, Übertragungen von magnetischem oder magnetisierbarem Material, die oben beschrieben wurden, in Gefäßen unterschiedlicher Größe durchzuführen (z. B. ein Eppendorf-Röhrchen, eine Platte mit 96 Vertiefungen, eine Platte mit 384 Vertiefungen). Das erfindungsgemäße Verfahren macht es möglich, Proben in sehr kleinen Reaktionsgefäßen zu handhaben. Eine Bearbeitung extrem kleiner Fluidvolumina bzw. Flüssigkeitsvolumina in kleinen Gefäßen ist z. B. auf dem Gebiet der Molekularbiologie sehr wesentlich.
Die erfindungsgemäße Übertragungsvorrichtung kann eine von Hand gehaltene oder in einem Ständer gehaltene Vorrichtung zur Bearbeitung einer Probe oder mehrerer Proben gleichzeitig sein, sie kann ein Teil einer größeren Apparatur sein oder kann in einer umfassenden automatisierten Anlage enthalten sein.
Eine Ausführungsform der Erfindung, die auf die Nucleinsäureisolierung, Enzymbearbeitung und -reinigung anwendbar ist, ist in Schema 2 dargestellt. Unter Verwendung der Erfindung kann die Nucleinsäure mit löslichen Enzymen (A) behandelt werden, wonach die Nucleinsäure ohne die Enzyme in ein anderes Reaktionsgefäß überführt wird, in dem sie reversibel an magnetisches oder magnetisierbares Material (B) gebunden wird. Die Nucleinsäure kann auch mit Enzymen behandelt werden, die an ein magnetisches oder magnetisierbares Material (C) gebunden sind. Diese Enzyme können entweder verwendet werden, um die Nucleinsäuren zu bearbeiten, oder um Enzyme, die gegebenenfalls im Reaktionsgemisch vorliegen, zu inaktivieren. Nach der Bearbeitung bzw. dem Processing erfordert die Nucleinsäure keine Reinigung, da die Processing-Enzyme bereits mit Hilfe der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus dem Reaktionsgefäß entfernt wurden. Die Erfindung ermöglicht auch die Verwendung willkürlicher Kombinationen der Verwendung löslichen und gebundenen Enzyms, wie auch eine Nucleinsäurereinigung beim Nucleinsäure-Processing.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zur Verdauung von Nucleinsäure mit Restriktionsenzymen und auch auf die Verwendung anderer Enzyme, die in Verfahren und Anwendungen der Molekularbiologie eingesetzt werden, anwendbar. Das an Mikropartikeln immobilisierte Enzym wird in das Reaktionsgefäß eingeführt, wo die enzymatische Reaktion über die notwendige Zeit ablaufen gelassen wird. Nach der Reaktion werden die Mikropartikel zusammen mit dem daran gebundenen Enzym aus dem Reaktionsgefäß entfernt. Auf diese Weise wird eine Inaktivierung des immobilisierten Enzyms unnötig. Das in der Reaktion eingesetzte immobilisierte Enzym wird zu der Waschvertiefung übertragen, wo Reste des Reaktionsgemisches weggewaschen werden. Die einmal gewaschenen immobilisierten Enzyme werden zu einem dafür bereitgestellten Gefäß transferiert um wieder verwendet zu werden.
Nach Bearbeitung mit Restriktionsenzymen kann das Reaktionsgefäß z. B. mit an Mikropartikeln immobilisiertem CIP-Enzym (Phosphatase aus Kälberdarm) oder anderem immobilisiertem Enzym, das für die bevorstehende Anwendung notwendig ist, beschickt werden. Wenn diese verwendet werden, wird das oben beschriebene Verfahren angewendet und es werden dieselben Vorteile wie bei Verwendung von Restriktionsenzymen erhalten.
Da die Enzyme, die einmal verwendet wurden, entfernt werden können, wird insgesamt eine Stufe zur Enzyminaktivierung eliminiert. Gleichzeitig ist das Verfahren wesentlich einfacher und schneller als das traditionelle mit Enzyminaktivierung. Bei dem in Schema 1 für den Fall eines einfachen Restriktionsenzyms und einer CIP-Behandlung dargestellten Vergleich ist zu erkennen, dass in dem neuen Verfahren viele Stufen weggelassen sind, da sie unnötig sind.