WO2002002225A9 - Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren - Google Patents

Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren Download PDF

Info

Publication number
WO2002002225A9
WO2002002225A9 PCT/EP2001/007460 EP0107460W WO0202225A9 WO 2002002225 A9 WO2002002225 A9 WO 2002002225A9 EP 0107460 W EP0107460 W EP 0107460W WO 0202225 A9 WO0202225 A9 WO 0202225A9
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
microchannel
acid molecule
carrier particle
building blocks
Prior art date
Application number
PCT/EP2001/007460
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2002002225A2 (de
WO2002002225A3 (de
Inventor
Zeno Foeldes-Papp
Johan Holm
Original Assignee
Gnothis Holding Sa
Zeno Foeldes-Papp
Johan Holm
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10065626A external-priority patent/DE10065626A1/de
Application filed by Gnothis Holding Sa, Zeno Foeldes-Papp, Johan Holm filed Critical Gnothis Holding Sa
Priority to EP01947427A priority Critical patent/EP1349649A2/de
Priority to US10/311,673 priority patent/US20050153284A1/en
Priority to AU2001269109A priority patent/AU2001269109A1/en
Publication of WO2002002225A2 publication Critical patent/WO2002002225A2/de
Publication of WO2002002225A3 publication Critical patent/WO2002002225A3/de
Publication of WO2002002225A9 publication Critical patent/WO2002002225A9/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Definitions

