WO2008075501A1 - 回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置 - Google Patents

回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置 Download PDF

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nucleic acid
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rotary
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Nao Yokota
Koji Miyazaki
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Konica Minolta Medical & Graphic, Inc.
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    • B03C2201/26—Details of magnetic or electrostatic separation for use in medical applications

Definitions

  • the present invention relates to a rotary extraction container for extracting or separating cells or nucleic acids from a biological sample or a biological sample, a cell type identification method using the same, a gene detection method, and an automatic nucleic acid extraction apparatus About.
  • samples from clinical sites always contain the risk of infection and contamination with viruses, bacteria, etc.! /, The ability to do so, or all or part of the pretreatment of such samples.
  • the development of methods and devices that can be implemented safely and quickly is desired.
  • the required amount of the sample is made extremely small, and the amount of reagent required is small. Minimizing the amount of analysis required is the greatest challenge required for microchips.
  • the concentration of the gene or nucleic acid to be detected may be dilute. Since the amount of sample that can be introduced into the chip is limited, such a sample amount does not fall within the measurable range. Therefore, a preliminary concentration or separation operation is required before introduction into the chip. Alternatively, it is necessary to mount a mechanism on the chip that can detect or quantify a small amount of reaction product with high sensitivity and ease.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a chemical method or a physical method is used as a method for extracting and separating nucleic acid from a biological sample.
  • Methods belonging to the latter include a method of extracting nucleic acid from cells by the action of vibrating beads (see, for example, Patent Document 5), and a method of separating and concentrating by applying an electric field (see, for example, Patent Documents 6 and 7). It has been reported. There are many problems in applying these methods as they are to microchips of ultra-fine devices.
  • Patent Document 1 Special Table 2001-511644
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 10-508100
  • Patent Document 3 Special Table 2003-516156
  • Patent Document 4 Japanese Translation of Special Publication 2003-516156
  • Patent Document 5 Special Table 2003—522521
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-217
  • Patent Document 7 International Publication No. 02/23180 Pamphlet
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, demands, etc., and its solution is a rotation capable of extracting and separating a target object safely and easily from a sample containing a plurality of substances. It is to provide a formula extraction container. In particular, a rotary extraction container that can easily carry out the extraction and separation of nucleic acids from biological samples or biological samples that have conventionally required complicated operations or large and expensive devices without fear of infection, contamination, etc. Is to provide. Furthermore, it is to provide a cell type identification method, gene detection method, and automatic nucleic acid extraction apparatus using the same.
  • the cylindrical container has at least two chambers
  • the rotating part can be in close contact with the cylindrical container part, and has an opening portion that connects any one of the small chambers to the outside,
  • the lid portion can seal the opening of the rotating portion
  • a rotary extraction container characterized by that.
  • the solid is a solid support carrying a target or a substance containing the target, and is a solid support having magnetic properties (magnetic support), and the solid extractor of the rotary extraction container! /, Any part 3.
  • nucleic acid is a nucleic acid of a microorganism belonging to Chlamydia (genus Chlamydia), Neisseria (genus Neisseria), or Mycobacterium (genus Mycobacterium). container.
  • the nucleic acid can be eluted from the cells present in the rotary extraction container by heating any part or the whole of the rotary extraction container. 8. The rotary extraction container according to any one of 7 above.
  • Nucleic acid can be eluted from cells existing in the rotary extraction container by applying ultrasonic waves to any part or the whole of the rotary extraction container.
  • the rotary extraction container according to any one of 1 to 7 above.
  • the nucleic acid can be extracted by performing a bacteria collection process, a washing process, and a lysis process in a plurality of chambers of the cylindrical container section.
  • the rotary extraction container as described.
  • a dropping port is provided at any location of the rotary extraction container, and the object extracted from the sample is dropped from the dropping port.
  • a rotary extraction container according to 1.
  • a method for identifying a cell type characterized in that a nucleic acid obtained by extraction with the rotary extraction container according to any one of 1 to 12 above is identified by a nucleic acid amplification method.
  • a gene detection method comprising an operation of amplifying and detecting a nucleic acid extracted by the rotary extraction container according to any one of 1 to 12 above in a device having a microchip. .
  • An automatic nucleic acid extraction apparatus that automatically extracts nucleic acid using the rotary extraction container according to any one of 1 to 12 above.
  • a rotary extraction container capable of extracting and separating a target object from a sample containing a plurality of substances safely and easily.
  • biological samples or biological samples
  • a rotatable extraction container can be provided.
  • a cell type identification method, gene detection method, and automatic nucleic acid extraction apparatus using the same can be provided.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing the configuration of a rotary extraction container according to the present invention.
  • FIG. 3 Conceptual diagram showing an example of a method for dropping an extract or the like
  • FIG. 4 Conceptual diagram showing an example of a microchip for nucleic acid amplification detection
  • the rotary extraction container of the present invention is a rotary extraction container for extracting a target object from a sample
  • the cylindrical container has at least two chambers,
  • the rotating part can be in close contact with the cylindrical container part, and has an opening to connect one of the small chambers to the outside,
  • the lid portion can seal the opening of the rotating portion
  • operation including rotation requires a rotation operation, but other operations such as an up / down shaking operation and an up / down inversion operation are included as a series of operations as necessary.
  • operation including movement requires an operation to move, but if necessary, other operations such as a solid support having magnetism on which an object is adsorbed as described later (magnetic The operation including the operation of collecting the support) by magnetic force is included as a series of operations.
  • solid as used in the present application means adsorption of a solid substance as a sample containing a target substance for extraction, a solid substance as a target substance for extraction, a target substance for extraction or a substance containing the target substance. (Including chemical adsorption, physical adsorption, etc.)
  • the description will be made with reference to the conceptual diagram of the rotary extraction container of the present invention shown in FIG.
  • the rotary extraction container basically consists of a cylindrical container part A, a rotating part B, and a lid part C. It is.
  • the cylindrical container A has at least two small chambers (for example, three small chambers A1 to A3 in FIG. 1), and the number of small chambers may be increased according to the purpose.
  • a collection chamber, a washing chamber, a resuspension chamber, and the like can be provided as in the embodiment described later.
  • the rotating part B can be in close contact with the cylindrical container part, and has an opening part D (the same opening area as the entrance of the small chamber) that connects one of the small chamber and one of the small chambers to the outside. From this opening D, a solution, suspension, and a solid substance, magnetic particles as a solid support, and the like can be taken in and out of any chamber of the cylindrical container.
  • the lid part C By closing the opening D of the rotating part B, the lid part C can simultaneously close the cylindrical container part A with force S.
  • the lid C also serves as a receptacle for substances coming out of the opening D when the rotary extraction container is turned upside down.
  • the rotary extraction container After rotating the rotating part B of the rotary extraction container until the opening D is just above the chamber containing the solution or solid, the rotary extraction container is turned upside down to dissolve from the chamber. Move liquid or solid to lid C via opening D. Next, after rotating the rotating part B and rotating so that the opening D is located immediately above another chamber, the solution or solid is transferred from the lid C to the other chamber via the opening D. Can be moved. Therefore, the force S is used to extract the object from the sample by such operations including rotation and movement.
  • the solid is a solid substance as a sample containing the target substance for extraction, a solid substance as the target substance for extraction, and a solid support on which the target substance for extraction is adsorbed,
  • the solid can be collected or the solid on which the target substance is adsorbed can be collected.
  • the solid is a solid support for adsorbing the target product or a substance containing the target product and is a magnetic support (hereinafter referred to as "magnetic support")
  • a rotary extraction vessel is used. By applying a magnet to any part of the vessel, it is possible to collect the magnetic support or the magnetic support on which the object or the substance containing the object is adsorbed.
  • materials for forming the cylindrical container A, the rotating part B, and the lid part C according to the present invention various known materials such as metals and plastics can be used according to the contents of the sample.
  • materials that can be used include polypropylene, polyethylene, and polycarbonate.
  • the size of the cylindrical container part A, the rotating part B, and the lid part C can also be set to an appropriate size according to the contents, amount, analysis device, and the like of the sample.
  • a bacterial collection solution (200 1) and magnetic beads (30 1; concentration lmg / ml) as a magnetic support are separated. Place the washing solution (1 ml) in the chamber (A2) and the lysis solution (100 1) in the chamber (A3).
  • the lid C By dripping from the lid C, it is possible to omit instruments such as pipettes and syringes and instrument operations, reduce operational errors, and simplify operations. For example, if a certain amount (for example, 25 a 1) of the lysis solution (100 1) is dropped, the test can be performed multiple times or multiple items.
  • the dripping part is preferably shaped like an eye drop container. If the solution can be pushed out as droplets like eye drops, a certain amount of liquid can be taken out of the container stably and accurately with a simple operation.
  • the above-described chambers (Al), (A2), and (A3) correspond to the above-described collection chamber, washing chamber, and resuspension chamber, respectively. It is safe and simple that at least one of magnetic beads, washing liquid, and resuspension is previously enclosed in any one of the chambers in order to separate the object from the sample as in the above embodiment. To preferred.
