-
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen und Verfahren zur Probenanalyse.
Spezieller ist die Erfindung auf Vorrichtungen und Verfahren zur Probenpfropfenbildung
und anschließenden
Abtrennung und/oder Analyse gerichtet.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Verfahren
zur Durchführung
und Analyse von chemischen Reaktionen im Mikrobereich erfordern
häufig
mehrere Schritte und ein ausgedehntes Handhaben von Reagenzien.
Diese Verfahren sind typischerweise arbeitsintensiv und beinhalten
komplizierte Kombinationen einer Instrumentierung, z.B. Pipetten,
Pumpen, Spritzen, Ventile, Rohrmaterial, Reagenzgefäße und Reaktionskammern.
Solche Kompliziertheiten können
zu Ungenauigkeiten, erhöhten
Kosten und verringerten Reaktionsausbeuten beitragen.
-
Analysentechniken
erfordern typischerweise einen hohen Grad an Arbeit und die Verwendung
von komplizierten Vorrichtungen. Außerdem beinhalten viele chemische
Labor- und Industrieprozesse die Verwendung von verhältnismäßig großen Volumina von
Reagenzien und mehreren Laborinstrumenten. Typische Immunoassays
großen
Umfangs erfordern z.B. die Verwendung von Pipetten, Reagenzgefäßen und
Reaktionskammern. Siehe z.B. Mattiasson et al., Proc. Int. Symp.
on Enzyme-Labeled Immunoassay of Hormones and Drugs, (Pal, S., Herausgeber,
Walter de Gruyter, Berlin (1978), Seite 91). Solche Prozesse können ungeachtet
des Umfangs der Reaktion auch mehrere Schritte erfordern. Demgemäß existiert
aufgrund der Einführung
von Verunreinigungen, volumetrischen Ungenauigkeiten und geringer
Reproduzierbarkeit ein Potential für verringerte Genauigkeit.
Diese Probleme sind insbesondere bei diagnostischen Anwendungen
im Mikrobereich spürbar, bei
denen biologische Proben analysiert werden, wie z.B. Immunoassays,
Polynucleotidamplifikationen oder -hybridisierungen.
-
In
letzter Zeit sind Anstrengungen unternommen worden, um chemische
Prozesse zu modernisieren, um Kosten zu reduzieren, Genauigkeit
zu erhöhen
und Redaktionsausbeuten zu verbessern. Z.B. sind Kapillarelektrophoresetechniken
vorschlagen worden, um die Auflösung
bei Immunoassays zu erhöhen.
Verschiedene Versuche sind unternommen worden, um andere übliche Analysentechniken
zu verbessern, wie z.B. die Polymerasekettenreaktion (PCR). Z.B.
berichtet das US-Patent 5,273,907 über eine mit PCR-Reagenzien
vorbeladene Kapillare, die verwendet wird, um zur DNA-Amplifikation
eine Probe an die Reagenzien abzugeben. Ähnlich beschreibt die internationale
Patentveröffentlichung WO
93/22058 ein Gerät
im Mikrobereich zur Ausführung
von PCR. In diesem Fall werden PCR-Reagenzien von einer ersten Kammer
durch Bewegung von Materialien durch Kanäle in einem Mikrochip mit einer
Probe in einer zweiten Kammer gemischt.
-
In
letzter Zeit sind Anstrengungen unternommen worden, um chemische
Prozesse zu modernisieren, um Arbeit und Kompliziertheit zu verringern. Eine
solche Anstrengung beinhaltet die Verwendung von Mikrochipanordnungen.
Eine Mikrochipanordnung besteht typischerweise aus einem dünnen Siliciumdioxidsubstrat
oder einem anderen polymeren Substrat, auf dem Kanäle geätzt sind.
Die Kanäle
dienen als Mittel zum Reagenzientransport und/oder als die Reaktionskammern
selbst. Mikrochipanordnungen zur Ausführung von chemischen Reaktionen
im Mikrobereich können
eine Reihe von miteinander verbundenen Kanälen umfassen. Z.B. können Kanäle auf der
Oberfläche
eines mikroverfertigten Festkörpers
geätzt
sein. Reagenzien in Lösung
werden dann in die Kanäle
platziert und mit z.B. Reagenzien reagieren gelassen, die sich bereits
in den Kanälen befinden.
Spannungsgradienten können
verwendet werden, um Probenfluss und -mischen zu steuern. Siehe
z.B. die internationale Veröffentlichung
WO 96/04547. Wasserstoff- und Sauerstoffgas resultieren häufig aus
einer Verwendung von Spannungsgradienten zum Steuern eines Probenflusses.
Elektrolyseprodukte können
sich auch in der Nähe
der Elektrodenoberfläche
ansammeln.
-
Mikrochipanordnungen,
die keine Spannungsgradienten erfordern, um die Proben und Lösungen zu
injizieren, sind konstruiert worden. Siehe z.B. das US-Patent No.
5,304,487; die internationale Veröffentlichung WO 93/22053; und
die internationale Veröffentlichung
WO 93/22054 (die Mikrochipanordnungen zur Probenanalyse beschreiben).
In solchen Systemen wird ein stationärer Flüssigkeitsstrom durch eine Reihe
von Kanälen
gepumpt, die auf einem Mikrochip geätzt sind. Eine Probe wird durch
einen der Kanäle
eingeführt
und mit dem Flüssigkeitsstrom
gemischt. Diese Systeme werden verwendet, um das Vorhandensein einer
Probenkomponente oder das Vorhandensein von einer gewissen biologischen
Entität
(z.B. ein Bakterium oder Virus) nachzuweisen, indem die Varianz
in der Fließgeschwindigkeit
zwischen Flüssigkeit
und mit Probe gemischter Flüssigkeit
gemessen wird, wenn jede durch den Mikrochip fließt.
-
Es
verbleibt ein Bedarf in der Technik an Verfahren und Geräten, die
die Zeit, Arbeit, Kosten, die biologische Gefährdungsexposition und die Kompliziertheit
verringern, die im Augenblick in der Leistungsfähigkeit einer chemischen Analyse
von biologischen Proben im Mikrobereich beinhaltet sind. Spezieller
gibt es einen Bedarf an Vorrichtungen und Verfahren, die effizient
und ökonomisch
einen Probenpfropfen bilden und ihn an einen Trennkanal und/oder
ein Analysengerät
abgeben.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es
sind Vorrichtungen und Verfahren zur schnellen, automatischen Analyse
von Proben im Mikrobereich unter Verwendung von Druckunterschieden
entwickelt worden. Ein Probenpfropfenbildungsgerät der Erfindung umfasst im
Allgemeinen zwei sich kreuzende Kanäle, einen Einführkanal
und einen Trennkanal. Eine Probe wird durch eine Öffnung in
einen ersten Kanal eingeführt,
der hierin als ein Probeneinführkanal
bezeichnet wird. Die Probe bewegt sich durch den Probeneinführkanal
durch Vakuum, Druck, Kapillarwirkung oder eine Kombination davon. In
einem Abstand von dem Punkt einer Probeneinführung bildet der Probeneinführkanal
eine Verbindungsstelle oder Kreuzung mit (d.h. er kreuzt sich mit)
einem zweiten Kanal, der hierin als ein Trennkanal bezeichnet wird.
Durch die Verwendung von Druck und/oder Vakuum, die an den Trennkanal und/oder
den Probeneinführkanal
angelegt werden, wird ein Teil der Probe in den Trennkanal transportiert,
wenn die Probenhauptmasse die Kreuzung zwischen dem Probeneinführ- und
-trennkanal kreuzt. Mit der richtigen Steuerung kann ein diskreter
Pfropfen einer Probe im Trennkanal reproduzierbar gebildet werden
und Abtrenntechniken und/oder einer Analyse unterzogen werden. Anschließend an
die Bildung des Probenpfropfens wird der Teil der Probe, der den
Probenpfropfen nicht bildet, typischerweise zu einem Abflussauslass
bewegt.
-
Eine
Bildung des Probenpfropfens an der Kanalkreuzung wird durch Aufbringung
von Druckunterschieden in und zwischen dem Probeneinführ- und -trennkanal
gesteuert. Ein erster Druckunterschied wird so aufgebracht, um einen
Probenfluss durch den Einführkanal
zu seiner Verbindungsstelle zu induzieren. Anschließend wird
mindestens ein zweiter Druckunterschied aufgebracht, um einen Teil
der Probe in den und entlang der Achse des Trennkanals zu bewegen.
Ein Pfropfen einer Probe wird im Allgemeinen im Trennkanal an der
Kreuzung gebildet, wenn der Druck axial entlang dem Trennkanal in
Bezug zum Probeneinführkanal
erhöht
wird. Die Frequenz und Größe einer
Pfropfenbildung wird gesteuert, indem die Druckunterschiede gesteuert
werden.
-
Der
Probeneinführ-
und -trennkanal können Kapillaren
sein, die gebildet sind, um sich an einer Kreuzung zu kreuzen. Eine
bevorzugte Struktur, die den Probeneinführ- und -trennkanal definiert,
ist ein mikroverfertigter Festkörper,
wie z.B. ein Mikrochip. Typischerweise werden Kanäle direkt
in den Mikrochip geätzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst
der Mikrochip eine Reihe von Probeneinführ- und -trennkanälen, die
auf seiner Oberfläche
geätzt sind.
