DE60012511T2 - Mikrofluidische systeme mit mikrokugelmatrizen zum nachweis von zielanalyten - Google Patents

Mikrofluidische systeme mit mikrokugelmatrizen zum nachweis von zielanalyten Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Verfahren und Geräte zur Durchführung von Analysen und im Besonderen Mikrofluidikvorrichtungen zum Nachweis von Zielanalyten.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es gibt eine Vielzahl an Tests und Sensoren zum Nachweis der Gegenwart und/oder der Konzentration bestimmter Substanzen in Fluids oder Gasen. Viele davon basieren auf bestimmten Ligand/Antiligand-Reaktionen als Detektionsmechanismus. Das bedeutet, dass bekannt ist, dass Substanzenpaare (d.h. Bindungspaare oder Liganden/Antiliganden) aneinander binden, während sie gar nicht oder kaum an andere Substanzen binden. Dies war der Kernpunkt zahlreicher Verfahren, die sich dieser Bindungspaare bedienen, um Komplexe nachzuweisen. Diese werden im Allgemeinen durch Markieren einer Komponente im Komplex auf beliebige Weise durchgeführt, um den gesamten Komplex nachweisbar zu machen, beispielsweise unter Verwendung von Radioisotopen, fluoreszierenden und anderen optisch aktiven Molekülen, Enzymen usw.
  • Ein Typ eines Sensors, der besonders vielversprechend ist, basiert auf Mikrokügelchen oder Perlen, die auf einem Substrat an diskreten Stellen verteilt sind. Jede Perle enthält eine chemische Funktionalität, wie z.B. einen Bindungspartner, die zum Nachweis der Gegenwart eines Zielanalyten eingesetzt werden kann. Die Perlen werden statistisch abgelagert, woraufhin eine Vielzahl an Decodierungssystemen verwendet wird, um die Position und die chemische Funktionalität an jeder Stelle aufzuklären. Vgl. beispielsweise WO 99/18434, WO 99/45357, WO98/40726 und WO 98/50782.
  • WO 00/04372, gemäß Art. 54 (3) anführbar, offenbart ein System zur Merkmalsbestimmung von Multianalyt-Fluids unter Verwendung einer Lichtquelle, einer Sensoranordnung und eines Detektors.
  • Es herrscht ein deutlicher Trend dahingehend vor, die Größe dieser Sensoren zu verringern, sowohl bezüglich der Empfindlichkeit als auch zur Senkung der Reagenskosten. Es wurden also eine Vielzahl von Mikrofluidikvorrichtungen entwickelt, die im Allgemeinen einen festen Träger mit Mikrokanälen umfassen und eine Vielzahl verschiedener Vertiefungen, Pumpen, Reaktionskammern und dergleichen einsetzen. Vgl. beispielsweise EP Nr. 0.637.996 B1; EP Nr. 0.637.998 B1; WO 96/39260; WO 97/16835; WO 98/13683; WO 97/16561; WO 97/43629; WO 96/39252; WO 96/15576; WO 96/15450; WO 97/37755; und WO 97/27324; und die U.S.-Patente Nr. 5.304.487; 5.071.531; 5.061.336; 5.747.169; 5.296.375; 5.110.745; 5.587.128; 5.498.392; 5.643.738; 5.750.015; 5.726.026; 5.35.358; 5.126.022; 5.770.029; 5.631.337; 5.569.364; 5.135.627; 5.632.876; 5.593.838; 5.585.069; 5.637.469; 5.486.335; 5.755.942; 5.681.484; und 5.603.351.
  • Es besteht demnach Bedarf an einem Mikrofluidik-Biosensor, der sowohl klein ist als auch eine hohe Dichte aufweist und mit hoher Durchlaufleistung eingesetzt werden kann.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Den oben formulierten Zielen gemäß stellt die vorliegende Erfindung Mikrofluidikvorrichtungen zum Nachweis eines Zielanalyten in einer Probe bereit. Die Vorrichtungen umfassen einen festen Träger, der eine beliebige Anzahl von Modulen umfasst, einschließlich einer Probeneinlassöffnung und zumindest einer Probenbehandlungsvertiefung, die zumindest eine Vertiefungseingangsöffnung und eine Vertiefungsausgangsöffnung umfasst. Die Vorrichtung umfasst im Allgemeinen weiters einen ersten Mikrokanal, um Fluidkontakt zwischen der Probeneinlassöffnung und der Probenbehandlungsvertiefung zu ermöglichen. Die Vorrichtung umfasst zudem ein Detektionsmodul, umfassend ein Substrat mit einer diskrete Stellen umfassenden Oberfläche, und eine Population von Mikrokügelchen, die zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst, worin jede Subpopulation ein bioaktives Mittel umfasst. Die Mikrokügelchen sind auf der Oberfläche verteilt. Das Detektionsmodul umfasst zu dem einen zweiten Mikrokanal, um Fluidkontakt zwischen der Probenbehandlungsvertiefung und der Detektionseinlassöffnung zu ermöglichen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine graphische Darstellung der verbesserten Signalintensität unter Vibration des Chips während der Hybridisierung.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung stellt Mikrofluidikkassetten oder -vorrichtungen bereit, die zur Durchführung einer Vielzahl an Manipulationen an einer Probe verwendet werden können, um im Nachweis oder Quantifizierung eines Zielanalyten zu resultieren. Diese Manipulationen können die Behandlung von Zellen (Zellkonzentration, Zelllyse, Zellentfernung, Zelltrennung usw.), das Abtrennen des gewünschten Zielanalyten von den anderen Komponenten der Probe, chemische oder enzymatische Reaktionen am Zielanalyten, den Nachweis des Zielanalyten usw. umfassen. Die Vorrichtungen der Erfindung können Folgendes umfassen: eine oder mehrere Vertiefungen zur Manipulation der Probe, Abfall oder Reagenzien; Mikrokanäle zu und zwischen diesen Vertiefungen, einschließlich Mikrokanälen, die elektrophoretische Trennmatrizen umfassen; Ventile zur Steuerung der Fluidbewegung; Pumpen auf dem Chip, wie beispielsweise elektroosmotische, elektrohydrodynamische oder elektrokinetische Pumpen; sowie Detektionssystem umfassend Perlenanordnungen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird. Die Vorrichtungen der Erfindung können konstruiert werden, um eine oder mehrere Proben oder Analyten zu manipulieren.
  • Die Mikrofluidikvorrichtungen der Erfindung werden zum Nachweis von Zielanalyten in Proben eingesetzt. Unter "Zielanalyt" oder "Analyt" oder gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin ein jedes Molekül, Verbindung oder Teilchen gemeint, das nachgewiesen werden soll. Wie nachstehen dargelegt wird, binden Zielanalyten vorzugsweise an Bindungsliganden, so wie zuvor bereits ausführlicher beschrieben wurde. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich ist, kann eine Vielzahl an Analyten unter Verwendung der vorliegenden Verfahren nachgewiesen werden; praktisch kann jeder Zielanalyt, für den es einen hierin beschriebenen Bindungsliganden gibt, unter Verwendung der Verfahren der Erfindung nachgewiesen werden.
  • Geeignete Analyten umfassen organische Moleküle, einschließlich Biomoleküle. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Analyt gegebenenfalls ein Umweltschmutzstoff (einschließlich Pestiziden, Insektiziden, Toxinen usw.); eine Chemikalie (einschließlich Lösungsmitteln, Polymeren, organischer Materialien usw.); therapeutische Moleküle (einschließlich therapeutisch oder missbräuchlich verwendeter Arzneimittel oder Drogen, Antibiotika usw.); Biomoleküle (einschließlich Hormonen, Cytokinen, Proteinen, Lipiden, Kohlenhydraten, Zellmembranantigenen und Rezeptoren (neuronale und hormonelle Rezeptoren, Nährstoff- und Zelloberflächenrezeptoren) oder deren Liganden usw.); ganze Zellen (einschließlich prokaryotische (wie beispielsweise pathogene Bakterien) und eukaryotische Zellen, einschließlich Tumorzellen von Säugern); Viren (einschließlich Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, Lentiviren usw.); und Sporen usw. Besonders bevorzugte Analyten sind Umweltschmutzstoffe; Nucleinsäuren, Proteine (einschließlich Enzymen, Antikörpern, Antigenen, Wachstumsfaktoren, Cytokinen usw.); therapeutische oder missbräuchlich verwendete Arzneimittel; Zellen; und Viren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure. Unter "Nucleinsäure" oder "Oligonucleotide" oder gleichwertigen Bezeichnungen sind hierin zumindest zwei kovalent aneinander gebundene Nucleotide zu verstehen. Eine Nucleinsäure der vorliegenden Erfindung enthält im Allgemeinen Phosphordiesterbindungen, obwohl in einigen Fällen, wie in Folge dargelegt wird, Nucleinsäureanaloga mit gegebenenfalls alternierendem Rückgrat eingeschlossen sind, die beispielsweise Phosphoramide (Beaucage et al., "Tetrahedron", 49(10):1925 (1993) und darin enthaltene Verweise; Letsinger, "J. Org. Chem.", 35:3800 (1970); Sprinzl et al., "Eur. J. Biochem.", 81:579 (1977); Letsinger et al., "Nucl. Acids Res.", 14:3487 (1986); Sawai et al., "Chem. Lett.", 805 (1984); Letsinger et al., "J. Am. Chem. Soc.", 110:4470 (1988); und Pauwels et al., "Chemica Scripta", 26:141 (1986)), Thiophosphat (Mag et al., "Nucleic Acids Res.", 19:1437 (1991); und das U.S.-Patent Nr. 5.644.048), Di thiophosphoat (Briu et al., "J. Am. Chem. Soc.", 111:2321 (1989)), O-Methylphosphoramidit-Bindungen (vgl. Eckstein, "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", Oxford University Press) und Peptidnucleinsäurerückgrate und -bindungen (vgl. Egholm, "J. Am. Chem. Soc.", 114:1895 (1992); Meier et al., "Chem. Int. Ed. Engl.", 31:1008 (1992); Nielsen, "Nature", 365:566 (1993); Carlsson et al., "Nature", 380:207 (1996)) umfassen. Andere analoge Nucleinsäuren umfassen jene mit positivem Rückgrat (Denpcy et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 92:6097 (1995); mit nichtionischem Rückgrat (U.S.-Patente Nr. 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 und 4.469.863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English", 30:423 (1991); Letsinger et al., "J. Am. Chem. Soc.", 110:4470 (1988); Letsinger et al., "Nucleoside & Nucleotide", 13:1597 (19941; Kapitel 2 und 3 der ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Shanghui und P. Dan Cook; Mesmaeker et al., "Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.", 4:395 (1994); Jeffs et al., "J.Biomolecular NMR", 34:17 (1994); "Tetrahedron Lett.", 37:743 (1996)) und mit Nicht-Ribose-Rückgrat, einschließlich der in den U.S.-Patenten Nr. 5.235.033 und 5.034.506 und in Kapitel 6 und 7 der ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Hrsg. Y. S. Shanghui und P. Dan Cook, beschriebenen. Nucleinsäuren, die einen oder mehrere carbozyklische Zucker umfassen, sind ebenfalls in der Definition von Nucleinsäuren enthalten (vgl. Jenkins et al., "Chem. Soc. Rev.", pp. 169–76 (1995)). Verschiedene Nucleinsäureanaloga sind in Rawls, "C&E News", Seite 35, 2. Juni 1997, beschrieben. Diese Modifikationen des Ribose-Phosphat-Rückgrats können durchgeführt werden, um das Zusetzen von Markern zu vereinfachen und um die Stabilität und die Halbwertszeit derartiger Moleküle in physiologischen Umgebungen zu erhöhen.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, findet gegebenenfalls jedes dieser Nucleinsäureanaloga gegebenenfalls Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Zudem können Gemische aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und -analoga hergestellt werden. Alternativ dazu können gegebenenfalls Gemische verschiedener Nucleinsäureanaloga und Gemische aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren und -analoga hergestellt werden.
  • Besonders bevorzugt sind Peptid-Nucleinsäuren (PNA), die Peptid-Nucleinsäureanaloga umfassen. Diese Rückgrate sind unter neutralen Bedingungen im Wesentlichen nichtionisch, im Gegensatz zum stark geladenen Phosphordiester-Rückgrat von natürlich auftretenden Nucleinsäuren. Daraus ergeben sich zwei Vorteile. Erstens weist das PNA-Rückgrat eine verbesserte Hybridisationskinetik auf. Bei PNAs ändert sich der Schmelzpunkt (Tm) von fehlgepaarten Basenpaaren im Vergleich zu korrekt gepaarten Basenpaaren stärker. DNA und RNA weisen bei einer internen Fehlpaarung einen Abfall des Fp. von 2–4 °C auf, während beim nichtionischen PNA-Rückgrat der Abfall eher 7–9 °C entspricht. Dies ermöglicht einen besseren Nachweis von Fehlpaarungen. Auf ähnliche Weise ist aufgrund ihrer nichtionischen Natur die Hybridisierung der an diesem Rückgrat gebundenen Basen relativ unempfindlich was die Salzkonzentration betrifft.
  • Die Nucleinsäuren können einsträngig oder doppelsträngig sein, wie spezifiziert wird, oder Abschnitte sowohl einer einsträngigen als auch einer doppelsträngigen Sequenz enthalten. Die Nucleinsäure kann eine DNA, sowohl genomische als auch cDNA, RNA oder ein Hybrid sein, worin die Nucleinsäure eine beliebige Kombination aus Desoxyribo- und Ribonucleotiden und eine beliebige Kombination aus Basen, einschließlich Uracil, Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin, Inosin, Xathanin, Hypoxathanin, Isocytosin, Isoguanin usw., enthält. So wie hierin verwendet umfasst die Bezeichnung "Nucleosid" umfasst Nucleotide und Nucleoside und Nucleotidnalaoga sowie modifizierte Nucleoside, wie beispielsweise aminomodifizierte Nucleoside. Zusätzlich umfasst "Nucleosid" nicht natürlich auftretende Analogstrukturen. So werden beispielsweise die einzelnen Einheiten einer Peptid-Nucleinsäure, die jede eine Base enthalten, hierin als ein Nucleosid bezeichnet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis von Zielnucleinsäuren bereit. Mit "Zielnucleinsäure" oder "Zielsequenz" und gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin eine Nucleinsäuresequenz oder ein einzelner Strang einer Nucleinsäure gemeint. Die Zielsequenz ist gegebenenfalls ein Abschnitt eines Gens, eine Regulationssequenz, genomische DNA, cDNA, RNA, einschließlich mRNA und rRNA, und Andere. Sie kann eine beliebige Länge aufweisen, wobei es sich versteht, dass längere Sequenzen spezifischer sind. In einigen Ausführungsformen ist es gegebenenfalls wünschenswert, die Nucleinsäureprobe zu fragmentieren oder zu in Fragmente mit 20 bis 10.000 Basenpaaren aufzuspalten, wobei etwa 500 Basenpaare in einigen Ausführungsformen bevorzugt sind. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, kann die komplementäre Zielsequenz zahlreiche Formen annehmen. Beispielsweise kann sie in einer größeren Nucleinsäuresequenz enthalten sein, d.h. unter anderem in einem Gen oder mRNA als Ganzes oder einem Teil davon, einem Restriktionsfragment eines Plasmids oder genomischer DNA.
  • Wie in Folge noch detaillierter dargelegt wird werden Sonden (einschließlich Primer) eingesetzt, um an Zielsequenzen zu hybridisieren, um die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenz in einer Probe zu bestimmen. Im Allgemeinen ist dieser Begriff für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung verständlich.
  • Die Zielsequenz kann gegebenenfalls auch aus verschiedenen Zieldomänen bestehen, beispielsweise kann bei Tests vom "Sandwich"-Typ, so wie nachstehend beschrieben, eine erste Probenzielsequenz an einer Fängersonde oder einer Fänger-Extendersonde hybridisieren und eine zweite Probenzielsequenz an einem Abschnitt einer Amplifikatorsonde, einer Markersonde oder einer anderen Fängersonde oder Fänger-Extendersonde usw. hybridisieren. Zudem können die Zieldomänen benachbart (d.h. zusammenhängend) oder voneinander getrennt sein. Werden beispielsweise Ligationsverfahren eingesetzt, so hybridisiert gegebenenfalls ein erster Primer an eine erste Zieldomäne, und ein zweiter Primer hybridisiert gegebenenfalls an eine zweite Zieldomäne; entweder sind die Domänen benachbart, oder sie sind gegebenenfalls durch ein oder mehrere Nucleotide getrennt, gekoppelt mit der Verwendung einer Polymerase und dNTPs, so wie in Folge detaillierter beschrieben.
  • Die Begriffe "erste" und "zweite" sollen nicht eine Ausrichtung der Sequenzen mit Bezug auf die 5'-3'-Ausrichtung der Zielsequenz vermitteln. Wird beispielsweise von einer 5'-3'-Ausrichtung der komplementären Zielsequenz ausgegangen, so kann die erste Zieldomäne entweder 5' zur zweiten Domäne oder 3' zur zweiten Domäne angeordnet sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt ein Protein. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich ist, gibt es eine große Anzahl an möglichen proteinhältigen Zielanalyten, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden können. Unter "Proteine" oder gleichwertigen Bezeichnungen sind hierin Proteine, Oligopeptide und Peptide, Derivate und Analoga, einschließlich Proteine, die nichtnatürlich vorkommende Aminosäuren und Aminosäureanaloga enthalten, und peptidomimetische Strukturen zu verstehen. Die Seitenketten können entweder in (R)- oder in (S)-Konfiguration vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die Aminosäuren in (S)- oder L-Konfiguration vor. Wie nachstehend erörtert wird kann es, wenn das Protein als bindender Ligand eingesetzt wird, wünschenswert sein, Proteinanaloga zu verwenden, um die Zersetzung durch Probenverunreinigungen zu verzögern.
  • Geeignete Zielanalyten umfassen Kohlenhydrate, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Marker für Brustkrebs (CA 15-3, CA 549, CA 27.29), Mucin-ähnliches tumorassoziiertes Antigen (MCA), Ovarialkrebs (CA 125), Pankreaskrebs (DE-PAN-2) und Kolorektal- und Pankreaskrebs (CA 19, CA 50, CA 242).
  • Diese Zielanalyten können in jeder beliebigen Anzahl an unterschiedlichen Probentypen gegenwärtig sein, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Blut, Lymphe, Speichel, Vaginal- und Analsekrete, Urin, Stuhl, Schweiß und Tränen, sowie in festen Geweben, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Leber, Milz, Knochenmark, Lunge, Muskel, Gehirn usw.
  • Demgemäß stellt die Erfindung Mikrofluidikvorrichtungen zum Nachweis von Zielanalyten bereit, die ein festes Substrat umfassen. Wie in Folge dargelegt wird kann das Substrat, das die Mikrofluidikvorrichtung bildet, (im Allgemeinen hierin als "Vorrichtungssubstrat" bezeichnet) gleich wie das Substrat der Detektionsanordnung (im Allgemeinen hierin als "Anordnungssubstrat" bezeichnet, nachstehend definiert) oder anders sein. Das feste Substrat kann aus zahlreichen verschiedenen Materialien hergestellt und auf verschiedenste Weisen konstruiert sein, so wie hierin erörtert wird und wie für Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich ist. Außerdem kann eine einzige Vorrichtung mehr als ein Substrat umfassen; beispielsweise kann eine "Probenbehandlungs"-Kassette vorliegen, die mit einer getrennten "Detektions"-Kassette verbunden ist; eine unbehandelte Probe wird der Probenbehandlungskassette zugeführt und manipuliert, um die Probe für die Detektion vorzubereiten, die dann von der Probenbehandlungskassette entfernt und der Detektionskassette zugeführt wird. Es kann gegebenenfalls eine weitere funktionelle Kassette vorliegen, in die die Vorrichtung hineinpasst; beispielsweise ein Heizelement, das in Kontakt mit der Probenkassette angeordnet ist, um Reaktionen, wie beispielsweise PCR, durchzuführen. In einigen Fällen ist ein Abschnitt des Substrats gegebenenfalls abnehmbar; beispielsweise kann die Probenkassette gegebenenfalls über eine abnehmbare Detektionskassette verfügen, sodass die gesamte Probenkassette nicht in Kontakt mit dem Detektionsgerät steht. Vgl. beispielsweise das U.S.-Patent Nr. 5.603.351 und WO 97/16561.
  • Die Zusammensetzung des Vorrichtungssubstrats hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich des zur Bildung der Vorrichtung verwendeten Verfahrens, der Verwendung der Vorrichtung, der Zusammensetzung der Probe, dem nachzuweisenden Analyten, der Größe der Vertiefungen und der Mikrokanäle, der Gegenwart oder der Abwesenheit von elektronischen Komponenten usw. Im Allgemeinen sollten die Vorrichtungen der Erfindung einfach sterilisierbar sein, einen niedrigen Fluoreszenzgrad aufweisen, nicht spezifisch binden, biokompatibel und gegenüber Temperaturänderungen beständig sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann das feste Mikrofluidik-Substrat aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Silicium, wie beispielsweise Siliciumwafer, Siliciumdioxid, Siliciumnitrid, Glas und Quarzglas, Galliumarsenid, Indiumphosphid, Aluminium, Keramik, Polyimid, Quarz, Kunststoffe, Harze und Polymere, einschließlich Polymethylmethacrylat, Acrylate, Polyethylen, Polyethylentherephthalat, Polycarbonat, Polystyrol und andere Styrol-Copolymere, Polypropylen, Polytetrafluorethylen, Superlegierungen, Zirkaloy, Stahl, Gold, Silber, Kupfer, Wolfram, Molybdän, Tantal, Kovar, Kevlar, Kapton, Mylar, Messing, Saphir usw. Hochwertiges Glas, wie beispielsweise hochschmelzendes Borosilicat oder Ouarzglase sind gegebenenfalls aufgrund ihrer UV-Durchlässigkeitseigenschaften bevorzugt, wenn bei irgendeinem Schritt der Probenmanipulation Technologien auf Lichtbasis eingesetzt werden. Zudem sind, so wie hierin dargelegt, gegebenenfalls Abschnitte der inneren Oberfläche der Vorrichtung mit einer Vielzahl an Beschichtungen je nach Bedarf beschichtet, um die nichtspezifische Bindung zu reduzieren, um die Bindung der Bindungsliganden zu ermöglichen usw.
  • Die Vorrichtungen der Erfindung können auf verschiedene Arten hergestellt werden, wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist. Vgl. beispielsweise WO 96/39260, die sich mit der Herstellung von fluiddichten elektrischen Isolierrohren beschäftigt; U.S.-Patent Nr. 5.747.169, das sich mit Dichtungen beschäftigt; und EP 0.637.996 B1; EP 0.367.998 B1; WO 96/39260; WO97/16835; WO 98/13683; WO 97/16561; WO 97/43629; WO 96/39252; WO 96/15576; WO 96/15450; WO 97/37755; und WO 97/27324; und die U.S.-Patente Nr. 5.304.487; 5.071.531; 5.061.336; 5.747.169; 5.296.375; 5.110.745; 5.587.128; 5.498.392; 5.643.738; 5.750.015; 5.726.026; 5.35.358; 5.126.022; 5.770.029; 5.631.337; 5.569.364; 5.135.627; 5.632.876; 5.593.838; 5.585.069; 5.637.469; 5.486.335; 5.755.942; 5.681.484; und 5.603.351. Geeignete Herstellungsverfahren hängen erneut auch hier von der Wahl des Substrats ab, jedoch schließen bevorzugte Verfahren eine Vielzahl von Mikro-Materialbearbeitungs- und Mikroherstellungsverfahren, unter anderem Filmauftragsverfahren, wie beispielsweise Schleuderbeschichtung, chemischer Dampfauftrag, Laserherstellung, Photolithographie und andere Ätzverfahren unter Einsatz chemischer Nassverfahren oder Plasmaverfahren, Stanzen, Spritzgussverfahren und Klebeverfahren (vgl. U.S.-Patent Nr. 5.747.169) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zudem gibt es Druckverfahren zur Bildung von Fluidführungswegen; das bedeutet, dass Strukturen des bedruckten Materials einen gerichteten Fluidtransport ermöglichen können. Die Erhöhungen der "Tinte" können somit dazu dienen, einen Strömungskanal zu definieren. Zudem ermöglicht gegebenenfalls die Verwendung von unterschiedlichen "Tinten" und "Pasten", verschiedenen Ab schnitten des Weges verschiedene Strömungseigenschaften zu verleihen. So können beispielsweise Materialien eingesetzt werden, um die gelöster Stoff/Lösungsmittel-RF-Werte zu verändern (das Verhältnis der von einem bestimmten gelösten Stoff zurückgelegten zu der von einer Lösungsmittelfront zurückgelegten Distanz). Beispielsweise können gedruckte Fluidführungswege mit einer aufgedruckten Schicht oder Schichten, bestehend aus zwei verschiedenen Materialien, die unterschiedliche Transportraten bereitstellen, hergestellt werden. Multimaterial-Fluidführungswege können verwendet werden, wenn eine Modifikation der Verweilzeit der Reagenzien in den Fluidführungswegen wünschenswert ist. Weiters können aufgedruckte Fluidführungswege Bereiche bereitstellen, die Reagenssubstanzen enthalten, indem das Reagens in der "Tinte" enthalten ist oder durch eine darauf folgenden Druckschritt darin eingeschlossen wird. Vgl. beispielsweise das U.S.-Patent Nr. 5.795.453.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das feste Substrat so konstruiert, dass eine einzelne Probe, die mehrere Zielanalyten enthält, behandelt werden kann. Das bedeutet, dass eine einzelne Probe der Vorrichtung zugeführt wird und die Probe entweder für eine parallel laufende Bearbeitung zum Nachweis der Analyten aliquot geteilt werden kann, oder die Probe wird gegebenenfalls nacheinander bearbeitet, wobei die einzelnen Zielanalyten seriell nachgewiesen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das feste Substrat so konstruiert, dass multiple Proben, von denen jede einen oder mehrere Zielanalyten enthält, behandelt werden können. Im Allgemeinen wird in dieser Ausführungsform jede Probe einzeln behandelt, das heißt, dass die Manipulationen und Analysen parallel ausgeführt werden, wobei es vorzugsweise zu keinem Kontakt oder Kontamination zwischen diesen kommt. Alternativ dazu können gegebenenfalls einige Schritte gemeinsam ausgeführt werden; beispielsweise kann es wünschenswert sein, verschiedene Proben getrennt zu bearbeiten, aber alle Zielanalyten in einer einzigen Detektionsanordnung, wie nachstehend beschrieben, nachzuweisen.
  • Zudem sollte es sich verstehen, dass, auch wenn der Hauptteil der Diskussion hierin auf die Verwendung planarer Substrate mit Mikrokanälen und Vertiefungen abzielt, auch andere geometrische Formen herangezogen werden können. Beispielsweise können zwei oder mehrere planare Substrate aufeinander gestapelt werden, um eine dreidimensionale Vorrichtung zu bilden, die Mikrokanäle enthalten kann, die sich in einer Ebene oder zwischen Ebenen ausdehnen; auf ähnliche Weise können sich Vertiefungen über zwei oder mehrere Ebenen erstrecken, um die Behandlung gößerer Probenvolumen zu ermöglichen. So können beispielsweise beide Seiten des Substrats zur Ausbildung von Mikrokanälen geätzt werden; vgl. beispielsweise die U.S.-Patente Nr. 5.603.351 und Nr. 5.681.484.
  • Somit umfassen die Vorrichtungen der Erfindung zumindest einen Mikrokanal oder Strömungskanal, der den Fluß der Probe von der Probeneinlassöffnung zu den anderen Komponenten oder Modulen des Systems zulässt. Die Gesamtheit der Mikrokanäle und Vertiefungen wird im Fach manchmal als "mesoskaliges Strömungssystem" bezeichnet. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich ist, können die Strömungskanäle in Abhängigkeit vom Verwendungszweck des Kanals auf verschiedenste Weise konzipiert werden. Beispielsweise kann sich ein einzelner, an der Probeneinlassöffnung beginnender Strömungskanal in eine Vielzahl kleinerer Kanäle teilen, sodass sie ursprüngliche Probe in diskrete Subproben zur parallelen Bearbeitung oder Analyse aufgeteilt wird. Alternativ dazu können mehrere Strömungskanäle von verschiedenen Modulen, beispielsweise der Probeneinlassöffnung und einem Probenspeichermodul gemeinsam in eine Mischkammer oder Reaktionskammer münden. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich ist, gibt eine breite Palette an möglichen Konstruktionsweisen; wichtig ist hierbei, dass die Strömungskanäle eine Bewegung der Probe und der Reagenzien von einem Bereich der Vorrichtung zu einem anderen zulassen. Beispielsweise kann die Weglänge der Strömungskanäle nach Bedarf geändert werden; sind ein Mischen zeitliche abgestimmte Reaktionen notwendig, können beispielsweise längere und manchmal gewundene Strömungskanäle eingesetzt werden; ähnlich sind zum Zweck der Trennung gegebenenfalls größere Längen wünschenswert. Alternativ dazu kann gegebenenfalls die Größe eines Kanals zur Verringerung oder zur Erhöhung der Durchflussrate der Probe geändert werden. So kann beispielsweise die Größe eines Kanals zur Reduktion der Probendurchflussrate gesteigert werden.
  • Im Allgemeinen werden die Mikrofluidikvorrichtungen der Erfindung als "mesoskalige" Vorrichtungen bezeichnet. Die Vorrichtungen hierin sind typischerweise in einem zur Analyse von Mikrovolumen geeigneten Maßstab konzipiert, obwohl in einigen Ausführungsformen große Proben (z.B. cm3 an Proben) gegebenenfalls in der Vorrichtung auf kleine Volumen für die folgende Analyse reduziert werden. Das bedeutet, dass "mesoskalig" sich hierin auf die Kammern und Mikrokanäle bezieht, die Querschnittsmaße in einer Größenordnung von 0,1 μm bis 500 μm aufweisen. Die mesoskaligen Strömungskanäle und Vertiefungen weisen eine bevorzugte Tiefe im Bereich von 0,1 μm bis 100 μm auf, typischerweise 2–50 μm. Die Kanäle weisen ein bevorzugte Breite von 2,0 bis 500 μm, noch bevorzugter 3–100 μm, auf. Für viele Anwendungen sind Kanäle von 5 bis 50 μm nützlich. Jedoch können für zahlreiche Anwendungen auch größere Maße im Millimeterbereich eingesetzt werden. Auf ähnliche Weise haben auch die Kammern (manchmal hierin auch als Vertiefungen bezeichnet) im Substrat größere Maße im Bereich von einigen Millimetern.
  • Zusätzlich zum Strömungskanalsystem sind die Vorrichtungen der Erfindung so konstruiert, dass sie eine oder mehrere aus einer Vielzahl an Komponenten, hierin als "Module" bezeichnet", umfassen, die abhängig vom Verwendungszweck in jeder beliebigen Vorrichtung zugegen sein können. Diese Module schließen die Folgenden ein, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt: Probeneinlassöffnungen; Probeneinführungs- oder Sammelmodule; Zellbehandlungsmodule (beispielsweise zur Zelllyse, Zellentfernung, Zellkonzentration, zur Zelltrennung oder zum Einfangen von Zellen, zur Zellfusion, Zeltwachstum usw.); Trennmodule (beispielsweise für Elektrophorese, Gelfiltration, Ablagerung usw.); Reaktionsmodule zur chemischen oder biologischen Veränderung der Probe, einschließlich Amplifikation des Zielanalyten (beispielsweise sind Amplifikationsverfahren nützlich, wenn es sich beim Zielanalyten um eine Nucleinsäure handelt, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strand-Displacement-Amplifikation (SDA), Nucleinsäuresequenz-basierter Amplifikation (NASBA), chemischer, physikalischer oder enzymatischer Spaltung oder Veränderung des Zielanalyten oder chemi scher Veränderung des Ziels; Fluidpumpen; Fluidventilen; Heizmodulen; Speichermodulen für Testreagenzien; Mischkammern; und Detektionsmodulen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung zumindest eine Probeneinlassöffnung zur Einführung einer Probe in die Vorrichtung. Diese kann Teil eines Probeneinführungs- oder Sammelmoduls sein oder auch getrennt von diesem bestehen; das heißt, die Probe kann direkt von der Probeneinlassöffnung in eine Trennkammer eingespeist werden, oder sie wird in einer Probensammelvertiefung oder -kammer vorbehandelt.
