DE102008025680A1 - Analyseeinrichtung und Verfahren zum Redoxcycling ohne Potentiostat - Google Patents

Analyseeinrichtung und Verfahren zum Redoxcycling ohne Potentiostat Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein elektrochemisch arbeitendes Sensorelement, umfassend eine erste und eine zweite Arbeitselektrode, wobei die genannten Arbeitselektroden in ihren elektrischen Potentialen floatend sind und zwischen ihnen eine vorbestimmte, für das Redoxcycling geeignete Potentialdifferenz besteht, und ferner ein Sensorarray, umfassend wenigstens zwei der genannten Sensorelemente. Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur amperometrischen Bestimmung von Substanzkonzentrationen mit Hilfe des Sensorelements oder Sensorarrays und eine Analysevorrichtung, umfassend wenigstens eine Durchflusszelle, die wenigstens ein Sensorarray umfasst, wenigstens eine Spannungsquelle und wenigstens ein Amperemeter, bereit. Schließlich betrifft die Erfindung einen Analysekit, umfassend wenigstens einen Marker zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz und wenigstens eine Indikatorsubstanz, sowie die Verwendung des Sensorelements, des Sensorarrays, der Analysevorrichtung oder des Analysekits in einem Immunoassay oder Hybridisierungsassay.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein elektrochemisch arbeitendes Sensorelement, umfassend eine erste und eine zweite Arbeitselektrode, wobei die genannten Arbeitselektroden in ihren elektrischen Potentialen floatend sind und zwischen ihnen eine vorbestimmte, für das Redoxcycling geeignete Potentialdifferenz besteht, und ferner ein Sensorarray, umfassend wenigstens zwei der genannten Sensorelemente. Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur amperometrischen Bestimmung von Substanzkonzentrationen mit Hilfe des Sensorelements oder Sensorarrays und eine Analysevorrichtung, umfassend wenigstens eine Durchflußzelle, die wenigstens ein Sensorarray umfaßt, wenigstens eine Spannungsquelle und wenigstens ein Amperemeter, bereit. Schließlich betrifft die Erfindung einen Analysekit, umfassend wenigstens einen Marker zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz und wenigstens eine Indikatorsubstanz, sowie die Verwendung des Sensorelements, des Sensorarrays, der Analysevorrichtung oder des Analysekits in einem Immunoassay oder Hybridisierungsassay.
  • Bei den amperometrischen Meßverfahren zur Bestimmung von Substanzkonzentrationen wird eine Spannungsdifferenz zwischen zwei Elektroden eingestellt, bei der die zu detektierende Substanz umgesetzt wird. Die bei der Reduktion oder Oxidation, z. B. beim sogenannten Redoxcycling (Redoxcyclisierung), fließenden Ströme ergeben das Meßsignal.
  • Eine breite Anwendung finden amperometrisch arbeitende Sensoren als Sauerstoffsensoren oder biochemische Sensoren zur Verfolgung und Beobachtung (Monitoring) immunchemischer und/oder molekularbiologischer Vorgänge. Bei den biochemischen Sensoren werden molekulare Erkennungssysteme, z. B. Haptene, Antigene oder Antikörper, auf oder in der Nähe der Elektroden plaziert (immobilisiert). Das Zielmolekül bindet daran und wird entweder direkt oder über Zwischenschritte mit einem Enzymlabel (Enzymmarker) versehen. Wird nun das entsprechende Enzymsubstrat zugegeben, setzt das Enzym eine Substanz frei, die detektiert werden kann. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen, optisch (z. B. kolorimetrisch oder durch Chemilumineszenz) oder elektrochemisch. Unabhängig von der Art der Detektion handelt es sich hierbei um den so genannten ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).
  • Auf ähnlichem Weg lassen sich auch Analyseverfahren für DNA, cDNA bzw. Oligonucleotide und auch RNA durchführen. Hierzu werden Nukleinsäuren (DNA, cDNA bzw. Oligonucleotide) als molekulare Erkennungssysteme auf oder in der Nähe der Elektroden plaziert (immobilisiert). Das Zielmolekül, in diesem Fall eine DNA oder cDNA, ein Oligonucleotid oder auch eine RNA bindet an bzw. hybridisiert mit der immobilisierten Nukleinsäure und wird ebenfalls direkt oder über Zwischenschritte mit einem Enzymlabel (Enzymmarker) versehen. Wird nun das entsprechende Enzymsubstrat zugegeben, setzt das Enzym eine Substanz frei, die detektiert werden kann. Dies kann auf verschiedene Weise geschehen, optisch (z. B. kolorimetrisch oder durch Chemilumineszenz) oder elektrochemisch. Unabhängig von der Art der Detektion handelt es sich dann um den so genannten Hybridisierungsassay. Ist eine RNA das Zielmolekül, so erfolgt die Anbringung des Enzymlabels über einen Antikörper, so daß in diesem Fall eine Mischform zwischen ELISA und Hybridisierungsassay vorliegt.
  • In den vorgenannten Assayverfahren können prinzipiell statt der an die immobilisierten molekularen Erkennungssysteme (Bindungsstellen) gebundenen nachzuweisenden Substanzen (Zielmoleküle) auch die freigebliebenen Bindungsstellen mit einem Enzymlabel versehen, und so die gebundenen Zielmoleküle indirekt nachgewiesen werden (kompetitiver Assay). Letzteres Verfahren kommt vor allem als Variante des ELISA zum Einsatz.
  • Die elektrochemischen Methoden weisen deutliche Vorteile hinsichtlich der Empfindlichkeit bei der Detektion auf. Wenn durch die enzymatische Reaktion eine elektrochemisch aktive Substanz freigesetzt wird, die sich für das Redoxcycling eignet, so eignet sich diese Substanz als Reporter für das Ausmaß der stattgefundenen Immunreaktion oder Hybridisierung eines Oligonucleotids oder DNA-Fragmentes mit einem anderen DNA-Fragment. Die verbesserte Empfindlichkeit wird durch den Effekt der Signalverstärkung beim Redoxcycling erreicht. Außerdem ermöglicht diese Methode eine starke Miniaturisierung dadurch, daß die für Anode und Kathode erforderlichen Elektroden in einer Interdigitalstruktur in Dünnfilmtechnologie ausgebildet sein können (für weitere Details wird auf die WO 99/07879 verwiesen). In der WO 99/07879 (z. B. Seite 10, Zeile 23) wird statt des hier verwendeten Begriffes ”Redoxcycling” auch der Begriff ”Redox Recycling” verwendet; beide Begriffe sind jedoch erfindungsgemäß synonym.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich daher auf ein elektrochemisches Meßverfahren zur Messung der Konzentration oder Konzentrationsänderung einer redoxaktiven Substanz. Daneben bezieht sich die Erfindung auch auf eine zugehörige Vorrichtung zur Durchführung des Meßverfahrens mit einem elektrochemischen Sensorelement.
  • Amperometrische Sensoren basieren auf dem einfachen Prinzip, daß reduzierbare oder oxidierbare Substanzen durch Anlegen eines entsprechenden Potentials an einer Elektrode umgesetzt werden können. Der dabei fließende sogenannte Faradaysche Strom ist ein Maß für die Konzentration dieser Substanz. Dieser Strom kann jedoch nicht direkt nach Anlegen des Potentials gemessen werden, da zunächst vor allem ein hoher kapazitiver Strom fließt. Dieser wird durch die Umladung der Doppelschicht der Elektrode verursacht. Er klingt exponentiell mit der Zeit ab.
  • Der Faradaysche Strom verringert sich ebenfalls mit der Zeit, da durch den Umsatz von Substanz eine Verarmung vor der Elektrode stattfindet. Die Nachlieferung von Substanz aus der Lösung zur Elektrode findet bei nicht gerührten, also nicht konvektiven Systemen, allein durch die Diffusion statt. Es stellen sich in der Lösung Konzentrationsprofile ein.
  • Speziell bei redoxaktiven Substanzen kann bisher unter Verwendung von Interdigitalelektroden das so genannte Redoxcycling eingesetzt werden. Dabei wird ausgenutzt, daß die an einer Elektrode oxidierte Substanz an der zweiten Elektrode wieder reduziert werden kann. Die Elektroden werden dabei konstant auf das Oxidations- bzw. Reduktionspotential eingestellt. Dazu werden die beiden Interdigitalelektroden mit kammartig ineinandergreifenden Elektrodenfingern zusammen mit der Referenzelektrode und einer Gegenelektrode an einen Bipotentiostaten angeschlossen (Niwa, O., Morita, M., Tabei, H., Anal. Chem. 62 (1991), 447–452, und DE 43 18 519 ).
  • Eine Vorraussetzung für das Redoxcycling ist, daß der Abstand zwischen den Elektroden, d. h. der einander zugeordneten Elektrodenfinger der Interdigitalelektroden, in der Größenordnung der Diffusionsschichtdicke, also im Bereich weniger μm, liegt. Auf Grund der Konzentrationsprofile geht in den gemessenen Strom neben der Konzentration und dem Diffusionskoeffizienten die Zahl der Elektrodenfinger und deren Länge ein (Aoki, K., J. Electroanal. Chem., 270 (1989), 35). Daraus ergibt sich, daß die erforderlichen Strukturen sehr fein und aufwendig in der Herstellung sein müssen. Ferner müssen die für die elektrochemische Detektion verwendeten Sensorelemente Elektroden beinhalten, die elektrisch einzeln kontaktiert sind. Bei amperometrischen und konduktometrischen Sensorelementen muß der Stromfluß über die Elektroden einzeln erfaßt werden können. Es kommt daher bevorzugt die Silizium-Chip-Technologie zum Einsatz.
  • In Silizium-Technologie sind verschiedene Biochips gefertigt und in Thewes, R. et al., "Sensor Arrays for Fully Electronic DNA Detection on CMOS", ISSCC Digest of Tech. Papers, 2002, 350 ff., beschrieben. Vorteilhaft ist hier die Integration von CMOS-Schaltungstechnik, Signalverarbeitung (Multiplexing) und Analog-Digital-Wandlung in die Sensorplattform selbst. So kann eine hohe Anzahl von Sensoren auf kleinster Fläche realisiert werden. Nachteilig wirken sich die Kosten für die Herstellung eines solchen Chips und die aufwendige Handhabung (Kontaktierung) aus. Für die so genannten low-density Arrays mit weniger als 100 Sensoren pro Quadratzentimeter sind daher die Kosten pro Einzelsensor hoch.
  • Die Monographie "Electrochemical Methods, Fundamentals and Applications", John Wiley & Sons, 1980 liefert einen allgemeinen Überblick über die elektrochemische Meßtechnik. Weitere Hinweise zur Messung speziell an Flüssigkeiten oder auch für biochemische Messungen werden in der DE 43 35 241 , DE 41 31 731 , DE 197 17 809 und DE 199 17 052 gegeben. Ein Verfahren zur elektrochemischen Messung des Redoxcyclings mit einer praxisgerechten Elektrodenanordnung ist im Einzelnen in der WO 01/67587 beschrieben.
  • Bisher war zusätzlich zu den Arbeitselektroden eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode (auch als Hilfselektrode bezeichnet) erforderlich, um so auch das absolute Potential der Arbeitselektroden mittels eines Potentiostaten oder Bipotentiostaten, der das Potential der Gegenelektrode entsprechend aussteuert, gegenüber einer Referenzelektrode einstellen zu können ( DE 100 58 397 ; WO 2005/073708 ).
  • Zwar vereinfacht sich gemäß WO 2005/073708 der Meßaufbau beim gepulsten Redoxcycling gegenüber dem normalen Redoxcycling mit konstanter Einstellung des Potentials der Arbeitselektroden dahingehend, daß kein Bipotentiostat benötigt wird. Jedoch wird immer noch ein einfacher Potentiostat in Kombination mit einem Pulsgenerator benötigt ( WO 2005/073708 , Seite 6, Zeile 11–14). Außerdem besteht die Elektrodenanordnung nach wie vor neben den zwei Meßelektroden aus einer Referenzelektrode und einer Gegenelektrode ( WO 2005/073708 , Seite 16, Zeile 19–24).