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, in dem eine an Mikropartikel immobilisierte Protease (z. B. Proteinase K) verwendet werden kann, um ein lösliches Enzym, das im Reaktionsgefäß vorliegt, zu inaktivieren. Proteinase K ist ein sehr gängiges Enzym mit vielen Anwendungen. Unglücklicherweise ist dieses Enzym sehr stabil und erfordert eine effiziente Inaktivierung (z. B. Phenolextraktion). Nach der beschriebenen Erfindung kann Proteinase K in immobilisierter Form verwendet und dann sehr effizient aus dem Reaktionsgefäß entfernt werden. Bei diesem Modus komplementiert die immobilisierte Proteinase K die Vorzüge der Erfindung als allgemeines Inaktivierungsverfahren für Enzyme. Dieser Modus ist speziell z. B. in Fällen, in denen das zu inaktivierende Enzym nicht in eine immobilisierte Form gebracht werden kann, das zu inaktivierende Enzym als Kontaminante im Reaktionsgemisch vorliegt oder, wenn es erwünscht ist, eine Gesamt-Enzyminaktivierung im Reaktionsgemisch sicherzustellen, sehr vorteilhaft. Die immobilisierte Proteinase K ergänzt die Verwendung der Erfindung in großem Maßstab, unter anderem in Anwendungen der Molekularbiologie.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf eine Nucleinsäureisolierung und -reinigung anwendbar. Als Anwendungen können z. B. Reinigung von Plasmid-DNA, cDNa, mRNA und Reinigung von PCR-Amplifikationsprodukten genannt werden. Die Erfindung ermöglicht auch eine Reinigung von Nucleinsäuren aus schwierigen Probenmatrices.
Das Verfahren gemäß der Erfindung hat auch auf Gebieten, auf denen an magnetischem Material immobilisierte Enzyme im Vergleich zu dem gegenwärtigen Verfahren zusätzlich Vorteile bringen, besonders günstige Anwendungen.
Mit dem Verfahren gemäß der Erfindung kann das immobilisierte Enzym zur Wiederverwendung aus einem Reaktionsgemisch gesammelt werden. Mit dem Verfahren kann das immobilisierte Enzym auch von einem Dosierungsgefäß in das Reaktionsgemisch übertragen werden. Wenn es erforderlich ist, können Mikropartikel, die mit Hilfe eines Magneten eingefangen wurden, in eine Waschflüssigkeit eingeführt werden, um Glycerin oder andere Konservierungsstoffe vor der Einführung derselben in das Reaktionsgemisch abzuwaschen. Im Waschgefäß können die Mikropartikel bei Bedarf aus dem magnetischen Feld freigesetzt werden, um die Partikel freizusetzen und das Waschen effizienter zu machen.
Die Erfindung ist auch zur Proteinreinigung gut geeignet. Besonders empfehlenswerte Wege zur Proteinreinigung sind die verschiedenen Affinitäts-Reinigungsverfahren. Mit den in der Erfindung beschriebenen Verfahren können Proteine auch aus einer sehr schwierigen Probenmatrix (die z. B. zerrissene Zellen enthält) gereinigt werden und die Proteine können in ein sehr kleines Volumen eluiert werden.
Die Übertragungsvorrichtung gemäß der Erfindung ermöglicht eine Handhabung zahlreicher Proben, wenn sie mit einer automatisierten Anlage verbunden ist. Die beschriebene Erfindung ermöglicht die Handhabung von Proben in sehr kleinen Fluidvolumina und sehr kleinen Reaktionsgefäßen. Die Handhabung von kleinen Volumina, die mit der durch die Erfindung beschriebenen Membrantechnik möglich gemacht wurde, bringt große Einsparungen bei den Kosten für Reagentien.
In der durch die Erfindung beschriebenen Übertragungsvorrichtung ist der Kontakt zwischen dem Magneten und der schützenden Membran dicht bzw. fest. Dies ist wichtig, wenn gewünscht wird, die Reproduzierbarkeit und Stärke des durch einen kleinen Magneten erhaltenen Magnetfelds sicherzustellen. Speziell in dem durch die Erfindung gezeigten Fall, in dem die schützende Membran dünn und dehnbar ist, wird eine ideale Situation verwirklicht, wenn mit kleinen Fluidvolumina und kleinen Reaktionsgefäßen gearbeitet wird. Sollte der Magnet von einer fixierten, nicht-dehnbaren schützenden Haube umgeben sein, könnte der Kontakt mit dem Magneten nicht reproduzierbar und dicht bzw. fest gemacht werden. Gleichzeitig würde der Magnet mit einer schützenden Haube einen beträchtlich größeren Durchmesser haben als die durch die Erfindung beschriebene Vorrichtung. Sollte der Magnet von einer schützenden Membran oder Beschichtung frei sein, so würde dies als eine sehr unpraktische Lösung mit großem Risiko für eine Kontamination verstanden.
Als Beispiele für Anwendungen gemäß der Erfindung können die Folgenden genannt werden:
1. Klonierung von DNA-Inserts