  • Unter Öffnung bzw. Stutzen ist ein Eingangs- oder Austrittspunkt, beispielsweise eines Kanals oder einer Vertiefung, zu verstehen, die den Fluss der Probe regelt. In einer Ausführungsform ist der Stutzen verschließbar, sodass sie eine Abdichtung bildet, die das Ausfließen der Probe aus einem abgedichteten Reservoir verhindert. Die Öffnung kann eine physische Strömungsbarriere, wie beispielsweise ein Stöpsel oder eine Membran, sein. Alternativ dazu wird die Öffnung/der Stutzen oder die Barriere durch Strömungsdruck, elektrischen Strom und dergleichen geregelt.
  • Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar ist, muss an jedem Eingangs- oder Austrittspunkt zwischen den verschiedenen Vertiefungen und Kanälen ein Stutzen sein. Es können jedoch, falls dies notwendig ist, jeder Eingangs- oder Austrittspunkt einen Stutzen umfassen. In einer Ausführungsform, beispielsweise, umfasst eine Probenbehandlungsvertiefung einen Vertiefungseinlassstutzen und gegebenenfalls auch eine Vertiefungsauslassstutzen. Auf ähnliche Weise umfasst ein Detektionsmodul einen Einlassstutzen und einen Auslassstutzen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung ein Probensammelmodul, das zur Konzentration oder Anreicherung der Probe, falls dies nötig ist, eingesetzt werden kann; vgl. beispielsweise das U.S.-Patent Nr. 5.770.029, einschließlich der Diskussion bezüglich Anreicherungskanäle und Anreicherungsmittel.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung ein Zellbehandlungsmodul. Dies ist dann von besonderer Bedeutung, wenn die Probe Zellen umfasst, die entweder den Zielanalyten enthalten oder die zum Nachweis des Zielanalyten entfernt werden müssen. So kann beispielsweise der Nachweis bestimmter Antikörper im Blut der Entfernung der Blutkörperchen bedürfen, um eine effiziente Analyse zu gewährleisten, oder die Zellen müssen vor dem Nachweis lysiert werden. In diesem Kontext beinhaltet der Begriff "Zellen" Virionen, die gegebenenfalls einer Behandlung vor der Analyse bedürfen, wie beispielsweise die Freisetzung der im Virion enthaltenen Nucleinsäure vor dem Nachweis der Zielsequenzen. Zudem können Zellbehandlungsmodule Folgemodule zum Nachwesi der Gegenwart oder Abwesenheit von Zellen einsetzen. Geeignete Zellbehandlungsmodule schließen Zelllysemodule, Zellentfernungsmodule und Module zur Zelltrennung oder zum Einfangen von Zellen ein, sind jedoch nicht auf diese eingeschränkt. Weiters steht, was für alle Module der Erfindung gilt, das Zellbehandlungsmodul über einen Strömungskanal in Fluidkommunikation mit zumindest einem anderen Modul der Erfindung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellbehandlungsmodul ein Zelllysemodul. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist können Zellen abhängig vom Zelltyp auf verschiedene Weisen lysiert werden. In einer Ausführungsform, die im EP 0.637.998 B1 und im U.S.-Patent Nr. 5.63.5.358 beschrieben werden, umfasst das Zelllysemodul gegebenenfalls Zellmembranen perforierende Vorsprünge, die sich von einer Oberfläche des Zellbehandlungsmodul aus erstrecken. Wird ein Fluid durch die Vorrichtung gezwängt, so werden die Zellen aufgebrochen. Auf ähnliche Weise kann mit scharfkantigen Teilchen, die sich im Zellbehandlungsbereich befinden, erzielt werden. Alternativ dazu kann das Zelllysemodul einen Bereich mit eingeschränkten Querschnittsmaßen umfassen, was zur Lyse der Zellen durch Druck führt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zelllysemodul ein Zelllysemittel, wie beispielsweise Detergenzien, NaOH, Enzyme, Proteinase K, Guanidinium-HCl usw. In einigen Ausführungsformen, bei Blutkörperchen, kann die Verdünnung der Probe mit Wasser oder einem Puffer zu einer hypotonischen Lyse führen. Das Lysemittel kann in gelöster Form innerhalb des Zelllysemoduls oder in einem Speichermodul, von wo aus es in das Lysemodul gepumpt wird, vorliegen. Alternativ dazu kann das Lysemittel in fester Form vorliegen, die bei der Einführung der Probe in Lösung aufgenommen wird. Ein bestimmte Temperatur kann, genauso wie ein Mischschritt, angewandt werden.
  • Das Zelllysemodul kann zudem, entweder im Inneren oder außerhalb, ein Filtermodul zur bedarfsgerechten Entfernung von Zellbruchstücken umfassen. Dieses Filter kann durch ein Mikroherstellungsverfahren zwischen dem Zelllysemodul und dem folgenden Modul gebildet werden, um die Entfernung der lysierten Zellmembranen und anderer Zellbruchstücke zu ermöglichen; Beispiele für geeignete Filter sind im EP 0.637.998 B1 aufgeführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellbehandlungsmodul ein Zelltrennmodul oder Zelleinfangmodul. Diese Ausführungsform verwendet einen Zelleinfangbereich, umfassend Bindungsstellen, die zur reversiblen Bindung eines Zelloberflächenmoleküls fähig sind, um die selektive Isolierung (oder Entfernung) eines bestimmten Zelltyps aus der Probenpopulation ermöglicht. Diese Bindungsgruppierungen können entweder auf der Oberfläche des Moduls oder auf einem im Inneren des Moduls befindlichen Teilchens (d.h. einer Perle) durch physikalische Absorption oder kovalente Bindung immobilisiert sein. Geeignete Bindungsgruppierungen hängen vom zu isolierenden oder zu entfernenden Zelltyp ab und umfassen im Allgemeinen Antikörper und andere Bindungsliganden, wie beispielsweise Liganden für Zelloberflächenrezeptoren usw. Somit kann ein bestimmter Zelltyp aus der Probe vor einer weiteren Behandlung dieser entfernt werden, oder der Testvorgang ist so konzipiert, dass der gewünschte Zelltyp spezifisch gebunden und die nichterwünschten Zelltypen weggespült werden, gefolgt von einer Freisetzung der gebundenen Zellen durch Zusatz von Reagenzien oder Lösungsmitteln, durch physikalisches Entfernen (d.h. höhere Durchflussrate oder Druck) oder durch In-situ-Lyse.
  • Alternativ dazu kann ein Zell-"Sieb" zur Trennung der Zellen auf der Grundlage ihrer Größe eingesetzt werden. Dies kann auf verschiedene Weisen erfolgen, einschließlich Vorsprüngen auf der Oberfläche die einen Ausschluß von Größen zulassen, einer Reihe von sich verengenden Kanälen oder einer Einrichtung vom Diafiltrationstyp.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellbehandlungsmodul ein Zellentfernungsmodul. Dieses kann dann eingesetzt werden, wenn eine Probe Zellen enthält, die im Test nicht benötigt werden. Im Allgemeinen wird die Zellentfernung wie bei den obigen "Sieben" auf der Grundlage des Ausschlusses von Größen mithilfe von aus dem Zellbehandlungsmodul herausführenden Kanälen, die für die Zellen zu klein sind, vollzogen; Filtration und Zentrifugation können ebenfalls durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Zellbehandlungsmodul ein Zellkonzentrationsmodul. Wie für Fachleute auf dem Gebiet klar ersichtlich ist, wird dies durch "Sieb"-Verfahren erreicht, beispielsweise um die Zellen aus einem großen Probenfluidvolumen vor der Lyse zu konzentrieren; oder durch Zentrifugation.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung ein Trennmodul. Trennen bedeutet in diesem Kontext die Abtrennung von zumindest einer Komponente der Probe von den anderen Komponenten der Probe. Dies kann, je nach Test, die Trennung oder Isolierung des Zielanalyten oder die Entfernung von Verunreinigungen, die die Analyse des Zielanalyten beeinträchtigen, umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trennmodul Trennmedien vom Chromatographie-Typ, wie beispielsweise absorptionsfähige Phasenmaterialien, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Umkehrphasenmaterialien (C8- oder C16-beschichtete Teilchen usw.), Ionentauschermaterialien, Affinitätschromatographie-Materialien, wie beispielsweise Bindungsliganden usw. Vgl. U.S.-Patent Nr. 5.770.029.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform setzt das Trennmodul Bindungsliganden ein, so im Allgemeinen hierin für die Zelltrennung oder Analytendetektion dargelegt. In dieser Ausführungsform werden Bindungsliganden (erneut durch die nachstehend beschriebene physikalische Absorption oder kovalente Bindung) im Trennmodul (erneut entweder an der inneren Oberfläche des Moduls, auf einem Teilchen, wie beispielsweise einer Perle, einer Faser oder einer Kapillare, das im Modul beispielsweise durch die Verwendung einer Fritte festgehalten ist) immobilisiert. Geeignete Bindungsgruppierungen hängen von der zu isolierenden oder zu entfernenden Probenkomponente ab. Unter "Bindungsligand" oder gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin eine Verbindung zu verstehen, die zum Binden einer Komponente der Probe, entweder eines Schmutzstoffs (zur Entfernung) oder des Zielanalyten (zur Anreicherung), eingesetzt wird. In einigen Ausführungsformen wird der Bindungsligand zum Sondieren der Gegenwart des Zielanalyten eingesetzt, der an den Zielanalyten bindet.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, hängt die Zusammensetzung des Bindungsliganden von der zu abzutrennenden Probenkomponente ab. Bindungsliganden für eine Vielzahl von Analyten sind bekannt oder können unter Verwendung bekannter Verfahren leicht ausgemacht werden. Ist beispielsweise die Komponente ein Protein, so umfassen die Bindungsliganden Proteine (insbesondere Antikörper oder Fragmente davon (FAbs usw.)) oder kleine Moleküle. Ist die Probenkomponente ein Metallion, so umfassen die Bindungsliganden im Allgemeinen die üblichen Ionenliganden oder Chelatbildner. Bevorzugte Bindungsliganden sind unter anderem Peptide. Ist die Komponente beispielsweise ein Enzym, so schließen geeignete Bindungsliganden Substrate und Hemmstoffe ein. Antigen-Antikörper-Paare, Rezeptorliganden sowie Kohlenhydrate und deren Bindungspartner sind ebenfalls geeignete Komponenten-Bindungsliganden-Paare. Der Bindungsligand ist gegebenenfalls eine Nucleinsäure, für den Fall, dass Nucleinsäure-bindende Proteine die Ziele sind; alternativ dazu können, so wie allgemein in den U.S.-Patenten Nr. 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337 und verwandten Patenten beschrieben, auch Nucleinsäure-"Aptamere" zur Bindung von praktische jedem Zielanalyten gebildet werden können. Analog dazu gibt es einen umfangreichen Literaturbestand zum Thema der Entwicklung von Bindungspartnern auf der Grundlage kombinatorischer chemischer Verfahren. In dieser Ausführungsform sind die bevorzugten Zusammensetzungen und Verfahren, wenn der Bindungsligand eine Nucleinsäure ist, in der WO 98/20162 dargelegt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bindung der Probenkomponente an den Bindungsliganden spezifisch, und der Bindungsligand ist Teil eines Bindungspaars. Unter "Spezifisch binden" ist hierin zu verstehen, dass der Ligand die Komponente, beispielsweise den Zielanalyten, mit zur Unterscheidung zwischen Analyt und anderen Komponenten oder Verunreinigungen in Testprobe ausreichender Spezifität bindet. Die Bindung sollte ausreichend stark sein, unter den Bedingungen des Trennschritts oder Tests, einschließlich Waschschritten zur Entfernung nichtspezifischer Bindungen, aufrecht zu bleiben. in einigen Ausführungsformen, beispielsweise beim Nachweis bestimmter Biomoleküle, liegt die Dissoziationskonstante des Analyten und des Bindungsliganden unter etwa 10–4–10–6 M–1, wobei unter etwa 10–5–10–9 M–1 bevorzugt und unter etwa 10–7–10–9 M–1 noch bevorzugter ist.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet klar ist hängt die Zusammensetzung des Bindungsliganden von er Zusammensetzung des Zielanalyten ab. Bindungsliganden sind für eine Vielzahl von Analyten bekannt oder können unter Verwendung bekannter Verfahren einfach ausgemacht werden. Ist der Analyt beispielsweise eine einsträngige Nucleinsäure, so ist der Bindungsligand im Allgemeinen eine im Wesentlichen komplementäre Nucleinsäure. Auf ähnliche Weise kann der Analyt ein Nucleinsäure-bindendes Protein sein, und der Fängerligand ist entweder eine einsträngige oder eine doppelsträngige Nucleinsäure; alternativ dazu kann der Bindungsligand Nucleinsäure-bindendes Protein sein, wenn der Analyt eine einsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäure ist. Ist der Analyt ein Protein, so sind die Bindungsliganden unter anderem Proteine oder kleine Moleküle. Bevorzugte Bindungsliganden schließen Peptide ein. Ist beispielsweise der Analyt ein Enzym, so umfassen geeignete Bindungsliganden Substrate, Hemmstoffe und andere Proteine, die das Enzym binden, d.h. die Komponenten eines Multienzym- (oder -protein-) Komplexes. Wie für Fachleute auf dem Gebiet klar ersichtlich ist, können zwei beliebige Moleküle, die eine – vorzugsweise spezifische – Bindung eingehen, entweder als Analyt oder als Bindungsligand eingesetzt werden. Geeignet Analyt/Bindungsligand-Paare sind unter anderem Antikörper/Antigene, Rezeptoren/Liganden, Proteine/Nucleinsäuren; Nucleinsäuren/Nucieinsäuren, Enzyme/Substrate und/oder Hemmstoffe, Kohlenhydrate (einschließlich Glykoproteine und Glykolipide)/Lectine, Kohlenhydrate und andere Bindungspartner, Proteine/Proteine; und Proteine/kleine Moleküle. Diese können Wildtyp- oder abstammende Sequenzen sein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Bindungsliganden Abschnitte (insbesondere die extrazellulären Abschnitte) von Zelloberflächenrezeptoren, von denen bekannt ist, dass sie multimerisieren, wie beispielsweise der Wachstumshormonrezeptor, Glucosetransporter (insbesondere GLUT4-Rezeptor), der Transferrinrezeptor, der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor, der Rezeptor für Lipoprotein niedriger Dichte, der Rezeptor von Lipoprotein hoher Dichte, der Leptinrezeptor, Interleukinrezeptoren, einschließlich IL-1-, IL-2-, IL-3-; IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-11-, IL-12-, IL-13-, IL-15-, und IL-16-Rezeptoren, der VEGF-Rezeptor, der PDGF-Rezeptor, der EPO-Rezeptor, der TPO-Rezeptor, Rezeptoren für ziliare neurotrophe Faktoren, der Prolactinrezeptor und T-Zellen-Rezeptoren.
  • Ist die vom Bindungsliganden gebundene Probenkomponente der Zielanalyt, so kann dieser, falls nötig, zu Detektionszwecken unter Verwendung verschiedener bekannter Verfahren, die von der Stärke der Bindungswechselwirkung abhängen, freigesetzt werden, einschließlich durch Veränderungen des pH-Werts, der Salzkonzentration, der Temperatur usw. oder durch den Zusatz konkurrierender Liganden usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trennmodul ein Elektrophoresemodul, so wie allgemein in den U.S.-Patenten Nr. 5.770.029; 5.126.022; 5.631.337; 5.569.364; 5.750.015 und 5.135.627 beschrieben. Bei der Elektrophorese werden Moleküle in erster Linie durch unterschiedliche elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeiten, die von ihrer unterschiedlichen Molekülgröße, Form und/oder Ladung verursacht werden, getrennt. Mikrokapillarrohre wurden in jüngster Zeit bei der Mikrokapillar-Gelelektrophorese (Hochleistungskapillarelektrophorese (HPCE)) ein gesetzt. Ein Vorteil von HPCE liegt darin, dass die sich vom angelegten elektrischen Feld ergebende Hitze aufgrund der großen Oberflächen-Fläche effizient abgeführt wird, wodurch eine schnelle Trennung ermöglicht wird. das Elektrophoresemodul dient der Trennung von Probenkomponenten durch das Anlegen eines elektrischen Felds, wobei die Bewegungen der Probenkomponenten entweder auf ihre Ladung oder, je nach Oberflächenchemie des Mikrokanals, auf den Hauptfluidstrom als Resultat des elektroosmotischen Flusses zurückzuführen sind.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, kann das Elektrophoresemodul eine Vielzahl von Formen aufweisen und umfasst im Allgemeinen einen elektrophoretischen Mikrokanal und entsprechende Elektroden, um ein elektrisches Feld an den Mikrokanal anzulegen. Abfallfluidauslässe und Fluidspeicher sind je nach Bedarf vorhanden.
  • Die Elektroden umfassen Elektrodenpaare, entweder ein einzelnes Paar oder, so wie in den U.S.-Patenten Nr. 5.126.022 und 5.750.015 beschrieben, eine Vielzahl von Paaren. Einzelne Paare verfügen im Allgemeinen über eine Elektrode an jedem Ende des Elektrophoresewegs. Multiple Elektrodenpaare können zur präzisen Steuerung der Bewegung der Probenkomponenten eingesetzt werden, sodass die Komponenten kontinuierlich einer Vielzahl von elektrischen Feldern entweder gleichzeitig oder sequentiell ausgesetzt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein elektrophoretisches Gelmedium eingesetzt werden. Durch Variieren der Porengröße des Mediums, indem zwei oder mehr Gelmedien mit unterschiedlicher Porösität eingesetzt werden, und/oder Bereitstellen eines Porengrößengradienten kann die Trennung der Probenkomponenten maximiert werden. Gelmedien für Trennungszwecke sind bekannt, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Polyacrylamid und Agarose. Eine bevorzugte elektrophoretische Trennungsmatrix wird im U.S.-Patent Nr. 5.135.627 dargelegt, das die Verwendung einer "Mosaikmatrix" beschreibt, die durch Polymerisation einer Dispersion aus Mikrodomänen ("Dispersoiden") und einer Polymermatrix gebildet wird. Dies ermöglicht die verbesserte Abtrennung von Zielanalyten, insbesondere von Nuclein säuren. Ähnlich beschreibt auch das U.S.-Patent Nr. 5.569.364 Elektrophorese-Trennmedien umfassend vernetzte Gelteilchen mit einer Größe von unter bis über Mikrometer-Maßen, die in Mikrofluidiksystemen Anwendung finden. Das U.S.-Patent Nr. 5.631.337 beschreibt die Verwendung von thermoreversiblen Hydrogelen, die Polyamidrückgrate mit N-Substituenten umfassen, die zur Bereitstellung von Wasserstoffbindenden Gruppen für eine verbesserte elektrophoretische Trennung dienen. Vgl. auch die U.S.-Patente Nr. 5.061.336 und Nr. 5.071.531, die sich mit Verfahren des Gießens von Gelen in Kapillarrohren beschäftigen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung ein Reaktionsmodul. Diese kann entweder die physikalische, chemische oder biologische Veränderung einer oder mehrerer Probenkomponenten einschließen. Alternativ dazu umfasst es gegebenenfalls ein Reaktionsmodul, in dem der Zielanalyt eine zweite Gruppierung verändert, die dann nachgewiesen werden kann; ist beispielsweise der Zielanalyt ein Enzym, so umfasst die Reaktionskammer gegebenenfalls ein Substrat, das nach der Modifikation durch den Zielanalyten nachgewiesen werden kann. In dieser Ausführungsform umfasst enthält das Reaktionsmodul gegebenenfalls die notwendigen Reagenzien, oder diese sind in einem Speichermodul gelagert und werden in Folge, so wie hierin dargelegt, nach Bedarf in das Reaktionsmodul gepumpt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reaktionsmodul eine Kammer zur chemischen Modifikation der gesamten Probe oder eines Teils davon. Beispielsweise kann eine chemische Spaltung der Probenkomponenten (CNBr-Spaltung von Proteinen usw.) oder eine chemische Vernetzung vollzogen werden. WO 97/43629 listet eine Vielzahl an möglichen chemischen Reaktionen auf, die in den Vorrichtungen der Erfindung durchgeführt werden können, einschließlich Amidbildung, Acylierung, Alkylierung, reduktiver Aminierung, Mitsunobu-, Diels-Alder- und Mannich-Reaktionen, Suzuki- und Stille-Kupplung usw. Auf ähnliche Weise beschreiben die U.S.-Patente Nr. 5.616.464 und Nr. 5.767.259 eine Variation der Ligations-Kettenreaktion (LCR; manchmal auch Oligonucleotid-Ligationsamplifikation oder OLA bezeichnet), in der eine Art "chemische Ligation" eingesetzt wird. In dieser Ausfüh rungsform wird, ähnlich wie bei der LCR, ein Primer-Paar eingesetzt, worin der erste Primer im Wesentlichen komplementär zu einer ersten Domäne des Ziels und der zweite Primer Wesentlichen komplementär zu einer benachbarten zweiten Domäne des Ziels ist (obwohl wie bei der LCR ein "Spalt" existiert können eine Polymerase und dNTPs zum "Füllen" des Spalts zugesetzt werden). Jeder Primer weist einen als "Seitenkette" dienenden Abschnitt auf, der nicht an die Zielsequenz bindet und der als eine Hälfte einer Stammstruktur dient, die nichtkovalent durch Wasserstoffbrückenbindung, Salzbrücke, Van-der-Waals-Kräfte usw. wechselwirkt. Bevorzugte Ausführungsformen setzen im Wesentlichen komplementäre Nucleinsäuren als Seitenketten ein. So werden bei der Hybridisation der Primer an der Zielsequenz die Seitenketten der Primer in räumliche Nähe gebracht und können, wenn die Seitenketten ebenfalls Nucleinsäuren umfassen, zudem Hybridisationskomplexe ausbilden. Zumindest eine Seitenkette der Primer umfasst einen aktivierbaren Vernetzer, der im Allgemeinen kovalent an die Seitenkette gebunden ist und bei der Aktivierung für eine chemische Vernetzung oder chemische Ligation sorgt. Die aktivierbare Gruppe umfasst gegebenenfalls irgendeine Gruppierung, die ein Vernetzen der Seitenketten ermöglicht und schließt chemisch, photonisch und thermisch aktivierte Gruppen ein, wobei photoaktivierbare Gruppen bevorzugt sind. In einigen Ausführungsformen reicht eine einzige aktivierbare Gruppe an einer der Seitenketten aus, um über die Wechselwirkung mit einer funktionellen Gruppe an einer anderen Seitenkette zur Vernetzung zu führen; in anderen Ausführungsformen sind aktivierbare Gruppe an jeder der Seitenketten vonnöten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Reaktionsmodul eine Kammer zur biologischen Veränderung der gesamten Probe oder eines Teils dieser. Beispielsweise enzymatische Verfahren, die Nucleinsäureamplifikation und andere Modifikationen von Nucleinsäuren, einschließlich Ligation, Spaltung, Zirkularisierung, Supercoiling, Methylierung, Acetylierung, Sequenzierung, Genotypisierung; Hydrolyse der Probenkomponenten oder Hydrolyse von Substraten durch Zielenzyme, Zusatz oder Entfernung nachweisbarer Markierungen, Zusatz oder Entfernung von Phosphatgruppen, Proteinmodifikation (Acylierung, Glykosylierung, Zusatz von Lipiden, Kohlenhydraten usw.), Synthese/Modifikation von kleinen Molekülen usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure, die biologische Reaktionskammer ermöglicht die Amplifikation der Zielnucleinsäure. Geeignete Amplifikationsverfahren, sowohl für die Amplifikation des Ziel als auch der Sonde, schließen Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR), Strand-Displacement-Amplifikation (SDA), selbsterhaltende Sequenzreplikation (3SR), QB-Replikase-Amplifikation (QBR), Reparatur-Kettenreaktion (RCR), Cycling-Probe-Technologie oder -Reaktion (CPT oder CPR), InvaderTM und Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) ein, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Verfahren, die derartige Methoden einsetzen, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. In dieser Ausführungsform umfassen die Reaktionsreagenzien im Allgemeinen zumindest ein Enzym (im Allgemeinen Polymerase), Primer und nach Bedarf Triphosphate.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Mikrofluidikvorrichtung eine Vielzahl von Reaktionsmodulen. In dieser Ausführungsform üben die Reaktionsmodule gegebenenfalls unterschiedliche Funktionen aus. So führt ein Reaktionsmodul beispielsweise PCR durch , während ein anderes für QβR zuständig ist. Alternativ dazu übt jedes Reaktionsmodul dieselbe Funktion aus. Wichtig ist hier, dass die Reaktionsmodule mit einem Detektionsmodul zur Analyse, wie nachstehend beschrieben, in Verbindung stehen.
  • Allgemeine Verfahren der Nucleinsäureamplifikation werden in Folge erörtert. In den meisten Fällen werden doppelsträngige Zielnucleinsäuren zu einsträngigen denaturiert, um die Hybridisation der Primer und anderer Sonden der Erfindung zu ermöglichen. Eine bevorzugte Ausführungsform setzt einen Wärmeschritt ein, im Allgemeinen durch Anheben der Reaktionstemperatur auf etwa 95 °C, jedoch sind auch pH-Wert-Änderungen und andere Verfahren, wie beispielsweise die Verwendung von zusätzlichen Sonden oder Nucleinsäure-bindenden Proteinen einsetzbar.
  • Eine Nucleinsäuresonde (hierin auch als Primer-Nucleinsäure bezeichnet) wird mit der Zielsequenz in Kontakt gebracht, um eine Hybridisationskomplex zu bilden. Mit "Primer-Nucleinsäure" ist hierin eine Nucleinsäuresonde zu verstehen, die an einem Abschnitt, d.h. einer Domäne, der Zielsequenz hybridisiert. Sonden der vorliegenden Erfindung sind so konzipiert, dass sie zu einer Zielsequenz (entweder die Zielsequenz der Probe oder an andere Sonden-Zielsequenzen, wie nachstehend beschrieben) komplementär sind, sodass es zur Hybridisation der Zielsequenz und der Sonden der vorliegenden Erfindung kommt. Wie nachstehend dargelegt wird muss diese Komplementarität nicht vollständig sein; es kann eine beliebige Anzahl an Basenfehlpaarungen vorliegen, die die Hybridisation zwischen der Zielsequenz und den einsträngigen Nucleinsäuren der vorliegenden Erfindung beeinträchtigen. Ist die Anzahl der Mutationen jedoch so groß, dass sich auch unter den am wenigsten stringenten Hybridisationsbedingungen keine Hybridisation vollziehen kann, so ist die Sequenz keine komplementäre Zielsequenz. Somit ist hierin unter "im Wesentlichen komplementär" eine zur Hybridisation unter normalen Reaktionsbedingungen ausreichende Komplementarität der Sonden zu den Zielsequenzen zu verstehen.
  • Eine Vielzahl von Hybridisationsbedingungen sind in der vorliegenden Erfindung einsetzbar, einschließlich hoch, mittel und niedrige Stringenzbedingungen; vgl. beispielsweise Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2. Ausgabe, 1989, und "Short Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al.(Hrsg.). Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und sind unter unterschiedlichen Umständen nicht gleich. Längere Sequenzen hybridisieren bei höheren Temperaturen spezifisch. Ein ausführlicher Leitfaden zur Hybridisation von Nucleinsäuren ist in Tijissen, "Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes, Overview of Principles of Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Assays" (1993), zu finden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass die Temperatur etwa 5–10 °C unter dem Schmelzpunkt (Tm) der spezifischen Sequenz liegt und ein und ein Ionenstärke-pH-Wert definiert ist. Tm ist jene Temperatur (unter definierter Ionenstärke, pH-Wert und Nucleinsäurekonzentration), bei der 50 % der zum Ziel komplementären Sonden an der Zielsequenz im Gleichgewicht hybridisieren (da die Zielsequenzen im Überschuss vorhanden sind, sind bei Tm 50 % der Sonden im Gleichgewicht besetzt). Stringente Bedingungen sind solche, bei denen die Salzkonzentration unter etwa 1,0 Natriumionen liegt, typischerweise mit einer Nariumionenkonzentration (oder andere Salze) von etwa 0,01 bis 1,0 M, einem pH-Wert von 7,0 bis 8,3 und einer Temperatur von zumindest etwa 30 °C für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und von zumindest etwa 60 °C für lange Sonden (z.B. mehr als 50 Nucleotide). Stringente Bedingungen können ebenfalls durch den Zusatz von Destabilisatoren, wie beispielsweise Formamid, erzielt werden. Die Hybridisationsbedingungen können zudem variieren, wenn ein nichtionisches Rückgrat, d.h. eine PNA, verwendet wird, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Außerdem können Vernetzer nach der Bindung des Ziels zur Vernetzung, d.h. zur kovalenten Bindung der beiden Stränge des Hybridisationskomplexes zugesetzt werden.
  • Somit werden die Tests im Allgemeinen unter Stringenzbedingungen durchgeführt, die die Ausbildung eines Hybridisationskomplexes nur in der Gegenwart des Zieles zulassen. Die Stringenz kann durch Veränderung der eines Verfahrensschritt-Parameters, der eine thermische Variable ist, gesteuert werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der Temperatur, der Formamidkonzentration, der Salzkonzentration, des chaotropen Salzkonzentration-pH-Werts, der organischen Lösungsmittelkonzentration usw.
  • Diese Parameter können ebenfalls zur Steuerung nichtspezifischer Bindungen eingesetzt werden, wie allgemein im U.S.-Patent Nr. 5.681.697 dargelegt. Es ist demnach gegebenenfalls wünschenswert, bestimmte Schritte unter Bedingungen höherer Stringenz zur Reduktion der nichtspezifischen Bindungen durchzuführen.
  • Die Größe der Primer-Nucleinsäure kann, wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, variieren, im Allgemeinen von 5 bis 500 Nucleotiden in der Länge, mit einer bevorzugten Anzahl an Primer zwischen 10 und 100, noch bevorzugter zwischen 15 und 50, und insbesondere von 10 bis 35, je nach Verwendungszweck und Amplifikationsverfahren.
  • Zusätzlich können verschiedene Amplifikationsverfahren weitere Anforderungen an die Primer stellen, wie in Folge detaillierter beschrieben wird.
  • Hat sich der Hybridisationskomplex zwischen dem Primer und der Zielsequenz gebildet, wird ein Enzym, manchmal als "Amplifikationsenzym" bezeichnet, zur Modifikation des Primers eingesetzt. Für alle hierin beschriebenen Verfahren gilt, dass die Enzyme zu jedem beliebigen Zeitpunkt während des Tests zugesetzt werden können, entweder vor, während oder nach dem Zusetzen der Primer. Die Identifikation des Enzyms hängt, wie nachstehend detaillierter beschrieben wird, vom verwendeten Amplifikationsverfahren ab. Auf ähnliche Weise hängt auch die Modifikation, wie nachstehend beschrieben wird, vom Amplifikationsverfahren ab, obwohl im Allgemeinen der erste Schritt einer jeden Reaktion hierin die Extension des Primer ist d.h. dem Primer werden Nucleotide zugeführt, um dessen Länge zu vergrößern.
  • Hat das Enzym den Primer modifiziert und einen modifizierten Primer gebildet, dissoziert der Hybridisierungskomplex. Im Allgemeinen werden die Amplifikationsschritte über einen Zeitraum hinweg wiederholt, um eine Reihe von Zyklen, abhängig von der Anzahl der Kopien der Ausgangszielsequenz und der Detektionsempfindlichkeit, zuzulassen, wobei 1 Zyklus bis Tausende von Zyklen möglich sind, 10 bis 100 Zyklen bevorzugt und 20 bis 50 Zyklen noch bevorzugter sind.