  • the invention relates to a method for single-molecule sequencing of nucleic acids and a device suitable for carrying out the method.
  • the sequencing of the human genome consisting of approx. 3 x 10 9 bases or the genome of other organisms and the determination and comparison of individual sequence variants requires the provision of sequencing methods which are fast on the one hand and can be used routinely and at low cost on the other hand.
  • sequencing methods for example the enzymatic chain termination method according to Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463), in particular by automation (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (1994), New York, Academic Press) can currently only have a maximum of 2,000 bases can be determined per day with a sequencer.
  • Another approach is single-molecule sequencing (Dörre et al., Bioimaging 5 (1997), 139-152), in which the sequence of nucleic acids is carried out by the progressive enzymatic degradation of fluorescence-labeled single-stranded DNA molecules and detection of the sequentially released monomer molecules in a microstructure channel, in which the monomer molecules are guided electroosmotically by pumps.
  • the advantage of this method is that only a single molecule of the target nucleic acid is sufficient to carry out a sequence determination.
  • the method according to the invention is a sequencing method in which a single nucleic acid molecule immobilized on a carrier is examined.
  • the carrier particle used for the process has a size that allows movement in microchannels and adherence to a desired one
  • the particle size is preferably in the range from 0.5 to 10 ⁇ m and particularly preferably from 1 to 3 ⁇ m. Examples of suitable materials for carrier particles are
  • Plastics such as polystyrene, glass, quartz, metals or semi-metals such as
  • Optically transparent carrier particles for example made of plastics or particles with a plastic core and one, are particularly preferred
  • Silicon dioxide shell used.
  • the nucleic acid molecules are preferably immobilized on the carrier particle via their 5 'ends.
  • the nucleic acid molecules can be bound to the support by covalent or non-covalent interactions.
  • the binding of the polynucleotides to the carrier can be mediated by high-affinity interactions between the partners of a specific binding pair, for example biotin / streptavidin or avidin, hapten / anti-hapten antibodies, sugar / lectin etc.
  • biotinylated nucleic acid molecules can be coupled to streptavidin-coated supports.
  • the nucleic acid molecules can also be bound to the support by adsorption.
  • Carrier particles to which only a single nucleic acid molecule is bound are used for the method according to the invention.
  • Such carrier particles can be produced in that the nucleic acid molecules provided for sequencing in a molar ratio of preferably 1: 5 to 1:20, e.g. 1:10, are brought into contact with the carrier particles under conditions in which the nucleic acid molecules are immobilized on the carrier.
  • the resulting carrier particles are then, e.g. B. sorted on the basis of the fluorescent marker groups contained on the nucleic acid molecules and separated from particles to which no nucleic acid molecule is bound. This sorting and separation can, for example, according to the in Holm et al.
  • nucleic acid molecules bound to a carrier can be in single-stranded or double-stranded form. In the case of double-stranded molecules, it must be ensured that labeled nucleotide building blocks can only be split off from a single strand.
  • a carrier for example DNA molecules or RNA molecules
  • essentially all, for example at least 90%, preferably at least 95% of all nucleotide building blocks of at least one base type carry a fluorescent labeling group.
  • essentially all nucleotide building blocks of at least two base types carry for example two, three or four base types, one fluorescent label, each base type advantageously carrying a different fluorescent label group.
  • Nucleic acids marked in this way can be obtained by enzymatic primer extension on a nucleic acid matrix using a suitable polymerase, for example a DNA polymerase such as a DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius or other thermostable organisms (Hopfner et al., PNAS USA 96 (1999), 3600 -3605) or a mutated Taq polymerase (Patel and Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-510) using fluorescence-labeled nucleotide building blocks.
  • the labeled nucleic acid strands can also be produced by amplification reactions, for example PCR.
  • asymmetrical amplification products in which only a single strand contains fluorescent labels.
  • Such asymmetrical amplification products can be sequenced in double-stranded form.
  • Nucleic acid fragments in which both strands are fluorescence-labeled are produced by symmetrical PCR. These two fluorescence-labeled strands can be separated and immobilized separately in single-stranded form on carrier particles, so that the sequence of one or both complementary strands can be determined separately.
  • one of the two strands at the 3 'end can be modified in this way, for example by installing a PNA clamp, so that it is no longer possible to split off monomer units. In this case, double-strand sequencing is possible.
  • a "sequence identifier" ie a labeled nucleic acid of known sequence
  • a "sequence identifier" ie a labeled nucleic acid of known sequence
  • the nucleic acid template the sequence of which is to be determined, can be selected, for example, from DNA templates such as genomic DNA fragments, cDNA molecules, plasmids etc., but also from RNA templates such as mRNA molecules.
  • the fluorescent labeling groups can be from known for labeling Bi o polymers, z.
  • Nucleated acids used fluorescent labeling groups such as fluorescein, rhodamine, phycoerythrin, Cy3, Cy5 or derivatives thereof, etc. can be selected.
  • Step (b) comprises introducing a loaded carrier particle into a sequencing device with a microchannel.
  • a capture laser e.g. an IR laser
  • the carrier particle can be held in a capillary or a microchannel according to process step (c).
  • a capture laser e.g. an IR laser
  • Such methods are described, for example, by Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31) and Chu (Science 253 (1991), 861-866).
  • the carrier particle is preferably held in place by an automated process.
  • the carrier particles are passed through the microchannel in the hydrodynamic flow, passing through a detection element.
  • the detector in the detection window is set in such a way that it recognizes a marked sphere on the basis of the fluorescence-marked D NA and / or an additional fluorescence-marked probe, and then automatically activates the capture laser in the measuring room.
  • Carrier particles that the detector does not classify as positive are passed through. After capturing a carrier particle, the sorting process is stopped and the remaining carrier particles are washed away. The sequencing reaction is then carried out on the immobilized carrier particle.
  • the sequencing reaction of the method according to the invention comprises the progressive cleavage of individual nucleotide building blocks from the immobilized nucleic acid molecules.
  • An enzymatic cleavage is preferably carried out using an exonuclease, single-strand or double-strand exonucleases which degrade in the 5 ' ⁇ 3' direction or in the 3 ' ⁇ 5' direction - depending on the type of immobilization of the nucleic acid strands on the support - can be used.
  • T7 DNA polymerase, E. coli exonuclease I or E. coli exonuclease III are particularly preferably used as exonucleases.
  • the invention is based on the fact that the nucleotide building blocks released by the cleavage reaction are passed through a microchannel by means of a hydrodynamic flow and are determined during the flow through the microchannel.
  • the hydrodynamic flow enables an increase in the flow speed, which in turn leads to an increase in the detection probability of a nucleotide building block.
  • the occurrence of wall effects compared to the electroosmotic pumps known from the prior art can be reduced by the hydrodynamic flow, which is generated, for example, by suction or application of pressure.
  • the hydrodynamic flow through the microchannel preferably has a parabolic flow profile, ie the flow rate is at a maximum in the center of the microchannel and decreases in a parabolic function towards the edges to a minimum speed.
  • the maximum flow rate through the microchannel is preferably in the range of 1 to 50 mm / s, particularly preferably in the range of 5 to 10 mm / s.
  • the diameter of the microchannel is preferably in the range from 1 to 100 ⁇ m, particularly preferably from 10 to 50 ⁇ m.
  • the measurement is preferably carried out in a linear microchannel with a substantially constant diameter.
  • the identification of fluorescence-labeled nucleotide building blocks according to step (e) of the method according to the invention can be carried out by means of any measurement method, for example with a location- and / or time-resolved fluorescence spectroscopy, which is capable of in a very small volume element such as is present in a microchannel. Capture fluorescence signals down to single photon count.
  • the detection can be carried out by means of confocal single molecule detection, such as by fluorescence correlation spectroscopy, with a very small, preferably confocal volume element, for example 0.1 x 10 "15 to 20 x 10 " 12 I, of the sample liquid flowing through the microchannel emitting an excitation light Is exposed to the laser, which excites the receptors located in this measurement volume to emit fluorescent light, the emitted fluorescent light from the measurement volume being measured by means of a photodetector, and establishing a correlation between the temporal change in the measured emission and the relative flow rate of the molecules involved, so that individual molecules can be identified in the measurement volume when diluted accordingly.
  • confocal single molecule detection such as by fluorescence correlation spectroscopy
  • the detection can also be carried out by a time-resolved decay measurement, a so-called time gating, as described, for example, by Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: “Ultrafast Phenomenes”, DH Auston, Ed. , Springer 1984.
  • the fluorescence molecules are excited within a measurement volume and then - preferably at a time interval of> 100 ps - the opening of a detection interval at the photodetector. In this way, background signals generated by Raman effects can be kept sufficiently low to enable essentially interference-free detection.
  • the detection is carried out using a laser device which has a diffraction element or a phase-modulating element in the beam path of the laser, which is optionally configured in combination with one or more optical imaging elements to produce a diffraction pattern in the form of a generate linear or two-dimensional arrays of focal areas in the microchannel, the optical arrangement being set up to confocally image each focal area for fluorescence detection by the photodetector arrangement.
  • the detection device is integrated in two walls of the microchannel delimiting one another, one wall having an array of laser elements emitting into the microchannel as fluorescent excitation light source and the other having an array of photodetector elements assigned to the laser elements as fluorescent light detectors ,
  • the hydrodynamic flow profile in the microchannel of the sequencing device achieves an increase in the probability of detection of nucleotide components, which is essential to the invention, and thus an improvement in sensitivity.
  • the hydrodynamic flow in the microchannel can be set and regulated by suitable electronic control devices.
  • electrophoretic and electroosmotic methods for the transport of reagents can also be used in the sequencing device.
  • the method according to the invention also allows the parallel one Sequence of several carrier-based nucleic acid molecules in different, preferably parallel microchannels.