Solche Kanäle
weisen vorzugsweise Querschnittsabmessungen von zwischen etwa 0,1 μm und etwa
1000 μm
auf.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst der Trennkanal eine Längsachse,
die ein Medium, z.B. Wasser, einen Elektrolyten oder eine Polyacrylamidlösung oder
-gel, enthält,
was die Abtrennung von Komponenten unterstützt, von denen vermutet wird,
dass sie sich in der Probe befinden. Folglich migriert ein Probenpfropfen,
der an der Kreuzung des Probeneinführ- und -trennkanals gebildet
ist, axial entlang dem Trennkanal, wo er in seine Komponenten getrennt
werden kann. Vorzugsweise enthalten der Probeneinführ- und
-trennkanal einen Puffer, der mit der Probe und dem Trennmedium
kompatibel ist, wenn vorhanden. Das Gerät kann weiter einen Spannungsgenerator
umfassen, um eine Spannung axial entlang der Längsachse des Trennkanals anzulegen.
Die Anlegung einer Spannung entlang dem Trennkanal kann die Abtrennung
von Komponenten der Probe unterstützen, z.B. wenn die Abtrennung durch
Elektrophorese erreicht wird.
-
Auch
umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform ein Gerät der Erfindung
einen Detektor. Der Detektor ist in der Nähe des Trennkanals platziert,
um abgetrennte Komponenten einer Probe nachzuweisen. Der Detektor
kann einen Ultraviolettdetektor, einen Sichtlichtdetektor, einen
Infrarotdetektor, einen Fluoreszenzdetektor, einen Chemilumineszenzdetektor,
einen Brechungsindexdetektor, einen Ramandetektor, ein Massenspektrometer,
einen elektrochemischen Detektor und/oder einen Leitfähigkeitsdetektor
umfassen. Vorzugsweise ist der Detektor ein Massenspektrometer,
ein Fluoreszenzdetektor oder ein Radioaktivitätsdetektor.
-
Ein
Probenpfropfenbildungsgerät
der Erfindung kann in Verbindung mit einem Probenabgabesystem verwendet
werden. Ein bevorzugtes Probenabgabegerät ist in einer in gemeinsamem
Besitz befindlichen, mitanhängigen
US-Patentanmeldung, Serial No. 09/(zu verbessern in, wenn verfügbar; identifiziert
durch das Vertreterzeichen No. SYP-131), mit dem Titel "Apparatus And Methods
For Sample Delivery",
offenbart. In einer bevorzugten Ausführungsform der Anmeldung findet
eine chemische Reaktion in einem Probenabgabesystem statt, und die
Produkte der Reaktion werden zu einem Probeneinführkanal eines Geräts der vorliegenden
Erfindung eingebracht.
-
Ein
bevorzugtes Probenabgabegerät
weist ein Gehäuse
auf, das eine Kapillare definiert, die ein offenes Ende zur Einführung einer
Probe und ein geschlossenes Ende aufweist. Das geschlossene Ende ist
vorzugsweise mit einem Temperaturregelgerät verbunden, das verwendet
wird, um eine Bewegung der Probe und Reaktanten im Probenabgabesystem zu
steuern. Chemische Reagenzien, wie z.B. Bindeproteine, Liganden,
Rezeptoren, Antikörper
oder Antigene können
in der Kapillare immobilisiert sein. Diese Reagenzien können nachweisbar
markiert sein und sind vorzugsweise fluoreszenzmarkiert. Diese Reagenzien
können
auch chemisch oder enzymatisch markiert sein, z.B., um eine Amplifikation
vor einem Nachweis zu ermöglichen.
-
Die
vorliegende Erfindung sorgt für
eine schnelle, genaue und reproduzierbare Analyse von Proben im
Mikrobereich. Bei Verwendung in Verbindung mit einem Probenabgabegerät, wie oben
beschrieben, ist die Analyse einer Probe vom Anfang bis zum Ende
ein automatischer Prozess. Außerdem kann
der automatische Prozess eine oder mehrere Reaktionen umfassen,
die im Probenabgabegerät stattfinden
können.
Die Erfindung wird bei Erwägung der
folgenden Zeichnungen, Beschreibung und Ansprüche weiter verstanden.
-
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 ist
eine schematische graphische Darstellung eines Probenpfropfenbildungsgeräts der Erfindung.
Ein Probeneinführkanal
bildet eine nichtparallele Verbindungsstelle mit einem Trennkanal,
in dem ein Probenpfropfen ausgebildet ist. Die Richtung eines Probenflusses
ist durch Pfeile 16, 18 und 20 angezeigt.
-
2: A–F
sind schematische Querschnittsansichten eines Geräts der Erfindung,
wobei ein Fluss einer Probe durch die Kanäle bei verschiedenen Stadien
während
der Durchführung
eines Verfahrens der Erfindung dargestellt ist.
-
3: A–F
sind schematische Querschnittsansichten eines Geräts der Erfindung,
wobei ein Fluss einer Probe durch die Kanäle bei Anlegung einer "Aufhäufungs"-Spannung entlang
dem Trennkanal dargestellt ist.
-
4 stellt
eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung dar, die eine Mikrochipanordnung ist, die mit einer
Reihe von Probeneinführkanälen und
-trennkanälen
geätzt
ist. Der wiedergegebene Mikrochip weist Verbindungen auf, die den
Druck und/oder die Spannung durch die Kanäle steuern.
-
5 stellt
ein Probenabgabesystem in Verbindung mit einer Mikrochipanordnungausführungsform
der vorliegenden Erfindung, wie in 4 wiedergegeben,
dar. Das Probenabgabesystem umfasst ein Array von Kapillaren, die
mit einem Satz von chemischen Reagenzien vorbeladen sind und in
Verbindung mit einem Temperaturregelgerät stehen. Die Kapillaren sind über der
Mikrochipanordnung positioniert und werden verwendet, um eine Probe
an die Probeneinführkanäle der Mikrochipanordnung
abzugeben.
-
6 stellt
ein Array von Kapillaren dar, die einen ersten Satz von chemischen
Reagenzien und einen zweiten Satz von chemischen Reagenzien enthalten.
Ein Temperaturregelgerät
ist in Verbindung mit den Kapillaren dargestellt. Ein zweites Temperaturregelgerät zur örtlichen
Erwärmung
und Kühlung ist
auch dargestellt. Die Kapillaren sind zur Abgabe von Proben an die
Probeneinführkanäle über einer Mikrochipanordnung
positioniert.
-
7 gibt
ein wissenschaftliches Instrument der Erfindung wieder, das ein
integriertes Probenabgabesystem, ein Probenpfropfenbildungsgerät und andere
in Beziehung stehende Ausrüstung
zur Durchführung
einer schnellen, automatischen Analyse von Proben im Mikrobereich
umfasst.
-
Gleiche
Bezugszeichen in respektiven gezeichneten Figuren zeigen entsprechende
Teile an.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung sorgt für
die automatische Bildung eines Probenpfropfens, der in seine einzelnen
Komponenten getrennt und/oder analysiert werden kann. Wie hierin
verwendet, soll der Terminus "Probe" jegliche Quelle
bedeuten, von der vermutet wird, dass sie eine beliebige Komponente,
die nachzuweisen oder zu identifizieren ist, oder irgendeine potentiell
reaktive chemische Entität
enthält.
Eine Probe kann "unverdünnt" sein oder kann mit
einem geeigneten Lösungsmittel
verdünnt
sein. Im Augenblick bevorzugte Proben umfassen, sind aber nicht
darauf beschränkt,
ein beliebiges biologisches Untersuchungsmaterial, von dem vermutet wird,
dass es eine Komponente von Interesse enthält. Zur Verwendung in der beanspruchten
Erfindung geeignete Proben umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Körperfluide,
wie z.B. Blut, Serum, Plasma, Urin, cerebrospinales Fluid, Saliva, Schweiß, Samen,
Tränen,
Vaginalfluid, Fruchtwasser und Aszitesflüssigkeit.
-
Wie
hierin verwendet, soll der Terminus "Komponente" eine beliebige identifizierbare oder nachweisbare
Substanz oder eine Substanz bedeuten, die eine Abtrennung von anderen
Substanzen in einer Probe unter Verwendung einer Vorrichtung der Erfindung
zulässt.
Bevorzugte Komponenten umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, chemische und
biologische Einheiten, wie z.B. Proteine, Peptide, Nucleinsäuren, Peptidhormone,
Nicht-Peptidhormone, Missbrauchsarzneimittel, Pharmazeutika, mikrobielle
Antigene, virale Antigene, Kohlenhydrate, polyklonale Antikörper, monoklonale
Antikörper,
Anti-Idiotyp-Antikörper, Antikörperfragmente,
Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, Biotin, Rezeptoren, Liganden,
Inhibitoren und Bindungskompetitoren. Komponenten können auch
an eine Sonde und insbesondere eine nachweisbar markierte Sonde
gebunden sein. Übliche
Sonden umfassen Polynucleotide, wie Ribosonden und Peptidnucleinsäuren (PNAs).
-
Allgemein
gesprochen, liefert die Erfindung Vorrichtungen und Verfahren zur
Analyse einer Probe im Mikrobereich. Jedoch kann eine Probe einer beliebigen
Größe mit einem
geeignet dimensionierten Probenanalysengerät der Erfindung unter Verwendung
von Konzepten und Prinzipien, die hierin offenbart sind, analysiert
werden. Eine Vorrichtung der Erfindung weist ein Gehäuse auf,
das zwei Kanäle definiert.