  • Die bisher im Stand der Technik bekannte Anordnung zur Durchführung des Redoxcyclings zur Analyse von Stoffkonzentrationen weist somit folgende Merkmale auf:
    • – Generator-Elektrode zur Umsetzung der enzymatisch gebildeten Substanz (z. B. Oxidation des entstandenen p-aminophenols zu Chinonimin)
    • – Kollektor-Elektrode zur Rückgewinnung der enzymatisch gebildeten Substanz (Reduktion des Chinonimins zu p-Aminophenol)
    • – Referenzelektrode
    • – Hilfselektrode (auch als Gegenelektrode bezeichnet)
    • – Potentiostat (elektronischer Regelkreis) zur elektrochemischen Fixierung der Potentiale von Generator- und Kollektor-Elektrode mit Bezug zur Referenzelektrode durch Aussteuerung der Hilfselektrode auf ein geeignetes Potential.
  • Eine solche Anordnung weist jedoch folgende Nachteile auf:
    • – Komplexität aufgrund der Elektrodenvielzahl
    • – Elektronischer Regelkreis (Potentiostat) ist anfällig für Störungen (z. B. Auftreten von sogenanntem Schwingen bei der Regelung)
    • – Referenzelektrode erfordert ein bestimmtes Elektrodenmaterial (z. B. Ag/AgCl)
    • – mikrotechnische Prozessierung verschiedener Elektrodenmaterialien ist aufwendig und teuer
    • – bei Arrays von n Array-Elementen (Spots; Sensorelementen) sind 2n Elektroden (Generator und Kollektor) sowie ein gemeinsamer Potentiostat mit einer Referenz- und einer Hilfs-Elektrode erforderlich; Referenz- und Hilfs-Elektrode müssen im Array in geeigneter Weise angeordnet sein, so daß alle Arrayelemente elektrochemisch gleich behandelt werden können
    • – sogenanntes ”Lock-Spot-Verfahren” (Verschließen der Array-Spots bzw. der auf dem Array befindlichen Sensorelemente), z. B. beim Betrieb in einer Durchflußzelle, ist nicht möglich, da der Potentiostat elektrisch abgetrennt werden würde.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, diese Nachteile zu überwinden und eine vereinfachte Elektrodenanordnung für das Redoxcycling unter Verzicht auf den Einsatz eines Potentiostaten bereitzustellen. Außerdem soll das Redoxcycling mit einem im Lock-Spot-Modus betriebenen Sensorarray, z. B. innerhalb einer Durchflußzelle, ermöglicht werden.
  • Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß zur Durchführung des Redoxcyclings auf Gegenelektrode und Referenzelektrode sowie Potentiostat oder Bipotentiostat verzichtet werden kann.
  • Es reicht vielmehr aus, wenn zwischen den Arbeitselektroden eines Sensorelements, d. h. zwischen der oxidierend wirkenden Arbeitselektrode WOx und der reduzierend wirkenden Arbeitselektrode WRed, eine vorbestimmte Potentialdifferenz besteht, wobei WOx ein höheres Potential aufweist als WRed; hierbei sind die genannten Arbeitselektroden in ihren elektrischen Potentialen floatend, d. h. ihr absolutes elektrisches Potential ist jeweils unbestimmt, die Arbeitselektroden sind also elektrochemisch unbestimmt.
  • Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß ein Verfahren zur Durchführung des Redoxcyclings einer ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz an einer solchen Elektrodenanordnung, bestehend aus lediglich zwei Arbeitselektroden, es erfordert, daß eine dritte elektrochemisch aktive Substanz zumindest zu Beginn des Redoxcyclings anwesend ist, um durch Aufnahme von Elektronen einer mit Elektronen übersättigten Elektrode (Anode) (im Falle einer zu oxidierenden ersten elektrochemisch aktiven Substanz) oder durch Abgabe von Elektronen an eine an Elektronen verarmte Elektrode (Kathode) (im Falle einer zu reduzierenden ersten elektrochemisch aktiven Substanz) den Prozeß des Redoxcyclings in Gang zu bringen. Andernfalls würde bei einer Oxidation der ersten elektrochemisch aktiven Substanz das elektrische Potential der Anode zu stark absinken, oder bei einer Reduktion der ersten elektrochemisch aktiven Substanz das elektrische Potential der Kathode zu stark ansteigen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit
    • (1) ein Sensorelement umfassend eine erste und eine zweite Arbeitselektrode, wobei die genannten Arbeitselektroden in ihren elektrischen Potentialen floatend sind und zwischen ihnen eine vorbestimmte Potentialdifferenz besteht;
    • (2) ein Sensorelement wie unter (1) definiert, wobei (i) die erste Arbeitselektrode als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx und die zweite Arbeitselektrode als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed oder umgekehrt die erste Arbeitselektrode als WRed und die zweite Arbeitselektrode als WOx geschaltet ist, oder (ii) die erste und zweite Arbeitselektrode jeweils im Wechsel als WOx und WRed geschaltet werden, und wobei in jedem Fall WOx ein höheres elektrisches Potential aufweist als WRed;
    • (3) ein Sensorelement wie unter (1) oder (2) definiert, wobei keine weiteren Elektroden, insbesondere keine weiteren Arbeitselektroden, keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode, vorhanden sind;
    • (4) ein Sensorelement wie unter (1) bis (3) definiert, wobei die beiden Arbeitselektroden (10, 20) jeweils kammartig mit einzelnen Fingern ausgebildet sind, wobei die Finger (11, ..., 14, 15, ..., 19, ...) der ersten Arbeitselektrode (10) mit den Fingern (21, ..., 24, 25, ..., 28, ...) der zweiten Arbeitselektrode (20) ineinandergreifen und so eine Interdigitalelektrode ausbilden;
    • (5) ein Sensorelement wie unter (1) bis (4) definiert, wobei die beiden planaren Arbeitselektroden in Dünnfilmtechnologie auf einem planaren Substrat ausgebildet sind, wobei sich bevorzugt zwischen jeder Arbeitselektrode und dem Substrat we nigstens eine Isolatorschicht befindet, wobei weiter bevorzugt wenigstens eine Isolatorschicht gebildet ist aus Siliziumoxid und/oder Siliziumnitrid, besonders bevorzugt SiO2 und/oder Si3N4;
    • (6) ein Sensorelement wie unter (1) bis (5) definiert, wobei die vorbestimmte Potentialdifferenz für das Redoxcycling eines vorgegebenen Redox-Paares geeignet ist, wobei das Redox-Paar bevorzugt aus einer ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz gebildet wird;
    • (7) ein Sensorelement wie unter (1) bis (6) definiert, wobei auf dem Sensorelement wenigstens eine Bindungsstelle umfassend ein Mittel zur Erkennung und Bindung einer nachzuweisenden Substanz, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern wie insbesondere monoklonalen Antikörpern, Kohlenhydratmolekülen wie insbesondere Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, Peptiden wie insbesondere Polypeptiden, Oligopeptiden, Depsipeptiden, cyclischen Peptiden, cyclischen Depsipeptiden, Proteinen, DNA, cDNA, RNA, und Oligonucleotiden, und besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, DNA, cDNA und Oligonucleotiden, vorhanden ist;
    • (8) ein Sensorarray (30) umfassend wenigstens zwei Sensorelemente (33, 34) wie unter (1) bis (7) definiert;
    • (9) ein Sensorarray wie unter (8) definiert, wobei außer den Arbeitselektroden der Sensorelemente keine weiteren Elektroden, bevorzugt keine weiteren Arbeitselektroden, keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode auf dem Sensorarray vorhanden sind, wobei besonders bevorzugt keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode, die für wenigstens zwei oder alle Sensorelemente gemeinsam geschaltet sind, auf dem Sensorarray vorhanden sind;
    • (10) ein Verfahren zur Bestimmung von Substanzkonzentrationen mit einem Sensorelement wie unter (1) bis (7) definiert oder einem Sensorarray wie unter (8) oder (9) definiert, umfassend die Schritte (i) In-Kontaktbringen wenigstens eines Sensorelementes wie unter (1) bis (7) definiert mit einer nachzuweisenden Substanz; (ii) Bindung der Substanz auf dem Sensorelement an wenigstens einer der wie unter (7) definierten Bindungsstellen; (iii) Markierung der in Schritt (ii) gebundenen Substanz oder der freigebliebenen Bindungsstellen mit einem Marker; (iv) Umsetzung einer Indikatorsubstanz mittels eines an den Marker gebundenen Enzyms zu einer ersten elektrochemisch aktiven Substanz; (v) Einstellung einer für das Redoxcycling in Schritt (vi) geeigneten Potentialdifferenz zwischen der wie unter (1) bis (5) definiert ersten und zweiten Arbeitselektrode des in Schritt (i) genannten Sensorelements; (vi) elektrochemisches Redoxcycling durch Umsetzung der ersten elektrochemisch aktiven Substanz mittels Oxidation an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WOx oder mittels Reduktion an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WRed zu einer zweiten elektrochemisch aktiven Substanz, und Umsetzung der zweiten elektrochemisch aktiven Substanz mittels Reduktion an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WRed oder mittels Oxidation an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WOx zu der ersten elektrochemisch aktiven Substanz, in Anwesenheit einer dritten elektrochemisch aktiven Substanz, die dabei zu einer vierten elektrochemisch aktiven Substanz umgesetzt wird; (vii) amperometrische Messung des während des Redoxcyclings in Schritt (vi) zwischen den Arbeitselektroden fließenden Stromes; und (viii) Bestimmung der Konzentration der nachzuweisenden Substanz in Abhängigkeit von dem in Schritt (vii) gemessenen Strom;
    • (11) ein Verfahren wie unter (10) definiert, wobei der Marker in Schritt (iii) ein Mittel zur Erkennung der nachzuweisenden Substanz oder zur Erkennung der freigebliebenen Bindungsstellen auf dem Sensorelement ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern wie insbesondere monoklonalen Antikörpern, Kohlenhydratmolekülen wie insbesondere Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, Gastmolekülen, die an Wirtsmoleküle wie insbesondere Kohlenhydratmoleküle, bevorzugt ausgewählt aus Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, binden, Peptiden wie insbesondere Polypeptiden, Oligopeptiden, Depsipeptiden, cyclischen Peptiden, cyclischen Depsipeptiden, Proteinen, DNA, cDNA, RNA, und Oligonucleotiden, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, DNA, cDNA und Oligonucleotiden;
    • (12) ein Verfahren wie unter (10) oder (11) definiert, wobei die Indikatorsubstanz in Schritt (iv) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Estern mit solchen Verbindungen, die wenigstens eine OH-Gruppe aufweisen, die direkt an ein C-Atom eines aromatisches Ringsystems gebunden ist, bevorzugt Phenolestern, bevorzugter Phenylphosphaten, Phenylpropionaten und Phenylbutyraten, wobei unter den Phenylbutyraten die Phenyl-n-butyrate bevorzugt sind, wobei weiter bevorzugt das genannte aromatische Ringsystem, insbesondere der Phenylring substituiert ist, besonders bevorzugt substituiert ist mit der Aminogruppe, und am meisten bevorzugt die Indikatorsubtanz p-Aminophenylphosphat ist;
    • (13) ein Verfahren wie unter (10) bis (12) definiert, wobei (a) die Arbeitselektroden in ihren elektrischen Potentialen floatend sind; (b) keine weiteren Elektroden, insbesondere keine weiteren Arbeitselektroden, keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode, verwendet werden; (c) zur Einstellung der Potentialdifferenz in Schritt (v) eine Spannungsquelle verwendet wird; und/oder (d) die Schritte (iv) bis (vii), gegebenenfalls (iv) bis (viii), im Lock-Spot-Modus unter Verschluß des Sensorelementes oder jedes einzelnen Sensorelements eines Sensorarrays mit einem Deckel durchgeführt werden, wobei die hierin unter (a) definierte Option bevorzugt ist, die Kombination der hierin unter (a) und (b) oder (a) und (c) definierten Optionen bevorzugter ist, die Kombination der hierin unter (a), (b) und (c) definierten Optionen noch weiter bevorzugt ist, und die Kombination der hierin unter (a) bis (d) definierten Optionen am meisten bevorzugt ist;
    • (14) ein Sensorelement wie unter (1) bis (7) definiert und speziell angepaßt zur Anwendung in einem Verfahren wie unter (10) bis (13) definiert;
    • (15) ein Sensorarray wie unter (8) oder (9) definiert und speziell angepaßt zur Anwendung in einem Verfahren wie unter (10) bis (13) definiert;
    • (16) eine Analysevorrichtung umfassend (a) wenigstens eine Durchflußzelle umfassend wenigstens ein Sensorarray wie unter (8), (9) oder (15) definiert, (b) wenigstens eine Spannungsquelle wie unter (13) definiert mit elektrischen Kontakten zu einer ersten und zweiten Arbeitselektrode wenigstens eines Sensorelementes auf wenigstens einem wie unter (a) definierten Sensorarray, und (c) wenigstens ein Amperemeter mit elektrischen Kontakten zu der ersten und zweiten wie unter (b) definierten Arbeitselektrode;
    • (17) einen Analysekit umfassend (a) wenigstens einen Marker wie unter (10) oder (11) definiert, und (b) wenigstens eine Indikatorsubstanz wie unter (10) oder (12) definiert;
    • (18) die Verwendung eines Sensorelements wie unter (1) bis (7) oder (14) definiert in einem Immunoassay oder Hybridisierungsassay;
    • (19) die Verwendung eines Sensorarrays wie unter (8), (9) oder (15) definiert in einem Immunoassay oder Hybridisierungsassay;
    • (20) die Verwendung einer Analysevorrichtung wie unter (16) definiert in einem Immunoassay oder Hybridisierungsassay; und
    • (21) die Verwendung eines Analysekits wie unter (17) definiert in einem Immunoassay oder Hybridisierungsassay.