Restriktionsenzyme
Bildung von stumpfen Enden (z. B. thermostabile Polymerasen, Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I, Mungbohnen-Nuklease)
Ligation (z. B. T4-DNA-Ligase, E. coli-DNA-Ligase, T4-RNA-Ligase)
Phosphorylierung (z. B. T4-Polynukleotid-Kinase)
Dephosphorylierung (z. B. CIP, E. coli-alkalische Phosphatase, T4-Polynukleotid-Kinase)
Verschachtelte Deletionen (z. B. T4-DNA-Polymerase, thermostabile Polymerasen, Exo III-Nuklease, Mungbohnen-Nuklease).

2. Synthese und Klonierung von cDNA

Z. B. reverse Transkriptase, RNase H, DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase I, E. coli-DNA-Ligase.

3. Markierung von Nucleinsäuren

5'-Markierung (z. B. T4-Polynukleotid-Kinase)
3'-Addition (z. B. T4-RNA-Ligase)
3'-Auffüllung (z. B. Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase)
3'-Austausch (z. B. T4-DNA-Polymerase, thermostabile Polymerasen)
Nick-Translation (z. B. E. coli-DNA-Polymerase I, thermostabile Polymerasen)
Verdrängungs-Synthese (z. B. T4-DNA-Polymerase, thermostabile Polymerasen, Exo III-Nuklease)
Statistisches Priming (z. B. Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I, thermostabile Polymerasen)
RNA-Sonden (z. B. T7-RNA-Polymerase, SP6-RNA-Polymerase)

4. Sequenzierung von Nucleinsäuren

Sequenzierung von DNA (z. B. E. coli-DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I, thermostabile Polymerasen)
Sequenzierung von RNA (z. B. reverse Transkriptase, thermostabile reverse Transkriptasen).

5. Mutation von Nucleinsäuren

Oligonukleotid-gerichtet (z. B. T4-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase, thermostabile Polymerasen)
Fehlerhafter Einbau (z. B. Exo III-Nuklease, Klenow-Fragment-DNA-Polymerase I, thermostabile Polymerasen).

6. Kartierung

Restriktion (z. B. Exo III-Nuklease)
Footprint-Technik (z. B. Exo III-Nuklease)
Transkript (z. B. reverse Transkriptase, Mungbohnen-Nuklease).

7. Reinigung und Isolierung von Nucleinsäuren

Reinigung von Plasmid-DNA
Reinigung von PCR-Produkten
Reinigung von DNA-Sonden
Reinigung von mRNA
Reinigung von DNA an Agarosegel

8. Assay-Verfahren in der Molekularbiologie

Molekularanalyse von Punktmutationen
DNA-Amplifikationsverfahren [PCR, Inverse PCR, Ligase-Ketten-Reaktion (LCR)]
Quantitative Bestimmung von DNA/RNA
Ribonuklease-Schutzassay
RFLP (Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus)

9. Analytische Verfahren

Arzneimittelanalyse [Durchmusterung kombinatorischer Bibliotheken, Durchmusterung mit hohem Durchsatz (high throughput screening (HTS)]
Lebensmittelanalyse (Pathogene, Arzneimittel, Toxine)
Umweltanalyse (Pestizide, Herbizide, Insektizide)
Diagnostika (Bakterien, Parasiten, Viren, Antikörper, Antigene).

10. Zelltrennung

Isolierung humaner Leukozyten
Isolierung humaner T-Zellen
Isolierung von Krebszellen.

11. Proteinreinigung

Affinitätsreinigung (His-Markierung, Streptavidin-Biotin, Antikörper)