  • the rotating part B is designed to rotate in the order of (A1) ⁇ (A2) ⁇ (A3), and is not reversely rotated, and a stopper is attached so that the rotating part B does not come off. Also, it is preferable to attach a stopper so that the lid C will come off once fitted.
  • each of the small chambers ((A1) to (A3)) and the lid C of the cylindrical container A is sealed in a state where one rotary extraction container is sealed. ! /
  • the process and operation of the collection process, washing process and lysis process can be performed in sequence.
  • the "bacterial collection step” refers to adsorption of the target bacteria from the collected solution to a solid support.
  • the “bacterial collection solution” refers to a solution prepared by previously dissolving a bacterium in a solvent in order to adsorb the bacterium on a solid support.
  • the suspension of bacteria will be included in this.
  • Wash step refers to a step of washing in order to remove excess solvent, reagents and the like from the solid support on which the bacteria are adsorbed.
  • the “bacteria lysis step” refers to a step of eluting nucleic acids into a solvent by destroying the cell walls and cell membranes of the bacteria by heating the bacteria adsorbed on the solid support.
  • Bacterial lysis solution refers to a solution for destroying bacterial cell walls and cell membranes to elute nucleic acids.
  • various reagents, magnetic supports (magnetic beads) and the like are required as described above. These reagents include lysing solutions or diluting solutions for dissolving or diluting samples, washing solutions, various buffer solutions, and the like.
  • a binding buffer solution for example, ammonium acetate, sodium chloride, chloride
  • a buffer solution composed of a salt such as potassium, sodium acetate or potassium acetate and an alcohol such as methanol, ethanol, isopropanol or n-butanol.
  • washing buffer a solution obtained by diluting the binding buffer 4 to 5 times may be used, but different types of buffers may be separately prepared. Water is preferred as the resuspension.
  • kits in an embodiment in which a set of necessary devices such as the magnetic support and various reagents described above is enclosed in a rotary extraction container in advance.
  • the use of the rotary extraction container of the present invention requires a conventionally complicated operation and a large and expensive apparatus! Extraction of nucleic acids, etc., due to the strength of natural samples, “separation” can be easily performed without fear of contamination, bino, zard, etc.
  • the operation of the rotary extraction container of the present invention is very simple as described above, a device that automatically performs a series of operations can be obtained.
  • it is suitable as an automatic nucleic acid extraction apparatus that automatically extracts nucleic acids.
  • nucleic acid and the like can be extracted and separated more easily without fear of contamination, such as biono and sand.
  • this automatic nucleic acid extraction apparatus can be incorporated into a nucleic acid analyzer or the like, which will be described later, and a series of operations necessary for analyzing nucleic acids and the like can be automatically performed from the beginning to the end.
  • the sample or target product is not limited to a specific substance, but a wide range. Various substances can be targeted. In particular, the effects of the present invention can be remarkably exhibited by including the following biological samples or biological samples as samples. In this case, the cells or nucleic acids are extracted and separated.
  • the target of extraction that is, the cells that can be the extraction target may be any of microorganisms (recently, mold, yeast, etc.), plants, animal cells, or cell cultures.
  • microorganisms relative to, mold, yeast, etc.
  • it is a microbial cell, and in particular, a microbial cell belonging to Chlamydia (genus Chlamydia), Neisseria (genus Neisseria) or mycobacteria (genus Mycobacterium) is desirable.
  • the sample is a sample containing the cells, and is not particularly limited as long as it is a biological sample.
  • a biological sample For example, whole blood, plasma, serum, puffy coat, urine, feces, saliva, sputum, cerebrospinal cord
  • samples derived from living organisms such as fluid, semen, tissue (eg, cancer tissue, lymph node, etc.), cell culture fluid (eg, mammalian cell culture, bacterial culture, etc.).
  • This includes nucleic acid-containing samples, samples that may contain or contain microorganisms, and any other samples (food, biological products, etc.) that may contain nucleic acids.
  • environmental samples that may contain organisms such as soil and wastewater.
  • the sample form is preferably a fluid sample, usually a solution or suspension liquid.
  • the sample can be dissolved solid or can be suspended in a liquid! /.
  • Nucleic acids that can be extracted in the present invention are deoxyribonucleic acid (DNA), and force S that exists in the form of ribonucleic acid (RNA).
  • DNA examples include plasmid DNA and complementary DNA (cDNA).
  • RNA such as genomic DNA include messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). It does not matter whether it is single-stranded or double-stranded.
  • a preferred range for the amount of DNA isolated is 0.001-1 mg.
  • the term "gene” refers to a nucleic acid carrying genetic information that expresses some function, that is, the power of DNA or RNA. It is simply a form of DNA or RNA that is a chemical entity. Sometimes it is said.
  • the “base” refers to a nucleotide nucleobase.
  • cell destruction is performed by heat. This is because heating is simple and it is not necessary to remove the drug used for cell membrane destruction later as described above.
  • the heating is performed in a temperature range in which the nuclear acid is not denatured by heat, that is, 70 to 120 ° C, preferably 80 to 120 ° C. More preferably 80 to; by heating at 100 ° C. for 20 seconds to 10 minutes, preferably 20 to 300 seconds.
  • the heating conditions vary depending on the type of cell or fungus (size, cell membrane composition and thickness, etc.), and therefore are selected appropriately within the above range. Heating is performed by any appropriate heating means. Examples include dry 'heat blocks, hot water baths, microwaves' ovens, and various heaters. However, it is not limited to these.
  • a step of concentrating the nucleic acid released by evaporating water by heat may be further included.
  • the heat to be applied is within a temperature range where the nucleic acid is not denatured by heat. Since the cell membrane destruction is performed by heating, the cell membrane destruction step by heat can also serve as the concentration step.
  • the target product to be extracted is particularly a cell or a nuclear acid
  • the sample is preferably a biological sample (or a sample derived from a living body) as described above.
  • the biological sample (or biological sample) is particularly preferably urine, blood, cell suspension, or sputum.
  • solid refers to a solid substance as a sample containing the target substance for extraction, a solid substance as the target substance for extraction, and a solid support that supports the target substance for extraction by adsorption. Contains the body.
  • the solid support according to the present invention is preferably a water-insoluble carrier.
  • the carrier is a magnetic carrier (hereinafter also referred to as “magnetic support”)!
  • the material forming the water-insoluble solid support is not particularly limited as long as it is insoluble in water.
  • water-insoluble as used herein means a solid phase that does not dissolve in an aqueous solution containing a water-soluble composition.
  • the solid support can be any known support or matrix that is currently widely used for fixation, separation, etc.
  • the target object such as cells contained in the sample is adsorbed on the solid support, but the solid support is capable of adsorbing the target object such as cells as long as the material, shape, size Is not particularly limited. Preference is given to materials which give a high surface area, for example for cell binding and thus nucleic acid binding.
  • the material specifically used as the solid support is not particularly limited, but in general, such as polystyrene, polypropylene, polyacrylate, polymethylmethacrylate, polyethylene, polyamide, latex, etc.
  • a synthetic organic polymer may be an inorganic substance such as glass, silica, silicon dioxide, silicon nitride, zirconium oxide, aluminum oxide, sodium oxide, calcium oxide, magnesium oxide, and zinc oxide, or a metal such as stainless steel and zirconium oxide.
  • These materials generally have an irregular surface and can be, for example, porous or granular, such as particles, fibers, webs, sintered bodies or sieves.
  • the shape of the solid support used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include granular, rod-like, plate-like, sheet, gel, membrane, fiber, capillary, strip, filter and the like. Preferably, it is granular. Granular materials, such as beads, are generally preferred because of their high binding capacity!
  • Examples of the granular form include a sphere, an ellipsoid, a cone, a cube, and a rectangular parallelepiped.
  • the carrier of spherical particles is preferable because it can be used in production and is ready for use since the magnetic stirring of the magnetic support is blocked.
  • the average particle size of beads as a solid support for adsorbing a target substance such as cells is preferably 0 to 6 m. When the average particle size is less than 0.5 m, if the bead body contains a magnetic substance, it does not exhibit sufficient magnetic responsiveness and can be used to separate the particles. It takes a long time, and a considerably large magnetic force is required for separation.
  • the particle size exceeds 10
  • the particles are likely to settle in an aqueous medium, and thus an operation of stirring the medium is required when capturing the cells.
  • the surface area of the particle body is small, it may be difficult to capture a sufficient amount of cells.
  • the entire bead including its surface is composed of the same material, it may be a hybrid body composed of a plurality of materials as required.
  • the core portion is made of a magnetically responsive material such as iron oxide or chromium oxide, and the surface thereof is coated with an organic synthetic polymer.
  • a magnetic support to which cells are bound can be easily separated (solid-liquid) from a sample solution by the magnetic force of a magnet, and the particles can be recovered. It is preferable that a magnetic material such as a paramagnetic material and a ferromagnetic material is contained. More preferably, both a paramagnetic material and a strong paramagnetic material or! /, Or one of them is contained. It is. In particular, it is preferable to use a strong paramagnetic substance in that there is no or little residual magnetization.