Die zwei Kanäle
kreuzen sich, um eine Kreuzung zu bilden. Eine Probe wird in einen
ersten Kanal, den Probeneinführkanal,
eingeführt.
Der Probeneinführkanal
kreuzt einen zweiten Kanal, den Trennkanal. Die Kanäle können sich
unter einem beliebigen Winkel kreuzen, um die Kreuzung zu bilden. Der
Trennkanal ist typischerweise länger
als die Länge
des Probeneinführkanals.
Vorzugsweise ist der Trennkanal mehr als zehnmal länger als
der Probeneinführkanal
und spezieller mehr als einhundertmal länger. Wenn der Unterschied
in den Längen
des Probeneinführkanals
und des Trennkanals nicht äußerst groß ist, kann
der Querschnitt des Probeneinführkanals
größer sein,
um den Druckabfall zu kompensieren, d.h. den Druckabfall zu verringern.
-
Eine
Vorrichtung der Erfindung umfasst weiter ein Druckregelgerät, um Druckgradienten
auf die Kanäle
aufzubringen. Das Druckregelgerät
selbst kann eine Überdruckquelle,
wie z.B. eine peristaltische Pumpe, oder eine Vakuumquelle, wie
z.B. eine Vakuumpumpe, sein. Eine Vakuumquelle kann auch ein Absorptionsgerät sein,
wie z.B. ein Docht, der unter Verwendung von Oberflächenspannung
(Kapillarwirkung) Flüssigkeit
in einen Kanal zieht. Jedoch kann das Druckregelgerät eine steuerbare
Druckquelle, z.B. eine Vakuumquelle, oder eine Überdruckquelle, wie z.B. eine
peristaltische Pumpe oder eine Druckgasquelle, umfassen. Demgemäß kann das Druckregelgerät Hardware,
wie z.B. Ventile, Manifolds, Rohrmaterial und dergleichen, umfassen.
Das Druckregelgerät
kann auch Kontroller, wie z.B. einen beliebigen geeigneten programmierbaren
Logikkontroller auf Mikroprozessor-Basis, einen Personalcomputerkontroller
oder dergleichen, zur Prozesssteuerung umfassen. Ein geeigneter
Kontroller umfasst Merkmale, wie z.B. Programmierbarkeit, Zuverlässigkeit,
Flexibilität
und Dauerhaftigkeit. Der geeignete Kontroller umfasst unter anderen
Merkmalen verschiedene Eingangs/Ausgangs-Ports, die verwendet werden,
um Verbindungen bereitzustellen, um Ventile zu öffnen und zu schließen, Fluide
zu regeln und zuzumessen. Der Kontroller umfasst auch geeigneten
Speicher, um Prozessrezepturen für
gewünschte Anwendungen
zu speichern. Natürlich
hängt der
Typ von Kontroller von der speziellen Anwendung ab.
-
Aufbringung
eines Druckgradienten in den Kanälen
bewegt die Probe durch die Kanäle.
Die Kanäle
sind vorzugsweise auf einem mikroverfertigten Festkörper gebildet,
wie z.B. einem Mikrochip. Der Trennkanal kann Siebmedien, wie z.B.
Polyacrylamid, als eine viskose Lösung oder ein Gel aufweisen, die
darin angeordnet sind, um eine Abtrennung und/oder Analyse zu erleichtern.
Nach Abtrennung können
die Probenkomponenten unter Verwendung eines Detektors nachgewiesen
werden, der entlang oder in der Nähe des Endes des Trennkanals
angeordnet ist. Die Vorrichtung kann verwendet werden, um automatisch
Assays, wie z.B. unter anderem Immunoassays, Enzymassays, chemische
Assays, Rezeptorassays, und Polynukleotididentifikationen auszuführen.
-
Eine
Vorrichtung der Erfindung sorgt für die automatische gleichförmige Herstellung
eines Probenpfropfens durch die Verwendung von Vakuum und/oder Überdruck
auf dem Probeneinführ-
und -trennkanal. Der Probeneinführ-
und -trennkanal definieren ein Injektionssystem eines wissenschaftlichen
Instruments der Erfindung. Wie in 1 veranschaulicht,
bildet der Probeneinführkanal 10 eine Kreuzung 11 mit
dem Trennkanal 12. Ein alternierendes Aufbringen von Überdruck
und/oder Vakuum auf die Kanäle
bewirkt, dass sich ein Probenpfropfen 14 stromabwärts der
Kreuzung im Trennkanal 12 bildet. (Es versteht sich, dass 1 eine
schematische Darstellung ist und dass in der Wirklichkeit der Probenpfropfen 14 in
den Kanälen
enthalten ist.) Pfeile 16, 18 und 20 zeigen
die Richtung eines Probenflusses an. Ein Spannungsgenerator 19 kann
verwendet werden, um einen Spannungsgradienten entlang der Längsachse
des Trennkanals anzulegen. Z.B. kann ein Spannungsgradient angelegt
werden, während ein
Druckunterschied eine Probe durch den Probeneinführkanal in einem Typ von Probenpfropfenbildungsprozess
bewegt, der als "Aufhäufung" bezeichnet wird,
was ausführlicher
unten beschrieben wird.
-
Um
eine Automatisierung der hierin beschriebenen Verfahren zu unterstützen, ist
ein anderer Aspekt der Erfindung ein wissenschaftliches Instrument,
das die oben beschriebene Probenanalysenvorrichtung enthält. Das
wissenschaftliche Instrument ermöglicht
die wirkungsvolle Automatisierung der Systeme der Erfindung mit
seinen Hilfsgeräten und
-ausrüstung.
Das wissenschaftliche Instrument ermöglicht auch, dass andere Vorrichtungen,
z.B. ein Probenabgabesystem, mit den Analysensystemen der Erfindung
verbunden wird, um zu ermöglichen, dass
eine funktionelle Konstruktion den Endbenutzererfordernissen entspricht.
Z.B. können
Analyseninstrumente mit einem wissenschaftlichen Instrument der
Erfindung verbunden werden, um eine Analyse von Proben, z.B. zu
gegebenen Zeitpunkten im Reaktionszyklus, zu ermöglichen. In der Erfindung nützliche
Analyseninstrumente sind Fachleuten gut bekannt und umfassen, sind
aber nicht darauf beschränkt,
Massenspektrometrieinstrumente, Chromatographiesysteme und verschiedene
Nachweisinstrumente, wie z.B. Ultraviolett-, Infrarot-, Fluoreszenz-
und Brechungsindexdetektoren. Ein solcher Detektor kann entfernt
von der Kreuzung und in Verbindung mit dem Trennkanal positioniert
sein.
-
Andere
nichtbeschränkende
Beispiele für Hilfsinstrumente,
die in der Erfindung nützlich
sind, umfassen Diagnoseinstrumente zur Durchführung von Assays und Synthetisiervorrichtungen
zum Automatisieren der Produktion von speziellen Verbindungen, um
Teil einer Probe zu werden. Solche Synthetisiervorrichtungen umfassen
diejenigen, die kombinatorische Synthesen, die das Durchmustern
von Bibliotheken von Verbindungen ermöglichen, mit den Abgabesystemen
der Erfindung ausführen
können. Sämtliche
obigen Instrumente und Geräte
können auf
eine schrittweise Art von Hand betrieben werden. Jedoch wird eine
volle Automatisierung bevorzugt. Wie für einen Fachmann ersichtlich
ist, umfasst eine Automatisierung vorzugsweise einen Mikroprozessor und/oder
Computer, der verschiedene Aspekte der Verfahren der Erfindung steuert,
aber typischerweise mindestens in Verbindung mit den Einrichtungen
zur Erzeugung der Druckunterschiede steht.
-
Verfahren
der Erfindung sorgen für
die Bildung eines Probenpfropfens und in gewissen Ausführungsformen
für eine
Abtrennung der Komponenten dieses Probenpfropfens. Die Aufbringung
von Druck/Vakuum dient dazu, die Probe durch die Kanäle des Injektionssystems
einer Vorrichtung der Erfindung zu drücken oder zu ziehen. Nachdem
ein Probenpfropfen im Trennkanal gebildet ist, können seine Komponenten vorzugsweise
durch Elektrophorese abgetrennt werden. Jedoch kann ein zugemessener Probenpfropfen
zu einem anderen Analysengerät ohne
weitere Abtrennung zur Analyse transportiert werden. Die 2A–2F veranschaulichen
die verschiedenen Stadien einer Probenpfropfenbildung. Zahlreiche
Mittel sind zur Einführung
einer Probe in die Vorrichtung vorhanden, z.B. eine Injektion von
einer Spritze oder dergleichen oder eine Einführung von einem Probenabgabesystem,
das im Stand der Technik bekannt ist. In einer anderen Ausführungsform
kann ein Absorptionsmaterial, wie z.B. Baumwolle, in den Einführkanal
platziert werden. Das Absorptionsmaterial zieht durch Kapillarwirkung
Probe in den Probeneinführkanal
an. In einer anderen Ausführungsform
kann ein Absorptionsmaterial in Kontakt mit dem Auslass des Probeneinführkanals
platziert sein, z.B. über
dem Kanal, so dass das Absorptionsmaterial die Probe durch den Probeneinführkanal
zieht, indem ein Vakuum von Oberflächenspannung (Kapillarwirkung)
erzeugt wird.