  • the nucleic acid coupled to a carrier particle is held essentially in the center of the microchannel, the cleaved fluorescence-labeled nucleotides are conducted downstream in a laminar flow to a detection volume element, which is positioned essentially in the center of the channel, where the highest flow rate prevails is.
  • the flow rate is preferably so great that, regardless of the thermal broadening of the flow trajectories by Brownian diffusion, the nucleotide arrives in the detector field and is registered.
  • the detector field is kept as small as possible so that the nucleotide bases are completely detected, while only a minimal fraction of the background contamination (ratio of the detector cross section to the channel cross section) occurs in the detector.
  • Another object of the invention is a device for sequencing an analyte in a sample liquid, comprising:
  • the device preferably also contains automatic manipulation devices, heating or cooling devices such as Peltier elements, means for sorting carrier particles, reservoirs and optionally supply lines for sample liquid and reagents, and electronic evaluation devices.
  • automatic manipulation devices heating or cooling devices such as Peltier elements, means for sorting carrier particles, reservoirs and optionally supply lines for sample liquid and reagents, and electronic evaluation devices.
  • the device is particularly suitable for carrying out the method according to the invention.
  • Yet another embodiment of the invention relates to a method for single molecule sequencing using only two fluorescent labels.
  • the invention thus relates to a method for sequencing nucleic acids, comprising the steps:
  • At least two carrier particles are provided with nucleic acid molecules immobilized thereon, which have at least partially overlapping sequences and in which the two fluorescent labels used for the two-color sequencing are each assigned to different bases or / and base combinations.
  • a first fluorescent label can be assigned to two bases B and B 2 and a second fluorescent label to two bases B 3 and B 4 on a carrier particle, and a first fluorescent label to two bases B 1 and B 3 and one on a second carrier particle second fluorescent label can be assigned to two bases B 2 and B 4 and if necessary a first fluorescent label can be assigned to two bases B and B 4 and a second fluorescent label to two bases B 2 and B 3 on a third carrier particle.
  • BB 2 , B 3 and B 4 each represent the four bases which occur in the nucleic acid to be sequenced, ie usually A, G, C and T.
  • a first fluorescent label is assigned to a base B and a second fluorescent label to three bases B 2 , B 3 and B 4 on a first carrier particle, a first fluorescent label to a base B 2 and a second fluorescent label three to a second carrier particle
  • Bases B ⁇ , B 3 and B 4 assigned, on a third carrier particle each assigned a first fluorescent label to a base B 3 and a second fluorescent label to three bases B 1 f B 2 and B 4 and on a fourth carrier particle each a first fluorescent label of a base B. 4 and a second fluorescent label assigned to three bases B ,, B 2 and B 3 .
  • a first fluorescent label is assigned to two bases on a first carrier particle and a second fluorescent label is assigned to the two other bases and on one second carrier particles assigned a first fluorescent label of a base and a second fluorescent label to the three other bases.
  • further carrier particles with other 2/2 or / and 1/3 combinations can optionally be used.
  • a complete determination of the base sequence of a DNA sequence can also be obtained using only 2 fluorescent labeling groups with different spectroscopic properties, such as emission wavelength or / and lifetime of the excited state.
  • 2 fluorescent labeling groups with different spectroscopic properties, such as emission wavelength or / and lifetime of the excited state.
  • two nucleotide bases are provided with a first labeling group and the other two nucleotide bases are provided with a second labeling group.
  • the nucleic acid to be sequenced is marked in a parallel approach in such a way that other base combinations are each provided with the same labeling group.
  • An example of this embodiment is shown below:
  • a sequence can be obtained if AT, AC or AG are in one color and CG, GT or CT in another color (see combinations 1, 2 and 3).
  • To obtain the complete base sequence it is sufficient to sequence the color combinations 1 and 2, 2 and 3 or 1 and 3.
  • a combination of 1, 2 and 3 is not absolutely necessary. In order to reduce the probability of errors, such a combination of 3 approaches is sometimes useful.
  • a complete sequence can be determined using two dual base / fluorescent label combinations. However, a single dual combination may be sufficient for certain types of sequences, for example for determining mutations.
  • a combination of the dual color combinations (e.g. two green and two red bases) with a single color combination (e.g. one green base and 3 red bases) is also interesting for certain embodiments.
  • the invention further relates to a method for sorting particles in a microchannel, comprising the steps:
  • Fluorescent label on which particles have a capture laser e.g. an IR laser is activated and, in the absence of the predetermined parameter on the particle, the capture laser is not activated
  • the detection element and / or the measuring element are preferably confocal volume elements, the detection element being arranged upstream of the measuring element in the microchannel.
  • Measuring the captured particle can include, for example, sequencing as previously described.
  • Figure 1 shows a section of a device for performing the method according to the invention.
  • a carrier particle (4) is held in a microchannel (2) by means of a capture laser (6).
  • a nucleic acid molecule (8) is immobilized on the carrier particle (4), from which individual nucleotide building blocks (10) are separated sequentially by enzymatic digestion and transported from a hydrodynamic flow through the microchannel to a detection element (1 2), preferably a confocal detection element, and detected there become.
  • the liquid flowing through the microchannel contains the enzyme used to digest the immobilized nucleic acid molecule, preferably an exonuclease.
  • the flow rate through the microchannel is set so that the broadening of the migration path of the split-off nucleotide building blocks caused by Brownian molecular motion is so small that they can be detected with sufficient statistical probability in the detection volume (1 2).
  • the device 2 shows a larger section of the device according to the invention, comprising the section (20a) of the microchannel (20) shown in FIG. 1 with the capturing laser and the confocal detection element (not shown here).
  • the device also contains a feed opening (22) and a drain opening (28) for liquid, for example solvent, between which the hydrodynamic flow in the microchannel (20) is generated by applying pressure or suction.
  • the device also contains an opening for supplying carrier particles (24) and an opening for Enzyme feed (26).
  • the enzyme and carrier particles can optionally be introduced by electroosmotic flow, a negative electrode being applied at (24) and (26) and a positive electrode at (28).
  • the hydrodynamic flow through the microchannel (20) can take place by means of electronically controlled pumps, which can be located outside the microstructure, but can also be integrated therein.
  • carrier particles are passed through the opening (24) into the channel (20).
  • a single carrier particle that is loaded with a nucleic acid molecule is held in place by the capture laser. Other particles and contaminants are washed away.
  • Enzyme is then added through the opening (26) and the sequencing reaction is carried out. After the sequencing is complete, the carrier particle is rinsed out of the microchannel. Then another sequencing cycle can be carried out with a new microparticle.
  • This procedure can be automated using appropriate electronic control devices.
  • the device can contain several microchannels for the parallel sequencing of several carrier particles.
  • FIG. 3 shows a preferred embodiment of an inventive device for single molecule sequencing.
  • This device comprises a carrier with at least 6 openings for microfluidic channels.
  • the opening (2) serves to supply the sample or the microparticles contained therein and, if appropriate, a buffer.
  • the opening (4) serves to supply the exonuclease.
  • the opening (6) is provided for discharging used solution from the carrier.
  • the openings (8) and (12) are also provided for discharging used solutions from the carrier.
  • the opening (10) serves to supply buffer.
  • the device can also contain further openings for the supply or discharge of liquids.
  • the diameter of the microfluidic channels within the carrier is preferably those for the feed line provided channels in the range of 40-80 microns, especially about 50 microns.
  • the discharge channels can have a considerably larger diameter, for example up to 500 ⁇ m. The widening of the diameter can take place immediately after the intersection of the channels and serves to improve the control and to increase the stability within the system.
  • the microparticle introduced into the device through the opening (2) is first captured in the area of position (20), e.g. by an IR laser, while the transport liquid is guided out of the carrier again through opening (8).
  • the captured microparticle is then transported to position 22 within the carrier, e.g. by a flow of liquid and / or by an IR laser where it is held again, e.g. by an IR laser, and then subjected to enzymatic degradation.
  • enzyme is passed through the opening (4) to the position (22) with the held microparticle and then transported out of the device again through the opening (12).
  • the nucleotides released by the enzymatic degradation of the nucleic acid on the microparticle at position (22) are detected downstream at position (24).
  • the buffer can be introduced into the device through the opening (10) and out again through the openings (8) and / or (12).
  • the enzyme in the device is flushed out through opening (12) and at the same time prevents a new microparticle, e.g. at position (20), comes into premature contact with the enzyme.
  • an electrical field can be created in the channels, for example via a positive electrode in the area of position (24) and a negative electrode in the area of opening (2). That way, the on stretched DNA to be sequenced immobilized on the microparticle and thus made more accessible for enzymatic treatment.
  • Reservoirs are provided for the liquids to be introduced into the device or the liquids derived from the device.
  • the invention thus furthermore relates to a device for sequencing nucleic acids, comprising: (a) an optically transparent microchannel,
  • this device comprises:
  • Communication microchannels (b) an opening (2) for introducing a carrier particle with a nucleic acid molecule immobilized thereon in a microchannel, essentially all nucleotide building blocks of at least a base type in at least one strand of the nucleic acid molecule carry a fluorescent label, (c) an opening (4) for introducing a nucleic acid-degrading enzyme into a microchannel, (d) a plurality of openings (6, 8, 12) for discharging liquid from the carrier .
  • the carrier has means for transporting the particle containing the nucleic acid to be sequenced from a first predetermined position, the capture position, to a second predetermined position, the degradation position.
  • the sequential operation of the device i.e. the analysis of several particles in a row, facilitated, in particular because in the capture position, contact with the nucleic acid-degrading enzyme can be better prevented.
  • Microchannels in the device according to the invention preferably have a larger diameter to the discharge openings, preferably an at least 1.5 times larger diameter than microchannels to the inlet openings.
  • the flow within the device is preferably a hydrodynamic flow. It is further preferred that means for Application of an electric field between the second predetermined position and the first predetermined position are provided.
  • the invention relates to a method for sequencing nucleic acids using a device as described above.
  • This method preferably comprises the steps:

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte: a) Beritstellen eines Trägerpartikels mit einem daraud immobilisierten Nukleinsäuremolekül, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindenstens einem Basentyp in mindestens einem strang des Nukleinsäuremoleküls eine Fluoreszenzmarkierung tragen, b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, um fassend einen Mikrokanal, c)Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung, d)fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsäuremolekül, e)Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mittels eines hydrodynamischen Flusses und f)Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsäuremoleküls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine, und eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.

Description

Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einzelmolekül-Sequenzierung von Nukleinsäuren und eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung.
Die Sequenzierung des aus ca. 3 x 109 Basen bestehenden humanen Genoms oder des Genoms anderer Organismen sowie die Bestimmung und der Vergleich individueller Sequenzvarianten erfordert die Bereitstellung von Sequenziermethoden, die einerseits schnell sind und andererseits routinemäßig und mit geringen Kosten eingesetzt werden können. Obwohl große Anstrengungen unternommen worden sind, um gängige Sequenziermethoden, z.B. die enzymatische Kettenabbruchmethode nach Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977) 5463), zu beschleunigen, insbesondere durch Automatisierung (Adams et al., Automated DNA Sequencing and Analysis (1994), New York, Academic Press) können derzeit maximal nur 2.000 Basen pro Tag mit einem Sequenziergerät bestimmt werden.
Während der letzten Jahre sind neue Ansätze zur Überwindung der Beschränkungen konventioneller Sequenzierverfahren entwickelt worden, u.a. die Sequenzierung durch Rastertunnelmikroskopie (Lindsay und Phillip, Gen. Anal. Tech. Appl. 8 (1991 ), 8-13), durch hochparallelisierte Kapillarelektrophorese (Huang et al., Anal. Chem. 64 (1992), 2149-2154; Kambara und Takahashi, Nature 361 (1993), 565-566), durch Oligonukleotidhybridisierung (Drmanac et al., Genomics 4 (1989), 1 14- 128; Khrapko et al., FEBS Let. 256 (1989), 1 18-122; Maskos und Southern, Nucleic Acids Res. 20 (1992), 1675-1678 und 1679-1684) sowie durch Matrix- unterstützte Laser-Desorptions/Ionisierungs- Massenspektroskopie (Hillenkamp et al., Anal. Chem. 63 (1991 ), 1 193A- 1203A).
Ein weiterer Ansatz ist die Einzelmolekülsequenzierung (Dörre et al., Bioimaging 5 (1997), 139-152), bei der die Sequenz von Nukleinsäuren durch fortschreitenden enzymatischen Abbau von fluoreszenzmarkierten einzelsträngigen DNA-Molekülen und Nachweis der sequenziell freigesetzten Monomermoleküle in einem Mikrostrukturkanal erfolgt, in dem die Monomermoleküle durch Pumpen elektroosmotisch geleitet werden. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass jeweils nur ein einziges Molekül der Zielnukleinsäure für die Durchführung einer Sequenzbestimmung ausreicht.
Ein Nachteil der bei Dörre et al. beschriebenen Methode besteht jedoch darin, dass die sequenziell freigesetzten Monomermoleküle mit den Wänden der MikroStrukturen wechselwirken können, was zu erheblichen Problemen bei der Auswertung führen kann. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe bestand somit darin, ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung von Nukleinsäuren bereitzustellen, das eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik darstellt und das insbesondere eine Verbesserung der Detektion durch Vermeidung von Wandeffekten ermöglicht.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen, (b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal, (c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
(d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul,
(e) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mittels eines hydrodynamischen Flusses und
(f) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsauremolekuls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist eine Sequenziermethode, bei der ein einzelnes auf einem Träger immobilisiertes Nukleinsauremolekul untersucht wird. Das für das Verfahren verwendete Trägerpartikel hat eine Größe, die eine Bewegung in Mikrokanälen und das Festhalten an einer gewünschten
Position innerhalb einer Sequenziervorrichtung ermöglicht. Die Partikelgröße liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 10 μm und besonders bevorzugt von 1 bis 3μm. Beispiele für geeignete Materialien von Trägerpartikeln sind
Kunststoffe wie Polystyrol, Glas, Quarz, Metalle oder Halbmetalle wie
Silicium, Metalloxide wie Siliciumdioxid oder Verbundmaterialien, die mehrere der zuvor genannten Komponenten enthalten. Besonders bevorzugt werden optisch transparente Trägerpartikel, beispielsweise aus Kunststoffen oder Partikel mit einem Kunststoffkern und einer
Siliciumdioxidhülle eingesetzt.
Die Nukleinsäuremoleküle werden vorzugsweise über ihre 5'-Enden auf dem Trägerpartikel immobilisiert. Die Bindung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger kann durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erfolgen. Beispielsweise kann die Bindung der Polynukleotide an den Träger durch hochaffine Wechselwirkungen zwischen den Partnern eines spezifischen Bindepaares, z.B. Biotin/Streptavidin oder Avidin, Hapten/Anti- Hapten-Antikörper, Zucker/Lectin etc., vermittelt werden. So können biotinylierte Nukleinsäuremoleküle an Streptavidin-beschichtete Träger gekoppelt werden. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle auch adsorptiv an den Träger gebunden werden. So kann eine Bindung von durch Einbau von Alkanthiolgruppen modifizierten Nukleinsäuremolekülen an metallische Träger, z.B. Goldträger, erfolgen. Noch eine weitere Alternative ist die kovalente Immobilisierung, wobei die Bindung der Polynukleotide über reaktive Silangruppen auf einer Silika-Oberfläche vermittelt werden kann.
Für das erfindungsgemäße Verfahren werden Trägerpartikel verwendet, an die nur ein einziges Nukleinsauremolekul gebunden ist. Derartige Trägerpartikel können dadurch erzeugt werden, dass die zur Sequenzierung vorgesehenen Nukleinsäuremoleküle in einem molaren Verhältnis von vorzugsweise 1 :5 bis 1 :20, z.B. 1 : 10, mit den Trägerpartikeln unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, bei denen eine Immobilisierung der Nukleinsäuremoleküle an den Träger stattfindet. Die resultierenden Trägerpartikel werden dann, z. B. anhand der auf den Nukleinsäuremolekülen enthaltenen Fluoreszenzmarkierungsgruppen sortiert und von Partikeln, an die kein Nukleinsauremolekul gebunden ist, abgetrennt. Diese Sortierung und Abtrennung kann beispielsweise nach den in Holm et al. (Analytical Methods and Instrumentation, Special Issue μTAS 96, 85-87), Eigen und Rigler (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994), 5740- 5747) oder Rigler (J. Biotech. 41 (1995), 177-186) beschriebenen Methode erfolgen, die eine Detektion mit einem konfokalen Mikroskop beinhalten.
Die an einen Träger gebundenen Nukleinsäuremoleküle, z.B. DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, können in einzelsträngiger Form oder doppelsträngiger Form vorliegen. Bei doppelsträngigen Molekülen muss sichergestellt sein, dass markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können. Bei den zu sequenzierenden Nukleinsäuresträngen tragen im Wesentlichen alle, z.B. mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 % aller Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe. Vorzugsweise tragen im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen, beispielsweise zwei , d rei od er vier Basentypen , ei ne Fluoreszenzmarkierung, wobei jeder Basentyp günstigerweise eine unterschiedliche Fluoreszenzmarkierungsgruppe trägt. Derart markierte Nukleinsäuren können durch enzymatische Primerextension an einer Nu- kleinsäurematrize unter Verwendung einer geeigneten Polymerase, z.B. einer DNA-Polymerase wie etwa einer DNA-Polymerase von Thermococcus gorgonarius oder anderen thermostabilen Organismen (Hopfner et al., PNAS USA 96 (1999), 3600-3605) oder einer mutierten Taq-Polymerase (Patel und Loeb, PNAS USA 97 (2000), 5095-510) unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotidbausteine erzeugt werden. Die markierten Nukleinsäurestränge können auch durch Amplifikationsreaktionen, z.B. PCR, hergestellt werden. So entstehen bei einer asymmetrischen PCR Amplifikationsprodukte, bei denen nur ein einziger Strang Fluoreszenzmarkierungen enthält. Derartige asymmetrische Amplifikationsprodukte können in doppelsträngiger Form sequenziert werden. Durch symmetrische PCR werden Nukleinsäurefragmente hergestellt, bei denen beide Stränge fluoreszenzmarkiert sind. Diese beiden fluoreszenzmarkierten Stränge können separiert und getrennt in einzelsträn- giger Form auf Trägerpartikeln immobilisiert werden, sodass die Sequenz eines oder beider Komplementärstränge separat bestimmt werden kann. Alternativ kann einer der beiden Stränge am 3'-Ende derart modifiziert werden, z.B. durch Einbau einer PNA-Klammer, sodass eine_Abspaltung von Monomerbausteinen nicht mehr möglich ist. In diesem Fall ist eine Doppelstrangsequenzierung möglich.
Gegebenenfalls kann an den zu untersuchenden Nukleinsäurestrang noch ein "Sequenzidentifikator", d.h. eine markierte Nukleinsäure bekannter Sequenz, angefügt werden, z.B. durch enzymatische Reaktion mit Ligase oder/und Terminaler Transferase, sodass zu Beginn der Sequenzierung zunächst ein bekanntes Fluoreszenzmuster und anschließend erst das der unbekannten, zu untersuchenden Sequenz entsprechende Fluoreszenzmuster erhalten wird. Die Nukleinsäurematrize, deren Sequenz bestimmt werden soll, kann beispielsweise aus DNA-Matrizen wie genomischen DNA-Fragmenten, cDNA-Molekülen, Plasmiden etc., aber auch aus RNA-Matrizen wie mRNA- Molekülen ausgewählt werden.
Die Fluoreszenzmarkierungsgruppen können aus bekannten zur Markierung vo n Bi o p o ly m e re n , z . B . N u kl e i n s ä u re n , v e rwe n d ete n Fluoreszenzmarkierungsgruppen, wie etwa Fluorescein, Rhodamin, Phycoerythrin, Cy3, Cy5 oder Derivaten davon etc. ausgewählt werden.
Schritt (b) umfasst das Einbringen eines beladenen Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung mit einem Mikrokanal. Mit Hilfe eines Einfanglasers, z.B. eines IR-Lasers, kann das Trägerpartikel in einer Kapillare oder einem Mikrokanal gemäß Verfahrensschritt (c) festgehalten werden. Derartige Methoden sind beispielsweise bei Ashkin et al. (Nature 330 (1987), 24-31 ) und Chu (Science 253 (1991 ), 861 -866) beschrieben.
Vorzugsweise erfolgt das Festhalten des Trägerpartikels durch einen automatisierten Prozess. Hierzu werden die Trägerpartikel im hydrodynamischen Fluss durch den Mikrokanal geleitet, wobei sie ein Detektionselement passieren. Der Detektor im Detektionsfenster wird so eingestellt, dass er eine markierte Kugel aufgrund der darauf befindlichen fluoreszenzmarkierten D NA u nd/oder einer zusätzlichen fluoreszenzmarkierten Sonde erkennt, und daraufhin automatisch das Aktivieren des Einfanglasers im Messraum bewirkt. Trägerpartikel, die der Detektor nicht als positiv einstuft, werden durchlaufen gelassen. Nach dem Einfangen eines Trägerpartikels wird der Sortierungsprozess gestoppt und die restlichen Trägerpartikel weggewaschen. Dann wird die Sequenzierungsreaktion am immobilisierten Trägerpartikel durchgeführt. Die Sequenzierungsreaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das fortschreitende Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von den immobilisierten Nukleinsäuremolekülen. Vorzugsweise erfolgt eine enzymatische Abspaltung unter Verwendung einer Exonuklease, wobei Einzelstrang- bzw. Doppelstrang-Exonukleasen, die in 5'→3'-Richtung oder in 3'→5'-Richtung abbauen - je nach Art der Immobilisierung der Nukleinsäurestränge auf dem Träger - eingesetzt werden können. Besonders bevorzugt werden als Exonukleasen T7 DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet.