  • forces and magnetic materials include triiron tetroxide (Fe 2 O 3), ⁇ -heavy sesquioxide ( ⁇ - F
  • metals such as ferrite, iron, manganese, cobalt, chromium, cobalt, nickel
  • the magnetic support used in the present invention is a bead made of particles having a small particle diameter, and has an excellent magnetic separation property (that is, the ability to separate in a short time by magnetism), And it is preferable that it can be re-dispersed by the operation of shaking up and down.
  • the content ratio of the magnetic substance in the magnetic beads is a force of 70% by mass or less, preferably 20 to 70% by mass, since the content ratio of the non-magnetic organic substance is 30% by mass or more. Preferably it is 30-70 mass%. If this ratio is less than 20% by mass, sufficient magnetic responsiveness is not exhibited, and it becomes difficult to separate particles in a short time by a required magnetic force. On the other hand, if this ratio exceeds 70% by mass, the amount of the magnetic substance exposed on the surface of the particle body increases, so that constituent components of the magnetic substance, for example, iron ions are eluted, and other materials are used during use. The particle body may become brittle and practical strength may not be obtained.
  • a sample solution containing cells and the like and a magnetic support are mixed, and by this mixing, the cells and the like are adsorbed on the magnetic support (chemical adsorption, physical adsorption, etc.). Then, cells and the like can be efficiently accumulated on the surface. Even when cells and the like are not adsorbed to the magnetic support, it is possible to accumulate the cells by magnetic force or centrifugal force. Therefore, it is desirable that cells or the like be adsorbed on the magnetic support, but it may not be adsorbed.
  • Some cells may not adsorb to the magnetic support.
  • the surface of the magnetic support has affinity for cells.
  • Functional groups rich in reactivity such as amino groups, aminocarbonyl imidazole groups, N-hydroxysuccinimide groups, or sugars, glycoproteins, antibodies that have specific affinity for target cells,
  • a “functional substance” such as a lectin or a cell adhesion factor may be bound, or the surface structure may be modified or an appropriate coating that promotes the binding may be applied.
  • a drug such as a chaotrope reagent, a surfactant, or a solvent bacterium that affects the nucleic acid amplification reaction, hybridization, restriction enzyme reaction, detection reaction, electrophoretic analysis, etc. in the post-process is used. Since it is not used, the separated (isolated) nucleic acid can be applied directly to the amplification reaction. Therefore, even if the amount of the sample is very small, according to the method of the present invention, it is possible to obtain a high yield from the cell and to have a high purity and to separate (isolate) the nucleic acid.
  • the rotary extraction container of the present invention can be suitably used for a method of identifying a cell type by extracting and amplifying an isolated nucleic acid by a nucleic acid amplification method and identifying the nucleic acid. That is, by using the rotary extraction container of the present invention for the identification method, the extraction (separation) operation essential for the method can be carried out simply, quickly and safely.
  • a nucleic acid extracted and isolated from bacterial cells contained in a sample is subjected to PCR (Polymerase Chain Reaction), SDA (Strand Displacement Amplification). ), LCR (Ligase Chain Reaction: Chain ixJ ', No, ICAN (Isothermal and Chimeric Primer—Initiated Amplification of Nucleic Acids), LAMP (Loop—Mediated Isot hernial Amplification) TMA (Transcription— Mediared Amplification), TAS (Transcription Amplification System), 3SR (Self— Sustained Sequence Replication System), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) Bacteria can be obtained by analyzing the amplified nucleic acid, for example, base sequencing, hybridization, Southern plot analysis, etc., and comparing it with a standard or target base sequence. The type of cell or the like can be identified.
  • the rotary extraction container of the present invention can also be suitably used for a genetic testing method including a step of amplifying and detecting a nucleic acid (gene) with an apparatus having a microchip. That is, by using the rotary extraction container of the present invention for the genetic testing method, the extraction / separation (isolation) operation essential to the method can be carried out simply, quickly and safely.
  • the nucleic acid analyzer for carrying out the genetic testing method of the present invention may include a microchip form, thereby enabling high-throughput analysis.
  • the nucleic acid analyzer for carrying out the genetic testing method of the present invention comprises a device main body in which a micro pump, a control device for controlling a microphone pump, a temperature control device for controlling temperature, etc. are integrated, and the device main body. It comprises a microchip for detecting nucleic acid amplification that can be mounted.
  • a microchip for detecting nucleic acid amplification that can be mounted.
  • the unit responsible for the control system related to each control of liquid feeding, mixing, and temperature constitutes the main body of the nucleic acid analyzer according to the present invention together with the micropump.
  • This apparatus main body is commonly used for the specimen by mounting the microchip on it. Steps such as liquid mixing, liquid feeding, nucleic acid amplification, and detection described above depend on the liquid feeding sequence, volume, and timing.
  • the micropump and the temperature control are incorporated into the software installed in the nucleic acid analyzer as a program. In the present invention, only the detachable microchip needs to be replaced.
  • the nucleic acid analyzer according to the present invention all the components are miniaturized and are easy to carry. Therefore, the nucleic acid analyzer is not restricted by the place and time of use, and has good workability and operability. Since a large number of micropump units used for liquid delivery are built into the main body, the microchip can be used as a disposable type.
  • the sample receiving unit 6 and the reagent storage unit 4 are provided with a micropump for feeding the contents of these storage units.
  • the micropump is connected to the upstream side of the reagent storage unit 4 via the pump connection unit 1 and supplies the driving liquid to the reagent storage unit side by the micropump, thereby pushing the reagent out to the flow path and feeding it.
  • the micropump unit is incorporated in the main body of the nucleic acid analyzer separately from the microchip for nucleic acid amplification detection. By attaching the microchip to the main body of the nucleic acid analyzer, the micropump unit is connected to the microchip from the pump connection part 1. It is like that.
  • a piezo pump is used as the micro pump. That is, the first channel in which the channel resistance changes in accordance with the differential pressure, the ratio of the change in the channel resistance to the change in the differential pressure is smaller than the first channel, the second channel, and the first channel And a piezo pump comprising a pressurizing chamber connected to the second flow path and an actuator for changing the pressure inside the pressurizing chamber. Details thereof are described in JP-A No. 2001-322099 and JP-A No. 2004-108285.
  • the microchip of this aspect has at least a sample liquid receiving part 6, a reagent containing part 4, a waste liquid storing part, a micropump connection part 1, and a fine flow path 3, and these parts are communicated with each other through the fine flow path.
  • the sample liquid (liquid containing the isolated nucleic acid) 5 is allowed to flow to the flow path constituting the nucleic acid amplification site provided downstream of the sample receiving part, and then to the flow path constituting the site for detecting the amplified nucleic acid.
  • the microchip is characterized in that the nucleic acid is analyzed and the resulting waste liquid is transferred to the waste liquid reservoir and confined. Furthermore, in addition to each storage section, flow path, and pump connection section, each element such as a liquid feed control section, a backflow prevention section, a reagent quantification section, and a mixing section is installed at a functionally appropriate position by microfabrication technology. ing.
  • the microchip for nucleic acid amplification detection is a single microchip produced by appropriately combining one or more members such as plastic resin, glass, silicon, and ceramics.
  • the vertical and horizontal sizes are usually several tens of mm and the height is several mm.
  • the micro flow path and the body of the microchip are formed of a plastic resin that is easy to process and inexpensive, and easy to dispose of by incineration.
  • polyolefins such as polypropylene and polystyrene resins are desirable because of their excellent moldability.
  • the microchannel is formed by a microfabrication technique with a width and height force of about 10 to several hundred ⁇ m, for example, a width of about 100 ⁇ m and a depth of about 100 ⁇ m.
  • Nucleic acid isolated using the rotary extraction container of the present invention is amplified at the nucleic acid amplification site of the microchip for nucleic acid amplification detection, and the nucleic acid amplified by the following! / Is sent to the detection site of the microchip.
  • the nucleic acid (gene) is detected.
  • nucleic acid is amplified by DNA amplification methods such as PCR, SDA, LCR, ICAN, LAMP, TMA, TAS, 3SR, and NASBA. Analysis of the amplified nucleic acid is performed by a conventional method, for example, the hybridization method, gold colloid adsorption method, or the like.
  • the whole or a part of the microchip and the nucleic acid analyzer are also various in structure, configuration, arrangement, shape, size, material, method, method and the like as long as they meet the gist of the present invention. be able to.
  • the rotary extraction container of the present invention is incorporated in the nucleic acid analyzer as the above-described automatic nucleic acid extraction apparatus, and can automatically perform a series of operations necessary for nucleic acid analysis from the beginning to the end. it can. This makes it easier to carry out the work more easily without fear of contamination, such as “bino” and “zard”.