  • Nach einer geeigneten Zeit oder Amplifikation wird der modifizierte Primer zu einem Detektionsmodul geführt und in einen Testkomplex inkorporiert, wie nachstehend beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Amplifikation eine Zielamplifikation. Die Zielamplifikation beinhaltet die Amplifikation (Replikation) der nachzuweisenden Zielsequenz, sodass die Anzahl der Kopien der Zielsequenz erhöht wird. Geeignete Zielamplifikationsverfahren sind unter anderem Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Strand-Displacement-Amplifikation (SDA), Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA), sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Amplifikationsverfahren PCR. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist häufig beschrieben worden und wird weit verbreitet eingesetzt, und sie beinhaltet den Einsatz der Primerextension in Kombination mit zyklischer Wärmebeanspruchung zur Amplifikation einer Zielsequenz; vgl. die U.S.-Patente Nr. 4.683.195 und 4.683.202 sowie "PCR Essential Data", C.R. Newton (Hrsg.), J. Wiley & Sons, 1995. Zudem gibt es eine Vielzahl an Variationsmöglichkeiten der PCR, die ebenfalls in der Erfindung Anwendung finden, unter anderem einschließlich der "quantitativen kompetitiven PCR" oder "QC-PCR", "Zufallsprimer-PCR" oder "AP-PCR", "Immuno-PCR", "Alu-PCR", "PCR-Einzelstrang-Konformationspolymorphismus" oder "PCR-SSCP", "Reverse-Transkriptase-PCR" oder "RT-PCR", "Biotin-Fang-PCR", "Vectorette-PCR", "Pfannenstiel-PCR" ("panhandle-PCR"), "PCR-Select cDNA-Subtraktion".
  • Im Allgemeinen kann PCR wie folgt beschrieben werden: Eine doppelsträngige Zielnucleinsäure wird, im Allgemeinen durch Anheben der Temperatur, denaturiert und anschließend in Gegenwart eines Überschusses eines PCR-Primers abgekühlt, welches dann an den ersten Zielstrang hybridisiert. Daraufhin wirkt eine DNA-Polymerase zur Extension des Primers auf diesen ein, was zur Synthese eines Strangs, der einen Hybridisationskomplex bildet, führt. Die Probe wird daraufhin zur erneut erwärmt, um den Hybridisationskomplex zu dissoziieren, wonach der Vorgang wiederholt wird. Unter Verwendung eines zweiten PCR-Primers für den komplementären Zielstrang vollzieht sich eine rasche und exponentielle Amplifikation. Die PCR-Schritte sind somit Denaturierung, Annealing und Extension. Die Einzelheiten der PCR sind bekannt und schließen die Verwendung einer thermostabilen Polymerase, wie beispielsweise Taq I-Polymerase, und zyklischer Wärmebeanspruchung ein.
  • Demzufolge benötigt die PCR-Reaktion zumindest einen PCR-Primer und eine Polymerase. Mesoskalige PCR-Vorrichtungen sind in den U.S.-Patenten Nr. 5.498.392 und Nr. 5.587.128 sowie in der WO 97/16561 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielamplifikationsverfahren SDA. Strand-Displacement-Amplifikation (SDA) ist allgemein in Walker et al., "Molecular Methods for Virus Detection", Academic Press Inc., 1995, und in den U.S.-Patenten Nr. 5.455.166 und 5.130.238 beschrieben.
  • Im Allgemeinen kann SDA wie folgt beschrieben werden. Eine einsträngige Zielnucleinsäure, üblicherweise eine DNA-Zielsequenz, wird mit einem SDA-Primer kontaktiert. Ein "SDA-Primer" weist im Allgemeinen eine Länge von 25 bis 100 Nucleotiden auf, wobei SDA-Primer mit etwa 35 Nucleotiden bevorzugt sind. Ein SDA-Primer ist im Wesentlichen komplementär zu einem Bereich am 3'-Ende der Zielsequenz, und der Primer verfügt über eine Sequenz an seinem 5'-Ende (außerhalb des zum Ziel komplementären Bereichs), die eine Erkennungssequenz für eine Restriktionsendonuclease ist, die manchmal hierin als "Nicking-Enzym" oder als "Nicking-Endonuclease" bezeichnet wird, wie nachstehend beschrieben wird. Der SDA-Primer hybridisiert dann an die Zielsequenz. Das SDA-Reaktionsgemisch enthält zudem eine Polymerase ("SDA-Polymerase", nachstehend beschrieben) sowie ein Gemisch aller vier Desoxynucleosidtriphosphate (auch als Desoxynucleotide oder dNTPs , d.h. dATP, dTTP, dCTP und dGTP bezeichnet), von denen zumindest eines ein substituiertes oder modifiziertes dNTP ist; somit ist der SDA-Primer modifiziert, d.h. extendiert, um einen modifizierten Primer zu bilden, der hierin manchmal als "neu synthetisierter Strang" bezeichnet wird. Das substiuierte dNTP ist modifiziert, sodass eine Spaltung des Strangs, der das substiuierte dNTP enthält, verhindert, jedoch nicht eine Spaltung im anderen Strang verhindert. Beispiele für geeignete substiuierte dNTPs umfassen 2'-Desoxyadenosin-5'-O-(1-thiotriphosphat), 5-Methyldesoxycytidin-5'-triphosphat, 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat, und 7-Desaza-2'-desoxyguanosin-5'-triphosphat, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zudem vollzieht sich die Substitution des dNTP gegebenenfalls nach der Inkorporation in einen neu synthetisierten Strang; beispielsweise kann eine Methylase eingesetzt werden, um dem synthetisierten Strang Methylgruppen zuzusetzen. Außerdem weist die Polymerase, wenn alle Nucleotide substituiert sind, gegebenenfalls eine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität auf. Sind jedoch weniger als alle Nucleotide substituiert, weist die Polymerase vorzugsweise keine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität auf.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, kann das Erkennungsstelle/Endonuclease-Paar eines aus einer Vielzahl von bekannten Kombinationen sein. Die Endonuclease ist so gewählt, dass sie einen Strang entweder an der Erkennungsstelle oder an einem aus 3' und 5' davon spaltet, ohne jedoch die komplementäre Sequenz zu spalten, entweder weil das Enzym nur einen Strang spaltet oder aufgrund der Inkorporation der substituierten Nucleotide. Geeignete Erkennungsstelle/Endonuclease-Paare sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt; geeignete Endonucleasen sind unter anderem HincII, HindII, AvaI, Fnu4HI, TthIIII, NcII, BstXI, BamI usw. Eine Darstellung der geeigneten Enzyme und ihrer entsprechenden Erkennungsstellen sowie der zu verwendenden modifizierten dNTPs findet sich im U.S.-Patent Nr. 5.455.166.
  • Ist die Polymerase (eine "SDA-Polymerase") genickt, so wird sie zur Extension des neu genickten Strangs, 5'-3', eingesetzt, wodurch ein weiterer neu synthetisierter Strang gebildet wird. Die gewählte Polymerase sollte imstande sein, eine 5'-3'-Polymerisation an der Nick-Stelle einzuleiten, sollte zudem den polymerisierten Strang stromabwärts vom Nick verschieben und keine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität aufweisen (dies kann zusätzlich durch den Zusatz eines Blockers erzielt werden). Geeignete Polymerasen umfassen somit das Kenlow-Fragment der DNA-Polymerase 1, Sequenase 1.0 und Sequenase 2.0 (U.S. Biochemical), T5 DNA-Polymerase und Phi29 DNA-Polymerase, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt.
  • Dementsprechend benötigt die SDA-Reaktion – in keiner bestimmten Reihenfolge – einen SDA-Primer, eine SDA-Polymerase, eine Nicking-Endonuclease und dNTPs, von denen zumindest eine Spezies modifiziert ist.
  • Im Allgemeinen bedarf die SDA keiner zyklischen Wärmebeanspruchung. Die Reaktionstemperatur wird im Allgemeinen hoch genug festgelegt, um nichtspezifische Hybridisierung zu verhindern, jedoch niedrig genug, um spezifische Hybridisierung zuzulassen; diese liegt, abhängig von den Enzymen, bei etwa 37 °C bis etwa 42 °C.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann, wie bei den meisten hierin beschriebenen Amplifikationsverfahren, eine zweite Amplifikationsreaktion unter Verwendung der zweiten komplementären Zielsequenz durchgeführt werden, was zu einem wesentlichen Anstieg der Amplifikation während eines zweiten festgelegten Zeitraums führt. Das bedeutet, dass eine zweite Primer-Nucleinsäure an einer zweiten Zielsequenz hybridisiert wird, um einen zweiten Hybridisationskomplex zu bilden. Der Zusatz des Enzyms, gefolgt von der Zerlegung des zweiten Hybridisationskomplex führt zur Bildung einer Reihe von neu synthetisierten zweiten Strängen.
  • Auf diese Weise wird eine Vielzahl von Zielmolekülen hergestellt und zum Detektionsmodul übermittelt, so wie nachstehend beschrieben. Wie in Folge detaillierter dargelegt wird, können diese Reaktionen (d.h. die Produkte dieser Reaktionen) auf verschiedene Arten nachgewiesen werden. Im Allgemeinen kann eine direkter oder ein indirekter Nachweis der Zielprodukte durchgeführt werden. Der "Direkte" Nachweis benötigt in diesem Kontext, genauso wie bei den anderen hierin dargelegten Amplifikationsstrategien, die Inkorporation einer Markierung, entweder durch die Inkorporation der Markierung in die Amplifikationsprimer oder durch Polymeraseinkorporation markierter Nucleotide in den wachsenden Strang. Alternativ dazu bestehen indirekte Nachweisverfahren, wie beispielsweise der Sandwich-Test, wobei die neu synthetisierten Stränge wenige oder gar keine Markierungen besitzen. Der Nachweis vollzieht sich dann über die Verwendung von Markersonden, die eine fluoreszierende Markierung umfassen; diese Markierungen hybridisieren entweder direkt am neu synthetisierten Strang oder an Zwischensonden, wie beispielsweise Amplifikationssonden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Zielamplifikationsverfahren Nucleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA). NASBA wird allgemein im U.S.-Patent Nr. 5.409.818 und in "Profiting from Gene-Based Diagnostics", CBT International Publishing Inc., N.J., 1996, beschrieben.
  • Im Allgemeinen kann die NASBA wie folgt beschrieben werden: Eine einsträngige Nucleinsäure, üblicherweise eine RNA-Zielsequenz (manchmal hierin auch als "die erste Zielsequenz" oder "die erste Matrize" bezeichnet), wird mit einem ersten NASBA-Primer kontaktiert. Ein "NASBA-Primer" weist im Allgemeinen eine Länge von 25 bis 100 Nucleotiden auf, wobei NASBA-Primer mit einer Länge von 50 bis 75 Nucleotiden bevorzugt sind. Der erste NASBA-Primer ist vorzugsweise ein DNA-Primer, der an seinem 3'-Ende eine im Wesentlichen zum 3'Ende der ersten Matrize komplementäre Sequenz besitzt. Der erste NASBA-Primer verfügt über einen RNA-Polymerase-Promotor an seinem 5'-Ende. Der erste NASBA-Primer wird dann an der ersten Matrize hybridisiert, um einen ersten Hybridisationskomplex zu bilden. Das NASBA-Reaktionsgemisch umfasst zudem ein Reverse-Transkriptase-Enzym (eine "NASBA-Reverse-Transkriptase") und eine Gemisch der vier dNTPs, sodass der erste NASBA-Primer modifiziert ist, um einen modifizierten ersten Primer zu bilden, der einen Hybridisierungskomplex aus RNA (die erste Matrize) und DNA (dem neu synthetisierten Strang) umfasst.
  • Unter "Reverse Transkriptase" oder "RNA-abhängige DNA-Polymerase" ist hierin ein Enzym zu verstehen, das zur Synthese von DNA aus einem DNA-Primer und einer RNA-Matrize fähig ist. Geeignete RNA-abhängige DNA-Polymerasen umfassen die Vogel-Myelobastosevirus-Reverse-Transkriptase ("AMV-RT"} und die Moloney-Mäuse-Leukemievirus-RT, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Zusätzlich zu den oben aufgeführten Komponenten enthält die NASBA-Reaktion weiters ein RNA-abbauendes Enzym, das hierin manchmal auch als eine Ribonuclease bezeichnet wird, das die RNA eines RNA:DNA-Hybriden hydrolysiert, ohne ein- oder doppelsträngige RNA oder DNA zu hydrolysieren. Geeignete Ribonucleasen sind unter anderem RNase H von E.coli und Kalbsthymus, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die Ribonuclease baut die erste RNA-Matrize im Hybridisationskomplex ab, was zur Dissoziation des Hybridisationskomplexes führt und einen neu synthetisierten DNA-Strand ergibt, der manchmal hierin auch als "die zweite Matrize" bezeichnet wird.
  • Weiters umfasst die NASBA-Reaktion einen zweiten NASBA-Primer, der im Allgemeinen DNA umfasst (obwohl, wie für alle Sonden hierin, einschließlich Primer, auch Nucleinsäureanaloga verwendet werden können). Dieser zweite NASBA-Primer verfügt an seinem 3'-Ende über eine im Wesentlichen zum 3'-Ende der zweiten Matrize komplementäre Sequenz und enthält zudem eine Antisense-Sequenz für einen funktionellen Promotor und die Antisense-Sequenz einer Transkriptionsstartstelle. Wird diese Primersequenz nun als Matrize für die Synthese der dritten DNA-Matrize verwendet, so enthält sie ausreichend Informationen, um eine spezifische und effiziente Bindung einer RNA-Polymerase und den Start der Transkription an der gewünschten Stelle zuzulassen. Bevorzugte Ausführungsformen, die den Antisense-Promotor und die Transskriptionsstartstelle verwenden, setzen die T7 RNA-Polymerase ein, obwohl auch andere RNA-Polymerasepromotoren und Startstellen verwendet werden können, wie nachstehend erläutert wird.
  • Der zweite Primer hybridisiert an der zweiten Matrize, und eine DNA-Polymerase, auch als eine "DNA-abhängige DNA-Polymerase" bezeichnet, die ebenfalls in der Reaktion gegenwärtig ist, synthetisiert eine dritte Matrize (einen zweiten neu synthetisierten DNA-Strang), was zur Bildung eines zweiten Hybridisationskomplexes führt, der zwei neu synthetisierten DNA-Stränge umfasst.
  • Letztendlich resultiert die Einbeziehung einer RNA-Polymerase und der vier notwendigen Ribonucleosidtriphosphate (Ribonucleotide oder NTPs) in der Synthese eines RNA-Strangs (eines dritten neu synthetisierten Strangs, der im Wesentlichen der ersten Matrize entspricht). Die RNA-Polymerase, manchmal hierin als eine "DNA-abhängige RNA-Polymerase" bezeichnet, erkennt den Promotor und initiiert spezifisch die RNA-Synthese an der Startstelle. Zudem synthetisiert die RNA-Polymerase vorzugsweise mehrere Kopien der RNA pro DNA-Duplex. Bevorzugte RNA-Polymerase schließen T7 RNA-Polymerase und andere bakteriophage RNA-Polymerasen, einschließlich des Phagen T3, des Phagen ϕII, des Salmonella-Phagen sp6 oder des Pseudomonase-Phagen gh-1, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Demzufolge benötigt die NASBA-Reaktion, in keiner bestimmten Reihenfolge, einen ersten NASBA-Primer, einen zweiten NASBA-Primer, umfassend eine Antisense-Sequenz eines RNA-Polymerase-Promotors, eine den Promotor erkennende Polymerase, eine Reverse Transkriptase, eine DNA-Polymerase, ein RNA-abbauendes Enzym, NTPs und dNTPs, zusätzlich zu den nachstehend aufgeführten Detektionskomponenten.
  • Diese Komponenten ergeben eine einzelne Starter-RNA-Matrize, die einen einzelnen DNA-Duplex erzeugt; da jedoch der DNA-Duplex zur Bildung multipler RNA-Stränge führt, die daraufhin erneut zum Starten der Reaktion eingesetzt werden können, vollzieht sich die Amplifikation sehr rasch.
  • Wie hierin dargelegt wird, kann sich der Nachweis neu synthetisierter Stränge auf mehrere Arten vollziehen. Im Detektionsmodul kann ein direkter Nachweis durchgeführt werden, wenn die neu synthetisierten Stränge ETM-Markierungen umfassen, die entweder durch Inkorporation in die Primer oder durch Inkorporation von modifizierten markierten Nucleotiden in den wachsenden Strang eingeführt wurden. Alternativ dazu kann, so wie nachstehend detaillierter beschrieben, ein indirekter Nachweis unmarkierter Stränge (die nun als "Ziel" im Detektionsmodul dienen) unter Verwendung verschiedener Sandwich-Testkonfigurationen vollzogen werden. Wie für Fachleute auf dem Gebiet klar ersichtlich ist, ist es vorzuziehen, DNA-Stränge während der NASBA nachzuweisen, da die Gegenwart der Ribonuclease die RNA-Stränge potentiell labil macht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Amplifikation eine Signalamplifikation. Eine Signalamplifikation beinhaltet die Verwendung einer beschränkten Anzahl an Zielmolekülen als Matrizen, um entweder multiple Signalsonden zu bilden oder um die Verwendung von multiplen Signalsonden zu ermöglichen. Signalamplifikationsstrategien schließen LCR-, CPT-, InvaderTM-Technologien sowie die Verwendung von Amplifikationssonden in Sandwich-Tests ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Amplifikationsverfahren LCR. Das Verfahren kann auf zwei verschiedene Arten durchgeführt werden; in einer ersten Ausführungsform wird nur ein Strang einer Zielsequenz als Ligationsmatrize eingesetzt; alternativ dazu können beide Stränge verwendet werden. Vgl. im Allgemeinen die U.S.-Patente Nr. 5.185.243 und 5.573.907; die EP 0.320.308 B1; EP 0.336.731 B1; EP 0.439.182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; WO 89/09835; und WO 99/37819.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die einsträngige Zielsequenz eine erste Zieldomäne und eine zweite Zieldomäne, und eine erste LCR-Primer- und ein zweite LCR-Primer-Nucleinsäure werden zugesetzt, die im Wesentlichen zur jeweiligen Zieldomäne komplementär sind und somit an den Zieldomänen hybridisieren. Diese Zieldomänen können direkt aneinander liegen, d.h. benachbart, oder durch mehrere Nucleotide voneinander getrennt sein. Sind sich nicht benachbart, so werden Nucleotide gemeinsam mit Mitteln zur Verbinden der Nucleotide, wie beispielsweise Polymerase, das die Nucleotide zu einem der Primer hinzufügt, zugesetzt. Die zwei LCR-Primer werden dann kovalent gebunden, beispielsweise unter Verwendung eines Ligaseenzyms, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. So bildet sich ein erster Hybridisationskomplex, der die ligierte Sonde und die Zielsequenz umfasst. Dieser Hybridisationskomplex wird daraufhin denaturiert (zerlegt), und das Verfahren wird zur Bildung eines Pools an ligierten Sonden wiederholt. Zudem kann es wünschenswert sein, dass die nachstehend beschriebenen Detektionssonden eine Fehlpaarung an der Sondenbindungsstelle umfasst, sodass die Detektionssonde nicht als Ligationsmatrize verwendet werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird LCR für beide Stränge einer doppelsträngigen Zielsequenz durchgeführt. Die Zielsequenz wird denaturiert, und zwei Sondensätze werden zugesetzt; ein so wie oben definierter Satz für einen Strang des Ziels und ein getrennter Satz (d.h. dritte und vierte Primersondennucleinsäuren) für den anderen Strang des Ziels. In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisieren die erste und die zweite Sonde, ebenso die dritte und die vierte Sonde, sodass eine Amplifikation sich vollziehen kann. Wurden die erste und die zweite Sonde an gebunden, so kann die ligierte Sonde nun zusätzlich zur zweiten Zielsequenz als Matrize zur Bindung der dritten und vierten Sonde eingesetzt werden. Auf ähnliche Weise dienen die ligierte dritte und vierte Sonde zusätzlich zum ersten Zielstrang als Matrize zur Bindung der ersten und zweiten Sonde. Auf diese Weise kann sich eine exponentielle Amplifikation vollziehen, und keine lineare.
  • Erneut kann, wie zuvor beschrieben, der Nachweis der LCR-Reaktion auf direkte Weise, für den Fall, dass ein oder beide Primer zumindest eine Markierung umfassen, oder auf indirekte Weise unter- Verwendung von Sandwich-Tests durch den Zusatz zusätzlicher Sonden erfolgen; das bedeutet, dass die ligierte Sonde als Zielsequenz dienen kann und für den Nachweis gegebenenfalls Amplifikationssonden, Fängersonden, Fänger-Extendersonden, Markersonden, Marker-Extendersonden usw. eingesetzt werden.
  • Die InvaderTM-Technologie basiert auf strukturspezifischen Polymerasen, die Nucleinsäuren stellenspezifisch spalten. Zwei Sonden werden eingesetzt: eine "Invader-Sonde" und "Signalsonde", die nebeneinander liegend an einer Zielsequenz mit nichtkomplementärer Überlappung hybridisieren. Das Enzym spaltet aufgrund der Erkennung des "Schwanzes" an der Überlappung und setzt den "Schwanz" mit einer Markierung frei. Dieser kann dann nachgewiesen werden. Die InvaderTM-Technologie wird in den U.S.-Patenten Nr. 5.846.717; 5.614.402; 5.719.028; 5.541.311; und 5.843.669 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Signalamplifikationsverfahren CPT. die CPT-Technologie wird in mehreren Patenten und Patentanmeldungen beschrieben, einschließlich der U.S.-Patente Nr. 5.011.769, 5.403.711, 5.660.988 und 4.876.187, und der gemäß dem PCT-Vertrag veröffentlichten Anmeldungen WO 95/05480, WO 95/1416, WO 95/00667 und U.S. Nr. 6.063.573.
  • Im Allgemeinen kann CPT wie folgt beschrieben werden: Ein CPT-Primer (hierin auch manchmal als "spaltbarer Primer" bezeichnet), der zwei durch eine spaltbare Verbindung getrennte Probensequenzen umfasst. Der CPT-Primer ist im Wesentli chen zur Zielsequenz komplementär und hybridisert somit an dieser, um einen Hybridisierungskomplex zu bilden. Die spaltbare Verbindung wird gespalten, ohne jedoch die Zielsequenz zu spalten, wodurch die zwei Sondensequenzen getrennt werden. Die zwei Sondensequenzen können somit leichter von Ziel abgetrennt werden, und die Reaktion kann beliebig oft wiederholt werden. Der gespaltene Primer wird dann auf die hierin beschriebene Weise nachgewiesen.
  • Unter "spaltbare Verbindung" ist hierin eine Verbindung zu verstehen, die gespalten werden kann, wenn die Sonde Teil eines Hybridisationskomplexes ist, d.h. wenn ein doppelsträngiger Komplex gebildet wird. Wichtig ist, dass die spaltbare Verbindung nur die spaltbare Sonde und nicht die Sequenz, an die hybridisiert ist (d.h. entweder die Zielsequenz oder die Sondensequenz), spaltet, sodass die Zielsequenz in der Reaktion zur Amplifikation des Signals erneut eingesetzt werden kann. So wie hierin verwendet ist die spaltbare Verbindung jedwede chemische Verbindungsstruktur, die zwei Sondensequenzen verbindet und die selektiv ohne Spaltung der Sondensequenzen oder der Sequenz, an die die abspaltbare Sonde hybridisiert ist, spaltbar ist. Die spaltbare Bindung kann eine Einfachbindung oder eine Vielfachsequenz? sein. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, kann eine Vielzahl möglicher spaltbarer Bindungen eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die spaltbare Bindung RNA. Dieses System, das zuvor beschrieben worden ist, basiert auf der Tatsache, dass bestimmte doppelsträngige Nucleasen, insbesondere Ribonucleasen, RNA-Nucleoside eines RNA:DNA-Hybridsationskomplexes nicken oder abtrennen. In dieser Ausführungsform sind RNAseH, Exo III und Reverse Transkriptase von besonderem Nutzen.
  • In einer Ausführungsform besteht die gesamte abspaltbare Sonde aus RNA, und das Nicken wird dann besonders einfach, wenn der Vorgang mit einer doppelsträngigen Ribonuclease ausgeführt wird, wie beispielsweise mit RNAseH oder Exo III. Zur Gänze aus RNA hergestellte RNA-Sonden sind besonders nützlich weil sie erstens enzymatisch einfach hergestellt werden können und weil sie zweitens mehrere Spaltungsstellen aufweisen, die für ein Nicking-Mittel, wie beispielsweise Ribonucleasen, zum Nicken oder Spalten zugänglich sind. Zur Gänze aus RNA hergestellte RNA-Sonden bedürfen somit keiner spaltbaren Verbindung, da die spaltbare Verbindung in der Sonde inhärent ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können, wenn die spaltbare Verbindung eine Nucleinsäure, wie beispielsweise RNA, ist, die Verfahren der Erfindung zum Nachweis von Fehlpaarungen eingesetzt werden, so wie allgemein im U.S.-Patent Nr. 5.660.988 und in der WO 95/14106 beschrieben, die hiermit durch Verweis aufgenommen sind. Diesen Fehlpaarungs-Nachweisverfahren liegt die Tatsache zugrunde, dass RNAseH gegebenenfalls nicht an den RNA:DNA-Duplex bindet und/oder diesen spaltet, wenn in der Sequenz Fehlpaarungen gegenwärtig sind. Somit sind in den NA1-R-NA2-Ausführungsformen NA1 und NA2 nicht-RNA-Nucleinsäuren, vorzugsweise DNA. Vorzugsweise liegt die Fehlpaarung innerhalb des RNA:DNA-Duplex, in einigen Ausführungsformen jedoch ist die Fehlpaarung gegebenenfalls in einer benachbarten Sequenz nahe der gewünschten Sequenz gegenwärtig, und zwar nahe genug, um die RNAseH (im Allgemeinen innerhalb einer oder zwei Basen) zu beeinträchtigen. In dieser Ausführungsform ist die spaltbare Nucleinsäure-Verbindung so konzipiert, dass die Sequenz der spaltbaren Verbindung die jeweilige nachzuweisende Sequenz, d.h. den Bereich der mutmaßlichen Fehlpaarung, widerspiegelt.
  • In einigen Ausführungsformen des Fehlpaarungsnachweises ist die Rate der Bildung der freigesetzten Fragmente so, dass die Verfahren im Wesentlichen ein Ja/Nein-Ergebnis liefern, wobei der Nachweis von praktisch jedem freigesetzten Fragment auf die Gegenwart der gewünschten Zielsequenz hinweist. Typischerweise jedoch bilden sich einige wenige gespaltene Sequenzen auch dann, wenn nur eine minimale Fehlpaarung vorliegt (beispielsweise eine 1-, 2- oder 3-Basenfehlpaarung oder eine 3-Basendeletion), obwohl die Zielsequenz nicht gegenwärtig ist. Demnach wird die Rate der Bildung gespaltener Fragmente und/oder die letztendliche Menge der gespaltenen Fragmente quantifiziert, um die Gegenwart oder Abwesenheit des Ziels zu bestimmen. Zudem kann die Verwendung sekundärer und tertiärer abspaltbarer Sonden in dieser Ausührungsform besonders nützlich sein, da diese den Unterschied zwischen einer korrekten Paarung und einer Fehlpaarung verstärken können. Diese Verfahren sind insbesondere bei der Bestimmung des homozygoten oder heterozygoten Zustand eines Patienten dienlich.
  • In dieser Ausführungsform ist es ein wichtiges Merkmal der spaltbaren Verbindung, dass ihre Länge durch die vermutete Differenz zwischen Ziel und Sonde bestimmt wird. Im Besonderen bedeutet dies, dass die spaltbare Verbindung lang genug ist, um die vermutete Differenz zu umfassen, und kurz genug, sodass die spaltbare Verbindung nicht unangebrachterweise an das jeweilige Nucleinsäuremolekül "spezifisch hybridisieren" kann, wenn die vermutete Differenz vorhanden ist; eine derartige unangemessene Hybridisierung würde das Abtrennen oder Spalten der spaltbaren Verbindungen auch dann zulassen, wenn das gewählte Nucleinsäuremolekül nicht zur Gänze zur Nucleinsäuresonde komplementär ist. Deshalb ist in einer bevorzugten Ausführungsform die spaltbare Verbindung zwischen 3 und 5 Nucleotide lang, sodass eine vermutete Nucleotiddifferenz von 1 bis 3 Nucleotiden von der spaltbaren Verbindung umfasst wird und sich 0, 1 oder 2 Nucleotide an jeder Seite der Differenz befinden.
  • Ist die spaltbare Verbindung eine Nucleinsäure, so setzen bevorzugte Ausführungsformen 1 bis etwa 100 Nucleotide ein, wobei etwa 2 bis etwa 20 bevorzugt und etwa 5 bis etwa 10 noch bevorzugter sind.
  • CPT kann enzymatisch oder chemisch ausgeführt werden. Das bedeutet, dass neben RNAseH auch zahlreiche andere Spaltmittel zum Spalten von spaltbaren RNA-Bindungen (und anderer Nucleinsäure-Bindungen). So wurde beispielsweise von zahlreichen chemischen Nucleasen berichtet; vgl. beispielsweise Sigman et al., "Annu. Rev. Biochem.", 59, 207–236, 1990; Sigman et al., "Chem. Rev.", 93, 2295–2316, 1993; Bashkin et al., "J. Org. Chem.", 55, 5125–5132, 1990; und Sigman et al., "Nuclear Acids and Molecular Biology", Band 3, 13–27, F. Eckstein und D.M.J. Lilley (Hrsg.), Springer-Verlag, Heidelberg, 1989.
  • Spezifische RNA-Hydrolyse ist ebenfalls ein sehr aktives Gebiet dar; vgl. beispielsweise Chin, "Acc. Chem. Res.", 24, 145–152, 1991; Breslow et al., "Tetrahedron", 47, 2365–2376, 1991; Anslyn et al., "Angew. Chem. Int. Ed. Engl.", 36, 432–450, 1997; und darin enthaltene Literaturverweise.
  • Reaktive Phosphatzentren sind ebenfalls bei der Entwicklung von spaltbaren Verbindungen von Bedeutung; vgl. Hendry et al., "Prog. Inorg. Chem: Bioinorganic Chem.", 31, 201–258, 1990.
  • Die jüngsten Ansätze bezüglich Stellen-gerichteter RNA-Hydrolyse schließen die Konjugation einer reaktiven Gruppierung, die imstande ist, Phosphordiesterbindungen an einem Erkennungselement zu spalten, das zu sequenzspezifischen Hybridisierung an RNA fähig ist. In den meisten Fällen ist ein Metallkomplex kovalent an einen DNA-Strang gebunden, der einen stabilen Heteroduplex bildet. Bei der Hybridisierung wird eine Lewis-Säure sehr nah an das RNA-Rückgrat gebunden, um Hydrolyse zu vollziehen; vgl. Magda et al., "J. Am. Chem. Soc.", 116, 7439, 1994; Hall et al., "Chem. Biology", 1, 185–190, 1994; Bashkin et al., "J. Am. Chem. Soc.", 116, 5981–5982, 1994; Hall et al., "Nucleic Acids Res.", 24, 3522, 1996; Magda et al., "J. Am. Chem. Soc.", 110, 2293, 1997; und Magda et al., "J. Am. Chem. Soc.", 119, 6947, 1997.
  • Auf ähnliche Weise zeigte sich, dass DNA-Polyamin-Konjugate Stellen-gerichtete RNA-Strangspaltung initiieren; vgl. beispielsweise Yoshinari et al., "J. Am. Chem. Soc.", 113, 5899–5901, 1991; Endo et al., "J. Org. Chem.", 62, 846, 1997; und Barbier et al., "J. Am. Chem. Soc.", 114, 3511–3515, 1992.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die spaltbare Verbindung nicht notwendigerweise RNA. Beispielsweise können chemische Spaltgruppierungen zur Spaltung basischer Stellen von Nucleinsäuren eingesetzt werden; vgl. Belmont et al., "New J. Chem.", 21, 47–54, 1997; sowie darin enthaltene Verweise. Auf ähnliche Weise können auch lichtspaltbare Gruppierungen, beispielsweise unter Verwendung von Übergangsmetallen, verwendet werden; vgl. Moucheron et al., "Inorg. Chem.", 36, 584–592, 1997.
