DE60110256T2

DE60110256T2 - Verfahren zum konzentrieren von analyten in proben

Info

Publication number: DE60110256T2
Application number: DE60110256T
Authority: DE
Inventors: Pierre Puget; Patrick Pouteau; Frederic Ginot; Patrice Caillat
Original assignee: BIOM RIEUX SA; Biom Rieux SA Marcy L Etoile; Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: BIOM RIEUX SA; Biom Rieux SA Marcy L Etoile; Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2001-11-27
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2021-11-28
Also published as: ATE293494T1; FR2817343A1; EP1343586B1; DE60110256D1; US7569398B2; EP1343586A1; AU2002222057A1; WO2002043865A1; US20040023273A1; FR2817343B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein in den Ansprüchen 1 und 2 definiertes Verfahren zum Konzentrieren eines in einer Probe enthaltenen Analyten.
Es betrifft alle Gebiete, in denen ein Analyt aus einer ersten Lösung in eine zweite Lösung überführt werden muss, und dies zum Beispiel aus Gründen der Inkompatibilität der durch die Lösung gebildeten Probe – oder von in dieser Probe enthaltenen Elementen – mit einem auf den Analyten abgestimmten Reagens oder chemischen Verfahren.
Es betrifft auch alle Gebiete, in denen ein Analyt konzentriert werden muss, um ihn nachzuweisen, zum Beispiel indem man ihn mit einem Überführungs- und/oder Nachweisreagens des Analyten reagieren lässt.
Zum Beispiel bestehen zahlreiche In-vitro-Diagnosetests darin, einen gesuchten Analyten mit einem adäquaten Reagens reagieren zu lassen. Das oder eines der Reaktionsprodukte wird anschließend direkt oder indirekt detektiert.
Man kann zum Beispiel die Immunologietests nennen, bei denen die chemische Reaktion eine Antikörper/Antigen-Erkennung ist, oder allgemeiner eine Protein/Ligand-Reaktion, und die Tests durch Nukleinsäure(n)-Sonden, in denen man eine Hybridisierung zwischen Nukleinsäuren detektiert.
Ein Diagnosetest ist um so besser, je höher seine Sensibilität und zugleich seine Spezifität sind. Er ist um so sensibler, je kleiner die Menge des gesuchten Analyten ist, die zu detektieren er ermöglicht. Er ist um so spezifischer, je mehr er nur für den gesuchten Analyten und nicht für ähnliche Analyten positiv ist.
Unter einem Analyten versteht man Korpuskeln oder Moleküle, die man isolieren, in ein anderes Medium überführen und/oder konzentrieren möchte, damit sie benutzt und/oder nachgewiesen werden können. Es handelt sich dabei zum Beispiel um einen Mikroorganismus, ein Bakterium, einen Pilz, ein Virus, ein Eukaryont; eine chemische Verbindung, ein Molekül wie ein Peptid, ein Protein, ein Enzym, ein Polysaccharid, ein Lipid, ein Lipoprotein, ein Lipopolysaccharid, eine Nukleinsäure, ein Hormon, ein Antigen, einen Antikörper, einen Wachstumsfaktor, ein Hapten; eine Zelle wie etwa eine Tumorzelle usw.
Stand der Technik
Zahlreiche Diagnosetests werden durchgeführt nach Schritten zur Extraktion der Targetanalyten der biologischen Proben, zur Reinigung zur Eliminierung der die Leistungen des Tests verfälschenden Produkte, zur Konzentration der Targetanalyten zur Erhöhung der Analytmenge pro Puffervolumeneinheit und zur Auflösung der Targetanalyten in einem Puffer, um sie chemisch zugänglich zu machen.
Außerdem, um die Sensibilität und die Spezifität eines Tests zu erhöhen, der ermöglicht, einen Analyten nachzuweisen, ist es manchmal notwendig, das Puffervolumen zu reduzieren, in dem sich die Exemplare des gesuchten Analyten befinden, und dabei die Integralität dieses Letzteren zu wahren.
Die Biologen haben ganz und gar klassische Mittel oder Einrichtungen zur Konzentration eines Analyten insbesondere durch die Anwendung von Techniken der Zentrifugierung, der Filtration und/oder der magnetischen Sedimentation. Diese Techniken erfordern Transfers von Lösungen und Manipulationen von Analyten, die zu einer unvermeidlichen Reduzierung der Menge des analysierbaren Analyten führen.
Zum Beispiel können bei den Verfahren des Zentrifugierens und des magnetischen Sedimentierens die eigentlichen Zentrifugierungs- oder Sedimentationsschritte mehrmals wiederholt werden, wobei die Grenze der Anzahl der Wiederholungen durch das Minimalvolumen der Lösung bestimmt wird, das leicht und zuverlässig mit einer klassischen Pipette verändert werden kann. Dieses Minimalvolumen hat die Größenordnung von ungefähr zehn Mikrolitern. Darunter (en-deça) verliert man Flüssigkeit und folglich Analyt, indem man ihn in "dicken" Behältern wie Pipettenkonussen, Flaschen usw. transportiert. Außerdem stellt sich das Problem der Verdampfung und Adsorption an den Wänden des Behälters während diese Handhabungen.
Das Dokument WO-A-9426414 beschreibt ein Verfahren zum Transport eines an magnetischen Teilchen fixierten Analyten von einem ersten Behälter zu einem zweiten.
Im Falle einer schwachen Konzentration des Analyten in einer Ausgangsprobe kann dies zu einem völligen Verschwinden des Analyten führen oder seine Menge derart reduzieren, dass er nicht mehr detektierbar ist.
Außer den erwähnten Nachteilen sind diese Manipulationen in materieller Hinsicht teuer und kosten sehr viel Zeit.
Dies bleibt ein konstantes Problem für zahlreiche industrielle Anwendungen, zum Beispiel die Detektion von pathogenen Mikroorganismen in einer biologischen Probennahme oder einer industriellen Probe.
Es existiert also echter Bedarf an einem Verfahren und einer Vorrichtung, die ermöglichen, einen Analyten aus einer ersten Lösung in eine zweite Lösung zu überführen und/oder einen Analyten zu konzentrieren und dabei die anfänglich vorhandene Analytmenge zu erhalten, und dies, um zum Beispiel die Sensibilität und die Spezifizität der Diagnosetests und jeder den Analyten betreffenden chemischen Reaktion zu erhöhen sowie die oben erwähnten Nachteile zu beseitigen.
Die vorliegende Erfindung entspricht diesem Bedarf und hat nicht nur den Vorteil, die oben erwähnten Nachteile zu beseitigen, sondern, wie der Fachmann feststellen wird, zahlreiche weitere Vorteile.
Darstellung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Konzentrieren eines Analyten, der in einer Probe enthalten ist, bei dem man:

– ausgehend von der Probe, in einem ersten Behälter mit einem Volumen α, der durch einen engen Durchgang mit einem zweiten Behälter mit einem Volumen β verbunden ist, wobei das Volumen β kleiner ist als das Volumen α, eine Lösung A herstellt, in welcher der Analyt an magnetischen Teilchen fixiert ist,
– den an den magnetischen Teilchen des ersten Behälters fixierten Analyten mittels eines magnetischen Systems in den engen Durchgang bewegt,
– den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten im Bereich des engen Durchgangs von den Teilchen freisetzt und
– den Analyten durch Flüssigkeitsverdrängung aus dem engen Durchgang in den zweiten Behälter transportiert, wobei die magnetischen Teilchen im Bereich des engen Durchgangs zurückgehalten werden.

Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren zum Konzentrieren eines Analyten, der in einer Probe enthalten ist, bei dem man:

– ausgehend von der Probe, eine Lösung A herstellt, in welcher der Analyt an magnetischen Teilchen fixiert ist,
– die Lösung A in einen ersten Behälter mit einem Volumen α einführt, der über einen engen Durchgang mit einem zweiten Behälter mit einem Volumen β verbunden ist, wobei das Volumen β kleiner ist als das Volumen α,
– den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten mittels eines magnetischen Systems aus dem ersten Behälter in den engen Durchgang bewegt,
– den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten im Bereich des engen Durchgangs von den Teilchen freisetzt und
– durch Flüssigkeitsverdrängung den Analyten aus dem engen Durchgang in den zweiten Behälter transportiert, wobei die magnetischen Teilchen im Bereich des engen Durchgangs zurückgehalten werden.

In der Folge werden die Analyten definiert.
Die Herstellung der Lösung A aus der Probe umfasst einen Schritt, bei der Analyt vorzugsweise auf umkehrbare Art an magnetischen Teilchen fixiert wird. Die Nützlichkeit dieser Umkehrbarkeit wird unten erläutert.
Die magnetischen Teilchen sind von adäquater Größe, insbesondere bezüglich des zu isolierenden Analyten und des Volumens der Lösung A. Sie können zum Beispiel submikrometrisch sein, wenn der Analyt ein Molekül ist.
Die Menge der benutzten Teilchen ist insbesondere abhängig von der Art und der Menge des zu fixierenden Analyten und ihre Anzahl ist vorzugsweise ausreichend, um die Gesamtheit des Analyten zu fixieren. Die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Teilchen können zum Beispiel Produkte der Schutzmarken Dynabeads der Firma Dynal (Norwegen) oder MACS der Firma Miltenyi Biotech (Deutschland) oder auch Produkte der Firma Immunicon Corp. (USA) sein.
Generell werden die verwendbaren magnetischen Teilchen üblicherweise in der Molekular- oder Zellularbiologie benutzt. Sie müssen insbesondere superparamagnetisch sein, um nach Annullierung des Magnetfelds wieder spontan zu diffundieren.
Beispiele von Protokollen des Fixierens oder Einfangens des Analyten durch die magnetischen Teilchen kann man zum Beispiel in den Referenzen Bioscience Product Catalogue 2000 und Miltenyi Biotec, Tri Magnétique de Cellules, Séparation de biomolécules 1999 finden. Die hauptsächlich verfügbaren Teilchen sind die Teilchen von Dynal, Seradyn, BioMag, spherotec oder Estapor (Schutzmarken). Solche Teilchen können überzogen sein mit Einfang-Oligonukleotiden, durch Adsorption oder Kovalenz. Die Dokumente US-A-4,672,040 und US-A-5,750,338 beschreiben in der vorliegenden Erfindung verwendbare Verfahren. Eine besonders vorteilhafte Realisierungsart dieser magnetischen Teilchen wird beschrieben in den durch einen der Anmelder unter den folgenden Referenzen eingereichten Patentanmeldungen:

– PCT/FR 97/00912 unter französischer Priorität vom 14. Mai 1996, und
– PCT/FR 97/00011 unter französischer Priorttät vom 6. Januar 1998.

Bei der letzten dieser Patentanmeldungen handelt es sich um thermosensible magnetische Teilchen, von denen jedes einen mit einer Zwischenschicht überzogenen magnetischen Kern hat. Die Zwischenschicht selbst ist mit einer Außenschicht auf Basis eines Polymers überzogen, das fähig ist zur Wechselwirkung mit wenigstens einem biologischen Molekül, wobei das äußere Polymer thermosensibel ist und eine zwischen bestimmte kritische untere Löslichkeitstemperatur (LCST) aufweist, enthalten zwischen 10 und 100 °C und vorzugsweise zwischen 20 und 60 °C. Diese Außenschicht wird synthetisiert aus kationischen Monomeren, die ein Polymer erzeugen, das die Fähigkeit hat, die Nukleinsäuren zu binden. Diese Zwischenschicht isoliert die magnetischen Ladungen des Kerns, um die Inhibitionsprobleme der Verstärkungstechniken dieser Nukleinsäuren zu vermeiden.
Erfindungsgemäß können die freigesetzten magnetischen Teilchen des Analyten mit Hilfe eines magnetischen Systems aus dem zweiten Behälter hinausbewegt werden. Dies kann nützlich sein, zum Beispiel um jede nachteilige Wechselwirkung der Teilchen mit den freigesetzten Analyten und/oder mit chemischen Reagenzien und/oder Einrichtungen zu vermeiden, die benützt werden, um sie nachzuweisen.
Nach der Erfindung ist die Freisetzung des gesuchten Analyten – oder Eluierung des Analyten – zum Beispiel in einer Pufferlösung zum Beispiel durch Erwärmung oder ein anderes adäquates Verfahren durchgeführt werden. Die anwendbaren Freisetzungsverfahren sind all die klassischen Verfahren nach dem Stand der Technik. Die chromatographischen Techniken bieten alle eine Vielfalt von Freisetzungstechniken von Proteinen oder anderen in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung benutzbaren Liganden, zum Beispiel eine pH-Veränderung oder eine Ionenstärkeänderung, oder einen Lösungsmittelwechsel, oder auch den Übergang in einen EDTA oder irgend eine andere chelatbildende Substanz der Metallkationen enthaltenden Puffer, wenn der Analyt an dem Teilchen durch eine Metall-Chelat-Technik an dem Teilchen fixiert wird.
Wenn der Analyt ein Oligonukleotid ist, kann man zum Beispiel bei einem Oligonnukleotid der Länge von 15 bis 25 Basen auf eine Temperatur von 50 bis 60 °C erwärmen, um alle Analyten von den magnetischen Teilchen zu trennen.
Nach der Erfindung ist das magnetische System ein System, das ermöglicht, ein stationäres oder ein variables Magnetfeld zu erzeugen, so dass die magnetischen Kugeln einer Kraft ausgesetzt werden können, die fähig ist, sie festzuhalten oder sie zu bewegen. Es kann eine Gruppe von Magneten oder Spulen sein.
Es kann sich auch um eine integrierte Spule handeln, realisiert zum Beispiel durch Mikrotechnologieverfahren wie etwa eine Abscheidung von Materialien und Maskier-Fotoresists, eine Bestrahlung dieser Resists und Ätzungen von Mustern im μm-Maßstab. Spulen dieses Typs werden zum Beispiel serienmäßig mit Hilfe der vorerwähnten Techniken realisiert, um Lese-Schreibköpfe für Festplatten herzustellen.
Nach der Erfindung können die magnetischen Teilchen, nachdem sie transportiert worden sind, wieder in Suspension versetzt werden, zum Beispiel in dem zweiten Behälter, durch Annullierung des durch das magnetische System erzeugten Magnetfelds.
Nach einer Variante der vorliegenden Erfindung liefern die Erfinder auch ein Verfahren zum Konzentrieren eines in einer Probe vorhandenen Analyten, bei dem man:

– ausgehend von der Probe, eine Lösung A herstellt, in welcher der Analyt an magnetischen Teilchen fixiert ist,
– die Lösung A in einen ersten Behälter mit einem Volumen α einführt, der über einen engen Durchgang mit einem zweiten Behälter mit einem Volumen β verbunden ist, wobei das Volumen β kleiner ist als das Volumen α,
– den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten mittels eines magnetischen Systems aus dem ersten Behälter in den engen Durchgang bewegt,
– den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten im Bereich des engen Durchgangs von den Teilchen freisetzt und
– durch Flüssigkeitsverdrängung den Analyten aus dem engen Durchgang in den zweiten Behälter transportiert.