Abstract

　複数の物質を含有する試料から目的物を安全かつ簡易に抽出・分離することができる回転式抽出容器を提供する。特に、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要としている生物試料又は生体由来試料からの核酸の抽出・分離を汚染・バイオハザード等の恐れなく簡易に実施することができる回転式抽出容器を提供する。更には、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置を提供する。当該回転式抽出容器は、 試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であって、円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、該回転部の回転を含む操作によって、該円柱型容器部のいずれかの小室に入っている溶液又は固体を、別の小室へ移動させることができ、その移動を含む操作によって試料から目的物を抽出することを特徴とする。

Description

明 細 書
回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、 及び自動核酸抽出装置
技術分野
[0001] 本発明は、生物試料又は生体由来試料からの細胞又は核酸の抽出 ·分離等する ための回転式抽出容器、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び 自動核酸抽出装置に関する。
背景技術
[0002] 一般に、複数の物質を含有する試料を分析する際、分析に先立って特定の分析対 象を抽出し、分離する操作を必要とすることが多い。例えば、血液、尿などの生物由 来試料は、分析に先立って行う検体の前処理の一つとして、試料に含まれる不要成 分 (タンパク質、脂質やイオン性物質など)を除去するために、抽出 ·分離する操作を 必要とすることが通例である。
[0003] 特に臨床現場からの試料は、ウィルス、細菌などの感染、汚染の危険性を常に内包 して!/、ること力、ら、そのような試料の前処理の全体または一部であっても安全かつ迅 速に実施できる方法や装置の開発が望まれている。
[0004] したがって、従来、種々の抽出 ·分離方法が提案されている。例えば、生化学的試 料中の核酸等の分析を目的として、特別な構造を有する容器や磁性粒子等を利用 する抽出 ·分離方法が提案されている（例えば特許文献;!〜 4参照。）。
[0005] しかしながら、これらの方法は、試料の前処理として必要な操作が煩雑である上、 必ずしも、上記の臨床現場からの試料を扱う際の感染、汚染の危険性等の諸問題を 解決するものではない。
[0006] 一方、近年、マイクロマシン技術および超微細加工技術を駆使することにより、従来 の試料調製、化学分析、化学合成などを行うための装置、手段（例えばポンプ、バル ブ、流路、センサーなど）を微細化して 1チップ上に集積化したシステムが開発されて いる。これは、 ^ — TAS (Micro Total Analysis System)、マイクロチップ、バイ ォリアクタ、ラブ ·オン 'チップ（Lab— on— chips)、バイオチップとも呼ばれ、医療検 查'診断分野、環境測定分野、農産製造分野でその応用が期待されている。
[0007] とりわけ遺伝子検査に見られるように、煩雑な工程、熟練した手技、機器類の操作 が必要とされる場合には、 自動化、高速化および簡便化されたミクロ化分析システム は、コスト、必要試料量、所要時間のみならず、時間および場所を選ばない分析を可 能とすることによる恩恵は多大と言える。
[0008] し力、し、上記のようなミクロ化分析システムにおいては、マイクロチップ等の上で検査 などを行うために、試料の必要量を極少の量とし、必要とされる試薬量も少なくて済 む分析の微量化を図ることは、マイクロチップ等に求められる最大課題である。ところ 1S 試料によっては、検出対象である遺伝子または核酸の濃度が希薄であることがあ る。チップに導入できる検体量も限られていることから、そうした検体量では測定可能 な範囲内に収まらない。したがって、チップに導入する前に予備的な濃縮または分離 の操作が必要となってくる。あるいは微量の反応生成物を高感度でしかも簡便に検 出、または定量できる機構をチップに搭載することが必要とされる。遺伝子の検出で は、 PCR (polymerase chain reaction)法による増幅反応を利用するのが通例 である。血液などの生体液を試料とする場合、そのまま検体として分析に供すること ができないことが多ぐ通常は何らかの前処理を加えることが要求されることも多い。
[0009] 例えば生物試料から核酸を抽出、分離する方法として、化学的方法または物理的 方法が用いられる。後者に属する方法として、振動するビーズの作用により細胞から 核酸を抽出する方法 (例えば特許文献 5参照。）、電場を適用して分離、濃縮する方 法 (例えば特許文献 6及び 7参照。）が報告されている。これらの方法をそのまま超微 細な装置のマイクロチップ等に適用することには、多くの問題がある。
[0010] したがって、このように簡便かつ迅速な検査手段を提供するマイクロチップ等を使 用する分析分野にぉレ、ても、抽出'分離等の前処理につ!、て解決すべき具体的な 問題、要望が提起され、その解決が望まれている。
特許文献 1：特表 2001— 511644号公報
特許文献 2：特表平 10— 508100号公報
特許文献 3：特表 2003 - 516156号公報
特許文献 4 :特表 2003 - 516156号公報 特許文献 5：特表 2003— 522521号公報
特許文献 6：特開 2004— 217号公報
特許文献 7：国際公開第 02/23180号パンフレット
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0011] 本発明は、上記問題 ·要望等に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、複数 の物質を含有する試料から目的物を安全かつ簡易に抽出 ·分離することができる回 転式抽出容器を提供することである。特に、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等 を必要としている生物試料又は生体由来試料からの核酸の抽出'分離を感染、汚染 等の恐れなく簡易に実施することができる回転式抽出容器を提供することである。更 には、それを用いた細胞種の同定方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置 を提供することである。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明に係る上記課題は下記の手段によって解決される。
[0013] 1.試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であって、
(i)円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、
(ii)該円柱型容器部は少なくとも二つの小室を有し、
(iii)該回転部は前記円柱型容器部に密着可能であり、かつ前記小室のいずれかと 外部をつなぐ開口箇所を有し、
(iv)該蓋部は前記回転部の開口箇所を密閉することができ、
(V)前記回転部の回転を含む操作によって、前記円柱型容器部のいずれかの小室 に入っている溶液又は固体を、別の小室へ移動させることができ、その移動を含む操 作によって試料から目的物を抽出する、
ことを特徴とする回転式抽出容器。
[0014] 2.前記移動を含む操作で、前記固体を集めること又は前記目的物を吸着させた固 体を集めることを特徴とする前記 1に記載の回転式抽出容器。
[0015] 3.前記固体が目的物又は目的物を含む物質を担持する固体支持体であって、磁 性を有する固体支持体 (磁性支持体）であり、前記回転式抽出容器の!/、ずれかの箇 所に磁石を当てることで、該磁性支持体又は前記目的物を吸着させた該磁性支持 体を集めることを特徴とする前記 1又は 2に記載の回転式抽出容器。
[0016] 4.前記目的物が核酸であり、前記目的物を含む物質が細胞であることを特徴とす る前記 1乃至 3の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[0017] 5.前記核酸が、クラミジァ菌（Chlamydia属）、淋菌（Neisseria属）、マイコバクテリ ァ（Mycobacterium属）に属する微生物の核酸であることを特徴とする前記 4に記 載の回転式抽出容器。
[0018] 6.前記試料が、生物試料又は生体由来試料であることを特徴とする前記 1乃至 5 の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[0019] 7.前記生体由来試料が、尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることを特徴とする 前記 6に記載の回転式抽出容器。
[0020] 8.前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体を加熱することによって、該回 転式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴とする前 記 1乃至 7の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[0021] 9.前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体に超音波を当てることによつ て、該回転式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴 とする前記 1乃至 7の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