Die oben angeführten Ausführungsformen der Erfindung sind lediglich Vorschläge zur Durchführung des Konzepts der Erfindung. Einem Fachmann auf dem Fachgebiet ist klar, dass die verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung innerhalb des Rahmens der nachfolgend angegebenen Ansprüche variieren können.
12. Beispiele für die Anwendung der Erfindung
In den nachfolgend angeführten Beispielen wird von der Übertragungsvorrichtung für magnetische Partikel gemäß der Erfindung Gebrauch gemacht.
Beispiel 1
DNA-Reinigung aus Agarosegel unter Verwendung Siliciumdioxid-beschichteter paramagnetischer Partikel
Die unten beschriebene DNA-Reinigung erfolgte unter Verwendung der Übertragungsvorrichtung für magnetische Partikel gemäß der Erfindung und gemäß Merck's Silica Paramagnetic Particles for Molecular Biology.
λ-DNA, die mit HindIII verdaut worden war, wurde durch Elektrophorese getrennt und das 6,6 kbp-Fragment wurde aus dem Gel geschnitten. Das Gelstück wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, es wurden 300 μl-Puffer (7 M NaClO₄, 1% Sorbit, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0) zugesetzt. Die Suspension wurde für 10 Minuten in einem Wasserbad mit 50°C inkubiert.
Das Mikrozentrifugenröhrchen wurde aus dem Wasserbad entfernt und die magnetischen Partikel wurden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aufgenommen. Die magnetischen Partikel wurden mit 500 μl Puffer A gewaschen. Das Waschen wurde zweimal wiederholt, wobei als Waschflüssigkeit 500 μl Puffer B [70% Ethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)] verwendet wurden. Nach dem letzten Waschgang wurden die Partikel an der Spitze der Übertragungsvorrichtung trocknen gelassen.
Die Partikel wurden in 20 μl Puffer C (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) suspendiert und 5 Minuten bei 50°C inkubiert. Die Partikel wurden mit der Übertragungsvorrichtung aus der Lösung, in die das DNA-Fragment eluiert worden war, herausgenommen.
Um eine Reinigung zu bestätigen, wurde das DNA-Fragment, das von den Partikeln freigesetzt worden war, zusammen mit einem λ-HindIII-Standard einer Elektrophorese unterzogen.
Beispiel 2
DNA-Reinigung aus einer Lösung unter Verwendung Carboxyl-beschichteter paramagnetischer Partikel
Die unten beschriebene DNA-Reinigung erfolgte unter Verwendung der Übertragungsvorrichtung für magnetische Partikel gemäß der Erfindung und unter Verwendung des PerSeptive Biosystems' BioMag^® DNA Isolation Kit for PCR Products.
100 μl einer 4 μg/ml Plasmid pUC19-Lösung wurden in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Ein 10 μl-Volumen gewaschener DNA-Sep-Partikel wurde zusammen mit 110 μl Hybridisierungspuffer (20% Polyethylenglykol 8000; 2,5 M NaCl) zugesetzt. Die Suspension wurde gemischt und dann bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert.
Die magnetischen Partikel wurden mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus der Lösung herausgenommen. Die Partikel wurden zweimal mit 100 μl Waschlösung (70% Ethanol) gewaschen, wonach sie an der Spitze der Übertragungsvorrichtung trocknen gelassen wurden.
DNA wurde durch Zusatz von 30 μl Elutionspuffer (10 mM Tris, pH 8) von den Partikeln eluiert und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Partikel wurden aus der DNA-enthaltenden Lösung unter Verwendung der Übertragungsvorrichtung aufgenommen.
Um die Reinigung zu bestätigen, wurde die gereinigte pUC19-DNA, die von den Partikeln freigesetzt worden war, mit pUC19 und λ-HindIII-Standards einer Elektrophorese unterworfen.
Beispiel 3
Plasmid-DNA-Reinigung aus Escherichia coli-Bakterienzellen unter Verwendung Carboxyl-beschichteter paramagnetischer Partikel
Die unten beschriebene DNA-Reinigung erfolgte unter Verwendung der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung für magnetische Partikel und unter Verwendung des PerSeptive Biosystems' BioMag^® Mini-Prep DNA Purification Kit. Das 9,0 kbp-Plasmid, das isoliert werden sollte, wurde in E. coli-Zellen transformiert.
3 ml Bakterienzellkultur wurden zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Zellpellet wurde in 30 μl Lösung 1 (50 mM Glucose, 25 mM Tris, 10 mM EDTA) suspendiert. 10 μl RNase und 60 μl Lösung 2 (0,2 M NaOH, 1 % SDS) wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden 45 μl Lösung 3 zugesetzt (3 M Kalium, 5 M Acetat) und die Suspension wurde auf Eis für 10 Minuten inkubiert. Das Gemisch wurde für 10 Minuten bei 15.800 × g zentrifugiert.