-
Wie
in 2A dargestellt, ist eine Probe 22 im
Probeneinführkanal 10 abgelagert.
In 2B zieht eine Aufbringung eines ersten Druckunterschied,
d.h. ein Vakuum, auf den Probeneinführkanal, entgegengesetzt dazu,
wo die Probe eingeführt wurde,
die Probe durch den Probeneinführkanal
und über
die Verbindungsstelle 11, die mit dem Trennkanal 12 gebildet
ist. In 2C zieht eine Aufbringung eines
zweiten Druckunterschieds, d.h. ein anderes Vakuum, auf den Trennkanal
einen Teil der Probe in den Trennkanal.
-
Eine
Aufbringung eines Druckunterschieds auf den Trennkanal 12 für ein spezifiziertes
Intervall erzeugt reproduzierbar diskrete Probenpfropfen. In 2D bewirkt
eine Aufbringung eines Überdrucks auf
den Trennkanal von der zum Proben-22-fluss entgegengesetzten
Richtung, dass sich ein Pfropfen einer Probe 14 stromabwärts von
der Kreuzung 11 bildet, während die restliche Probe zum
Auslass oder zurück
zur Einführstelle
bewegt wird. In gewissen Ausführungsformen
kann sich der Überdruck
fortsetzen, um den Probenpfropfen durch den Trennkanal zu bewegen,
um eine Abtrennung zu bewerkstelligen, ähnlich zum Betrieb einer Chromatographiesäule.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
der Trennkanal ein Siebmedium zur Abtrennung der Probenkomponenten
auf Grundlage von Ladung oder Größe. Das
Siebmedium kann z.B. Polyacrylamid, Agarose, Polyethylenoxid, Polyvinylpyrolidin und
Methylcellulose umfassen. Andere Siebmedien, wie z.B. Chromatographieteilchen,
können
abhängig von
der speziellen Anwendung verwendet werden. In 2E werden
die Komponenten der Probe elektrophoretisch entlang dem Trennkanal
bewegt und werden durch Anlegen eines Spannungsgradienten entlang
der Längsachse
des Trennkanals 12 abgetrennt. Eine Abtrennung der Probenkomponenten
wird durch Standardelektrophoreseverfahren erzielt. Schließlich gibt
anschließend
an eine Abtrennung und/oder Analyse 2F einen Überdruck
wieder, der von beiden Richtungen entlang dem Trennkanal aufgebracht
wird, um die Probenüberbleibsel
aus dem Kanal herauszudrängen,
um das System zu reinigen.
-
Es
versteht sich, dass die unterschiedlichen Druckunterschiede, die
verwendet werden, um einen Probenpfropfen im Trennkanal zu bilden,
für eine spezielle
Anwendung angepasst werden können. D.h.,
ob Vakuum und/oder Überdruck
verwendet werden, und in welcher Reihenfolge, hängt von der Analyse ab, die
durchzuführen
ist. Außerdem
sind die zeitliche Steuerung, die Stärke und Stelle der Druckunterschiede
Variablen, die unter Verwendung der allgemeinen Prinzipien und Konzepte,
die hierin offenbart sind, optimiert werden sollten. Z.B. wird in
einer Ausführungsform
der erste Druckunterschied, der auf den Einführkanal aufgebracht wird, vor
der Aufbringung des zweiten Druckunterschieds auf den Trennkanal
reduziert. Jedoch sollen die spezifischen Beispiele, die hierin
erörtert
und wiedergegeben sind, die vorliegende Erfindung veranschaulichen,
aber in keiner Weise beschränken.
-
Ein
Weg, um die Zusammensetzung eines Probenpfropfens zu manipulieren,
der unter Verwendung von Verfahren der Erfindung gebildet ist, besteht
darin, die Ionenstärke
der Medien, z.B. der Pufferlösungen,
in jedem Kanal zu variieren. In dem in den 2A–2F wiedergegebenen
Beispiel waren die Ionenstärken
der Medien im Probeneinführkanal
und dem Trennkanal im Wesentlichen gleich. Als Ergebnis ist der
Probenpfropfen, der gebildet wird, in Bezug zu den in der Probe
vorhandenen ionischen oder geladenen Spezies nicht konzentriert oder
verdünnt.
D.h. eine Konzentration der geladenen Spezies im Probenpfropfen
sollte ungefähr gleich
ihrer Konzentration in der in den Probeneinführkanal eingebrachten Anfangsprobe
sein.
-
Jedoch
kann ein Probenpfropfen auch unter Verwendung eines Prozesses gebildet
werden, der als "Aufhäufung" bezeichnet wird,
der die geladenen Komponenten einer Probe an der Kreuzung vor einer Probenpfropfenbildung
konzentriert. Im Wesentlichen, wenn ein elektrisches Potenzial axial
entlang dem Trennkanal angelegt wird, während ein Druckgradient eine
Probe entlang dem Probeneinführkanal bewegt,
ergibt sich ein Gebiet von erhöhter
Ionenkonzentration an der Kreuzung, vorausgesetzt, dass sich das
Medium im Probeneinführkanal
bei einer niedrigeren Ionenstärke
befindet als das Medium im Trennkanal. Dies führt zu einem Probenpfropfen,
der in einer oder mehreren Ionenspezies in Bezug zur in die Probeneinführung eingeführten Probe
konzentrierter ist. Eine Modulation der angelegten Spannung ermöglicht,
dass eine gewünschte
Probenkonzentration verwirklicht wird.
-
Mit
Bezug auf die 3A–3F ist
das Verfahren zur Probenpfropfenbildung, das als "Aufhäufung" bezeichnet wird,
wiedergegeben, wobei eine Vorrichtung der Erfindung verwendet wird.
Die 3A–3F zeigen
eine Reihe von schematischen Darstellungen, die denen in den 2A–2F ähneln, außer dass
die Ionenstärke der
Medien im Probeneinführkanal 10 geringer
ist als die Ionenstärke
des Mediums im Trennkanal 12. Zusätzlich wird ein Spannungsgradient
an den Trennkanal 12 angelegt, während ein Vakuum eine Probe entlang
dem Probeneinführkanal 10 bewegt,
wie in 3B dargestellt. Wie für einen
Fachmann ersichtlich, erfahren Ionenspezies, die sich in einem angelegten
elektrischen Potenzial von einem Medium geringerer Ionenstärke zu einem
Medium höherer
Ionenstärke
bewegen, eine Abnahme in ihrer Bewegungsgeschwindigkeit aufgrund
eines verminderten elektrischen Feldes im Medium höherer Ionenstärke. Demgemäß, wie in 3B dargestellt, "akkumulieren" sich die Ionenspezies
an der Grenzfläche 24 der zwei
Medien sich unterscheidender Ionenstärke. Beim kontinuierlichem
Fluss einer Probe durch die Verbindungsstelle werden die Ionenspezies
in einer Probe an der Grenzfläche 24 hochkonzentriert.
Anschließend
an das geeignete Maß einer "Aufhäufung" wird das elektrische
Potenzial entfernt, und es wird ein Druckunterschied am Trennkanal
angelegt, um einen Probenpfropfen zu bilden, der in der Ionenspezies
der Probe konzentriert ist, wie in den 3C und 3D dargestellt.
Die restlichen Schritte des Verfahrens, die 3E und 3F,
sind wie oben für die 2E und 2F beschrieben.
-
Die
Prozedur einer Aufhäufung
kann nützlich sein,
um Komponenten in verdünnten
Proben zu konzentrieren, so dass eine nachweisbare Menge der Komponente
oder Komponenten von Interesse durch den Trennkanal transportiert
werden. Alternativ kann ein Probenmedium unter Verwendung von "Anti-Aufhäufung" verdünnt werden.
Es wird im Wesentlichen dieselbe Prozedur praktiziert, jedoch befindet
sich die Probe in einem Medium höherer
Ionenstärke
als im Trennkanal vorhanden ist. Demgemäß kann ein optimierter Probenpfropfen,
z.B. seine Größe und Konzentration
von Komponenten, durch die obigen Techniken gesteuert werden, d.h.
Aufhäufung,
Anti-Aufhäufung
und Nicht-Aufhäufung.
-
4 veranschaulicht
eine bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung. Eine Mikrochipanordnung 25, die mit einer
Reihe von Probeneinführkanälen 10 und
Trennkanälen 12 geätzt ist,
ist dargestellt. Die Kanäle
treffen sich, um eine Kreuzung 11 zu bilden. Wie wiedergegeben,
weist der Mikrochip eine Mehrzahl von Probeneinführ- und -trennkanälen auf. Die
Kanäle
sind zwischen etwa 10 μm
und etwa 100 μm
in der Breite und etwa 0,1 μm
bis etwa 1000 μm in
der Tiefe. Der Mikrochip weist auch Manifolds 26 und 27 auf,
um eine Probe und/oder Reagenzien zu den und/oder in die Trenn-
und Probeneinführkanäle zu transportieren.
-
Mikrochips
mit Probeneinführ-
und -trennkanälen
können
in großen
Mengen von einem Festkörpersubstratmaterial
konstruiert und gefertigt werden. Sie können leicht sterilisiert werden.