Nach einer Variante des Konzentrationsverfahrens der vorliegenden Erfindung kann der Analyt in dem zweiten Behälter freigesetzt werden und entweder durch Transport der die Analyten enthaltenden Flüssigkeit oder durch Transport mittels Bewegen einer Flüssigkeit des zweiten Behälters in einen dritten Behälter befördert werden.
Nach der Erfindung kann man mit Hilfe eines magnetischen Systems die freigesetzten magnetischen Teilchen des Analyten des zweiten Behälters durch den engen Durchgang in den ersten Behälter bewegen, oder von dem engen Durchgang in den genannten ersten Behälter.
Nach der Erfindung, wie oben schon beschrieben, kann der Analyt von den magnetischen durch Modifizierung der physikalischen oder chemischen Bedingungen freigesetzt werden, zum Beispiel durch Erwärmung oder durch Reaktion mit wenigstens einer in der anderen Lösung vorhandenen Substanz.
Nach der Erfindung kann ein Agens zur Immobilisierung des Analyten an der Gesamtheit oder einem Teil mindestens einer Wand des zweiten Behälters oder irgendeinem festen Träger, der in dem zweiten Behälter vorhanden ist, fixiert werden. Solche Träger können zum Beispiel gebildet werden durch Siliciumkugeln, durch volle, hohle oder poröse Glaskugeln, durch Quarzteilchen, durch Sandkörner, durch Vermiculit-, Zeolit- und/oder Feldspatkörner, durch Glas- und/oder Steinwolle, durch Tonkugeln, durch Korkteilchen, durch Agglomeration kleiner Teilchen gebildete Polystyrol-, Polyethylen-, Polypropylenkugeln von unterschiedlicher Porosität und Dicke, durch Latexkugeln, durch gelatineüberzogene Kugel und durch Harzkörner.
Nach der Erfindung kann der enge Durchgang die Form einer Kapillare haben. Diese Form kann vorteilhaft sein, um zum Beispiel die Diffusion des Analyten des zweiten Behälters in den ersten Behälter zu begrenzen, wenn der genannte Analyt von den magnetischen Teilchen freigesetzt worden ist.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Verfahren für den Nachweis eines Analyten in einer Probe, bei dem:

– man den Analyten durch Anwendung eines Konzentrationsverfahrens der vorliegenden Erfindung konzentriert,
– man den Analyten in dem zweiten Behälter oder irgendeinem mit dem zweiten Behälter direkt oder indirekt verbundenen Behälter nachweist.

Der zweite Reaktionsbehälter oder irgendein anderer, mit diesem zweiten Behälter direkt oder indirekt verbundener Behälter kann ein Reagens oder Reagenzien enthalten, trocken oder gelöst und dazu bestimmt, mit dem Analyten direkt oder indirekt zu reagieren. Unter "indirekt" versteht man, dass mit dem Analyten oder einem seiner erhaltenen Derivate mehrere aufeinanderfolgende chemische Reaktionen realisiert werden können. Im Stand der Technik werden magnetische Teilchen in Tablettenform beschrieben, zum Beispiel in dem Dokument EP-A-0 811 694. Die Herstellung der Tabletten ist im Stand der Technik ebenfalls gut beschrieben, zum Beispiel in den Dokumenten US-A-4,678,812 und US-A-5,275,016. Diese oben erwähnte Herstellung kann zur Synthese der anderen Tabletten benützt werden, die in der Folge beschrieben werden, zum Beispiel:

– eine Tablette, die strukturelle Bestandteile des Typs dNTP, Einleitungskerne (amorces) oder Ionen enthält, welche die spätere Vergrößerung ermöglichen, wie zum Beispiel beschrieben in dem Patent US-A-5,098,893 oder dem Artikel "Ambiant-temperature-stable molecular biology reagents" von R. Ramanujam et al., Product Application Focus, Vol. 14, Nr. 3, 470-473,
– eine funktionale Bestandteile wie Enzyme enthaltende Tablette, die in Verbindung mit den oben erwähnten strukturellen Bestandteilen die Durchführung einer Vergrößerung ermöglicht. Beispiele solcher Tabletten liefern das Patent US-A-4 891 319, die Patentanmeldungen WO-A-87/00196 und WO-A-95/33488 oder der Artikel "Extraordinary stability of enzymes dried in trehalose: simplified molecular biology", von C. Colaço et al., Bio/Technology, Vol. 10, September 1992, 1007-1011.

Man kann zum Beispiel nach der vorliegenden Erfindung Hybridisierungsstellen vorsehen, die an einer Fläche des zweiten Behälters befestigt sind, so dass sie für den Analyten zugänglich sind, wenn dieser sich in dem zweiten Behälter befindet. Dies kann man zum Beispiel in Form eines integrierten ADN-Chips realisieren. So kann also man nach der vorliegenden Erfindung, wenn der nachzuweisende Analyt eine Nukleinsäure ist, diese durch eine Nukleinsäure-Chip-Technik nachgewiesen werden.
Nach der vorliegenden Erfindung kann der zweite Behälter folglich ein Speicher eines Mikrobauteils sein, zum Beispiel ein Bio-Chip, zum Beispiel ein ADN-Chip. Unter Bio-Chip versteht man irgendeinen Träger an dem Liganden fixiert sind, und insbesondere versteht man unter einem ADN-Träger irgendeinen festen Träger, an dem Nukleinsäuren fixiert sind. Das Fixierungsverfahren der Liganden kann unterschiedlich sein und insbesondere Adsorption oder Kovalenz umfassen, wie zum Beispiel die In-situ-Synthese durch die Photolithographietechniken oder durch ein piezoelektrisches System, durch kapillare Abscheidung von vorgebildeten Liganden. Zur Erläuterung findet man Beispiele dieser auf ADN-Chips angewendeten Bio-Chips in den Publikationen von G. Ramsay, Nature Biotechnology, 16, S. 40-44, 1998; F. Ginot, Human Mutation, 10, S. 1-10, 1997; J. Cheng et al., Molecular diagnostics, 1(3), S. 183-200, 1996; T. Livache et al., Nucleic Acids Research, 22(15), S. 2915-2921, 1994; J. Cheng et al., Nature Biotechnology, 16, S. 541-546, 1998 oder in den Patenten US 4,981,783 (Augenlicht), US 5,700,637 (Southern), US 5,445,934 (Fodor), US 5,744,305 (Fodor), US 5,807,522 (Brown).
Nach der Erfindung kann der zweite Behälter auch eine Eintrittskammer zu einem anderen Behälter eines anderen Verfahrens sein. So kann der zweite Behälter direkt oder indirekt mit einem weiteren Behälter verbunden sein, der für andere den Analyten oder eines seiner Derivate betreffenden chemische Reaktionen oder Verfahrensschritte benutzt wird, zum Beispiel eine Reinigung, eine Verstärkung, eine Markierung usw. Der andere Behälter kann zum Beispiel eine PCR-Kammer sein, um ein Gen zu verstärken, mit anschließend einer Analyse in einem Laborchip ("micro-Total Analysis System": MicroTAS).
Nichtsdestotrotz können alle technischen Verstärkungen benutzt werden. So existieren zur Verstärkung der Nukleinsäuren u.a. folgende Techniken:

– PCR (Polymerase Chain Reaction), wie beschrieben in dem Patent US-A-4 683 195, US-A-4 683 202 und US-A-4 800 159,
– LCR (Ligase Chain Reaction), dargestellt zum Beispiel in der Patentanmeldung EP-A-0 201 184,
– PCR (Repair Chain Reaction), beschrieben in der Patentanmeldung WO-A-90/01069,
– 3SR (Self Sustained Sequence Replication) mit der Patentanmeldung WO-A-90/06995,
– NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) mit der Patentanmeldung WO-A-91/02818,
– SPSR (Single Primer Sequence Replication) mit dem Patent US-A-S 399 491, und
– TMA (Transcription Mediated Amplification) mit dem Patent US-A-5 399 491.