Der Überstand wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 10 μl gewaschene DNA-Sep-Partikel enthielt, transferiert. 150 μl 2x Hybridisierungslösung (20% Polyethylenglykol 8000; 2,5 M NaCl) wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert.
Magnetische Partikel wurden unter Verwendung der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus der Lösung aufgenommen. Die Partikel wurden zweimal mit 200 μl Waschlösung (70% Ethanol) gewaschen, wonach sie an der Spitze der Übertragungsvorrichtung trocknen gelassen wurden.
DNA wurde durch Zugabe von 30 μl Elutionslösung (10 mM Tris, pH 8) aus den Partikeln eluiert und für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Partikel wurden mit der Übertragungsvorrichtung aus der DNA-enthaltenden Lösung herausgenommen.
Um die Reinigung zu bestätigen, wurde die gereinigte Plasmid-DNA, die von den Partikeln freigesetzt worden war, zusammen mit λ-HindIII-Standards einer Elektrophorese unterzogen.
Beispiel 4
DNA-Verdau unter Verwendung eines an magnetischen Partikeln immobilisierten Restriktionsenzyms
25 μg Restriktionsenzym BglII und 1,3 mg gewaschene Dynal's Dynabeads^® M-280 Tosylactivated Superparamagnetic Particles wurden in 160 μl 0,1 M Boratpuffer, pH 9,5, suspendiert. Die Suspension wurde für 7 Tage bei 8°C unter leichtem Mischen inkubiert.
Die magnetischen Partikel wurden mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus der Lösung aufgenommen und zweimal bei 4°C für 5 min jeweils mit PBS-Puffer [Phosphat-gepufferte Salzlösung, die 0,1 % (G/V) BSA (Rinderserumalbumin) enthält] gewaschen. Die Partikel wurden einmal bei 8°C für 2 Tage in 0,2 M Tris-Puffer (pH 8,5; 0,1% BSA) gewaschen und einmal bei 4°C für 5 min mit PBS-Puffer gewaschen. Die gewaschenen Partikel wurden in 160 μl PBS-Puffer suspendiert.
1 μg λ-DNA in 50 μl 6 mM Tris-Puffer [pH 7,9; 150 mM NaCl; 6 mM MgCl₂; 1 mM DTT (Dithiothreitol)] wurde bei 37°C für 1 h unter Verwendung verschiedener Mengen an Re striktionsenzym BglII, das an magnetischen Partikeln immobilisiert war, verdaut. Nach dem Verdau wurden die magnetischen Partikel mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus der Lösung herausgenommen.
Um die Reinigung zu bestätigen, wurde die verdaute DNA zusammen mit λ-HindIII-Standard und löslicher, mit BglII-verdauter λ-DNA einer Elektrophorese unterzogen.
Beispiel 5
Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten unter Verwendung von CIP, die an magnetischen Partikeln immobilisiert ist
10 mg gewaschener Prolabo's Estapor EM2 100/40 Superparamagnetic Particles wurden in 900 μl 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4; 150 mM NaCl; 1 mM MgCl₂; 0,1 mM ZnCl₂) suspendiert. 2 mg DSS (Disuccinatimidylsuberat), suspendiert in 100 μl DMF (N,N-Dimethylformamid), wurden der Suspension zugesetzt. Die Suspension wurde unter langsamem Mischen für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die magnetischen Partikel wurden mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus der Lösung herausgenommen und einmal mit 1 ml und einmal mit 0,5 ml Phosphatpuffer bei Raumtemperatur gewaschen.
Die Partikel wurden in 200 μl Phosphatpuffer, der 160 μg CIP (Phosphatase aus Kälberdarm) enthielt, suspendiert und die Suspension wurde für 30 min unter langsamem Mischen bei Raumtemperatur inkubiert.
Die magnetischen Partikel wurden mit der Übertragungsvorrichtung aus der Lösung herausgenommen und bei Raumtemperatur zweimal mit 0,5 ml Phosphatpuffer gewaschen. Die Partikel wurden in 1 ml 35 mM Tris-Puffer (pH 8,0; 50 mM KCl; 1 mM MgCl₂; 0,1 M ZnCl₂) suspendiert und bei Raumtemperatur unter langsamem Mischen 30 min inkubiert.
Die magnetischen Partikel wurden mit der Übertragungsvorrichtung aus der Lösung herausgenommen und zweimal mit 1 ml 10 mM Tris-Puffer (pH 8,0; 50 nM KCl; 1 mM MgCl₂; 0,1 M ZnCl₂) bei Raumtemperatur gewaschen. Die Partikel wurden in 1 ml desselben Puffers resuspendiert.
Plasmid pUC19-DNA wurde mit dem löslichen Restriktionsenzym BglII unter Erhalt von 1568 bp- und 1118 bp-Fragmenten geschnitten. 0,5 μg der Fragmente wurden für 1 h bei 37°C mit unterschiedlichen Mengen an CIP, die an magnetische Partikel gebunden war, inkubiert. 10 μl 10 mM Tris (pH 7,9; 10 mM MgCl₂; 1 mM DTT; 50 mM NaCl) wurde als Reaktionspuffer verwendet.
Nach Dephosphorylierung wurden die Partikel mit daran immobilisierter CIP mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus dem Reaktionsgemisch herausgenommen.