Siliciumdioxid ist wegen der gut entwickelten Technologie, die seine genaue
und effiziente Fertigung ermöglicht,
ein bevorzugtes Substratmaterial, aber andere Materialien können verwendet
werden, einschließlich
Polymere, wie z.B. Polytetrafluorethylene. Die Probeneinführ- und
-trennkänale
können
von einem Siliciumdioxidsubstrat durch die verschiedensten maschinellen
Mikrobearbeitungsverfahren, die Fachleuten bekannt sind, kostengünstig in
großen
Mengen gefertigt werden. Die maschinellen Mikrobearbeitungsverfahren, die
verfügbar
sind, umfassen Filmablagerungsprozesse, wie z.B. Schleuderbeschichtung
und chemisches Aufdampfen, Laserfertigungs- oder fotolithografische
Techniken, wie z.B. UV- oder Röntgenstrahlprozesse,
und Ätzverfahren,
die durch entweder nasschemische Prozesse oder Plasmaprozesse durchgeführt werden
können.
(Siehe z.B. Manz, et al., Trends in Analytical Chemistry 10: 144–149 (1991)).
-
Kanäle von variierenden
Breiten und Tiefen können
mit Abmessungen im Mikrobereich gefertigt werden. Ein Siliciumdioxidsubstrat,
das gefertigte Probeneinführ-
und -trennkanäle
enthält,
kann mit einer dünnen
anodisch gebundenen Glasabdeckung abgedeckt und versiegelt werden.
Andere durchsichtige oder opake Abdeckmaterialien können verwendet
werden. Jedoch sollte zur richtigen anodischen Bindung eines von
dem Substrat oder der Abdeckung Siliciumdioxid und das andere Silicium
sein. Demgemäß können z.B.
ein Siliciumdioxid- und ein Siliciumsubstrat in Sandwichbauweise
angeordnet sein, oder es kann ein Siliciumsubstrat zwischen zwei
Glasabdeckungen eingefügt
sein. Die Verwendung einer transparenten Abdeckung führt zu einem
Fenster, das ein dynamisches Betrachten der Kanalinhalte erleichtert
und ein optisches Probenehmen der Kanäle entweder visuell oder maschinell
ermöglicht.
Andere Fertigungsansdätze
können
verwendet werden.
-
Zu
analysierende Proben können
an das Probenpfropfenbildungsgerät
der Erfindung durch Probenabgabesysteme abgegeben werden, wie in der
in gemeinsamem Besitz befindlichen mitanhängigen US-Patentanmeldung,
Serial No. 09/(zu ändern in:
identifiziert als Vertreterzeichen No. SYP-131), mit dem Titel "Apparatus And Methods
For Sample Delivery",
offenbart. Ein bevorzugtes Array von solchen Probenabgabesystemen
ist in 5 dargestellt. Ein Array von Kapillaren 28 wird
durch einen Arrayhalter 30 gehalten. Der Innendurchmesser
der Kapillaren liegt vorzugsweise zwischen etwa 5 μm und etwa 1000 μm, und bevorzugter
zwischen etwa 20 μm
und etwa 300 μm.
Obwohl Abmessungen für
im Wesentlichen kreisförmige
Querschnittsflächen
von Kapillaren bereitgestellt werden, werden ähnliche Querschnittsflächen für nicht
kreisförmige
Kanäle
bevorzugt, beispielsweise wie rechteckige Kanäle mit einer Breite und einer
Tiefe.
-
Ein
Ende von jeder der Kapillaren ist versiegelt und berührt ein
Temperaturregelgerät 32.
Die Kapillaren weisen auch eine Öffnung
auf, die vorzugsweise zum geschlossenen Ende entgegengesetzt ist. Die
Kapillaren können
aus z.B. Glas oder Kunststoff hergestellt sein, und das Temperaturregelgerät kann ein
beliebiges im Handel erhältliches
oder kundenspezifisch hergestelltes Heiz- und Kühlgerät sein, z.B. ein Peltierelement.
Die Kapillaren können
weiter chemische Reagenzien 34 enthalten, die auf ihren Wänden immobilisiert
sind. Eine Immobilisierung der chemischen Reagenzien auf den Kapillarwänden kann
durch Trocknen erzielt werden. Die Reagenzien können zur Kapillare abgegeben
werden, indem sie z.B. mit einer Mikronadel in die Kapillare injiziert
werden. Typischerweise weist die Mikronadel einen Durchmesser auf,
der kleiner als der Innendurchmesser der Kapillare ist. Sobald sich
die chemischen Reagenzien an ihrem Ort befinden, können sie
durch Techniken getrocknet werden, die im Stand der Technik bekannt
sind. Alternativ können
die Reagenzien durch Erwärmen
und Kühlen
hydraulisch geladen werden, um eine die Reagenzien enthaltende Lösung in
die Kapillare zu ziehen, wobei die Reagenzien an der gewünschten
Stelle in der Kapillare getrocknet werden, dann diejenigen Gebiete
gewaschen werden, wo die Reagenzien nicht gewünscht werden. Die Reagenzien
können
auch durch andere im Stand der Technik bekannte Techniken geladen werden.
-
Die
in den Kapillaren immobilisierten chemischen Reagenzien können Bindeproteine,
Liganden, Rezeptoren, Antikörper
oder Antigene für
eine Komponente sein, von der vermutet wird, dass sie in der Probe
enthalten ist. Die Reagenzien können
zusätzlich
umfassen: Puffer, Tenside, Zusatzmittel, Arzneimittelträger, Träger, Haptane
oder andere kompatible Moleküle,
die eine Reaktion mit Probenkomponenten erleichtern oder beeinflussen.
-
Die
Reagenzien können
auch nachweisbare Einheiten umfassen. Wie hierin verwendet, soll
der Terminus "nachweisbare
Einheit" eine beliebige
Einheit bedeuten, die zur Verwendung in der beanspruchten Erfindung
geeignet ist, einschließlich
aber nicht beschränkt
auf: Enzyme, Fluorophore, Biotin, Chromophore, Radioisotope, Farbteilchen,
elektrochemische oder chemilumineszierende Einheiten. Eine im Augenblick
bevorzugte nachweisbare Einheit ist eine Fluoreszenzeinheit, wie
z.B. Rhodamin. Andere im Augenblick bevorzugte nachweisbare Einheiten
umfassen: Fluorescein, Cyaninfarbstoffe, Cumarine, Phycoerythrin,
Phycobiliproteine, Dansylchlorid und Texasrot.
-
Ein
Probenabgabesystem, wie oben beschrieben, kann zur Abgabe einer
Probe zur Analyse über
der Öffnung
eines Probeneinführkanals
einer Mikrochipanordnung 25 positioniert werden. Beim Betrieb
nehmen die Probenabgabesysteme die Probe auf, ermöglichen,
dass die Probe mit den chemischen Reagenzien reagiert, die auf ihren
Wänden
immobilisiert sind, und geben dann die Produkte der Reaktion, wenn
vorhanden, zu den Probeneinführkanälen eines
Geräts
der Erfindung ab. Wie in 5 dargestellt, kann ein Array
von solchen Probenabgabesystemen gleichzeitig eine Mehrzahl von
Proben an eine Mehrzahl von Probeneinführkanälen auf einer Mikrochipanordnung 25 abgeben.
-
Eine
Modulation einer Temperatur in der Nähe des geschlossenen Endes
der Kapillaren durch das Temperaturregelgerät 32 steuert die Aufnahme und
Abgabe von Proben, d.h. die Bewegung der Probe in den Kapillaren.
Da die Kapillaren an einem Ende versiegelt sind, bewirkt ein Erwärmen und
Kühlen
des Gases in dem geschlossenen Ende der Kapillaren, dass sich Gas
expandiert bzw. kontrahiert. Wenn das Gas erwärmt wird, erhöht sich
das Volumen, das es einnimmt, und folglich der Druck in der Kapillare
ungefähr
entsprechend dem idealen Gasgesetz PV = nRT, wobei P der Druck ist,
V das Volumen ist, n die Anzahl von Gasmolekülen ist, R die Konstante 8,314
JK–1mol–1 ist
und T die Temperatur ist. Gas wird deshalb durch die Öffnung in
der Kapillare gedrängt,
wenn das Gas erwärmt
wird. Die Kapillare wird dann in die Probe eingetaucht und gekühlt. Beim
Kühlen
kontrahiert sich das Gas in der Kapillare, und die Probe tritt in
die Kapillare ein. Wenn sich das Gas in der Kapillare kontrahiert,
nimmt der Druck in der Kapillare ab. Der Druckunterschied zwischen der
Außenseite
und Innenseite der Kapillare drängt die
Probe in die Kapillare.
-
Bei
ausreichendem Kühlen
berührt
die Probe die chemischen Reagenzien, die auf den Kapillarwänden immobilisiert
sind, und reagiert mit diesen Reagenzien. Die Zeit, die eine Probe
in Kontakt mit den Reagenzien bleiben darf, wird durch die auszuführende Reaktion
bestimmt. Ein weiteres Erwärmen und/oder
Kühlen
der Kapillare bewegt die Proben von einer ersten Stelle im Reaktor
zur zweiten und zu anschließenden
Stellen, wo eine zweite oder anschließende Reaktionen stattfinden.
Nachdem die Reaktion beendet ist, bewirkt ein Wiedererwärmen der
Kapillare, dass sich das Gas expandiert, wobei die Probe aus der
Kapillare gedrängt
wird. Wenn die Kapillare über
der Öffnung
eines Probeneinführkanals
einer Vorrichtung der Erfindung positioniert ist, wird die Probe
zur Probenpfropfenbildung direkt an diese Vorrichtung abgegeben.
