JPWO2008075501A1 - 回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置 - Google Patents

Abstract

複数の物質を含有する試料から目的物を安全かつ簡易に抽出・分離することができる回転式抽出容器を提供する。特に、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要としている生物試料又は生体由来試料からの核酸の抽出・分離を汚染・バイオハザード等の恐れなく簡易に実施することができる回転式抽出容器を提供する。更には、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置を提供する。当該回転式抽出容器は、試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であって、円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、該回転部の回転を含む操作によって、該円柱型容器部のいずれかの小室に入っている溶液又は固体を、別の小室へ移動させることができ、その移動を含む操作によって試料から目的物を抽出することを特徴とする。

Description

本発明は、生物試料又は生体由来試料からの細胞又は核酸の抽出・分離等するための回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置に関する。

一般に、複数の物質を含有する試料を分析する際、分析に先立って特定の分析対象を抽出し、分離する操作を必要とすることが多い。例えば、血液、尿などの生物由来試料は、分析に先立って行う検体の前処理の一つとして、試料に含まれる不要成分（タンパク質、脂質やイオン性物質など）を除去するために、抽出・分離する操作を必要とすることが通例である。

特に臨床現場からの試料は、ウィルス、細菌などの感染、汚染の危険性を常に内包していることから、そのような試料の前処理の全体または一部であっても安全かつ迅速に実施できる方法や装置の開発が望まれている。

したがって、従来、種々の抽出・分離方法が提案されている。例えば、生化学的試料中の核酸等の分析を目的として、特別な構造を有する容器や磁性粒子等を利用する抽出・分離方法が提案されている（例えば特許文献１〜４参照。）。

しかしながら、これらの方法は、試料の前処理として必要な操作が煩雑である上、必ずしも、上記の臨床現場からの試料を扱う際の感染、汚染の危険性等の諸問題を解決するものではない。

一方、近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バルブ、流路、センサーなど）を微細化して１チップ上に集積化したシステムが開発されている。これは、μ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）、マイクロチップ、バイオリアクタ、ラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−ｃｈｉｐｓ）、バイオチップとも呼ばれ、医療検査・診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。

とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作が必要とされる場合には、自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システムは、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可能とすることによる恩恵は多大と言える。

しかし、上記のようなミクロ化分析システムにおいては、マイクロチップ等の上で検査などを行うために、試料の必要量を極少の量とし、必要とされる試薬量も少なくて済む分析の微量化を図ることは、マイクロチップ等に求められる最大課題である。ところが、試料によっては、検出対象である遺伝子または核酸の濃度が希薄であることがある。チップに導入できる検体量も限られていることから、そうした検体量では測定可能な範囲内に収まらない。したがって、チップに導入する前に予備的な濃縮または分離の操作が必要となってくる。あるいは微量の反応生成物を高感度でしかも簡便に検出、または定量できる機構をチップに搭載することが必要とされる。遺伝子の検出では、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法による増幅反応を利用するのが通例である。血液などの生体液を試料とする場合、そのまま検体として分析に供することができないことが多く、通常は何らかの前処理を加えることが要求されることも多い。

例えば生物試料から核酸を抽出、分離する方法として、化学的方法または物理的方法が用いられる。後者に属する方法として、振動するビーズの作用により細胞から核酸を抽出する方法（例えば特許文献５参照。）、電場を適用して分離、濃縮する方法（例えば特許文献６及び７参照。）が報告されている。これらの方法をそのまま超微細な装置のマイクロチップ等に適用することには、多くの問題がある。

したがって、このように簡便かつ迅速な検査手段を提供するマイクロチップ等を使用する分析分野においても、抽出・分離等の前処理について解決すべき具体的な問題、要望が提起され、その解決が望まれている。
特表２００１−５１１６４４号公報 特表平１０−５０８１００号公報 特表２００３−５１６１５６号公報 特表２００３−５１６１５６号公報 特表２００３−５２２５２１号公報 特開２００４−２１７号公報 国際公開第０２／２３１８０号パンフレット

本発明は、上記問題・要望等に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、複数の物質を含有する試料から目的物を安全かつ簡易に抽出・分離することができる回転式抽出容器を提供することである。特に、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要としている生物試料又は生体由来試料からの核酸の抽出・分離を感染、汚染等の恐れなく簡易に実施することができる回転式抽出容器を提供することである。更には、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置を提供することである。

本発明に係る上記課題は下記の手段によって解決される。

１．試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であって、
（ｉ）円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、
（ii）該円柱型容器部は少なくとも二つの小室を有し、
（iii）該回転部は前記円柱型容器部に密着可能であり、かつ前記小室のいずれかと外部をつなぐ開口箇所を有し、
（iv）該蓋部は前記回転部の開口箇所を密閉することができ、
（ｖ）前記回転部の回転を含む操作によって、前記円柱型容器部のいずれかの小室に入っている溶液又は固体を、別の小室へ移動させることができ、その移動を含む操作によって試料から目的物を抽出する、
ことを特徴とする回転式抽出容器。