7,5 μl H₂O, 2 μl 300 mM Tris (pH 7,8; 10 mM MgCl₂; 100 mM DTT; 10 mM ATP) und 0,5 μl Ligase (3 U/μl) wurden den dephosphorylierten Fragmenten zugesetzt und das so erhaltene Reaktionsgemisch wurde für 17 h bei 15°C inkubiert.
Die mit Ligase behandelten DNA-Fragmente wurden mit λ-HindIII-Standard, Ligationskontrollen und nicht-geschnittenem Plasmid pUC19 einer Elektrophorese unterzogen, um die Funktionalität von CIP, die an magnetischen Partikeln immobilisiert war, zu bestätigen.
Beispiel 6
Restriktionsenzym-Inaktivierung unter Verwendung von Proteinase K, die an magnetischen Partikeln immobilisiert war
0,23 mg B-9-ITC (Biotinisocyanat mit einem Spacer mit neun Atomen) wurde in 50 μl DMF (N,N-Dimethylformamid) gelöst. Dazu wurden 0,45 mg zu biotinylierende Proteinase K, gelöst in 450 μl 50 mM-Boratpuffer, pH 9,5, gegeben. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur für 3,5 h unter langsamem Vermischen inkubiert. Etwaiges, nicht-umgesetzt verbliebenes Biotinylierungsreagens wurde durch Gelfiltration aus der Lösung entfernt. Gleichzeitig wurde der Puffer in PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4) geändert. Die Hälfte der biotinylierten und gelfiltrierten Proteinase K wurde zur Immobilisierung verwendet.
10 mg gewaschene Merck's BioBeads Streptavidin Paramagnetic Particles wurden in 1 ml gelfiltrierter Proteinase K-Lösung suspendiert. Die Suspension wurde unter langsamem Mischen für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Die magnetischen Partikel wurden mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus der Lösung herausgenommen und zweimal mit 1 ml 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4, 150 mM NaCl-Lösung bei Raumtemperatur und achtmal mit 1 ml 6 mM Tris-Puffer (pH 7,5; 6 mM MgCl₂; 100 mM NaCl; 1 mM DTT) bei 50°C für 30 min gewaschen. Die gewaschenen Partikel wurden in 1 ml Tris-Puffer (pH 8,0; 10 mM CaCl₂) suspendiert.
Variierende Mengen an Proteinase K, die an magnetischen Partikeln immobilisiert war, wurden in 35 μl Reaktionslösung, die 35 U Restriktionsenzym BglII in 6 mM Tris-Puffer (pH 7,5; 6 mM MgCl₂; 100 mM NaCl; 1 mM DTT) enthielt, suspendiert und die Suspension wurde für 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach Inaktivierung des Restriktionsenzyms wurden die magnetischen Parikel unter Verwendung der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus der Lösung herausgenommen. Eine Inaktivierung der Restriktionsenzyme BamHI und HindIII mit an magnetische Partikel gebundener Proteinase K wurde auch wie oben für BglII durchgeführt, allerdings unter Verwendung von 6 mM Tris-Puffer (pH 7,9; 6 mM MgCl₂; 150 mM NaCl; 1 mM DTT) als Reaktionspuffer.
Die Restriktionsenzymaktivität nach Inaktivierung wurde unter Verwendung von λ-DNA als Substrat analysiert. Eine Restriktionsenzyminaktivierung wurde elektrophoretisch durch Isolierung von Proben zusammen mit verdautem DNA-Standard bestätigt.
Beispiel 7
Detektion von polyaromatischen Kohlenwasserstoffen unter Verwendung eines Immunoassays auf der Basis magnetischer Partikel
Die Detektion von polyaromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) wurde mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung und dem Strategic Diagnostics' PAHs RaPID Assay^®, das ein enzymgebundener Immunoassay auf der Basis magnetischer Partikel ist, durchgeführt.
150 μl von 2, 10 und 50 ppb-Phenanthren-Standards wurden in Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert, und zwar jeweils in doppelter Ausführung. 150 μl PAHs-Antikörper-Enzym-Konjugat (PAH-Analogon, markiert mit Meerrettichperoxidase) und 300 μl PAHs-Antikörper, gebunden an paramagnetische Partikel (Kaninchen-anti-PAH-Antikörper, kovalent an Mikropartikel gebunden), wurden in die Röhrchen gegeben. Die Reaktionsgemische wurden bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert.
Die magnetischen Partikel wurden mit der erfindungsgemäßen Übertragungsvorrichtung aus den Reaktionslösungen herausgenommen und zweimal mit 600 μl Waschlösung (Wasser plus Detergens) gewaschen.
Die Partikel wurden in 300 μl Farblösung (Wasserstoffperoxid und 3,3',5,5'-Tetramethylbentsidin in einer organischen Base) suspendiert und bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. 500 μl Stopp-Lösung (0,5% Schwefelsäure) wurden in jedes Röhrchen gegeben.
Die Proben wurden spektralphotometrisch bei 450 nm unter Verwendung der Waschlösung als Blindprobe gemessen. Die Resultate wurden in einer Standardkurve aufgetragen.
Schema 1
Schema 2