-
Ein
Probenabgabesystem, das in Verbindung mit einem Probenanalysengerät der Erfindung verwendet
wird, kann verwendet werden, um zahlreiche Typen von chemischen
Reaktionen durchzuführen.
Z.B. kann das System und das Gerät
bei Diagnoseanwendungen, wie z.B. Blutuntersuchungen (z.B., um Blutkomponenten
zu identifizieren oder um DNA im Blut nachzuweisen/zu identifizieren),
Immunoassays (z.B., um das Vorhandensein eines spezifischen Antigens
in einer Probe nachzuweisen) oder kolorimetrischen oder anderen
Assays (z.B. radiochemischen, chemilumineszierenden, Bindungsassays und
dergleichen) verwendet werden. Das System und das Gerät können verwendet
werden, um Toxine (z.B. Bakterien, Alkohol, Arzneimittel, Viren,
Organismen, Metalle, anormale Niveaus von physiologischen Chemikalien
und dergleichen) oder andere Komponenten in einer Probe (z.B. einer
biologischen oder Umweltprobe) nachzuweisen. Ein Probenabgabesystem
kann auch in einer chemischen Synthese (z.B. bei der Herstellung
von Arzneimitteln, Peptiden, Nucleotiden usw.) verwendet werden.
Zusätzlich kann
ein Probenabgabesystem in zahlreichen Labortechniken, wie z.B. der
Peptid- oder Nucleotidsequenzierung, -amplifikation oder -modifikation,
verwendet werden.
-
Ein
Probenabgabesystem, das Target-Polynucleotidsequenzen amplifiziert
und bei ihrem Nachweis hilft, kann auch verwendet werden, um eine
Probe an eine Vorrichtung der Erfindung abzugeben. 6 stellt
ein Array von Kapillaren 28 in thermischer Verbindung mit
einem Temperaturregelgerät 32 dar. Jede
Kapillare weist ein versiegeltes Ende auf, das sich in der Nähe des Temperaturregelgeräts 32 befindet.
Die Kapillaren enthalten jeweils einen ersten Satz von chemischen
Reagenzien 38 und einen zweiten Satz von chemischen Reagenzien 40,
die auf den Kapillarwänden
immobilisiert sind. Ein zweites Temperaturregelgerät 42,
das Rohrleitungen für
warmes und/oder kaltes Gas oder Flüssigkeit aufweist, ermöglicht eine
Steuerung der Temperatur in einem diskreten Teil der Kapillare,
z.B. dem Gebiet, das die chemischen Reagenzien enthält. Die
dargestellten Probenabgabesysteme sind über einer Mikrochipanordnung 25 positioniert,
um die Reaktionsprodukte an den Probeneinführkanälen 10 einer Vorrichtung der
Erfindung abzulagern.
-
Eine
Verwendung des zweiten Temperaturregelgeräts ermöglicht, dass die Temperatur
der Reaktionen gesteuert wird, ohne dass die Temperatur des Gases
im geschlossenen Ende der Kapillare beeinflusst wird. Wie bei Erörterung
von 5 oben beschrieben, bewirkt eine Erwärmung der
Kapillare, dass sich das Gas expandiert, und bewegt folglich die
Probe in der Kapillare oder aus ihr heraus. Indem ein diskreter
Teil der Kapillare dort, wo die Reagenzien und die Probe lokalisiert
sind, erwärmt
wird, kann die Temperatur der Reaktion gesteuert werden, ohne dass
die Probe in der Kapillare bewegt wird. Verschiedene in oder außerhalb
der Kapillare vorhandene Isolatoren können verwendet werden, um eine Probe
in der Kapillare stationär
zu halten, während auch
ein örtliches
Erwärmen
und/oder Kühlen
ermöglicht
wird. D.h. die Isolatoren können
das Gas in der Nähe
des geschlossenen Endes der Kapillare thermisch abschirmen, um seine
Expansion oder Kontraktion zu verhindern.
-
In
einer Ausführungsform
der Erfindung kann der erste Satz von Reagenzien 38 Reagenzien
zur Ausführung
einer Polynucleotidamplifikationsreaktion sein, wie z.B. PCR. PCR
ist im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe z.B. das US-Patent No. 5,330,892.
Zusätzlich
können
andere Polynucleotidamplifikationsreaktionen, die im Stand der Technik bekannt
sind, unter Verwendung eines Reaktors durchgeführt werden, einschließlich einer
isothermen In-vitro-Amplifikation von DNA unter Verwendung eines
Restriktionsenzym/DNA-Polymerasesystems, Walker, et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 89: 392–96
(1992), und einer Ligasekettenreaktion (LCR). Backman, Clin. Chem.
38: 457–58
(1992), die alle hierin durch Bezug aufgenommen werden.
-
Reagenzien
zur Ausführung
von PCR umfassen typischerweise einen Puffer, mindestens einen Primer,
eine Polymerase, wie beispielsweise Taq-Polymerase, und mindestens
ein Nucleosidtriphosphat. Die Wahl von Puffern, Primern und anderen
Komponenten liegt innerhalb der fachlicher Sachkenntnis, abhängig von
Charakteristiken der Sequenz, die zu amplifizieren ist (z.B. Länge, Abundanz in
der Probe, G/C-Gehalt). Eine Polymerase kann aus der Gruppe ausgewählt werden,
die besteht aus: Taq-Polymerase, E. coli-DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment
von E. coli- DNA-Polymerase
I, T4-DNA-Polymerase, anderen verfügbaren DNA-Polymerasen, reverser
Transkriptase und anderen Enzymen, einschließlich wärmestabilen Enzymen. Die Nucleosidtriphosphate
können
dCTP, dGTP, dATP oder dTTP einschließen.
-
Der
zweite Satz von Reagenzien 40 umfasst Sonden zur Bindung
an amplifizierte Target-DNA. Sonden zur Verwendung in einem Reaktor
können ein
beliebiges DNA-Bindeprotein sein und können vorzugsweise eine komplementäre Sequenz
sein, wie z.B. eine Ribosonde, ein Polynucleotid oder eine PNA.
Es ist vorzuziehen, dass die Sonden nachweisbar markiert sind. Bevorzugte
Markierungen umfassen Radioisotrope, fluoreszierende oder kolorimetrische
Markierungen, enzymatische Markierungen und Molekulargewichtsmarkierungen.
Eine besonders bevorzugte Sonde ist eine Peptidnucleinsäure oder PNA.
Peptidnucleinsäuren
sind wohlbekannte DNA-Imitatoren mit einer neutralen Polyamidhauptkette,
auf der die Nucleinsäurebasen
auf dieselbe Weise angebracht sind, wie sie an der Phosphathauptkette
der DNA angebracht sind. Siehe Egholm, et al., Nature, 365: 566–568 (1993);
Oerum et al., Nucl. Acids Res., 23: 5332–36 (1993); Pluskal et al.,
The FASEB Journal, Poster#35 (1994); Practical PNA: Identifying
Point Mutations by PNA Directed PCR Clamping, PerSeptive Biosystems,
Band 1, Auflage 1 (1995). Peptidnucleinsäure-Synthone und -Oligomere
sind im Handel erhältlich.
(PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA). Siehe auch die PCT-Veröffentlichungen
EP 92/01219, EP 92/01220 und die US 92/10921, die hierin durch Bezug
aufgenommen sind. Peptidnucleinsäuresonden
bilden typischerweise stabilere Duplexe mit DNA, verglichen mit DNA/DNA-Duplexen.
Außerdem,
weil PNA/DNA-Komplexe einen höheren
thermischem Schmelzpunkt aufweisen als die analogen DNA/DNA-Duplexe
kann eine Verwendung von PNA-Sonden
die Reproduzierbarkeit von Blottingassays verbessern.
-
Fluorescein-
oder Biotin-markierte PNA-Sonden werden auf einem Expedite Nucleic
Acid Synthesis System (PerSeptive Biosystems) synthetisiert. Spacereinheiten
aus 8-Amino-3,6-dioxaoctansäure (-o-)
werden zur Harzgebundenen PNA hinzugefügt, bevor aktivierte Ester
von Biotin (Bio) oder Fluorescein (Flu), wie z.B. der Dimethoxytritylbiotinester
von 1-(4'-Nitrophenyl)pyrazolin-5-on
(DMTr-bio-HPP) oder 5,6-Carboxyfluorescein-N- hydroxysuccinimid, mit der PNA umgesetzt
werden. Nach Markierung werden die PNAs von dem Harz abgespalten,
und jegliche Schutzgruppen werden unter Verwendung von z.B. einer
TFMSA/TFA/m-Cresol/Thioanisol (2:6:1:1)-Mischung für zwei Stunden
bei Raumtemperatur entfernt. Markierte PNA wird durch Zugabe von
wasserfreiem Ether gefällt.
Ein roher PNA-Niederschlag wird durch eine Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
auf einer Deltapack C18-Säule (Waters)
und durch Sephadex G-25 gereinigt, um fluoreszierende Verunreinigungen
zu entfernen.
-
Eine
Immobilisierung der chemischen Reagenzien auf den Kapillarwänden kann
durch Trocknen erzielt werden. Die Reagenzien können an die Kapillare abgegeben
werden, z.B. indem sie mit einer Mikronadel in die Kapillare injiziert
werden. Andere Techniken zur Einführung von Reagenzien in eine Kapillare
oder einen Kanal sind zuvor erörtert
worden oder sind Fachleuten bekannt. Nachdem sich die chemischen
Reagenzien an ihrem Ort befinden, werden sie getrocknet, indem z.B.
warme Luft über
sie geblasen wird oder sie in einen Ofen platziert werden. Die PCR-Reagenzien
können
in einer Kohlenhydratmatrix getrocknet werden, wie beispielsweise Dextran
oder Trehalose, bevor sie auf den Kapillarwänden immobilisiert werden.
Jeder Satz von chemischen Reagenzien wird vorzugsweise in separaten Ringen
um die Kapillarwände
getrocknet.
-
Beim
Betrieb wird die Probe, von der vermutet wird, dass sie eine Target-Polynucleotidsequenz enthält, in Kontakt
mit dem ersten Satz von Reagenzien in den Kapillaren (d.h. den PCR-Reagenzien) gebracht,
indem das geschlossene Ende der Kapillare erwärmt wird, um Gas zu verdrängen, wobei
die Kapillare in die Probe gesetzt wird und dann das geschlossene
Ende der Kapillare gekühlt
wird, um das Gas zu kontrahieren und folglich die Probe hereinzuziehen.
Sobald die Kapillare ausreichend gekühlt ist, berührt die
Probe den ersten Satz von chemischen Reagenzien. Das zweite Temperaturregelgerät 42, das
an einer Position auf dem Reaktor platziert ist, die durch die PCR-Reagenzien
eingenommen wird, steuert eine Temperaturwechselbehandlung. Das zweite
Teperaturregelgerät 42 erhöht zuerst
die Temperatur an der durch PCR-Reagenzien eingenommenen Position,
um doppelsträngige
DNA in der Probe zu denaturieren. Dasselbe oder ein unterschiedliches Temperaturregelgerät kühlt dann
das Reaktorgebiet, das die PCR-Reagenzien enthält, um ein Reassoziierenlassen
von PCR-Primern an einzelsträngigen
Matrizensträngen
zu bewirken. Ein Erwärmen
auf eine Temperatur, die zwischen derjenigen zur Denaturierung und
derjenigen zum Reassoziierenlassen liegt, bewirkt eine Primerextension.
Eine Anzahl von solchen Zyklen wird wiederholt, bis die Reaktion
vollständig
ist. Die Anzahl von PCR-Zyklen sowie die genauen Reagenzien, die
verwendet werden, variieren abhängig
von der Menge von verfügbarer
Template-DNA, Reaktionswirkungsgrad
und anderen bekannten Faktoren. Allgemeine Protokolle und Parameter
zur PCR sind bekannt und sind z.B. in Short Protocols in Molecular
Biology, 15-1–15-40
(Ausebel, et al., Herausgeber, 1995) verfügbar.
-
Sobald
die PCR beendet ist, wird die amplifizierte Targetsequenz in Kontakt
mit dem Satz von komplementären
Sonden gebracht, indem das Gas im geschlossenen Ende der Kapillare
mit dem Teperaturregelgerät 32 gekühlt wird.
Der Fachmann erkennt, dass ein einziges Temperaturregelgerät verwendet
werden kann, um die Kapillare zu erwärmen oder zu kühlen, um
eine Probe zu bewegen, und um diskrete Kapillargebiete zur PCR zu
erwärmen
oder zu kühlen.
Jedoch werden wie in 6 dargestellt, separate Temperaturregelgeräte bevorzugt.
Der Satz von Sonden kann mehrere Kopien einer einzigen Sonde umfassen,
von der bekannt ist, dass sie mit mindestens einem Teil des amplifizierten
Targets hybridisiert, oder der Satz kann eine Mehrzahl von unterschiedlichen
Sonden umfassen, wobei einige an Teilen des Targets hybridisieren,
einige nichtkomplementär
zum Target sind.
-
Die
Probe, die amplifizierte Nucleinsäure umfasst, wird in Kontakt
mit den Sonden gebracht, indem die Kapillare gekühlt wird, um zu bewirken, dass sich
die Probe nach oben (weg von dem Punkt eines Gas/Proben-Eintritts)
und in Kontakt mit dem Gebiet der Kapillare bewegt, das Sonden umfasst,
wie oben erwähnt.
Eine Probe wird mit dem Satz von Sonden für eine Zeit inkubieren gelassen,
die ausreicht, um eine Hybridisierung bis zu einem gewünschten
Niveau von Stringentheit zu bewirken. Die Hybridisierungsparameter
(d.h. Zeit, Puffer, Salzkonzentration, Temperatur usw.) werden auf
Grundlage von Sequenzlänge,
G/C-Gehalt, gewünschte
Stringentheit und anderen Kriterien, die einem Fachmann bekannt sind,
bestimmt. Siehe z.B. Ausubel, supra bei 6–7. Sobald ein gewünschtes
Niveau von Hybridisierung erreicht worden ist, wird die Probe (einschließlich Hybridduplexe,
die zwischen Target und Sonde gebildet sind) in einem Probenpfropfenbildungsgerät der Erfindung
durch weiteres Erwärmen
des Reaktors eluiert. Eine eluierte Probe kann dann gewaschen werden,
um eine überschüssige (ungebundene)
Markierung zu entfernen. Die Target-Polynucleotidsequenz wird dann
unter Verwendung einer Probenanalysenvorrichtung der Erfindung nachgewiesen,
um das Vorhandensein und/oder die Menge von Target-DNA zu bestimmen.
-
Die
Probenanalysenvorrichtung zur Injektion, Abtrennung von Probenkomponenten
und Nachweis von markierten Komponenten kann mit einem Probenabgabegerät, wie oben
beschrieben, zur schnellen automatischen Analyse von biologischen Proben
kombiniert werden, ohne die komplizierte Maschinerie, Zeit und die
biologische Gefährdungsexposition,
die vorhandenen Systemen inhärent
sind. 7 stellt eine integrierte Probenanalysenvorrichtung
und Reaktorarray dar. Das integrierte Gerät enthält eine Probenkarte 44 mit
einer Membran, auf der eine Probe, wie beispielsweise Blut, abgelagert
ist. Die Karte kann z.B. eine IsoCodeTM-Karte
(Schleicher & Schuell,
King, NH) sein. Die Karte kann chemische Reagenzien zum Lysieren
der Zellen der Probe, die auf der Kartenmembran abgelagert ist,
enthalten. Das Lysat wird dann durch einen Ofen 46 getrocknet, wodurch
die DNA von den lysierten Zellen an der Kartenmembran fixiert wird.
Das integrierte Gerät umfasst
weiter Reaktoren 48, wie oben mit Bezug auf 5 oder 6 beschrieben.
Das Gerät
enthält eine
Mikrochipanordnung 25 mit Probeneinführ- und -trennkanälen, die
mit einer Druck/Vakuum-Einheit 50, Hochspannungsstromversorgung 52 und
Hochdruckpatrone 54 verbunden sind.
-
In
der Nähe
des Endes der Trennkanäle
der Mikrochipanordnung befindet sich ein optisches Nachweismodul 56.
Das optische Nachweismodul weist das Vorhandensein von nachweisbaren
Einheiten nach, die an die Komponente von Interesse in der Probe
gebunden sind. Ein Nachweis kann durch Methodiken erzielt werden,
umfassend, aber nicht beschränkt
auf: Extinktion von Ultraviolettstrahlung, Extinktion von sichtbarer
Strahlung, Fluoreszenz, Brechungsindex, Raman- oder Massenspektroskopie, Elektrochemie
und Leitfähigkeit.
Ein Nachweis durch Fluoreszenz wird bevorzugt. Ein Fluoreszenznachweis
unter Verwendung dieses Moduls beinhaltet einen Mikrochiplaserstrahl,
der über
die Kanäle
des Mikrochip scannt.
-
Das
integrierte Gerät
umfasst weiter eine sterile Deionateinheit 58, eine Siebgelpuffereinheit 60 und
eine Mikrokanalrekonditionierungslösungseinheit 62. Jede
von diesen drei Einheiten, wie wiedergegeben, ist in zwei Hälften aufgeteilt,
wobei eine Hälfte
die frischen Lösungen
enthält
und die andere Hälfte
Abfalllösungen
enthält.
-
Beim
Betrieb wird eine Probe auf der Membran der Probenkarte 44 abgelagert,
und die Karte wird in das integrierte Gerät eingesetzt, wie in 7 dargestellt.
Die Zellen in der Probe werden durch die chemischen Reagenzien,
die in der Membran enthalten sind, lysiert. Die zelluläre DNA oder
andere Probenkomponenten werden dann auf der Membran durch Erwärmen mit
dem Ofen 46 angetrocknet. An diesem Punkt kann die Karte
entfernt und archiviert werden, oder sie kann beim fortgesetzten
Verarbeiten verwendet werden. Alternativ kann ein Guthrie-Papiertrockenblutblot
verwendet werden, um die Probe abzulagern.
-
Nach
Antrocknen der Probe an der Karte werden die Kartenmembranen unter
Verwendung von sterilem Deionat von der Einheit 58 mit
Dampf erwärmt,
um die Probenkomponenten in einer kleinen Menge von Flüssigkeit
zu extrahieren. Die Kapillaren der Reaktoren 48 werden
dann erwärmt,
um Gas zu verdrängen, über die
Membranen in Position bewegt und in die Flüssigkeit eingetaucht, die die
Probe enthält.