10.前記試料から前記目的物を抽出するために、磁性粒子、洗浄液、再懸濁液のう ち少なくとも一つがいずれかの小室に予め封入されていることを特徴とする前記 1乃 至 9の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[0022] 11.前記円柱型容器部の複数の小室において、集菌工程、洗浄工程、溶菌工程 を実施し、核酸を抽出することができることを特徴とする前記 1乃至 10の何れか一項 に記載の回転式抽出容器。
[0023] 12.前記回転式抽出容器の何れかの箇所に滴下口を設け、前記試料から抽出し た前記目的物を滴下口から滴下することを特徴とする前記 1乃至 11の何れか一項に 記載の回転式抽出容器。
13.前記 1乃至 12の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し得られた核 酸を、核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法。 14.前記 1乃至 12の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し得られた核 酸を、マイクロチップを有する装置において増幅し、検出する操作を含むことを特徴と する遺伝子検出方法。
[0024] 15.前記 1乃至 12の何れか一項に記載の回転式抽出容器を用い自動的に核酸を 抽出することを特徴とする自動核酸抽出装置。
発明の効果
[0025] 本発明の上記手段により、複数の物質を含有する試料から目的物を安全かつ簡易 に抽出'分離することができる回転式抽出容器を提供することができる。特に、従来 煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要としている生物試料 (又は生体由来試料） 力、らの核酸の抽出 ·分離を汚染'バイオノ、ザード等の恐れなく簡易に実施することが できる回転式抽出容器を提供することができる。更には、それを用いた細胞種の同定 方法、遺伝子検出方法、及び自動核酸抽出装置を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0026] [図 1]本発明の回転式抽出容器の構成を示す概念図
[図 2]核酸抽出方法の一例を示す概念図
[図 3]抽出液等の滴下方法の一例を示す概念図
[図 4]核酸増幅検出用マイクロチップの一例を示す概念図
符号の説明
[0027] A 円柱型容器部
Al , A2, A3 小室
B 回転部
C 蓋部 C
D 開口箇所
1 マイクロポンプ接続部
2 送液制御部
3 微細流路
4 試薬収容部
5 検体液（単離された核酸を含有する液） 6 検体液受容部
7 試薬
発明を実施するための最良の形態
[0028] 本発明の回転式抽出容器は、試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であつ て、
ω円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、
(ϋ)該円柱型容器部は少なくとも二つの小室を有し、
( )該回転部は前記円柱型容器部に密着可能であり、かつ前記小室のいずれかと 外部をつなぐ開口箇所を有し、
(iv)該蓋部は前記回転部の開口箇所を密閉することができ、
(V)前記回転部の回転を含む操作によって、前記円柱型容器部のいずれかの小室 に入っている溶液又は固体を、別の小室へと移動させることができ、その移動を含む 操作によって試料から目的物を抽出する、
ことを特徴とする。
[0029] この特徴は、請求の範囲第 1項乃至第 15項に係る発明に共通する技術的特徴で ある。
[0030] ここで、「回転を含む操作」とは、回転操作を必須とするが、必要に応じて、その他 の操作、例えば上下振盪の操作、上下逆転の操作等を一連の操作として含めた操 作をいう。また、「移動を含む操作」とは、移動させる操作を必須とするが、必要に応じ て、その他の操作、例えば、後述するように、 目的物を吸着させた磁性を有する固体 支持体 (磁性支持体）を磁力で集める操作等を一連の操作として含めた操作をレ、う。
[0031] なお、本願でいう「固体」とは、抽出の目的物を含有している試料としての固体物質 、抽出の目的物質としての固体物質、抽出の目的物又は目的物を含む物質を吸着（ 化学吸着及び物理吸着等を含む。 )により担持させる固体支持体である。
[0032] 以下、本発明とその構成要素等について詳細な説明をする。
[0033] (回転式抽出容器の構成）
図 1に示した本発明の回転式抽出容器の概念図を参照しながら説明をする。当該 回転式抽出容器は、基本的には、円柱型容器部 A、回転部 B、及び蓋部 Cで構成さ れる。
[0034] 円柱型容器部 Aは少なくとも二つの小室（例えば図 1においては、小室 A1〜小室 A3の三つの小室）を有し、 目的に応じて小室を増設してもよい。例えば、後述する実 施の形態のように集菌用小室，洗浄用小室，再懸濁用小室等を設けることができる。
[0035] 回転部 Bは円柱型容器部に密着可能であり、小室を部分的に塞ぐ箇所と小室のい ずれか一つと外部をつなぐ開口箇所 D (小室の入り口と同じ開口面積）を有する。こ の開口箇所 Dから円柱型容器部のいずれかの小室に、試料としての溶液、懸濁液、 及び固体物質や固体支持体としての磁性粒子等を出し入れすることができる。
[0036] 蓋部 Cは回転部 Bの開口箇所 Dを密閉することにより、同時に円柱型容器部 Aを密 閉すること力 Sできる。また、当該蓋部 Cは、回転式抽出容器を逆さにしたときに開口箇 所 Dから出てくる物質の受器の役割も果たす。
[0037] なお、回転式抽出容器の回転部 Bをその開口箇所 Dが溶液又は固体が入っている 小室の真上に来るまで回転させた後、回転式抽出容器を逆さにして当該小室から溶 液又は固体を、開口箇所 Dを経由して蓋部 Cに移動させる。次に、回転部 Bを回転し て開口箇所 Dが別の小室の真上更に来るように回転させた後に、溶液又は固体を蓋 部 Cから開口箇所 Dを経由して当該別の小室へと移動させることができる。したがつ て、このような回転操作や移動操作を含む操作によって試料から目的物を抽出する こと力 Sでさる。
[0038] すなわち、当該固体が、抽出の目的物を含有している試料としての固体物質、抽出 の目的物質としての固体物質、及び抽出の目的物を吸着させた固体支持体である 場合、上記のような移動を含む操作で、当該固体を集めること又は目的物を吸着さ せた固体を集めることができる。
[0039] なお、固体が目的物または目的物を含む物質を吸着させる固体支持体であり、 つ磁性を有する支持体（以下「磁性支持体」という。）である場合には、回転式抽出容 器のいずれかの箇所に磁石を当てることで、当該磁性支持体又は前記目的物あるい は目的物を含む物質を吸着させた該磁性支持体を集めることができる。
[0040] 本発明に係る円柱型容器 A、回転部 B、及び蓋部 Cを形成する材料としては、試料 内容に応じて、金属、プラスチック等種々の公知の材料を用いることができる。好まし い材料としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネイト等を挙げることができ
[0041] また、円柱型容器部 A、回転部 B、及び蓋部 Cのサイズも試料の内容、量や分析装 置等に応じて適切なサイズにすることができる。
[0042] (回転式抽出容器の操作手順）
本発明の回転式抽出容器を使用する際の操作手順を本発明の実施形態の典型 的な例によって説明する（図 2及び図 3参照）。
[0043] (1)予め、円柱型容器部 Aの一つの小室 (A1)には集菌溶液（200 1)と、磁性支 持体として磁性ビーズ (30 1 ;濃度 lmg/ml)を、別の小室 (A2)には洗浄溶液（1 ml)を、また小室 (A3)には溶菌溶液（100 1)を入れておく。
[0044] (2)回転部 Bの開口箇所 Dから上記小室 (A1)に試料 (尿 lml)を入れ、蓋部 Cをセ ットし、密閉する。
[0045] (3)試料 (尿 lml)、集菌溶液（200 ^ 1)、磁性ビーズ (30 ^ 1)を撹拌し、混合した後
1分放置し、磁性ビーズに菌を吸着させる。
[0046] (4)回転式抽出容器を逆さにし、蓋部に磁石を当て（30秒）、磁性ビーズを集め回 収 (集菌)する。
[0047] (5)回転式抽出容器の上下を戻し、開口箇所 Dが別の小室 (A2)に来るように回転 部 2を回転させた後に、磁石をはずし、磁性ビーズを小室 (A2)に移動させる。
[0048] (6)小室 (A2)にお!/、て洗浄溶液 lmlと磁性ビーズを撹拌混合し、洗浄する。
[0049] (7)回転式抽出容器を逆さにし、蓋部 Cに磁石を当て（30秒）、洗浄済みの磁性ビ ーズを回収する。
[0050] (8)回転式抽出容器の上下を戻し、開口箇所 Dが別の小室 (A3)に来るように回転 部 Bを回転させた後に、磁石をはずし、磁性ビーズを小室 (A3)を移動させる。
[0051] (9)小室 (A2)にお!/、て溶菌溶液（100 μ 1)と磁性ビーズを撹拌混合する。
[0052] (10)回転式抽出容器を逆さにし、蓋部 Cをヒーターへ入れて所定温度'時間（94 °Cで 1分間)加熱し、菌を溶解する (核酸を抽出する)。