Claims

Übertragungsvorrichtung (2, 2', 2'', 2'''), die zum Einfangen und Freisetzen von Mikropartikeln (12) geeignet ist, die gebundene, immobilisierte Substanz umfassen, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen Magneten (8) sowie eine dehnbare Membran (18, 18') aus elastomerem Material umfasst, so dass die Membran (18, 18') dicht bzw. fest gegen die Oberfläche des Magneten gepresst ist und den Magneten (8) von den Mikropartikeln (12) abtrennt, das auf die Mikropartikel (12) gerichtete Magnetfeld jedoch nicht wesentlich schwächt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- net, dass das elastomere Material ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Siliconkautschuk, Polyurethan, Fluorelastomer, Polychloropren und chlorsulfoniertem Polyethylen.
Übertragungsvorrichtung (2, 2', 2'') nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Magneten (8) umfasst, der ein in einem rohrartigen Gehäuseteil (4) axial vorwärts und rückwärts beweglicher Permanentmagnet ist und an einem Ende des Gehäuseteils (4, 4') eine Membran (18) umfasst, gegen die die Oberfläche des Permanentmagneten gepresst werden kann, um die Mikropartikel an der Membran (18) einzufangen und von der die Mikropartikel freigesetzt werden können, indem der Permanentmagnet (8) von der Membran (18) wegbewegt wird.
Übertragungsvorrichtung nach Anspruch 1, dadurch ge- kennzeichnet, dass der Magnet aus magnetisierbarem Material hergestellt ist, das durch ein elektrisches Feld oder mit Hilfe eines Permanentmagneten magnetisiert wird und dass der Magnet magnetisiert wird, um Mikropartikel an der Membran einzufangen und dass das magnetische Feld entfernt wird durch Entfernen des magnetisierenden elektrischen Felds oder durch Trennen des Permanentmagneten von dem magnetisierbaren Magneten, um die Mikropartikel freizusetzen.
Übertragungsvorrichtung (2''') nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie mehrere Magnete (8) umfasst, mit denen eine an Mikropartikeln (12) immobilisierte Substanz gleichzeitig von mehreren ersten benachbarten Gefäßen in mehrere zweite benachbarte Gefäße überführt wird.
Übertragungsvorrichtung (2') nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine Membran (18'), die mehreren Magneten (8) gemeinsam ist, die Mikropartikel (12) von den Oberflächen der Magnete (8) abtrennt.
Übertragungsvorrichtung (2') nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung (2') mit Hülsen (26) versehen ist, in denen sich die Magnete (8) in axialer Richtung bewegen und durch die die Membran gedehnt wird.
Übertragungsvorrichtung (2') nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (18') so vorgeformt ist, dass sie für jeden Magnet (8) einen in geeigneter Weise vorgeformten Bereich (24) umfasst.
Übertragungsvorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehäuseteil (4'') der Übertragungsvorrichtung (2'') in geeigneter Weise mit dem Schaft (32) einer Pipette (30) verbunden ist, so dass die Bewegung des Magneten (8) der Übertragungsvorrichtung (2'') mit einer Steuervorrichtung (10'') zur Steuerung der Pipette (30) gesteuert werden kann.
Übertragungsvorrichtung (2''') nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gehäuse (4''') der Übertragungsvorrichtung länglich ist und zwei im Wesentlichen parallele längliche Arme (36, 38) umfasst, wobei sich an einem ersten Ende des ersten Arms (36) ein Magnet (8) befindet und sich an einem ersten Ende des zweiten Arms (38) ein Halter (40) für die Nase (16) befindet und dass die Arme (36, 38) miteinander verbunden sind und dass die Arme optional einer Federkraft unterworfen sind, die bestrebt ist, die ersten Enden der Arme (36, 38) entweder voneinander zu entfernen oder näher zusammenzubringen.
Verfahren zum Übertragen einer an Mikropartikel immobilisierten Substanz aus einem ersten Gefäß in ein zweites Gefäß, wobei die Mikropartikel aus magnetischem oder magnetisierbarem Material bestehen oder die Mikropartikel mit einem magnetischem oder magnetisierbarem Körper verbunden sind und die Mikropartikel, an denen die Substanz immobilisiert ist, mit Hilfe eines Magneten eingefangen werden, der in das erste Gefäß eingetaucht wird, woraufhin der Magnet zusammen mit den daran eingefangenen Mikropartikeln in das zweite Gefäß überführt wird und die Mikropartikel vom Einfluss des Magneten freigesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Magneten von den Mikropartikeln durch eine dehnbare Membran aus elastomerem Material abgetrennt ist, so dass die Membran dicht bzw. fest gegen die Oberfläche des Magneten gepresst ist und den Magnet von den Mikropartikeln abtrennt, das auf die Mikropartikel gerichtete Magnetfeld jedoch nicht wesentlich schwächt.