Nach Kühlen
der Kapillaren kontrahiert sich das Gas im geschlossenen Ende der
Kapillaren, und die Probe wird in die Kapillaren gezogen. Die Kapillaren sind
vorzugsweise mit Reagenzien vorbeladen, die für den Immunoassay oder den
auszuführenden
Polynucleotidnachweis spezifisch sind, wie oben beschrieben.
-
Die
einmal in den Kapillaren umgesetzte Probe, wie oben beschrieben,
wird in den Probeneinführkanälen der
Mikrochipanordnung 25 abgelagert. Die Kapillaren bewegen
sich darüber,
so dass sie über den
Probeneinführkanälen positioniert
sind. Die Kapillaren werden dann durch ein Temperaturregelgerät 32 erwärmt, so
dass sich Gas im Innern des geschlossenen Endes der Kapillare expandiert
und die Probe aus der Kapillare heraus drängt, wie oben mit Bezug auf 5 und 6 beschrieben.
Einmal verwendet, können
die Probenabgabesysteme entsorgt werden, und neue Systeme, die Reagenzien
für die nächste Reaktion
von Interesse enthalten, können
in das integrierte Gerät
eingesetzt werden.
-
Sobald
sie am Probeneinführkanal
der Mikrochipanordnung abgelagert ist, wird die Druck/Vakuum-Einheit 50 verwendet,
um einen Druckgradienten im Innern der Probeneinführ- und
-trennkanäle des
Mikrochip zu erzeugen und dadurch die Probe in den Trennkanal zu
injizieren, wie oben mit Bezug auf 2 beschrieben.
Der Spannungsgenerator 52 kann auch verwendet werden, um
einen Spannungsgradienten am Trennkanal anzulegen, um die Aufhäufungstechnik
auszuführen,
wie oben mit Bezug auf 3 beschrieben.
-
Nach
Bildung des Probenpfropfens im Trennkanal wird der Spannungsgenerator 52 verwendet,
um eine Spannung axial entlang dem Trennkanal des Mikrochip anzulegen,
um die Komponenten der Probe zu trennen. Ein Siebmedium ist in den Kanälen des
Mikrochip vorbeladen. Der Puffer von der Einheit 60 wird
in die Trennkanäle
vor einer Bildung des Probenpfropfens injiziert.
-
Wenn
die Proben das Ende des Trennkanals erreichen, wird das optische
Nachweismodul 56 verwendet, um das Vorhandensein der nachweisbaren Einheiten,
die an den Probenkomponenten angebracht sind, in den Trennkanälen nachzuweisen.
Für Polynucleotididentifikationen
werden die Ergebnisse des optischen Nachweises mit Daten verglichen,
die von Gendiagnoseexperimenten erzeugt sind. Diese Daten liegen
in der Form von Intensität-gegen-Zeit-Kurven
vor, die sich beim Bestimmen einer Entsprechungsähnlichkeit elektronisch suchen
lassen.
-
Nach
Ausführung
der Analyse wird Druck von der Hochdruckpatrone 54 verwendet,
um Druck an beiden Enden des Trennkanals anzulegen, um die Kanäle der Mikrochipanordnung
zu reinigen. Die Kanäle
werden dann unter Verwendung einer Rekonditionierungslösung von
der Einheit 62 rekonditioniert. Die Mikrochipanordnung
kann dann in anschließenden
Analysen wiederverwendet werden. Alternativ kann die Mikrochipanordnung
entsorgt werden.
-
Verglichen
mit Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, verwendet
ein Probenpfropfenbildungsgerät
der Erfindung Druckunterschiede, um einen Probenpfropfen zur Abtrennung
und/oder Analyse zu bilden. Vorteile der vorliegenden Erfindung
umfassen das Vermögen,
einen Probenpfropfen, der nichtionische Spezies enthält, zu bilden
und zu trennen, und das Vermögen,
einen Probenpfropfen ohne Anlegung eines elektrischen Feldes zu
bilden, so dass die Oberflächencharakteristiken
von dem und das Medium im Kanal eine Probenpfropfenbildung nicht
sehr beeinflussen. Demgemäß bietet die
vorliegende Erfindung mehrere Vorteile gegen Pfropfenbildungsgeräte und -verfahren,
die im Stand der Technik bekannt sind.
-
Zusätzlich,
werden bei Verwendung in Verbindung mit einem oben beschriebenen
Probenabgabesystem weitere Vorteile verwirklicht. Verglichen mit der
Verwendung von herkömmlichen
Mengenreglern, wie z.B. Spritzen und Pumpen, weist ein thermisch gesteuertes
Probenabgabesystem weniger bewegliche Teile auf, die verschleißen oder
eine umfassende Wartung erfordern mögen. Außerdem, da das Probenabgabesystem
unabhängig
von einem Analyseninstrument sein kann, werden andere Vorteile verwirklicht.
Z.B. können
die Probenabgabekanäle
aus kostengünstigen
Materialien hergestellt sein, wie z.B. Kunststoffkapillarrohrmaterial,
da eine optische Qualität
oder integrierte Elektroden nicht erforderlich sind. Demgemäß ist eine
Einmalverwendung eines Kanals attraktiv, was einen Reinigungsschritt und/oder
Querverunreinigungen beseitigen kann.
-
Zusätzlich,
da die Kanäle
typischerweise bei einer Analysentechnik nicht direkt verwendet
werden, können
die Kanäle
leicht bewegbar sein und einen höheren
Grad an Toleranz zum Positionieren mit einem Probenpfropfenbildungsgerät dieser
Erfindung aufweisen. D.h., da das Nachweissystem eines Analysengeräts typischerweise
stationär
bleibt, muss die optische Ausrichtung einer Flüssigkeitsnachweiskapillare
einmal für
eine optimale Genauigkeit während der
Analyse einer Mehrzahl von Proben durchgeführt werden. Weiter, wenn das
Probenabgabesystem ein chemisches Reagenz enthält und dazu verwendet wird,
um eine Reaktion auszuführen,
können
jegliche teilchenförmigen
Stoffe, die vorhanden sind oder während der Reaktion gebildet
werden, leicht vor einer Einführung
der Reaktionsprodukte zu einem Probenpfropfenbildungsgerät filtriert
werden, wodurch ein Verstopfen und/oder eine ungenaue Analyse verhindert
werden. Diese obigen Merkmale ermöglichen, dass eine einfache
und kostengünstige
Automationsrobotik verwendet wird.
-
Verglichen
mit einer Verwendung von herkömmlichen
Systemen, die auf Kapillarwirkung angewiesen sind, um Chemikalien
abzugeben, zu mischen und/oder umzusetzen, zeigt ein Probenabgabesystem
der Erfindung mehrere Vorteile. Die Oberfläche eines Kanals eines Probenabgabesystems
der Erfindung kann hydrophil oder hydrophob sein, im Gegensatz zu
einer Kapillarwirkungsoberfläche,
die eine hydrophile Oberfläche
erfordert. Auch mit Bezug auf die Oberfläche des Kanals hängt die
Probenlösungszumessungsreproduzierbarkeit
weniger von den Oberflächencharakteristiken
und Probenkonstituenten ab. Zusätzlich
ermöglicht
das Probenabgabesystem der Erfindung eine direkte Steuerung über die
Zumessung von Proben und Reagenzien, und ermöglicht, dass eine Blasenabtrennung
routinemäßig praktiziert
wird. Diese Vorteile werden nicht nur durch das Probenabgabesystem,
das oben beschrieben ist, erzielt, sondern auch mit Bezug auf ein
Probenpfropfenbildungsgerät
der Erfindung, das Druckunterschiede verwendet.
-
Verglichen
mit elektroosmotischem Fluss zum Abgeben, Mischen und/oder Umsetzen
von Chemikalien zeigt ein Probenabgabesystem, das Druck verwendet,
einige derselben Vorteile im Vergleich mit einer Verwendung der
oben erörterten
Kapillarwirkung, d.h. Oberflächencharakteristiken
und Lösungszumessungreproduzierbarkeit.
Außerdem ist
das Probenabgabesystem typischerweise zur Ausführung einer Analyse und/oder
von chemischen Reaktionen in seiner Lösungszusammensetzung unbeschränkt. D.h.
Variablen, wie z.B. pH, Ionenstärke, Pufferzusammensetzung,
chemische Zusatzmittel und Lösungsmittel
sind häufig
unbeschränkt,
abhängig
von der speziellen Anwendung. Diese Variablen sind typischerweise
beschränkt,
damit ein effektiver elektroosmotischer Fluss auftritt. Wieder werden,
wie oben erwähnt,
diese Vorteile nicht nur mit dem oben beschriebenen Probenabgabesystem
verwirklicht, sondern auch mit Bezug auf ein Probenpfropfenbildungsgerät der Erfindung,
das Druckunterschiede verwendet.
-
Deshalb
ermöglicht,
wie oben beschrieben und veranschaulicht, die vorliegende Erfindung
eine Hochgeschwindigkeitsanalyse von biologischen Proben im Mikrobereich
ohne die Kompliziertheit, Zeit, Arbeit und die biologische Gefährdungsexposition herkömmlicher
Techniken. Zusätzliche
Aspekte und Ausführungsformen
der Erfindung sind bei Betrachtung der vorhergehenden Offen barung
ersichtlich. Demgemäß ist der
Bereich der Erfindung nur durch den Umfang der angefügten Ansprüche beschränkt.
-
Die
Erfindung kann in anderen spezifische Formen verwirklicht sein.