  • Andere Ansätze beruhen auf chemischen Gruppierungen oder Enzymen; vgl. beispielsweise Keck et al., "Biochemistry", 34, 12029–12037, 1995; Kirk et al., "Chem. Commun.", 1998, im Druck; Spaltung von G-U-Basenpaaren durch Metallkomplexe; vgl. "Biochemistry", 31, 5423–5429, 1992; Diaminkomplexe zur Spaltung von RNA; Komiyama et al., "J. Org. Chem.", 62, 2155–2160, 1997; und Chow et al., "Chem. Rev.", 97, 1489–1513, 1997, und darin enthaltene Verweise.
  • Der erste Schritt des CPT-Verfahrens beinhaltet die Hybridisierung eines primären abspaltbaren Primers (auch als abspaltbare Sonde bezeichnet) an das Ziel. Dies wird vorzugsweise bei einer Temperatur durchgeführt, die sowohl die Bindung der längeren primären Sonde als auch die Abtrennung der kürzeren, gespaltenen Abschnitte der primären Sonde möglich ist, was für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich ist. So wie hierin beschrieben kann dies in Lösung vollzogen werden, oder es wird entweder das Ziel oder eine oder mehrere spaltbare Sonden auf einem festen Träger angebracht. Beispielsweise ist es möglich, "Ankersonden" auf einem festen Träger auf dem Testsubstrat zu verwenden, die zu einem Abschnitt der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär sind, vorzugsweise zu einer Sequenz, die nicht dieselbe Sequenz ist, an die auch eine spaltbare Sonde bindet. Auf ähnliche Weise sind, so wie hierin dargelegt, in einer bevorzugten Ausführungsform eine oder mehrere der spaltbaren Sonden auf einem festen Träger angebracht, wie beispielsweise auf einer Perle (derartige Amplifikationsperlen sind von den nachstehend beschriebenen Detektionsanordnungsperlen zu unterschieden). In dieser Ausführungsform diffundiert das lösliche Ziel, um die Bildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen der löslichen Zielsequenz und der trägergebundenen abspaltbaren Sonde zu ermöglichen. In dieser Ausführungsform ist es gegebenenfalls wünschenswert, zusätzliche spaltbare Verbindungen in die abspaltbaren Sonden einzuführen, um die Freisetzung von zwei oder mehr Sondensequenzen zuzulassen, sodass mehr als eine Sondensequenz pro spaltbare Sonde nachgewiesen werden kann, wie nachstehend erläutert wird, und zwar mit dem Zweck der maximalen Signalverstärkung.
  • Bei dieser Ausführungsform (genauso wie bei anderen Verfahren hierin) setzen bevorzugte Vorgehensweisen Schnitt- oder Brechverfahren zum Zuschneiden der Nucleinsäuresonde, die die Zielsequenz enthält, zu einer Größe, die eine ausreichende Diffusion der Zielsequenz auf der Oberfläche einer Perle zulässt. Dies kann durch Brechen der Nucleinsäure mittels mechanischer Kräfte oder durch Spalten der Nucleinsäure unter Verwendung von Restriktionsendonucleasen erzielt werden. Alternativ dazu kann ein das Ziel enthaltendes Fragment unter Verwendung von Polymerase, Primer und der Probe als Matrize, so wie in der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), erhalten werden. Zudem kann auch eine Amplifikation des Ziels unter Einsatz von PCR oder LCR und verwandten Verfahren durchgeführt werden; dies kann insbesondere dann nützlich sein, wenn die Zielsequenz in der Probe in sehr geringen Kopienzahl vorhanden ist. Auf ähnliche Weise sind auch zahlreiche andere Verfahren auf dem Gebiet der Erfindung zur Steigerung der Misch- und Hybridisierungsrate bekannt, einschließlich Rühren, Erwärmen, Verfahren zur Erhöhung der Gesamtkonzentration, wie beispielsweise Ausfällen, Trocknen, Dialyse, Zentrifugation, Elektrophorese, Magnetperlenkonzentration usw.
  • Im Allgemeinen werden die spaltbaren Sonden in molarem Überschuss zu ihren Zielen (einschließlich beider Zielsequenzen und anderer spaltbarer Sonden, beispielsweise wenn sekundäre und tertiäre spaltbare Sonden eingesetzt werden) eingeführt, wobei das Verhältnis spaltbare Sonde:Ziel vorzugsweise zumindest 100:1, noch bevorzugter zumindest 1.000:1, insbesondere zumindest 10.000:1, beträgt. In einigen Ausführungsformen ist der Überschuss Sonde:Ziel noch viel größer. Derartige Verhältnisse können bei allen hierin beschriebenen Amplifikationsverfahren eingesetzt werden.
  • Hat sich der Hybridisierungskomplex zwischen der primären spaltbaren Sonde und dem Ziel gebildet, so wird der Komplex nun Spaltungsbedingungen ausgesetzt. Wie sich versteht hängt dies von der Zusammensetzung der spaltbaren Sonde ab; ist die se RNA, so wird RNAseH eingeführt. Es sollte festgehalten werden, dass unter bestimmten Umständen, wie sie beispielsweise in der WO 95/00666 und WO 95/00667 allgemein beschrieben sind, die Verwendung eines doppelsträngigen Bindemittels, wie beispielsweise RNAseH, gegebenenfalls ein Fortschreiten der Reaktion auch bei Temperaturen über dem Fp. des primäre Sonde:Ziel-Hybridisierungskomplexes ermöglicht. Dementsprechend kann der Zusatz der spaltbaren Sonde zum Ziel entweder vor der Einführung des Spaltmittels oder der Spaltbedingungen durchgeführt werden, oder die Sonden werden in Gegenwart des Spaltmittels oder der Spaltbedingungen zugesetzt.
  • Die Spaltbedingungen führen zur Trennung der zwei (oder mehr) Sondensquenzen der primären spaltbaren Sonde. Ergebnis ist, dass die kürzeren Sonden nicht mehr an der Zielsequenz hybridisert bleiben, wodurch sich der Hybridisierungskomplex auflöst und die Zielsequenz intakt bleibt. Die optimale Temperatur zur Durchführung von CPT-Reaktionen liegt im Allgemeinen bei etwa 5 °C bis etwa 25 °C unter dem Schmelzpunkt des Sonde:Ziel-Hybridisierungskomplexes. Dies erlaubt eine schnelle Hybridisierungsrate und einen hohen Grad an Spezifität für die Zielsequenz. Der Fp. des jeweiligen Hybridisierungskomplexes hängt von der Salzkonzentration, dem GC-Gehalt und der Länge des Komplexes ab, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist und hierin dargelegt wird.
  • Während der Reaktion kann es notwendig sein, wie auch bei den anderen Amplifikationsverfahren hierin, die Spaltung der Sonde sowie der Zielsequenz mithilfe von nichtspezifischen Nucleasen zu unterdrücken. Derartige Nucleasen werden im Allgemeinen während der Isolierung der DNA durch Wärme- oder Extraktionsverfahren aus der Probe entfernt. Mehrere Hemmer für einsträngige Nucleasen, wie beispielsweise Vanadat, die Hemmer it-ACE und RNAsin, ein Placenta-Protein, beeinträchtigen die RNAseH-Aktivität nicht. Dies kann, abhängig von der Reinheit der RNAseH und/oder der Zielsequenz nicht notwendig sein.
  • Diese Schritte werden wiederholt, indem die Reaktion über einen Zeitraum hinweg fortschreiten gelassen wird. Die Reaktion wird üblicherweise für etwa 15 Minuten bis etwa 1 Stunde durchgeführt. Im Allgemeinen wird jedes Molekül der Zielsequenz in diesem Zeitraum zwischen 100 und 1.000 Mal umgesetzt, je nach Länge und Sequenz der Sonde, den spezifischen Reaktionsbedingungen und dem Spaltverfahren. Beispielsweise werden für jede Kopie der Zielsequenz, die in der Testprobe gegenwärtig ist, 100 bis 1.000 Moleküle durch RNAseH gespalten. Ein höherer Amplifikationsgrad kann dadurch erzielt werden, dass der Reaktion ein längeres Fortschreiten gewährt wird oder dass, wie hierin dargelegt ist, sekundäre tertiäre oder quartäre Sonden verwendet werden.
  • Nach Vollendung der Reaktion, was üblicherweise durch Zeit oder Ausmaß der Spaltung bestimmt wird, müssen die nichtgespaltenen Sonden vor dem Nachweis entfernt oder neutralisiert werden, sodass ein Binden der nichtgespaltenen Sonden an eine Detektionssonde verhindert wird, was sonst zu fälschlich positiven Signalen führen würde. Dies kann auf verschiedene Weisen erfolgen, wie nachstehend allgemein beschrieben wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Trennung durch die Verwendung eines festen Trägers (entweder eine innere Oberfläche der Vorrichtung oder im Inneren der Vorrichtung befindliche Perlen), der die primäre Sonde enthält, erleichtert. Werden die spaltbaren Sonden auf dem Träger angebracht, so kann ein Vorbeifließen der Sonde am festen Träger zur Entfernung der nichtgespaltenen Sonden führen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform basiert die Trennung auf der Gelelektrophorese der Reaktionsprodukte zur Trennung der längeren, nichtgespaltenen Sonde von den kürzeren, gespaltenen Sondensequenzen, so wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und hierin beschrieben ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform basiert die Trennung auf einer Fällung mit starker Säure. Dies ist zur Trennung von langen (im Allgemeinen länger als 50 Nucleotide) Fragmenten von kürzeren (im Allgemeinen etwa 10 Nucleotide) Fragmenten vonnutzen. Die Einführung einer starken Säure, wie beispielsweise Trichloressig säure, in die Lösung (im Allgemeinen aus einem Speichermodul heraus) verursacht das Ausfällen der längeren Sonde, während die kleineren, gespaltenen Fragmente in Lösung verbleiben. Fritten oder Filter können zur Entfernung des Niederschlags eingesetzt werden, und die gespaltenen Sondensequenzen können quantfiziert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die gespaltenen Sonden eine nachweisbare Markierung und einen Affinitätsbindungsliganden oder -gruppierung, sodass ein Affinitätsträger eingesetzt werden kann, um die Trennung zu vollziehen. In dieser Ausführungsform ist es wichtig, dass die nachweisbare Markierung, die zur Detektion verwendet wird, nicht dieselbe Sondensequenz ist, die die Affinitätsgruppierung enthält, sodass die Entfernung der nichtgespaltenen Sonde und der gespaltenen, die Affinitätsgruppierung enthaltenden Sonde nicht die alle nachweisbaren Markierungen entfernt. Geeignete Affinitätsgruppierungen schließen Biotin-Avidin-Streptavidin, Lectine, Haptene, Antikörper usw. ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der Bindungspartner der Affinitätsgruppierung ist an einem festen Träger gebunden (erneut entweder an einer inneren Oberfläche der Vorrichtung oder an im Inneren der Vorrichtung befindlichen Perlen), und das Vorbeifließen der Sonde am Träger wird genutzt, um die nichtgespaltenen Sonden herauszuziehen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Die gespaltenen Sondensequenzen, die keine Affinitätsgruppierung enthalten, bleiben in Lösung und können dann, wie nachstehend dargelegt, entfernt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, die der obigen Ausführungsform ähnlich ist, wird eine Nucleinsäure-Trennsequenz in die spaltbare Sonde eingeführt, die während der Reaktion nicht gespalten wird. Ein zur Trennsequenz komplementäre Nucleinsäure wird an einen festen Träger gebunden und dient als Fängersequenz. Vorzugsweise wird die Trennsequenz den spaltbaren Sonden zugesetzt und wird nicht von der Zielsequenz nicht erkannt, sodass eine generalisierte Fängersequenz in einer Vielzahl von Tests eingesetzt werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die nichtgespaltene Sonde durch den Zusatz einer im Wesentlichen komplementären Neutralisierungsnucleinsäure, im All gemeinen aus einem Speichermodul heraus, neutralisiert. Dies ist in Ausführungsformen, die Fängersequenzen als Trennsequenzen einsetzen, und in Einstufensystemen besonders nützlich, da das Komplement zu einer Sonde, das Fängersequenzen enthält, aufgrund der Länge weitaus stabilere Hybridisierungskomplexe bildet als der gespaltene Sonde-Detektionssonde-Komplex. Wichtig ist, dass die nichtgespaltene Sonde nicht zur Bindung an eine für gespaltene Sonden spezifische Detektionssonde zur Verfügung steht. Deshalb wird dieser Schritt in einer Ausführungsform im Detektionsmodul vollzogen, und die Neutralisierungsnucleinsäure ist eine Detektionssonde auf der Oberfläche des Anordnungssubstrats, an einer separaten "Adresse", sodass das Signal vom Hybridisierungskomplex nicht zum Signal der gespaltenen Fragmente beiträgt. Alternativ dazu kann die Neutralisierungsnucleinsäure an einem festen Träger gebunden sein; die Probe fließt zum Quenchen der Reaktion an der Neutralisierungsoberfläche vorbei und tritt somit nicht das Detektionsmodul ein.
  • Nach der Entfernung oder Neutralisierung der nichtgespaltenen Sonde wird der Nachweis durch den Zusatz der gespaltenen Sondensequenzen zum Detektionsmodul durchgeführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden keine Sonden höherer Ordnung verwendet, und der Nachweis basiert auf der/den Sondensequenzen) des primären Primers. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zumindest eine, vorzugsweise mehrere, sekundäre Sonden verwendet (hierin auch als sekundäre Primer bezeichnet). Die sekundären spaltbaren Sonden können der Reaktion auf verschiedene Arten zugesetzt werden. Wichtig ist hier zu verhindern, dass die sekundären spaltbaren Sonden an den nichtgespaltenen primären Sonde hybridisieren, da dies zur Erzeugung eines fälschlich positiven Signals führt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die primären und sekundären Sonden an feste Träger gebunden. Ausschließlich bei der Hybridisierung der primären Sonden mit dem Ziel, die zur Spaltung und Freisetzung der primären Sondensequenzen von der Perle führt, können die nun diffundierbaren primären Sondensequenzen an die sekundären Sonden binden. Im Gegenzug dienen die primären Sondensequenzen als Ziel für die sekundären spaltbaren Sonden, was zur Spaltung und Freisetzung der sekundären Sondensequenzen führt. In einer alternativen Ausführungsform wird die gesamte Reaktion in Lösung vollzogen. In dieser Ausführungsform werden die primären Sonden zugesetzt, woraufhin die Reaktion für einen Zeitraum fortschreiten gelassen wird, und die nichtgespaltenen primären spaltbaren Sonden werden wie oben beschrieben entfernt. Daraufhin werden die sekundären Sonden zugesetzt, und die Reaktion schreitet fort. Die sekundären nichtgespaltenen Sonden werden dann entfernt, und die gespaltenen Sonden werden, wie allgemein hierin dargelegt, nachgewiesen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden zumindest ein, vorzugsweise mehr, tertiäre Sonden eingesetzt. Die tertiären spaltbaren Sonden können der Reaktion auf verschiedene Arten zugesetzt werden. Wichtig ist hier zu verhindern, dass die tertiären spaltbaren Sonden an den nichtgespaltenen sekundären Sonde hybridisieren, da dies zur Erzeugung eines fälschlich positiven Signals führt. Diese Verfahren werden allgemein wie oben beschrieben durchgeführt. Analog dazu können auch quartäre Sonden auf die zuvor beschriebene Weise verwendet werden.
  • CPT benötigt somit, erneut in keiner bestimmten Reihenfolge, einen ersten CPT-Primer, der eine erste Sondensequenz umfasst, eine spaltbare Verbindung und eine zweite Sondensequenz; sowie ein Spaltmittel.
  • Auf diese Weise erzeugt CTP eine große Menge an gespaltenen Primer, dann auf die nachstehend dargelegte Weise nachgewiesen werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Signalamplifikationsverfahren ein "Sandwich"-Test, wie allgemein in der WO 99/37819 und in den U.S.-Patenten Nr. 5.681.702, 5.597.909, 5.545.730, 5.594.117, 5.591.584, 5.571.670, 5.580.731, 5.571.670, 5.591.584, 5.624.802, 5.635.352, 5.594.118, 5.359.100, 5.124.246 und 5.681.697 beschrieben. Obwohl Sandwich-Tests nicht zu einer Veränderung der Primer führen, können Sandwich-Tests als Signalamplifikationsverfahren betrachtet werden, da multiple Signale (d.h. Markersonden) an ein einziges Ziel gebunden werden, was zur Verstärkung des Signals führt. Sandwich-Tests werden eingesetzt, wenn die Zielsequenz nur wenige oder keine nachweisbaren Markierungen umfas sen; d.h., wenn eine sekundäre, die Markierungen umfassende Sonde zur Signalerzeugung eingesetzt wird.
  • Wie hierin erörtert wird sollte angemerkt werden, dass die Sandwich-Tests zum Nachweis von primären Zielsequenzen (z.B. einer Patientenprobe) oder auch als Verfahren zum Nachweis des Produkts einer wie oben beschriebenen Amplifikationsreaktion eingesetzt werden können; so kann beispielsweise ein jeder der obigen neu synthetisierten Stränge, beispielsweise unter Verwendung von PCR, LCR, NASBA, SDA usw., als die "Zielsequenz" in einem Sandwich-Test verwendet werden.
  • Im Allgemeinen können Sandwich-Verfahren wie folgt beschrieben werden. Die nachstehend beschriebenen Reaktionen können entweder in Reaktionsmodul mit folgendem Transfer zum Detektionsmodul zum Zweck des Nachweises oder im Detektionsmodul mit Zusatz der benötigten Komponenten durchgeführt werden; um für mehr Klarheit zu sorgen werden beide gemeinsam erörtert.
  • Einleitend soll gesagt werden, dass, wie in Folge detaillierter beschrieben wird, Fänger-Extendersonden der Zielsequenz zum Anbinden an die Perlen im Detektionsmodul zugesetzt werden können.
  • Die Verfahren umfassen den Zusatz einer Amplifikatorsonde, die an die Zielsequenz entweder direkt oder durch die Verwendung einer oder mehrerer Marker-Extendersonden hybridisert wird, die dazu dienen, die Bildung einer "generischen" Amplifikatorsonde zuzulassen. Vorzugsweise umfasst die Amplifikatorsonde ein Vielzahl von Amplifikationssequenzen, obwohl, wie nachstehend beschrieben, in einigen Ausführungsformen die Amplifikatorsonde gegebenenfalls auch nur eine einzige Amplifikationssequenz, oder zumindest zwei Amplifikationssequenzen, enthält. Die Amplifikatorsonde kann mehrere verschiedene Formen annehmen; entweder eine verzweigte Struktur, eine Dendrimer-Struktur oder eine lineare "Kette" von Amplifikationssequenzen. Markersonden, die nachweisbare Markierungen umfassen, hybridisieren dann an den Amplifikationssequenzen (oder in einigen Fällen hybridisieren die Mar kersonden direkt an die Zielsequenz), und die Markierungen werden auf die nachstehend detaillierter beschriebene Weise nachgewiesen.
  • Wie sich für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung versteht können die Systeme der Erfindung eine Vielzahl unterschiedlicher Formen annehmen. Im Allgemeinen gibt es drei Systemtypen, die verwendet werden können: (1) "Nicht-Sandwich"-Systeme (hierin auch als "direkter" Nachweis bezeichnet), bei denen die Zielsequenz selbst markiert wird (erneut entweder weil die Primer Markierungen umfassen oder weil markierte Nucleotide in die neu synthetisierten Stränge inkorporiert wurden); (2) Systeme, in denen Markersonden direkt an die Zielanalyten binden; und (3) Systeme, in denen Markersonden indirekt an die Zielanalyten gebunden werden, beispielsweise durch die Verwendung einer Amplifikatorsonde.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die eine Amplifikatorsonde umfassen. Unter "Amplifikatorsonde" oder "Nucleinsäure-Multimer" oder "Amplifikationsmultimer" oder gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin eine Nucleinsäure zu verstehen, die zur Vereinfachung der Signalamplifikation verwendet wird. Amplifikatorsonden umfassen zumindest eine einsträngige Nucleinsäuresondensequenz, wie nachstehend definiert, und zumindest eine einsträngige Nucleinsäureamplifikationssequenz, wobei eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen bevorzugt sind.
  • Amplifikatorsonden umfassen eine erste Sondensequenz, die entweder direkt oder indirekt zur Hybridisierung an die Zielsequenz eingesetzt wird. Das bedeutet, dass die Amplifikatorsonde selbst gegebenenfalls eine erste Sondensequenz aufweist, die im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist, oder dass sie eine erste Sondensequenz aufweist, die im Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt einer zusätzlichen Sonde ist, die in diesem Fall als Marker-Extendersonde bezeichnet wird, die einen ersten Abschnitt aufweist, der im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde im Wesentlichen komplementär zur Zielsequenz.
  • Im Allgemeinen gilt, so wie für alle Sonden hierin, dass die erste Sondensequenz ausreichend lang ist, um Spezifität und Stabilität zu gewährleisten. Deshalb sind die so konzipierten Sondensequenzen der Erfindung, dass die an eine andere Nucleinsäure (d.h. Sondensequenzen, Amplifikatorsequenzen, Abschnitte oder Domänen größerer Sonden) hybridisieren, zumindest etwa 5 Nuceloside lang, wobei zumindest 10 bevorzugt und zumindest 15 noch bevorzugter sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden mehrere unterschiedliche Amplifikatorsonden verwendet, wobei jede erste Sondensequenzen besitzt, die an einen jeweils anderen Abschnitt der Zielsequenz hybridisieren. Somit kommt es zu mehr als einer Amplifikationssutufe; die Amplifikatorsonde stellt die Verstärkung des Signals aufgrund einer Vielzahl an Markierungsvorgängen bereit, und unterschiedliche Amplifikatorsonden, von denen jede diese Vielzahl an Markierungen aufweist, wird für jede Zielsequenz eingesetzt. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden demnach zumindest zwei unterschiedliche Pools an Amplifikatorsonden, wobei jeder Pool eine unterschiedliche Sondensequenz zur Hybridisierung an unterschiedliche Abschnitte der Zielsequenz aufweist; die einzige tatsächliche Beschränkung der Anzahl an verschiedenen Sonden ist die Länge der ursprünglichen Zielsequenz. Zudem besteht die Möglichkeit, dass verschiedene Amplifikatorsonden unterschiedliche Amplifikationssequenzen enthalten, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert die Amplifikatorsonde nicht direkt an der Probenzielsequenz, sondern hybridisert statt dessen an einen ersten Abschnitt der Marker-Extendersonde. Dies ist insbesondere zur Ermöglichung der Verwendung von "generischen" Amplifikatorsonden von Bedeutung, d.h. von Amplifikatorsonden, die mit einer Vielzahl unterschiedlicher Ziele eingesetzt werden können. Dies ist gegebenenfalls wünschenswert, weil mehrere der Amplifikatorsonden spezieller Syntheseverfahren bedürfen, beispielsweise wenn eine verzweigte Struktur verwendet wird. Deshalb ist der Zusatz einer relativ kurzen Sonde als Marker-Extendersonde bevorzugt. Die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde ist somit im Wesentlichen zu einem ersten Abschnitt oder Domäne einer ersten einsträngigen Marker-Extender-Nucelinsäuresonde komplementär. Die Marker-Extendersonde enthält weiters einen zweiten Abschnitt oder Domäne, der zu einem Abschnitt der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär ist. Jeder dieser Abschnitte ist vorzugsweise zumindest etwa 10 bis etwa 50 Nucleotide lang, wobei ein Bereich von etwa 15 bis etwa 30 bevorzugt ist. Die Bezeichnungen "erster" und "zweiter" sind nicht dazu da, auf die Ausrichtung der Sequenz in Bezug auf die 5'-3'-Ausrichtung des Ziels oder der Sondensequenzen hinzuweisen. Wird beispielsweise eine 5'-3'-Ausrichtung der komplementären Zielsequenz angenommen, so kann der erste Abschnitt sowohl 5' zum zweiten Abschnitt als auch 3' zum zweiten Abschnitt angeordnet sein. Aus praktischen Gründen wird die Reihenfolge der Sequenz hierin von links nach rechts beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann mehr als eine Marker-Extendersonde-Amplifikatorsonde-Paar eingesezt werden. Das heißt, dass eine Vielzahl an Marker-Extendersonden verwendet werden können, von denen jede einen zu einem jeweils anderen Abschnitt der Zielsequenz komplementären Abschnitt aufweist; dies kann als weitere Stufe der Amplifikation dienen. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet somit einen Pool von zumindest zwei Marker-Extendersonden, wobei die Obergrenze durch die Länge der Zielsequenz festgesetzt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird mehr als eine Marker-Extendersonde mit einer einzigen Amplifikatorsonde verwendet, um nichtspezifische Bindung einzudämmen, wie allgemein im U.S.-Patent Nr. 5.681.697 beschrieben, welches hiermit durch Verweis aufgenommen ist. In dieser Ausführungsform hybridisiert ein erster Abschnitt der ersten Marker-Extendersonde an einen ersten Abschnitt der Zielsequenz, und der zweite Abschnitt der ersten Marker-Extendersonde hybridisiert an eine erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde. Ein erster Abschnitt der zweiten Marken-Extendersonde hybridisiert an einen zweiten Abschnitt der Zielsequenz, und der zweite Abschnitt der zweiten Marker-Extendersonde hybridisiert an eine zweite Sondensequenz der Amplifikatorsonde. Diese bilden Strukturen aus, die manchmal als "Kreuz"-Strukturen oder -Konfigurationen bezeichnet werden, und werden im Allge meinen durchgeführt, um bei der Verwendung von verzweigten oder Dendrimer-Amplifikatorsonden für Stabilität zu sorgen.
  • Zudem kann, was für Fachleute auf dem Gebiet ersichtlich ist, die Marker-Extendersonde gegebenenfalls mit einer nachstehend beschriebenen Präamplifikatorsonde anstatt direkt mit der Amplifikatorsonde wechselwirken.
  • Ähnlich wie zuvor beschrieben verwendet eine bevorzugte Ausführungsform mehrere unterschiedliche Amplifikatorsonden, von denen eine jede eine erste Sondensequenz umfasst, die an einen jeweils anderen Abschnitt der Marker-Extendersonde hybridisiert. Weiters ist es, wie oben beschrieben, zudem möglich dass die verschiedenen Amplifikatorsonden unterschiedliche Amplifikationssequenzen enthalten, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt ist.
  • Zusätzlich zur ersten Sondensequenz umfasst die Amplifikatorsonde zumindest eine Amplifikationssequenz. "Amplifikationssequenz" oder "Amplifikationssegment" oder gleichwertige Bezeichnungen stehen hierin für eine Sequenz, die entweder zur direkten oder zur indirekten Bindung an einen ersten Abschnitt einer Markersonde eingesetzt wird, wie in Folge noch detaillierter beschrieben wird (obwohl in einigen Fällen die Amplifikationssequenz gegebenenfalls direkt an eine Detektionssonde bindet). Vorzugsweise umfasst die Amplifikatorsonde eine Vielzahl an Amplifikationssequenzen, wobei etwa 3 bis etwa 1.000 bevorzugt, etwa 10 bis etwa 100 noch bevorzugter, und etwa 50 am meisten bevorzugt sind. In einigen Fällen, insbesondere wenn lineare Amplifikatorsonden verwendet werden, sind 1 bis etwa 20 bevorzugt und etwa 5 bis etwa 10 besonders bevorzugt.
  • Die Amplifikationssequenzen können auf verschiedenste Weisen miteinander verbunden sein, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung klar ist. Sie können direkt kovalent aneinander oder an Zwischensequenzen oder chemischen Gruppierungen durch Nucleinsäure-Bindungen, wie beispielsweise Phosphordiesterbindungen, PNA-Bindungen usw., oder durch dazwischen liegende Bindemittel, wie beispielsweise Aminosäure-, Kohlenhydrat- oder Polyolbrücken oder durch andere Vernetzen oder Bindungspartner gebunden sein. Die Verbindungstelle(n) können an den Enden eines Segments und/oder an einem oder mehreren Nucleotiden im Strang liegen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Amplifikationssequenzen über Nucleinsäure-Bindungen angebunden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden verzweigte Amplifikatorsonden verwendet, wie allgemein im U.S.-Patent Nr. 5.124.246 beschrieben. Verzweigte Amplifikatorsonden können eine "gabelähnliche" oder eine "kammähnliche" Struktur aufweisen. "Gabelähnliche" verzweigte Amplifikatorsonden verfügen im Allgemeinen über drei oder mehr Oligonucleotidsegmente, die sich von einem Ausgangspunkt aus zur Bildung einer verzweigten Struktur erstrecken. Der Ausgangspunkt ist gegebenenfalls ein anderes Nucleotidsegment oder ein multifunktionelles Molekül, an dem zumindest drei Segmente kovalent oder eng gebunden sein können. "Kammähnliche" verzweigte Amplifikatorsonden haben ein lineares Rückgrat mit einer Vielzahl an Seitenkettennucleotiden, die sich vom Rückgrat aus erstrecken. In beiden Strukturen hängen die seitenständigen Segmente von einem modifizierten Nucleotid oder einer anderen organischen Gruppierung mit angemessenen funktionellen Gruppen zur Bindung von Oligonucleotiden ab. Weiters stehen in beiden Strukturen eine große Anzahl an Amplifikationssequenzen zur direkten oder indirekten Bindung an Detektionssonden zur Verfügung. Im Allgemeinen werden diese Strukturen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, unter Verwendung von modifizierten multifunktionellen Nucleotiden hergestellt, wie unter anderem in den U.S.-Patenten Nr. 5.635.352 und Nr. 5.124.246 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Dendrimer-Sonden eingesetzt, wie allgemein im U.S.-Patent Nr. 5.175.270 beschrieben. Dendrimer-Amplifikatorsonden weisen Amplifikationssequenzen auf, die mittels Hybridisierung gebunden sind, und verfügen somit über Abschnitte einer doppelsträngigen Nucleinsäure als Komponente ihrer Struktur. Die äußere Oberfläche der Dendrimer-Amplifikatorsonde weist eine Vielzahl von Amplifikationssequenzen auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden lineare Amplifikatorsonden eingesetzt, die über individuelle Amplifikationssequenzen verfügen, die an ihren Enden entweder direkt oder über kurze Zwischensequenzen zur Bildung eines Polymers miteinander verbunden sind. So wie bei den anderen Amplifikatorstrukturen können zusätzliche Sequenzen oder Gruppierungen zwischen den Amplifikationssequenzen gegenwärtig sein.
  • In einer Ausführungsform weist die lineare Amplifikatorsonde eine einzige Amplifikationssequenz auf. In einer bevorzugten Ausführungsform jedoch umfasst die lineare Amplifikatorsonde ein Vielzahl an Amplifikationssequenzen.
  • Zusätzlich kann die Amplifikatorsonde völlig linear, völlig verzweigt, ein völliges Dendrimer oder jedwede Kombination davon sein.
  • Die Amplifikationssequenzen der Amplifikatorsonde werden zur direkten oder indirekten Bindung einer Markersonde verwendet, um einen Nachweis zu ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Amplifikationssequenzen der Amplifikatorsonde zu einem ersten Abschnitt einer Markersonde im Wesentlichen komplementär. Alternativ dazu werden Amplifkator-Extendersonden eingesetzt, die einen an die Amplifikationssequenz bindenden ersten Abschnitt und einen an den ersten Abschnitt der Markersonde bindenden zweiten Abschnitt aufweisen.
  • Zudem umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung gegebenenfalls "Präamplifikator"-Moleküle, die als Bindungsgruppierung zwischen den Marker-Extender-Molekülen und den Amplifikatorsonden dienen.
  • Somit sind die Markersonden entweder zu einer Amplifikationssequenz oder zu einem Abschnitt der Zielsequenz im Wesentlichen komplementär.
  • Der Nachweis der Amplifikationsreaktionen der Erfindung, einschließlich des direkten Nachweises der Amplifikationsprodukte und des indirekten Nachweises unter Verwendung von Markersonden (d.h. Sandwich-Tests), wird durch Detektieren von Test komplexen, die die als Komponente des Hybridisierungskomplexes angebundenen Markierungen umfassen, durchgeführt.