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeich- net, dass das elastomere Material ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Siliconkautschuk, Polyurethan, Fluorelastomer, Polychloropren und chlorsulfoniertem Polyethylen.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeich- net, dass der Magnet ein Permanentmagnet ist, der näher an die Membran gebracht wird, um die Mikropartikel auf der Membran einzufangen und dass der Permanentmagnet weiter von der Membran weggebracht wird, um die Mikropartikel freizusetzen.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeich- net, dass der Magnet aus einem magnetisierbaren Material hergestellt ist, das mit einem elektrischen Feld oder mit Hilfe eines Permanentmagneten magnetisiert wird, um die Mikropartikel auf der Membran einzufangen, und dass das Magnetfeld entfernt wird durch Entfernen des magnetisierenden elektrischen Feldes oder durch Trennen des Permanentmagneten von dem magnetisierbaren Material, um die Mikropartikel freizusetzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikropartikel paramagnetische, superparamagnetische oder ferromagnetische Partikel sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierte Substanz ein Protein, Polypeptid oder Hapten ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeich- net, dass die immobilisierte Substanz ein Restriktionsenzym oder ein DNA- und/oder RNA-modifizierendes Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeich- net, dass die immobilisierte Substanz eine Protease, bevorzugt Proteinase K, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierte Substanz eine Nucleinsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierte Substanz eine Zelle oder ein Virus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die an magnetischen oder magnetisierbaren Mikropartikeln immobilisierte Substanz mit einer Übertragungsvorrichtung übertragen wird, die mit automatisierten Einrichtungen verbunden ist.
Verfahren zur Modifizierung von Nucleinsäure mit einem nucleinsäuremodifizierenden Enzym, dadurch gekenn- zeichnet, dass das an Mikropartikeln immobilisierte Enzym in ein Reaktionsgefäß übertragen wird, in dem die Modifizierung der Nucleinsäure stattfindet und dass das immobilisierte Enzym aus dem Reaktionsgefäß nach dem Verfahren gemäß Anspruch 11 entfernt wird.
Verfahren zum Übertragen von Nucleinsäure, wie zum Beispiel DNA, RNA, aus einem Gefäß in ein anderes, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikropartikel, an die die Nucleinsäure gebunden werden soll, in das Reaktionsgefäß übertragen werden, wobei die Nucleinsäure (DNA, RNA) an die Mikropartikel gebunden ist, wonach die Mikropartikel aus dem Reaktionsgefäß nach dem Verfahren gemäß Anspruch 11 entfernt werden.
Probenverarbeitungssystem auf der Grundlage von Mikropartikel-immobilisierter Substanz, dadurch gekennzeich- net, dass es umfasst: – eine oder mehrere Reihen von Vertiefungen (58), wobei jede Reihe, die bevorzugt parallel zu anderen angeordnet ist, mindestens eine erste Vertiefung (60) umfasst, die die Menge der zu dosierenden Mikropartikel und gegebenenfalls die benötigten Konservierungsmittel enthält und optional eine zweite Vertiefung (62) umfasst, die eine zweite Substanz enthält, in der die Menge der Mikropartikel für eine erste Behandlung, wie zum Beispiel das Waschen, eingetaucht werden kann, bevor sie optional in eine dritte Vertiefung (64) eingeführt wird, wo die zweite gewünschte Behandlung, wie zum Beispiel eine Reaktion, stattfindet und – eine Übertragungsvorrichtung (2', 2'', 2'''), die einen Magneten (8) und eine dehnbare Membran (18, 18') aus elastomerem Material umfasst, so dass die Membran (18, 18') dicht bzw. fest gegen die Oberfläche des Magneten gepresst ist und den Magneten (8) von den Mikropartikeln (12) abtrennt, jedoch das auf die Mikropartikel (12) gerichtete Magnetfeld nicht wesentlich schwächt.
Probenverarbeitungssystem nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das elastomere Material ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Siliconkautschuk, Polyurethan, Fluorelastomer, Polychloropren und chlorsulfoniertem Polyethylen.
Probenverarbeitungssystem nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass jede Reihe von Vertiefungen (58) einen separaten Streifen (58) bildet und dass eine gewünschte Anzahl von Streifen (58), die optional miteinander verbunden sein können, eine Platte (56) bilden.