Nach der Erfindung können andere bzw. weitere Reagenzien verwendet werden, etwa lyophilisierte Reagenzien, um zum Beispiel einen homogenen Test zur Detektion des Analyten zu machen, zum Beispiel durch Fluoreszenztransfer.
Erfindungsgemäß ist der Analyt oben in nichteinschränkender Weise definiert.
Es wird nun eine Vorrichtung zum Transportieren eines an in einer Flüssigkeit vorhandnen magnetischen Teilchen fixierten Analyten beschrieben, die umfasst:

– einen ersten Behälter mit einem Volumen α, der eine Flüssigkeit enthält und durch einen engen Durchgang mit einem zweiten Behälter verbunden ist,
– den zweiten Behälter mit dem Volumen β, kleiner als das Volumen α des ersten Behälters, und
– eine magnetisches System, das ermöglicht, die magnetischen Partikel, an denen der Analyt fixiert ist, durch den engen Durchgang aus dem ersten Behälter in den zweiten Behälter zu bewegen.

Einige Elemente dieser Vorrichtung wurden schon in Verbindung mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung beschrieben und müssen im Rahmen der nachfolgenden Beschreibung in Betracht gezogen werden.
Diese Behälter sind zum Beispiel als Reaktionskammern verwendbar. Die oben erwähnten Techniken ermöglichen auch, für den erfindungsgemäßen Transfer von Lösungen- oder eines an Mikroteilchen fixierten Analyten – von einem ersten Behälter in einen zweiten Behälter, zum Beispiel von einer Reaktionskammer in eine andere Reaktionskammer, Kapillaren mit einem Querschnitt von einigen μm² bis einige hundert μm² zu realisieren.
Das Volumenverhältnis α/β kann zum Beispiel 10 bis 1000 betragen.
Der erste Behälter kann zum Beispiel ein Volumen von ungefähr 0,1 bis 100 μm betragen.
Der zweite Behälter kann ein Volumen von ungefähr 0,01 bis 1 μl haben.
Die Erfindung ermöglicht folglich eine Reduzierung des Volumens, die 100- bis 1000-mal größer ist als das, was mit den automatisierten Laboratoriumspraktiken oder "makroskopischen" Systemen nach dem Stand der Technik erreicht werden kann, indem sie Flüssigkeiten mit Pipetten und Fläschchen von einigen zehn μl handhabt. Sie ermöglicht daher, eine Probe um denselben Faktor 100 bis 1000 zu konzentrieren.
Ein Effekt der Techniken des Photolithographierens fester Substrate, zum Beispiel aus Silicium, Siliciumdioxid oder Glas, oder des sehr genauen Formens von Kunststoffen, ermöglicht das Realisieren von Behältern mit submikrometrischen Dimensionen – sogar in der Größenordnung einiger Mikrometer – in mindestens einer Richtung, die folglich bis auf Bruchteile eines Mikroliters reduzierte Volumen haben können.
Der erste Behälter und/oder der zweite Behälter kann/können eine Form haben, die in Richtung des genannten engen Durchgangs konvergiert. Der enge Durchgang kann zum Beispiel die Form einer Kapillare haben, wie beschrieben in dem vorangehenden Paragraphen.
Der enge Durchgang kann zum Beispiel einen zwischen 1 μm² und 1 mm² und vorzugsweise zwischen 100 μm² und 0,1 mm² enthaltenen Querschnitt haben.
Der zweite Behälter und/oder der enge Durchgang kann/können mit Flüssigkeitseintritts-/-austrittskanälen versehen sein. Diese Kanäle haben selbstverständlich einen Querschnitt, der angepasst ist in Abhängigkeit von den Lösungsvolumen, die sie aufnehmen sollen. So können diese Kanäle, um zum Beispiel den Analyten in dem zweiten Behälter durch eine Hybridisierung auf durch einen festen Träger getragenen Fangsonden nachzuweisen, wenn es sich um eine Nukleinsäure handelt, dazu benutzt werden, vor dem Leseschritt die notwendigen Spülungen zu machen.
Die vorerwähnten Vorrichtungen können ein Loch in Form einer Kapillare aufweisen, präsent im Bereich des zweiten Behälters, das diesen direkt mit der Außenseite verbindet. Wenn in dem zweiten Behälter Einfüll- und/oder Transferoperationen von Fluid in den zweiten Behälter stattfinden, dient dieses Loch dazu, das anfänglich in dem Behälter vorhandene Fluid, egal ob Luft oder Flüssigkeit, zu entleeren. Das Vorhandensein von Luft in dem zweiten Behälter ist nur eine Eventualität. Es können Löcher an anderen Stellen vorhanden sein, zum Beispiel im Bereich des engen Durchgangs, des ersten Behälters usw. Diese Verbindungslöcher zur Umgebungsluft können zum Beispiel durch Kugelventile gesteuert werden.
Die Erfindung ermöglicht also dank der Anwendung von Techniken der Mikrotechnologie die Realisierung sogenannter Laborchips, in angelsächsischer Terminologie "lab-on-a-chip" oder auch "micro-Total-Analysis-System" (MicroTAS).
In dem Laborchip-Beispiel kann die in der vorliegenden Erfindung verwendbare Vorrichtung mit anderen Funktionen kombiniert werden, um ein kompletteres und präziseres biologisches Analysesystem zu bilden.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel das erste Element einer Anordnung sein, die umfasst:

1. einen Volumenkonzentrations-/-reduktionsmodul,
2. einen Verstärkungsmodul,
3. einen Trennungsmodul, zum Beispiel durch Elektrophorese,
4. einen Detektionsmodul.

Ein Beispiel einer integrierten Vorrichtung mit den obigen Elementen 2, 3 und 4 wird beschrieben in dem Referenzdokument von M.A. Burns et al. "An Integrated Nanoliter DNA Analysis Device", Science, Vol. 282, 16. Oktober 1998.
Bei bestimmten Realisierungen der vorliegenden Erfindung können die Konzepte der Reaktionskammer und der Transferkanäle also zusammenfallen, da die Laborchips die Durchführung von kontinuierlichen Verfahren ermöglichen, deren Reaktionen in Kapillaren stattfinden, zum Beispiel bei bestimmten Kapillar-Elektrophorese- und PCR-Techniken.
Die Erfindung kann zum Beispiel nützlich sein, wenn der gesuchte Analyt anfänglich in einer Probe von großem Volumen aber begrenzter Menge vorhanden ist.
Die vorgeschlagene Erfindung ermöglicht zum Beispiel, durch die Anwendung der oben genannten Mikrotechnologien eine Lösung von Molekülen zu konzentrieren, die man detektieren möchte, oder einen Analyten aus einer ersten Lösung in eine zweite Lösung mit einem Volumen zu transferieren, das kleiner ist als ein Mikroliter, was bei den klassischen Laborverfahren völlig unmöglich ist.
Die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel in einem automatisierten In-vitro-Diagnosesystem oder einem System zu Detektion biologischer Kontaminationsstoffe auf Gebieten wie etwa der Nahrungsmittelindustrie und/oder der industriellen mikrobiologischen Kontrolle angewendet werden.
Die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel angewendet werden zur verstärkungslosen ultrasensiblen Detektion von Pathogenen in einer biologischen Probe. Die Nukleinsäuren der potentiell in einer Probe vorhandenen Pathogene können durch die üblichen Techniken extrahiert werden. Sie können anschließend gereinigt und konzentriert werden, immer mittels Standardtechniken, bis zu einem Puffervolumen von einigen zehn Mikrolitern.
Die Anwendung der Vorrichtung oder des Mikrobauteils ermöglicht in diesem Fall, das biologische Material in dem Volumen der Reaktionskammer zu konzentrieren, das der zweiten Komponente entspricht. Hier ermöglichen die späteren Schritte der Hybridisierung auf einem planen Träger und der Detektion, das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein von Nukleinsäuren von bestimmter, für die Infektion der Probe charakteristischer Sequenz zu detektieren.
Die Anwendung der Erfindung ermöglicht also, die Sensibilität eines Tests sehr stark zu erhöhen – bei gleichen Leistungen des Detektionssystems.
Die vorliegende Erfindung kann zum Beispiel angewendet werden, um die Immunitätstests (immuno-essais) zu verbessern. Bei den Immunitätstests, bei denen sich ein Sensibilitätsproblem stellt, ermöglicht die Anwendung der oben beschriebenen Erfindung nämlich, ihre Sensibilität sehr stark zu erhöhen, indem man das biologische Material in einem sehr kleinen Volumen konzentriert.
Bei den Immunitätstests (immuno-essais) mit einer ausreichenden Menge an zu detektierendem biologischen Material ermöglicht die Anwendung der Erfindung also, die Probe zu konzentrieren und folglich die Dauer der immunologischen Reaktion zu verkürzen.
Weitere Merkmale und Vorteile gehen aus den nachfolgenden Beispielen hervor, die nur der Erläuterung dienen, nicht einschränkend sind und sich auf die beigefügten Figuren beziehen.
Kurzbeschreibung der Figuren
Die 1 ist eine schematische perspektivische und explodierte Teilschnittansicht einer ersten Realisierungsart einer gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbaren Vorrichtung,
die 2 ist eine schematische perspektivische und explodierte Teilschnittansicht einer zweiten Realisierungsart einer gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbaren Vorrichtung,
die 3 ist eine schematische perspektivische und explodierte Teilschnittansicht einer dritten Realisierungsart einer gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbaren Vorrichtung,
die 4 ist eine schematische Darstellung eines ersten bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendbaren Magneten, und
die 5 ist eine schematische Darstellung eines zweiten bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendbaren Magneten.
In diesen Figuren bezeichnen identische Bezugszeichen identische Elemente.
Beispiele
Beispiel 1 : Beispiel zur Herstellung der Lösung A
Die biologische Probe wird mit klassischen Mitteln bzw. Einrichtungen der Molekularbiologie behandelt, um eine Lösung zu erhalten, welche die zu detektierenden ARN-Targetmoleküle enthält; diese Lösung hat ein Volumen von 200 μl und die Pufferlösung ist die Folgende: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1 M, Triton X-100 0,05%, Lachs-ADN 0,14 mg/ml.
Dieser Lösung gibt man 2 μl einer Lösung von Fang-Oligonukleotiden bei; diese Fang-Oligonukleotiden-Lösung wird gebildet durch: Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8, Fang-Oligonukleotiden 10¹¹/μl; das Fang-Oligonukleotid ist ein 5'-biotyniliertes Oligonukleotid einer Sequenz von zum Beispiel 32 Basen, komplementär zu einer Untersequenz bzw. Teilsequenz der Target-ADN.
Inkubation 2h bei 35°C.
Zugabe von 1 μl Immunicon Corporation Ferrofluid-Streptavidin-Teilchen, unverdünnt.
Inkubation 30 Minuten bei 35°C.
Unter diesen Bedingungen werden mehr als 95 % der Targetmoleküle auf den magnetischen Teilchen immobilisiert.
Beispiel 2 : Vorrichtung gemäß einer ersten Realisierungsart
Die in diesem Beispiel beschriebene Vorrichtung ist ein Mikrobauteil, das ermöglicht, das Puffervolumen, in dem sich ein gesuchter Analyt befindet, um den Faktor 100 bis 1000 zu reduzieren und dabei die in der ursprünglichen Probe enthaltene Analytmenge beizubehalten.
Die generelle Architektur des Bauteils 1 ist in der 1 dargestellt. Sie wird gebildet durch eine Einführungskammer 3, eventuell verlängert durch eine Einführungseinrichtung, gebildet durch die Teile 13 und 15, die durch einen engen Durchgang 5 verbunden ist mit einer Reaktionskammer 7, hier dargestellt in Form einer Kapillare. Die dargestellten Formen der beiden Kammern sind beispielartig. Die Kammern und die Kapillare können andere Formen oder Größen haben, je nach Anwendung oder Herstellungstechnik des Bauteils. Die 1 suggeriert eine Herstellungsmethode, nach der die Kammern und der enge Durchgang des Bauteils in ein planes Material geätzt werden, das dann durch Klebung oder irgendeine andere Befestigungsart mit dem Deckel 11 verbunden wird. Dies ist eine mögliche Herstellungsart, aber die Verfahren der Erfindung hängen nicht von dieser Herstellungsart ab. Zur Herstellung der Vorrichtung könnte auch irgendeine andere Technik angewendet werden, die insbesondere ermöglicht:

• direkte Vertiefungen in einem Material zu realisieren, um Hohlräume mit der Form der Kammern und des engen Durchgangs zu schaffen,
• oder die Kammern 3 und 7 sowie den engen Durchgang in der oberen Platte – in dem Beispiel der Deckel 11 – anstatt in der unteren Platte zu realisieren.

Man kann zum Beispiel die "LIGA"-Bildtechniken (technique ả l'image de la "LIGA") nennen, welche die Lithographie, die Galvanoplastik und das Formen bzw. Gießen (moulage) benutzen.
Ein Loch 9 ermöglicht die Entleerung der gasförmigen oder flüssigen Fluide, wenn man Flüssigkeiten in die Kammern einführt oder in ihnen transferiert.
Die Probe und die verschiedenen Reagenzien oder Puffer können auf verschiedene Weisen in die Vorrichtungen eingegeben werden. Zwei werden in der Folge als Beispiele angegeben.
Die erste Realisierungsart, dargestellt in der 1, besteht dann, in dem Deckel 11 der Vorrichtung eine Öffnung vorzusehen und diese Öffnung mit einem konischen Trichter zu versehen. Ein zylindrisches Teil 13 dient dazu, den konischen Trichter in Position zu halten und die Dichtheit zwischen dem Trichter und der Vorrichtung sicherzustellen. Indem man in dem konischen Trichter zum Beispiel eine Pipette, ein Ansatzstück eines Verdünnungsgeräts oder einer Spritze ansetzt, kann man den Puffer oder ein Reagens ins Innere der Vorrichtung "pressen", indem man einen Druck auf die Flüssigkeit ausübt. Die Luft oder irgendein anderes flüssiges oder gasförmiges Fluid, das zunächst in der Vorrichtung vorhanden ist, wird durch das Loch 9 entleert. Dieses Loch mündet hier in der Reaktionskammer, aber es kann sich fallweise auch an anderen Stellen der Vorrichtung befinden. Eventuell können auch mehrere Löcher vorgesehen werden.
Eine zweite Realisierungsart zur Einführung der Flüssigkeit in die Vorrichtung ist in der 2 dargestellt. Bei diesem Realisierungsfall 1(a) werden die Flüssigkeiten durch eine Kapillare 17 eingegeben, die selbst durch eine in der Figur nicht dargestellte Schnittstelle mit der Außenseite der Vorrichtung verbunden ist. Der Deckel 19 enthält keine Öffnung.
Beispiel 3 : Konzentration mit Transport auf magnetischen Teilchen
Das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren ermöglicht, das Puffervolumen, in dem sich ein gesuchter Analyt befindet, um einen Faktor 100 bis 1000 zu reduzieren und dabei die in der anfänglichen Probe enthaltenen Analytmenge beizubehalten.
Das Bauteil wird vorher mit Puffer ohne den gesuchten Analyten und ohne magnetische Teilchen gefüllt. Dieser Puffer kann eingefüllt werden, indem man die nötige Menge in den in der 1 dargestellten konischen Trichter 15 gießt und in diesem Trichter einen pneumatischen Druck anwendet. Sobald das Bauteil gefüllt ist, wird der in dem konischen Trichter 15 vorhandene überflüssige Puffer zum Beispiel mit einer Pipette entnommen.
Die mit einer bestimmten Puffermenge – zum Beispiel ungefähr 30 μl – gebildete Probe, in der die gesuchten Analyten vorher an magnetischen Teilchen fixiert worden sind, wird in den konischen Trichter 15 gegeben.
Die magnetischen Teilchen werden anschließend in Richtung Boden der Einführungskammer 3 (1) gezogen, mit Hilfe eines Magneten, zum Beispiel dem Magneten 30 mit der in der 4 dargestellten Form, der sich unter der Vorrichtung befindet, senkrecht unter dem konischen Trichter. Die magnetischen Teilchen versammeln sich dann als Bodensatz.
Mit Hilfe eines anderen Magneten, zum Beispiel dem Magneten 40 mit der in der 5 dargestellten Form, der so geführt wird, dass sich die Vorrichtung in seinem Spalt 42 befindet, wird der Teilchen-Bodensatz angezogen und aus seiner Anfangsposition in der Einführungskammer 3 durch die Kapillare 5 hindurch in die Reaktionskammer 7 transportiert.
Der Analyt wird anschließend durch Erwärmung (Elution) im Innern der Reaktionskammer 7 von den magnetischen Teilchen befreit. Während dieser Reaktion werden die magnetischen Teilchen in der Reaktionskammer 7 eventuell wieder in Suspension versetzt, indem man den Magneten zurückzieht.
Die magnetischen Teilchen sammeln sich in der Reaktionskammer wieder als Bodensatz, indem man wieder einen Magneten benutzt, zum Beispiel mit der in der 4 dargestellten Form. Sie werden anschließend wieder durch die Kapillare transportiert, aber in umgekehrter Richtung, nämlich aus der Reaktionskammer 7 in die Einführungskammer 3, indem man einen Magneten mit der in der 5 dargestellten Form benutzt.
Das Endresultat dieser Folge von Operationen ist der Transport des gesamten Analyten von dem konischen Trichter 15 bis in die Reaktionskammer 7 mit einem sehr viel kleineren Volumen.
Beispiel 4 : Konzentration mit Fluid-Transport
Das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren ist eine Variante des Vorhergehenden.
Wie vorhergehend wird das Bauteil mit Puffer ohne magnetische Teilchen gefüllt. Die mit einer bestimmten Puffermenge – zum Beispiel ungefähr 30 μl – gebildete Probe, in der die gesuchten Analyten vorher an magnetischen Teilchen fixiert worden sind, wird in den konischen Trichter 15 gegeben. Die magnetischen Teilchen werden in Richtung Boden der Einführungskammer 3 (1) gezogen, mit Hilfe eines Magneten mit zum Beispiel der in der 4 dargestellten Form. Die magnetischen Teilchen sammeln sich dann als Bodensatz.
Mit Hilfe eines anderen Magneten, zum Beispiel dem Magneten mit der in der 5 dargestellten Form, der so geführt wird, dass sich die Vorrichtung in seinem Spalt befindet, wird der Teilchen-Bodensatz angezogen und aus seiner Anfangsposition in die Kapillare 5 transportiert (und nicht mehr in die Reaktionskammer 7).
Der Analyt wird anschließend durch Erwärmung (Elution) im Innern der Kapillare 5 von den magnetischen Teilchen befreit. Während dieser Reaktion werden die magnetischen Teilchen in der Kapillare eventuell wieder in Suspension versetzt, indem man den Magneten zurückzieht.
Die magnetischen Teilchen sammeln sich in der Kapillare wieder zu einem Bodensatz, indem man wieder einen Magneten benutzt, zum Beispiel mit der in der 4 dargestellten Form. In diesem Moment sind die Analyten im Innern der Kapillare wieder frei in Lösung. Indem man durch einen Überdruck in dem konischen Trichter 15 Puffer ins Innere der Vorrichtung presst, bewirkt man eine Verschiebung der in der Kapillare befindlichen Flüssigkeit in die Reaktionskammer 7. Die gelösten Analyten werden also durch die Verschiebung der Flüssigkeit in die Reaktionskammer 7 mitgenommen. Hingegen bleiben die magnetischen Teilchen, als Bodensatz festgehalten durch den festen Magneten, in der Kapillare zurück.
Das Endergebnis dieser Folge von Operationen ist wie vorhergehend der Transport des gesamten Analyten von dem konischen Trichter 15 bis in die Reaktionskammer 7 mit einem sehr viel kleineren Volumen.
Nach einer Variante dieses Verfahrens sind die magnetischen Teilchen in Form von trockenen Gebilden in der Einführungskammer 3 schon vorhanden. Solche Gebilde sind gut beschrieben in den Patenten US-A-5,750,338 und 4,672,040. Die Einführung der Probe in die Kammer 3 bringt die magnetischen Teilchen in Lösung, so dass sie sich an dem von Anfang an in der Probe enthaltenen Analyten fixieren können.
Beispiel 5 : Anwendung der Erfindung für den Nachweis des Analyten in einem homogenen Detektionstest
In diesem Beispiel wird der Analyt nachgewiesen, indem man den die Technik der "Molecular Beacons" benutzt, so wie beschrieben in Tyagi, S. and Kramer, F.R., Nat. Biotechnol. 14:30-308, 1996.
Kurz gefasst besteht diese Technik darin, die Targetmoleküle mit Nukleinsonden, den "Molecular Beacons" zu versehen, welche die folgende Struktur haben: die Sondensequenz wird komplementär zu dem Target beiderseits durch zwei einige Nukleotide lange Arme verlängert, komplementär zueinander. Ein Fluorophor, zum Beispiel die EDANS-Gruppe, wird an einem der Arme fixiert, während ein Fluoreszenz-Inhibitor, zum Beispiel die DABCYL-Gruppe, am anderen Arm fixiert wird. Bei Fehlen des Targets hybridisieren sich die beiden Arme der Sonde aufeinander und die Fluoreszenz von EDANS wird durch das DABCYL gelöscht. Wenn die Sonde sich auf dem Target anlagert, sind die beiden Gruppen voneinander beabstandet und die Fluoreszenz von EDANS ist frei. Derart wird das Vorhandensein und sogar die Konzentration des Analyten durch das Fluoreszenzsignal und die Intensität dieses Signals nachgewiesen.
Diese Technik wird bei einer Vorrichtung zum Beispiel wie folgt angewendet:

1. Herstellen der zu analysierenden Lösung A, wobei der Analyt eine Nukleinsäure ist.
2. Füllen des zweiten Behälters 7 der Vorrichtung sowie des engen Durchgangs 5 und des Bodens 3 des ersten Behälters mit einer Nachweisflüssigkeit, welche die vorhergehend definierten, zur Detektion des Analyten notwendigen Nukleinsäuren enthält.
3. Einführen der Lösung A in den ersten Behälter 3, verlängert durch den Konus 15.
4. Magnetisches Konzentrieren der magnetischen Teilchen auf dem Boden des ersten Behälters 3, sodann magnetisches Transportieren der magnetischen Teilchen in den zweiten Behälter 7, zum Beispiel entsprechend den in dem Beispiel 3 beschriebenen Modalitäten.
5. Heizen der gesamten Vorrichtung auf 60°C und Halten dieser Temperatur während 1 bis 2 Minuten. Der Analyt ist dann von den Teilchen befreit.
6. Magnetisches Transportieren der magnetischen Teilchen aus dem zweiten Behälter 7 in den ersten Behälter.
7. Erwärmen auf die zur Hybridisierung der Nuklein-Beacon-Sonde adäquaten Temperatur, zum Beispiel 25°C.
8. Lesen der Fluoreszenz in dem zweiten Behälter 7, zum Beispiel indem man die Vorrichtung unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop, ausgerüstet mit einem Photovervielfacher, platziert.

Der Vorteil dieser Prozedur in Bezug auf den Stand der Technik besteht darin, den Analyten in einem Alpha/beta-Verhältnis zu konzentrieren, zum Beispiel hundertfach, und folglich die Restfluoreszenz der "Molecular Beacons"-Sonden relativ zu verringern und derart den intrinsischen Rauschabstand dieser Analyt-Nachweistechnik in demselben Maße zu vergrößern. Die Empfindlichkeit des Test erhöht sich ebenso.
Beispiel 6 : Anwendung der Erfindung für den Nachweis des Analyten mit Hilfe eines ADN-Chips
Bei diesem Beispiel wird der Analyt durch Hybridisierung auf einem ADN-Chip nachgewiesen. Der ADN-Chip hat in Bezug auf die in dem Beispiel 5 dargestellte Markierungstechnik den Vorteil, viele parallele Hybridisierungen realisieren zu können, also dem Biologen größere Analyseleistungen zu ermöglichen.
In diesem Beispiel ist der Boden des zweiten Behälters 7 ein ADN-Chip, gebildet zum Beispiel durch ungefähr 20 Hybridisierungsstellen. Der Chip wird hergestellt durch ADN-Depots gemäß den Standardmitteln nach dem Stand der Technik der ADN-Chips.
Diese Technik wird bei einer Vorrichtung zum Beispiel wie folgt angewendet:

1. Herstellen der zu analysierenden Lösung A, wobei der Analyt eine Nukleinsäure ist, die durch eine fluoreszierende Gruppierung, zum Beispiel Fluoreszein, durch klassische Mittel nach dem Stand der Technik markiert wird.
2. Füllen des zweiten Behälters 7 der Vorrichtung sowie des engen Durchgangs 5 und des Bodens 3 des ersten Behälters mit dem Hybridisierungspuffer, zum Beispiel: Tris 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 1 M, Triton X-100 0,05%, Lachs-ADN 0,14 mg/ml.
3. Einführen der Lösung A in den ersten Behälter bzw. Konus 15.
4. Magnetisches Konzentrieren der magnetischen Teilchen auf dem Boden des ersten Behälters 3, sodann magnetisches Transportieren der magnetischen Teilchen in den zweiten Behälter 7, zum Beispiel entsprechend den in dem Beispiel 3 beschriebenen Modalitäten.
5. Heizen der gesamten Vorrichtung auf 60°C. Der Analyt ist dann von den Teilchen befreit.
6. Magnetisches Transportieren der magnetischen Teilchen aus dem zweiten Behälter 7 in den ersten Behälter 3.
7. Hybridisieren unter Temperatur- und Zeitbedingungen, die für den betreffenden ADN-Chip adäquat sind. Zum Beispiel Hybridisierung während 30 Minuten bei 40°C.
8. Waschen durch Passieren einer Waschlösung, zum Beispiel Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1 M, Triton X-100 0,05%, durch den zweiten Behälters 7 mit Fluideintritt und – austritt durch die in der 3 dargestellten Öffnungen 21, 22.
9. Lesen der auf dem ADN-Chip vorhandenen Fluoreszenz, zum Beispiel indem man die Vorrichtung unter einem mit einer CCD-Kamera ausgerüsteten Epifluoreszenz-Mikroskop platziert und indem man eine adäquate Vergrößerung wählt.

Wie bei dem vorangehenden Beispiel ermöglicht die Konzentration des Analyten vor seiner Hybridisierung auf dem ADN-Chip eine schnellere Reaktion des Analyten auf dem ADN-Chip. Diese Beschleunigung der Kinetik in Bezug auf den Stand der Technik ermöglicht, entweder die Hybridisierungszeit zu reduzieren oder die Detektionsempfindlichkeit des Systems zu erhöhen, da diese Empfindlichkeit generell durch die Hybridisierungskinetik des Analyten auf dem ADN-Chip begrenzt wird.
Beispiel 7 : Anwendung der Erfindung als Zugangspunkt eines μTAS
In diesem Beispiel dient die Erfindung als Zugangspunkt eines μTAS, das komplexer ist als eine Vorrichtung, die nur zwei durch einen engen Durchgang getrennte Behälter besitzt. Als Beispiel eines μTAS nehmen wir das durch das Team von A. Northrup präsentierte, bestehend aus einer Verstärkungskammer, gefolgt von Kapillarelektrophorese der verstärkten Produkte und einer Detektion (s. Anal. Chem. 1996, 68, 4081-4086).
In diesem Beispiel ist der zweite Behälter nämlich eine PCR-Verstärkungskammer, zum Beispiel hergestellt durch die Mittel der Mikrotechnologien. Diese bedeutet, dass der zweite Behälter eine Heizeinrichtung, eine Kühleinrichtung und einen Temperaturfühler umfasst, was ermöglicht, auf die in dem zweiten Behälter 7 enthaltene flüssige Probe thermische Zyklen anzuwenden. Der diesen zweiten Behälter durchschneidende Fluideingang/-ausgang 21, 22 ist der Einführungskanal – durch Elektrophorese – der in der Trennungskapillare verstärkten Probe. Dargestellt in den Figuren sind weder die Trennungskapillare (s. 1 des obengenannten Artikels) noch die Mikrospeicher, die ermöglichen, die elektrischen Felder anzuwenden, die notwendig sind zur Einführung und dann zur Trennung durch Elektrophorese.
Der zweite Behälter enthält außerdem trockene Zentrifugate bzw. Stoffe (culots), die alle zur Verstärkung durch PCR notwendigen Produkte enthalten; diese Produkte sind durch gut bekannte Techniken "glasifiziert", und die kugelförmigen glasifizierten Stoffe (culots glassifiés), welche die zur Verstärkung notwendigen Produkte enthalten, werden vor dem Anbringen des Deckels in dem zweiten Behälter deponiert. Die Herstellung dieser Stoffe (culots) ist in Dokumenten aus dem Stand der Technik gut beschrieben, zum Beispiel in US-A-4,678,812 und US-A-5,275,016.
Die Trennungskapillare enthält außerdem ein Trennungsgel, zum Beispiel Hydroxyethylcellulose, die selbst einen fluoreszierenden ADN-Markierstoff enthält, zum Beispiel das orange Thiazol. Die ADN-Fragmente werden also im Laufe ihrer elektrophoresischen Wanderung in der Trennungskapillare durch oranges Thiazol markiert Diese Vorrichtung wird zum Beispiel wie folgt benutzt:

1. Herstellen der zu analysierenden Lösung A, wobei der Analyt eine Nukleinsäure ist.
2. Füllen der gesamten Vorrichtung, insbesondere der Kapillaren, mit der Elektrophoreselösung; die Rückstände bzw. Zentrifugate (culots) der in dem zweiten Behälter vorhandenen Reagenzien beginnen sich zu hydrieren.
3. Einführen der Lösung A in den ersten Behälter bzw. Konus 15.
4. Magnetisches Konzentrieren der magnetischen Teilchen auf dem Boden des ersten Behälters 3, sodann magnetisches Transportieren der magnetischen Teilchen in den zweiten Behälter 7 entsprechend den in dem obigen Beispiel 3 beschriebenen Modalitäten.
5. Heizen des zweiten Behälters 7 auf 60°C. Warten, 10 bis 30 Minuten lang, abhängig von dem aufzulösenden Reagensrest bzw. -zentrifugat (culot). Der Hauptzweck dieses Heizens besteht darin, die in dem Behälter vorhandenen Reagensrückstände beschleunigt wieder in den Lösungszustand zu versetzen.
6. Thermischer Zyklus, um die Verstärkungsoperation der Targets durchzuführen (es gibt magnetische Teilchen, welche die Verstärkung nicht stören, so dass es nicht notwendig ist, sie aus der Verstärkungskammer zu entfernen),
7. Injizieren der in der Ausgangskapillare verstärkten Probe durch Elektrophorese.
8. Kapillarelektrophorese in der Trennungskapillare, zum Beispiel nach den in dem obenerwähnten Artikel beschriebenen Modalitäten.
9. Detektion der verstärkten Fragmente durch zum Beispiel ein Epifluoreszenz-Mikroskop, ausgestatte mit einem Photovervielfacher, wobei sich das Feld des Mikroskops am Ende der Trennungskapillare befindet.

In diesem Beispiel ermöglicht die Kopplung der Erfindung mit einem integrierten Verstärkungs- und Kapillarelektrophoresesystem:

• Konzentration der Probe vor der Verstärkung, zum Beispiel hundertfach, also Reduktion Anzahl der nötigen Verstärkungszylklen (ungefähr 8 Zyklen weniger), was die der Verstärkung eigenen Risiken begrenzt (Verstärkungsverzerrungen entsprechend den Sequenzen, Überkreuz-Kontaminationsgefahr, ...),
• Reduktion des Volumens der Probe für die Verstärkung, also Reduktion der Mengen der zur Verstärkung notwendigen Reagenzien und folglich ein Kostengewinn bei den Reagenzien,
• Erhöhung der Anzahl der Proben, die in ein und derselben Vorrichtung parallel verarbeitet werden können, dank der Reduzierung der Dimensionen der Verstärkungskammer.

Außerdem ermöglicht die Schnelligkeit, mit der die gesamte Kette realisiert wird – mit dem magnetischen Transport in der Größenordnung von einigen Minuten, der Verstärkung in 10 bis 15 Minuten und der Elektrophorese in 1 bis 2 Minuten -, Ergebnisse von hervorragender Qualität zu erhalten, ohne die Notwendigkeit, die Abteile durch Ventile isolieren zu müssen.

Claims

Verfahren zum Konzentrieren eines Analyten, der in einer Probe enthalten ist, bei dem man – ausgehend von der Probe, in einem ersten Behälter mit einem Volumen α, der durch einen engen Durchgang mit einem zweiten Behälter mit einem Volumen β verbunden ist, wobei das Volumen β kleiner ist als das Volumen α, eine Lösung A herstellt, in welcher der Analyt an magnetischen Teilchen fixiert ist, – den an den magnetischen Teilchen des ersten Behälters fixierten Analyten mittels eines magnetischen Systems in den engen Durchgang überführt, – den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten im Bereich des engen Durchgangs aus den Teilchen freisetzt und – den Analyten durch Flüssigkeitsverdrängung aus dem engen Durchgang in den zweiten Behälter transportiert, wobei die magnetischen Teilchen im Bereich des engen Durchgangs zurückgehalten werden.
Verfahren zum Konzentrieren eines Analyten, der in einer Probe enthalten ist, bei dem man: – ausgehend von der Probe, eine Lösung A herstellt, in welcher der Analyt an magnetischen Teilchen fixiert ist, – die Lösung A in einen ersten Behälter mit einem Volumen α einführt, der über einen engen Durchgang mit einem zweiten Behälter mit einem Volumen β verbunden ist, wobei das Volumen β kleiner ist als das Volumen α, – den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten mittels eines magnetischen Systems aus dem ersten Behälter in den engen Durchgang überführt, – den an den magnetischen Teilchen fixierten Analyten im Bereich des engen Durchgangs aus den Teilchen freisetzt und – durch Flüssigkeitsverdrängung den Analyten aus dem engen Durchgang in den zweiten Behälter transportiert, wobei die magnetischen Teilchen im Bereich des engen Durchgangs zurückgehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man die von dem Analyten befreiten magnetischen Teilchen mittels eines magnetischen Systems aus dem engen Durchgang in den ersten Behälter transportiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der Analyt aus den magnetischen Teilchen freigesetzt wird durch Modifizierung der physikalischen oder chemischen Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man ein Agens zur Immobilisierung des Analyten an der Gesamtheit oder einem Teil mindestens einer Wand des zweiten Behälters oder irgendeinem festen Träger, der in dem zweiten Behälter vorhanden ist, fixiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem der enge Durchgang die Form einer Kapillare hat.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, bei dem man – den Analyten durch Anwendung eines Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche konzentriert und – den Analyten in dem zweiten Behälter oder in irgendeinem anderen Behälter, der direkt oder indirekt mit dem zweiten Behälter verbunden ist, nachweist.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Analyt ausgewählt wird aus Mikroorganismen, wie z.B. einem Bakterium, einem Pilz, einem Virus, einer chemischen Verbindung, einem Molekül, wie z.B. einem Peptid, einem Protein, einem Enzym, einem Polysaccharid, einem Lipid, einem Lipoprotein, einem Lipopolysaccharid, einer Nucleinsäure, einem Hormon, einem Antigen, einem Antikörper, einem Wachstumsfaktor und einer Tumorzelle.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem der Analyt, der eine Nucleinsäure ist, nachgewiesen wird durch eine Nucleinsäure-, vorzugsweise DNA-Chip-Technologie.