  • Zudem kann, wie im U.S.-Patent Nr. 5.587.128 beschrieben, die Reaktionskammer eine Zusammensetzung, entweder in Lösung oder an der Oberfläche der Reaktionskammer angebracht, umfassen, die die Hemmung einer Amplifikationsreaktion durch die Zusammensetzung der Vertiefung verhindert. Beispielsweise können die Wandoberflächen mit einem Silan, beispielsweise unter Verwendung eines Silanisierungsreagens, wie beispielsweise Dimethylchlorsilan, oder mit einem Siliconisierungsreagens, wie beispielsweise AquasilTM oder SurfacilTM (Pierce, Rockford, IL), die Organosilane mit einer hydrolysierbaren Gruppe sind, beschichtet sein. Diese hydrolysierbare Gruppe kann in Lösung hydrolysieren, um ein Silanol zu bilden, das polymerisieren und einen dicht angebundenen Film auf der Oberfläche der Kammer bilden kann. Die Beschichtung umfasst gegebenenfalls auch einen Blocker, der mit dem Film zur weiteren Reduktion der Hemmung reagieren kann; geeignete Blocker sind unter anderem Aminosäurepolymere und Polymere, wie beispielsweise Polyvinylpyrrolidon, Polyadenylsäure und Polymaleimid. Alternativ dazu kann bei Siliciumsubstraten ein Siliciumoxidfilm auf den Wänden bereitgestellt sein, oder die Reaktionskammer kann mit einem relativ inerten Polymer, wie beispielsweise Polyvinylchlorid, beschichtet sein. Zudem kann es wünschenswert sein, blockierende Polynucleotide zuzusetzen, um alle Bindungsstellen auf der Oberfläche der Kammer zu besetzen.
  • In dieser und in anderen Ausführungsformen kann zumindest ein Heiz- und/oder Kühlmodul verwendet werden, das entweder Teil der Reaktionskammer oder eigenständig ist, jedoch in räumliche Nähe zum Reaktionsmodul gebracht werden kann. Geeignete Heizmodule sind in den U.S.-Patenten Nr. 5.498.392 und Nr. 5.587.128 sowie in der WO 97/16561 beschrieben und umfassen gegebenenfalls elektrische Widerstandsheizungen, Impulslaser oder andere Quellen elektromagnetischer Energie, die zur Reaktionskammer geleitet wird. Es sollte festgehalten werden, dass, wenn Heizelemente eingesetzt werden, es gegebenenfalls wünschenswert ist, eine Reaktionskammer von relativ geringer Höhe zu verwenden, um den Wärmetransfer zu erleichtern; vgl. U.S.-Patent Nr. 5.587.128.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ermöglicht die biologische Reaktionskammer die enzymatische Spaltung oder Veränderung des Zielanalyten. Beispielsweise können Restriktionsendonucleasen zur Spaltung von Zielnucleinsäuren, die die Zielsequenzen umfassen, beispielsweise genomische DNA, in kleinere Fragmente eingesetzt werden, um entweder die Amplifikation oder den Nachweis zu erleichtern. Zudem kann, wenn der Zielanalyt ein Protein ist, dieses mittels einer Protease gespalten werden. Andere Arten der enzymatischen Hydrolyse können ebenfalls durchgeführt werden, je nach Zusammensetzung des Zielanalyten. Weiters kann, wie hierin beschrieben, der Zielanalyt ein Enzym umfassen, und die Reaktionskammer umfasst ein Substrat, welches dann gespalten wird, um ein nachweisbares Produkt zu ergeben.
  • Zusätzlich umfasst das Reaktionsmodul in einer Ausführungsform eine Kammer zur physikalischen Veränderung der gesamten Probe oder eines Teils dieser, beispielsweise zum Scheren genomischer oder großer Nucleinsäuren, zur UV-Vernetzung usw.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung zumindest eine Fluidpumpe. Pumpen fallen im Allgemeinen in zwei Kategorien: auf dem Chip und außerhalb des Chips; d.h. die Pumpen (im Allgemeinen auf der Basis von Elektroden) können sich innerhalb der Vorrichtung selbst befinden, oder sie können in einem Gerät vorhanden sein, in das die Vorrichtung hineinpasst, sodass es zu einer Ausrichtung der benötigten Strömungskanäle kommt, wodurch das Pumpen der Fluids ermöglicht wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Pumpen in der Vorrichtung selbst enthalten. Diese Pumpen sind im Allgemeinen Pumpen auf Elektrodenbasis; d.h. die Anlegung von elektrischen Feldern kann eingesetzt werden, um sowohl geladene Teilchen als auch das Haupt-Lösungsmittel zu bewegen, abhängig von der Zusammensetzung der Probe und der Vorrichtung. Geeignete Pumpen auf dem Chip schließen elektroosmotische (EO) Pumpen und elektrohydrodynamische (EHD) Pumpen ein, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt; alle Pumpen auf Elektrodenbasis wurden auf dem Gebiet der Erfindung manchmal als "elektrokinetische (EK) Pumpen" bezeichnet. All diese Pumpen basieren auf Konfigurationen von Elektroden, die entlang einem Strömungskanal angeordnet sind, die die Probenkomponenten enthaltenden Proben zu pumpen. Wie auf dem Gebiet der Erfindung beschrieben wurde sind die Konfigurationen einer jeden dieser Pumpen auf Elektrodenbasis leicht unterschiedlich; beispielsweise hängt die Wirksamkeit einer EDH-Pumpe von der Beabstandung der zwei Elektroden ab, wobei gilt, dass je enger sie beieinander liegen, desto kleiner die zur Veranlassung des Fluidflusses notwendige anzulegende Spannung. Alternativ dazu sollte bei EO-Pumpen der Abstand zwischen den Elektroden größer sein, und zwar bis zur halben Länge des Kanals, in dem die Fluids bewegt werden, da die Elektroden nur in der Einwirkung einer Kraft eine Rolle spielen und nicht, wie bei EHD, in der Erzeugung von Ladungen, auf die die Kraft einwirkt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine elektroosmotische Pumpe eingesetzt. Elektroosmose (EO) basiert auf der Tatsache, dass die Oberflächen zahlreicher Feststoffe, einschließlich Quarz, Glas und anderer, in der Gegenwart ionischer Metalle verschieden, positiv und oder negativ, geladen werden. Die geladenen Oberflächen ziehen entgegengesetzt geladene Gegenionen in wässrigen Lösungen an. Das Anlegen von Spannung führt zur Migration der Gegenionen zur entgegengesetzt geladenen Elektrode und bewegt auch den Hauptanteil des Fluids. Die Volumenstromrate verläuft proportional zum Strom, und der im Fluid erzeugte Volumenstrom ist ebenfalls proportional zur angelegten Spannung. Der elektroosmotische Fluss ist bei Flüssigkeiten nützlich, die dieselbe Leitfähigkeit aufweisen, und ist üblicherweise nicht auf nichtpolare Lösungsmittel anwendbar. EO-Pumpen sind in den U.S.-Patenten Nr. 4.908.112 und Nr. 5.632.876 sowie in den WO 96/39252 und WO 97/43629 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine elektrohydrodynamische (EHD) Pumpe verwendet. In der EHD übertragen die Elektroden, die in Kontakt zum Fluidtransfer stehen, Ladung, wenn Spannung angelegt wird. Diese Ladungsübertragung entsteht entweder durch Übertragung eines Elektrons zu oder Entfernung eines sol chen aus dem Fluid, sodass der sich Flüssigkeitsstrom in Richtung von der ladenden Elektrode hin zur entgegengesetzt geladenen Elektrode bewegt. EHD-Pumpen können zum Pumpen widerstandsbehafteter Flüssigkeiten, wie beispielsweise nichtpolarer Flüssigkeiten, eingesetzt werden. EHD-Pumpen sind im U.S.-Patent Nr. 5.632.876 beschrieben, welches hiermit durch Verweis aufgenommen ist.
  • Die Elektroden der Pumpen weisen vorzugsweise einen Durchmesser von etwa 25 Mikrometern bis etwa 100 Mikrometern, noch bevorzugter von etwa 50 Mikrometern bis etwa 75 Mikrometern, auf. Vorzugsweise stehen die Elektroden von der Oberseite eines Strömungskanals in eine Tiefe von etwa 5 % bis etwa 95 % der Tiefe des Kanals vor, wobei etwa 25 % bis etwa 50 % bevorzugt sind. Zusätzlich kann, wie in der WO 96/39252 beschrieben, ein inneres Pumpsystem auf Elektrodenbasis im Flüssigkeitsverteilungssystem der Vorrichtungen der Erfindung mit einer Flussratensteuerung an mehreren Pumpstellen und mit weniger Elektronik, wenn die Pumpen durch Anlegung von Impulsspannungen durch die Elektroden betrieben werden, eingebaut sein; so wird der zusätzliche Vorteil einer einfachen Integrierung in hochdichte Systeme, der Reduktion des Ausmaßes an Elektrolyse, die sich an den Elektroden vollzieht, der Reduktion der Wärmekonvektion in der Nähe der Elektroden sowie die Möglichkeit, einfachere Treiber zu verwenden, und die Möglichkeit, sowohl einfache als auf komplexe Impulswellengeometrien zu verwenden, bereitgestellt.
  • Welche Spannung an die Elektroden notwendigerweise angelegt werden muss, um einen Fluidfluss auszulösen, hängt von der Geometrie der Elektroden und den Eigenschaften des zu bewegenden Fluids ab. Die Flussrate der Fluids ist eine Funktion der Amplitude der zwischen den Elektroden angelegten Spannung, der Elektrodengeometrie und der Fluideigenschaften, die für jedes Fluid auf einfache Weise bestimmt werden können. Testspannungen können bis zu 1500 Volt betragen, jedoch ist eine Betriebsspannung von etwa 40 bis 300 Volt wünschenswert. Eine analoger Treiber wir im Allgemeinen zur Änderung der an der Pumpe angelegten Spannung aus einer DC-Stromquelle verwendet. Eine Übertragungsfunktion für jedes Fluid wird experimentell als die angelegte Spannung ermittelt, die den gewünschten Fluss oder Fluiddruck des im Kanals bewegten Fluids erzeugt. Ein analoger Treiber ist jedoch im Allgemeinen bei jeder Pumpe entlang dem Kanal vonnöten und ist ein geeigneter Operationsverstärker.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine mikromechanische Pumpe entweder auf dem Chip oder außerhalb des Chips verwendet, so wie auf den Gebiet der Erfindung bekannt ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Pumpe außerhalb des Chips verwendet. Beispielsweise passen die Vorrichtungen der Erfindung gegebenenfalls in einen Apparat oder in ein Gerät, das eine Einbettungsstelle zum Anbringen der Vorrichtung aufweist, die sich mit den Öffnungen (d.h. Probeneinlassöffnungen, Fluideinlassöffnungen und Abfallaustrittsöffnungen) und den Elektrodenleitungen decken. Der Apparat kann Pumpen beinhalten, die die Probe zur Vorrichtung zuführen können; die beispielsweise Proben, die Zellen enthalten, in das Vorsprünge enthaltende Zelllysemodul zwingen können, um bei der Anwendung eines ausreichenden Flussdrucks die Zelllyse zu veranlassen. Derartige Pumpen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
  • in einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung vorzugsweise zumindest ein Fluidventil, das den Fluss des Fluid in ein Modul der Vorrichtung oder aus diesem heraus steuern kann. Eine Vielzahl an Ventilen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. In einer Ausführungsform beispielsweise umfasst das Ventil gegebenenfalls eine Kapillarsperre, so wie allgemein in der WO 97/43629 beschrieben. In dieser Ausführungsform mündet der Kanal in einen größeren Raum, der so konzipiert ist, dass die Bildung einer energieminimierenden Flüssigkeitsoberfläche gefördert wird, wie beispielsweise ein Meniskus an der Öffnung. Vorzugsweise umfassen Kapillarsperren einen Damm, der die vertikale Höhe des Kanals unmittelbar vor der Mündung in einen größeren Raum, wie beispielsweise eine Kammer, anhebt. Zusätzlich kann, so wie im U.S.-Patent Nr. 5.858.195 beschrieben, ein Typ eines "virtuellen Ventils" verwendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung Abdichtungsöffnungen, um den Eintritt von Fluids, einschließlich Proben, in eines der Module der Erfindung zuzulassen, woraufhin die Öffnung geschlossen wird, um einen Verlust der Probe zu verhindern.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung zumindest ein Speichermodul für Testreagenzien. Dieses ist mit den anderen Modulen des Systems über Strömungskanäle verbunden und umfasst gegebenenfalls Vertiefungen oder Kammern oder verlängerte Strömungskanäle. Dies können eine Vielzahl von Reagenzien, Puffern, Salzen usw. enthalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung ein Mischmodul; es können dies, wie bei den Speichermodulen, verlängerte Strömungskanäle (insbesondere für zeitlich festgelegtes Mischen nützlich), eine Vertiefungen oder Kammern sein. Insbesondere im Fall der verlängerten Strömungskanäle können auf der Seite des Kanals Vorsprünge bestehen, die das Mischen bewirken.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vorrichtungen der Erfindung ein Detektionsmodul. Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren und Zusammensetzungen ausgerichtet, die zum Nachweis biologischer Zielanalytenspezies, wie beispielsweise Nucleinsäure und Proteine, nützlich sind. Im Allgemeinen basiert das Detektionsmodul auf der in den WO 99/18434; WO 99/45357 und WO 98/40726 dargelegten Arbeit.
  • Die Detektionsmodule der vorliegenden Erfindung umfassen ein Anordnungssubstrat mit einer diskrete Stellen umfassenden Oberfläche und eine Population von Anordnungsmikrokügelchen (manchmal hierin als Perlen bezeichnet), die über die Oberfläche der Anordnung verteilt sind. Das Detektionsmodul der hierin beschriebenen Mikrofluidikvorrichtungen basiert auf vorangegangener Arbeit, die ein Perlen-basiertes chemisches Analysesystem umfasst, in dem Perlen, auch als Mikrokügelchen bezeichnet, die Träger verschiedener chemischer Funktionalitäten sind, auf einem Anordnungssubstrat verteilt sind, welches eine strukturierte Oberfläche aus diskreten Stellen umfasst, die die Mikrokügelchen binden können. Im Allgemeinen werden die Mikrokügelchen zufällig auf dem Substrat verteilt, wodurch mehrere unterschiedliche Methoden zum "Decodieren" der Anordnungen angewendet werden können. In einer Ausführungsform sind in den Perlen optische Signaturen inkorporiert, im Allgemeinen fluoreszierende Farbstoffe, die eingesetzt werden können, um die chemische Funktionalität an jeder einzelnen Perle zu identifizieren. Dies ermöglicht eine von ihrer Position auf dem Substrat getrennte Synthese der Kandidatenmittel (d.h. Verbindungen, wie beispielsweise Nucleinsäuren und Antikörper), d.h. die Kandidatenmittel können auf den Perlen synthetisiert werden, woraufhin die Perlen zufällig auf einer strukturierten Oberfläche verteilt werden. Da die Perlen zuerst mit einer optischen Signatur codiert werden, bedeutet dies, dass die Anordnung später "decodiert" werden kann, d.h. nachdem die Anordnung fertig gestellt wurde, kann eine bestimmten Stelle auf der Anordnung mit der Perle oder dem Kandidatenmittel in Zusammenhang gebracht werden. Das bedeute, dass die Perlen auf der Anordnung zufällig verteilt werden können, was ein schnelles und kostengünstiges Verfahren im Vergleich zur In-situ-Synthese oder zu Auftupfverfahren nach dem Stand dem Stand der Technik darstellt. Diese Verfahren sind allgemein in den WO 98/40726; WO 00/16101, den U.S.-Patenten Nr. 6.023.540, Nr. 6.200.737 und Nr. 6.266.459 beschrieben.
  • Der Nachteil dieser Verfahren liegt in der Tatsache, dass das System für eine Anordnung von sehr hoher Dichte eine große Anzahl an unterschiedlichen optischen Signaturen benötigt, deren Verwendung schwer oder zeitaufwendig sein kann. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung auch zahlreiche Verbesserungen dieser Verfahren bereit, die im Allgemeinen auf Verfahren des Codierens und Decodierens der Anordnungen abzielen. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung klar ersichtlich ist also das Platzieren der bioaktiven Mittel im Allgemeinen zufällig, wodurch ein Codierungs-/Decodierungssystem notwendig ist, um das bioaktive Mittel an jeder Position der Anordnung zu identifizieren. Dies kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden, wie nachstehend detaillierter beschrieben wird, im Allgemeinen Folgendes einschließend: a) die Verwendung eines Decoder-bindenden Liganden (DBL), der im Allgemeinen direkt markiert ist und entweder an das bioaktive Mittel oder an Identifikator-bindende Liganden (IBLs) bindet, die an den Perlen gebunden sind; b) Positionsdecodierung, beispielsweise durch Zielen auf die Position der Perlen (beispielsweise unter Verwendung von lichtaktivierbaren oder lichtspaltbaren Gruppierungen, um das selektive Zusetzen von Perlen an bestimmten Stellen zu ermöglichen), oder unter Verwendung von Sub-Bündeln oder selektives Beladen der Stellen, wie Folge detaillierter dargelegt wird; c) selektives Decodieren, worin ausschließlich jene Perlen, die an ein Ziel binden, decodiert werden; oder d) Kombinationen aus jedem dieser. In einigen Fällen, wie nachstehend detaillierter beschrieben wird, können alle so Perlen decodiert werden, oder auch nur jene, die, die einen bestimmten Zielanalyten binden. Auch kann dies vor oder nach dem Zusetzen des Zielanalyten durchgeführt werden.
  • Im Detektionsmodul der vorliegenden Erfindung können optische Signaturen, Decoderbindende Liganden, die während eines Decodierungsschritte zugesetzt werden, oder eine Kombination dieser Verfahren zum "Decodieren" verwendet werden. Die Decoder-bindenden Liganden binden entweder an einen bestimmten Indentifikatorbindenden Partnerliganden, der auf einer Perle positioniert ist, oder an das bioaktive Mittel selbst, beispielsweise wenn die Perlen einsträngige Nucleinsäuren als bioaktive Mittel umfassen. Die Decoder-bindenden Liganden sind entweder direkt oder indirekt markiert, wodurch das Decodieren durch den Nachweis der Gegenwart von Markierungen erfolgt. Unter Verwendung von Pools an Decoder-bindenden Liganden auf sequenzielle Weise ist es möglich, die Anzahl an notwendigen Decodierungsschritten drastisch zu reduzieren.
  • Wurden Identität (d.h. das tatsächliche Mittel) und Position eines jeden Mikrokügelchens auf der Anordnung bestimmt, wird nun die Detektionsanordnung Proben ausgesetzt, die die Zielanalyten enthalten, obwohl dies auch, so wie nachstehend beschrieben, vor oder während der Analyse durchgeführt werden kann. Die Komponenten der Mikrofluidikvorrichtung können beim Decodieren nach Wunsch eingesetzt werden. Die Zielanalyten binden an die bioaktiven Mittel, wie in Folge detaillierter beschrieben wird, und führen zu einer Veränderung des optischen Signals einer bestimmten Perle und somit zum Nachweis.
  • Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Detektionsmodule bereit, die Anordnungen mit zumindest einem Substrat mit einer eine Vielzahl an Teststellen umfassenden Oberfläche umfassen. Unter "Anordnung" ist hierin ein Vielzahl an Kandidatenmittel im Format einer Anordnung zu verstehen. Es können Anordnungen hergestellt werden, die von etwa 2 bis zu vielen Millionen verschiedene bioaktive Mittel (d.h. verschiedene Perlen) enthalten, wobei sehr große faseroptische Anordnungen möglich sind. Im Allgemeinen umfasst eine Anordnung 2 bis viele Milliarden oder mehr, abhängig von der Größe der Perlen und des Substrats sowie vom Endzweck der Anordnung, somit können Anordnungen von sehr hoher Dichte, von hoher Dichte, von mäßiger Dichte, niedriger Dichte und von sehr niedriger Dichte hergestellt werden. Bevorzugte Bereiche für Anordnungen von sehr hoher Dichte liegen bei etwa 10.000.000 bis etwa 2.000.000.000 (alle Zahlen pro cm2), wobei etwa 100.000.000 bis etwa 1.000.000.000 bevorzugt sind. Hochdichte Anordnungen liegen im Bereich von etwa 100.000 bis etwa 10.000.000, wobei etwa 1.000.000 bis etwa 5.000.000 besonders bevorzugt sind. Mäßig dichte Anordnungen liegen im besonders bevorzugten Bereich von etwa 10.000 bis etwa 100.000, wobei insbesondere etwa 20.000 bis etwa 50.000 bevorzugt sind. Anordnungen von niedriger Dichte liegen im Allgemeinen bei unter 10.000, wobei etwa 1.000 bis etwa 5.000 bevorzugt sind. Anordnungen von sehr niedriger Dichte liegen bei unter 1.000, wobei etwa 10 bis etwa 1.000 bevorzugt, und etwa 100 bis etwa 500 besonders bevorzugt sind. In einigen Ausführungsformen liegt die Zusammensetzung der Erfindung gegebenenfalls nicht in einem Anordnungsformat vor; d.h. in einigen Ausführungsformen können genauso Zusammensetzungen hergestellt werden, die nur ein einziges bioaktives Mittel umfassen. Zudem können in einigen Ausführungsformen multiple Substrate eingesetzt werden, entweder verschiedene oder identische Zusammensetzungen. So können beispielsweise große Anordnungen eine Vielzahl an Substraten umfassen.
  • Außerdem liegt ein Vorteil der vorliegenden Zusammensetzung darin, dass insbesondere durch den Einsatz von Faseroptiktechnologie Anordnungen von äußerst hoher Dichte hergestellt werden können. Da beispielsweise Perlen mit einer Größe von 200 μm oder weniger (wobei Perlen von einer Größe bis zu 200 nm möglich sind) verwendet werden können, und da sehr kleine Fasern bekannt sind ist es möglich, dass eine große Anzahl wie bis zu 250.000 oder mehr (in einigen Fällen 1 Million) verschiedene Fasern und Perlen in einem 1 mm2 Faserbündel enthalten ist, wobei eine Dichte von mehr als 15.000.000 einzelner Perlen und Fasern (erneut in einigen Fällen sogar 25–50 Millionen) 0,5 cm2 möglich ist.
  • Unter "Anordnungssubstrat" oder "fester Träger der Anordnung" oder gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin ein Material zu verstehen, das modifiziert werden kann, um einzelne diskrete Stellen zu umfassen, die zur Bindung oder Anhaftung von Perlen geeignet und für zumindest eines der hierin beschriebenen Nachweisverfahren geeignet sind. Wie für Fachleute auf dem Gebiet klar ersichtlich ist, steht eine Vielzahl möglicher Anordnungssubstrate zur Verfügung. Mögliche Substrate schließen Glas und modifiziertes oder funktionalisiertes Glas, Kunststoffe (einschließlich Acryle, Polystyrol und Copolymere von Styrol und anderen Materialien, Polypropylen, Polyethylen, Polybutylen, Polyurethane, TeflonJ usw.), Polysaccharide, Nylon oder Nitrocellulose, Harze, Silica oder Materialien auf Silica-Basis, einschließlich Silicium und modifiziertes Silicium, Kohlenstoff, Metalle, anorganische Glase, Kunststoffe, Faseroptikbündel und eine Vielzahl an anderen Polymeren ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Im Allgemeinen lassen diese Substrate einen optischen Nachweis zu und sind selbst kaum fluoreszent. Die Anordnungssubstrate können dieselben wie die Vorrichtungssubstrate oder andere sein. Falls anders können sei auf verschiedenste Weise an der Vorrichtung angebracht sein, wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der Verwendung von Klebern, des Zusammenschmelzens zweier Materialien (beispielsweise durch Wärme oder den Einsatz organischer Lösungsmittel).
  • Im Allgemeinen ist das Substrat flach (planar), obwohl, wie Fachleute auf dem Gebiet wissen, auch andere Konfigurationen von Testsubstraten eingesetzt werden können, beispielsweise können dreidimensionale Konfigurationen verwendet werden, beispielsweise durch Einbetten der Perlen in einen porösen Kunststoffblock, der den der Probe den Zugang zu den Perlen ermöglicht, und die Verwendung eines konfokalen Mikroskops zum Nachweis. Ähnlich können die Perlen auch an der inne ren Oberfläche eines Rohrs zur Analyse der hindurchfließenden Probe platziert werden, um das Probenvolumen zu minimieren. Bevorzugte Testsubstrate umfassen die nachstehend erörterten Faseroptikbündel und flache, planare Substrate, wie beispielsweise Glas, Polystyrol und andere Kunststoffe und Acryle.
  • Dementsprechend umfasst die Anordnung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Faseroptikbündel. Das heißt, dass der Mikrofluidikchip und ein Faseroptikbündel, wie in den WO 98/40726 und WO 00/016101 beschrieben, kombiniert werden, um die Vorrichtung der Erfindung zu bilden.
  • In einer Ausführungsform werden Mikrofluidikchip und das Faseroptikbündel getrennt voneinander hergestellt und dann kombiniert. Um das Faseroptikbündel mit dem Mikrofluidikchip zu kombinieren wird ein Loch im Chip gemacht, das einen Kanal im Chip überschneidet. In einer bevorzugten Ausführungsform steht das Loch senkrecht zum Kanal. Weiters wird bevorzugt, dass das Loch nur die erste Wand des Kanals penetriert. Letztendlich wird bevorzugt, dass der Durchmesser des Lochs zum Durchmesser des Faseroptikbündels passt. Entspricht der Durchmesser des Lochs nicht exakt der Größe des Faseroptikbündels, können Verbindungspasstücke eingesetzt werden, um die Verbindung des Chips mit dem Faseroptikbündel zu vereinfachen.
  • Wurde die Öffnung im Chip gebildet, so wird nun das Faseroptikbündel in das Loch eingeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Bündels der ersten Wand des Kanals entsprechend ausgerichtet.
  • Das Bündel wird durch eine Vielzahl möglicher Weisen, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, am Chip befestigt. Diese umfassen beispielsweise die Kleber oder Presspassung.
  • In einer Ausführungsform werden die Mikrokügelchen auf der Anordnung oder dem Bündel vor dessen Verbindung mit dem Chip verteilt. Alternativ dazu werden die Per len nach dem Anbringen des Bündels an den Chip verteilt, wie in Folge noch beschrieben wird.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat selbst, das die diskreten Stellen umfasst, die Mikrofluidikkammer. Das bedeutet, dass ein Kanal der Mikrofluidikvorrichtung so modifiziert ist, dass er Vertiefungen zur Verteilung der Perlen aufweist. In einer Ausführungsform werden die Vertiefungen durch Ätzen oder Formen der Oberfläche der Kammer auf die hierin beschriebene Weise gebildet. Alternativ dazu werden dem Boden der Kammer vorgefertigte Vertiefungen zugesetzt, d.h. auf diesem angebracht.
  • Das Testsubstrat umfasst eine Testoberfläche, die eine Vielzahl an Teststellen umfasst, d.h. die Stellen, an denen der Test zum Nachweis eines Zielanalyten durchgeführt wird. Die Teststellen sind im Allgemeinen physisch voneinander getrennt, obwohl auch andere Konfigurationen (Hydrophilie/Hydrophobie usw.) eingesetzt werden können, um die Teststellen voneinander zu trennen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Testsubstrat eine Scheibe oder ein Schnittstück eines Faserbündels oder eine Anordnung, so wie allgemein im U.S.-Patent Nr. 2001-0.029.049, in der WO 99/67641, im U.S.-Patent Nr. 6.200.737, in den WO 98/40726, WO 99/18434 und WO 98/50782, die hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen sind. Bevorzugte Ausführungsformen verwenden vorgefertigte einheitliche Faseroptikanordnungen. Unter "vorgefertigte einheitliche Faseroptikanordnungen" ist hierin eine Anordnung aus diskreten einzelnen Faseroptiksträngen zu verstehen, die koaxial ausgerichtet und entlang ihrer Länge miteinander verbunden sind. Die Faserstränge sind im Allgemeinen einzeln umhüllt. Ein Punkt jedoch, der vorgefertigte einheitliche Anordnungen von anderen Faseroptikformaten unterscheidet, ist die Tatsache, dass die Fasern nicht einzeln physikalisch manipulierbar sind; d.h., dass ein Strang im Allgemeinen an keinem Punkt entlang seiner Länge von einem anderen Faserstrang physikalisch getrennt werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Testoberfläche eine Vielzahl an diskreten Stellen. Das bedeutet, dass zumindest eine Oberfläche des Substrats modifiziert ist, um einzelne, diskrete Stellen zur späteren Anbringung von Mikrokügelchen zu umfassen. Diese Stellen umfassen gegebenenfalls physikalisch veränderte Stellen, d.h. physikalische Konfigurationen, wie beispielsweise Vertiefungen oder kleine Einbuchtungen im Substrat, die die Perlen festhalten können, sodass sich ein Mikrokügelchen in der Vertiefung ablagern kann, oder die Verwendung anderer Kräfte (magnetisch oder Druck) oder chemisch veränderte oder aktive Stellen, wie beispielsweise chemisch funktionalisierte Stellen, elektrostatisch veränderte Stellen, hydrophob/hydrophil funktionalisierte Stellen, Klebstoffpunkte usw.
  • Die Stellen ergeben gegebenenfalls ein Muster, d.h. eine regelmäßige Zeichnung oder Konfiguration, oder sie sind zufällig verteilt. Eine bevorzugte Ausführungsform verwendet ein regelmäßiges Muster an Stellen, sodass den Stellen eine Adresse im X-Y-Koordinatensystem zugeteilt werden kann. "Muster" beinhaltet in diesem Zusammenhang eine Grundeinheitszelle, vorzugsweise eine solche, die eine hohe Perlendichte auf dem Substrat zulässt. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass diese Stellen gegebenenfalls nicht diskret sind. Das bedeutet, dass beispielsweise die Verwendung einer einheitlichen Oberfläche mit haftenden oder chemischen Funktionalitäten möglich ist, die das Anbringen von Perlen an jeder beliebigen Stelle zulässt. Das bedeutet, dass die Oberfläche des Substrats modifiziert ist, um das Anbringen von Mikrokügelchen an einzelnen Stellen zu ermöglichen, unabhängig davon, ob diese Stellen an andere Stellen angrenzen oder nicht angrenzen. Die Oberfläche des Substrats kann also so modifiziert sein, dass diskrete Stellen gebildet werden, die nur über eine zugeordnete Perle verfügen, oder alternativ dazu ist die Oberfläche des Substrats modifiziert, und die Perlen können sich an einer beliebigen Stelle absetzen, landen aber letztendlich an diskreten Stellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Substrats so modifiziert, dass sie Vertiefungen aufweist, d.h. Einbuchtungen in der Oberfläche des Substrats. Dies kann, so wie allgemein auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, unter Verwendung zahlreicher Verfahren erreicht werden, einschließlich, jedoch nicht aus schließlich, Photolithographie, Druckverfahren, Formverfahren und Mikroätzverfahren. Wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist hängt das verwendete Verfahren von der Zusammensetzung und der Form des Substrats ab.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche des Substrats physikalisch verändert, um die Stellen auszubilden. In einer bevorzugten Ausführungsform, beispielsweise wenn das Anordnungssubstrat ein faseroptisches Bündel ist, liegt die Substratoberfläche am terminalen Ende des Faserbündels, so wie allgemein in der WO 98/40726, WO 00/16101, den U.S.-Patenten Nr. 6.023.540, Nr. 6.327.410 und Nr. 6.266.459 beschrieben. In dieser Ausführungsform werden die Vertiefungen in einem terminalen oder distalen Ende eines einzelne Fasern umfassenden Faseroptikbündel ausgebildet. In dieser Ausführungsform sind die Kerne der einzelnen Faser mit Bezug auf den Mantel geätzt, sodass kleine Vertiefungen oder Einbuchtungen an einem Ende der Fasern gebildet werden. Die notwendige Tiefe der Vertiefungen hängt von der Größe der den Vertiefungen zuzusetzenden Perlen ab.