Die Erfindung beruht darauf, dass die durch die Abspaltungsreaktion freigesetzten Nukleotidbausteine mittels eines hydrodynamischen Flusses durch einen Mikrokanal geleitet und während des Flusses durch den Mikrokanal bestimmt werden. Durch den hydrodynamischen Fluss wird eine Erhöhung der Flussgeschwindigkeit ermöglicht, die wiederum zu einer Erhöhung der Detektionswahrscheinlichkeit eines Nukleotidbausteins führt. Weiterhin kann man durch den hydrodynamischen Fluss, der z.B. durch Saugwirkung oder Anlegen von Druck erzeugt wird, das Auftreten von Wandeffekten gegenüber dem aus dem Stand der Technik bekannten elektroosmotischen Pumpen verringern. Der hydrodynamische Fluss durch den Mikrokanal weist vorzugsweise ein parabolisches Flussprofil auf, d.h. die Fließgeschwindigkeit ist maximal im Zentrum des Mikrqkanals und nimmt in einer parabolischen Funktion zu den Rändern bis zu einer Minimalgeschwindigkeit ab. Die Flussgeschwindigkeitdurch den Mikrokanal liegt im Maximum vorzugsweise im Bereich von 1 bis 50 mm/s, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 mm/s. Der Durchmesser des Mikrokanals liegt vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 μm, besonders bevorzugt von 10 bis 50 μm. Vorzugsweise wird die Messung in einem linearen Mikrokanal mit im Wesentlichen einen konstanten Durchmesser durchgeführt. Die Identifizierung fluoreszenzmarkierter Nukleotidbausteine gemäß Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann mittels einer beliebigen Messmethode, z.B. mit einer orts- oder/und zeitaufgelösten Fluoreszenz- Spektroskopie erfolgen, die in der Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement wie es in einem Mikrokanal vorliegt, Fluoreszenzsignale bis hinunter zu Einzelphotonenzählung zu erfassen.
Beispielsweise kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetektion, wie etwa durch Fluoreszenz- Korrelationsspektroskopie, erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise konfokales Volumenelement, beispielsweise 0,1 x 10"15 bis 20 x 10"12 I der durch den Mikrokanal strömenden Probeflüssigkeit einem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem Messvolumen befindlichen Rezeptoren zur Emission von Fluoreszenzlicht anregt, wobei das emittierte Fluoreszenzlicht aus dem Messvolumen mittels eines Fotodetektors gemessen wird, und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission und der relativen Flussgeschwindigkeit der beteiligten Moleküle erstellt wird, sodass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne Moleküle in dem Messvolumen identifiziert werden können. Auf Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details zu den für die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung des europäischen Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc.Photo-Opt.lnstrum.Eng. 1921 (1993), 239 ff.) und Mets und Rigler (J.Fluoresc.4 (1994) 259-264) beschrieben.
Alternativ bzw. zusätzlich kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomenes", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben. Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens und anschließend - vorzugsweise in einem zeitlichen Abstand von > 100 ps - das Öffnen eines Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detektion unter Verwendung einer Laser-Vorrichtung, die ein Beugungselement oder ein phasenmodulierendes Element im Strahlengang des Lasers aufweist, welches gegebenenfalls in Kombination mit einem oder mehreren optischen Abbildungselementen dazu eingerichtet ist, aus dem Laserstrahl ein Beugungsmuster in Form eines linearen oder zweidimensionalen Arrays von Fokalbereichen in dem Mikrokanal zu erzeugen, wobei die optische Anordnung dazu eingerichtet ist, jeden Fokalbereich konfokal für die Fluoreszenzdetektion durch die Fotodetektoranordnung abzubilden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Detektionsvorrichtung in zwei aneinander gegenüberliegende Seiten begrenzende Wände des Mikrokanals integriert, wobei eine Wand einen Array von in den Mikrokanal emittierenden Laserelementen als Fluoreszenz-Anregungslichtquelle aufweist und die andere einen Array von den Laserelementen jeweils gegenüberliegend zugeordneten Fotodetektorelementen als Fluoreszenzlichtdetektoren aufweist. Diese beiden Ausführungsformen sind ausführlich in der Patentanmeldung DE 100 23 423.2 offenbart.
Eine erfindungswesentliche Erhöhung der Detektionswahrscheinlichkeit von Nukleotidbausteinen und somit eine Verbesserung der Sensitivität wird durch das hydrodynamische Flussprofil im Mikrokanal der Sequenziervorrichtung erreicht. Der hydrodynamische Fluss im Mikrokanal kann durch geeignete elektronische Steuereinrichtungen eingestellt und geregelt werden. Zusätzlich zum hydrodynamischen Fluss im Mikrokanal können in der Sequenziervorrichtung auch elektrophoretische und elektroosmotische Methoden zum Transport von Reagenzien eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt auch die parallele Seq u enzi eru n g vo n me h rere n Träg e rp arti ke l-g e bu nd e n e n Nukleinsäuremolekülen in jeweils verschiedenen, vorzugsweise parallel angeordneten Mikrokanälen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die an ein Trägerpartikel gekoppelte Nukleinsäure im Wesentlichen in der Mitte des Mikrokanals festgehalten, die abgespaltenen fluoreszenzmarkierten Nukleotide werden in einem laminaren Fluss stromabwärts zu einem Detektionsvolumenelement geleitet, welches im Wesentlichen in der Kanalmitte, wo die höchste Flussgeschwindigkeit herrscht, positioniert ist. Die Flussgeschwindigkeit ist dabei vorzugsweise so groß, dass ungeachtet der thermischen Verbreiterung der Flusstrajektorien durch Brown'sche Diffusion das Nukleotid im Detektorfeld ankommt und registriert wird. Das Detektorfeld wird dabei so klein wie möglich gehalten, dass die Nukleotidbasen vollständig detektiert werden, während nur ein geringstmöglicher Bruchteil der Hintergrundkontamination (Verhältnis des Detektorquerschnitts zum Kanalquerschnitt) im Detektor auftritt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zu Sequenzierung eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend:
(a) einen optisch transparenten Mikrokanal,
(b) Mittel zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul in den Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine
Fluoreszenzmarkierung tragen,
(c) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position des Mikrokanals,
(d) Mittel zum Erzeugen eines hydrodynamischen Flusses im Mikrokanal, (e) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleins uremolekul und (f) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
Die Vorrichtung enthält vorzugsweise weiterhin automatische Manipulationsvorrichtungen, Heiz- oder Kühleinrichtungen wie Peltier- Elemente, Mittel zur Sortierung von Trägerpartikeln, Reservoirs und gegebenfalls Zufuhrleitungen für Probeflüssigkeit und Reagenzien sowie elektronische Auswertungsgeräte.
Die Vorrichtung ist insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einzelmolekülsequenzierung unter Verwendung von nur zwei Fluoreszenzmarkierungen. Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen und wobei 2 Fluoreszenzmarkierungen mit unterschiedlichen Eigenschaften für die 4 Basen verwendet werden,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal, (c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
(d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul,
(e) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal und (f) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsauremolekuls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine. In einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens zwei Trägerpartikel mit darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekülen bereitgestellt, die mindestens teilweise überlappende Sequenzen aufweisen und bei denen die zwei für die Zweifarbensequenzierung verwendeten Fluoreszenzmarkierungen jeweils unterschiedlichen Basen oder/und Basenkombinationen zugeordnet sind. In einer ersten Variante kann auf einem Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung zwei Basen B, und B2 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung zwei Basen B3 und B4 zugeordnet werden, auf einem zweiten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung zwei Basen B^ und B3 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung zwei Basen B2 und B4 zugeordnet werden und gegebenenfalls auf einem dritten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung zwei Basen B, und B4 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung zwei Basen B2 und B3 zugeordnet werden. Dabei stehen B B2, B3 und B4 für die jeweils vier in der zu sequenzierenden Nukleinsäure vorkommenden Basen, d.h. üblicherweise A, G, C und T.
In einer weitere Variante wird auf einem ersten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B und eine zweite Fluoreszenzmarkierung drei Basen B2, B3 und B4 zugeordnet, auf einem zweiten Trägerpartikel wird jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B2 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung drei Basen B^, B3 und B4 zugeordnet, auf einem dritten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B3 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung drei Basen B1 f B2 und B4 zugeordnet und auf einem vierten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B4 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung drei Basen B,, B2 und B3 zugeordnet. ,
In noch einer weiteren Variante wird auf einem ersten Trägerpartikel eine erste Fluoreszenzmarkierung zwei Basen und eine zweite Fluoreszenzmarkierung den zwei anderen Basen zugeordnet und auf einem zweiten Trägerpartikel eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base und eine zweite Fluoreszenzmarkierung den drei anderen Basen zugeordnet. In dieser Ausführungsform können gegebenenfalls noch weitere Trägerpartikeln mit anderen 2/2 oder/und 1 /3 Kombinationen eingesetzt werden.
Eine vollständige Bestimmung der Basenfolge einer DNA-Sequenz kann auch unter Verwendung von nur 2 Fluoreszenzmarkierungsgruppen mit unterschiedlichen spektroskopischen Eigenschaften, wie etwa Emmissionswellenlänge oder/und Lebensdauer des angeregten Zustands, erhalten werden. Hierzu können z.B. zwei Nukleotidbasen mit einer ersten Markierungsgruppe und die anderen beiden Nukleotidbasen mit einer zweiten Markierungsgruppe versehen werden. Parallel hierzu wird die zu sequenzierende Nukleinsäure einem Parallelansatz so markiert, dass andere Basenkombinationen mit jeweils der gleichen Markierungsgruppe versehen werden. Im Folgenden ist ein Beispiel für diese Ausführungsform dargestellt:
(1 ) AT grün, CG rot: ACGACATGCAATTGGGCAAAT TGCTGTACGTTAACCCGTTTA
(2) AC grün, TG rot: ACGACATGCAATTGGGCAAAT
CATCACGTACCGGTTTACCCG
(3) AG grün, TC rot: ACGACATGCAATTGGGCAAAT
GTAGTGCATGGCCAAATGGGC