２．前記移動を含む操作で、前記固体を集めること又は前記目的物を吸着させた固体を集めることを特徴とする前記１に記載の回転式抽出容器。

３．前記固体が目的物又は目的物を含む物質を担持する固体支持体であって、磁性を有する固体支持体（磁性支持体）であり、前記回転式抽出容器のいずれかの箇所に磁石を当てることで、該磁性支持体又は前記目的物を吸着させた該磁性支持体を集めることを特徴とする前記１又は２に記載の回転式抽出容器。

４．前記目的物が核酸であり、前記目的物を含む物質が細胞であることを特徴とする前記１乃至３の何れか一項に記載の回転式抽出容器。

５．前記核酸が、クラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）に属する微生物の核酸であることを特徴とする前記４に記載の回転式抽出容器。

６．前記試料が、生物試料又は生体由来試料であることを特徴とする前記１乃至５の何れか一項に記載の回転式抽出容器。

７．前記生体由来試料が、尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることを特徴とする前記６に記載の回転式抽出容器。

８．前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体を加熱することによって、該回転式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴とする前記１乃至７の何れか一項に記載の回転式抽出容器。

９．前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体に超音波を当てることによって、該回転式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴とする前記１乃至７の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
１０．前記試料から前記目的物を抽出するために、磁性粒子、洗浄液、再懸濁液のうち少なくとも一つがいずれかの小室に予め封入されていることを特徴とする前記１乃至９の何れか一項に記載の回転式抽出容器。

１１．前記円柱型容器部の複数の小室において、集菌工程、洗浄工程、溶菌工程を実施し、核酸を抽出することができることを特徴とする前記１乃至１０の何れか一項に記載の回転式抽出容器。

１２．前記回転式抽出容器の何れかの箇所に滴下口を設け、前記試料から抽出した前記目的物を滴下口から滴下することを特徴とする前記１乃至１１の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
１３．前記１乃至１２の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し得られた核酸を、核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法。
１４．前記１乃至１２の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し得られた核酸を、マイクロチップを有する装置において増幅し、検出する操作を含むことを特徴とする遺伝子検出方法。

１５．前記１乃至１２の何れか一項に記載の回転式抽出容器を用い自動的に核酸を抽出することを特徴とする自動核酸抽出装置。

本発明の上記手段により、複数の物質を含有する試料から目的物を安全かつ簡易に抽出・分離することができる回転式抽出容器を提供することができる。特に、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要としている生物試料（又は生体由来試料）からの核酸の抽出・分離を汚染・バイオハザード等の恐れなく簡易に実施することができる回転式抽出容器を提供することができる。更には、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置を提供することができる。

本発明の回転式抽出容器の構成を示す概念図 核酸抽出方法の一例を示す概念図 抽出液等の滴下方法の一例を示す概念図 核酸増幅検出用マイクロチップの一例を示す概念図

符号の説明

Ａ 円柱型容器部
Ａ１，Ａ２，Ａ３ 小室
Ｂ 回転部
Ｃ 蓋部Ｃ
Ｄ 開口箇所
１ マイクロポンプ接続部
２ 送液制御部
３ 微細流路
４ 試薬収容部
５ 検体液（単離された核酸を含有する液）
６ 検体液受容部
７ 試薬

本発明の回転式抽出容器は、試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であって、
（ｉ）円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、
（ii）該円柱型容器部は少なくとも二つの小室を有し、
（iii）該回転部は前記円柱型容器部に密着可能であり、かつ前記小室のいずれかと外部をつなぐ開口箇所を有し、
（iv）該蓋部は前記回転部の開口箇所を密閉することができ、
（ｖ）前記回転部の回転を含む操作によって、前記円柱型容器部のいずれかの小室に入っている溶液又は固体を、別の小室へと移動させることができ、その移動を含む操作によって試料から目的物を抽出する、
ことを特徴とする。

この特徴は、請求の範囲第１項乃至第１５項に係る発明に共通する技術的特徴である。

ここで、「回転を含む操作」とは、回転操作を必須とするが、必要に応じて、その他の操作、例えば上下振盪の操作、上下逆転の操作等を一連の操作として含めた操作をいう。また、「移動を含む操作」とは、移動させる操作を必須とするが、必要に応じて、その他の操作、例えば、後述するように、目的物を吸着させた磁性を有する固体支持体（磁性支持体）を磁力で集める操作等を一連の操作として含めた操作をいう。

なお、本願でいう「固体」とは、抽出の目的物を含有している試料としての固体物質、抽出の目的物質としての固体物質、抽出の目的物又は目的物を含む物質を吸着（化学吸着及び物理吸着等を含む。）により担持させる固体支持体である。

以下、本発明とその構成要素等について詳細な説明をする。

（回転式抽出容器の構成）
図１に示した本発明の回転式抽出容器の概念図を参照しながら説明をする。当該回転式抽出容器は、基本的には、円柱型容器部Ａ、回転部Ｂ、及び蓋部Ｃで構成される。