  • Die erfindungsgemäße Analyseeinrichtung weist in einer Ausführungsform folgende Merkmale auf:
    • – zwei elektrochemisch unbestimmte (in ihren elektrischen Potentialen floatende) Elektroden (Arbeitselektroden) mit einer vorbestimmten Potentialdifferenz je Sensorelement
    • – eine chemische Substanz (Indikatorsubstanz), die vom Labelenzym (an den Marker gebundenes Enzym) umgesetzt wird
    • – eine erste elektrochemisch aktive Substanz, die aus der chemischen Substanz unter Katalyse des Labelenzyms gebildet wird und unter der vorbestimmten Potentialdifferenz bei Entstehung einer zweiten elektrochemisch aktiven Substanz elektrochemisch zyklisiert (redoxcyclisiert) werden kann
    • – eine dritte elektrochemisch aktive Substanz, die während des Redoxcyclings der ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz zu einer vierten elektrochemisch aktiven Substanz umgesetzt wird, ohne dabei jedoch selber einem Redoxcycling-Prozeß unterworfen zu sein, d. h. die dritte und vierte elektrochemisch aktive Substanz bilden zwar ein Redox-Paar, sind aber so gewählt, daß sie selber unter der vorbestimmten Potentialdifferenz der Arbeitselektroden und unter den sonstigen gegebenen Bedingungen einem Redoxcycling nicht unterworfen werden.
  • Erfindungsgemäß werden nur zwei Elektroden, d. h. eine erste und eine zweite Arbeitselektrode pro Arrayposition verwendet.
  • Referenz- und Hilfs- oder Gegenelektrode sowie Potentiostat entfallen. Dadurch entfallen auch die oben genannten Nachteile.
  • Zwei in ihren elektrischen Potentialen floatende (Arbeits) Elektroden mit einer für das Redoxcycling (Redoxcyclisierung) geeigneten Potentialdifferenz sind jedoch alleine mit dem Redoxcyclisierungs-Paar (z. B. p-Aminophenol und Chinonimin) nicht funktionsfähig. Simulationen belegen, daß bei enzymatischer Bildung von p-Aminophenol die Anode durch Aufnahme von Elektronen aus p-Aminophenol nach kurzer Zeit negativ aufgeladen werden würde und dadurch das elektrische Potential absinken würde. Eine weitere Umsetzung von p-Aminophenol wäre nicht mehr möglich.
  • Erfindungsgemäß wird eine dritte elektrochemisch aktive Substanz (z. B. gelöster Sauerstoff) eingeführt, die aufgrund ihrer Tendenz, Elektronen von der Kathode aufzunehmen, ein Absinken der Elektroden-Potentiale verhindert.
  • Aus Sicht der Stoffbilanz muß mindestens soviel dritte elektrochemisch aktive Substanz (z. B. Sauerstoff) vorhanden sein, daß die Umsetzung der ersten elektrochemisch aktiven Substanz (z. B. p-Aminophenol) einmal kompensiert wird. Einmal umgesetzte erste elektrochemisch aktive Substanz (z. B. p-Aminophenol) wird dann durch das Redoxcycling ständig regeneriert.
  • Beispielsweise liegt die Indikatorsubstanz (Enzymsubstrat, z. B. p-Aminophenylphosphat) in einer Konzentration im mM-Bereich vor, ebenso liegt der gelöste Sauerstoff im mM-Bereich vor, während die erste und zweite elektrochemisch aktive Substanz, wie z. B. p-Aminophenol und Chinonimin, in einer Konzentration im μM-Bereich vorliegen. Dies bedeutet, daß die dritte elektrochemisch aktive Substanz, wie z. B. gelöster Sauerstoff, in etwas 1000-fachem Überschuß gegenüber der ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz, wie z. B. p-Aminophenol und Chinonimin, vorliegt.
  • Die erfindungsgemäße Anordnung sowie das zugehörige Verfahren können insbesondere vorteilhaft für das ”Lock-Spot-Verfahren” eingesetzt werden.
  • Ein Sensorelement umfaßt erfindungsgemäß zwei Arbeitselektroden, nämlich eine erste und eine zweite Arbeitselektrode, und bevorzugt umfaßt das Sensorelement keine weiteren Elektroden wie etwa eine Hilfselektrode (Gegenelektrode) oder eine Referenzelektrode. Die erste Arbeitselektrode kann als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx (Anode) geschaltet sein, während die zweite Arbeitselektrode als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed (Kathode) geschaltet wird. Umgekehrt kann aber auch die erste Arbeitselektrode als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed (Kathode) geschaltet sein, während die zweite Arbeitselektrode als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx (Anode) geschaltet ist.
  • Diese Art der Schaltung kann während des gesamten Meßvorganges bzw. Redoxcyclings konstant bleiben oder mit einer bestimmten Frequenz hin- und her wechseln, um hierdurch störende Einflüsse des Diffusionsstromes aufgrund der sich um die Elektroden ausbildenden Diffusionsschicht (Konzentrationsgradient) zu minimieren.
  • Wie in der WO 2005/073708 offenbart, kann – im Gegensatz zum ”normalen” Redoxcycling, bei dem ein stationärer Zustand eingestellt wird – eine schnelle Relaxation des Konzentrationsgradienten elektrochemisch erzwungen werden. Dazu wird das Potential der Arbeitselektrode gepulst. Es bildet sich eine Diffusionsschicht aus, deren Dicke am Ende der Meßperiode einen Maximalwert erreicht, der von der Länge der Meßphase abhängt. Bei einer Messung von Oxidationsströmen wird während der Relaxationsphase ein hinreichendes Reduktionspotential eingestellt. Die während der Meßphase oxidierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies werden so wieder reduziert. Der Konzentrationsgradient und damit die Diffusionsschicht werden abgebaut. Statt also wie beim normalen Redoxcycling konstante Diffusionsschichtdicken zu etablieren, wird beim gepulsten Redoxcycling die Diffusionsschicht zeitlich auf- und wieder abgebaut. Soll eine Reduktion beobachtet werden, so muß während der Meßphase das Reduktionspotential und während der Relaxationsphase das entsprechende Oxidationspotential eingestellt werden. In beiden Fällen wird dadurch eine zumindest in ihrem Maximalwert begrenzte Diffusionsschichtdicke eingestellt.
  • Der Begriff ”in ihren elektrischen Potentialen floatend” oder kurz ”floatend” bedeutet elektrochemisch unbestimmt, d. h. floatende Arbeitselektroden besitzen kein absolut festgelegtes elektrisches Potential, die Arbeitselektroden sind also elektrochemisch unbestimmt; zwischen den floatenden Arbeitselektroden kann aber eine bestimmte Potentialdifferenz bestehen bzw. eingestellt sein. Hierzu ist jede Arbeitselektrode einzeln elektrisch kontaktiert.
  • Die erste und zweite Arbeitselektrode können erfindungsgemäß die gleiche oder identische Gestalt aufweisen, planar sein, eine Dicke von 10–1000 nm, bevorzugt 100–500 nm, besonders bevorzugt 200–400 nm aufweisen, eine Breite von 0,5 bis 5 μm, bevorzugt 1 μm aufweisen. Der Abstand zwischen den Arbeitselektroden WOx und WRed, bei kammartigen Elektroden zwischen einem Kamm der WOx zu dem nächsten benachbarten Kamm der WRed, ist kleiner oder gleich dem 5-fachen der Dicke der sich an jeder Elektrode ausbildenden Diffusionsschicht, bevorzugt ≤ 10 μm, bevorzugter ≤ 5 μm, weiter bevorzugt ≤ 3 μm, noch weiter bevorzugt 0,5–1,5 μm und am meisten bevorzugt 1 μm.
  • Die beiden Arbeitselektroden bestehen bevorzugt aus demselben Material, bevorzugter einem Edelmetall, besonders bevorzugt Gold.
  • Die beiden Arbeitselektroden sind bevorzugt planar ausgebildet, insbesondere in Dünnfilmtechnologie auf einem planaren Substrat als Träger. Bevorzugt befindet sich zwischen jeder Arbeitselektrode und dem Substrat wenigstens eine Isolatorschicht, wobei weiter bevorzugt wenigstens eine Isolator schicht gebildet ist aus Siliziumoxid und/oder Siliziumnitrid, besonders bevorzugt SiO2 und/oder Si3N4.
  • Das Substrat ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Metall (wobei in diesem Fall zwischen Metall und Arbeitselektrode zwingend eine Isolatorschicht angeordnet ist), Kunststoff, Glas, Keramik, Silizium und kristallographisch orientiertem Silizium, bevorzugter ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silizium und kristallographisch orientiertem Silizium. Besonders bevorzugt besteht das Substrat aus kristallographisch orientiertem Silizium. Das erfindungsgemäß verwendete Substrat, insbesondere das Silizium oder kristallographisch orientierte Silizium als Substrat, wird vorzugsweise so eingesetzt und bearbeitet, wie in der CMOS (complementary metal oxide semiconductor)-Technologie allgemein üblich. So erfolgt z. B. die Gestaltung der Schaltungsarchitektur über Photomasken und Ätztechnik und die Herstellung der einzelnen Schaltelemente (Transistoren, Dioden etc.) durch Auftragung dünner Schichten, d. h. komplementär leitender Schichten durch Epitaxieverfahren.
  • Das Sensorelement kann in CMOS-Schaltungstechnik (integrierter CMOS-Chip) zusammen mit einer Schaltung für die Signalverarbeitung und für die Analog-Digitalwandlung, und gegebenenfalls einer Schaltung für die Signalverstärkung, auf dem Substrat integriert sein, wobei das Substrat bevorzugt kristallographisch orientiertes Silizium ist. Da jede Arbeitselektrode elektrisch einzeln kontaktiert ist, kann für jedes Sensorelement unabhängig von den anderen Sensorelementen eine bestimmte Potentialdifferenz zwischen den Arbeitselektroden dieses Sensorelementes eingestellt und der während des Redoxcyclings fließende Strom (Redoxstrom) über ein diesem Sensorelement zugeordnetes Amperemeter gemessen werden. Außerdem ist durch diese einzelne elektrische Kontaktierung gewährleistet, daß die vorgenannte Schaltung für die Signalverarbeitung, für die Analog-Digitalwandlung und für die Sig nalverstärkung, soweit für die Messung erforderlich, mit diesem Sensorelement schaltungstechnisch verbunden werden kann.
  • In einer Ausführungsform verfügt der integrierte CMOS Chip über integrierte Strommessungseinrichtungen inklusive Verstärkung pro Sensorposition, über A/D-Wandlungseinrichtungen für jede Position, sowie über eine Multiplexeinrichtung zur hochfrequenten (vorzugsweise ca. 10 kHz), seriellen Auslesung aller Sensorsignale über eine digitale Datenleitung; damit ist eine quasi parallele Auslesung aller Sensorpositionen im 1–5 Hz-Bereich möglich.
  • Die vorbestimmte Potentialdifferenz zwischen den Arbeitselektroden ist so gewählt, daß sie für das Redoxcycling eines vorgegebenen Redox-Paares geeignet ist, wobei das Redox-Paar bevorzugt aus einer ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz gebildet wird.
  • Zum Nachweis einer zu bestimmenden Substanz oder Substanzkonzentration ist auf dem Sensorelement wenigstens eine Bindungsstelle umfassend ein molekulares Erkennungssystem als Fängermolekül, d. h. ein Mittel zur Erkennung und Bindung dieser nachzuweisenden Substanz vorhanden. Das Mittel zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz ist hierzu auf dem Sensorelement immobilisiert, wobei die Immobilisierung über auf dem Sensorelement vorhandene, übliche Ankergruppen erfolgen kann. Zusätzlich kann das Mittel zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz über einen Linker in bekannter Weise an die Ankergruppe chemisch gebunden sein. Bevorzugt ist dieses Mittel je nach Art der nachzuweisenden Substanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern wie insbesondere monoklonalen Antikörpern, Kohlenhydratmolekülen wie insbesondere Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, Peptiden wie insbesondere Polypeptiden, Oligopeptiden, Depsipeptiden, cyclischen Peptiden, cyclischen Depsipeptiden, Proteinen, DNA, cDNA, RNA, und Oligonucleotiden, und besonders bevorzugt ausgewählt aus der Grup pe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, DNA, cDNA und Oligonucleotiden.
  • Das erfindungsgemäße Sensorelement kann von einem Polymerring umgeben sein, der bewirkt, daß sich bei der Herstellung des Sensorelementes das Mittel zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz (in gelöster Form) auf dem Sensorelement (Spot) genauer positionieren läßt und während des Herstellungsvorgangs dort verbleibt.
  • Das Sensorelement weist einen rechteckigen oder quadratischen Grundriß, bevorzugt mit Abmessungen im Bereich von 100 × 100 μm bis 1000 × 1000 μm, weiter bevorzugt 150 × 150 bis 300 × 300 μm, am meisten bevorzugt 200 × 200 μm, oder einen kreisförmigen Grundriß, bevorzugt mit einem Durchmesser im Bereich von 100 bis 1500 μm, weiter bevorzugt 100 bis 500 μm, am meisten bevorzugt 150 μm, auf.
  • Das erfindungsgemäße Sensorarray umfaßt wenigstens zwei erfindungsgemäße Sensorelemente. Jedes Sensorelement auf dem Sensorarray kann jeweils von einem Polymerring umgeben sein, der bewirkt, daß sich bei der Herstellung des Sensorelementes bzw. des Sensorarrays das Mittel zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz (in gelöster Form) auf dem Sensorelement (Spot) genauer positionieren läßt und während des Herstellungsvorgangs dort verbleibt.
  • Das Sensorarray umfaßt 10 bis 1000, bevorzugt 50–150, besonders bevorzugt 100 Sensorelemente, oder 2n Sensorelemente, wobei n eine positive ganze Zahl von 1 bis 10, bevorzugt n = 7 ist, oder m × 96 Sensorelemente, wobei m eine positive ganze Zahl von 1 bis 10, bevorzugt m die Zahl 1 oder 4 ist.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung weisen unter den Sensorelementen eines Sensorarrays nicht mehr als 10, bevorzugt nicht mehr als 5, weiter bevorzugt nicht mehr als 2 Sensorelemente, und besonders bevorzugt nicht mehr als 1 Sensorelement das gleiche Mittel zur Erkennung und Bindung der nachzu weisenden Substanz auf. Dies ermöglicht die gleichzeitige Messung (vieler) verschiedener nachzuweisender Substanzen auf lediglich einem Sensorarray.
  • Der Abstand zwischen zwei benachbarten Sensorelementen eines Sensorarrays kann von 5 bis 100 μm, bevorzugt von 10 bis 50 μm, besonders bevorzugt 20 μm betragen.
  • Im Falle des Sensorarrays ist bevorzugt eine Schaltung, ausgewählt aus Schaltungen für die Signalverarbeitung, für die Analog-Digitalwandlung und für die Signalverstärkung, für alle Sensorelemente gemeinsam integriert, d. h. alle Sensorelemente nutzen gemeinsam jeweils eine der genannten Schaltungen.
  • Die nachzuweisende Substanz (Zielmolekül) kann im Prinzip jede Substanz sein, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren auf einem Sensorelement gebunden bzw. eingefangen und anschließend markiert werden kann. Insbesondere kann die nachzuweisende Substanz eine sein, die an das hierin definierte Mittel zur Erkennung und Bindung einer nachzuweisenden Substanz, insbesondere spezifisch oder selektiv, bindet. Beispielsweise ist die nachzuweisende Substanz ein Gastmolekül, das in einem erfindungsgemäßen Wirtsmolekül, insbesondere spezifisch, aufgenommen wird, ferner eine DNA, cDNA, RNA, ein Oligonucleotid, ein Antikörper oder ein Antigen, das an einen Antikörper, insbesondere monoklonalen Antikörper bindet.
  • Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Marker ist ein Mittel entweder zur Erkennung der nachzuweisenden Substanz (beim Sandwich-Assay) oder zur Erkennung der freigebliebenen Bindungsstellen auf dem Sensorelement (beim kompetitiven Assay), an die der Marker dabei jeweils bindet. Der Marker ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern wie insbesondere monoklonalen Antikörpern, Kohlenhydratmolekülen wie insbesondere Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, Gastmolekülen, die an Wirts moleküle wie insbesondere Kohlenhydratmoleküle, bevorzugt ausgewählt aus Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, binden, Peptiden wie insbesondere Polypeptiden, Oligopeptiden, Depsipeptiden, cyclischen Peptiden, cyclischen Depsipeptiden, Proteinen, DNA, cDNA, RNA, und Oligonucleotiden, bevorzugter ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, DNA, cDNA und Oligonucleotiden, und besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, DNA, cDNA und Oligonucleotiden.
  • Insbesondere die erfindungsgemäßen Kohlenhydratmoleküle, wie insbesondere die Stoffklassen der Cyclodextrine, Calixarene und Hemicarceranden, die erfindungsgemäßen Gastmoleküle, die an Wirtsmoleküle wie insbesondere Kohlenhydratmoleküle, bevorzugt ausgewählt aus Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, binden, sind wie in der Literatur definiert (Beyer, Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 24. Auflage, Stuttgart, 2004; insbesondere wird auf die Seiten 490, 491, 879 und 880 dieses Lehrbuchs verwiesen).
  • Nach Anzahl der verknüpften Aminosäuren wird oft folgende Unterteilung getroffen: Proteine weisen mehr als 100 Aminosäuren auf, während unter Polypeptiden solche Peptide verstanden werden, die aus 10 bis 100 Aminosäureresten aufgebaut sind, und Peptide mit 2 bis 9 Aminosäureresten als Oligopeptide bezeichnet werden (Beyer, Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 24. Auflage, Stuttgart, 2004, Seite 890; Breitmeier, E. und Jung, G., Organische Chemie II, Stuttgart, 1983, Seite 391). Die erfindungsgemäßen Peptide und Proteine können natürlich vorkommende, insbesondere proteinogene, und/oder synthetische Aminosäuren, die der D- und/oder L-Reihe angehören, bzw. deren Reste enthalten. Unter synthetischen Aminosäuren werden zum einen übliche Derivate der natürlich vorkommenden, insbesondere proteinogenen Aminosäuren verstanden, wie z. B. solche mit Schutzgruppen oder Modifikationen der Seitenkette; darüber hinaus umfassen synthetische Aminosäuren auch künstliche Aminosäuren, die sich von den natürlich vorkommenden durch ihre chemische Struktur unterscheiden, aber ähnliche Eigenschaften (z. B. hinsichtlich Hydrophilie der Seitenkette) aufweisen können.
  • Ist das Mittel zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz und/oder der Marker eine DNA oder cDNA, so handelt es sich bei dieser bevorzugt um eine einzelsträngige DNA bzw. einzelsträngige cDNA, so daß die Bildung von Duplexstrukturen mit nachzuweisender, einzelsträngiger DNA bzw. cDNA oder von Heteroduplexstrukturen mit nachzuweisender RNA ohne weiteres und auf einfache Weise ermöglicht wird.
  • Oligonucleotide sind erfindungsgemäß solche Nucleotide, die aus 2 bis 50, bevorzugt 2 bis 30, bevorzugter 2 bis 25, weiter bevorzugt 2 bis 20, noch weiter bevorzugt 2 bis 15, und besonders bevorzugt 2 bis 10 Mononucleotiden bzw. deren Resten aufgebaut sind. Bei den Mononucleotiden handelt es sich vorzugsweise um solche, die auch in DNA- bzw. cDNA-Molekülen auftreten, d. h. natürlich vorkommende Desoxyribonucleotide; es sind aber auch künstliche Mononucleotide, die sich in ihrer chemischen Struktur von denen der natürlich vorkommenden Desoxyribonucleotide unterscheiden, aber ähnliche Eigenschaften wie z. B. die Fähigkeit zur Basenpaarung aufweisen können, möglich.
  • Der Nachweis der Bindung des Markers wiederum geschieht durch ein Enzymlabel, d. h. ein Enzym, das entweder bereits vor Einsatz oder Zugabe des Markers direkt oder über einen Linker an den Marker gebunden ist, oder ein Enzym, das erst nachträglich, d. h. nach Bindung des Markers an die nachzuweisende Substanz (beim Sandwich-Assay) oder an die freigebliebenen Bindungsstellen auf dem Sensorelement (beim kompetitiven Assay) zugegeben wird und dann an den Marker entweder direkt oder über einen Linker bindet. Bei der nachträglichen Zugabe des Enzyms ist dieses beispielsweise mit einem Linker (z. B. Avidin oder Streptavidin) verknüpft, der die Bindung des Enzyms an eine bestimmte Anknüpfungsstelle (z. B. gebildet durch Biotin) des verwendeten Markers in situ während der Durchführung des Assays ermöglicht, wobei der Linker eine möglichst hohe spezifische Affinität für diese Anknüpfungsstelle aufweist (Schlüssel-Schloß-Prinzip). Ein komplementäres System aus (hoch)affinem Linker und Anknüpfungsstelle bilden bekanntermaßen beispielsweise Avidin oder Streptavidin und Biotin (Beyer, Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 24. Auflage, Stuttgart, 2004, Seite 798; vergleiche auch Seite 948).
  • Ein Beispiel für einen Sandwich-Assay ist der Sandwich-Immunoassay, der beispielsweise so angelegt sein kann, daß auf dem Sensorelement Antiköper gegen ein nachzuweisendes Antigen immobilisiert sind. Wird das nachzuweisende Antigen mit dem Sensorelement in Kontakt gebracht, so bindet das Antigen an die immobilisierten Antikörper. Die Erkennung des nachzuweisenden Antigens kann dann durch Bindung eines biotinylierten Marker-Antikörpers an eine freie Bindungsstelle des gebundenen Antigens geschehen. Der Nachweis der Bindung des biotinylierten Antikörpers wiederum geschieht durch Bindung eines vorher mit einem Enzym verknüpften Avidin- oder Streptavidinmoleküls. Es kann aber der Marker-Antikörper auch bereits direkt, d. h. vor dessen Zugabe mit dem Enzym verbunden sein.
  • Ein Beispiel für einen kompetitiven Assay ist der kompetitive Immunoassay, bei dem nachzuweisende Antigene an Antiköper als Bindungsstellen binden, die auf dem Sensorelement immobilisiert sind. Der Nachweis der gebundenen Antigene erfolgt dann indirekt, in dem die freigebliebenen Bindungsstellen durch Zugabe Enzym markierter Antigene ermittelt werden.
  • Als Enzyme sind im Prinzip alle Enzyme geeignet, die eine Indikatorsubstanz in einer Reaktion zu einer elektrochemisch aktiven Substanz umsetzten können, wobei die gebildete elektrochemisch aktive Substanz sich als erfindungsgemäß erste elektrochemisch aktive Substanz eignet. Solche Enzyme sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phos phatasen, insbesondere alkalischen Phosphatasen, und Esterasen, bevorzugt alkalischen Phosphatasen.
  • Die im Verfahren eingesetzte Indikatorsubstanz ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Estern mit solchen OH-Gruppen, die direkt an ein C-Atom eines aromatischen Ringsystems wie z. B. dem des Benzols, Naphthalins oder Anthracens gebunden sind (d. h. das C-Atom in der Gruppierung C-OH ist Teil des aromatischen Ringsystems), bevorzugter Phenolestern, noch bevorzugter Phenylphosphaten, Phenylpropionaten und Phenylbutyraten, wobei unter den Phenylbutyraten die Phenyl-n-butyrate bevorzugt sind, wobei weiter bevorzugt das genannte aromatische Ringsystem, insbesondere der Phenylring substituiert ist, besonders bevorzugt substituiert ist mit der Aminogruppe, und am meisten bevorzugt ist die Indikatorsubtanz p-Aminophenylphosphat.
  • Als Substituenten am aromatischen Ring eignen sich insbesondere solche Substituenten, die einen positiven induktiven und/oder positiven mesomeren Effekt ausüben, bevorzugt die Aminogruppe, besonders bevorzugt in para-Stellung.
  • Eine elektrochemisch aktive Substanz ist erfindungsgemäß eine chemische Substanz, die an einer Elektrode elektrochemisch oxidiert (durch Abgabe von Elektronen an die Elektrode, d. h. an die Arbeitselektrode WOx) oder reduziert (durch Aufnahme von Elektronen von der Elektrode, d. h. von der Arbeitselektrode WRed) werden kann.
  • Unter Potentialdifferenz zwischen den Arbeitselektroden ist erfindungsgemäß eine an den beiden Arbeitselektroden anliegende elektrische Spannung, die mit einer üblichen Spannungsquelle erzeugt wird, zu verstehen.
  • Die Spannungsquelle ist bevorzugt regelbar, d. h. die Höhe der Spannung kann jeweils auf das verwendete Redoxcyclisierungs-Paar, also die erste und zweite elektrochemisch aktive Substanz, und deren Konzentration im Analyten abgestimmt werden.
  • Als Spannungsquelle zur Einstellung der Potentialdifferenz zwischen den Arbeitselektroden ist erfindungsgemäß eine normale Spannungsquelle und insbesondere kein Potentiostat oder Bipotentiostat vorgesehen.
  • Eine für das Redoxcycling geeignete Potentialdifferenz ist dann eine solche elektrische Spannung, bei der eine Oxidation der ersten elektrochemisch aktiven Substanz zu einer zweiten elektrochemisch aktiven Substanz und eine Reduktion der hierbei gebildeten zweiten elektrochemisch aktiven Substanz zu der ersten elektrochemisch aktiven Substanz erfolgt, oder, im umgekehrten Falle, eine solche elektrische Spannung, bei der eine Reduktion der ersten elektrochemisch aktiven Substanz zu einer zweiten elektrochemisch aktiven Substanz und eine Oxidation der hierbei gebildeten zweiten elektrochemisch aktiven Substanz zu der ersten elektrochemisch aktiven Substanz erfolgt.
  • Erfindungsgemäß bilden die erste und die zweite elektrochemisch aktive Substanz ein Redox-Paar und nehmen als solches an dem erfindungsgemäß durchgeführten Redoxcycling teil.
  • Die erste elektrochemisch aktive Substanz ist ausgewählt aus Substanzen, die sich durch enzymatische Reaktion aus der Indikatorsubstanz bilden lassen, und anschließend elektrochemisch entweder oxidiert oder reduziert werden können, und sich für das Redoxcycling eignen.
  • Als erste elektrochemisch aktive Substanz, die elektrochemisch oxidiert werden kann, kommen insbesondere Verbindungen mit wenigstens einer OH-Gruppe in Frage, die direkt an ein C-Atom eines aromatisches Ringsystems wie z. B. dem des Benzols, Naphthalins oder Anthracens gebunden ist (d. h. das C-Atom in der Gruppierung C-OH ist Teil des aromatischen Ringsystems), bevorzugt Phenole, wobei weiter bevorzugt das genannte aromatische Ringsystem, insbesondere der Phenylring substituiert ist, besonders bevorzugt substituiert ist mit der Aminogrup pe, und am meisten bevorzugt ist die Indikatorsubtanz p-Aminophenylphosphat.
  • Als Substituenten am aromatischen Ring eignen sich insbesondere solche Substituenten, die einen positiven induktiven und/oder positiven mesomeren Effekt ausüben, bevorzugt die Aminogruppe, besonders bevorzugt in para-Stellung.
  • Als zu dieser ersten elektrochemischen Substanz komplementäre zweite elektrochemisch aktive Substanz eignet sich eine oxidierte Form der ersten elektrochemisch aktiven Substanz, bevorzugt enthaltend eine Chinoniminstruktur, besonders bevorzugt p-Chinonimin ist.
  • Beispielsweise bilden p-Aminophenol und p-Chinonimin als erste und zweite elektrochemisch aktive Substanz ein für das Redoxcycling geeignetes Redox-Paar.
  • Die dritte und vierte elektrochemisch aktive Substanz bilden eine weiteres Redox-Paar, das aber unter den gegebenen Bedingungen, d. h. insbesondere bei der zwischen den Arbeitselektroden bestehenden Potentialdifferenz nicht an einem Redoxcycling teilnimmt. Die dritte elektrochemisch aktive Substanz wird aber zumindest zu Beginn des Redoxcyclings der ersten/zweiten elektrochemisch aktiven Substanz, d. h. bei der Oxidation oder Reduktion der ersten elektrochemisch aktiven Substanz zu der zweiten elektrochemisch aktiven Substanz, zu einer vierten elektrochemisch aktiven Substanz umgesetzt. Diese Umsetzung ist entweder eine Reduktion der dritten elektrochemisch aktiven Substanz in dem Falle, in dem die erste elektrochemisch aktive Substanz an einer Arbeitselektrode WOx (als Anode) oxidiert wird, oder entsprechend eine Oxidation der dritten elektrochemisch aktiven Substanz in dem umgekehrten Falle, in dem die erste elektrochemisch aktive Substanz an einer Arbeitselektrode WRed (als Kathode) reduziert wird.
  • Die Umsetzung zu der vierten elektrochemisch aktiven Substanz ist unter den gegebenen Bedingungen, also vor allem aufgrund der zwischen den Arbeitselektroden bestehenden Potentialdif ferenz, irreversibel, so daß kein Redoxcycling der dritten und vierten elektrochemisch aktiven Substanz stattfindet. Die dritte elektrochemisch aktive Substanz hilft somit und ist notwenig, um das Redoxcycling in Gang zu bringen. Die dritte elektrochemisch aktive Substanz nimmt hierzu entweder Elektronen von einer Arbeitselektrode WOx, die bezüglich der ersten elektrochemisch aktiven Substanz als Anode fungiert und mit Elektronen gesättigt ist, auf, oder die dritte elektrochemisch aktive Substanz gibt Elektronen an eine Arbeitselektrode WRed, die bezüglich der ersten elektrochemisch aktiven Substanz als Kathode fungiert und an Elektronen verarmt ist, ab.
  • Die dritte elektrochemisch aktive Substanz ist somit ausgewählt aus Substanzen, die
    • (a) aufgrund ihres Redoxpotentials unter den gegebenen Bedingungen (z. B. Konzentration) geeignet sind, entweder Elektronen von einer mit Elektronen gesättigten Arbeitselektrode WOx zu übernehmen, dabei selber reduziert werden und so ein Absinken der Elektrodenpotentiale verhindern, oder
    • (b) Elektronen an eine an Elektronen verarmte Arbeitselektrode WRed abzugeben, dabei selber oxidiert werden und so ein Ansteigen der Elektrodenpotentiale verhindern, ohne jedoch jeweils selber einem Redoxcycling unterworfen zu sein.
  • Bevorzugt bilden die dritte und vierte elektrochemisch aktive Substanz ein Redox-Paar, das bei einem Redoxcyclisierungspotential redoxcyclisiert wird, das wenigstens 300 mV höher als die für das Redoxcycling an den Arbeitselektroden eingestellte Potentialdifferenz zwischen den Arbeitselektroden, insbesondere wie in Schritt (v) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen und definiert, liegt.
  • Bevorzugt ist die dritte elektrochemisch aktive Substanz ausgewählt aus den vorstehend unter (a) definierten Substanzen, bevorzugter ist sie Sauerstoff, besonders bevorzugt Luftsauerstoff, wobei der Sauerstoff oder Luftsauerstoff am meisten bevorzugt in gelöster Form vorliegt.
  • Unter den Begriff ”Lock-Spot-Verfahren” oder ”Lock-Spot-Modus” wird erfindungsgemäß eine Betriebsart der Analysevorrichtung, die ein erfindungsgemäßes Sensorelement oder Sensorarray enthält, verstanden, bei der ein einzelnes Sensorelement (Spot) oder die auf dem Array befindlichen Sensorelemente (Array-Spots) jeweils einzeln verschlossen werden, z. B. von oben durch einen Deckel, so daß jeweils ein ”Lock-Spot” hergestellt wird. Die für jedes Sensorelement vorgesehenen Deckel können in einem Deckelträger zusammengefaßt sein, der durch eine Vorrichtung auf die Sensorelemente oder den Sensorarray abgesenkt werden kann, um mehrere oder alle verwendete Sensorelemente gleichzeitig zu verschließen. Das Lock-Spot-Verfahren kommt insbesondere vorteilhaft beim Betrieb des Sensorelementes oder Sensorarrays, gegebenenfalls unter Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, in einer Durchflußzelle zum Einsatz. Durch den Verschluß jedes einzelnen Sensorelementes im Lock-Spot-Verfahren werden eventuell störende Einflüsse (z. B. ungewolltes Vermischen des Analyten zwischen den Sensorelementen während der Messung bzw. des Redoxcyclings; störende elektrische Beeinflussung der Arbeitselektroden verschiedener, insbesondere benachbarter Sensorelemente untereinander) vermieden. Dies wiederum ermöglicht ein weitgehend störungsfreies Redoxcycling, hat also eine Verbesserung der Meßgenauigkeit zur Folge.
  • Das Verfahren kann erfindungsgemäß auch auf folgende Arten durchgeführt werden:
    Beim normalen Redoxcycling wird (insbesondere während der gesamten Dauer der Schritte (v) bis (vii), gegebenenfalls der Schritte (v) bis (viii))
    • (a) die erste Arbeitselektrode als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx und die zweite Arbeitselektrode als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed, oder
    • (b) die erste Arbeitselektrode als WRed und die zweite Arbeitselektrode als WOx geschaltet, wobei in jedem Fall WOx ein höheres elektrisches Potential aufweist als WRed.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann das Verfahren auch so durchgeführt werden, daß (insbesondere während der gesamten Dauer der Schritte (v) bis (vii), gegebenenfalls der Schritte (v) bis (viii)) die erste und zweite Arbeitselektrode im Wechsel als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx und als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed geschaltet werden, wobei WOx ein höheres elektrisches Potential aufweist als WRed. Bevorzugt ist hierfür das sogenannte gepulste Redoxcycling, bei dem das Potential der Arbeitselektroden gepulst wird, und es werden abwechselnd Meßphasen sowie Relaxationsphasen gebildet. Eine Relaxationsphase dient zur Relaxation des um wenigstens eine der Arbeitselektroden gebildeten Konzentrationsgradienten wenigstens einer elektrochemisch aktiven Substanz (zu weiteren Details des gepulsten Redoxcyclings wird auch auf WO 2005/073708 verwiesen, wobei die darin enthaltenen Angaben nur insoweit übernommen werden, als sie sich auf die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Sensorelemente, die Arbeitselektroden mit floatenden elektrischen Potentialen aufweisen, übertragen lassen).
  • Beim gepulsten Redoxcycling erfolgt die amperometrische Messung des zwischen den Arbeitselektroden fließenden Stromes in Schritt (vii) bevorzugt am Ende der Meßphase.
  • Bei der Messung von Oxidationsströmen wird während der Relaxationsphase ein hinreichendes Reduktionspotential eingestellt, bei dem die während der Meßphase oxidierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies wieder reduziert werden. Bei der Messung von Reduktionsströmen wird während der Relaxationsphase ein hinreichendes Oxidationspotential eingestellt, bei dem die während der Meßphase reduzierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies wieder oxidiert werden.
  • Die Wiederholrate für das gepulste Redoxcycling beträgt insbesondere wenigstens 1/10 Hz.
  • Weiterhin kann das gepulste Redoxcycling erfindungsgemäß mit vorgebbaren Impulsformen, vorzugsweise mit einem Rechteck-, Dreieck- oder Sinus-Verlauf, durchgeführt werden.
  • Die Relaxationsphase ist entweder wenigstens so lang wie die Meßphase oder erheblich länger als diese, bevorzugt 3- bis 7-mal länger als die Meßphase.
  • Bei einer Wiederholrate von 1 Hz beträgt die Pulslänge der Meßphase 100 bis 300 ms, vorzugsweise 250 ms, und die Pulslänge der Relaxationsphase zwischen 700 und 900 ms, vorzugsweise 750 ms.
  • Mit Vorteil wird die Potentialdifferenz derart gewählt, daß die Umsetzungen der ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz im Diffusionsgrenzstrombereich ablaufen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine Analysevorrichtung bereit, die folgendes umfaßt:
    • (a) wenigstens eine Durchflußzelle, die wenigstens ein Sensorarray (als Boden) umfaßt,
    • (b) wenigstens eine Spannungsquelle mit elektrischen Kontakten zu der ersten und zweiten Arbeitselektrode wenigstens eines Sensorelementes auf wenigstens einem wie unter (a) definierten Sensorarray, und
    • (c) wenigstens ein Amperemeter mit elektrischen Kontakten zu der ersten und zweiten wie unter (b) definierten Arbeitselektrode zur Messung des zwischen den Arbeitselektroden fließenden elektrischen Stromes während des Redoxcyclings.
  • Die Durchflußzelle wird erfindungsgemäß gebildet aus:
    • – einem erfindungsgemäßen Sensorarray als ”Boden”, wobei die Arbeitselektroden der Sensorelemente des Sensorarrays, optional zusammen mit einer oder mehreren (integrierten) elektronischen Schaltungen, auf einem Substrat oder Sensor-Substrat aufgebracht sind, (z. B. Silizium); vorzugsweise ist das Substrat planar (z. B. Silizium-Chip)
    • – Seitenwänden, bestehend vorteilhaft aus Chip-Vergußmaterial (Polymer); vorteilhafterweise ist die Höhe der Seitenwände (50–500 μm, typischerweise 150 μm) wesent lich kleiner als die Dimensionen des Bodens (1–10 mm, typischerweise 5 mm)
    • – einem ”Deckel” der typischerweise parallel zum Boden angeordnet ist; im Falle von ”Lock-Spot” ist der Deckel vorteilhaft als ”Stempel” einsetzbar, wobei der Deckel starr mit seitlicher, elastischer Führung oder vollständig elastisch ausgeführt sein kann; Montage z. B. durch Verkleben
    • – wenigstens einem Zufluß und einem Abfluß, um Flüssigkeit in die Zelle bzw. durch die Zelle zu pumpen; Zufluß und Abfluß werden z. B. an den Rändern, durch Aussparungen im Deckel an die Zelle herangeführt und dann auf die Chipfläche geleitet.
  • Die Analysevorrichtung kann zusätzlich wenigstens eine Lock-Spot-Vorrichtung mit einem ”Stempel”, der Deckel für jedes einzelne Sensorelement des Sensorarrays aufweist, umfassen. Bevorzugt ist die Lock-Spot-Vorrichtung in die Durchflußzelle integriert und bildet dann auch den Deckel der Durchflußzelle, wie vorstehend erläutert.
  • Vorzugsweise beträgt in der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung die Anzahl der
    • (a) Sensorarrays von 1 bis 96,
    • (b) Durchflußzellen von 1 bis 96,
    • (c) Spannungsquellen von 1 bis 96,
    • (d) Amperemeter von 1 bis 96, und/oder
    • (e) Lock-Spot-Vorrichtungen mit je 1 bis 96 Deckeln 1 bis 96.
  • Besonders bevorzugt beträgt die Anzahl der Durchflußzellen von 1 bis 96, und die Anzahl der Sensorarrays, Spannungsquellen, Amperemeter und Lock-Spot-Vorrichtungen ist jeweils gleich der Anzahl der Durchflußzellen.
  • Eine Ausführungsform der Analysevorrichtung ist beispielsweise ein Analyseautomat für die medizinische Diagnostik oder klinische Chemie, für die Gendiagnostik, Genomik und Proteomik. Die Analysevorrichtung kann zum Auffinden bestimmter DNA-, RNA- oder cDNA-Moleküle und damit bestimmter Genabschnitte oder Bruchstücke hiervon dienen.
  • Schließlich wird auch ein Analysekit umfassend wenigstens einen Marker und wenigstens eine Indikatorsubstanz bereitgestellt. Der Analysekit kann zusätzlich wenigstens ein Enzym wie hierin definiert, das gegebenenfalls an einen Linker, der die Bindung an den Marker ermöglicht und wie hierin definiert ist, gebunden ist, und/oder wenigstens eine dritte elektrochemisch aktive Substanz umfassen. Zusätzlich kann der Analysekit auch ein Sensorelement oder ein Sensorarray umfassen.
  • Das Sensorelement, das Sensorarray, die Analysevorrichtung und der Analysekit gemäß der vorliegenden Erfindung eignen sich besonders zur Verwendung in einem Immunoassay oder Hybridisierungsassay, bei den Immunoassays insbesondere in einem kompetitiven Immunoassay oder Sandwich-Immunoassay. Unter den Immunoassays bevorzugt ist der Sandwich-Immunoassay. Bevorzugt sind der Sandwich-Immunoassay und der Hybridisierungsassay.
  • Beschreibung der Figuren
  • Es zeigen jeweils in schematischer Vereinfachung
  • 1 eine Anordnung der zwei Arbeitselektroden für das Redoxcycling, wobei die strich-punktierte Linie den Bereich des in 2 gezeigten Ausschnitts markiert,
  • 2 einen vergrößerten Ausschnitt aus 1, und
  • 3 ein Sensorarray umfassend mehrere Sensorelemente.
  • 1 zeigt eine Ausführungsform für eine Elektrodenanordnung, bestehend aus einer ersten und einer zweiten Arbeitselektrode, z. B. als WOx und WRed, die hier in Interdigitalstruktur als sogenannte Interdigital-Elektroden (10) und (20) ausgeführt sind.
  • Als ”Interdigitalelektrode” wird hier eine Elektrode mit fingerartigen Elektrodenteilen bezeichnet, wobei zwei Interdigitalelektroden kammartig ineinandergreifen können. Dies bedeutet, daß die erste Arbeitselektrode (10) parallele Finger (11), (12), (13), (14), (15), ... und die zweite Arbeitselektrode (20) parallele Finger (21), (22), (23), (24), (25), ... aufweist – wie in 2 vergrößert dargestellt.
  • 3 zeigt eine Ausführungsform für ein Sensorarray, d. h. eine Anordnung mehrerer Sensorelemente, wobei jedes Sensorelement eine Arbeitselektrode WOx und eine Arbeitselektrode WRed umfaßt. Hier ist ein Sensorarray (30) mit rechteckigem Grundriß gezeigt, der mehrere Sensorelemente (31), (32), (33), (34), ..., (38), ... umfaßt.
  • Ausführungsbeispiel
  • Die vorliegende Erfindung kann beispielsweise in wie folgt beschriebener Weise ausgeführt werden.
  • 1) Sensorchip:
  • Siliziumchip mit einem Array, bestehend aus 128 Positionen (16 × 8), Pitch: 250 μm; je Position zwei Interdigitalelektroden-Arrays von ca. 150 μm Durchmesser; Gold-Elektrodenfinger 1 μm; Elektrodenabstand 1 μm; Untergrund Siliziumnitrid; jede Position umgeben von einem Polymerring mit Innendurchmesser 180 μm und Außendurchmesser 220 μm; Höhe 5 μm.
  • Chip montiert auf Träger, elektrisch kontaktiert; verkapselt mit Epoxy; eingebaut in Durchflußzelle: Höhe des Flowkanals: 200 μm; Breite ca. 3 mm. Jede Sensorposition gespottet mit 1 nl 10 μM thiol-funktionalisiertem 20mer Oligonucleotid.
  • 2) Hybridisierung:
  • Durchflußzelle wird gespült mit 20 μl 1 nM biotinyliertem 20mer komplementärem Target-Oligonucleotid, dann für 2 min bei 45°C gehalten. Waschen mit Pufferlösung (100 mM Phosphatpuffer pH 7)
  • 3) Label:
  • Durchflußzelle wird gespült mit 20 μl Streptavidin/alkalische Phosphatase Konjugat-Lösung, dann für 1 min bei 20°C gehalten.
    Waschen mit Pufferlösung (100 mM Phosphatpuffer pH 7)
  • 4) Messung:
  • Durchflußzelle wird gespült mit 100 μl 2 mM p-Aminophenylphosphat-Lösung in 50 mM Luft-gesättigtem Trispuffer pH 9 bei 40°C (ca. 10 μl/s), dann stopped flow.
  • Vor dem stopped flow werden die Interdigitalelektroden-Pärchen mit 400 mV elektrisch polarisiert und eine Einrichtung zur elektrischen Strom-Messung angeschlossen.
  • (Der integrierte CMOS Chip verfügt über integrierte Strommessungseinrichtungen inkl. Verstärkung pro Sensorposition, über A/D-Wandlungseinrichtungen für jede Position, sowohl über eine Multiplexeinrichtung zur hochfrequenten, seriellen Auslesung ca. 10 kHz aller Sensorsignale über eine digitale Datenleitung; damit ist eine quasi parallele Auslesung aller Sensorpositionen im 1–5 Hz-Bereich möglich.)
  • Im Flow mit Enzymsubstrat (p-Aminophenylphosphat) wird bereits ein elektrischer Basisstrom gemessen, der bei Stopped Flow zu einem signifikanten Anstieg führt, der proportional zur Enzymlabel-Konzentration, und damit zur Target-Oligo-Konzentration ist.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - WO 99/07879 [0006, 0006]
    • - DE 4318519 [0010]
    • - DE 4335241 [0013]
    • - DE 4131731 [0013]
    • - DE 19717809 [0013]
    • - DE 19917052 [0013]
    • - WO 01/67587 [0013]
    • - DE 10058397 [0014]
    • - WO 2005/073708 [0014, 0015, 0015, 0015, 0033, 0080]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • - Niwa, O., Morita, M., Tabei, H., Anal. Chem. 62 (1991), 447–452 [0010]
    • - Aoki, K., J. Electroanal. Chem., 270 (1989), 35 [0011]
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    • - Beyer, Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 24. Auflage, Stuttgart, 2004 [0052]
    • - Beyer, Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 24. Auflage, Stuttgart, 2004, Seite 890 [0053]
    • - Breitmeier, E. und Jung, G., Organische Chemie II, Stuttgart, 1983, Seite 391 [0053]
    • - Beyer, Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 24. Auflage, Stuttgart, 2004, Seite 798 [0056]

Claims (61)

  1. Sensorelement umfassend eine erste und eine zweite Arbeitselektrode, wobei die genannten Arbeitselektroden in ihren elektrischen Potentialen floatend sind und zwischen ihnen eine vorbestimmte Potentialdifferenz besteht.
  2. Sensorelement gemäß Anspruch 1, wobei (i) die erste Arbeitselektrode als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx und die zweite Arbeitselektrode als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed oder umgekehrt die erste Arbeitselektrode als WRed und die zweite Arbeitselektrode als WOx geschaltet ist, oder (ii) die erste und zweite Arbeitselektrode jeweils im Wechsel als WOx und WRed geschaltet werden, und wobei in jedem Fall WOx ein höheres elektrisches Potential aufweist als WRed.
  3. Sensorelement gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei keine weiteren Elektroden, insbesondere keine weiteren Arbeitselektroden, keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode, vorhanden sind.
  4. Sensorelement gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die beiden Arbeitselektroden (10, 20) jeweils kammartig mit einzelnen Fingern ausgebildet sind, wobei die Finger (11, 14, 15, ..., 19, ...) der ersten Arbeitselektrode (10) mit den Fingern (21, ..., 24, 25, ..., 28, ...) der zweiten Arbeitselektrode (20) ineinandergreifen und so eine Interdigitalelektrode ausbilden.
  5. Sensorelement gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die beiden Arbeitselektroden (i) gleiche Gestalt aufweisen und planar sind; (ii) eine Dicke von 10–1000 nm, bevorzugt 100–500 nm, besonders bevorzugt 200–400 nm aufweisen; (iii) eine Breite von 0,5 bis 5 μm, bevorzugt 1 μm aufweisen; und/oder (iv) einen Abstand zwischen einem Kamm der ersten Arbeitselektrode zu dem nächsten benachbarten Kamm der zweiten Arbeitselektrode von kleiner oder gleich dem 5-fachen der Dicke der sich an jeder Elektrode ausbildenden Diffusionsschicht, bevorzugt von ≤ 10 μm, bevorzugter ≤ 5 μm, weiter bevorzugt ≤ 3 μm, noch weiter bevorzugt 0,5–1,5 μm und am meisten bevorzugt 1 μm aufweisen.
  6. Sensorelement gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die beiden Arbeitselektroden aus demselben Material, bevorzugt Edelmetall, besonders bevorzugt Gold bestehen.
  7. Sensorelement gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die beiden planaren Arbeitselektroden in Dünnfilmtechnologie auf einem planaren Substrat ausgebildet sind, wobei sich bevorzugt zwischen jeder Arbeitselektrode und dem Substrat wenigstens eine Isolatorschicht befindet, wobei weiter bevorzugt wenigstens eine Isolatorschicht gebildet ist aus Siliziumoxid und/oder Siliziumnitrid, besonders bevorzugt SiO2 und/oder Si3N4.
  8. Sensorelement gemäß Anspruch 7, wobei das Substrat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metall, wobei zwischen Metall und Arbeitselektrode die in Anspruch 7 definierte Isolatorschicht angeordnet ist, Kunststoff, Glas, Keramik, Silizium und kristallographisch orientiertem Silizium, bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Silizium und kristallographisch orientiertem Silizium, besonders bevorzugt kristallographisch orientiertes Silizium ist.
  9. Sensorelement gemäß Anspruch 8, wobei das Sensorelement in CMOS-Schaltungstechnik zusammen mit einer Schaltung für die Signalverarbeitung und für die Analog-Digitalwandlung, und gegebenenfalls einer Schaltung für die Signalverstärkung, auf dem Substrat integriert ist, wobei das Substrat kristallographisch orientiertes Silizium ist.
  10. Sensorelement gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die vorbestimmte Potentialdifferenz für das Redoxcycling eines vorgegebenen Redox-Paares geeignet ist, wobei das Redox-Paar bevorzugt aus einer ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz gebildet wird.
  11. Sensorelement gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, wobei auf dem Sensorelement wenigstens eine Bindungsstelle umfassend ein Mittel zur Erkennung und Bindung einer nachzuweisenden Substanz, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern wie insbesondere monoklonalen Antikörpern, Kohlenhydratmolekülen wie insbesondere Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, Peptiden wie insbesondere Polypeptiden, Oligopeptiden, Depsipeptiden, cyclischen Peptiden, cyclischen Depsipeptiden, Proteinen, DNA, cDNA, RNA, und Oligonucleotiden, und besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, DNA, cDNA und Oligonucleotiden, vorhanden ist.
  12. Sensorelement gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, das (i) einen rechteckigen oder quadratischen Grundriß, bevorzugt mit Abmessungen im Bereich von 100 × 100 μm bis 1000 × 1000 μm, weiter bevorzugt 150 × 150 bis 300 × 300 μm, am meisten bevorzugt 200 × 200 μm, oder (ii) einen kreisförmigen Grundriß, bevorzugt mit einem Durchmesser im Bereich von 100 bis 1500 μm, weiter bevorzugt 100 bis 500 μm, am meisten bevorzugt 150 μm aufweist.
  13. Sensorarray (30) umfassend wenigstens zwei Sensorelemente (33, 34) wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 definiert.
  14. Sensorarray gemäß Anspruch 13, umfassend (i) 10 bis 1000, bevorzugt 50–150, besonders bevorzugt 100 der definierten Sensorelemente, oder (ii) 2n der definierten Sensorelemente, wobei n eine positive ganze Zahl von 1 bis 10, bevorzugt n = 7 ist, oder (iii) m × 96 der definierten Sensorelemente, wobei m eine positive ganze Zahl von 1 bis 10, bevorzugt m die Zahl 1 oder 4 ist.
  15. Sensorarray gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei nicht mehr als 10, bevorzugt nicht mehr als 5, weiter bevorzugt nicht mehr als 2 Sensorelemente, und besonders bevorzugt nicht mehr als 1 Sensorelement das gleiche Mittel zur Erkennung und Bindung der nachzuweisenden Substanz wie in Anspruch 11 definiert aufweisen.
  16. Sensorarray gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Abstand zwischen zwei benachbarten Sensorelementen von 5 bis 100 μm, bevorzugt von 10 bis 50 μm, besonders bevorzugt 20 μm beträgt.
  17. Sensorarray gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die Schaltung wie in Anspruch 9 definiert ist, und wobei die Schaltung für alle Sensorelemente gemeinsam integriert ist.
  18. Sensorarray gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 17, wobei außer den Arbeitselektroden der Sensorelemente keine weiteren Elektroden, bevorzugt keine weiteren Arbeitselektroden, keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode auf dem Sensorarray vorhanden sind, wobei besonders bevorzugt keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode, die für wenigstens zwei oder alle Sensorelemente gemeinsam geschaltet sind, auf dem Sensorarray vorhanden sind.
  19. Verfahren zur Bestimmung von Substanzkonzentrationen mit einem Sensorelement wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 definiert oder einem Sensorarray wie in irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18 definiert, umfassend die Schritte (i) In-Kontaktbringen wenigstens eines Sensorelementes wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 definiert mit einer nachzuweisenden Substanz; (ii) Bindung der Substanz auf dem Sensorelement an wenigstens einer der wie in Anspruch 11 definierten Bindungsstellen; (iii) Markierung der in Schritt (ii) gebundenen Substanz oder der freigebliebenen Bindungsstellen mit einem Marker; (iv) Umsetzung einer Indikatorsubstanz mittels eines an den Marker gebundenen Enzyms zu einer ersten elektrochemisch aktiven Substanz; (v) Einstellung einer für das Redoxcycling in Schritt (vi) geeigneten Potentialdifferenz zwischen der wie in den Ansprüchen 1 bis 7 definierten ersten und zweiten Arbeitselektrode des in Schritt (i) genannten Sensorelements; (vi) elektrochemisches Redoxcycling durch Umsetzung der ersten elektrochemisch aktiven Substanz mittels Oxidation an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WOx oder mittels Reduktion an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WRed zu einer zweiten elektrochemisch aktiven Substanz, und Umsetzung der zweiten elektrochemisch aktiven Substanz mittels Reduktion an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WRed oder mittels Oxidation an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WOx zu der ersten elektrochemisch aktiven Substanz, in Anwesenheit einer dritten elektrochemisch aktiven Substanz, die dabei zu einer vierten elektrochemisch aktiven Substanz umgesetzt wird; (vii) amperometrische Messung des während des Redoxcyclings in Schritt (vi) zwischen den Arbeitselektroden fließenden Stromes; und (viii) Bestimmung der Konzentration der nachzuweisenden Substanz in Abhängigkeit von dem in Schritt (vii) gemessenen Strom.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei (a) die nachzuweisende Substanz in einer Mischung mit wenigstens einer anderen Substanz enthalten ist; (b) die Bindung in Schritt (ii) selektiv für nur eine bestimmte nachzuweisende Substanz erfolgt und gegebenenfalls zwischen Schritt (ii) und (iii) ein Waschschritt zur Entfernung der anderen, nicht nachzuweisenden Substanzen erfolgt; und/oder (c) die nachzuweisende Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, cDNA, Oligonucleotiden, RNA, Antikörpern und Antigenen, bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus DNA, cDNA, Oligonucleotiden, Antikörpern und Antigenen.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 19 oder 20, wobei der Marker in Schritt (iii) ein Mittel zur Erkennung der nachzuweisenden Substanz oder zur Erkennung der freigebliebenen Bindungsstellen auf dem Sensorelement ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, Antikörpern wie insbesondere monoklonalen Antikörpern, Kohlenhydratmolekülen wie insbesondere Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, Gastmolekülen, die an Wirtsmoleküle wie insbesondere Kohlenhydratmoleküle, bevorzugt ausgewählt aus Cyclodextrinen, Calixarenen und Hemicarceranden, binden, Peptiden wie insbesondere Polypeptiden, Oligopeptiden, Depsipeptiden, cyclischen Peptiden, cyclischen Depsipeptiden, Proteinen, DNA, cDNA, RNA, und Oligonucleotiden, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern, DNA, cDNA und Oligonucleotiden.
  22. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 21, wobei (a) die nachzuweisende Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, cDNA und Oligonucleotiden, das Mittel zur Erkennung und Bindung einer nachzuweisenden Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, cDNA und Oligonucleotiden, bevorzugt Oligonucleotiden, und der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, cDNA und Oligonucleotiden, bevorzugt Oligonucleotiden; (b) die nachzuweisende Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus RNA, das Mittel zur Erkennung und Bindung einer nachzuweisenden Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DNA, cDNA und Oligonucleotiden, bevorzugt Oligonucleotiden, und der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, bevorzugt monoklonalen Antikörpern; (c) die nachzuweisende Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, das Mittel zur Erkennung und Bindung einer nachzuweisenden Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, bevorzugt monoklonalen Antikörpern, und der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern und Antigenen, bevorzugt monoklonalen Antikörpern und Antigenen; oder (d) die nachzuweisende Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, das Mittel zur Erkennung und Bindung einer nachzuweisenden Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antigenen, und der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern und Antigenen, bevorzugt monoklonalen Antikörpern und Antigenen.
  23. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 22, wobei (a) der Marker bereits vor Ausführung der Schritte (iii) und (iv) an das wie in Schritt (iv) des Verfahrens nach Anspruch 19 definierte Enzym direkt oder über einen Linker gebunden ist, oder (b) der Marker nach Ausführung des Schritts (iii) und vor Ausführung des Schritts (iv) an ein Enzym direkt oder über einen Linker gebunden wird, wobei die hierin unter (b) definierte Option bevorzugt ist.
  24. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 23, wobei die Indikatorsubstanz in Schritt (iv) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Estern mit solchen Verbindungen, die wenigstens eine OH-Gruppe aufweisen, die direkt an ein C-Atom eines aromatisches Ringsystems gebunden ist, bevorzugt Phenolestern, bevorzugter Phenylphosphaten, Phenylpropionaten und Phenylbutyraten, wobei unter den Phenylbutyraten die Phenyl-n-butyrate bevorzugt sind, wobei weiter bevorzugt das genannte aromatische Ringsystem, insbesondere der Phenylring substituiert ist, besonders bevorzugt substituiert ist mit der Aminogruppe, und am meisten bevorzugt die Indikatorsubtanz p-Aminophenylphosphat ist.
  25. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 24, wobei das Enzym in Schritt (iv) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphatasen, insbesondere alkalischen Phosphatasen, und Esterasen, bevorzugt alkalischen Phosphatasen.
  26. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 25, wobei (a) das elektrochemische Redoxcycling in Schritt (vi) durch Umsetzung der ersten elektrochemisch aktiven Substanz mittels Oxidation an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WOx zu einer zweiten elektrochemisch aktiven Substanz, und die Umsetzung der zweiten elektrochemisch aktiven Substanz mittels Reduktion an einer wie in Schritt (v) definierten Arbeitselektrode WRed zu der ersten elektrochemisch aktiven Substanz erfolgt; (b) die erste elektrochemisch aktive Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Verbindungen, die wenigstens eine OH-Gruppe aufweisen, die direkt an ein C-Atom eines aromatisches Ringsystems gebunden ist, bevorzugter Phenolen, wobei weiter bevorzugt das genannte aromatische Ringsystem, insbesondere der Phenylring substituiert ist, besonders bevorzugt substituiert ist mit der Aminogruppe, und am meisten bevorzugt p-Aminophenol ist; und/oder (c) die zweite elektrochemisch aktive Substanz eine oxidierte Form der ersten elektrochemisch aktiven Substanz, bevorzugt enthaltend eine Chinoniminstruktur, besonders bevorzugt p-Chinonimin ist.
  27. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 26, wobei die Umsetzung der dritten elektrochemisch aktiven Substanz zu der vierten elektrochemisch aktiven Substanz in Schritt (vi) entweder (a) durch Reduktion erfolgt im Falle der Oxidation der ersten elektrochemisch aktiven Substanz, oder (b) durch Oxidation erfolgt im Falle der Reduktion der ersten elektrochemisch aktiven Substanz.
  28. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 27, wobei die dritte und vierte elektrochemisch aktive Substanz ein Redox-Paar bilden, das bei einem Redoxcyclisierungspotential redoxcyclisiert wird, das wenigstens 300 mV höher als die in Schritt (v) des Verfahrens in Anspruch 19 definierte Potentialdifferenz zwischen den Arbeitselektroden liegt, wobei die dritte/vierte elektrochemisch aktive Substanz bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus gelöstem Sauerstoff/H2O2, gelöstem Luftsauerstoff/H2O2 und p-Benzochinon/p-Hydrochinon, besonders bevorzugt gelöster Luftsauerstoff/H2O2 ist.
  29. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 28, wobei (a) die Arbeitselektroden in ihren elektrischen Potentialen floatend sind; (b) keine weiteren Elektroden, insbesondere keine weiteren Arbeitselektroden, keine Gegenelektrode und keine Referenzelektrode, verwendet werden; (c) zur Einstellung der Potentialdifferenz in Schritt (v) eine Spannungsquelle verwendet wird; und/oder (d) die Schritte (iv) bis (vii), gegebenenfalls (iv) bis (viii), im Lock-Spot-Modus unter Verschluß des Sensorelementes oder jedes einzelnen Sensorelements eines Sensorarrays mit einem Deckel durchgeführt werden, wobei die hierin unter (a) definierte Option bevorzugt ist, die Kombination der hierin unter (a) und (b) oder (a) und (c) definierten Optionen bevorzugter ist, die Kombination der hierin unter (a), (b) und (c) definierten Optionen noch weiter bevorzugt ist, und die Kombination der hierin unter (a) bis (d) definierten Optionen am meisten bevorzugt ist.
  30. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 29, wobei während der gesamten Dauer der Schritte (v) bis (vii), gegebenenfalls der Schritte (v) bis (viii) (a) die erste Arbeitselektrode als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx und die zweite Arbeitselektrode als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed, oder (b) die erste Arbeitselektrode als WRed und die zweite Arbeitselektrode als WOx geschaltet ist, und wobei in jedem Fall WOx ein höheres elektrisches Potential aufweist als WRed.
  31. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 19 bis 29, wobei während der gesamten Dauer der Schritte (v) bis (vii), gegebenenfalls der Schritte (v) bis (viii), die erste und zweite Arbeitselektrode im Wechsel als oxidierend wirkende Arbeitselektrode WOx und als reduzierend wirkende Arbeitselektrode WRed geschaltet werden, wobei WOx ein höheres elektrisches Potential aufweist als WRed.
  32. Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei das Potential der Arbeitselektroden gepulst wird und abwechselnd Meßphasen sowie Relaxationsphasen zur Relaxation des um wenigstens eine der Arbeitselektroden gebildeten Konzentrationsgradienten wenigstens einer elektrochemisch aktiven Substanz gebildet werden.
  33. Verfahren gemäß Anspruch 32, wobei in Schritt (vii) die amperometrische Messung des zwischen den Arbeitselektroden fließenden Stromes am Ende der Meßphase erfolgt.
  34. Verfahren gemäß Anspruch 32 oder 33, wobei (a) bei der Messung von Oxidationsströmen während der Relaxationsphase ein hinreichendes Reduktionspotential eingestellt wird und die während der Meßphase oxidierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies wieder reduziert werden; oder (b) bei der Messung von Reduktionsströmen während der Relaxationsphase ein hinreichendes Oxidationspotential eingestellt wird und die während der Meßphase reduzierten und noch vor der Elektrode befindlichen Spezies wieder oxidiert werden.
  35. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 32 bis 34, wobei die Wiederholrate für das gepulste Redoxcycling wenigs tens 1/10 Hz beträgt.
  36. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 32 bis 35, wobei das gepulste Redoxcycling mit vorgebbaren Impulsformen, vorzugsweise mit einem Rechteck-, Dreieck- oder Sinus-Verlauf, durchgeführt wird.
  37. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 32 bis 36, wobei die Relaxationsphase wenigstens so lang ist wie die Meßphase.
  38. Verfahren gemäß Anspruch 37, wobei die Relaxationsphase erheblich länger, bevorzugt 3- bis 7-mal länger ist als die Meßphase.
  39. Verfahren gemäß Anspruch 38, wobei bei einer Wiederholrate von 1 Hz die Pulslänge der Meßphase 100 bis 300 ms, vorzugsweise 250 ms, und die Pulslänge der Relaxationsphase zwischen 700 und 900 ms, vorzugsweise 750 ms, beträgt.
  40. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 32 bis 39, wobei die Potentialdifferenz derart gewählt wird, daß die Umsetzungen der ersten und zweiten elektrochemisch aktiven Substanz im Diffusionsgrenzstrombereich ablaufen.
  41. Sensorelement wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 definiert und speziell angepaßt zur Anwendung in einem Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 19 bis 40 definiert.
  42. Sensorarray wie in irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18 definiert und speziell angepaßt zur Anwendung in einem Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 19 bis 40 definiert.
  43. Analysevorrichtung umfassend (a) wenigstens eine Durchflußzelle umfassend wenigstens ein Sensorarray wie in irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18 oder 42 definiert, (b) wenigstens eine Spannungsquelle wie in Anspruch 29 definiert mit elektrischen Kontakten zu der ersten und zweiten Arbeitselektrode wenigstens eines Sensorelementes auf wenigstens einem wie unter (a) definierten Sensorarray, und (c) wenigstens ein Amperemeter mit elektrischen Kontakten zu der ersten und zweiten wie unter (b) definierten Arbeitselektrode.
  44. Analysevorrichtung gemäß Anspruch 43, zusätzlich umfassend wenigstens eine Lock-Spot-Vorrichtung mit einem Deckel je Sensorelement des Sensorarrays.
  45. Analysevorrichtung gemäß Anspruch 43 oder 44, wobei die Anzahl der (a) Sensorarrays von 1 bis 96, (b) Durchflußzellen von 1 bis 96, (c) Spannungsquellen von 1 bis 96, (d) Amperemeter von 1 bis 96, und/oder (e) Lock-Spot-Vorrichtungen mit je 1 bis 96 Deckeln 1 bis 96 beträgt, wobei vorzugsweise die Anzahl der Durchflußzellen von 1 bis 96 beträgt, und die Anzahl der Sensorarrays, Spannungsquellen, Amperemeter und Lock-Spot-Vorrichtungen jeweils gleich der Anzahl der Durchflußzellen ist.
  46. Analysekit umfassend (a) wenigstens einen Marker wie in irgendeinem der Ansprüche 19 und 21 bis 23 definiert, und (b) wenigstens eine Indikatorsubstanz wie in Anspruch 19 oder 24 definiert.
  47. Analysekit gemäß Anspruch 46 zusätzlich umfassend wenigstens ein Enzym wie in Anspruch 19, 23 unter (b) oder 25 definiert, das gegebenenfalls an einen Linker gebunden ist.
  48. Analysekit gemäß Anspruch 46 oder 47 zusätzlich umfassend wenigstens eine dritte elektrochemisch aktive Substanz wie in Anspruch 19 oder 28 definiert.
  49. Analysekit gemäß irgendeinem der Ansprüche 46 bis 48 zusätzlich umfassend wenigstens ein Sensorelement wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 oder 41 definiert oder wenigstens ein Sensorarray wie in irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18 oder 42 definiert.
  50. Verwendung eines Sensorelements wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 oder 41 definiert in einem Immunoassay.
  51. Verwendung gemäß Anspruch 50, wobei der Immunoassay ein kompetitiver Immunoassay oder Sandwich-Immunoassay, bevorzugt ein Sandwich-Immunoassay ist.
  52. Verwendung eines Sensorelements wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12 oder 41 definiert in einem Hybridisierungsassay.
  53. Verwendung eines Sensorarrays wie in irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18 oder 42 definiert in einem Immunoassay.
  54. Verwendung gemäß Anspruch 53, wobei der Immunoassay ein kompetitiver Immunoassay oder Sandwich-Immunoassay, bevorzugt ein Sandwich-Immunoassay ist.
  55. Verwendung eines Sensorarrays wie in irgendeinem der Ansprüche 13 bis 18 oder 42 definiert in einem Hybridisierungsassay.
  56. Verwendung einer Analysevorrichtung wie in irgendeinem der Ansprüche 43 bis 45 definiert in einem Immunoassay.
  57. Verwendung gemäß Anspruch 56, wobei der Immunoassay ein kompetitiver Immunoassay oder Sandwich-Immunoassay, bevorzugt ein Sandwich-Immunoassay ist.
  58. Verwendung einer Analysevorrichtung wie in irgendeinem der Ansprüche 43 bis 45 definiert in einem Hybridisierungsassay.
  59. Verwendung eines Analysekits wie in irgendeinem der Ansprüche 46 bis 49 definiert in einem Immunoassay.
  60. Verwendung gemäß Anspruch 59, wobei der Immunoassay ein kompetitiver Immunoassay oder Sandwich-Immunoassay, bevorzugt ein Sandwich-Immunoassay ist.
  61. Verwendung eines Analysekits wie in irgendeinem der Ansprüche 46 bis 49 definiert in einem Hybridisierungsassay.
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