[0053] (11)蓋部 Cに磁石を当て磁性ビーズを保持したままで（30秒）、回転式抽出容器 の上下を戻し、溶液を (A3)に戻す。 [0054] (12)蓋部 Cをはずし、小室 (A3)力もマイクロピペット又はスポイト等で核酸抽出液 を回収する。または蓋部 Cに滴下口を開け、滴下口から核酸抽出液を核酸増幅検出 用マイクロチップ等に滴下する。滴下口は、小室 (A3)など回転式抽出容器のいず れかの箇所に設けることができる力 蓋部 Cに設けるのが好ましい。蓋部 Cから滴下 することによって、ピペット、スポイトなどの器具および器具操作の省略、操作ミスの軽 減、操作の簡便化を図ることができる。例えば溶菌溶液（100 1)のうち一定量 (例え ば 25 a 1)を滴下すれば、複数回または複数項目の検査を行うことができる。滴下部 分は、 目薬容器のような形状が好ましい。 目薬のように液滴として溶液を押し出すこと ができれば、簡便な動作で安定かつ正確に一定量の液を容器から取り出すことが可 能である。
[0055] なお、上記の小室 (Al)、（A2)及び (A3)は、それぞれ前述の集菌用小室、洗浄 用小室、及び再懸濁用小室に相当する。上記実施例のように試料から前記目的物を 分離するために、磁性ビーズ、洗浄液、再懸濁液のうち少なくとも一つがいずれかの 小室に予め封入されていることが、安全、簡便であることから好ましい。
[0056] また、回転部 Bは、（A1)→(A2)→(A3)の順に回るようになつており、逆回転しな い、かつ回転部 Bが外れないようにストッパーが付けてあり、蓋部 Cも一度はめると外 れなレ、ようにストッパーを付けておくことが好ましレ、。
[0057] 上記の実施形態例から分かるように、一つの回転式抽出容器を密封した状態で、 円柱型容器部 Aの各小室（ (A1)〜 (A3) )及び蓋部 Cのそれぞれにお!/、て、集菌ェ 程、洗浄工程及び溶菌工程の処理 ·操作を順々に実施できる。
[0058] なお、本願で、「集菌工程」とは、 目的物である菌を集菌溶液から固体支持体に吸 着等させることをいう。「集菌溶液」とは、菌を固体支持体に吸着等させるために菌を 溶媒に予め溶解して調製した溶液をいう。なお、菌の懸濁液もこれに含めることにす る。「洗浄工程」とは、菌を吸着させた固体支持体から、余分な溶媒や試薬等を除去 するために洗浄する工程をいう。また、「溶菌工程」とは、固体支持体に吸着等してい る菌を加熱等により、菌の細胞壁や細胞膜を破壊して核酸を溶媒中に溶出する工程 をいう。「溶菌溶液」とは、菌の細胞壁や細胞膜を破壊して核酸を溶出させるための 溶液をいう。 [0059] 本発明の回転式抽出容器を使用して核酸等を抽出する際には、上記のように、各 種試薬、磁性支持体 (磁性ビーズ)等が必要となる。これらの試薬の中には、試料を 溶解又は希釈するための溶解液又は希釈液、洗浄液、各種緩衝液なども含まれる。
[0060] なお、核酸を抽出 ·単離する場合には、各種緩衝液等を必要とするが、例えば、結 合緩衝液 (集菌溶液等）としては、例えば、酢酸アンモユウム、塩化ナトリウム、塩化力 リウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の塩と、メタノール、エタノール、イソプロパノー ノレ、 n—ブタノール等のアルコールとからなる緩衝液が例として挙げられる。また、洗 浄緩衝液 (洗浄液）としては、上記結合緩衝液を 4〜5倍に希釈したものを用いてもよ いが、異なる種類の緩衝液を別途用意してもよい。再懸濁液としては、水が好適であ
[0061] 本発明の好まし!/、態様の一つとして、上記の、磁性支持体や各種試薬等必要な器 材一式を予め回転式抽出容器に封入した態様のキットとしておくことが望ましい。
[0062] 以上の実施形態例から分かるように、本発明の回転式抽出容器を使用することによ り、従来煩雑な操作や大型で高価な装置等を必要として!/、る生物試料又は生体由 来試料力もの核酸等の抽出'分離を汚染'バイオノ、ザード等の恐れなく簡易に実施 すること力 Sでさる。
[0063] (自動核酸抽出装置）
本発明の回転式抽出容器の操作は、上記のように非常に簡易であることから、一連 の操作を自動的に行う装置とすることができる。特に、自動的に核酸を抽出する自動 核酸抽出装置として好適である。これにより核酸等の抽出'分離を汚染'バイオノ、ザ ード等の恐れなく一層簡易に実施することができる。
[0064] なお、この自動核酸抽出装置を後述する核酸分析装置等に組み込み、核酸等の 分析に必要な一連の操作を最初から最後まで自動的に行うこともできる。
[0065] (試料及び目的物）
本発明の回転式抽出容器を用いて試料 (サンプル)から目的物（「抽出対象物」とも いう。）を抽出'分離する場合、試料や目的物としては、特定の物質に限られず、広範 な種々の物質を対象とすることができる。特に、本発明の効果を顕著に発現すること ができるのは、下記の生物試料ないし生体由来の試料を試料として、それらに含有さ れている細胞や核酸等を抽出'分離の目的物とする場合である。
[0066] 本発明において抽出の目的物、すなわち抽出対象物とすることができる細胞は、微 生物（最近、カビ、酵母等）、植物、動物の細胞又は細胞培養物のいずれであっても よぐ特に限定されない。好ましくは、微生物の細胞であり、特にクラミジァ菌（Chlam ydia属）、淋菌（Neisseria属）、マイコバクテリア（Mycobacterium属）に属する微 生物の細胞が望ましい。
[0067] 試料は前記細胞を含有する試料であり、生体由来の試料であれば、特に制限は無 いが、例えば全血、血漿、血清、パフィーコート、尿、粪便、唾液、喀痰、脳脊髄液、 精液、組織 (例えば、癌組織、リンパ節等）細胞培養液 (例えば、哺乳動物細胞培養 物及び細菌培養物等）など生体由来の殆どの試料が該当する。核酸含有試料、微 生物などが混入又は含有する可能性のある試料、その他核酸が含有されてレ、る可能 性のあるあらゆる試料 (食品、生物学的製剤等）が対象となる。或いは、土壌、排水の ような生物を含有する可能性のある環境試料が挙げられる。試料の形態は、好ましく は流体の試料であり、通常は、溶液若しくは懸濁液の液体である。試料は溶解できる 固体であるか、又は液体の中に浮遊して!/、る固体であってもよ!/、。
[0068] 本発明において抽出の対象とすることができる核酸は、デォキシリボ核酸 (DNA)、 及びリボ核酸 (RNA)の形態で存在する力 S、 DNAとしては、プラスミド DNA、相補 D NA(cDNA)、及びゲノム DNAなど、 RNAとしては、メッセンジャー RNA(mRNA) 、トランスファー RNA (tRNA)及びリボソーム RNA (rRNA)などが含まれる。なお、 一本鎖又は二本鎖を問わない。単離される DNA量の好適な範囲として 0. 001-1 mgである。
[0069] 本願にお!/、て、「遺伝子」とは、何らかの機能を発現する遺伝情報を担う核酸、すな わち DNA又は RNAをいう力 単に化学的実体である DNA, RNAの形でいうことも ある。また「塩基」とは、ヌクレオチドの核酸塩基のことをいう。
[0070] 前記の細胞膜の破壊は、公知の種々の物理的方法を用いることができる。好ましく は熱により細胞破壊が行われる。これは加熱が簡便であり、上記のように細胞膜破壊 に使用した薬剤を後で除く必要がないからである。具体的には、前記の加熱は、核 酸が熱により変性しない温度範囲、すなわち、 70〜； 120°C、好ましくは 80〜； 120°C、 更に好ましくは 80〜； 100°Cで、 20秒〜 10分間、好ましくは 20〜300秒間の加熱に よる。加熱条件 (温度、時間）は細胞又は菌の種類 (大きさ、細胞膜の組成と厚さ等） によって異なるため、上記の範囲で適宜選択する。加熱は、あらゆる適切な加熱手段 により行われる力 ドライ'ヒートブロック、湯浴、マイクロウエーブ 'オーブン、各種ヒー ターなどが例示される。しかし、これらに限定されるものではない。
[0071] なお上記行程に加えて、熱によって水分を蒸発させることにより遊離した核酸を濃 縮する工程を更に含めてもよい。加える熱は、核酸が熱により変性しない温度範囲内 である。上記の細胞膜破壊が加熱により行われるために、熱による細胞膜破壊工程 はこの濃縮工程を兼ねることができる。
[0072] 以上より、本発明の回転式抽出容器の好適な適用態様としては、本発明の目的- 解決課題、発明の効果等の観点から、抽出対象である目的物が、特に細胞又は核 酸であることが好ましい。したがって、試料としては、特に上記のような生物試料（又 は生体由来試料)であることが好ましい。また、当該生物試料 (又は生体由来試料)と しては、特に尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることが好ましい。
[0073] (固体支持体）
前述のように、本願でいう「固体」には、抽出の目的物を含有している試料としての 固体物質、抽出の目的物質としての固体物質、及び抽出の目的物を吸着により担持 させる固体支持体が含まれる。これらの固体のうち、本発明に係る固体支持体は、水 不溶性の担体であるであることが好ましい。また、磁性を有する担体（以下において、 「磁性支持体」ともレ、う。 )であることが好まし!/、。
[0074] 本発明にお!/、て、水不溶性の固体支持体を形成する材料は、特に限定されるもの ではないが、水に不溶であればよい。ここでいう水不溶性とは、具体的に水、他のい 力、なる水可溶性組成を含む水溶液に溶解しない固相を意味する。固体支持体は、 固定、分離等用に現在広く使用され、提案されている公知の支持体又はマトリックス の!/、ずれであってもよ!/、。
[0075] 具体的には無機化合物、金属、金属酸化物、有機化合物又はこれらを組み合わせ た複合材料を含む。試料に含まれる細胞等の目的物を固体支持体に吸着させるが、 固体支持体は、細胞等の目的物を吸着させ得るものであれば、材質、形状、サイズ は特に限定されない。好ましいのは、例えば、細胞の結合、したがって、核酸の結合 のためには高!/、表面積を与える材料である。
[0076] 具体的に固体支持体として使用される材料は、特に限定されるものではないが、一 般にポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアタリレート、ポリメチルメタタリレート、ポリェチ レン、ポリアミド、ラテックスなどのような合成有機高分子、ガラス、シリカ、二酸化珪素 、窒化珪素、酸化ジルコニウム、酸化アルミニウム、酸化ナトリウム、酸化カルシウム、 酸化マグネシウム、酸化亜鉛などの無機物又はステンレス、ジルコユアなどの金属で あってもよい。これらの材料は一般に不規則な表面を持ち、例えば多孔性又は粒状 、例えば粒子、繊維、ウェブ、焼結体又は篩いであることができる。
[0077] よって、本発明において用いられる固体支持体の形状としては特に限定されるもの ではないけれども、粒状、棒状、板状、シート、ゲル、膜、繊維、毛細管、ストリップ、フ ィルターなどが挙げられ、好ましくは、粒状である。粒状材料、例えばビーズは、結合 能力が大きレ、ために一般に好まし!/、。
[0078] 粒状の形態としては、例えば球形、楕円体形、錐体、立方形、直方体形などが挙げ られる。このうち球形粒子の担体は製造しやすぐ使用時に、磁性支持体の回転攪 拌がしゃすいことからも好ましい。細胞等の目的物を吸着する固体支持体としてのビ ーズの平均粒径は、 0. 好ましくは 2〜6 mであることが好ましい。平均 粒径が 0. 5 m未満である場合、当該ビーズ本体が磁性体を含有してなるものであ る場合は、充分な磁気応答性を発現せず、当該粒子を分離するために相当に長い 時間を要し、また、分離するために相当に大きい磁力が必要となる。一方、粒径が 10 を超える場合には、当該粒子が水性媒体中で沈降しやすいものとなるため、細 胞を捕捉する際に媒体を攪拌する操作が必要となる。また、粒子本体の表面積が小 さくなるため、充分な量の細胞を捕捉することが困難となることがある。
[0079] その表面も含めたビーズ全体が同一の材料から構成されている場合のほかに、必 要に応じて複数の素材から構成されるハイブリット体であってもよい。例えば分析の 自動化に対応することができるために、コア部分は酸化鉄、又は酸化クロムのような 磁気応答性材料で作られ、その表面を有機合成ポリマーで被覆された複合ビーズが 挙げられる。 [0080] 細胞を結合させた磁性支持体を試料液から、磁石の磁力によって容易に（固液）分 離'粒子の回収をすることができる点で、その磁性支持体が常磁性体、強常磁性体、 及び強磁性体などの磁性体が含有されてなるものであることが好ましぐより好ましく は、常磁性体及び強常磁性体の両方又は!/、ずれか一方が含有されてなるものであ る。特に残留磁化がないか又は少ない点で、強常磁性体を用いることが好ましい。
[0081] 力、かる磁性体の具体例としては、四三酸化鉄 (Fe O )、 γ—重三二酸化鉄（ γ— F
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e〇）、各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル
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、マンガンなどの各種合金を挙げることができ、これらのうち、四三酸化鉄が特に好ま しい。
[0082] 本発明にお!/、て用いられる磁性支持体は、小粒径の粒子よりなるビーズであって、 優れた磁気分離性 (すなわち磁気によって短時間で分離する性能）を有し、かつ、ゆ るレ、上下振盪の操作によって再分散し得るものであることが好ましレ、。
[0083] 磁性ビーズにおける磁性体の含有割合は、非磁性体の有機物質の含有割合が 30 質量％以上であることから、 70質量％以下とされる力 好ましくは、 20〜70質量％、 より好ましくは 30〜70質量％である。この割合が 20質量％未満であると、充分な磁 気応答性が発現されず、所要の磁力によって短時間で粒子を分離することが困難と なること力 Sある。一方、この割合が 70質量％を超えると、粒子本体表面に露出する磁 性体の量が多くなるため、当該磁性体の構成成分、例えば、鉄イオンの溶出などが 生じ、使用時に他の材料に悪影響を及ぼすことがあり、また、粒子本体が脆くなつて 実用的な強度が得られないことがある。
[0084] 本発明に係る抽出方法では、細胞等を含む試料液と磁性支持体 (好ましくは磁性 ビーズ)とを混合し、この混合により細胞等が磁性支持体に吸着 (化学吸着及び物理 吸着等を含む。）すると、細胞等を効率よくその表面上に集積することができる。細胞 等が磁性支持体に吸着しない場合も磁力又は遠心分力で細胞を集積することが可 能である。したがって、細胞等が磁性支持体に吸着することが望ましいが、吸着しなく てもよい。
[0085] 細胞、特に細菌細胞の中には、磁性支持体に吸着しない場合もある。更に確実に 細胞の吸着、付着を促進するため、磁性支持体の表面に細胞に対して親和性を有 する基、アミノ基、ォキシカルボ二ルイミダゾール基、 N—ヒドロキシコハク酸イミド基と いった反応性に富む官能基、或いは標的の細胞に特異的に親和性を示す糖、糖タ ンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」などを結合させるか 、その表面構造の改変、結合を促進する適当なコーティングなどを施してもよい。
[0086] 試料によっては、それに含まれる細胞、特に対象菌細胞の濃度が薄!/、場合、大量 の試料液を処理し、分離、濃縮などの操作が必要となる。細胞を磁性支持体に結合 若しくは付着させて、細胞中の核酸を簡便に抽出する本発明の方法によれば、簡便 な操作で迅速にそうした試料の処理ができる。特に磁性ビーズと着脱可能なカバー を付けた磁石を利用する本発明における固液分離操作は、試料が少量しかな!/ヽ場 合にも極めて便利である。かかる場合には、分離、抽出などの過程で、細胞又は核 酸のロスが生じて、 目的とする核酸の最終収量が分析に好適な量を下回るケースも ある力 本発明の方法では、そうした単離途中でのロスは殆ど生じない。後工程にあ る核酸増幅反応、ハイブリダィゼーシヨン、制限酵素反応、検出反応、電気泳動分析 などに影響を及ぼす、カオトロープ試薬、界面活性剤、又は溶剤菌などの薬剤を本 発明の方法では使用しないため、分離（単離)された核酸はそのまま増幅反応に適 用すること力 Sできる。したがって、試料量が微量であっても、本発明の方法によれば、 細胞から高収量でし力、も純度が高!/、核酸を分離（単離)すること力 Sできる。
[0087] (核酸の増幅）
本発明の回転式抽出容器は、抽出し、単離された核酸を核酸増幅法により増幅し 、核酸の同定をすることにより細胞種を同定する方法に好適に使用することができる 。すなわち、当該同定方法に本発明の回転式抽出容器を用いることによって、当該 方法に必須の抽出'分離（単離)操作を、簡易、迅速、かつ安全に実施することがで きる。
[0088] 具体的には、試料に含まれる細菌細胞等から抽出され、単離された核酸を、 PCR ( Polymerase Chain Reaction：ポリメラーセ運鎖反 、リ、 SDA (Strand Displac ement Amplification：鎖置換増幅法)、 LCR (Ligase Chain Reaction :リガ一 セ: 鎖 ixJ'、ノ、 ICAN (Isothermal and Chimeric Primer— Initiated Amplifi cation of Nucleic acids：等温核酸増幅法）、 LAMP (Loop— Mediated Isot hernial Amplification) TMA (Transcription— Mediared Amplification : 転写増幅法）、 TAS (Transcription Amplification System)、 3SR (Self— Su stained Sequence Replication System :自己複製)、 NASBA (Nucleic Aci d Sequence -Based Amplification：核酸配列に基づく増幅法）などの DNA増 幅法により増幅し、増幅された核酸の分析、例えば、塩基配列決定、ハイブリダィゼ ーシヨン法、サザンプロット分析など行って、標準又は対象の塩基配列とを比較する ことにより細菌細胞等の種類を同定することができる。
[0089] (遺伝子検査方法）
本発明の回転式抽出容器は、マイクロチップを有する装置で核酸 (遺伝子）を増幅 し、検出する段階を含む遺伝子検査方法にも好適に使用することができる。すなわち 、当該遺伝子検査方法に本発明の回転式抽出容器を用いることによって、当該方法 に必須の抽出 ·分離（単離)操作を、簡易、迅速、かつ安全に実施することができる。
[0090] 本発明の遺伝子検査方法を実施するための核酸分析装置として、マイクロチップ 形態のものを含んでもよぐこれによりハイスループットな分析が可能となる。
[0091] 〈核酸分析装置〉
本発明の遺伝子検査方法を実施するための核酸分析装置は、マイクロポンプ、マ イク口ポンプを制御する制御装置、温度を制御する温度制御装置などが一体化され た装置本体と、この装置本体に装着可能な核酸増幅検出用マイクロチップとからなる 。予め試薬が封入されたマイクロチップの検体受容部に検体液を注入して、そのマイ クロチップを核酸分析装置の本体に装着すると、送液ポンプを作動させるための機 構的連結、必要であれば制御用の電気的接続もなされる。本体とこのマイクロチップ とを接合させると、マイクロチップの流路も作動状態となる。したがって、好ましい態様 の一例では、操作が開始されると検体及び試薬類の送液、混合、核酸の増幅、検出 などが、一連の連続的工程として自動的に実施される。