円柱型容器部Ａは少なくとも二つの小室（例えば図１においては、小室Ａ１〜小室Ａ３の三つの小室）を有し、目的に応じて小室を増設してもよい。例えば、後述する実施の形態のように集菌用小室，洗浄用小室，再懸濁用小室等を設けることができる。

回転部Ｂは円柱型容器部に密着可能であり、小室を部分的に塞ぐ箇所と小室のいずれか一つと外部をつなぐ開口箇所Ｄ（小室の入り口と同じ開口面積）を有する。この開口箇所Ｄから円柱型容器部のいずれかの小室に、試料としての溶液、懸濁液、及び固体物質や固体支持体としての磁性粒子等を出し入れすることができる。

蓋部Ｃは回転部Ｂの開口箇所Ｄを密閉することにより、同時に円柱型容器部Ａを密閉することができる。また、当該蓋部Ｃは、回転式抽出容器を逆さにしたときに開口箇所Ｄから出てくる物質の受器の役割も果たす。

なお、回転式抽出容器の回転部Ｂをその開口箇所Ｄが溶液又は固体が入っている小室の真上に来るまで回転させた後、回転式抽出容器を逆さにして当該小室から溶液又は固体を、開口箇所Ｄを経由して蓋部Ｃに移動させる。次に、回転部Ｂを回転して開口箇所Ｄが別の小室の真上更に来るように回転させた後に、溶液又は固体を蓋部Ｃから開口箇所Ｄを経由して当該別の小室へと移動させることができる。したがって、このような回転操作や移動操作を含む操作によって試料から目的物を抽出することができる。

すなわち、当該固体が、抽出の目的物を含有している試料としての固体物質、抽出の目的物質としての固体物質、及び抽出の目的物を吸着させた固体支持体である場合、上記のような移動を含む操作で、当該固体を集めること又は目的物を吸着させた固体を集めることができる。

なお、固体が目的物または目的物を含む物質を吸着させる固体支持体であり、かつ磁性を有する支持体（以下「磁性支持体」という。）である場合には、回転式抽出容器のいずれかの箇所に磁石を当てることで、当該磁性支持体又は前記目的物あるいは目的物を含む物質を吸着させた該磁性支持体を集めることができる。

本発明に係る円柱型容器Ａ、回転部Ｂ、及び蓋部Ｃを形成する材料としては、試料内容に応じて、金属、プラスチック等種々の公知の材料を用いることができる。好ましい材料としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネイト等を挙げることができる。

また、円柱型容器部Ａ、回転部Ｂ、及び蓋部Ｃのサイズも試料の内容、量や分析装置等に応じて適切なサイズにすることができる。

（回転式抽出容器の操作手順）
本発明の回転式抽出容器を使用する際の操作手順を本発明の実施形態の典型的な例によって説明する（図２及び図３参照）。

（１）予め、円柱型容器部Ａの一つの小室（Ａ１）には集菌溶液（２００μｌ）と、磁性支持体として磁性ビーズ（３０μｌ；濃度１ｍｇ／ｍｌ）を、別の小室（Ａ２）には洗浄溶液（１ｍｌ）を、また小室（Ａ３）には溶菌溶液（１００μｌ）を入れておく。