  • im Allgemeinen sind in dieser Ausführungsform die Mikrokügelchen nicht kovalent in den Vertiefungen gebunden, obwohl die Vertiefungen, so wie nachstehend allgemein beschrieben, zusätzlich chemisch funktionalisiert sein können, gegebenenfalls werden Vernetzer verwendet, oder es kann eine physische Barriere, d.h. ein Film oder Membran über den Perlen eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Substrats so modifiziert, dass die chemisch veränderte Stellen umfasst, die zur kovalenten oder nichtkovalenten Anbringung der Mikrokügelchen der Erfindung an die diskreten Stellen oder Positionen auf dem Substrat verwendet werden können. "Chemisch veränderte Stellen" schließen in diesem Kontext den Zusatz von Mustern aus chemischen funktionellen Gruppen, unter anderem Aminogruppen, Carboxygruppen, Oxogruppen und Thiolgruppen, die zur kovalenten Bindung von Mikrokügelchen, die im Allgemeinen auch entsprechende reaktive funktionelle Gruppen enthalten, eingesetzt werden können; den Zusatz eines Musters aus einem Kleber, der zur Bindung der Mikrokügelchen (entweder durch vorherige chemische Funktionalisierung für den Zusatz des Klebers oder durch direkten Zusatz des Klebers) verwendet werden kann; den Zusatz eines Musters aus geladenen Gruppen (den chemischen Funktionalitäten ähnlich) für die elektrostatische Anhaftung der Mikrokügelchen, d.h. wenn die Mikrokügelchen zu den Stellen entgegengesetzt geladene Gruppen umfassen; den Zusatz eines Musters aus chemischen funktionellen Gruppen, die den Stellen unterschiedliche Hydrophilie oder Hydrophobie verleihen, sodass der Zusatz von ähnlich hydrophoben oder hydrophilen Mikrokügelchen unter geeigneten Versuchsbedingungen zur Bindung der Mikrokügelchen an die Stellen auf Grundlage der Hydroaffinität führt. Beispielsweise leitet die Verwendung von hydrophoben Stellen mit hydrophoben Perlen in einem wässrigen System die Bindung der Perlen vorzugsweise zu den Stellen hin. Wie zuvor dargelegt beinhaltet "Muster" in diesem Zusammenhang das Durchführen einer einheitlichen Behandlung der Oberfläche, um die Bindung der Perlen an diskreten Stellen zu ermöglichen, und die Behandlung der Oberfläche, die zur Ausbildung der diskreten Stellen führt. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, kann dies auf verschiedene Weisen erzielt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Substrat so konfiguriert, dass ein Vermischen der Probe, der Reagenzien, der Mikrokügelchen usw. möglich ist. Das bedeutet, dass in einer Vielzahl von Ausführungsformen ein Mischen oder ein Wirbeln der Probe wünschenswert ist. Dies kann auf verschiedene Weisen geschehen. in einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Substrat vorstehende Mikrostrukturen, wie beispielsweise vertikale "Pfosten" oder Wehre oder andere Strukturen, die ein Wirbeln der Probe veranlassen, wie beispielsweise kantige Einbuchtungen. Diese Strukturen können in Bezug auf die Kammer so konfiguriert sein, dass das Vorbeifließen der Probe an der Anordnung ein Mischen oder ein Wirbeln der Probe verursacht. beispielsweise ist in einer Ausführungsform die Detektionsoberfläche in Bezug auf die Kammer "vertieft angelegt" oder "versenkt", sodass das Vorbeifließen der Probe an der Elektrode ein Mischen veranlasst. In einer bevorzugten Ausführungsform sind vertikale "Pfosten" oder "Nadeln" eingebaut, um ein Wirbeln der Probe zu bewirken.
  • Diese Mikrostrukturen können an einem beliebigen Ort in der Vorrichtung eingebaut sein, einschließlich innerhalb der Kammern oder Kanäle, und können aus jedem hierin beschriebenen Substrat unter Einsatz bekannter Mikroherstellungsverfahren gebildet werden. In einer Ausführungsform sind diese Mikrostrukturen aus Materialien gebildet oder beschichtet, die anders als das Substrat sind, und unerwünschte Wechselwirkungen mit den Perlen oder der Probe zu verhindern; beispielsweise sind in einer bevorzugten Ausführungsform die Pfosten aus Metall gefertigt.
  • Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen zudem eine Population an Mikrokügelchen. Unter "Population" ist hierin eine Vielzahl an zuvor für Anordnungen beschriebenen Perlen zu verstehen. Innerhalb der Population gibt es getrennte Subpopulationen, die aus einem einzigen Mikrokügelchen oder aus mehreren identischen Mikrokügelchen bestehen können. Das heißt, dass in einigen Ausführungsformen, wie nachstehend ausführlicher beschrieben wird, die Anordnung gegebenenfalls nur eine einzige Perle für jedes bioaktive Mittel aufweist; bevorzugte Ausführungsformen verwenden eine Vielzahl an Perlen eines jeden Typs.
  • Mit "Mikrokügelchen" oder "Perle" oder "Teilchen" oder gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin ein kleines, diskretes Teilchen gemeint. Die Zusammensetzung der Perlen variiert in Abhängigkeit der Klasse des bioaktiven Mittels und des Syntheseverfahrens. Geeignete Perlenzusammensetzungen umfassen jene, die zur Peptid- und Nucleinsäuresynthese sowie zur Synthese von organischen Gruppierungen eingesetzt werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Kunststoffen, Keramik, Glas, Polystyrol, Methylstyrol, Acrylpolymeren, paramagnetischen Materialien, Thoria Sol, Graphitkohlenstoff, Titandioxid, Latex oder vernetzten Dextranen, wie beispielsweise Sepharose, Nylon, Cellulose, vernetzte Mizellen und Teflon – all diese können verwendet werden. Die Publikation "Microsphere Detection Guide" der Bangs Laboratories, Fishers, IN, USA, ist ein nützlicher Leitfaden.
  • Die Perlen müssen nicht kugelförmig sein; unregelmäßige Teilchen können eingesetzt werden. Zudem können die Teilchen porös sein, wodurch die Oberfläche der Perle, die für die Bindung des bioaktiven Mittels oder für die Bindung der Markierung zur Verfügung steht, vergrößert werden. Die Perlengröße reicht von Nanometergröße, d.h. 100 nm, bis zu Millimetergröße, d.h. 1 mm, wobei Perlen mit von etwa 0,2 Mikrometern bis etwa 200 Mikrometern bevorzugt sind, und von etwa 0,5 bis etwa 5 Mikrometern besonders bevorzugt sind, obwohl in einigen Ausführungsformen manchmal auch kleinere Perlen verwendet werden können.
  • Es sollte festgehalten werden, dass eine Schlüsselkomponente der Erfindung die Verwendung einer Substrat/Perlen-Paarung ist, die die Zuordnung oder Bindung von Perlen an diskreten Stellen auf der Oberfläche des Substrats ermöglicht, sodass sich die Perlen im Verlauf des Tests nicht bewegen.
  • Jedes Mikrokügelchen umfasst ein Bioaktives Mittel, obwohl, was Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist, gegebenenfalls auch, je nach Syntheseverfahren, Mikrokügelchen vorhanden sind, die kein bioaktives Mittel umfassen. Unter "bioaktives Kandidatenmittel" oder "bioaktives Mittel" oder "chemische Funktionalität" oder "Bindungsligand" ist hierin ein jedes Molekül, z.B. Protein, Oligopeptid oder kleines organisches Molekül, Koordinationskomplex, Polysaccharid, Polynucleotid usw., zu verstehen, das an die Mikrokügelchen der Erfindung gebunden werden kann. Es versteht sich, dass die Zusammensetzungen der Erfindungen zwei Hauptverwendungszwecke aufweisen. In einer bevorzugten Ausführungsform, wie nachstehend ausführlicher erläutert wird, werden die Zusammensetzungen zum Nachweis der Gegenwart eines bestimmten Zielanalyten eingesetzt; beispielsweise die Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Nucleotidsequenz oder eines bestimmten Proteins, wie beispielsweise ein Enzym, ein Antikörper oder ein Antigen. In einer alternativen Ausführungsform werden die Zusammensetzungen zum Screening von bioaktiven Mitteln, z.B. eines Kandidatenmedikaments, hinsichtlich der Bindung an einen bestimmten Zielanalyten eingesetzt.
  • Bioaktive Mittel schließen zahlreiche chemische Klassen ein, sind jedoch typischerweise organische Moleküle, vorzugsweise kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 und weniger als 2.500 Dalton. Bioaktive Mittel umfassen funktionelle Gruppen, die zur strukturellen Wechselwirkung mit Protei nen, insbesondere zur Wasserstoffbrückenbindung, notwendig sind, und schließen typischerweise Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppen, vorzugsweise zumindest zwei der funktionellen chemischen Gruppen, ein. Die bioaktiven Mittel umfassen häufig zyklische Kohlenstoffstrukturen oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die mit einer oder mehr der obigen funktionellen Gruppen substituiert sind. Bioaktive Mittel sind auch in den Reihen der Biomoleküle zu finden, einschließlich Peptiden, Nucleinsäuren, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Derivaten, Strukturanaloga oder Kombinationen davon. Besonders bevorzugt sind Nucleinsäuren und Proteine.
  • Bioaktive Mittel können aus einer Vielzahl von Quellen gewonnen werden, einschließlich Bibliotheken synthetischer und natürlicher Verbindungen. Beispielsweise stehen zahlreiche Methoden zur zufälligen und direkten Synthese einer enormen Vielzahl von organischen Verbindungen und Biomolekülen zur Verfügung, einschließlich der Expression zufallsveränderter Oligonucleotide. Alternativ dazu stehen Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form von Bakterien-, Pilz-, Pflanzen- und Tierextrakten zur Verfügung oder sind schnell herzustellen. Zudem sind natürliche und synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen durch herkömmliche chemische, physikalische und biochemische Mittel einfach zu modifizieren. Bekannte pharmakologische Mittel können direkten oder zufälligen chemischen Modifikationen unterzogen werden, wie beispielsweise Acylierung, Alkylierung, Veresterung und/oder Amidierung zur Erzeugung von Strukturanaloga.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Proteine.
  • In einer der bevorzugten Ausführungsformen sind die bioaktiven Mittel natürlich auftretende Proteine. So werden gegebenenfalls proteinhältige Zellextrakte oder zufällige oder direkte Verdaue von proteinhältigen Zellextrakten verwendet. Auf diese Weise können Bibliotheken prokaryotischer und eukaryotischer Proteine zum Screening in den hierin beschriebenen Systemen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt sind in dieser Ausführungsform Bibliotheken von Bakterien-, Pilz-, Viren- und Säugetier proteinen, wobei Letztere bevorzugt und menschliche Proteine besonders bevorzugt sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Peptide mit etwa 5 bis etwa 30 Aminosäuren, wobei etwa 5 bis etwa 20 Aminosäuren bevorzugt und etwa 7 bis etwa 15 besonders bevorzugt sind. Die Peptide können Verdaue natürlich auftretender Proteine, so wie zuvor beschrieben, zufällige Peptide oder "beeinflusste" zufällige Peptide sein. Mit "zufallsverändert" oder gleichwertigen Bezeichnungen ist hierin gemeint, dass jede Nucleinsäure bzw. jedes Peptid aus zufälligen Nucleotiden bzw. Aminosäuren besteht. Da im Allgemeinen all diese zufälligen Peptide (oder Nucleinsäuren, nachstehend erörtert) chemisch synthetisiert sind können sie ein beliebiges Nucleotid oder eine beliebige Aminosäure an jeder beliebigen Position inkorporieren. Der synthetische Vorgang kann so konzipiert sein, dass zufallsveränderte Proteine oder Nucleinsäuren erzeugt werden, um die Bildung von allen oder den meisten möglichen Kombinationen entlang der Länge der Sequenz zu ermöglichen, wodurch eine Bibliothek zufallsveränderter proteinhältiger bioaktiver Mittel gebildet wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Bibliothek bioaktiver Mittel verwendet. Die Bibliothek sollte eine ausreichend strukturell unterschiedliche Population von bioaktiven Mitteln bereitstellen, um eine wahrscheinlichkeitstheoretisch ausreichende Palette an Bindungen an Zielanalyten zu verwirklichen. Demgemäß muss eine Wechselwirkungsbibliothek umfangreich genug sein, dass zumindest ein Element eine Struktur aufweist, die diesem Affinität gegenüber dem Zielanalyten verleiht. Obwohl die notwendige absolute Größe der Bibliothek schwierig zu bemessen ist, gibt uns die Natur mit der Immunantwort einen Hinweis: eine Diversität von 107–108 verschiedenen Antikörpern stellt zumindest eine Kombination mit ausreichender Affinität zur Wechselwirkung mit den meisten potentiellen Antigenen bereit, mit denen ein Organismus konfrontiert wird. veröffentlichte In-vitro-Selektionsverfahren haben ebenfalls gezeigt, dass eine Biblitheksgröße von 107–108 ausreicht, um Strukturen mit Affinität zum Ziel zu finden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden deshalb in den vorliegenden Verfahren zumindest 106, vorzugsweise zumindest 107, noch be vorzugter zumindest 108 und insbesondere zumindest 109 verschiedene bioaktive Mittel gleichzeitig analysiert. Bevorzugte Verfahren maximieren Größe und Diversität der Bibliothek.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Bibliothek zur Gänze zufallsverändert, wobei es an keiner Stelle Sequenzpräferenzen oder -konstanten gibt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Bibliothek beeinflusst. Das bedeutet, dass einige Stellen innerhalb der Sequenz entweder konstant gehalten sind, oder sie sind aus einer eingeschränkten Anzahl an Möglichkeiten ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform beispielsweise sind die Nucelotide oder Aminosäuren innerhalb einer definierten Klasse zufallsverändert, beispielsweise hydrophobe Aminosäuren, hydrophile Reste, sterisch beeinflusste (entweder kleine oder große) Reste, für die Bildung von Cysteinen, zum Vernetzen, für Proline für SH-3-Domänen, Serine, Threonine, Tyrosine oder Histidine für Phsophorylierungsstellen usw., oder zu Purinen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel Nucleinsäuren, wie oben definiert (allgemein hierin als "Sondennucleinsäuren" oder Kandidatensonden" bezeichnet). So wie oben allgemein für Proteine beschrieben können bioaktive Nucleinsäure-Mittel natürlich auftretende Nucleinsäuren, zufällige Nucleinsäuren oder "beeinflusste" zufällige Nucleinsäuren sein. Beispielsweise können Verdaulösungen prokaryotischer oder eukaryotischer Genome wie oben für Proteine dargelegt verwendet werden.
  • Sind die bioaktiven Mittel Nucleinsäuren, so sind die so konzipiert, dass sie im Wesentlichen zu Zielsequenzen komplementär sind. Der Begriff "Zielsequenz" oder gleichwertige Bezeichnungen stehen hierin für eine Nucleinsäuresequenz auf einem einzelnen Strang einer Nucleinsäure. Die Zielsequenz kann eine Abschnitt eines Gens, eine Regulationssequenz, genomische DNA, cDNA, RNA, einschließlich mRNA und rRNA oder eine andere sein. Sie kann beliebig lang sein, wobei sich versteht, dass längere Sequenzen spezifischer sind. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, kann die komplementäre Zielsequenz viele Formen an nehmen. Beispielsweise kann sie in einer größeren Nucleinsäuresequenz enthalten sein, d.h. unter anderem als Ganzes oder als Teil eines Gens oder mRNA, als Restriktionsfragment eines Plasmids oder einer genomischen DNA. Wie nachstehend detaillierter erklärt wird werden Sonden zur Hybridisierung an den Zielsequenzen hergestellt, um die Gegenwart oder Abwesenheit der Zielsequenz in einer Probe zu bestimmen. Im Allgemeinen ist dies für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung verständlich.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel organische chemische Gruppierungen, wobei eine Vielzahl dieser in der Fachliteratur zur Verfügung stehen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede Perle einen einzigen Typ eines bioaktiven Mittels, obwohl vorzugsweise mehrere einzelne bioaktive Mittel an jede Perle angebunden sind. Auf ähnliche Weise verwenden bevorzugte Ausführungsformen mehr als ein Mikrokügelchen, das jeweils ein einzigartiges bioaktives Mittel umfasst; das bedeutet, dass durch die Verwendung von Subpopulationen von Mikrokügelchen Redundanz im System eingebaut ist, da jedes Mikrokügelchen der Subpopulation dasselbe bioaktive Mittel umfasst. Die Anzahl der Perlen jeder Subpopulation variiert. Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung dürfte bekannt sein, dass die zufällige Verteilung der Perlen auf der Anordnung dem Prinzip der Poissonschen Verteilung gehorcht, wodurch jede einzelne Subpopulation dieselbe Anzahl oder eine andere Anzahl an Perlen auf dem Anordnungsubstrat aufweist. Auf ähnliche Weise variiert die Redundanz der Anordnung je nach Anwendungszweck. In bevorzugten Ausführungsformen sind zumindest zwei Perlen einer jeden Subpopulation auf der Anordnung gegenwärtig, wobei zumindest etwa 3 bis etwa 50 bevorzugt, etwa 5 bis etwa 20 noch bevorzugter, und insbesondere etwa 8 bis etwa 10 bevorzugt sind.
  • Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, können die bioaktiven Mittel entweder direkt auf den Perlen synthetisiert werden, oder sie werden hergestellt und nach der Synthese angebracht. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Bindemittel eingesetzt, um die bioaktiven Mittel an die Perlen zu binden, um dadurch gute Haftung und ausreichende Flexibilität zur Ermöglichung einer guten Wechselwirkung mit dem Zielmolekül und zur Vermeidung von unerwünschten Bindungsreaktionen bereitzustellen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Mittel direkt auf den Perlen synthetisiert. Wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist werden derzeit zahlreiche Klassen chemischer Substanzen auf festen Trägern synthetisiert, wie beispielsweise Peptide, organische Gruppierungen und Nucleinsäuren. Es handelt sich hierbei um eine relativ direkte Art der Anpassung der derzeitigen Syntheseverfahren an die Verwendung von Perlen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die bioaktiven Mittel zuerst synthetisiert und dann kovalent an die Perlen gebunden. Wie für Fachleute auf dem Gebiet ersichtlich ist, hängt die Durchführung dessen von der Zusammensetzung der bioaktiven Mittel und der Perlen ab. Die Funktionalisierung Oberflächen des festen Trägers, wie beispielsweise bestimmte Polymere mit chemisch reaktiven Gruppen, wie beispielsweise Thiole, Amine, Carboxyle usw., ist im Allgemeinen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Dementsprechend können Mikrokügelchen-"Rohlinge" mit einer Oberflächenchemie verwendet werden, die die Anbindung der gewünschten Funktionalität durch den Benutzer erleichtert. Einige Beispiele dieser Oberflächenchemie von Mikrokügelchen-Rohlingen schließen Aminogruppen, die aliphatische und aromatische Amine enthalten, Carboxylsäuren, Aldehyde, Amide, Chlormethylgruppen, Hydrazid, Hydroxygruppen, Sulfomate und Sulfate ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Diese funktionellen Gruppen können eingesetzt werden, um den Perlen eine beliebige Anzahl an Kandidatenmitteln zuzusetzen, im Allgemeinen unter Anwendung bekannter Chemie. Beispielsweise können kohlenhydrathältige Kandidatenmittel an einen aminofunktionalisierte Träger angebunden werden; der Aldehyd des Kohlenhydrats wird unter Einsatz von Standardverfahren hergestellt, woraufhin der Aldehyd mit einer Aminogruppe auf der Oberfläche umgesetzt wird. In einer alternativen Ausführungsform wird gegebenenfalls ein Sulfhydryl-Binder eingesetzt. Mehrere reaktive Sulfhydryl-Binder sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, wie beispielsweise SPDP, Maleimide, α-Halogenacetyle und Pyridyldisulfide (vgl. beispielsweise den Katalog der Pierce Chemical Company aus dem Jahr 1994, die Seiten 155–200 des technischen Anschnitts zum Thema Vernetzer, der hierin durch Verweis aufgenommen ist), die zum Anbringen von Cysteinen, die proteinhältige Mittel enthalten, an den Träger. Alternativ dazu kann eine Aminogruppe auf dem Kandidatenmittel zur Bindung an eine Aminogruppe auf der Oberfläche eingesetzt werden. Beispielsweise ist eine große Anzahl an stabilen bifunktionellen Gruppen auf diesem Gebiet bekannt, einschließlich homobifunktioneller und heterobifunktioneller Vernetzer (vgl. Pierce-Katalog und -Handbuch, Seiet 155 bis 200). In einer weiteren Ausführungsform können Carboxylgruppen (entweder der Oberfläche oder des Kandidatenmittels) unter Verwendung wohl bekannter Bindemittel in ein Derivat überführt werden (vgl. Pierce-Katalog). Beispielsweise aktivieren Carboiimide Carboxylgruppen für den Angriff durch gute Nucleophile, wie beispielsweise Amine (vgl. Torchilin et al., Critical Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems, 7(4):275–308 (1991)). Proteinhältige Kandidatenmittel können auch unter Verwendung anderer auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren angebunden werden, beispielsweise zur Bindung von Antikörper an Polymere; vgl. Slinkin et al., "Bioconj. Chem.", 2:342–348 (1991); Torchilin et al., oben; Trubetskoy et al., "Bioconj. Chem.", 3:323–327 (1992); King et al., "Cancer Res.", 54:6176–6185 (1994); und Wilbur et al., "Bioconjugate Chem.", 5:220–235 (1994). Es versteht sich, dass sie Kandidatenmittel auf eine Vielzahl von Weisen angebunden werden können, einschließlich der oben aufgeführten. Wichtig ist hierbei, dass die Art der Bindung die Funktionalität des Kandidatenmittel nicht wesentlich verändert; d.h., dass das Kandidatenmittel in einer derart flexiblen Weise angebunden werden soll, dass es mit dem Ziel wechselwirken kann.
  • Spezifische Verfahren zur Immobilisierung von Enzymen auf Mikrokügelchen sind nach dem Stand der Technik bekannt. In einem Fall werden Mikrokügelchen mit NH2-Oberflächenchemie verwendet. Die Oberflächenaktivierung wird mit einer 2,5%-igen phosphatgepufferten Salzlösung(10 mM) von Glutaraldehyd erzielt, die einen pH-Wert von 6,9 bereitstellt (138 mM NaCl, 2,7 mM KCl). Diese wird für 2 Stunden auf einem Rührbett bei Raumtemperatur gerührt. Die Mikrokügelchen werden daraufhin mit hochreinem Wasser plus 0,01 % Tween 20 (Tensid) –0,02% gespült und in Folge erneut mit PBS mit einem pH-Wert von 7,7 plus 0,01 % Tween 20 gespült. Letztendlich wird das Enzym zugesetzt, vorzugsweise nach Filtration mit einem 0,45 μm Amicon Micropure Filter.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die Mirkokügelchen zusätzlich eine optische Signatur, die zur Identifikation des bioaktiven Mittels eingesetzt werden kann; vgl. beispielsweise WO 98/40726, WO 00/16101, die U.S.-Patente Nr. 6.023.540, 6.200.737 und 6.266.459.
  • In einigen Ausführungsformen umfassen die Mirkokügelchen zusätzlich Identifikatorbindende Liganden zur Verwendung in bestimmten Decodierungssystemen. Unter "Identifikator-bindende Liganden" oder "IBLs" ist hierin eine Verbindung zu verstehen, die spezifisch an einen entsprechenden Decoder-bindenden Liganden (DBL) bindet, um die Klärung der Identität des an die Perle gebundenen bioaktiven Mittels zu erleichtern. Das bedeutet, dass der IBL und der entsprechende DBL ein Bindungspartnerpaar bilden. Unter "spezifisch binden" ist hierin zu verstehen, dass der IBL an den DBL mit zur Unterscheidung zwischen dem entsprechenden DBL und anderen DBLs (d.h. DBLs für andere IBLs) oder anderen Komponenten oder Verunreinigungen des Systems ausreichender Spezifität bindet. Die Bindung sollte ausreichend stark ein, um unter den Bedingungen des Decodierungsschritts stabil zu bleiben, einschließlich der Waschschritte zur Beseitigung nichtspezifischer Bindungen. In einigen Ausführungsformen, beispielsweise wenn die IBLs und die entsprechenden DBLs Proteine oder Nucleinsäuren sind, liegt die Dissoziationskonstante des IBL zu seinem DBL unter etwa 10–4–10–6 M–1, wobei unter etwa 10–5–10–9 M–1 bevorzugt und unter etwa 10–7–10–9 M–1 besonders bevorzugt ist.
  • IBL-DBL-Bindungspaare sind bekannt oder können schnell unter Verwendung bekannter Verfahren ausgemacht werden. Ist beispielsweise der IBL ein Protein, umfassen die DBLs Proteine (insbesondere umfassend Antikörper oder Fragmente davon (FAbs usw.)) oder kleine Moleküle, oder umgekehrt (der IBL ist ein Antikörper und der DBL ein Protein). Metallion-Metallion-Liganden- oder Chelatbildnerpaare sind ebenfalls vonnutzen. Antigen-Antikörper-Paare, Enzyme und Substrate oder Hemmer, andere Protein-Protein-Wechselwirkungspaare, Rezeptor-Liganden, komplementäre Nucleinsäuren und Kohlenhydrate und deren Bindungspartner sind weitere geeignete Bindungspaare. Nucleinsäure-Nucleinsäure-bindende Proteinpaare sind auch nützlich. Auf ähnliche Weise, so wie allgemein in den U.S.-Patenten Nr. 5.270.163, 5.475.096, 5.567.588, 5.595.877, 5.637.459, 5.683.867, 5.705.337 und verwandten Patenten beschrieben, auch Nucleinsäure-"Aptamere" zur Bindung von praktisch jedem Zielanalyten gebildet werden können. Analog dazu gibt es einen umfangreichen Literaturbestand zum Thema der Entwicklung von Bindungspartnern auf der Grundlage kombinatorischer chemischer Verfahren.
  • In einer bevorzugte Ausführungsform ist der IBL ein Molekül, dessen Farbe oder Leuchteigenschaften sich in Gegenwart eines selektiv bindenden DBL verändern. Beispielsweise kann der IBL ein fluoreszierender pH-Indikator sein, dessen Emissionsintensität sich mit dem pH-Wert ändert. Ähnlich dazu kann der IBL ein fluoreszierender Ionenindikator sein, dessen Emissionseigenschaften sich mit der Ionenkonzentration ändern.
  • Alternativ dazu ist der IBL ein Molekül, dessen Farbe oder Leuchteigenschaften sich in Gegenwart verschiedener Lösungsmittel verändern. Beispielsweise kann der IBL ein fluoreszierendes Molekül, wie beispielsweise ein Ethidiumsalz, dessen Fluoreszenzintensität in hydrophober Umgebung steigt. Ähnlich dazu kann der IBL ein Fluoresceinderivat sein, dessen Farbe sich zwischen wässrigen und nichtpolaren Lösungsmitteln ändert.
  • In einer Ausführungsform kann der DBL an eine Perle gebunden sein, d.h. eine "Decoderperle", die gegebenenfalls eine Markierung, wie beispielsweise ein Fluorophor, trägt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das IBL-DBL-Paar im Wesentlichen komplementäre einsträngige Nucleinsäuren. In dieser Ausführungsform können die Bindungsliganden als "Identifikatorsonden" und "Decodersonden" bezeichnet werden. Im Allgemeinen weisen die Identifikator- und Decodersonden entlang ihrer Länge etwa 4 bis etwa 1.000 Basenpaare auf, wobei etwa 6 bis etwa 100 bevorzugt und etwa 8 bis etwa 40 besonders bevorzugt sind. Wichtig ist hier, dass die Sonden lang genug sind, um spezifisch zu sein, d.h. um zwischen verschiedenen IBL-DBL-Paaren zu unterscheiden, und gleichzeitig kurz genug sind, sowohl a) eine Dissoziation, falls nötig, unter geeigneten Versuchsbedingungen, als auch b) eine effiziente Hybridisierung zuzulassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform, wie nachstehend genauer dargelegt, binden die IBLs nicht an DBLs, sondern es werden die IBLs als Identifikatorgruppierungen ("IMs") eingesetzt, die direkt, beispielsweise unter Verwendung von Massenspektroskopie, identifiziert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten die Mikrokügelchen keine optische Signatur. Das heißt, dass, so wie in der WO 98/40726, WO 00/16101, den U.S.-Patenten Nr. 6.023.540, 6.327.410 und 6.266.459 beschrieben, jede Subpopulation von Mikrokügelchen gegebenenfalls eine einzigartige optische Signatur oder optische Markierung umfasst, die zur Identifikation des einzigartigen bioaktiven Mittels dieser Subpopulation von Mikrokügelchen verwendet wird; das bedeutet, dass zur Decodierung die optischen Eigenschaften der Perlen herangezogen werden, sodass eine Perle, die die einzigartige optische Signatur umfasst, von den Perlen an anderen Stellen mit anderen optischen Signaturen unterschieden werden kann. So wird jedem bioaktiven Mittel eine einzigartige optische Signatur zugeteilt, sodass die Mikrokügelchen, die die dieses bioaktive Mittel umfassen, auf der Grundlage dieser Signatur identifizierbar sind. Derartige optische Signaturen umfassen Farbstoffe, üblicherweise Chromophore oder Fluorophore, die in den Perlen eingeschlossen oder an diese angebunden wurden. Zur Diversität der optischen Signaturen werden unterschiedliche Fluorochrome, verschiedene Mischverhältnisse von Fluorochromen und verschiedene Konzentrationen (Intensitäten) von Fluorochromen verwendet.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform basieren die Anordnungen ausschließlich auf den optischen Eigenschaften zur Decodierung der Anordnungen. Wie jedoch Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung wissen, ist es in einigen Ausführungsformen möglich, optische Signaturen als zusätzliches Codierungsverfahren in Kombination mit anderen, nachstehend beschriebenen Verfahren zu benutzen. So kann beispielsweise, wie nachstehend detaillierter dargelegt wird, die Größe der Anordnung wirksam gesteigert werden, während nur ein Satz an Decodergruppierungen auf verschiedene Arten eingesetzt wird, von denen eine die Verwendung optischer Signaturen auf einigen der Perlen darstellt. So ermöglicht beispielsweise die Verwendung eines "Satzes" an Decodermolekülen, die Verwendung zweier Perlenpopulationen, eine mit und eine ohne optische Signatur, die wirksame Steigerung der Anordnungsgröße. Die Verwendung multipler optischer Signaturen steigert auf ähnliche Weise die mögliche Größe der Anordnung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst jede Perlensubpopulation eine Vielzahl verschiedener IBLs. Durch die Verwendung einer Vielzahl verschiedener IBLs zum Codieren für ein jedes bioaktive Mittel wir die Anzahl der möglichen einzigartigen Codes wesentlich gesteigert. Das bedeutet, dass durch die Verwendung eines einzigen IBL pro bioaktives Mittel die Größe der Anordnung der Zahl einzigartiger IBLs entspricht (unter der Annahme, dass es zu keiner nachstehend erläuterten "Wiederverwendung" kommt). Unter Verwendung einer Vielzahl n von verschiedenen IBLs pro Perle kann die Größe der Anordnung auf 2n gesteigert werden, wenn die Gegenwart oder Abwesenheit eines jeden IBL als Indikator herangezogen wird. So erzeugt beispielsweise die Zuordnung von 10 IBLs pro Perle eine 10-Bit-Binärcode, worin jedes Bit als "1" (IBL gegenwärtig) oder "0" (IBL abwesend) bezeichnet werden kann. Ein 10-Bit-Binärcode weist 210 mögliche Varianten auf. Die Größe der Anordnung kann jedoch, so wie in Folge ausführlicher erläutert, weiter gesteigert werden, wenn ein zusätzlicher Parameter einbezogen wird, wie beispielsweise Konzentration oder Intensität; so kann beispielsweise bei der Verwendung zweier Konzentrationen des IBL die Anordnungsgröße auf 3n gesteigert werden. Somit wird in dieser Ausführungsform jedem einzelnen bioaktiven Mittel in der Anordnung eine Kombination aus IBLs zugeordnet, die den Perlen vor oder nach der Synthese des bioaktiven Mittels, d.h. dem gleichzeitigen Zusatz von IBLs und den Komponenten des bioaktiven Mittels, zugesetzt werden kann.
  • Alternativ dazu kann, wenn das bioaktive Mittel ein Polymer aus verschiedenen Resten ist, d.h. wenn das bioaktive Mittel ein Protein oder eine Nucleinsäure ist, die Kombination verschiedener IBLs zur Klärung der Sequenz des Proteins oder der Nucleinsäure verwendet werden.
  • So kann beispielsweise unter Verwendung von zwei unterschiedlichen IBLs (IBL1 und IBL2) die erste Position einer Nucleinsäure geklärt werden: Beispielsweise kann Adenosin durch die Gegenwart von IBL1 und IBL2 dargestellt werden; Thymidin kann durch die Gegenwart von IBL1 und die Abwesenheit von IBL2 dargestellt werden; Cytosin kann durch die Gegenwart von IBL2 und die Abwesenheit von IBL1 dargestellt werden; und Guanosin kann durch die Abwesenheit beider dargestellt werden. Die zweite Position der Nucleinsäure kann auf ähnliche Wesie unter Verwendung von IBL3 und IBL4 bestimmt werden; somit steht die Gegenwart von IBL1, IBL2, IBL3 und IBL4 für die Sequenz AA; IBL1, IBL2 und IBL3 für die Sequenz AT; IBL1, IBL3 und IBL4 für die Sequenz TA usw. Für die dritte Position werden IBL5 und IBL6 verwendet usw. Auf diese Weise kann die Verwendung von 20 verschiedenen Identifikatoren ein einzigartiger Code für jedes mögliche 10-mer erzeugt werden.
  • Das System für Proteine ist ähnlich, benötigt jedoch eine größere Anzahl an unterschiedlichen IBLs zur Identifikation einer jeden Position, je nachdem, welche Diversität an jeder Position zugelassen wurde. Wurde beispielsweise jede Aminosäure an jeder Position zugelassen, so werden 5 verschiedene IBLs für jede Position benötigt. Wurden hingegen, so wie oben beschrieben, zufällige Peptide als bioaktive Mittel eingesetzt, so kann eine Beeinflussung in das System integriert werden; nicht alle Aminosäuren können an allen Positionen gegenwärtig sein, und einige Positionen können vorbestimmt sein; dementsprechend besteht gegebenenfalls die Möglichkeit, vier verschiedene IBLs pro Aminosäure zu verwenden.
  • Auf diese Weise kann eine Art "Strichcode" für jede Sequenz gebildet werden; die Gegenwart bzw. Abwesenheit eines jeden einzelnen IBL ermöglicht die Identifikation jedes bioaktiven Mittels.
  • Zudem ermöglicht die Verwendung verschiedener Konzentrationen oder Dichten der IBLs eine Art "Wiederverwendung". Weist beispielsweise die Perle, die ein erstes Mittel umfasst, eine 1X-Konzentration des IBL auf, und eine zweite Perle, die ein zweites Mittel umfasst, eine 10X-Konzentration des IBL auf, so ermöglicht die Verwendung von Sättigungskonzentrationen des entsprechenden markierten DBL dem Benutzer, die beiden Perlen zu unterscheiden.
  • Wurden die Mikrokügelchen, die die Kandidatenmittel und die einzigartigen Markierungen umfassen, hergestellt, werden sie dem Substrat zur Ausbildung einer Anordnung zugesetzt. Im Allgemeinen werden die Verfahren zur Herstellung der Anordnungen und zur Decodierung der Anordnungen durchgeführt, um die Anzahl der verschiedenen Kandidatenmittel, die einzigartig codiert werden können, größtmöglich zu steigern. Die Zusammensetzungen der Erfindung können auf verschiedene Arten hergestellt werden. Im Allgemeinen werden die Anordnungen durch Zusetzen einer die Perlen enthaltenden Lösung oder Aufschlämmung zu einer Oberfläche hergestellt, die die Bindungsstellen für die Perlen umfasst. Dies kann in einer Vielzahl von Puffern durchgeführt werden, einschließlich wässriger und organischer Lösungsmittel und Gemischen. Das Lösungsmittel kann abdampfen und die überschüssigen Perlen entfernt werden.
  • In einer Ausführungsform werden die Perlen oder Mikrokügelchen durch die Mikrofluidikkanäle mit der Anordnung kontaktiert oder auf dieser verteilt. Das heißt, dass die Perlen durch die Kanäle strömen und in den Vertiefungen des Substrats absetzen gelassen werden. Die Perlen können sowohl vor als auch nach dem Kontaktieren des Substrats verteilt werden. Eine bevorzugte Ausführungsform setzt ein Kontaktieren der Perlen und der Probe vor der Beladung der Anordnung ein, kombiniert mit einem Mischvorgang, da dies die Bindungskinetik verbessern kann. Werden die Perlen mit der Probe vor der Verteilung kontaktiert, so wird die Lösung gegebenen falls in eine Mikrowellanordnung "geleert". Das bedeute, dass die Probe einschließlich der Perlen in einen Kanal oder eine Detektionsvertiefung fließt, die Mirkowells umfasst. Die Perlen setzen sich in den Vertiefungen ab und der Probenüberschuss wird entfernt.
  • In einer alternativen Ausführungsform werden die Perlen auf der Anordnung, einschließlich der Faseroptikbündel, aufgebracht oder verteilt bevor die Anordnung mit dem Mikrofluidikchip kombiniert wird.
  • Es sollte festgehalten werden, dass nicht alle Stellen auf der Anordnung eine Perle umfassen müssen; d.h. es können gegebenenfalls einige Stellen auf dem Substrat vorliegen, die unbesetzt sind. Zudem kann es einige Stellen geben, die mehr als eine Perle enthalten, obwohl dies im Allgemeinen nicht bevorzugt ist.
  • In einigen Ausführungsformen, beispielsweise wenn eine chemische Anbindung durchgeführt wird, ist es möglich, die Perlen auf nichtzufällige oder geordnete Weise gebunden werden. Werden beispielsweise lichtaktivierbare Bindungslinker oder lichtaktivierbare Kleber oder Masken eingesetzt, können ausgewählte Stellen auf der Anordnung zur Anbindung geeignet gemacht werden, sodass sich eine definierte Perlenpopulation sich darauf ablagert.
  • Die Anordnungen der vorliegenden Erfindung sind so konstruiert, dass die Information bezüglich der Identität der Kandidatenmittel in die Anordnung eingebaut ist, sodass die zufällige Ablagerung der Perlen in den Faservertiefungen "decodiert" werden kann, um die Identifizierung des Kandidatenmittels an allen Positionen zu ermöglichen. Dies kann auf mehrere Weisen und vor, während bzw. nach der Verwendung der Anordnung zum Nachweis von Zielmolekülen geschehen, wie in der WO 99167641, U.S.-Patent Nr. 2002-0.132.221, der WO 01/46675 und WO 99/67641 beschrieben.
  • Nachdem die Anordnung hergestellt wurde wird sie nun "decodiert", um die Position eines oder mehrerer bioaktiver Mittel, d.h. jede Perlensubpopulation, auf der Substratoberfläche zu identifizieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein selektives Decodierungssystem eingesetzt. In diesem Fall werden nur jene Mikrokügelchen decodiert, deren optisches Signal aufgrund der Bindung des Zielanalyten eine Veränderung aufweist. Dies wird im Allgemeinen dann durchgeführt, wenn die Anzahl der "Treffer", d.h. der zu decodierenden Stellen, im Allgemeinen gering ist. Das bedeutet, dass die Anordnung zuerst unter Versuchsbedingungen in Abwesenheit der Zielanalyten gescannt wird. Die Probe, die die Zielanalyten enthält, wird zugesetzt, und ausschließlich jene Stellen, die ein verändertes optisches Signal aufweisen, werden decodiert. Beispielsweise können die Perlen, die entweder an den positiven oder an den negativen Signalstellen liegen, entweder selektiv markiert oder von der Anordnung entfernt werden (beispielsweise durch den Einsatz lichtspaltbarer Linker), woraufhin sie in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACS) sortiert oder angereichert werden. Das heißt, dass entweder alle negativen Perlen von der Anordnung entfernt werden, woraufhin die positiven entweder entfernt oder in situ analysiert werden, oder es werden alternativ dazu alle positiven entfernt und analysiert. Alternativ dazu umfassen die Markierungen gegebenenfalls halogenierte aromatische Verbindungen, und der Nachweis der Markierung wird beispielsweise mittels Gaschromatographie, chemischer Markierungen, isotoper Markierungen, Massenspektralmarkierungen vollzogen.
  • Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann dies auch in Systemen durchgeführt werden, in denen die Anordnung nicht decodiert ist; d.h. eine Korrelation zwischen Perlenzusammensetzung und Stelle ist nicht immer eine zwingende Voraussetzung. In dieser Ausführungsform werden die Perlen auf die Anordnung geladen und der Test durchgeführt. Die "Positiven", d.h. jene Perlen, deren optisches Signal eine Veränderung aufweist, wie nachstehend genauer beschrieben wird, werden daraufhin markiert, um sie von den "negativen" Perlen zu unterscheiden oder zu trennen. Hierfür gibt es verschiedene Möglichkeiten, vorzugsweise unter Verwendung faseroptischer Anordnungen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält je de Perle einen fluoreszierenden Farbstoff. Nach dem Test oder der Identifikation der "Positiven" oder "aktiven Perlen" wird Licht entweder nur entlang den positiven Fasern oder nur entlang den negativen Fasern ausgestrahlt, im Allgemeinen in Gegenwart eines lichtaktivierten Reagens (typischerweise gelöster Sauerstoff). Im ersteren Fall werden alle aktiven Perlen lichtgebleicht. Bei der nichtselektiven Entfernung aller Perlen mit anschließender Sortierung, beispielsweise unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS), können die nichtfluoreszierenden aktiven Perlen von den fluoreszierenden negativen Perlen getrennt werden. Werden alternativ dazu die negativen Fasern mit Licht bestrahlt, so fluoreszieren alle Negativen nicht, während alle Positiven fluoreszent sind, und die Sortierung kann vonstatten gehen. Die Bestimmung des angebundenen bioaktiven Mittels kann direkt, beispielsweise unter Einsatz von Massenspektroskopie, durchgeführt werden.
  • Alternativ dazu kann die Identifizierung unter Verwendung von Identifikatorgruppierungen ("IMs") durchgeführt werden, die den IBLs zwar ähnlich sind, jedoch nicht unbedingt an DBLs binden. Das heißt, dass anstatt einer direkten Klärung der Struktur des bioaktiven Mittels die Zusammensetzung der IMs als Identifikator dienen kann. So kann beispielsweise eine spezifische IM-Kombination der Codierung der Perle dienen und zur Identifizierung des Mittels in der Perle nach der Freisetzung von der Perle, gefolgt von einer Analyse, beispielsweise unter Verwendung eines Gaschromatographen oder eines Massenspektroskops, verwendet werden.
  • Alternativ dazu umfasst jede Perle einen nichtfluoreszierenden Vorläufer eines fluoreszierenden Farbstoffs, anstatt jede Perle mit einem fluoreszierenden Farbstoff zu versehen. Beispielsweise kann unter Verwendung lichtspaltbarer Schutzgruppen, beispielsweise bestimmte ortho-Nitrobenzylgruppen, auf einem fluoreszierenden Molekül die Lichtaktivierung des Fluorochroms durchgeführt werden. Nach dem Test wird Licht wiederum entweder nur entlang den "positiven" Fasern oder nur entlang den "negativen" Fasern ausgestrahlt, um diese Populationen zu unterscheiden. Die beleuchteten Vorläufer werden dann in einen fluoreszierenden Farbstoff umgewandelt. Alle Perlen werden dann in der Anordnung entfernt und sortiert, um Populatio nen aus fluoreszierenden und nichtfluoreszierenden Perlen (entweder die positiven und die negativen oder umgekehrt) zu bilden
  • In einer alternativen Ausführungsform schleißen die Anbindungsstellen der Perlen (beispielsweise die Vertiefungen) ein photopolymerisierbares Reagens ein, oder das photopolymerisierbare Mittel wird der bereits konstruierten Anordnung zugesetzt. Nach dem Test wird Licht wiederum entweder nur entlang den "positiven" Fasern oder nur entlang den "negativen" Fasern ausgestrahlt, um diese Populationen zu unterscheiden. Als Folge der Bestrahlung sind entweder alle Positiven oder alle Negativen polymerisiert und in den Stellen fixiert oder an dies gebunden, während die andere Perlenpopulation aus der Anordnung entfernt werden kann.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Position eines jeden bioaktiven Mittels mithilfe von Decoder-bindenden Liganden (DBLs) ermittelt. Wie oben dargelegt binden die DBLs entweder an Identifikator-bindende Liganden, falls gegenwärtig, oder an die bioaktiven Mittel selbst, vorzugsweise dann, wenn das bioaktive Mittel ein Protein oder eine Nucleinsäure ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform bindet der DBL an den IBL, wie oben beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die bioaktiven Mittel einsträngige Nucleinsäuren, und der DBL ist eine im Wesentlichen komplementäre einsträngige Nucleinsäure, hierin als Decodersonde bezeichnet, die an das bioaktive Mittel, bindet (hybridisiert). Eine Decodersonde, die im Wesentlichen zu jeder Kandidatensonde komplementär ist, wird hergestellt und zur Decodierung der Anordnung eingesetzt. In dieser Ausführungsform sollten die Kandidatensonden und die Decodersonden ausreichend lang sein (und der Decodierungsschritt unter geeigneten Bedingungen durchgeführt werden), um Spezifität zuzulassen; d.h. jede Kandidatensonde bindet an die entsprechende Decodersonde mit ausreichen Spezifität, um die Unterscheidung einer jeden der Kandidatensonden zu ermöglichen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die DBLs entweder direkt oder indirekt markiert. Unter "markiert" ist hierin eine Verbindung zu verstehen, die zumindest über ein angebundenes Element, Isotop oder chemische Verbindung verfügt, die den Nachweis der Verbindung ermöglicht. Im Allgemeinen lassen sich Markierungen in drei Klassen einteilen: a) isotope Markierungen, welche radioaktive oder schwere Isotope sein können; b) magnetische, elektrische, thermische; und c) farbgebende oder leuchtende Farbstoffe; obwohl Markierungen auch Enzyme und Teilchen, wie beispielsweise magnetische Teilchen, umfassen. Bevorzugte Markierungen schließen Leuchtmarkierungen, einschließlich Fluorochromen, ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der DBL direkt markiert, d.h. der DBL umfasst eine Markierung. In einer alternativen Ausführungsform ist der DBL indirekt markiert, d.h. ein markierender Bindungsligand (LBL), der an den DBL bindet, wird verwendet. In dieser Ausführungsform kann das markierender Bindungsligand-DBL-Paar wie oben die IBL-DBL-Paare beschrieben sein.
  • Demzufolge wird die Identifizierung der Position der einzelnen Perlen (oder Perlensubpopulationen) durch einen oder mehrere Decodierungsschritte durchgeführt, umfassend eine Bindung zwischen dem markierten DBL und dem IBL oder dem bioaktiven Mittel (d.h. Hybridisierung zwischen der Kandidatensonde und der Decodersonde, wenn das bioaktive Mittel eine Nucleinsäure ist): Nach dem Decodieren können die DBLs entfernt werden und die Anordnung kann verwendet werden; unter einigen Umständen jedoch, beispielsweise wenn der DBL an einen IBL und nicht an das bioaktive Mittel bindet, ist das Entfernen des DBLs nicht notwendig (obwohl dies unter bestimmten Umständen wünschenswert sein kann). Zudem kann der Decodierungsschritt, wie hierin dargelegt, sowohl vor der Verwendung der Anordnung für den Test, während des Tests und nach dem Test durchgeführt werden.
  • In einer Ausführungsform wird ein einziger Decodierungsschritt durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird jeder DBL mit einer einzigartigen Markierung versehen, sodass die Anzahl der einzigartigen Markierungen der Anzahl der bioaktiven Mittel entspricht oder größer als diese ist (obwohl in einigen Fällen die einzigartigen Mar kierungen "wiederverwendet" werden können, so wie hierin beschrieben ist; auf ähnliche Weise können auch sich geringfügig unterscheidende Varianten der Kandidatensonden denselben Decoder gemeinsam verwenden, falls sie Varianten einem anderen Parameter entsprechend codiert sind, d.h. Perlengröße oder Markierung). Für jedes bioaktive Mittel oder jeden IBL wird ein DBL hergestellt, der an dieses oder diesen spezifisch bindet und ein einzigartige Markierung umfasst, beispielsweise ein oder mehrere Fluorochrome. Die Identität eines jeden DBL, sowohl seine Zusammensetzung (d.h. seine Sequenz, wenn es sich um eine Nucleinsäure handelt) als auch seine Markierung, sind somit bekannt. durch das Zusetzten der DBLs zur Anordnung, die die bioaktiven Mittel umfasst, unter Bedingungen, die die Ausbildung von Komplexen (als Hybridisierungskomplexe bezeichnet, falls es sich bei den Komponenten um Nucleinsäuren handelt) zwischen den DBLs und den bioaktiven Mitteln oder den IBLs zulassen, kann die Position aller DBLs geklärt werden. Dies ermöglicht die Identifizierung der Position aller bioaktiven Mittel; die zufällige Anordnung wurde entschlüsselt. Falls nötig können die DBLs entfernt werden und die Zielprobe aufgebracht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Anzahl an einzigartigen Markierungen kleiner als die Zahl der einzigartigen bioaktiven Mittel, wodurch eine sequenzielle Reihe an Decodierungsschritten durchgeführt wird. Um die Erläuterung zu vereinfachen wird diese Ausführungsform für Nucleinsäuren erklärt, obwohl auch andere Arten von bioaktiven Mitteln und DBLs nützlich sind. In dieser Ausführungsform werden die Decodersonden in n Sätze zur Decodierung unterteilt. Die Anzahl der Sätze entspricht der Anzahl an einzigartigen Markierungen. Jede Decodersonde wird in n getrennten Reaktionen mit n unterschiedlichen Markierungen versehen. Alle Decodersonden verfügen über dieselben n Markierungen. Die Decodersonden werden in Pools zusammengeführt, sodass jeder Pool nur über eine der n Markierungsversionen eines jeden Decoders verfügt und niemals zwei Decodersonden in allen Pools dieselbe Markierungsequenz aufweist. die Anzahl an Pools, die benötigt wird, um dies zu gewährleisten, wird durch die Anzahl der Decodersonden und n bestimmt. Die Hybridisierung eines jeden Pools am Substrat erzeugt an jeder Adresse ein Signal. Die sequenzielle Hybridisierung eines jeden Pools erzeugt einen einzigartigen, sequenzspezifischen Code für jede Kandidatensonde. So wird die Kandidatensonde an jeder Adresse in der Anordnung identifiziert. Werden beispielsweise 4 Markierungen verwendet können 4 × n sequenzielle Hybridisierungsvorgänge idealerweise 4n Sequenzen unterscheiden, obwohl in einigen Fällen gegebenenfalls mehrere Schritte nötig sind. Nach der Hybridisierung eines jeden Pools werden die Hybride denaturiert und die Decodersonden entfernt, sodass die Sonden nun einsträngig für den nächsten Hybridisierungsvorgang vorliegen (obwohl es auch möglich ist, begrenzte Mengen des Ziels zu hybridisieren, sodass die zur Verfügung stehende Sonde nicht gesättigt ist. Sequenzielle Hybridisierungsvorgänge können durchgeführt werden und durch Subtraktion der bestehenden Signale aus der vorangegangenen Hybridisierung analysiert werden).
  • Das Beispiel dient der Veranschaulichung. Angenommen es liegen eine Anordnung aus 16 Sonden-Nucleinsäuren (Nummer 1–16) und vier einzigartige Markierungen vor (beispielsweise vier verschiedene Fluophore, Markierungen A–D). Decodersonden 1–16 werden hergestellt, die den Sonden auf den Perlen entsprechen. Der erste Schritt besteht im Markieren der Decodersonden 1–4 mit der Markierung A, die Decodersonden 5–8 mit Markierung B, die Decodersonden 9– 12 mit Markierung C und die die Decodersonden 13–16 mit Markierung D. Die Sonden werden gemischt und der Pool mit der die Perlen und den angebunden Kandidatensonden umfassenden Anordnung kontaktiert. Die Position einer jeden Markierung (und somit eines jeden Decoder- und Kandidatensonden-Paars) wird nun bestimmt. Daraufhin wird der erste Satz an Decodersonden entfernt. Ein zweiter Satz wird zugesetzt, diesmal jedoch sind die Decodersonden 1, 5, 9 und 13 mit der Markierung A gekennzeichnet, die Decodersonden 2, 6, 10 und 14 mit der Markierung B gekennzeichnet, die Decodersonden 3, 7, 11 und 15 mit der Markierung C gekennzeichnet und die Decodersonden 4, 8, 12 und 16 mit der Markierung D gekennzeichnet. Somit enthielten jene Perlen, die die Markierung A bei beiden Decodierungsschritten umfassten, die Kandidatensonde 1; Markierung A beim ersten Decodierungsschritt und Markierung B beim zweiten Decodierungsschritt stand für umfassend Kandidatensonde 2; Markie rung A beim ersten Decodierungsschritt und Markierung C beim zweiten Decodierungsschritt steht für umfassend Kandidatensonde 3 usw.
  • In einer Ausführungsform werden die Decodersonden in situ markiert; das bedeutet, dass sie nicht vor der Decodierungsreaktion markiert werden müssen. In dieser Ausführungsform ist die eintretende Decodersonde kürzer als die Kandidatensonde, wodurch ein 5'-"Überstand" an der Decodersonde entsteht. Der Zusatz markierter ddNTPs (jedes mit einer einzigartigen Markierung versehen) und einer Polymerase ermöglicht den Zusatz der Markierungen auf spezifische Weise, wodurch ein sequenzspezifisches Signalmuster erzeugt wird. Auf ähnliche Weise können auch andere Modifikationen durchgeführt werden, einschließlich Ligation usw.
  • Außerdem ist es möglich, da die Größe der Anordnung von der Anzahl an einzigartigen Markierungen abhängt, einen Satz einzigartiger DBLs für eine größere Anzahl an Teststellen "wiederzuverwenden". Dies kann auf mehrere Weisen durchgeführt werden; beispielsweise durch die Verwendung von Subpopulationen, die optische Signaturen umfassen. Ähnlich verläuft die Verwendung einen Positionscodierungssystems innerhalb einer Anordnung; verschiedene Subbündel können den DBL-Satz wiederverwenden. Ähnlich auch eine Ausführungsform, die die Perlengröße als Codierungsparameter verwendet, wodurch die Wiederverwendung eines Satzes einzigartiger DBLs für jede Perlengröße möglich wird. Alternativ dazu kann das sequenzielle Teilbeladen von Anordnungen mit Perlen die Wiederverwendung von DBLs ermöglichen. Weiters kann es auch zum "Code-Sharing", der gemeinsamen Verwendung eines Codes, kommen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die DBLs gegebenenfalls wiederverwendet, indem einige Perlensubpopulationen optische Signaturen umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die optische Signatur im Allgemeinen ein Gemisch aus Reporter-Farbstoffen, vorzugsweise sind diese fluoreszierend. Durch Variieren des Gemischs (d.h. des Verhältnisses eines Farbstoffs zum anderen) und der Konzentration des Farbstoffs (was zu Unterschieden im Signal führt), können Matrizen einzigartiger Signale erzeugt werden. dies kann durch kovalentes Binden der Farb stoffe an die Oberfläche der Perlen oder alternativ dazu durch Einschließen des Farbstoffs im Inneren der Perle geschehen. Die Farbstoffe können Fluorochrome oder Phosphore sein, sind jedoch vorzugsweise weise fluoreszierende Farbstoffe, die aufgrund ihrer starken Signale ein gutes Signal:Geräusch-Verhältnis zur Decodierung bieten. Für die Erfindung geeignete Farbstoffe schließen fluoreszierende Lanthanoidkomplexe, einschließlich Europium- und Terbiumkomplexe, Fluorescin, Rhodamin, Tetramethylrhodamin, Eosin, Erythrosin, Pyren, Malachitgrün, Stilben, Lucifer-Gelb, Cascade BlueTM, Texas-Rot und andere, die in der 6. Ausgabe des "Molecular Probes Handbook" von Richard P. Haugland beschriebene, das hiermit ausdrücklich durch Verweis aufgenommen ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Codierung in einem Verhältnis von zumindest zwei Farbstoffen durchgeführt werden, obwohl auch mehrere Codierungsparameter, wie beispielsweise die Größe der Perlen, eingesetzt werden können. Zudem sind die Markierungen voneinander unterscheidbar; zwei verschiedene Markierungen können somit verschiedene Moleküle (d.h. zwei verschiedene Fluophore) oder alternativ dazu eine Markierung mit verschiedenen Konzentrationen und Intensitäten umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe kovalent an der Oberfläche der Perlen angebunden. Dies kann im Allgemeinen so wie für die Bindung der bioaktiven Mittel beschrieben unter Verwendung von funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der Perlen durchgeführt werden. Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist werden diese Anbindungen zur Minimierung der Einwirkungen auf die Farbstoffe durchgeführt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Farbstoffe nichtkovalent mit den Perlen verbunden, im Allgemeinen durch Einbetten der Farbstoffe in den Poren der Perlen.
  • Weiters ist das Codieren mit Verhältnissen von zwei oder mehreren Farbstoffen anstelle von Konzentrationen eines einzigen Farbstoffs bevorzugt, da dies für Unem pfindlichkeit gegenüber der Intensität des Lichts sorgt, das zum Abfragen der Signatur des Reporterfarbstoffs eingesetzt wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein raum- oder positionsbezogenes Codierungssystem verwendet. In dieser Ausführungsform werden Subbündel oder Subanordnungen (d.h. Abschnitte der Gesamtanordnung) verwendet. Analog zum Telefonsystem entspricht jede Subanordnung einer "Ortsvorwahl", die über dieselben Markierungen (d.h. Telefonnummern) wie andere Subanordnungen verfügen kann, die auf der Grundlage der Position der Subanordnung unterschieden werden. So kann beispielsweise dieselbe einzigartige Markierung von Bündel zu Bündel wiederverwendet werden. Die Verwendung von 50 einzigartigen Markierungen in Kombination mit 100 verschiedenen Subanordnungen kann somit eine Anordnung aus 5.000 verschiedenen bioaktiven Mittel ergeben. In dieser Ausführungsform ist es von Bedeutung, dass die Identifizierung eines Bündels und eine Unterscheidung dessen von anderen möglich ist, was im Allgemeinen händisch oder durch die Verwendung von Marker-Perlen, d.h. Perlen mit einzigartigen Markierungen für jede Subanordnung, durchgeführt wird.
  • In alternativen Ausführungsformen können weitere Codierungsparameter hinzugefügt werden, wie beispielsweise die Größe der Mirkokügelchen. Gegebenenfalls erlaubt beispielsweise die Verwendung von Perlen unterschiedlicher Größe auch die Wiederverwendung von DBL-Sätzen; das bedeutet, dass die Möglichkeit gegeben ist, Mikrokügelchen von unterschiedlichen Größen zur Erweiterung der Codierungsparameter der Mikrokügelchen verwendet werden können. Optische Faseranordnungen können so hergestellt werden, dass sie Punkte mit verschiedenen Faserdurchmessern oder Querschnitten enthalten; alternativ dazu können zwei oder mehr Faseroptikbündel, von denen jedes andere Querschnitte der einzelnen Faser aufweist, zusammengefasst werden, um ein größeres Bündel zu bilden; oder es werden Faseroptikbündel mit Fasern desselben Querschnitts, jedoch mit unterschiedlichen Perlengrößen verwendet. Im Falle der unterschiedlichen Querschnitte können die größten Vertiefungen mit den größten Mikrokügelchen gefüllt werden, und schrittweise werden kleinere Mikrokügelchen in kleineren Vertiefungen untergebracht, bis alle Vertiefungsgrößen gefüllt sind. Auf diese Wesie könnte dasselbe Farbstoffverhältnis zur Codierung für Mikrokügelchen unterschiedlicher Größe, wodurch die Anzahl der in der Anordnung vorliegenden unterschiedlichen Oligonucieotidsequenzen oder chemischen Funktionalitäten erhöht wird. Obwohl dies hier für Faseroptiksubstrate dargelegt wurde, kann dieses so wie auch die anderen hierin beschriebenen Verfahren auch auf andere Substrate und mit anderen Anbindungsmethoden angewendet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Codieren und Decodieren durch sequenzielles Beladen der Anordnung mit den Mikrokügelchen durchgeführt. Wie zuvor das raumbezogene Codierungsverfahren beschrieben können auch in dieser Ausführungsform die optischen Signaturen wiederverwendet werden. In dieser Ausführungsform wird die Bibliothek aus Mikrokügelchen, von denen jedes ein unterschiedliches bioaktives Mittel umfasst (oder die Subpopulationen, von denen jede ein unterschiedliches bioaktives Mittel umfasst) in eine Vielzahl von Subbibliotheken unterteilt; beispielsweise können je nach Größe der gewünschten Anordnung und der Anzahl einzigartiger Markierungen 10 Subbibliotheken gebildet werden, von denen jede etwa 10 % der Gesamtbibliothek umfasst, wobei jede Subbibliothek in etwa dieselben einzigartigen Markierungen umfasst. Daraufhin wird die erste Subbibliothek dem Faseroptikbündel, das die Vertiefungen umfasst, zugesetzt, und die Position eines jeden bioaktiven Mittels wird, im Allgemeinen unter Verwendung von DBLs, bestimmt. In Folge wird die zweite Subbibliothek zugesetzt und die Position eines jeden bioaktiven Mittels erneut bestimmt. Das Signal umfasst nun in diesem Fall das Signal des "ersten" DBL und des "zweiten DBL", und durch den Vergleich der beiden Matrizen kann die Position einer jeden Perle in jeder Subbibliothek bestimmt werden. Auf ähnliche Weise ermöglicht der sequenzielle Zusatz der dritten, vierten usw. Subbibliothek ein Füllen der Anordnung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform kann "Code-Sharing" auf verschiedene Arten durchgeführt werden. In einer ersten Ausführungsform kann ein einziger Code (d.h. IBL/DBL-Paar) zwei oder mehreren Mitteln zugeteilt werden, wenn die Bindungsstärken der Zielanalyten einen ausreichen großen Unterschied aufweisen. Beispielswei se können zwei in einem mRNA-Quantifizierungstest verwendete Nucleinsäuresonden einen gemeinsam Code besitzen, wenn sich ihre Hybridisierungssignalintensitäten nicht überschneiden. Ähnlich könnten auch, wenn Analytenklassen erwünscht sind, alle Sonden für unterschiedliche Elemente einer Klasse, wie beispielsweise Kinasen oder G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, einen Code gemeinsam verwenden. Auf ähnliche Wesie kann eine derartige Anordnung auch zum Nachweis von Homologen bekannter Gene eingesetzt werden. In dieser Ausführungsform ist jedes Gen durch einen heterologen Sondensatz vertreten, der an unterschiedlichen Regionen des Gens hybridisiert (und deshalb unterschiedliche Sequenzen aufweist). Der Sondensatz verfügt über einen gemeinsamen Code. Ist ein Homolog gegenwärtig, kann dieser gegebenenfalls an einigen, jedoch nicht an allen Sonden hybridisieren. Der Homologiegrad kann gegebenenfalls durch den Anteil der hybridisierenden Sonden und die mittlere Hybridisierungsintensität angezeigt werden. Ähnlich könnten auch mehrere Antikörper für dasselbe Protein einen gemeinsamen Code verwenden.
  • Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist kann die Decodierung vor oder nach dem Einbringen des Detektionsmoduls in die Mikrofluidikvorrichtung erfolgen.