[0092] 送液、混合、温度の各制御に関わる制御系を受け持つユニットは、マイクロポンプと ともに本発明に係る核酸分析装置の本体を構成する。この装置本体は、これに上記 マイクロチップを装着することにより検体に対して共通で使用される。上記の液体の 混合、送液、核酸の増幅、検出などの工程は、送液順序、容量、タイミングなどにつ いて予め設定された条件として、マイクロポンプ及び温度の制御とともにプログラムと して核酸分析装置に搭載されたソフトウェアに組み込まれている。本発明では脱着可 能な上記マイクロチップのみ交換すればよい。本発明に係る核酸分析装置は、いず れのコンポーネントも小型化され、持ち運びに便利な形態としているために、使用す る場所及び時間に制約されず、作業性、操作性が良好である。送液に使用する多数 のマイクロポンプユニットが装置本体側に組み込まれているので、マイクロチップはデ イスポーザブルタイプとして使用できる。
[0093] 〈核酸増幅検出用のマイクロチップ、マイクロポンプ及びポンプの接続部〉
核酸増幅検出用マイクロチップの好ましい態様の一例として、図 4に掲げる実施形 態を説明する。検体受容部 6,試薬収容部 4について、これらの収容部の内容液を送 液するマイクロポンプが設けられている。マイクロポンプは、ポンプ接続部 1を介して 試薬収容部 4の上流側に接続され、マイクロポンプにより駆動液を試薬収容部側へ 供給することによって、試薬を流路へ押し出して送液している。マイクロポンプユニット は、核酸増幅検出用マイクロチップとは別途の核酸分析装置本体に組み込まれてお り、マイクロチップを核酸分析装置本体に装着することによって、ポンプ接続部 1から マイクロチップに接続されるようになっている。
[0094] 本実施形態では、マイクロポンプとしてピエゾポンプを用いる。すなわち、流路抵抗 が差圧に応じて変化する第一流路と、差圧の変化に対する流路抵抗の変化の割合 が該第一流路よりも小さレ、第二流路と、該第一流路及び該第二流路に接続された加 圧室と、該加圧室の内部の圧力を変化させるためのァクチユエ一タとを備えたピエゾ ポンプである。その詳細は、特開 2001— 322099号公報、特開 2004— 108285号 公報に記載されている。
[0095] 上記核酸分析装置用として用いられる核酸増幅検出用チップについては、好まし い態様の一例について、以下に記載する。その態様のマイクロチップは、少なくとも 検体液受容部 6,試薬収容部 4,廃液貯留部、マイクロポンプ接続部 1及び微細流路 3を有し、各部を微細流路で連通させている。検体液（単離された核酸を含有する液 ) 5を、検体受容部下流に設けられた核酸増幅部位を構成する流路、次いで増幅さ れた核酸を検出する部位を構成する流路へ流して、試薬収容部 4の試薬 7と混合す ることによって核酸を分析するとともに、その結果、生じる廃液を該廃液貯留部へ移し て閉じ込めることを特徴とするマイクロチップである。更に各収容部、流路、ポンプ接 続部に加えて、送液制御部、逆流防止部、試薬定量部、混合部などの各エレメントが 、機能的に適当な位置に微細加工技術により設置されている。
[0096] 次に、マイクロチップの好ましい態様の例を示す。核酸増幅検出用のマイクロチップ は、プラスチック樹脂、ガラス、シリコン、セラミックスなどの 1以上の部材を適宜組み 合わせて作製される一枚のマイクロチップである。その縦横のサイズは、通常、数 10 mmぐらい、高さが数 mm程度である。好ましくは、マイクロチップの微細流路及び躯 体は、加工成形が容易で安価であり、焼却廃棄が容易なプラスチック樹脂で形成さ れる。なかでもポリプロピレンなどのポリオレフインやポリスチレンの樹脂は成型性に 優れるために望ましい。微細流路は、微細加工技術によりその幅及び高さ力 約 10 〜数 100 μ mのサイズ、例えば幅 100 μ m、深さ 100 μ m程度に形成される。
[0097] 〈核酸の増幅及び検出〉
本発明の回転式抽出容器を用いて単離された核酸は、核酸増幅検出用マイクロチ ップの核酸増幅部位で増幅され、次!/、で増幅された核酸が該マイクロチップの検出 部位に送られて核酸 (遺伝子）の検出が行われる。核酸の増幅は、上記のように PCR , SDA、 LCR, ICAN, LAMP, TMA, TAS, 3SR, NASBAなどの DNA増幅法 により増幅する。増幅された核酸の分析を常法、例えばノ、イブリダィゼーシヨン法、金 コロイド吸着法などにより行う。
[0098] 上記マイクロチップ及び核酸分析装置の全体又は一部についても、構造、構成、 配置、形状形態、寸法、材質、方式、方法などを本発明の趣旨に合致する限り、種々 のものにすることができる。
[0099] なお、本発明の回転式抽出容器は、前述の自動核酸抽出装置として上記核酸分 析装置に組み込み、核酸の分析に必要な一連の操作を最初から最後まで自動的に 行うこと力 Sできる。これにより汚染'バイオノ、ザード等の恐れなく一層簡易に実施する こと力 Sでさる。
[0100] 以上、本発明の典型的実施形態の一例として示された図面を参照しながら、本発 明につ!/、て説明したが、本発明は、かかる形態 ·態様及び例に限定されるものではな
LUOLO/LOOZdT/lDd 6 V T0SS.0/800Z OAV

Claims

請求の範囲
[1] 試料から目的物を抽出する回転式抽出容器であって、
ω円柱型容器部、回転部、及び蓋部で構成され、
(ϋ)該円柱型容器部は少なくとも二つの小室を有し、
( )該回転部は前記円柱型容器部に密着可能であり、かつ前記小室のいずれかと 外部をつなぐ開口箇所を有し、
(iv)該蓋部は前記回転部の開口箇所を密閉することができ、
(V)前記回転部の回転を含む操作によって、前記円柱型容器部のいずれかの小室 に入っている溶液又は固体を、別の小室へ移動させることができ、その移動を含む操 作によって試料から目的物を抽出する、
ことを特徴とする回転式抽出容器。
[2] 前記移動を含む操作で、前記固体を集めること又は前記目的物を吸着させた固体を 集めることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の回転式抽出容器。
[3] 前記固体が目的物又は目的物を含む物質を担持する固体支持体であって、磁性を 有する固体支持体 (磁性支持体）であり、前記回転式抽出容器のいずれかの箇所に 磁石を当てることで、該磁性支持体又は前記目的物を吸着させた該磁性支持体を集 めることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の回転式抽出容器。
[4] 前記目的物が核酸であり、前記目的物を含む物質が細胞であることを特徴とする請 求の範囲第 1項乃至第 3項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[5] 前記核酸が、クラミジァ菌（Chlamydia属）、淋菌（Neisseria属）、マイコバクテリア（
Mycobacterium属）に属する微生物の核酸であることを特徴とする請求の範囲第 4 項に記載の回転式抽出容器。
[6] 前記試料が、生物試料又は生体由来試料であることを特徴とする請求の範囲第 1項 乃至第 5項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[7] 前記生体由来試料が、尿、血液、細胞懸濁液、又は喀痰であることを特徴とする請 求の範囲第 6項に記載の回転式抽出容器。
[8] 前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体を加熱することによって、該回転 式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴とする請求 の範囲第 1項乃至第 7項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[9] 前記回転式抽出容器のいずれかの箇所又は全体に超音波を当てることによって、該 回転式抽出容器内に存在する細胞から核酸を溶出することができることを特徴とする 請求の範囲第 1項乃至第 7項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[10] 前記試料から前記目的物を抽出するために、磁性粒子、洗浄液、再懸濁液のうち少 なくとも一つがいずれかの小室に予め封入されていることを特徴とする請求の範囲第
1項乃至第 9項の何れか一項に記載の回転式抽出容器。
[11] 前記円柱型容器部の複数の小室において、集菌工程、洗浄工程、溶菌工程を実施 し、核酸を抽出することができることを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 10項の何 れか一項に記載の回転式抽出容器。
[12] 前記回転式抽出容器の何れかの箇所に滴下口を設け、前記試料から抽出した前記 目的物を滴下口から滴下することを特徴とする請求の範囲第 1項乃至第 11項の何れ か一項に記載の回転式抽出容器。
[13] 請求の範囲第 1項乃至第 12項の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し 得られた核酸を、核酸増幅法により同定することを特徴とする細胞種の同定方法。
[14] 請求の範囲第 1項乃至第 12項の何れか一項に記載の回転式抽出容器により抽出し 得られた核酸を、マイクロチップを有する装置において増幅し、検出する操作を含む ことを特徴とする遺伝子検出方法。
[15] 請求の範囲第 1項乃至第 12項の何れか一項に記載の回転式抽出容器を用い自動 的に核酸を抽出することを特徴とする自動核酸抽出装置。
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