（２）回転部Ｂの開口箇所Ｄから上記小室（Ａ１）に試料（尿１ｍｌ）を入れ、蓋部Ｃをセットし、密閉する。

（３）試料（尿１ｍｌ）、集菌溶液（２００μｌ）、磁性ビーズ（３０μｌ）を撹拌し、混合した後１分放置し、磁性ビーズに菌を吸着させる。

（４）回転式抽出容器を逆さにし、蓋部に磁石を当て（３０秒）、磁性ビーズを集め回収（集菌）する。

（５）回転式抽出容器の上下を戻し、開口箇所Ｄが別の小室（Ａ２）に来るように回転部２を回転させた後に、磁石をはずし、磁性ビーズを小室（Ａ２）に移動させる。

（６）小室（Ａ２）において洗浄溶液１ｍｌと磁性ビーズを撹拌混合し、洗浄する。

（７）回転式抽出容器を逆さにし、蓋部Ｃに磁石を当て（３０秒）、洗浄済みの磁性ビーズを回収する。

（８）回転式抽出容器の上下を戻し、開口箇所Ｄが別の小室（Ａ３）に来るように回転部Ｂを回転させた後に、磁石をはずし、磁性ビーズを小室（Ａ３）を移動させる。

（９）小室（Ａ２）において溶菌溶液（１００μｌ）と磁性ビーズを撹拌混合する。

（１０）回転式抽出容器を逆さにし、蓋部Ｃをヒーターへ入れて所定温度・時間（９４℃で１分間）加熱し、菌を溶解する（核酸を抽出する）。

（１１）蓋部Ｃに磁石を当て磁性ビーズを保持したままで（３０秒）、回転式抽出容器の上下を戻し、溶液を（Ａ３）に戻す。

（１２）蓋部Ｃをはずし、小室（Ａ３）からマイクロピペット又はスポイト等で核酸抽出液を回収する。または蓋部Ｃに滴下口を開け、滴下口から核酸抽出液を核酸増幅検出用マイクロチップ等に滴下する。滴下口は、小室（Ａ３）など回転式抽出容器のいずれかの箇所に設けることができるが、蓋部Ｃに設けるのが好ましい。蓋部Ｃから滴下することによって、ピペット、スポイトなどの器具および器具操作の省略、操作ミスの軽減、操作の簡便化を図ることができる。例えば溶菌溶液（１００μｌ）のうち一定量（例えば２５μｌ）を滴下すれば、複数回または複数項目の検査を行うことができる。滴下部分は、目薬容器のような形状が好ましい。目薬のように液滴として溶液を押し出すことができれば、簡便な動作で安定かつ正確に一定量の液を容器から取り出すことが可能である。

なお、上記の小室（Ａ１）、（Ａ２）及び（Ａ３）は、それぞれ前述の集菌用小室、洗浄用小室、及び再懸濁用小室に相当する。上記実施例のように試料から前記目的物を分離するために、磁性ビーズ、洗浄液、再懸濁液のうち少なくとも一つがいずれかの小室に予め封入されていることが、安全、簡便であることから好ましい。

また、回転部Ｂは、（Ａ１）→（Ａ２）→（Ａ３）の順に回るようになっており、逆回転しない、かつ回転部Ｂが外れないようにストッパーが付けてあり、蓋部Ｃも一度はめると外れないようにストッパーを付けておくことが好ましい。

上記の実施形態例から分かるように、一つの回転式抽出容器を密封した状態で、円柱型容器部Ａの各小室（（Ａ１）〜（Ａ３））及び蓋部Ｃのそれぞれにおいて、集菌工程、洗浄工程及び溶菌工程の処理・操作を順々に実施できる。

なお、本願で、「集菌工程」とは、目的物である菌を集菌溶液から固体支持体に吸着等させることをいう。「集菌溶液」とは、菌を固体支持体に吸着等させるために菌を溶媒に予め溶解して調製した溶液をいう。なお、菌の懸濁液もこれに含めることにする。「洗浄工程」とは、菌を吸着させた固体支持体から、余分な溶媒や試薬等を除去するために洗浄する工程をいう。また、「溶菌工程」とは、固体支持体に吸着等している菌を加熱等により、菌の細胞壁や細胞膜を破壊して核酸を溶媒中に溶出する工程をいう。「溶菌溶液」とは、菌の細胞壁や細胞膜を破壊して核酸を溶出させるための溶液をいう。

本発明の回転式抽出容器を使用して核酸等を抽出する際には、上記のように、各種試薬、磁性支持体（磁性ビーズ）等が必要となる。これらの試薬の中には、試料を溶解又は希釈するための溶解液又は希釈液、洗浄液、各種緩衝液なども含まれる。

なお、核酸を抽出・単離する場合には、各種緩衝液等を必要とするが、例えば、結合緩衝液（集菌溶液等）としては、例えば、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の塩と、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール等のアルコールとからなる緩衝液が例として挙げられる。また、洗浄緩衝液（洗浄液）としては、上記結合緩衝液を４〜５倍に希釈したものを用いてもよいが、異なる種類の緩衝液を別途用意してもよい。再懸濁液としては、水が好適である。

本発明の好ましい態様の一つとして、上記の、磁性支持体や各種試薬等必要な器材一式を予め回転式抽出容器に封入した態様のキットとしておくことが望ましい。

以上の実施形態例から分かるように、本発明の回転式抽出容器を使用することにより、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要としている生物試料又は生体由来試料からの核酸等の抽出・分離を汚染・バイオハザード等の恐れなく簡易に実施することができる。

（自動核酸抽出装置）
本発明の回転式抽出容器の操作は、上記のように非常に簡易であることから、一連の操作を自動的に行う装置とすることができる。特に、自動的に核酸を抽出する自動核酸抽出装置として好適である。これにより核酸等の抽出・分離を汚染・バイオハザード等の恐れなく一層簡易に実施することができる。

なお、この自動核酸抽出装置を後述する核酸分析装置等に組み込み、核酸等の分析に必要な一連の操作を最初から最後まで自動的に行うこともできる。

（試料及び目的物）
本発明の回転式抽出容器を用いて試料（サンプル）から目的物（「抽出対象物」ともいう。）を抽出・分離する場合、試料や目的物としては、特定の物質に限られず、広範な種々の物質を対象とすることができる。特に、本発明の効果を顕著に発現することができるのは、下記の生物試料ないし生体由来の試料を試料として、それらに含有されている細胞や核酸等を抽出・分離の目的物とする場合である。

本発明において抽出の目的物、すなわち抽出対象物とすることができる細胞は、微生物（最近、カビ、酵母等）、植物、動物の細胞又は細胞培養物のいずれであってもよく、特に限定されない。好ましくは、微生物の細胞であり、特にクラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）に属する微生物の細胞が望ましい。

試料は前記細胞を含有する試料であり、生体由来の試料であれば、特に制限は無いが、例えば全血、血漿、血清、パフィーコート、尿、糞便、唾液、喀痰、脳脊髄液、精液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）細胞培養液（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）など生体由来の殆どの試料が該当する。核酸含有試料、微生物などが混入又は含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されている可能性のあるあらゆる試料（食品、生物学的製剤等）が対象となる。或いは、土壌、排水のような生物を含有する可能性のある環境試料が挙げられる。試料の形態は、好ましくは流体の試料であり、通常は、溶液若しくは懸濁液の液体である。試料は溶解できる固体であるか、又は液体の中に浮遊している固体であってもよい。

本発明において抽出の対象とすることができる核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及びリボ核酸（ＲＮＡ）の形態で存在するが、ＤＮＡとしては、プラスミドＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、及びゲノムＤＮＡなど、ＲＮＡとしては、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などが含まれる。なお、一本鎖又は二本鎖を問わない。単離されるＤＮＡ量の好適な範囲として０．００１〜１ｍｇである。

本願において、「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担う核酸、すなわちＤＮＡ又はＲＮＡをいうが、単に化学的実体であるＤＮＡ，ＲＮＡの形でいうこともある。また「塩基」とは、ヌクレオチドの核酸塩基のことをいう。

前記の細胞膜の破壊は、公知の種々の物理的方法を用いることができる。好ましくは熱により細胞破壊が行われる。これは加熱が簡便であり、上記のように細胞膜破壊に使用した薬剤を後で除く必要がないからである。具体的には、前記の加熱は、核酸が熱により変性しない温度範囲、すなわち、７０〜１２０℃、好ましくは８０〜１２０℃、更に好ましくは８０〜１００℃で、２０秒〜１０分間、好ましくは２０〜３００秒間の加熱による。加熱条件（温度、時間）は細胞又は菌の種類（大きさ、細胞膜の組成と厚さ等）によって異なるため、上記の範囲で適宜選択する。加熱は、あらゆる適切な加熱手段により行われるが、ドライ・ヒートブロック、湯浴、マイクロウェーブ・オーブン、各種ヒーターなどが例示される。しかし、これらに限定されるものではない。

なお上記行程に加えて、熱によって水分を蒸発させることにより遊離した核酸を濃縮する工程を更に含めてもよい。加える熱は、核酸が熱により変性しない温度範囲内である。上記の細胞膜破壊が加熱により行われるために、熱による細胞膜破壊工程はこの濃縮工程を兼ねることができる。

以上より、本発明の回転式抽出容器の好適な適用態様としては、本発明の目的・解決課題、発明の効果等の観点から、抽出対象である目的物が、特に細胞又は核酸であることが好ましい。したがって、試料としては、特に上記のような生物試料（又は生体由来試料）であることが好ましい。また、当該生物試料（又は生体由来試料）としては、特に尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることが好ましい。

（固体支持体）
前述のように、本願でいう「固体」には、抽出の目的物を含有している試料としての固体物質、抽出の目的物質としての固体物質、及び抽出の目的物を吸着により担持させる固体支持体が含まれる。これらの固体のうち、本発明に係る固体支持体は、水不溶性の担体であるであることが好ましい。また、磁性を有する担体（以下において、「磁性支持体」ともいう。）であることが好ましい。

本発明において、水不溶性の固体支持体を形成する材料は、特に限定されるものではないが、水に不溶であればよい。ここでいう水不溶性とは、具体的に水、他のいかなる水可溶性組成を含む水溶液に溶解しない固相を意味する。固体支持体は、固定、分離等用に現在広く使用され、提案されている公知の支持体又はマトリックスのいずれであってもよい。

具体的には無機化合物、金属、金属酸化物、有機化合物又はこれらを組み合わせた複合材料を含む。試料に含まれる細胞等の目的物を固体支持体に吸着させるが、固体支持体は、細胞等の目的物を吸着させ得るものであれば、材質、形状、サイズは特に限定されない。好ましいのは、例えば、細胞の結合、したがって、核酸の結合のためには高い表面積を与える材料である。

具体的に固体支持体として使用される材料は、特に限定されるものではないが、一般にポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレン、ポリアミド、ラテックスなどのような合成有機高分子、ガラス、シリカ、二酸化珪素、窒化珪素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛などの無機物又はステンレス、ジルコニアなどの金属であってもよい。これらの材料は一般に不規則な表面を持ち、例えば多孔性又は粒状、例えば粒子、繊維、ウェブ、焼結体又は篩いであることができる。

よって、本発明において用いられる固体支持体の形状としては特に限定されるものではないけれども、粒状、棒状、板状、シート、ゲル、膜、繊維、毛細管、ストリップ、フィルターなどが挙げられ、好ましくは、粒状である。粒状材料、例えばビーズは、結合能力が大きいために一般に好ましい。

粒状の形態としては、例えば球形、楕円体形、錐体、立方形、直方体形などが挙げられる。このうち球形粒子の担体は製造しやすく、使用時に、磁性支持体の回転攪拌がしやすいことからも好ましい。細胞等の目的物を吸着する固体支持体としてのビーズの平均粒径は、０．５〜１０μｍ、好ましくは２〜６μｍであることが好ましい。平均粒径が０．５μｍ未満である場合、当該ビーズ本体が磁性体を含有してなるものである場合は、充分な磁気応答性を発現せず、当該粒子を分離するために相当に長い時間を要し、また、分離するために相当に大きい磁力が必要となる。一方、粒径が１０μｍを超える場合には、当該粒子が水性媒体中で沈降しやすいものとなるため、細胞を捕捉する際に媒体を攪拌する操作が必要となる。また、粒子本体の表面積が小さくなるため、充分な量の細胞を捕捉することが困難となることがある。

その表面も含めたビーズ全体が同一の材料から構成されている場合のほかに、必要に応じて複数の素材から構成されるハイブリット体であってもよい。例えば分析の自動化に対応することができるために、コア部分は酸化鉄、又は酸化クロムのような磁気応答性材料で作られ、その表面を有機合成ポリマーで被覆された複合ビーズが挙げられる。

細胞を結合させた磁性支持体を試料液から、磁石の磁力によって容易に（固液）分離・粒子の回収をすることができる点で、その磁性支持体が常磁性体、強常磁性体、及び強磁性体などの磁性体が含有されてなるものであることが好ましく、より好ましくは、常磁性体及び強常磁性体の両方又はいずれか一方が含有されてなるものである。特に残留磁化がないか又は少ない点で、強常磁性体を用いることが好ましい。

かかる磁性体の具体例としては、四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）、各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの各種合金を挙げることができ、これらのうち、四三酸化鉄が特に好ましい。

本発明において用いられる磁性支持体は、小粒径の粒子よりなるビーズであって、優れた磁気分離性（すなわち磁気によって短時間で分離する性能）を有し、かつ、ゆるい上下振盪の操作によって再分散し得るものであることが好ましい。

磁性ビーズにおける磁性体の含有割合は、非磁性体の有機物質の含有割合が３０質量％以上であることから、７０質量％以下とされるが、好ましくは、２０〜７０質量％、より好ましくは３０〜７０質量％である。この割合が２０質量％未満であると、充分な磁気応答性が発現されず、所要の磁力によって短時間で粒子を分離することが困難となることがある。一方、この割合が７０質量％を超えると、粒子本体表面に露出する磁性体の量が多くなるため、当該磁性体の構成成分、例えば、鉄イオンの溶出などが生じ、使用時に他の材料に悪影響を及ぼすことがあり、また、粒子本体が脆くなって実用的な強度が得られないことがある。

本発明に係る抽出方法では、細胞等を含む試料液と磁性支持体（好ましくは磁性ビーズ）とを混合し、この混合により細胞等が磁性支持体に吸着（化学吸着及び物理吸着等を含む。）すると、細胞等を効率よくその表面上に集積することができる。細胞等が磁性支持体に吸着しない場合も磁力又は遠心分力で細胞を集積することが可能である。したがって、細胞等が磁性支持体に吸着することが望ましいが、吸着しなくてもよい。

細胞、特に細菌細胞の中には、磁性支持体に吸着しない場合もある。更に確実に細胞の吸着、付着を促進するため、磁性支持体の表面に細胞に対して親和性を有する基、アミノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応性に富む官能基、或いは標的の細胞に特異的に親和性を示す糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」などを結合させるか、その表面構造の改変、結合を促進する適当なコーティングなどを施してもよい。

試料によっては、それに含まれる細胞、特に対象菌細胞の濃度が薄い場合、大量の試料液を処理し、分離、濃縮などの操作が必要となる。細胞を磁性支持体に結合若しくは付着させて、細胞中の核酸を簡便に抽出する本発明の方法によれば、簡便な操作で迅速にそうした試料の処理ができる。特に磁性ビーズと着脱可能なカバーを付けた磁石を利用する本発明における固液分離操作は、試料が少量しかない場合にも極めて便利である。かかる場合には、分離、抽出などの過程で、細胞又は核酸のロスが生じて、目的とする核酸の最終収量が分析に好適な量を下回るケースもあるが、本発明の方法では、そうした単離途中でのロスは殆ど生じない。後工程にある核酸増幅反応、ハイブリダイゼーション、制限酵素反応、検出反応、電気泳動分析などに影響を及ぼす、カオトロープ試薬、界面活性剤、又は溶剤菌などの薬剤を本発明の方法では使用しないため、分離（単離）された核酸はそのまま増幅反応に適用することができる。したがって、試料量が微量であっても、本発明の方法によれば、細胞から高収量でしかも純度が高い核酸を分離（単離）することができる。

（核酸の増幅）
本発明の回転式抽出容器は、抽出し、単離された核酸を核酸増幅法により増幅し、核酸の同定をすることにより細胞種を同定する方法に好適に使用することができる。すなわち、当該同定方法に本発明の回転式抽出容器を用いることによって、当該方法に必須の抽出・分離（単離）操作を、簡易、迅速、かつ安全に実施することができる。

具体的には、試料に含まれる細菌細胞等から抽出され、単離された核酸を、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：鎖置換増幅法）、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：リガーゼ連鎖反応）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｐｒｉｍｅｒ−Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：等温核酸増幅法）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｒｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：転写増幅法）、ＴＡＳ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ：自己複製）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：核酸配列に基づく増幅法）などのＤＮＡ増幅法により増幅し、増幅された核酸の分析、例えば、塩基配列決定、ハイブリダイゼーション法、サザンプロット分析など行って、標準又は対象の塩基配列とを比較することにより細菌細胞等の種類を同定することができる。

（遺伝子検査方法）
本発明の回転式抽出容器は、マイクロチップを有する装置で核酸（遺伝子）を増幅し、検出する段階を含む遺伝子検査方法にも好適に使用することができる。すなわち、当該遺伝子検査方法に本発明の回転式抽出容器を用いることによって、当該方法に必須の抽出・分離（単離）操作を、簡易、迅速、かつ安全に実施することができる。

本発明の遺伝子検査方法を実施するための核酸分析装置として、マイクロチップ形態のものを含んでもよく、これによりハイスループットな分析が可能となる。

〈核酸分析装置〉
本発明の遺伝子検査方法を実施するための核酸分析装置は、マイクロポンプ、マイクロポンプを制御する制御装置、温度を制御する温度制御装置などが一体化された装置本体と、この装置本体に装着可能な核酸増幅検出用マイクロチップとからなる。予め試薬が封入されたマイクロチップの検体受容部に検体液を注入して、そのマイクロチップを核酸分析装置の本体に装着すると、送液ポンプを作動させるための機構的連結、必要であれば制御用の電気的接続もなされる。本体とこのマイクロチップとを接合させると、マイクロチップの流路も作動状態となる。したがって、好ましい態様の一例では、操作が開始されると検体及び試薬類の送液、混合、核酸の増幅、検出などが、一連の連続的工程として自動的に実施される。

送液、混合、温度の各制御に関わる制御系を受け持つユニットは、マイクロポンプとともに本発明に係る核酸分析装置の本体を構成する。この装置本体は、これに上記マイクロチップを装着することにより検体に対して共通で使用される。上記の液体の混合、送液、核酸の増幅、検出などの工程は、送液順序、容量、タイミングなどについて予め設定された条件として、マイクロポンプ及び温度の制御とともにプログラムとして核酸分析装置に搭載されたソフトウェアに組み込まれている。本発明では脱着可能な上記マイクロチップのみ交換すればよい。本発明に係る核酸分析装置は、いずれのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用する場所及び時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。送液に使用する多数のマイクロポンプユニットが装置本体側に組み込まれているので、マイクロチップはディスポーザブルタイプとして使用できる。

〈核酸増幅検出用のマイクロチップ、マイクロポンプ及びポンプの接続部〉
核酸増幅検出用マイクロチップの好ましい態様の一例として、図４に掲げる実施形態を説明する。検体受容部６，試薬収容部４について、これらの収容部の内容液を送液するマイクロポンプが設けられている。マイクロポンプは、ポンプ接続部１を介して試薬収容部４の上流側に接続され、マイクロポンプにより駆動液を試薬収容部側へ供給することによって、試薬を流路へ押し出して送液している。マイクロポンプユニットは、核酸増幅検出用マイクロチップとは別途の核酸分析装置本体に組み込まれており、マイクロチップを核酸分析装置本体に装着することによって、ポンプ接続部１からマイクロチップに接続されるようになっている。

本実施形態では、マイクロポンプとしてピエゾポンプを用いる。すなわち、流路抵抗が差圧に応じて変化する第一流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合が該第一流路よりも小さい第二流路と、該第一流路及び該第二流路に接続された加圧室と、該加圧室の内部の圧力を変化させるためのアクチュエータとを備えたピエゾポンプである。その詳細は、特開２００１−３２２０９９号公報、特開２００４−１０８２８５号公報に記載されている。

上記核酸分析装置用として用いられる核酸増幅検出用チップについては、好ましい態様の一例について、以下に記載する。その態様のマイクロチップは、少なくとも検体液受容部６，試薬収容部４，廃液貯留部、マイクロポンプ接続部１及び微細流路３を有し、各部を微細流路で連通させている。検体液（単離された核酸を含有する液）５を、検体受容部下流に設けられた核酸増幅部位を構成する流路、次いで増幅された核酸を検出する部位を構成する流路へ流して、試薬収容部４の試薬７と混合することによって核酸を分析するとともに、その結果、生じる廃液を該廃液貯留部へ移して閉じ込めることを特徴とするマイクロチップである。更に各収容部、流路、ポンプ接続部に加えて、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部などの各エレメントが、機能的に適当な位置に微細加工技術により設置されている。

次に、マイクロチップの好ましい態様の例を示す。核酸増幅検出用のマイクロチップは、プラスチック樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどの１以上の部材を適宜組み合わせて作製される一枚のマイクロチップである。その縦横のサイズは、通常、数１０ｍｍぐらい、高さが数ｍｍ程度である。好ましくは、マイクロチップの微細流路及び躯体は、加工成形が容易で安価であり、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂で形成される。なかでもポリプロピレンなどのポリオレフィンやポリスチレンの樹脂は成型性に優れるために望ましい。微細流路は、微細加工技術によりその幅及び高さが、約１０〜数１００μｍのサイズ、例えば幅１００μｍ、深さ１００μｍ程度に形成される。

〈核酸の増幅及び検出〉
本発明の回転式抽出容器を用いて単離された核酸は、核酸増幅検出用マイクロチップの核酸増幅部位で増幅され、次いで増幅された核酸が該マイクロチップの検出部位に送られて核酸（遺伝子）の検出が行われる。核酸の増幅は、上記のようにＰＣＲ，ＳＤＡ、ＬＣＲ，ＩＣＡＮ，ＬＡＭＰ，ＴＭＡ，ＴＡＳ，３ＳＲ，ＮＡＳＢＡなどのＤＮＡ増幅法により増幅する。増幅された核酸の分析を常法、例えばハイブリダイゼーション法、金コロイド吸着法などにより行う。

上記マイクロチップ及び核酸分析装置の全体又は一部についても、構造、構成、配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々のものにすることができる。

なお、本発明の回転式抽出容器は、前述の自動核酸抽出装置として上記核酸分析装置に組み込み、核酸の分析に必要な一連の操作を最初から最後まで自動的に行うことができる。これにより汚染・バイオハザード等の恐れなく一層簡易に実施することができる。

以上、本発明の典型的実施形態の一例として示された図面を参照しながら、本発明について説明したが、本発明は、かかる形態・態様及び例に限定されるものではない。

Claims (15)

1. 試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であって、
   （ｉ）円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、
   （ii）該円柱型容器部は少なくとも二つの小室を有し、
   （iii）該回転部は前記円柱型容器部に密着可能であり、かつ前記小室のいずれかと外部をつなぐ開口箇所を有し、
   （iv）該蓋部は前記回転部の開口箇所を密閉することができ、
   （ｖ）前記回転部の回転を含む操作によって、前記円柱型容器部のいずれかの小室に入っている溶液又は固体を、別の小室へ移動させることができ、その移動を含む操作によって試料から目的物を抽出する、
   ことを特徴とする回転式抽出容器。
2. 前記移動を含む操作で、前記固体を集めること又は前記目的物を吸着させた固体を集めることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の回転式抽出容器。
3. 前記固体が目的物又は目的物を含む物質を担持する固体支持体であって、磁性を有する固体支持体（磁性支持体）であり、前記回転式抽出容器のいずれかの箇所に磁石を当てることで、該磁性支持体又は前記目的物を吸着させた該磁性支持体を集めることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の回転式抽出容器。
4. 前記目的物が核酸であり、前記目的物を含む物質が細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
5. 前記核酸が、クラミジア菌（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ属）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属）、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属）に属する微生物の核酸であることを特徴とする請求の範囲第４項に記載の回転式抽出容器。
6. 前記試料が、生物試料又は生体由来試料であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
7. 前記生体由来試料が、尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の回転式抽出容器。
8. 前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体を加熱することによって、該回転式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第７項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
9. 前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体に超音波を当てることによって、該回転式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第７項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
10. 前記試料から前記目的物を抽出するために、磁性粒子、洗浄液、再懸濁液のうち少なくとも一つがいずれかの小室に予め封入されていることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第９項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
11. 前記円柱型容器部の複数の小室において、集菌工程、洗浄工程、溶菌工程を実施し、核酸を抽出することができることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１０項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
12. 前記回転式抽出容器の何れかの箇所に滴下口を設け、前記試料から抽出した前記目的物を滴下口から滴下することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１１項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
13. 請求の範囲第１項乃至第１２項の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し得られた核酸を、核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法。
14. 請求の範囲第１項乃至第１２項の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し得られた核酸を、マイクロチップを有する装置において増幅し、検出する操作を含むことを特徴とする遺伝子検出方法。
15. 請求の範囲第１項乃至第１２項の何れか一項に記載の回転式抽出容器を用い自動的に核酸を抽出することを特徴とする自動核酸抽出装置。