Eine Sequenz kann erhalten werden, wenn AT, AC oder AG in einer Farbe vorliegen und CG, GT oder CT in einer anderen Farbe (siehe Kombinationen 1 , 2 und 3). Um die vollständige Basenfolge zu erhalten, reicht es aus, die Farbkombinationen 1 und 2, 2 und 3 oder 1 und 3 zu sequenzieren. Eine Kombination von 1 , 2 und 3 wird nicht unbedingt benötigt. Um die Fehlerwahrscheinlichkeit zu verringern, ist eine solche Kombination von 3 Ansätzen jedoch manchmal zweckmäßig. Bei einer Sequenzierung mit zwei Farben existieren für jede Farbkombination 22 x 22 = 16 Möglichkeiten. Wie zuvor ausgeführt, kann man unter Verwendung von zwei dualen Basen/Fluoreszenzmarkierungskombinationen eine vollständige Sequenz bestimmen. Für bestimmte Arten von Sequenzen, z.B. zur Bestimmung von Mutationen, kann jedoch auch eine einzige duale Kombination ausreichend sein.
Weiterhin kann gegebenenfalls nur eine einzige Base der ersten Farbe und die anderen drei Basen in einer anderen Farbe verwendet werden. Hierbei müssen vier Ansätze sequenziert werden, um die vollständige Sequenz zu erhalten. Auch eine Kombination der dualen Farbkombinationen (z.B. zwei grüne und zwei rote Basen) mit einer Einzelfarbenkombination (z.B. eine grüne Base und 3 rote Basen) ist für bestimmte Ausführungsformen interessant.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Sortieren von Partikeln in einem Mikrokanal, umfassend die Schritte:
(a) Leiten von Partikeln durch ein Detektionselement im Mikrokanal, wobei das Detektionselement so eingestellt ist, dass bei Vorhandensein eines vorbestimmten Parameters, z.B. einer
Fluoreszenzmarkierung, auf dem Partikel ein Einfanglaser, z.B. ein IR- Laser, aktiviert wird und bei Fehlen des vorbestimmten_Parameters auf dem Partikel der Einfanglaser nicht aktiviert wird,
(b) Festhalten eines Partikels, auf dem der vorbestimmte Parameter vorhanden ist, durch den Einfanglaser in einem Messelement,
(c) Unterbrechen des Sortiervorgangs und
(d) Messen des festgehaltenen Partikels.
Das Detektions- oder/und das Messelement sind vorzugsweise konfokale Volumenelemente, wobei das Detektionselement stromaufwärts bezüglich des Messelements im Mikrokanal angeordnet ist. Das Messen des festgehaltenen Partikels kann beispielsweise eine Sequenzierung wie zuvor beschrieben umfassen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren erläutert werden. Es zeigen:
Figur 1 einen Ausschnitt einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. In einem Mikrokanal (2) wird ein Trägerpartikel (4) mittels eines Einfang-Lasers (6) festgehalten. Auf dem Trägerpartikel (4) ist ein Nukleinsauremolekul (8) immobilisiert, von dem durch enzymatischen Verdau einzelne Nukleotidbausteine (10) sequenziell abgespalten werden und von einem hydrodynamischen Fluss durch den Mikrokanal zu einem Detektionselement (1 2) vorzugsweise einem konfokalen Detektionselement transportiert und dort nachgewiesen werden. Die durch den Mikrokanal strömende Flüssigkeit enthält das zum Verdau des immobilisierten Nukleinsauremolekuls verwendete Enzym, vorzugsweise eine Exonuklease.
Die Fließgeschwindigkeit durch den Mikrokanal wird so eingestellt, dass die durch die Brown'sche Molekularbewegung verursachte Verbreiterung des Wanderungswegs der abgespaltenen Nukleotidbausteine derart gering ist, sodass sie mit ausreichender statistischer Wahrscheinlichkeit im Detektionsvolumen (1 2) nachgewiesen werden können.
Figur 2 einen größeren Ausschnitt der erfindungsgemäßen Vorrichtung, umfassend den in Figur 1 gezeigten Ausschnitt (20a) des Mikrokanals (20) mit dem Einfang-Laser und dem konfokalen Detektionselement (hier nicht gezeigt) . Die Vorrichtung enthält weiterhin eine Zufuhröffnung (22) und eine Abflussöffnung (28) für Flüssigkeit, z.B. Lösungsmittel, zwischen denen durch Anlegen von Druck oder Saugwirkung der hydrodynamische Fluss im Mikrokanal (20) erzeugt wird. Weiterhin enthält die Vorrichtung eine Öffnung zur Zufuhr von Trägerpartikeln (24) und eine Öffnung zur Zufuhr von Enzym (26). Die Einleitung von Enzym und Trägerpartikel kann gegebenenfalls durch elektroosmotischen Fluss erfolgen, wobei eine negative Elektrode bei (24) und (26) und eine positive Elektrode bei (28) angelegt wird. Der hydrodynamische Fluss durch den Mikrokanal (20) kann durch elektronisch geregelte Pumpen erfolgen, die sich außerhalb der MikroStruktur befinden können, jedoch auch darin integriert sein können.
Zur Durchführung des Verfahrens werden Trägerpartikel durch die Öffnung (24) in den Kanal (20) geleitet. Ein einzelnes Trägerpartikel, welches mit einem Nukleinsauremolekul beladen ist, wird durch den Einfang-Laser festgehalten. Andere Partikel und Verunreinigungen werden fortgespült. Anschließend wird durch die Öffnung (26) Enzym zugegeben und die Sequenzierungsreaktion durchgeführt. Nach Abschluss der Sequenzierung wird das Trägerpartikel aus dem Mikrokanal herausgespült. Dann kann ein weiterer Sequenzierzyklus mit einem neuen Mikropartikel durchgeführt werden. Diese Prozedur kann durch Verwendung entsprechender elektronischer Steuerungsgeräte automatisiert werden. Weiterhin kann die Vorrichtung mehrere Mikrokanäle zur parallelen Sequenzierung mehrerer Trägerpartikel enthalten.
Figur 3 eine bevorzugte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Einzelmolekül-Sequenzierung. Diese Vorrichtung umfasst einen Träger mit mindestens 6 Öffnungen für mikrofluidische Kanäle. Die Öffnung (2) dient zur Zufuhr der Probe bzw. der darin enthaltenen Mikropartikel und gegebenenfalls eines Puffers. Die Öffnung (4) dient zur Zufuhr der Exonuklease. Die Öffnung (6) ist zur Ableitung von verbrauchter Lösung aus dem Träger vorgesehen. Die Öffnungen (8) und (12) sind ebenfalls zur Ableitung verbrauchter Lösungen aus dem Träger vorgesehen. Die Öffnung (10) dient zur Zufuhr von Puffer. Gegebenenfalls kann die Vorrichtung noch weitere Öffnungen zur Zuleitung bzw. Ableitung von Flüssigkeiten enthalten. Der Durchmesser der mikrofluidischen Kanäle innerhalb des Trägers ist vorzugsweise bei den für die Zuleitung vorgesehenen Kanälen im Bereich von 40-80 μm, insbesondere ca. 50 μm. Die Ableitungskanäle können einen erheblich größeren Durchmesser, beispielsweise bis zu 500 μm aufweisen. Die Verbreiterung des Durchmessers kann unmittelbar nach dem Schnittpunkt der Kanäle stattfinden und dient zu einer Verbesserung der Kontrolle und zu einer Stabilitätserhöhung innerhalb des Systems.
Das durch die Öffnung (2) in die Vorrichtung eingeleitete Mikropartikel wird zunächst im Bereich von Position (20) eingefangen, z.B. durch einen lR- Laser, während die Transportflüssigkeit durch Öffnung (8) wieder aus dem Träger geleitet wird. Anschließend wird das eingefangene Mikropartikel innerhalb des Trägers zu Position 22 transportiert, z.B. durch einen Flüssigkeitsstrom oder/und durch einen IR-Laser, wo es wieder festgehalten, z.B. durch einen IR-Laser, und anschließend dem enzymatischen Abbau unterzogen wird. Hierzu wird Enzym durch die Öffnung (4) zur Position (22) mit dem festgehaltenen Mikropartikel geleitet und anschließend durch die Öffnung (12) wieder aus der Vorrichtung transportiert. Die durch den enzymatischen Abbau der Nukleinsäure auf dem Mikropartikel an Position (22) freigesetzten Nukleotide werden stromabwärts an Position (24) detektiert.
Nach Beendigung der Messung kann Puffer durch die Öffnung (10) in die Vorrichtung eingeleitet und durch die Öffnungen (8) oder/und (12) wieder herausgeleitet werden. Auf diese Weise wird das in der Vorrichtung befindliche Enzym durch Öffnung (12) herausgespült und zugleich verhindert, dass ein neues, in die Vorrichtung eingeleitetes Mikropartikel, z.B. an Position (20), vorzeitig mit dem Enzym in Kontakt kommt.
Gegebenfalls kann in den Kanälen ein elektrisches Feld angelegt werden, z.B. über eine positive Elektrode im Bereich von Position (24) und eine negative Elektrode im Bereich Öffnung (2). Auf diese Weise kann die auf dem Mikropartikel immobilisierte zu sequenzierende DNA gestreckt und somit besser der enzymatischen Behandlung zugänglich gemacht werden.
Für die in die Vorrichtung einzuleitenden Flüssigkeiten bzw. die aus der Vorrichtung abgeleiteten Flüssigkeiten sind Reservoirs (nicht gezeigt) vorgesehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit eine Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend: (a) einen optisch transparenten Mikrokanal,
(b) Mittel zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul in den Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
(c) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer ersten vorbestimmten Position des Mikrokanals,
(d) Mittel zum Transport des Trägerpartikels zu einer zweiten vorbestimmten Position des Mikrokanals, (e) Mittel zum Erzeugen eines Flusses im Mikrokanal,
(f) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul an der zweiten vorbestimmten Position und
(g) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst diese Vorrichtung:
(a) einen Träger umfassend ein System von in fluidischer
Kommunikation stehenden Mikrokanälen, (b) eine Öffnung (2) zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul in einem Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen, (c) eine Öffnung (4) zum Einleiten eines Nukleinsäure-abbauenden Enzyms in einen Mikrokanal, (d) mehrere Öffnungen (6, 8, 12) zum Ableiten von Flüssigkeit aus dem Träger,
(e) eine Öffnung (10) zum Einleiten von Puffer in einen Mikrokanal,
(f) Mittel zum Erzeugen eines Flüssigkeitsstroms in den Mikrokanälen,
(g) Mittel zum Einfangen des Trägerpartikels an einer ersten vorbestimmten Position (22),
(h) Mittel zum Transport eines eingefangenen Trägerpartikels zu einer zweiten vorbestimmten Position (24), (i) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul an der zweiten vorbestimmten Position (24) und
(j) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen
Nukleotidbausteine.
Ein wesentliches Merkmal dieser Vorrichtung besteht darin, dass der Träger Mittel zum Transport des die zu sequenzierende Nukleinsäure enthaltenden Partikels von einer ersten vorbestimmten Position, der Einfangposition, zu einer zweiten vorbestimmten Postition, der Abbauposition, aufweist. Auf diese Weise wird der sequenzielle Betrieb der Vorrichtung, d.h. die Analyse von mehreren Partikeln hintereinander, erleichtert, insbesondere weil in der Einfangposition ein Kontakt mit dem Nukleinsäure-abbauenden Enzym besser verhindert werden kann.
Vorzugsweise haben Mikrokanäle in der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu den Ableitungsöffnungen einen größeren Durchmesser, vorzugsweise einen mindestens 1 ,5fach größeren Durchmesser als Mikrokanäle zu den Einleitungsöffnungen. Der Fluss innerhalb der Vorrichtung ist vorzugsweise ein hydrodynamischer Fluss. Weiterhin ist bevorzugt, dass Mittel zum Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen der zweiten vorbestimmten Position und der ersten vorbestimmten Position vorgesehen sind.
Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, wobei man eine Vorrichtung wie zuvor beschrieben verwendet. Dieses Verfahren umfasst vorzugsweise die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Öffnung (2) eines Trägers umfassend ein System von in fluidischer Kommunikation stehenden Mikrokanälen,
(c) Festhalten der Trägerpartikels an einer ersten vorbestimmten Position (22) innerhalb des Trägers,
(d) Transportieren des Trägerpartikels zu einer zweiten vorbestimmten Position (24) innerhalb des Trägers,
(e) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul an der zweiten vorbestimmten Position (24),
