DE102014207183A1

DE102014207183A1 - Sequenziervorrichtung zum elektronischen Einzelmolekül-Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls

Info

Publication number: DE102014207183A1
Application number: DE102014207183.6A
Authority: DE
Inventors: Tim Albrecht; Oliver Hayden
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2014-04-15
Filing date: 2014-04-15
Publication date: 2015-10-15

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Sequenziervorrichtung (1) mit mindestens einer Elektrodenanordnung (10) zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls (32), umfassend: zwei einander gegenüberliegende Elektroden (12, 14), wobei die Oberflächen (O) der Elektroden (12, 14) einen Zwischenraum (17) zwischen den beiden Elektroden (12, 14) begrenzen, der einen Eintrittsbereich (20) eines Analyten (30) mit einem Austrittsbereich (22) des Analyten (30) verbindet, wobei die Elektroden (12, 14) zum Bereitstellen eines elektrischen Feldes innerhalb des Zwischenraums (17) ausgelegt sind, und – eine Proteinbindungsstelle (B) des Eintrittsbereichs (20), die dazu ausgelegt ist, ein Protein (28) zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls (32) zu immobilisieren. Eine der Elektroden (12, 14) umfasst dabei die Proteinbindungsstelle (B), und der Zwischenraum (17) ist als Spalt ausstaltet. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Sequenzierverfahren mithilfe der Sequenziervorrichtung (1).

Description

Die Erfindung betrifft eine Sequenziervorrichtung mit mindestens einer Elektrodenanordnung zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls und ein entsprechendes Sequenzierverfahren.
Bei der Sequenzierung von Biopolymeren mittels Nanoporen passiert ein biologisches Makromolekül, beispielsweise eine Nukleinsäure, eine biologische oder künstliche Nanopore. Bei der Sequenzierung können dabei einzelne Basen des Nukleinsäurestrangs durch eine Veränderung der Ionenleitfähigkeit in der Pore (also ein elektrischer Porenwiderstand) beim Passieren der Nukleinsäure durch die Nanopore analysiert werden. Eine Probe der Nukleinsäure wird dabei über ein elektrisches Feld, z.B. mittels Elektrophorese, durch die Nanopore geführt. Beim Passieren der Nanopore von unterschiedlichen Nukleotiden ändert sich der Ionen-Strom. Diese Änderung ist abhängig von dem Nukleotid, welches den Sequenzierkanal passiert, so dass das Nukleotid detektiert und die Sequenz der Nukleinsäure ermittelt werden kann. Alternativ kann ein Tunnelstrom, der beim Passieren des Biopolymers auftritt, in der Nanopore quer zur Transportrichtung des Biopolymers gemessen werden, wobei die Höhe des Tunnelstroms abhängig ist von z.B. dem Nukleotid oder der Aminosäure, welche sich in der Nanopore befindet.
Bisherige Ansätze zur Nanoporen-Sequenzierung verwenden eine vertikale Porenarchitektur relativ zu einer Substratebene, also zu einer Ebene eines Silizium-Wafers. Eid et al. (2009; Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules, SCIENCE Vol. 323 (2) JANUARY 2009, pp. 133–138) von Pacific Bioscience haben einen Einzelmolekül-sensitiven Ablauf etabliert, der markierte Einzelbasen in Nanowells, also in kleinen Vertiefungen, optisch detektieren kann. Mit Ausnahme von optischen Verfahren, die bisher von den Unternehmen Noblegen oder Pacific Bioscience entwickelt werden, konnte bisher noch kein Verfahren elektronisch ausreichend sensitiv und spezifisch Einzelbasen einer Strangsequenz über ein Tunnelstrommeßverfahren oder Redoxverfahren, entweder direkt über dem Nukleinsäurestrang oder indirekt über Einzelbasen des Stranges, detektieren.
Die vertikale Architektur von biologischen oder solid-state Nanopore-Bauteilen, um eine ausreichende sensitive und spezifische Sequenzierung von Nukleinsäuren zu erreichen, ist aufwendig und nicht mit konventionellen Fabrikationsprozessen herzustellen. Hybride Bauteile aus biologischen Poren und CMOS basierter Ausleseelektronik zeigt geringen Durchsatz und keine ausreichende Auflösung von Einzelbasen, um die Sequenz eines Stranges mit ausreichender Statistik ablesen zu können. Die wesentlichen Einflußgrößen sind hierbei (1) die Einfangswahrscheinlichkeit von Einzelbasen in die Nanopore, die beispielsweise bei einem „Sequencing-by-Synthesis“ oder bei Exonuklease-Verfahren detektiert werden müssen und (2) die Auflösung, die es erlaubt, eine einzelne Base innerhalb eine Stranges zu detektieren. Bei einem Ansatz von Oxford Nanopore wird bisher eine Auflösung von nur 3–5 Basen beim Durchfädeln des Stranges durch die Pore erreicht. Solid-State Poren (unter 10 nm Durchmesser) können mit einem CMOS durch aufwendige Prozesse hergestellt werden, wie Transmissionselektronenmikroskopie oder Focused-Ion-Beam, wobei aber nicht die Porendurchmesser und Geometrien von biologischen Poren, wie alpha-Hämolysin, erreicht werden können. Zudem sind diese Prozesse mit einer CMOS Linie nur eingeschränkt kompatibel und hochskalierbar.
Um eine Tunnelstromsequenzierung zu betreiben, werden üblicherweise Nanoporen-Technologien herangezogen. Jedoch konnte aufgrund fehlender Einzelbasenauflösung in bisher keinem Ansatz eine ausreichende Sensitivität und Spezifität erreicht werden, um Basen innerhalb einer DNA-Polymerkette eindeutig zu identifizieren. Bei Kumar et al. (2012) (S. Kumar, C. Tao, M. Chien, B. Hellner, A. Balijepalli, J. W. F. Robertson, Z. Li, J. J. Russo, J. E. Reiner, J. J. Kasianowitz: „PEG-labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis", Scientific Reports 2012, (2) 684: 1–8) konnten bisher eine ausreichende Spezifität in einem „Sequencing-by-Synthesis“-Ansatz erreicht werden, der mit einer Polymerase nahe an einer Biopore vorgenommen wurde, wobei und die anorganischen Pyrophosphate als Reaktionsprodukte markierter Nukleotidtriphosphate („NTPs“) durch Widerstandsmessung identifiziert werden konnten. Nachteil dieses Bioporen-Ansatzes ist jedoch die eingeschränkte Biasspannung, die an eine Lipidmembran angelegt werden kann, ohne den Gigaseal zu verlieren (typischerweise 100 Millivolt beziehungsweise Feldstärken von über zehn hoch sechs Volt pro Meter), der für die hohe Auflösung der Widerstandsmessung benötigt wird. Ungelöst bei diesem Ansatz ist auch nach wie vor die Diskriminierung des Hintergrundes (Diskriminierung von NTPs von den Reaktionsprodukten) und der Einfangsquerschnitt um mit hoher statistischer Sicherheit die Reaktionsprodukte einzufangen.
Neben der Fragestellung des Bauteiles für die Sequenzierung ist für eine kostengünstige Hochdurchsatztechnologie der Verfahrensablauf entscheidend. Ein im Stand der Technik bekanntes Einzelmolekülprodukt von Oxford Nanopore erreicht bei einem Strangsequenzieren eine Auflösung von typischerweise 5 Basen (im besten Fall 3 Basen). Der Einzelstrang wird dabei durch die Pore hindurchgezogen und schrittweise abgelesen. Diese moderate Auflösung erlaubt nur eine unzureichende Sequenziersicherheit für klinische Anwendungen. Pacific Bioscience nutzt als Plattform Nanowellarrays aus in denen über evaneszente Fluoreszenzdetektion „Sequencing-by-Synthesis“ von Einzelpolymerasen beobachtet werden kann. Aufgrund des diffusionslimitierenden Verfahrensablaufs sind auch hier nur unzureichende Sensitivitäten und Spezifitäten für klinische Applikationen zu erreichen.
Allen existierenden Plattformtechnologien zur Einzelmolekülsequenzierung (Pore oder Well) ist eine vertikale Orientierung von Wells und Poren zu eigen, und dass man auf nicht auf einen komplementären Metall-Oxid-Halbleiter („Complementary Metal Oxide Semiconductor“, „CMOS“) kompatible Fabrikationsprozesse zurückgreifen muss, was eine kostengünstige Herstellung des Sequenziergeräts verbietet. Alle Poren oder Well basierten Sequenziersysteme, die hohe Leselängen von über einer Kilobase versprechen, zeigen eine unzureichende statistische Sicherheit, die einzelne Base zu detektieren, die üblicherweise durch die biologische Komponente (Polymerase oder Biopore) hervorgerufen wird.
Eine der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe ist das Verbessern der Spezifität und der Sensitivität eines Sequenziervorganges.
Die Aufgabe wird von der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee, einen spalt- oder schlitzförmigen Zwischenraum zwischen zwei Elektroden als Sequenzierkanal bereitzustellen und mit einer Einzelmolekülsequenzierung zu kombinieren. Die vorliegende Erfindung bringt mehrere Vorteile für ein Sequenziersystem für klinische Anwendungen: (1) eine CMOS kompatible Herstellung eines Sequenziergeräts, (2) eine hohe Integrationsdichte der Sensoren, (3) ein Verfahrensablauf, der hohe Sensitivität und Spezifität ermöglicht, und (4) eine Detektionsmethode für skalierbare Hochdurchsatzsequenzierung. Es wird folglich eine Hochdurchsatzsequenziertechnologie zur Einzelmoleküldetektion bereitgestellt, um ein biologisches Makromolekül mit einer Fehlerrate beim einmaligen Ablesen der Sequenz von unter 1% zu sequenzieren, und um einen Durchsatz von über 1 Gigabasen/Stunde für Nukleinsäuren und Leselängen von zum Beispiel über 10000 Basen für Nukleinsäuren auf der Basis einer skalierbaren Technologie zu erreichen.
Die oben gestellte Aufgabe wird gelöst von der erfindungsgemäßen Sequenziereinrichtung mit mindestens einer Elektrodenanordnung zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls, beispielsweise eines Nukleinsäurestranges. Die mindestens eine Elektrodenanordnung umfasst eine erste Elektrode und eine weitere, der ersten Elektrode gegenüberliegend angeordnete Elektrode, wobei jede Elektrode eine Oberfläche aufweist und die Oberflächen der Elektroden einen Zwischenraum zwischen den beiden Elektroden begrenzen. Der Zwischenraum verbindet einen ersten Bereich der Sequenziervorrichtung als Eintrittsbereich eines Analyten mit einem weiteren Bereich der Sequenziervorrichtung als Austrittsbereich des Analyten, wobei die Elektroden zum Bereitstellen eines elektrischen Feldes innerhalb des Zwischenraums ausgelegt sind. Der Zwischenraum ist dabei als Spalt ausgestaltet. Dabei ist unter einem Spalt auch ein Schlitz, insbesondere ein Nanoschlitz, zu verstehen.
Im Gegensatz zu einer vertikalen Architektur einer Nanopore ermöglicht diese horizontale Anordnung ein elektronisches Erfassen eines Signals des Analyten, sodass eine höhere Spezifität und Sensibilität ermöglicht werden. Weiterhin ist eine serielle und damit kostengünstigere Fertigung eines Sequenziersystems ermöglicht. Insbesondere bei einem sogenannten Nanoschlitz als Zwischenraum, also einem schlitz- oder spaltförmig ausgestalteten Zwischenraum mit einer Höhe von zehn Nanometern oder darunter, wird eine hohe Auflösung erreicht. Die Notwendigkeit einer optischen Messung entfällt, sodass das Verfahren skalierbar ist, das heißt die einzelnen Bauteile können aufeinander abgestimmt werden.
Die Sequenziervorrichtung umfasst weiterhin eine Proteinbindungsstelle an dem Eintrittsbereich, die dazu ausgelegt ist, ein Protein zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls zu immobilisieren, wobei eine der Elektroden die Proteinbindungsstelle umfasst.
Hierdurch ist eine Einzelmoleküldetektion ermöglicht, da nicht das biologische Makromolekül, sondern eine Folge von Analyten, die stellvertretend für das biologische Makromolekül für jeden Makromolekülbaustein jeweils eine sequenzspezifische Markierung tragen, von den Elektroden erfasst werden. In Kombination mit der Verwendung einer wie oben beschriebenen Elektrodenanordnung mit dem beschriebenen Zwischenraum werden Spezifität und Sensibilität weiterhin erhöht und erreichen eine Auflösung von bis zu einem Teilmolekül, also zum Beispiel einem Nukleotid. Gleichzeitig wird die Einfangswahrscheinlichkeit der Analyten in den Zwischenraum deutlich erhöht, da höhere elektrische Feldstärken als bei biologischen Systemen angelegt werden können.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung sind die Oberflächen der Elektroden planar ausgestaltet und/oder parallel zueinander angeordnet und/oder weisen einen Abstand zueinander von zehn Nanometern oder weniger als zehn Nanometern auf. Vorzugsweise sind die Oberflächen parallel zueinander angeordnet und weisen einen Abstand von zehn Nanometern oder weniger als zehn Nanometern auf. Zusätzlich können die Elektroden planar ausgestaltet sein. Die geringe Höhe des daraus entstehenden Zwischenraums ist mit gängigen Auswerteelektroniken und Sensoren, beispielsweise einem CMOS, kompatibel und kann seriell hergestellt werden.
Die Elektrodenanordnung ist gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung dazu ausgelegt, bei einem direkten Kontakt des Analyten mit einer der Elektrodenoberflächen einen Tunnelstrom des durch den Zwischenraum durchtretenden Analyten zu erfassen. Eine Tunnelstrommessung quer zur elektrophoretischen Translozierrichtung des Analyten kann bei hohen Feldstärken von zehn hoch sieben („10E7“) Volt pro Meter durchgeführt werden. Weiterhin werden Mehrfachmessungen eines jeweiligen Analyten ermöglicht, wodurch die Spezifität durch die statistische Sicherheit einer Mehrfachmessung erhöht wird. Mehrfachmessungen sind dabei unabhängig von einer Orientierung des Analyten im Zwischenraum möglich. Eine elektronische Sequenzierung auf der Basis von Tunnelstromdetektion hat gegenüber allen Sequenziermethoden den höchsten Durchsatz bei gleichzeitig langen Leselängen („Read-lengths“) von über zehn Kilobasen bei Nukleinsäuren. Alternativ oder zusätzlich kann das elektronische Erfassen eines Analyten ein Erfassen eines Redox-Recyclings umfassen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung ermöglichen zwei von der Elektrodenanordnung unabhängige Elektrophoreseelektroden ein Anlegen eines elektrophoretischen Feldes. Im Gegensatz zur reinen Diffusion oder einem mechanischen Leiten des Analyten durch den Zwischenraum werden der oder die Analyten sehr effizient und mit einer sehr hohen Einfangswahrscheinlichkeit in den Zwischenraum geleitet.
Die Elektrodenanordnung kann gemäß einer ebenfalls sehr vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung eine Opferschicht umfassen, die in dem Zwischenraum zwischen den Elektroden angeordnet ist. Diese schützt die Elektroden und kann kurz vor dem eigentlichen Sequenzieren entfernt werden. Damit kann so ein Wasserstrom durch den Zwischenraum ermöglicht werden.
Ein zusätzlicher Schutz der Elektroden vor einem Kurzschluss und vor einem weniger zielgerichtetem Binden des Proteins an die Elektrodenanordnung kann gemäß weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung erreicht werden, wenn die Elektrodenanordnung zumindest teilweise eine Passivierungsschicht auf zumindest einem eine der Elektroden umfassenden Bauteil umfasst.
Ein noch effizienteres Erhöhen der Einfangswahrscheinlichkeit, also der Wahrscheinlichkeit, mit der ein Analyt in den Zwischenraum geleitet wird, kann gemäß einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung erreicht werden, wenn die Oberfläche der weiteren Elektrode eine größere Fläche aufweist als die Oberfläche der ersten Elektrode, sodass ein Teilbereich der Oberfläche der weiteren Elektrode die erste Elektrode überlappt. In einer vorteilhaften Weiterbildung erhöht sich die Einfangswahrscheinlichkeit durch ein Erhöhen einer Einzugskraft zusätzlich, wenn die Proteinbindungsstelle ausschließlich an der weiteren Elektrode, die vorzugsweise eine positive Elektrode umfasst, angeordnet ist.
Die Sequenziervorrichtung kann in einer weiteren Ausführungsform mehrere Elektrodenanordnungen umfassen, deren Zwischenräume so angeordnet sind, dass ein zwischen den jeweiligen Eintrittsbereichen zentral angeordneter Austrittsbereich den Austrittsbereich einer jeden Elektrodenanordnung bildet. Dadurch kann bei einer Einsparung von Bauraum eine Vielzahl von biologischen Makromolekülen gleichzeitig sequenziert werden.
Die Sequenziervorrichtung kann zusätzlich oder alternativ mehrere Elektrodenanordnungen umfassen, deren Zwischenräume so angeordnet sind, dass die jeweiligen Eintrittsbereiche nebeneinander angeordnet sind und durch die jeweiligen Zwischenräume mit einem einzigen Austrittsbereich verbunden sind. Hierdurch werden die oben genannten Vorteile einer Sequenziervorrichtung mit mehreren Elektrodenanordnungen ebenfalls erreicht.
Die oben gestellte Aufgabe wird ebenfalls gelöst von einem Verfahren zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls mithilfe einer Sequenziervorrichtung gemäß einer der oben beschriebenen Ausführungsformen. Die sich ergebenden Vorteile entsprechen denjenigen, die bereits oben zu den entsprechenden Vorrichtungsmerkmalen genannt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:

– Immobilisieren eines Proteins zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls an der Proteinbindungsstelle,
– Binden des biologischen Makromoleküls an das Protein,
– sequentielles Bereitstellen mehrerer Analyten durch Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls (32) durch das Protein,
– Translozieren der Analyten durch den Zwischenraum vom Eintrittsbereich in den Austrittsbereich, und
– elektronisches Erfassen der translozierten Analyten durch Bereitstellen eines elektrischen Feldes innerhalb des Zwischenraums durch die Elektroden der Elektrodenanordnung und dadurch Sequenzieren des biologischen Makromoleküls.

Gemäß einer besonders geeigneten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt weiterhin ein Anlegen eines elektrophoretischen Feldes durch zwei von der Elektrodenanordnung unabhängige Elektrophoreseelektroden.
Bei Vorliegen einer Opferschicht in dem Zwischenraum kann gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Entfernen einer zwischen den beiden Elektroden der Elektrodenanordnungen angeordneten Opferschicht durch beispielsweise Ätzen erfolgen.
Ein Bereitstellen der mehreren Analyten durch ein Replizieren des biologischen Makromoleküls mithilfe eines oder mehrerer biologischer Molekülbausteine, der oder die zum Synthetisieren des Replikats erforderlich sind, zum Beispiel von Nukleotiden, oder durch ein Spalten des biologischen Makromoleküls, gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt, erhöht zusätzlich eine Einfangswahrscheinlichkeit und reduziert zusätzlich ein Hintergrundrauschen. Der jeweilige an einen biologischen Molekülbaustein gebundene Analyt wird dabei während des Vorgangs des Replizierens abgespalten und eine elektrische Ladung des Analyten wird umgekehrt. Der Analyt umfasst dabei vorzugsweise einen redoxaktiven Marker.
Durch eine solche selektive Erfassung wird eine statistische Sicherheit verbessert, eine Stochastikproblematik also nahezu vollständig umgangen. Zeitgleich wird ein Hintergrundrauschen beim Erfassen des Messsignals reduziert oder nahezu vollständig verhindert.
Das elektronische Erfassen umfasst gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Erfassen eines Tunnelstroms und/oder ein Redox-Recycling, vorzugsweise einen Tunnelstrom, des Analyten.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Die gezeigten Beispiele stellen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar. Funktionsgleiche Elemente weisen in den Figuren dieselben Bezugszeichen auf. Es zeigt:
1 eine schematische Darstellung zu einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung mit einer Elektrodenanordnung,
2 eine schematische Darstellung zu einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sequenzierverfahrens mithilfe einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung mit einer Elektrodenanordnung,
3 eine schematische Darstellung zu einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Sequenzierverfahrens mithilfe einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung mit einer Elektrodenanordnung,
4, 5, 6 jeweils eine schematische Darstellung zu einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung mit mehreren Elektrodenanordnungen in einer Seitenansicht (4) und jeweils in einer Aufsicht (5 und 6).
In dem in der 1 dargestellten Beispiel ist das der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung zugrunde liegende Prinzip veranschaulicht:
Die 1 zeigt eine Elektrodenanordnung 10 zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls, z.B. einer Nukleinsäure oder eines beliebigen Proteins, mit einer ersten Elektrode 12 und einer weiteren Elektrode 14, die miteinander über eine Spannungsquelle 16 (in der 1 nicht gezeigt) verbunden sind. Im vorliegenden Beispiel ist die Elektrodenanordnung 10 dabei so in beispielsweise einem Sequenziergerät als Sequenziervorrichtung 1 (in der 1 nicht gezeigt) angeordnet, dass die erste Elektrode 12 über der weiteren Elektrode 14 angeordnet ist. Die erste Elektrode 12 und/oder die weitere Elektrode 14 können dabei teilweise, vorzugsweise vollständig, aus einem Edelmetall, vorzugsweise Gold, Platin oder Palladium, bestehen. Im Beispiel der 1 weist die erste Elektrode 12 dabei eine erste Kantenlänge b von beispielsweise 100 Nanometern auf. Diese kann jedoch je von einer Enzymgeschwindigkeit eines Proteins 28 zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls 30 (im Folgenden verkürzt als „Protein 28“ bezeichnet), z.B. einer Polymerasegeschwindigkeit oder Verdauungsrate einer Exonuklease (vorzugsweise zehn Nukleotide pro Sekunde), einer Prozessivität des Proteins 28 (zum Beispiel zehn Kilobasen oder mehr, beispielsweise 30 Kilobasen), und einer Translokationsgeschwindigkeit, also derjenigen Geschwindigkeit, in der ein Analyt 30 durch den Zwischenraum 17 geleitet wird, angepasst werden.
Jede der Elektroden 12, 14 weist dabei vorzugsweise eine planare Oberfläche O auf, wobei die Ebenen, in der die planaren Oberflächen O liegen, vorzugsweise parallel zueinander liegen. Eine „planare Oberfläche O“ schließt dabei auch eine Oberfläche ein, die fabrikationsbedingte Unebenheiten umfasst, also beispielsweise punktuelle oder flächige Abweichungen von beispielsweise 0,1 Nanometern bis beispielsweise 10 Nanometern. Die Oberfläche O der weiteren Elektrode 14 kann eine größere Fläche aufweisen als die erste Elektrode 12, sodass nur ein Teilbereich der Oberfläche O der weiteren Elektrode 14 der ersten Elektrode 12 gegenüberliegend angeordnet ist, sodass der Teilbereich die erste Elektrode 12 überlappt. Vorzugsweise weist die weitere Elektrode 14 dabei eine Überlappung von beispielsweise 30 Nanometern bei beispielsweise einem 90 Nanometer bis 130 Nanometer großen Elektrodenanordnungskern („130/90 Node“) auf, also dem Bereich, an dem beide Elektroden einander gegenüberliegen.
Die beiden Oberflächen O sind einander zugewandt und begrenzen einen Zwischenraum 17, der sich dadurch auszeichnet, dass er als Spalt, also als Schlitz, ausgebildet ist. Die Oberflächen O der Elektroden 12, 14 bilden somit jeweils eine Innenwandung des Spalts oder Schlitzes. Der Zwischenraum 17 weist dabei vorzugsweise eine Höhe von zehn Nanometern oder weniger als zehn Nanometern, beispielsweise zwei Nanometern, auf, die dem Abstand der beiden Elektrodenoberflächen O entspricht. Idealerweise weist der Zwischenraum 17 Maße von zehn Nanometern Breite (als eine zu einer Länge senkrechten Erstreckung), zehn Nanometern Höhe (als Abstand zwischen den Elektroden 12, 14) und 100 Nanometern Länge (als Erstreckung von einem cis-Bereich-seitigen Ende zu einem trans-Bereich-seitigen Ende) auf und/oder hat eine quaderförmige Ausgestaltung.
Die Innenwandungen der Oberflächen O können vorzugsweise mit einer Opferschicht beschichtet sein, vorzugsweise mit einer Opferschicht aus einem Metalloxid, wie z.B. Germaniumoxid. Idealerweise ist der Zwischenraum 17 vollständig mit der Opferschicht 19 ausgefüllt, die direkt vor einem erfindungsgemäßen Sequenziervorgang durch z.B. Ätzen entfernt werden kann (siehe unten, zu den 2 und 3). Der Zwischenraum 17 verbindet einen Eintrittsbereich 20 der Sequenziervorrichtung 1, der im Folgenden als „cis-Bereich“ 20 bezeichnet wird, mit einem Austrittsbereich 22, der Sequenziervorrichtung 1, der im Folgenden als „trans-Bereich“ 20 bezeichnet wird. Der cis-Bereich 20 ist dabei derjenige Bereich, in dem ein Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls erfolgt, z.B. bei einem „Sequencing-by-synthesis“ Ansatz, also einem Sequenzierverfahren, bei dem das Sequenzieren durch eine Synthese des biologischen Makromoleküls, z.B. durch eine DNA-Replikation, ermöglicht wird. Beide Bereiche 20, 22 können vorzugsweise durch einen anisotropischen Prozess geätzt werden
Mindestens eine der beiden Elektroden, vorzugsweise eine in der Sequenziervorrichtung 1 unterhalb der ersten Elektrode 12 angeordneten Elektrode 14, weist eine Prozeinbindungsstelle B auf, die beispielsweise an die Elektrodenoberfläche kovalent gebundene Thiolgruppen T umfasst. Die Proteinbindungsstelle B ist dazu ausgelegt, ein Protein 28 zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls, beispielsweise eine DNA-Polymerase, DNA-Exonuklease oder eine Proteinase, zu binden. Die Proteinbindungsstelle ist auf der dem cis-Bereich 20 zugewandten Seite der Elektrode 14 angeordnet. Geeignete Proteine 28 sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt, ebenso ein Verfahren zum Binden des Proteins 28 an eine Oberfläche, wobei die im Stand der Technik bekannten Techniken auf das Anbringen an eine Elektrodenoberfläche übertragen werden kann.
Jede Elektrode 12, 14 ist vorzugsweise an einem die jeweilige Elektrode 12, 14 tragendenden Bauteil 18, einem sogenannten „Foundry“, angeordnet. Das die weitere Elektrode 14 tragendende Bauteil 18 umfasst im Beispiel der 1 beispielsweise einen planaren Silizium-Wafer und beispielsweise zusätzlich eine Ausleseelektronik, beispielsweise ein CMOS, zum Auslesen der von der weiteren Elektrode 14 erfassten Signale. Die erste Elektrode kann beispielsweise eine Schutzschicht 26, die die erste Elektrode 12 während z.B. einem Ätzen der Opferschicht 19 schützt, umgeben sein und in einem die erste Elektrode 12 tragenden Bauteil 18 aus beispielsweise Aluminiumoxid und/oder Siliziumoxid angeordnet sein. Die Schutzschicht 26 ist vorzugsweise eine Schicht, an der ein Binden des Proteins 28 reduziert oder sogar nahezu vollständig verhindert wird.
Zusätzlich kann eine Passivierungsschicht 24, beispielsweise aus einer selbstorganisierenden Monoschicht („Self-assembled monolayer“, „SAM“) aus z.B. Phosphonaten, das die erste Elektrode 12 tragenden Bauteil 18 zumindest teilweise umgeben und/oder zumindest teilweise auf dem die weitere Elektrode tragenden Bauteil 18 angebracht sein.
Gängige Herstellungsverfahren zum Anordnen von Elektroden in einem die Elektroden 12, 14 tragenden Bauteil 18 sowie dem Anbringen einer Passivierungsschicht 24 sind aus dem Stand der Technik bekannt, beispielsweise aus Lemay et al. (2013) (S. G. Lemay, S. Kang, K. Mathwig, P. S. Singh: Single-Molecule Electrochemistry: Present Status and Outlook, Accounts of Chemical Research, 2013, 46: 2, pp. 369–377).
Die 2 und die 3 zeigen jeweils ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls 32, beispielsweise einer Nukleinsäure (z.B. ein Oligonukleotid, eine doppelsträngige oder einzelsträngige Ribonukleinsäure („RNA“) oder Desoxyribonukleinsäure („DNA“)). Vorzugsweise ist dabei ein Verfahren zum Sequenzieren einer DNA als biologisches Makromolekül 32 gezeigt. Dazu kann beispielsweise eine erfindungsgemäße Sequenziervorrichtung 1, mit einer wie bereits zu der 1 beschriebenen Elektrodenanordnung 10, verwendet werden.
Die in der 2 gezeigte Elektrodenanordnung 10 umfasst dabei eine erste Elektrode 12, die Kantenlängen a, b von beispielsweise 100 Nanometern aufweist. Die weitere Elektrode 14 weist zumindest in einer lateralen Ausdehnung eine größere Kantenlänge auf, sodass die weitere Elektrode 14 in beispielsweise zwei Teilbereichen die erste Elektrode 12 überlappt, also zwei Teilbereiche aufweist, die die erste Elektrode 12 überragen.
Liegt in dem Zwischenraum 17 eine Opferschicht 19 vor, vorzugsweise eine Opferschicht aus Germaniumoxid, kann zunächst ein Entfernen dieser Opferschicht 19 durch zum Beispiel ein Ätzen mit beispielsweise Wasserstoffperoxid, Wasser oder einem starken Ätzmittel erfolgen. Geeignete Ätzverfahren sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Sequenzieren des biologischen Makromoleküls 32, beispielsweise eines einzel- oder doppelsträngigen DNA-Stranges von zum Beispiel unter 100 Kilobasen, kann das Protein 28 zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls, beispielsweise eine DNA-Polymerase, eine Proteinase oder ein ribosomaler Komplex, an die Proteinbindungsstelle B einer beispielhaften Platin- oder Palladiumelektrode 14 gebunden und damit immobilisiert werden. Im vorliegenden Beispiel kann exemplarisch eine T7-DNA-Polymerase von circa 100 Kilodalton mit einer Polymerisationsrate von 300 Nukleotiden pro Sekunde und einer Prozessivität von zwei Kilobasen verwendet werden. Weitere Alternativen sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt. Über eine Poisson-Statisik kann beispielsweise ein Beladen von einem Drittel oder zwei Drittel der in der Sequenziervorrichtung 1 vorhandenen Elektrodenanordnungen 10 mit dem Protein 28 erfolgen. Dadurch wird ermöglicht, dass an jede der Elektrodenanordnungen 10 einer Sequenziervorrichtung 1 nur ein Protein 28 gebunden wird.
Bei Zugeben des zu sequenzierenden biologischen Makromoleküls 32 (Verfahrensschritt S1) wird dieses im cis-Bereich 22 mit dem Protein 28 in Kontakt gebracht und bindet an dieses. Im vorliegenden Beispiel beginnt z.B. eine Replikation der beispielhaften DNA, sobald biologische Teilmoleküle 34 als Bausteine für ein biologisches Makromolekül, die zum Synthetisieren des Replikats notwendig sind, hier im Beispiel redoxmarkierte Desoxyribonukleosidtriphosphate („dNTPS“), und gegebenenfalls entsprechende Oligonuleotide („Primer“) in einem geeigneten Puffer (beispielsweise 40 Millimolar Tris/HCl, pH 7,5, 10 Millimolar Magnesiumchlorid (MgCl₂, 1 Millimolar DDT) zugegeben werden. In der 2 sind beispielhaft die vier verschiedenen redoxmarkierten dNTPs Desoxyadenosintriphosphat („dATP“), Desoxycytidintriphosphat („dCTP“), Desoxyguanosintriphosphat („dGTP“) und Desoxythymidintriphosphat („dTTP“) mit jeweils unterschiedlichen Schraffuren gezeigt. Um einen elektrophoretischen Transport von überschüssigen, nichtgebundenen biologischen Makromolekülen 32 zu vermeiden, können diese in einem Waschschritt mit einem dem Fachmann für diesen Zweck geläufigen Waschpuffer entfernt werden.
Die biologischen Teilmoleküle 34 sind im Falle des beispielhaften „Sequencing-by-Synthesis“-Verfahren an einen für das jeweilige Teilmolekül 34 spezifischen Redoxmarker gebunden, der bei einem Einbau in ein neusynthetisiertes biologisches Makromolekül abgespalten wird und durch das Abspalten zum Beispiel einer durch ein Komplexieren einer alpha- und einer beta-ständigen Phosphatgruppe von anorganischem Phosphat (PPi) eine Ladungsumkehr erfährt. Der abgespaltene Marker wird hier als „Analyt“ 30 bezeichnet. Ein Nettoladungsunterschied zwischen einem Reaktionsprodukt, zum Beispiel anorganischem Pyrophosphat, und den beispielhaften Nukleotidtriphosphaten durch geladene Markierungen kann so erzeugt werden. Der Nettoladungsunterschied erlaubt, selbst die beispielhaft genannten markierten anorganischen Pyrophosphate und überschüssige Nukleotidtriphosphate zu diskriminieren (siehe auch G. Bashford, D. Lamb, D. Grone, B. Eckles, K. Kornelsen, L. Middendorf, J. Williams, „Automated bead-trapping apparatus and control system for single-molecule DNA sequencing", Optics Express 2008, 16 (5): 3445–3455).
Im Beispiel einer DNA-Replikation können die beispielhaften dNTPS beispielsweise sogenannte „charge switching“-Nukleotide, also Nukleotide, die mit einem genannten Redoxmarker markiert sind, verwendet werden, wie sie beispielsweise in der US 6,869,764 B2 beschrieben sind, oder von Bashford et al. (2008). Die genannten Referenzen gehen ebenfalls auf geeignete Konzentrationen von Kofaktoren in der Lösung ein, wie z.B. Magnesium, beispielsweise eine Magnesiumkonzentration von zwei Millimolar.
Alternativ zu einem Replizieren kann ein Spalten oder Abspalten des biologischen Makromoleküls 32 erfolgen. Das Protein 28 umfasst dann beispielsweise eine DNA-Exonuklease, die das biologische Makromolekül 32 in einzelne dNTPs spaltet. In diesem Fall kann das biologische Makromolekül 32 ein Replikat, z.B. ein Produkt einer Polymerasekettenreaktion umfassen, das redoxmarkierte Teilmoleküle 34 umfasst. In diesem Fall bedarf es lediglich einer Zugabe von Kofaktoren für die Exonuklease. Bei Abspalten der beispielhaften Teilmoleküle 34 wird der Analyt 30 freigegeben und erfährt eine Ladungsumkehr.
Zum kontinuierlichen Sequenzieren einer Probe kann das biologische Makromolekül 32 nach erfolgtem Spalten oder Replizieren von dem Protein 28 gelöst und ein weiteres biologisches Makromolekül 32 an das Protein 28 gebunden werden, es kann folglich eine Regenerieren des biologischen Makromoleküls 32 erfolgen. Hierbei müssen keine neuen Farbstoffe vor einem etwaigen Ausbleichen erneuert werden, da es sich nicht um ein optisches Nachweisverfahren handelt. Der Assay ist wieder verwendbar.
Der Analyt 30 wird nach der Ladungsumkehr mittels eines elektrophoretischen Feldes durch zwei Elektrophoreseelektroden 36, 38 (in der 2 nicht gezeigt) in die Bewegungsrichtung P durch den Zwischenraum 17, der einen Abstand d von zum Beispiel 10 Nanometern aufweist, transloziert, das heißt durch den Zwischenraum 17 in den trans-Bereich 22 geführt (S2). Die in der 2 dargestellte Bewegungsrichtung P verdeutlicht einen mehrfachen Kontakt mit jeweils einer der Elektroden 12, 14, wobei ein Redox-Recycling des Analyten 30, vorzugsweise jedoch eine Tunnelstrommessung des Analyten 30, erfolgen kann.
Alternativ oder zusätzlich ist ein Erfassen eines Redox-Recyclings möglich, beispielsweise in einem zehn Nanometer unter weniger als zehn Nanometer hohen Zwischenraum 17 (wobei die Höhe den Abstand der Elektroden 12, 14 bemisst), was beispielsweise ein integriertes Signal im Picoamperebereich ergeben würde.
Ein Gleichgewicht zwischen der beispielhaften Polymerasegeschwindigkeit, einer Bandbreite des Verstärkers und/oder der Translokationsgeschwindigkeit kann beispielsweise bei einer beispielhaften Polymerasegeschwindigkeit von einem bis 100 Nukleotiden pro Sekunde (regulierbar durch die Art und Kinetik des Enzyms), vorzugsweise einem Nukloetid pro 10 Millisekunden, einer Bandbreite von etwa 100 Kilohertz und einer Translokationsgeschwindigkeit von unter zehn Millisekunden, die über eine Feldstärke eingestellt werden kann, erreicht werden. Ein beispielhafter geeigneter Sensor ist in der WO 2013/100949A1 beschrieben. Einen Überblick über elektronische Detektionsverfahren ist bei Zwolak (2008) gegeben (M. Zwolak: „Colloquim: Physical Approaches to DNA Sequencing and Detection", Reviews of Modern Physics 30: 141–165; insbesondere Seiten 155–161).
Die 3 verdeutlicht noch einmal den Vorgang der Ladungsumkehr und der Translokation zum Beispiel des bereits zur 2 beschriebenen Sequenzierverfahrens. Die beispielhaften dNTPS als Teilmoleküle 34 und das biologische Makromolekül 32 liegen im cis-Bereich 20 beispielsweise mit einer negativen Ladung („–“) vor.
Der Analyt 30 wird nach der Ladungsumkehr von dem cis-Bereich 20 über den Zwischenraum 17 in den trans-Bereich 22 geleitet.
Dies erfolgt durch ein Bereitstellen eines elektrischen Felds durch den Zwischenraum 17 durch die von den Elektroden 12, 14 unabhängigen Elektrophoreseelektroden 36, 38 zum Aufbau einer elektrophoretischen Spannung, von denen eine im cis-Bereich 20 und eine im trans-Bereich 22 angeordnet ist, beispielsweise in einem Bereich von zehn hoch fünf bis zehn hoch neun Volt pro Meter (10⁵ V/m–10⁹ V/m), vorzugsweise von zehn hoch sieben Volt pro Meter (10⁷ V/m) bei einer Länge des Zwischenraums 17 von 100 Nanometern, oder von über zehn hoch sieben Volt pro Meter (10⁷ V/m). Der Einzug wird verstärkt, wenn das Protein 28 an der beispielhaft überlappenden Elektrode 14 immobilisiert ist.
Der nach der Ladungsumkehr vorzugsweise positiv geladene Analyt 30, in der 3 durch ein „+“ gekennzeichnet, wird also mittels des elektrophoretischen Feldes in die Bewegungsrichtung P durch den Zwischenraum 17 transloziert.
Beispielhaft kann eine elektrophoretische Kraft über zwei Elektrophoreseelektroden 36, 38 aus Silber oder Silberchlorid angelegt werden. Eine kapazitive Ladung und eine Drift für eine Transimpedanzverstärkung werden dabei vorzugsweise minimal gewählt, beispielsweise mit einem Stromrauschen von ungefähr 10 Femtoampere pro Wurzel Hertz (10 fA/√Hz), um eine Stromstärke von einem Picoampere bei einer Bandbreite von einem Kilohertz zu detektieren.
Als Verstärker kann ein dem Fachmann für diese Zwecke gängiger Verstärker verwendet werden. Beispielhaft kann ein CMOS-Verstärker mit einem Stromrauschen von 25 Femtoampere pro Wurzel Hertz (25 fA/√Hz) oder 3 Femtoampere pro Wurzel Hertz (3 fA/√Hz) verwendet werden. Dies ermöglicht Mehrfachmessungen eines Analyten 30 mit einer ausreichend geringen Rauschleistung, sodass eine besonders gute Diskriminierung einzelner Analyten 30 – und damit einzelner Teilmoleküle 34 – ermöglicht wird.
Ein anschließendes Auswerten der erfassten Daten, zum Beispiel kinetischer Daten oder erfassten Signalstärken eines Tunnelstroms kann durch eine dem Fachmann geläufige Ausleseelektronik (in den 1–6 nicht gezeigt) durchgeführt werden.
Aufgrund der – in diesem Beispiel – negativen Gesamtladung des biologischen Makromoleküls 32 und den Teilmolekülen 34 entsteht, entsteht an der weiteren Elektrode 14, die vorzugsweise eine positive Elektrode ist, eine repulsive Kraft (S3), die ein Eintreten des biologischen Makromoleküls 32 und den Teilmolekülen 34 in den Zwischenraum 17 reduziert oder nahezu vollständig verhindert. Freie Teilmoleküle 34 werden folglich „abgefiltert“, wodurch ein Hintergrundrauschen innerhalb des Zwischenraumes 17 vermindert wird.
Bei einer Tunnelstrommessung in einem beispielhaften zwei Nanometer hohen Zwischenraum 17 mit zum Beispiel positiv geladenen Analyten 30 kann eine hohe Grenzfrequenz erreicht werden, wodurch Mehrfachmessungen eines jeweiligen Analyten 30 bei Kontakt mit einer der Elektroden 12, 14 unabhängig von der Orientierung des jeweiligen Analyten ermöglicht werden.
Eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Sequenziervorrichtung 1 umfasst mehrere Elektrodenanordnungen 10. Die 4 zeigt hierzu ein Ausführungsbeispiel mit zwei Elektrodenanordnungen 10 in einer Seitenansicht. Ein Bauteil 18 kann dabei beispielsweise an gegenüberliegenden Enden zwei erste Elektroden 12 umfassen, sodass sich die Bauteile 18 mit der jeweils weiteren Elektrode 14 gegenüberliegen. Dadurch entsteht ein zentral angeordneter trans-Bereich 22, den sich beide Elektrodenanordnungen 10 teilen, während jede Elektrodenanordnung einen eigenen cis-Bereich 20 aufweist.
Die 5 zeigt eine Aufsicht mehrerer Elektrodenanordnungen 10, wobei in der 5 der Übersicht halber nur die Bereiche 20 und 22 sowie die Zwischenräume 17 schematisiert sind. Ebenso wie in der 4 ist ein gemeinsamer trans-Bereich 22 durch eine entsprechende Anordnung der Bauteile zentral ausgelegt, hier im Beispiel mit vier Zwischenräumen 17 und folglich vier Elektrodenanordnungen.
Die 6 zeigt eine „Reihenschaltung“ von Elektrodenanordnungen 10, wobei die beispielhaften acht Zwischenräume 17 aufgrund der Anordnung der jeweiligen Bauteile so nebeneinander angeordnet sind, dass die jeweiligen Eintrittsbereiche 20 nebeneinander angeordnet sind und durch die jeweiligen Zwischenräume 17 mit einem einzigen trans-Bereich 22 verbunden sind.
Die obigen Ausführungsbeispiele veranschaulichen die erfindungsgemäße Idee, einen spalt- oder schlitzförmigen Zwischenraum zwischen zwei Elektroden als Sequenzierkanal bereitzustellen und dabei eine Einzelmolekülsequenzierung vorzunehmen.
Es wird eine Hochdurchsatzsequenziertechnologie zur Einzelmoleküldetektion (z.B. auf Basis von Poren) um ein biologisches Makromolekül zu sequenzieren mit einer Fehlerrate beim einmaligen Ablesen der Sequenz von unter 1%, einem Durchsatz von über 1 Gigabasen/Stunde für Nukleinsäuren und Leselängen von zum Beispiel über 10000 Basen für Nukleinsäuren auf der Basis einer skalierbaren Technologie. Die vorliegende Erfindung löst mehrere Probleme eines Sequenziersystems für klinische Anwendungen: (1) CMOS kompatible Herstellung eines Sequencers, (2) die Integrationsdichte der Sensoren, (3) ein Verfahrensablauf; der hohe Sensitivität und Spezifität ermöglicht, und (4) eine Detektionsmethode für skalierbare Hochdurchsatzsequenzierung.
Die 1, 2 und 3 zeigen schematisch einen CMOS kompatiblen Einzelmolekülsequenzierer als Sequenziervorrichtung 1. Gegenüber publizierten und kommerzialisierten Verfahrensabläufen mit biologischen und solid state Nanoporen (Nanowells von Pacific Bioscience; Strangsequenzierung von Oxford Nanopore) ist der Ansatz skalierbar und näher an einem klinischem Verfahrensablauf, aufgrund der Bauteilgeometrie und -eigenschaften, die eine deterministische Sequenzierung ermöglicht:

(1) nicht-optische Messmethode durch z.B. Erfassen eines Tunnelstroms, die es erlaubt, skalierbare Sensorarrays aufzubauen, die unabhängig voneinander Events messen können (im Vergleich zu diskreten Arbeitsschritte bei Ion Torrent; keine aufwendigen Laser und Dektektoren wie bei Pac Bio;
(2) einen zum Beispiel durch Dünnfilmprozesse herstellbaren Nanoschlitz als Zwischenraum 17 mit Tunnelelektroden 12, 14 (vorzugsweise < 10 Nanometer Höhe, < 300 Nanometer Breite und < 1 Mikrometer Länge), der eine CMOS kompatible und hochskalierbare Fertigung erlaubt gegenüber Nanoporen mit vertikaler Architektur (< 10 Nanometer) und serieller Fertigung (Alignment der Elektroden zur Nanopore stellt eine zusätzliche Herausforderung dar, die durch den Schlitz elegant gelöst werden kann). Der Zwischenraum 17, z.B. als Schlitz ausgestaltet, kann beispielsweise durch eine Opferschicht hergestellt werden, die zwischen den Tunnelelektroden 12, 14 liegt und < 10 Nanometer dick ist. Metal Overlay Precision der konventionellen CMOS Prozesse erlaubt ein Alignment der Elektroden 12, 14 mit einer Präzision von unter einem Drittel des CMOS Node; typisch < 10 Nanometer für einen 130 Nanometer Node);
(3) die beispielhafte Tunnelstrommessung hat hohe Grenzfrequenzen (Bauteil-limitiert) und erlaubt dadurch in Kombination mit der Transportstrecke und der Translokationsgeschwindigkeit eine mehrfache Messung des beispielhaften Tunnelstromes eines Analyten 30 unabhängig von der Analyt-Orientierung zwischen den Elektroden 12, 14. Die entsprechende Beschaltung mit Stromverstärkung und Digitalisierung des Tunnelstroms erfolgt bevorzugt jeweils für ein beispielhaftes Nanoschlitz-Bauteil 18 und befindet sich in räumlicher Nähe zum beispielhaften Nanoschlitz (zB unter den Wells für den beispielhaften Nanoschlitz);
(4) aufgrund des Solid-State Ansatzes erlaubt die Bauteilgeometrie durch den beispielhaften Schlitz das Anlegen von hohen Feldstärken (über zehn hoch sieben (10E7) Volt pro Meter (V/m), wo Lipidschichten mit Bionanoporen zu wenig Isolierwiderstand zeigen (Grenzfeldstärken von unter zehn hoch sechs (10E6) Volt pro Meter und damit eine höhere Einfangwahrscheinlichkeit von Analyten 30 als Reaktionsprodukt am beispielhaften Schlitzeingang gewährleistet werden können.

Der Verfahrensablauf auf der Basis von beispielsweise „Sequencing-by-Synthesis“ erlaubt eine selektive Erfassung von Analyten 30 als Reaktionsprodukt unabhängig vom Hintergrund und damit eine basenspezifische Sequenzierung auf Einzelmolekülebene:

(1) ein Protein 28, beispielsweise eine DNA-Polymerase, wird durch selektive Bindung unmittelbar am beispielhaften Schlitzeingang kovalent gebunden (beispielsweise durch eine Thiolbindung an Edelmetallen wie zum Beispiel Gold, Platin oder Palladium). Um nur jeweils ein Protein 28 am beispielhaften Schlitzeingang zu fixieren, kann zum Beispiel unter Annahme einer Poisson-Statistik eine Beladung der beispielhaften Schlitzseite vorgenommen werden, vorzugsweise werden nur zwei Drittel der Bauteile 18 und/oder der Elektroden 12, 14 mit einem Protein 28 zum Replizieren oder Spalten beladen. Diese Beladung wird durch die beispielhafte Polymerase-Konzentration und die Beladungszeit gesteuert.
(2) Die negative Gesamtladung von beispielsweise gamma-Triposphat markierten NTPs sowie beispielsweise negativ geladene DNA-Polymere als biologische Makromoleküle 32 können nicht in den beispielhaften Schlitz gezogen werden aufgrund von positivem Pol an der beispielhaften Schlitzseite mit der beispielhaften DNA-Polymerase). Die Marker sind vorzugsweise redoxaktiv und basenspezifisch (beispielsweise vier Marker für A/T/G/C);
(3) Unter beispielsweise konventionellen DNA Polymerasebedingungen von zum Beispiel 2 mM Mg2+ und pH 7.2 erfolgt eine Ladungsumkehr beim beispielhaften markierten Pyrophosphat. Dieses Reaktionsprodukt wird in den beispielhaften Schlitz gezogen und transloziert. Während der Translokation erfolgt die Tunnelstrommessung;
(4) Translozierte Analyten 30, zum Beispiel Pyrophosphate, werden auf der beispielhaften Schlitzgegenseite durch repulsive Kräfte am beispielhaften Schlitzeingang von einem Rücktransport abgehalten.

Gegenüber allen Systemen kann der Verfahrensablauf derart gestaltet werden, dass eine beispielhafte DNA Polymerbeladung der beispielhaften Polymerasen mit beispielsweise Primern am beispielhafte Schlitzeingang kontinuierlich erfolgen kann, da die beispielhaften Polymerasen keinem oxidativen Stress wie bei Pacific Bioscience ausgesetzt sind und ein selektiver Stofftransport von nur zum Beispiel positiv geladenen Spezien erfolgt, die eine kontinuierliche Abfolge von Beladung und Sequenzierung erlaubt. Darüber hinaus ermöglicht der Verfahrensablauf eine mehrfache Messung des gleichen Analyten 30, was die statistische Sicherheit erhöht, um beispielsweise eine Base als Molekülbaustein 34 korrekt zu identifizieren. Die elektrophoretische Mobilität der beispielhaften Nukleotide liegt im Bereich von 0.014–0.015 cm2/(Vmin) für Monophosphate und 0.02–0.021 cm2/(Vmin) für Triphosphate (Electrophoresis 2001, 22, 1119–1126). Dies entspricht 2.3–2.5e–8 m2/(Vs) bzw. 3.3–3.5e–8 m2/(Vs). Angenommen, die elektrophoretischen Mobilitäten bewegen sich im Bereich von 3.5e–7 bis 3.5e–8 m2/(Vs), dann ergeben sich mit zum Beispiel einem elektrischen Feld von 10 hoch 7 V/m Geschwindigkeiten von 3.5m/s und 0.35 m/s. Bei beispielhaften Schlitzlängen von 50 Nanometern und 300 Nanometern resultieren Verweilzeiten von 14 Nanosekunden (50 Nanometern, 3.5 m/s) bis 860 Nanosekunden (300 Nanometern, 0.35 m/s). Diesen Verweilzeiten sind noch die Oberflächenadsorptionszeiten hinzuzurechnen, die im Tunnelgap ~0.1 ms lang sind. Die Tunnelstrommessung kann in erster Näherung schneller erfolgen (< 1 Millisekunde) als die Translozierung des markierten Pyrophosphats (ungefähr 1 Millisekunde). Damit ergibt sich eine statistische Sicherheit, dass sich je Zeiteinheit nur zum Beispiel ein Pyrophosphat im beispielhaften Nanoschlitz befindet und die Messung der beispielhaften Pyrophosphate schneller ist als die die typische Polymerisationsrate der beispielhaften Polymerasen (< 300 Nukleotide/Sekunde). Damit erlaubt der Verfahrensablauf, die beispielhaften Polymerasen unter nativeren Bedingungen einzusetzen als bei Pacific Bioscience, wodurch ein geringerer Einbaufehler zu erwarten ist (abkühlen der Bauteile ist nicht notwendig; eine temperaturstabile Messbedingung ist aber bevorzugt).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 6869764 B2 [0049]
WO 2013/100949 A1 [0054]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Eid et al. (2009; Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules, SCIENCE Vol. 323 (2) JANUARY 2009, pp. 133–138) [0003]
Kumar et al. (2012) (S. Kumar, C. Tao, M. Chien, B. Hellner, A. Balijepalli, J. W. F. Robertson, Z. Li, J. J. Russo, J. E. Reiner, J. J. Kasianowitz: „PEG-labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis“, Scientific Reports 2012, (2) 684: 1–8) [0005]
Lemay et al. (2013) (S. G. Lemay, S. Kang, K. Mathwig, P. S. Singh: Single-Molecule Electrochemistry: Present Status and Outlook, Accounts of Chemical Research, 2013, 46: 2, pp. 369–377 [0042]
G. Bashford, D. Lamb, D. Grone, B. Eckles, K. Kornelsen, L. Middendorf, J. Williams, „Automated bead-trapping apparatus and control system for single-molecule DNA sequencing”, Optics Express 2008, 16 (5): 3445–3455 [0048]
Bashford et al. (2008) [0049]
M. Zwolak: „Colloquim: Physical Approaches to DNA Sequencing and Detection“, Reviews of Modern Physics 30: 141–165; insbesondere Seiten 155–161 [0054]
Electrophoresis 2001, 22, 1119–1126 [0071]

Claims

Sequenziervorrichtung (1) mit mindestens einer Elektrodenanordnung (10) zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls (32), wobei die mindestens eine Elektrodenanordnung (10) der Sequenziervorrichtung (1) umfasst: – eine erste Elektrode (12) und eine weitere, der ersten Elektrode (12) gegenüberliegend angeordnete Elektrode (14), wobei jede Elektrode (12, 14) eine Oberfläche (O) aufweist und die Oberflächen (O) der Elektroden (12, 14) einen Zwischenraum (17) zwischen den beiden Elektroden (12, 14) begrenzen, der einen ersten Bereich der Sequenziervorrichtung (1) als Eintrittsbereich (20) eines Analyten (30) mit einem weiteren Bereich der Sequenziervorrichtung (1) als Austrittsbereich (22) des Analyten (30) verbindet, wobei die Elektroden (12, 14) zum Bereitstellen eines elektrischen Feldes innerhalb des Zwischenraums (17) ausgelegt sind, und – eine Proteinbindungsstelle (B) an dem Eintrittsbereich (20), die dazu ausgelegt ist, ein Protein (28) zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls (32) zu immobilisieren, dadurch gekennzeichnet, dass – eine der Elektroden (12, 14) die Proteinbindungsstelle (B) umfasst, und – der Zwischenraum (17) als Spalt ausgestaltet ist.
Sequenziervorrichtung (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberflächen (O) der Elektroden (12, 14) parallel zueinander angeordnet sind und/oder einen Abstand zueinander von zehn Nanometern oder weniger als zehn Nanometern aufweisen.
Sequenziervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung (10) dazu ausgelegt ist, bei einem direkten Kontakt des Analyten (30) mit einer der Elektrodenoberflächen (O) einen Tunnelstrom des durch den Zwischenraum (17) durchtretenden Analyten (30) und/oder ein Redox-Recycling, vorzugsweise einen Tunnelstrom, zu erfassen.
Sequenziervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch zwei von der Elektrodenanordnung (10) unabhängige Elektrophoreseelektroden (36, 38) zum Anlegen eines elektrophoretischen Feldes.
Sequenziervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung (10) eine Opferschicht (19) umfasst, die in dem Zwischenraum (17) zwischen den Elektroden (12, 14) angeordnet ist.
Sequenziervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Elektrodenanordnung (10) zumindest teilweise eine Passivierungsschicht (24) auf einem eine der Elektroden (12, 14) umfassenden Bauteil (18) umfasst.
Sequenziervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche (O) der weiteren Elektrode (14) eine größere Fläche aufweist als die Oberfläche (O) der ersten Elektrode (12), sodass ein Teilbereich der Oberfläche (O) der weiteren Elektrode (14) die erste Elektrode (12) überlappt.
Sequenziervorrichtung (1) nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteinbindungsstelle (B) ausschließlich an der weiteren Elektrode (14), die vorzugsweise eine positive Elektrode umfasst, angeordnet ist.
Sequenziervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenziervorrichtung (1) mehrere Elektrodenanordnungen (10) umfasst, deren Zwischenräume (17) so angeordnet sind, dass ein zwischen den jeweiligen Eintrittsbereichen (20) zentral angeordneter Austrittsbereich (22) den Austrittsbereich (20) einer jeden Elektrodenanordnung (10) bildet.
Sequenziervorrichtung (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenziervorrichtung (1) mehrere Elektrodenanordnungen (10) umfasst, deren Zwischenräume (17) so angeordnet sind, dass die jeweiligen Eintrittsbereiche (20) nebeneinander angeordnet sind und durch die jeweiligen Zwischenräume (17) mit einem einzigen Austrittsbereich (22) verbunden sind.
Verfahren zum Sequenzieren eines biologischen Makromoleküls (32) mithilfe einer Sequenziervorrichtung (1) gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend die Schritte: – Immobilisieren eines Proteins (28) zum Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls (32) an der Proteinbindungsstelle (B), – Binden des biologischen Makromoleküls (32) an das Protein (28), – sequentielles Bereitstellen mehrerer Analyten (30) durch Replizieren oder Spalten des biologischen Makromoleküls (32) durch das Protein (28), – Translozieren der Analyten (30) durch den Zwischenraum (17) vom Eintrittsbereich (20) in den Austrittsbereich (22), und – elektronisches Erfassen der translozierten Analyten (30) durch Bereitstellen eines elektrischen Feldes innerhalb des Zwischenraums (17) durch die Elektroden (12, 14) der Elektrodenanordnung (10) und dadurch Sequenzieren des biologischen Makromoleküls (32).
Verfahren nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch den Schritt: – Anlegen eines elektrophoretischen Feldes durch zwei von der Elektrodenanordnung (10) unabhängige Elektrophoreseelektroden (36, 38).
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, gekennzeichnet durch den Schritt: – Entfernen einer zwischen den beiden Elektroden (12, 14) der Elektrodenanordnungen (10) angeordneten Opferschicht (19) durch Ätzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Bereitstellen der mehreren Analyten (30) durch Replizieren des biologischen Makromoleküls (32) mithilfe eines oder mehrerer biologischer Molekülbausteine (34), der oder die zum Synthetisieren des Replikats erforderlich sind, oder durch Spalten des biologischen Makromoleküls (32) erfolgt, wobei der jeweilige an einen biologischen Molekülbaustein (34) gebundene Analyt (30) während des Vorgangs des Replizierens abgespalten wird und eine elektrische Ladung des Analyten (30) umgekehrt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das elektronische Erfassen ein Erfassen eines Tunnelstroms und/oder ein Redox-Recycling, vorzugsweise einen Tunnelstrom, des Analyten (30) umfasst.