  • Wurden die Zusammensetzungen der Erfindung hergestellt sind sie für zahlreiche Anwendungen vonnutzen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen zum Sondieren einer Probenlösung hinsichtlich der Gegenwart oder Abwesenheit eines Zielanalyten eingesetzt, einschließlich der mengenmäßigen Quantifizierung des gegenwärtigen Zielanalyten, so wie dies oben definiert ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Zielanalyt eine Nucleinsäure. Die Tests werden in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden zur Gendiagnose eingesetzt. Es können beispielsweise Sonden unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren hergestellt werden, um Zielsequenzen, wie beispielsweise das Gen für nichtpolypösen Dickdarmkrebs, das BRCA1-Brustkrebsgen, P53, ein Gen, das mit einer Vielzahl von Krebsformen in Verbindung gebracht wird, das ApoE4-Gen, das auf ein erhöhtes Alzheimerrisiko schließen lässt, wobei ein einfache präsymptomatische Screening-Untersuchung von Patienten möglich ist, Mutationen im Mukoviszidose-Gen, Cytochrom p450s oder andere, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, nachzuweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Viren und Bakterien unter Verwendung der Komplexe der Erfindung nachgewiesen. In dieser Ausführungsform werden Sonden so konzipiert, um Zielsequenzen von einer Vielzahl von Bakterien und Viren nachzuweisen. Beispielsweise basieren derzeitige Blutuntersuchungsverfahren auf dem Nachweis von HIV-Antikörpern. Die hierin geoffenbarten Verfahren ermöglichen ein direktes Screenig klinischer Proben zum Nachweis von HIV-Nucleinsäuren, insbesondere von hochkonservierten HIV-Sequenzen. Zudem wird so eine direkte Überwachung des im Patienten zirkulierenden Virus als ein verbessertes Verfahren zur Bewertung der Wirkung von Antivirus-Therapien ermöglicht. Analog dazu können auch mit Leukämie in Verbindung stehende Viren, HTLV-I und HTLV-II, auf diese Weise nachgewiesen werden. Auch kann so der Nachweis für bakterielle Infektionen, wie beispielsweise Tuberkulose, Chlamydien und andere sexuell übertragbare Krankheiten erbracht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nucleinsäuren der Erfindung als Sonden für toxische Bakterien bei der Untersuchung von Wasser- und Lebensmittelproben eingesetzt. Beispielsweise können Proben behandelt werden, Bakterien zu lysieren und deren Nucleinsäuren freizusetzen, woraufhin Sonden zur Erkennung von Bakterienstämmen eingesetzt werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, von pathogenen Stämmen, wie beispielsweise Salmonellen, Campylobacter, Vibrio cholerae, Leishmania, enterotoxische E. coli-Stämme und Legionärskrankeitsbakterien. Auch können auf ähnliche Weise Strategien der biologischen Sanierung mithilfe der Zusammensetzungen der Erfindung bewertet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden für forensische "genetische Fingerabdrücke" eingesetzt, um DNA von einem Tatort mit Proben von Opfern und Verdächtigen zu vergleichen.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden die Sonden in einer Anordnung zur Sequenzierung durch Hybridisierung verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch als Methode zum Nachweis von Mutationen oder Fehlpaarungen in Nucleinsäure-Zielsequenzen Anwendung finden. In jüngster Zeit beispielsweise lag ein Schwerpunkt auf der Analyse des Zusammenhangs zwischen genetischer Variabilität und Phänotypus unter Verwendung von polymorphen DNA-Markern. In früheren Arbeiten wurden kurze tandemartige Wiederholungen (STRs) als polymorphe Positionsmarker eingesetzt; seit kurzem aber liegt der Schwerpunkt auf der Verwendung von Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs), die mit einer mittleren Häufigkeit von mehr als 1 pro Kilobase in der genomischen DNA des Menschen auftreten. Einige SNPs, insbesondere jene in der und um die codierende Sequenz befindlichen, sind wahrscheinlich die unmittelbare Ursache von therapeutisch relevanten phänotypischen Varianten. Es gibt mehrere wohl bekannte Polymorphismen, die klinisch bedeutsame Phänotypen verursachen; beispielsweise stehen die ApoE2/3/4-Varianten in Verbindung mit verschiedenen relativen Alzheimerrisiken und anderen Krankheiten (vgl. Cordor et al., "Science", 261 (1993)). Die Multiplex-PCR-Amplifikation von SNP-Loci mit folgender Hybridisierung an Oligonucleotidanordnungen erwies sich als präzises und verlässliches Verfahren zur gleichzeitigen Genotypisierung von zumindest Hunderten von SNPs; vgl. Wang et al., "Science", 280:1077 (1998); vgl. auch Schafer et al., "Nature Biotechnology", 16:33–39 (1998). Mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können die Anordnungen nach dem Stand der Technik auf einfache Weise ersetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zusammensetzungen der Erfindung zum Screening von bioaktiven Mitteln zur Suche nach einem Mittel, das an ein Zielmolekül bindet und vorzugsweise dessen Funktion ändert, verwendet. Wie zuvor beschrieben kann eine Vielzahl unterschiedlicher Testformate eingesetzt werden, wie für Fachleute auf diesem Gebiet ersichtlich ist. Im Allgemeinen ist der Zielanalyt, für ein Bindungspartner gesucht wird, markiert; die Bindung des Zielanalyten durch das bioaktive Mittel führt zur Übertragung der Markierung an die Perle, worauf der Nachweis folgt.
  • Im Allgemeinen wird eine Probe, die den Zielanalyten (ob zum Nachweis des Zielanalyten oder zum Screening nach Bindungspartnern des Zielanalyten) enthält, der Anordnung unter Bedingungen zugesetzt, die zum Binden des Zielanalyten an zumindest eines der bioaktiven Mittel geeignet sind; d.h. im Allgemeinen unter physiologischen Bedingungen. Daraufhin wird die Gegenwart bzw. Abwesenheit des Zielanalyten nachgewiesen. Wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, kann dies auf verschiedene Weisen durchgeführt werden, im Allgemeinen durch die Verwendung einer Veränderung im optischen Signal. diese Veränderung kann sich durch zahlreiche verschiedene Mechanismen ergeben. Einige Beispielen schließen die Bindung eines farbmarkierten Analyten an die Perle, die Erzeugung einer Farbstoffspezies auf oder nahe den Perlen, die Zerstörung einer existierenden Farbstoffspezies, eine Veränderung der optischen Signatur nach der Wechselwirkung des Analyten mit dem Farbstoff auf der Perle oder jedwedes andere optisch erkennbare Ereignis ein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ändert sich das optische Signal als Folge der Bindung eines direkt oder indirekt mit einer nachweisbaren Markierung, vorzugsweise optischen Markierung, wie beispielsweise Fluorochrom, versehenen Zielanalyten. Wird beispielsweise ein proteinhältiger Zielanalyt verwendet, so kann dieser mit einem Fluophor direkt oder beispielsweise durch die Verwendung eines markierten Antikörpers indirekt markiert sein. Ähnlich sind Nucleinsäuren auf einfache Wesie mit Fluorochromen zu markieren, beispielsweise während einer PCR-Amplifikation, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Alternativ dazu kann nach der Bindung der Zielsequenzen ein Hybridisierungsindikator als Markierung verwendet werden. Hybridisierungsindikatoren verbinden sich bevorzugt und üblicherweise irreversibel mit doppelsträngigen Nucleinsäuren. Hybridisierungsindikatoren umfassen Interkalatoren und an große und/oder kleine Furchen bindende Moleküle. In einer bevorzug ten Ausführungsform werden gegebenenfalls Interkalatoren herangezogen; da es ausschließlich in der Gegenwart von doppelsträngigen Nucleinsäuren zu einer Interkalation kommt, leuchtet die Markierung nur in der Gegenwart des Zielhybridisierungskomplexes auf. So wird als Folge der Bindung des Zielanalyten an das bioaktive Mittel an dieser Stelle ein neues optisches Signal erzeugt, das dann nachgewiesen werden kann.
  • Alternativ dazu erzeugt in einigen Fällen, wo wie zuvor erwähnt, der Zielanalyt, wie beispielsweise ein Enzym, eine Spezies, die optisch entweder direkt oder indirekt nachweisbar ist.
  • Weiters kann in einigen Ausführungsformen eine Veränderung der optischen Signatur als Basis des optischen Signals herangezogen werden. Beispielsweise ändert gegebenenfalls die Wechselwirkung einiger chemischer Zielanalyten mit einigen fluoreszierenden Farbstoffen auf den Perlen die optische Signatur, wodurch ein anderes optisches Signal erzeugt wird.
  • Wie Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist kann in einigen Ausführungsformen die Gegenwart bzw. Abwesenheit des Zielanalyten durch Verwendung von Veränderungen in anderen optischen oder nichtoptischen Signalen bestimmt werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, durch oberflächenverstärkte Raman-Spektroskopie, Oberflächen-Plasmonresonanz, Radioaktivität usw.
  • Die Tests können unter verschiedensten Versuchsbedingungen durchgeführt werden, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist. Eine Vielzahl an Reagenzien kann in den Screening-Tests eingebunden werden. Diese umfassen Reagenzien wie beispielsweise Salze, neutrale Proteine, z.B. Albumin, Detergenzien, usw., die zur Vereinfachung der optimalen Protein-Protein-Bindung und/oder zur Reduktion nichtspezifischer oder hintergründiger Wechselwirkungen verwendet werden können. Ebenfalls können Reagenzien eingesetzt werden, die die Effizienz des Tests anderweitig steigern, wie beispielsweise Proteaseinhibitoren, Nucleaseinhibitoren, antimikrobielle Mittel usw. Das Gemisch der Komponenten kann in jeder beliebigen Reihenfolge zugesetzt werden, die für benötigten Bindungen sorgt. Verschiedene Hemm- und Waschschritte können, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden Konkurrenz-Hybridisierungstests mit zwei Farben durchgeführt. Diese basieren gegebenenfalls auf herkömmliche Sandwich-Tests. Die Perlen umfassen eine Fängersequenz, die an einer Stelle (stromauf oder stromab) des SNP liegt, um die Zielsequenz einzufangen. zwei SNP-Allel-spezifische Sonden, von denen jede mit einem anderen Fluorophor markiert ist, werden an die Zielsequenz hybridisiert. Der Genotypus kann aus einem Verhältnis der zwei Signale herausgelesen werden, wobei die korrekte Sequenz im Allgemeinen eine bessere Bindung aufweist. Dies bietet den Vorteil, dass die Zielsequenz selbst nicht markiert werden muss. Zudem bedeutet dies, da die Sonden konkurrieren, dass die Bindungsbedingungen nicht optimiert sein müssen. Unter Bedingungen, unter denen eine fehlgepaarte Sonde stabil gebunden verbleiben würde, kann sie eine korrekt gepaarte Sonde noch immer verdrängen. Der Konkurrenz-Test kann somit unter derartigen Bedingungen eine bessere Unterscheidung bereitstellen. Da zahlreiche Tests parallel ausgeführt werden können die Bedingungen nicht für jede Sonde gleichzeitig optimiert werden. Ein Konkurrenz-Test-System kann somit dazu beitragen, nicht optimale Bedingungen für die Unterscheidung von Fehlpaarungen wettzumachen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Didesoxynucleotid-Kettenabschluss-Sequenzierung unter Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung durchgeführt. In dieser Ausführungsform wird eine DNA-Polymerase zur Extension eines Primers unter Einsatz von Fluoreszenz-markierten ddNTPs verwendet. Das 3'-Ende des Primers befindet sich angrenzend an die SNP-Stelle. Auf diese Weise ist eine einfache Basenextension komplementär zur Sequenz an der SNP-Stelle. Werden vier verschiedene Fluorophore, eines für jede Base, verwendet, so kann die SNP-Sequenz aus dem Vergleich der vier basenspezifischen Signale abgeleitet werden. Dies kann auf mehrere Weisen geschehen. In einer ersten Ausführungsform kann die Fängersonde extendiert werden; bei dieser Herangehensweise muss die Sonde entweder 5'-3' an der Perle synthetisiert oder am 5' Ende gebunden werden, um so ein freies 3'-Ende für die Polymerase-Extension bereitzustellen. Alternativ dazu kann ein Test vom Sandwich-Typ durchgeführt werden; in dieser Ausführungsform wird das Ziel auf der Probe durch eine Sonde eingefangen, woraufhin ein Primer anelliert und extendiert wird. Auch hier im letzteren Fall muss die Zielsequenz nicht markiert werden. Zudem stellt dies gesteigerte Stringenz bereit, da Sandwich-Tests zweier spezifischer Wechselwirkungen bedürfen, was insbesondere für die Analyse von komplexen Proben hilfreich ist.
  • Die SNP-Analyse kann auch unter Einsatz von Pyrosequenzierung unter anderen Verfahren durchgeführt werden, so wie allgemein in den U.S.-Patenten Nr. 2002-0.177.141, Nr. 2003-0.108.867, Nr. 6.355.431 und der WO 00/63437 beschrieben.
  • In einigen Ausführungsformen findet der Einsatz von Adapter, so wie im U.S.-Patent Nr. 6.355.431 beschrieben, in der Erfindung Anwendung.
  • Zusätzlich ist es möglich, falls der Zielanalyt und der DBL an das Mittel binden, den Nachweis von nichtmarkierten Zielanalyten mittels konkurrierender Decodierung zu erbringen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Verfahren der Erfindung für Anordnungsqualitätskontrollen vonnutzen. Vor dieser Erfindung wurden keine Verfahren beschrieben, die einen positiven Test der Leistung einer jeden Sonde: in jeder Anordnung bereitstellen. Das Decodieren der Anordnung stellt nicht nur einen solchen Test bereit, sondern führt diesen unter Verwendung der während des Decodierungsvorgangs selbst erhaltenen Daten durch. Deshalb ist keine zusätzliche Versuchsarbeit vonnöten. Dies Erfindung bedarf ausschließlich eines Satzes an Datenanalyse-Algorithmen, der in einer Software codiert werden kann.
  • Durch das Qualitätskontrollverfahren kann eine Vielzahl systematischen und zufälligen Problemen, die in einer Anordnung auftreten, identifiziert werden. Zufällig gegenwärtige Staubkörnchen oder andere Schmutzstoffe können gegebenenfalls dazu führen, dass einige Sensoren ein unkorrektes Signal emittieren – dies kann nun wäh rend des Decodierens nachgewiesen werden. Das Fehlen eines oder mehr Mittel in multiplen Anordnungen kann ebenfalls nachgewiesen werden. Ein Vorteil dieses Qualitätskontrollverfahrens liegt darin, dass es unmittelbar vor dem Test selbst durchgeführt werden kann und dass es sich hierbei um einen echten Funktionstest eines jeden einzelnen Sensors handelt. Jedwedes Problem, das zwischen der Konstruktion der Anordnung und ihrer tatsächlichen Verwendung auftritt, kann somit nachgewiesen werden. Bei Anwendungen, die eines hohen Grads an Sicherheit bedürfen, und/oder wenn eine signifikante Wahrscheinlichkeit eines Sensorversagens während des Versuchsvorgangs besteht, können Decodierung und Qualitätskontrolle vor und nach der eigentlichen Probenanalyse durchgeführt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Anordnungen zur Qualitätskontrolle der Reagenzien eingesetzt werden. In vielen Fällen werden biologische Makromoleküle als Reagenzien eingesetzt, die einer Qualitätskontrolle unterzogen werden müssen. Beispielsweise können umfangreiche Sätze von Oligonucleotidsonden als Reagenzien bereitgestellt werden. Typischerweise ist die Durchführung einer Qualitätskontrolle für eine große Zahl verschiedener biologischer Makromoleküle schwierig. Der hierin beschriebene Ansatz kann für diese verwendet werden, indem die Reagenzien (als DBLs formuliert) anstelle der Anordnungen als variabel betrachtet werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform werden die hierin beschriebenen Verfahren in der Kalibrierung von Anordnungen angewendet. Für zahlreiche Anwendungen, wie beispielsweise mRNA-Quantifizierung, ist es wünschenswert, über ein Signal zu verfügen, das eine lineare Antwort auf die Konzentration des Zielanalyten ist, oder, falls nichtlinear, dass eine Beziehung zwischen der Konzentration und dem Signal ermittelt werden kann, sodass die Konzentration des Zielanalyten abgeschätzt werden kann. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erstellung von Kalibrierungskurven parallel für mehrere Perlen in einer Anordnungen bereit. Die Kalibirierungskurven können unter Bedingungen erstellt werden, die die Komplexität der zu analysierenden Probe simulieren. Jede Kurve kann unabhängig von den anderen (d.h. für andere Konzentrationsbereiche), jedoch zur gleichen Zeit wie alle an deren Kurven für die Anordnung erstellt werden. Somit wird in dieser Ausführungsform das sequenzielle Codierungsschema mit verschiedenen Konzentrationen umgesetzt, die als die Code-"Markierungen" anstelle der verschiedenen Fluorophore dienen. Auf diese Wesie kann das Signal als Antwort auf die Konzentration für jede Perle gemessen werden. Diese Kalibrierung kann knapp vor der Verwendung der Anordnung durchgeführt werden, sodass jede Sonde auf jeder Anordnung nach Bedarf individuell kalibriert wird.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform können die Verfahren der Erfindung auch zur Testentwicklung verwendet werden. So ermöglichen die Verfahren beispielsweise die Identifizierung von guten und schlechten Sonden; wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist funktionieren einige Sonden deshalb nicht gut, weil sie nicht gut hybridisieren oder weil sie mit mehr als einer Sequenz kreuzhybridisieren. Diese Schwierigkeiten können auf einfache Wesie während des Decodierens nachgewiesen werden. Die Fähigkeit der schnellen Bewertung der Sondenleistung weist das Potential auf, Zeit und Kosten der Testentwicklung drastisch zu verringern.
  • Auf ähnliche sind die Verfahren der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform für die Quantifizierung in der Testentwicklung nützlich. Eine große Herausforderung in vielen Tests ist die Breitstellung der Fähigkeit, Unterschiede in der Konzentration zwischen den Proben nachzuweisen, der Fähigkeit zur Quantifizierung dieser Unterschiede und der Messung der absoluten Konzentration der Analyten, all dies in Gegenwart eines komplexen Gemischs aus verwandten Analyten. Ein Beispiel für dieses Problem ist die Quantifizierung einer spezifischen mRNA in Gegenwart einer zellulären Gesamt-mRNA. Ein Ansatz, der als Grundlage für mRNA-Quantifizierung entwickelt worden wurde verwendet multiple Paarungs- und Fehlpaarungs-Sondenpaare (Lockhart et al., 1996), hiermit in seiner Gesamtheit durch Verweis aufgenommen. Dieser Ansatz ist zwar einfach, bedarf jedoch einer relativ großen Anzahl an Sonden. Bei dieser Herangehensweise wird eine quantitative Antwort auf die Konzentration durch Mitteln der Signale eines Satzes aus unterschiedlichen Sonden an das betroffene Gen oder die betroffenen Sequenz erhalten. Dies ist deshalb notwendig, weil nur einige der Sonden quantitativ antworten, und es nicht möglich, mit Sicherheit vor auszusagen, welche diese Sonden sind. In Ermangelung von Vorwissen ist nur die mittlere Antwort einer angemessen ausgewählten Sondensammlung quantitativ. In der vorliegenden Erfindung kann dies jedoch allgemein auf Nucleinsäure-basierte Tests und auf andere Tests angewendet werden. Der Kern des Ansatzes besteht in der Identifizierung der Sonden, die in einem bestimmten Test quantitativ antworten, anstelle des Mittelns dieser mit anderen Sonden. Dies wird unter Verwendung des zuvor beschriebenen Anordnungskalibrierungschemas durchgeführt, in dem konzentrationsbasierte Codes verwendet werden. Vorteile dieser Herangehensweise sind unter anderem: weniger Sonden, die gebraucht werden; die Präzision der Messung ist weniger stark von der Anzahl der verwendeten Sonden abhängig; und die Antwort der Sensoren ist mit einem hohen Grad an Sicherheit bekannt, da jede einzelne Sequenz auf effiziente Wesie getestet werden kann. Wichtig ist hier festzuhalten, dass gut funktionierende Sonde empirisch ausgewählt werden, wodurch Schwierigkeiten und Ungewissheiten bei der Voraussage der Sondenleistung insbesondere bei komplexen Sondengemischen vermieden werden. Im Gegensatz dazu wurde bei den bisher beschriebenen Versuchen mit geordneten Anordnungen eine relativ kleine Anzahl an Sequenzen durch Ausführen von quantitativen Impulsversuchen, in denen eine bekannte mRNA dem Gemisch zugesetzt wird, überprüft.
  • Im Allgemeinen funktionieren die Verfahren wie folgt: In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ziel zum Detektionsmodul gebracht. Im Allgemeinen können zwei Verfahren eingesetzt werden; die nachstehend beschriebenen Testkomplexe werden zuerst gebildet (d.h. alle löslichen Komponenten werden entweder gleichzeitig oder nacheinander zusammengemischt), und zwar "stromauf" vom Detektionsmodul, woraufhin der Komplex der Oberfläche zur folgenden Bindung an eine Detektionsanordnung zugesetzt wird. Alternativ dazu kann das Ziel dort zugesetzt werden, wo es den Fänger-bindenden Liganden bindet, und dann werden die zusätzlichen Komponenten zugesetzt. Letzteres wird nachstehend detailliert beschrieben, jedoch kann jedes der beiden Verfahren durchgeführt werden. Ähnlich dazu könne auch einige Komponenten zugesetzt und der Elektrophorese unterzogen werden, woraufhin andere Komponenten zugesetzt werden; beispielsweise kann der Zielanalyt gegebenenfalls mit irgendeiner Fänger-Extendersonde kombiniert werden und dann trans portiert werden usw. Zudem könne, wie hierin dargelegt, "Wasch"-Schritte durchgeführt werden, durch die Einführung von Puffer in das Detektionsmodul, wodurch überschüssige Reagenzien (nichtgebundene Analyten, überschüssige Sonden usw.) von der Oberfläche entfernt werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Verfahren die Bearbeitung der Probe stromauf von der Detektionskammer. Des bedeutet, dass die Probenbearbeitung in einem oder in mehreren Kanälen vollzogen wird; die Probenbearbeitung erfolgt jedoch parallel. Die vorbereitete Probe wird dann in einem einzigen Kanal wieder zusammengeführt, der zum Detektionsmodul führt. So kann beispielsweise eine Vielzahl von verschiedenen PCR-Reaktionen in einer Vielzahl von Kammern durchgeführt werden, wobei alle Reaktionsprodukte einer einzigen Anordnung zugesetzt werden. Alternativ dazu können die Produkte parallel durchgeführte Reaktionen verschiedenen Anordnungen zugesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Reaktion sequenziell durchgeführt; beispielsweise kann eine erste PCR-Reaktion in einer ersten Kammer und eine "ineinandergeschachtelte" PCR in einer folgenden Kammer durchgeführt werden.
  • Die Probenbewegung innerhalb der Kanäle kann durch herkömmliche Verfahren, einschließlich durch elektroosmotischen Fluss, Kapillarwirkung oder -druck, wie hierin beschrieben, und einschließlich der Pumpen auf dem Chip oder außerhalb dessen, erzeugt werden. In einer Ausführungsform stoppt die Sondenbewegung sobald die Sonde das Detektionsmodul kontaktiert. So wird Zeit für die Durchführung eines jeden der oben beschriebenen Tests gewonnen. Alternativ dazu muss die Sondenbewegung nicht notwendigerweise gestoppt werden, jedoch verlangsamt sie sich, wenn die Sonde die Anordnung durchläuft. Alternativ dazu wird der Fluss nicht verändert, wenn schnelle Reaktionen oder ein Rückfluss eingesetzt werden.
  • Das Regeln des Probenflusses wird durch eine Minderung der an die Sonde angelegten Triebkraft erzielt. Alternativ dazu können physische Aspekte des Detektionsmoduls so geändert werden, dass sie den Probenfluss beeinflussen. In einer Ausfüh rungsform ist der Durchmesser des Detektionsmodul im Vergleich zu dem der Kanäle vergrößert. Dies ergibt eine Verlangsamung des Probenflusses.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann eine Rückfluss des Probenflusses durch das Detektionsmodul veranlasst werden. In dieser Ausführungsform wird ein geschlossener Kanalkreis zum Rückfluss der Probe eingesetzt. Ein Rückfluss kann gegebenenfalls auch den Test und/oder den Signalnachweis durch erleichtertes Mischen in der Anordnung verbessern.
  • Die Probe wird der die Anordnung im Detektionsmodul zugeführt und daraufhin an den Pereln immobilisiert oder gebunden. In einer Ausführungsform wird dies durch Ausbildung eines Bindungskomplexes (hierin häufig als ein Hybridisierungskomplex bezeichnet, wenn Nucleinsäuren zum Einsatz kommen} zwischen einer Fängersonde und einem Abschnitt der Zielsequenz durchgeführt. Alternativ dazu kann die Bindung der Zielsequenz an die Perlen zeitgleich mit anderen Reaktionen durchgeführt werden.
  • Das Verfahren schreitet mit der Einführung von Amplifikatorsonden, falls solche eingesetzt werden, fort. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Amplifikatorsonde eine erste Sondensequenz, die im Wesentlichen zu einem Abschnitt der Zielsequenz komplementär ist, und zumindest eine Amplifikationssequenz.
  • In einer Ausführungsform wird die erste Sondensequenz der Amplifikatorsonde an die Zielsequenz hybridisiert, und jedwede nichthybridisierte Amplifikatorsonde wird entfernt. Dies wird wie allgemein auf dem Gebiet der Erfindung bekannt durchgeführt und hängt vom Typ des Tests ab. Ist die Zielsequenz auf der Anordnung immobilisiert wird die Entfernung von überschüssigen Reagenzien im Allgemeinen durch einen oder mehrere Waschschritte vollzogen, wie Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist.
  • Die Erfindung stellt somit Testkomplexe bereit, die zumindest eine Zielsequenz und eine Markersonde umfassen. "Testkomplex" steht hierin für eine Sammlung von Bin dungs- oder Hybridisierungskomplexen, die Analyten, einschließlich Bindungsliganden und Zielen, umfassen, die einen Nachweis zulässt. Die Zusammensetzung des Testkomplexes hängt von der Verwendung der verschiedenen Sondenkomponenten ab, wie hierin beschrieben wurde. Der Testkomplex umfasst gegebenenfalls, wie hierin dargelegt, die Zielsequenz, Markersonden, Fänger-Extendersonden, Marker-Extendersonden und Amplifikatorsonden, je nach verwendeter Konfiguration.
  • Die Test werden im Allgemeinen unter stringenten Bedingungen durchgeführt, die die Bildung des Markersondenbindungskomplexes nur in Gegenwart des Zielanalyten erlauben. Stringenz kann durch Ändern von Parametern eines Schrittes, der eine thermodynamische Variable darstellt, gesteuert werden; unter anderem sind dies die Temperatur, die Formamidkonzentration, die Salzkonzentration, der chaotrope Salzkonzentration-pH-Wert, die organischen Lösungsmittelkonzentration usw. Stringenz kann auch die Durchführung eines Elektrophorese-Schritts implizieren, um nichtspezifische Materialien (d.h. mit niedriger Stringenz) von der Detektionsanordnung zu entfernen.
  • Diese Parameter können such zur Steuerung von nichtspezifischen Bindungen verwendet werden, so wie allgemein im U.S.-Patent Nr. 5.681.697 beschrieben. Es ist deshalb gegebenenfalls wünschenswert, bestimmte Schritte mit stärkeren Stringenzbedingungen durchzuführen; beispielsweise wenn ein anfänglicher Hybridisierungsschritt zwischen der Zielsequenz und den Marker-Extender- und Fänger-Extendersonden durchgeführt wird. Eine Ausführung diese Schritts unter Bedingungen, die der spezifischen Bindung förderlich sind macht eine Reduktion nichtspezifischer Bindungen möglich.
  • Wurden die Testkomplexe auf der Detektionsanordnung gebildet, so kommt es nun zum Nachweis, im Allgemeinen durch den optischen Nachweis von Fluoreszenz. Bevorzugte Ausführungsformen setzen somit Detektionsmodule ein, die optische Fenster zur Ermöglichung des Nachweises der Zielanalyten umfassen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Probe zum leichteren Signalnachweis gemischt. Das bedeutet, dass, so wie in 1 gezeigt, eine deutliche Verstärkung der Signale beobachtet werden kann, wenn die Probe während eines Versuchs in Schwingung versetzt wird. in einer Ausführungsform werden diese Schwingungen oder das Mischen durch Vibration des Chips selbst verursacht. Alternativ dazu wird das Mischen durch einen kontinuierlichen Probenfluss entlang der Anordnungsoberfläche ausgelöst. In dieser Ausführungsform stellt der Fluss der Probe über die Mikrokügelchen umfassende Oberfläche ausreichend starke Merkmale im Seitenverhältnis bereit, um einen Grad an Turbulenz der des Flusses zu verursachen, der die Wechselwirkungen der Probe mit der Perlen verstärkt. In einer alternativen Ausführungsform dienen die zuvor beschriebene vertikalen Mikrostrukturen oder Pfosten zur Unterbrechung des laminaren Flusses über die mit Perlen bestückte Oberfläche.
  • Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung weiters Vorrichtungen oder Apparate zum Nachweis von Analyten unter Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung bereit. Wie für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung ersichtlich ist, können die Module der Erfindung auf eine Vielzahl von Weisen konfiguriert werden, abhängig von der Anzahl und der Größe der Proben sowie der Anzahl und der Art der gewünschten Manipulationen.
  • Wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Faseroptikbündel im Detektionsmodul eingesetzt werden die Ergebnisse des Versuchs vom nicht am Chip angebrachten Ende des Bündels abgelesen. In dieser Ausführungsform ist dieses Ende des Bündels mit einer CCD-Kamera oder einem anderen Scanning-Intsrument verbunden, wie auf diesem Gebiet bekannt ist. Zudem werden die Ergebnisse durch Fokussieren eines konfokalen Scanning-Intsruments auf das Ende des Faserbündels, das sich im Chip befindet, überprüft.
  • Wie hierin dargelegt wurde können die Vorrichtungen der Erfindung in Kombination mit einem Gerät zur Zufuhr von Fluids zu und zum Erhalt dieser von den Vorrichtungen verwendet werden. Diese Gerät kann eine "Einbettungsstelle" zur Platzierung der Vorrichtungen) und zum Festhalten dieser an Ort und Stelle sowie zum sich De cken mit Einlass- und Austrittsöffnungen, falls vorhanden, umfassen. Das Gerät kann weiters Pumpen (Pumpen außerhalb des Chips) und Mittel zur Betrachtung des Inhalts der Vorrichtung umfassen, einschließlich Mikroskopen, Kameras (einschließlich CCD-Kameras und Scanner) usw. Das Gerät kann im Einbettungsbereich über elektrische Kontakte verfügen, die zu den in der Struktur des Chips integrierten Kontakten passen, beispielsweise zum Erwärmen mittels Strom oder zur Elektrophorese. Das Gerät kann mit herkömmlichen Schaltsystemsensoren ausgestattet sein, die in Kommunikation mit den Sensoren zur Wärmeregulierung in der Vorrichtung stehen, beispielsweise für die PCR-Wärmeregulierung. Das Gerät kann außerdem ein Rechnersystem umfassend einen Mikroprozessor besitzen, um die verschiedenen Module des Systems zu steuern und die Daten zu analysieren.

Claims (5)

  1. Mikrofluidikvorrichtung zur Detektion eines Zielanalyten in einer Probe, die einen festen Träger umfasst, der Folgendes umfasst: (a) eine Probeneinlassöffnung; (b) zumindest eine Probenbehandlungsvertiefung; (c) einen ersten Mikrokanal, um Fluidkontakt zwischen der Probeneinlassöffnung und der Probenbehandlungsvertiefung zu ermöglichen; (d) ein Detektionsmodul, umfassend (i) ein Substrat mit einer Oberfläche, die getrennte Stellen umfasst; und (ii) eine Population von Mikrokügelchen, die zumindest eine erste und eine zweite Subpopulation umfasst, worin jede Subpopulation einen bioaktiven Stoff umfasst; worin die Mikrokügelchen auf der Oberfläche verteilt sind; (iii) eine Detektionseinlassöffnung zum Aufnehmen der Probe; und (e) einen zweiten Mikrokanal, um Fluidkontakt zwischen der Probenbehandlungsvertiefung und der Detektionseinlassöffung zu ermöglichen.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, worin das Substrat ein Faseroptikbündel umfasst.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin jede Subpopulation außerdem eine optische Signatur umfasst.
  4. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin jede Subpopulation außerdem einen Identifikator-bindenden Liganden umfasst, der einen Decoderbindenden Liganden bindet, so dass die Identifikation des bioaktiven Stoffs aufgeklärt werden kann.
  5. Vorrichtung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der bioaktive Stoff eine Nucleinsäure ist.
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