(f) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal und
(g) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsauremolekuls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
(c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung,
(d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul,
(e) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mittels eines hydrodynamischen Flusses und
(f) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsauremolekuls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägerpartikel aus Kunststoff, Glas, Quarz, Metallen, Halbmetallen, Metalloxiden oder aus einem Verbundmaterial verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägerpartikel einen Durchmesser von 0,5 bis 10 μm aufweist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsauremolekul auf dem Trägerpartikel über seinen 5'- Terminus mittels bioaffiner Wechselwirkungen immobilisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein 5'-biotinyliertes Nukleinsauremolekul an ein Avidin- oder Streptavidin-beschichtetes Trägerpartikel immobilisiert wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsauremolekul in einzelsträngiger Form auf dem Trägerpartikel immobilisiert ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nukleinsauremolekul in doppelsträngiger Form auf dem Trägerpartikel immobilisiert ist, wobei markierte Nukleotidbausteine nur von einem einzigen Strang abgespalten werden können.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,- dadurch gekennzeichnet, dass im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens zwei Basentypen eine Fluoreszenzmarkierung tragen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Festhalten des Trägerpartikels mit einem Einfanglaser erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerpartikel in einem Mikrokanal festgehalten werden.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Abspalten einzelner Nukleotidbausteine durch eine Exonuklease erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass T7-DNA-Polymerase, E.coli Exonuklease I oder E.coli Exonuklease III verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mit einem Durchmesser von 1 bis 100 m geleitet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal mit einer Geschwindigkeit von 1 bis 50 mm/s geleitet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch eine konfokale Fluoreszenzmessung in einem Detektionsvolumenelement erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch konfokale Einzelmoleküldetektion wie etwa Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie erfolgt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung bzw. Time Gating in einem Detektionsvolumenelement erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass eine parallele Bestimmung von Nukleinsäuremolekülen in mehreren Mikrokanälen durchgeführt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass an das zu sequenzierende Nukleinsauremolekul eine Sequenz mit bekannter Basenfolge angefügt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägerpartikel im Wesentlichen in der Mitte des Mikrokanals festgehalten und die abgespaltenen Nukleotidbausteine in einem laminaren Fluss zu einem Detektionsvolumenelement geleitet werden, das in der Kanalmitte positioniert ist.
21 . Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsvolumenelement so klein wie möglich gehalten wird, um alle abgespaltenen Nukleotidbausteine gerade noch nachzuweisen.
22. Vorrichtung zur Sequenzierung eines Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend:
(a) einen optisch transparenten Mikrokanal,
(b) Mittel zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul in den Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
(c) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer vorbestimmten Position des Mikrokanals,
(d) Mittel zum Erzeugen eines hydrodynamischen Flusses im Mikrokanal,
(e) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner N u kleoti d b a uste i n e vo n d em i mm o b i l i si e rte n Nukleinsauremolekul und
(f) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
23. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen und wobei 2 Fluoreszenzmarkierungen mit unterschiedlichen
Eigenschaften für die 4 Basen verwendet werden,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Sequenziervorrichtung, umfassend einen Mikrokanal,
(c) Festhalten des Trägerpartikels in der Sequenziervorrichtung, (d) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul, (e) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen Mikrokanal und
(f ) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsauremolekuls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die unterschiedlichen spektroskopischen Eigenschaften aus Emissionswellenlänge oder/und Lebensdauer ausgewählt werden.
25. Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (a) das Bereitstellen von mindestens 2 Trägerpartikeln mit darauf immobilisierten Nukleinsäuremolekülen umfasst, die mindestens teilweise überlappende Sequenzen aufweisen und bei denen die 2 Fluoreszenzmarkierungen jeweils unterschiedlichen Basen oder/und Basenkombinationen zugeordnet sind.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem ersten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung 2 Basen B., und B2 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung B3 und B4 zugeordnet wird, auf einem zweiten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung 2 Basen und B3 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung 2 Basen B2 und B4 zugeordnet wird und gegebenenfalls auf einem dritten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung 2 Basen B und B4 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung 2 Basen B2 und B3 zugeordnet wird.
27. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem ersten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B und eine zweite Fluoreszenzmarkierung 3 Basen B2, B3 und B4 zugeordnet wird, auf einem zweiten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B2 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung 3 Basen B1f B3 und B4 zugeordnet wird, auf einem dritten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B3 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung 3 Basen B1f B2 und B4 zugeordnet wird und auf einem vierten Trägerpartikel jeweils eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base B4 und eine zweite Fluoreszenzmarkierung 3 Basen Bv B2 und B3 zugeordnet wird.
28. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass auf einem ersten Trägerpartikel eine erste Fluoreszenzmarkierung 2 Basen und eine zweite Fluoreszenzmarkierung den 2 anderen Basen zugeordnet wird und auf einem zweiten Trägerpartikel eine erste Fluoreszenzmarkierung einer Base und eine zweite Fluoreszenzmarkierung den drei anderen Basen zugeordnet wird.
29. Verfahren zum Sortieren von Partikeln in einem Mikrokanal, umfassend die Schritte:
(a) Leiten von Partikeln durch ein Detektionselement im Mikrokanal, wobei das Detektionselement so eingestellt ist, dass bei Vorhandensein eines vorbestimmten Parameters auf dem Partikel ein Einfanglaser aktiviert wird und bei Fehlen des vorbestimmten Parameters auf dem Partikel der Einfanglaser nicht aktiviert wird, (b) Festhalten eines Partikels, auf dem der vorbestimmte Parameter vorhanden ist, durch den Einfanglaser in einem Messelement,
(c) Unterbrechen des Sortiervorgangs und
(d) Messen des festgehaltenen Partikels.
30. Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend: (a) einen optisch transparenten Mikrokanal, (b) Mittel zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul in den Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen, (c) Mittel zum Festhalten des Trägerpartikels an einer ersten vorbestimmten Position des Mikrokanals,
(d) Mittel zum Transport des Trägerpartikels zu einer zweiten vorbestimmten Position des Mikrokanals,
(e) Mittel zum Erzeugen eines Flusses im Mikrokanal, (f) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner
N u kleotid b a u ste in e vo n d e m i m m o bil i si e rte n Nukleinsauremolekul an der zweiten Position und. (g) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
31. Vorrichtung zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend:
(a) einen Träger umfassend ein System von in fluidischer Kommunikation stehenden Mikrokanälen,
(b) eine Öffnung (2) zum Einbringen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleinsauremolekul in einen
Mikrokanal, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen, (c) eine Öffnung (4) zum Einleiten eines Nukleinsäure-abbauenden Enzyms in einem Mikrokanal, (d) mehrere Öffnungen (6, 8, 12) zum Ableiten von Flüssigkeit aus dem Träger,
(e) eine Öffnung (10) zum Einleiten von Puffer in einen Mikrokanal,
(f) Mittel zum Erzeugen eines Flüssigkeitsstroms in den Mikrokanälen,
(g) Mittel zum Einfangen des Trägerpartikels an einer ersten vorbestimmten Position (22),
(h) Mittel zum Transport eines eingefangenen Trägerpartikels zu einer zweiten vorbestimmten Position (24), (i) Mittel zum fortschreitenden Abspalten einzelner
Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul an der zweiten vorbestimmten Position (24) und (j) Mittel zum sequenziellen Nachweis der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
32. Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrokanäle zu den Ableitungsöffnungen (6, 8, 12) einen größeren Durchmesser, vorzugsweise einen mindestens 1,5fach größeren Durchmesser als die Mikrokanäle zu den Einleitungsöffnungen (4) und (10) aufweisen.
33. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel (f) zum Erzeugen eines hydrodynamischen Flusss im Träger vorgesehen sind.
34. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Anlegen eines elektrischen Fedides zwischen der zweiten vorbestimmten Position (24) und der ersten vorbestimmten Position (22) vorgesehen sind.
35. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 34 verwendet.
36. Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuren, umfassend:
(a) Bereitstellen eines Trägerpartikels mit einem darauf immobilisierten Nukleins uremolekul, wobei im Wesentlichen alle Nukleotidbausteine von mindestens einem Basentyp in mindestens einem Strang des Nukleinsauremolekuls eine Fluoreszenzmarkierung tragen,
(b) Einbringen des Trägerpartikels in eine Öffnung (2) eines Trägers umfassend ein System von in fluidischer Kommunikation stehenden Mikrokanälen,
(c) Festhalten der Trägerpartikels an einer ersten vorbestimmten Position (22) innerhalb des Trägers,
(d) Transportieren des Trägerpartikels zu einer zweiten vorbestimmten Position (24) innerhalb des Trägers, (e) fortschreitendes Abspalten einzelner Nukleotidbausteine von dem immobilisierten Nukleinsauremolekul an der zweiten vorbestimmten Position, (f) Leiten der abgespaltenen Nukleotidbausteine durch einen
Mikrokanal und (g) Bestimmen der Basenfolge des Nukleinsauremolekuls aufgrund der Abfolge der abgespaltenen Nukleotidbausteine.
PCT/EP2001/007460 2000-06-30 2001-06-29 Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren WO2002002225A2 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01947427A EP1349649A2 (de) 2000-06-30 2001-06-29 Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren
US10/311,673 US20050153284A1 (en) 2000-06-30 2001-06-29 Single molecule sequencing method
AU2001269109A AU2001269109A1 (en) 2000-06-30 2001-06-29 Single molecule sequencing method

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10031840.1 2000-06-30
DE10031840 2000-06-30
DE10065626.9 2000-12-29
DE10065626A DE10065626A1 (de) 2000-06-30 2000-12-29 Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2002002225A2 WO2002002225A2 (de) 2002-01-10
WO2002002225A3 WO2002002225A3 (de) 2003-04-24
WO2002002225A9 true WO2002002225A9 (de) 2003-08-07

Family

ID=26006237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2001/007460 WO2002002225A2 (de) 2000-06-30 2001-06-29 Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20050153284A1 (de)
EP (1) EP1349649A2 (de)
AU (1) AU2001269109A1 (de)
WO (1) WO2002002225A2 (de)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050164181A1 (en) * 2001-11-27 2005-07-28 Thomas Bricson Nanostructure, in particular for analysing individual molecules
EP1933817B1 (de) * 2005-09-13 2014-03-12 Affymetrix, Inc. Kodierte mikroteilchen
EP2158476B8 (de) 2007-05-08 2019-10-09 Trustees of Boston University Chemische funktionalisierung von festkörper-nanoporen und nanoporen-arrays sowie anwendungen davon
WO2008147879A1 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Ryan Golhar Automated method and device for dna isolation, sequence determination, and identification
AU2010301128B2 (en) 2009-09-30 2014-09-18 Quantapore, Inc. Ultrafast sequencing of biological polymers using a labeled nanopore
ES2683707T3 (es) * 2012-05-02 2018-09-27 Ibis Biosciences, Inc. Secuenciación de ADN
US9651539B2 (en) 2012-10-28 2017-05-16 Quantapore, Inc. Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment
AU2014268322B2 (en) 2013-05-24 2019-01-24 Quantapore, Inc. Nanopore-based nucleic acid analysis with mixed FRET detection
ES2789000T3 (es) 2014-10-10 2020-10-23 Quantapore Inc Análisis de polinucleótidos basado en nanoporos con marcadores fluorescentes que se inactivan mutuamente
WO2016065339A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 Quantapore, Inc. Efficient optical analysis of polymers using arrays of nanostructures
CN109477813A (zh) 2016-07-05 2019-03-15 昆塔波尔公司 基于光学的纳米孔测序

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4962037A (en) * 1987-10-07 1990-10-09 United States Of America Method for rapid base sequencing in DNA and RNA
US5405747A (en) * 1991-09-25 1995-04-11 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer Method for rapid base sequencing in DNA and RNA with two base labeling
IL108497A0 (en) * 1993-02-01 1994-05-30 Seq Ltd Methods and apparatus for dna sequencing
EP1190229B1 (de) * 1998-05-22 2011-10-26 California Institute Of Technology Miniaturisierter zellsortierer
DE19844931C1 (de) * 1998-09-30 2000-06-15 Stefan Seeger Verfahren zur DNS- oder RNS-Sequenzierung

Also Published As

Publication number Publication date
AU2001269109A1 (en) 2002-01-14
WO2002002225A2 (de) 2002-01-10
EP1349649A2 (de) 2003-10-08
WO2002002225A3 (de) 2003-04-24
US20050153284A1 (en) 2005-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60012511T2 (de) Mikrofluidische systeme mit mikrokugelmatrizen zum nachweis von zielanalyten
WO2002038806A2 (de) Nachweis von nukleinsäure-polymorphismen
DE60018733T2 (de) Vorrichtung und verfahren zur probenanalyse
DE60127939T2 (de) Nukleinsäure-Nachweisverfahren mit universellem Priming
WO2003020968A2 (de) Verfahren zur analyse von nukleinsäurekettensequenzen und der genexpression
EP2761022B1 (de) Verfahren zur räumlichen anordnung von probenfragmenten zur amplifikation und immobilisierung für weitere derivatisierungen
WO2002002225A9 (de) Einzelmolekül-sequenzierungsverfahren
DE10324912A1 (de) Verfahren zur Detektion von DNA-Punktmutationen (SNP-Analyse) sowie zugehörige Anordnung
DE10214395A1 (de) Verfahren zur Analyse von Einzelnukleotidpolymorphismen
EP1294946B1 (de) Multiplex-sequenzierungsverfahren
WO2002097406A1 (de) Verwendung von optischen diffraktionselementen in nachweisverfahren
DE19811731A1 (de) Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz
EP1448798A1 (de) Nanostruktur insbesondere zur analyse von einzelmolekülen
EP1303353B1 (de) Verfahren und vorrichtung zum analysieren von chemischen oder biologischen proben
WO2003052136A2 (de) Sequenzierung über lochmembranen
DE10224339A1 (de) Verfahren zur hochparallelen Nukleinsäuresequenzierung
DE10065626A1 (de) Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren
DE102004038359A1 (de) Paralleles Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Sequenzierungsverfahren
EP1458892B1 (de) Evaneszenz-basierendes multiplex-sequenzierungsverfahren
EP1816217B1 (de) Verfahren zum Nachweis mehrerer Zielnukleinsäuren
DE10316159A1 (de) 5`-3`-Exonuklease Assay zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren
WO2003093502A2 (de) Multiplex-nachweis von nukleinsäure-polymorphismen
DE10065631A1 (de) Nachweis von Nukleinsäure- Polymorphismen
DE102014207183A1 (de) Sequenziervorrichtung zum elektronischen Einzelmolekül-Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls
WO2019215005A1 (de) Mikrofluidische vorrichtung und verfahren zur nanostruktur-sequenzierung von nukleotidsträngen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001947427

Country of ref document: EP

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PUBLISHED INTERNATIONAL SEARCH REPORT (4 PAGES) REPLACED BY CORRECT INTERNATIONAL SEARCH REPORT (10 PAGES)

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001947427

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10311673

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP