CN109477813A - 基于光学的纳米孔测序 - Google Patents

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Abstract

在某些方面中，本发明涉及分析多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：将具有预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；将多核苷酸易位穿过纳米孔，其中多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中纳米孔在空间上定向荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子大体上不响应于激发光束；当具有荧光标记物的核苷酸离开纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有预先确定的偏振状态的激发光束的激发时，检测由荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及由荧光信号的变化来识别离开纳米孔的核苷酸。

Description

基于光学的纳米孔测序
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年7月5日提交的美国临时专利申请第62/358,552号的优先权的益处，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
背景
纳米孔测序(nanopore sequencing)已经被提出作为克服当前DNA测序技术中的一系列挑战的方法，包括降低每次运行的测序成本、简化样品制备、减少运行时间、增加序列读取长度、提供实时样品分析及类似方法。然而，用纳米孔的聚合物分析，例如DNA分析，具有其自身的一系列技术困难，例如可靠的纳米结构制造、DNA易位速率(translocationrate)的控制、明确的核苷酸识别、来自纳米标度传感器(nanoscale sensor)的大的阵列的信号的检测和处理等等，例如Branton等人，Nature Biotechnology,26(10):1146-1153(2008)。
核苷酸的光学检测已经被提出作为纳米孔测序领域中一些技术困难的潜在解决方案，比如例如，从纳米孔的大阵列收集独立信号的困难。然而，实施光学方法存在许多挑战，特别是在光学噪音的显著背景下，测量易位多核苷酸时来自单个分子标记物的光学信号的困难。来自单个分子的荧光信号的测量已经被进行，并且已经通过将分子的荧光吸收偶极子(fluorescent absorption dipole)与激发光的电场矢量的方向对齐被优化，例如Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy，第三版(Springer,2006)；Moerner等人，Review of Scientific Instruments,74(8):3597-3619(2003)；Michalet等人，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,32:161-182(2003)，但所使用的技术未曾被应用于纳米孔测序。
鉴于上文，如果方法可用于对齐或定向荧光标记物以用于优化的信号产生和检测，那么可以解决纳米孔测序中的光学信号的低信噪比(signal-to-noise ratio)的挑战。
发明概述
本发明涉及用于多核苷酸分析的方法和装置，所述多核苷酸分析使用纳米孔来对齐和/或定向荧光吸收偶极子(fluorescent absorption dipole)用于优先激发或静止。
在一个方面中，本发明涉及分析多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将具有预先确定的偏振状态(polarization state)的激发光束引导至纳米孔；(b)将多核苷酸易位穿过纳米孔，其中多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中纳米孔在空间上定向荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子大体上不响应于激发光束；(c)当具有荧光标记物的核苷酸离开纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有预先确定的偏振状态的激发光束的激发时，检测由荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及(d)从荧光信号的变化识别离开纳米孔的核苷酸。
本发明通过使用纳米孔在空间上限制和定向荧光标记物的吸收偶极子，有利地克服了基于光学的纳米孔测序(optically based nanopore sequencing)领域的以上问题。本发明的这些优点和其他优点在许多实施方式和应用中被例示，其中的某些在下文和整个说明书中被总结。
附图简述
图1A-1B图示出了本发明的示例性实施方案。
图2图示出了采用相互猝灭荧光标记物和自猝灭荧光标记物的本发明的实施方案。
图3A-图3B图示出了使用蛋白质纳米孔(protein nanopore)和在纳米孔阵列上具有金属层的落射照明(epi-illumination)以减小背景或具有FRET激发的TIR的本发明的实施方案。
图3C-图3D图示出了采用猝灭剂的实施方案。
图4图示出了共聚焦落射照明系统的基本部件。
图5图示出了用于激发纳米孔阵列中或附近的光学标记物而不产生FRET信号的TIRF系统的元件。
图6是流程图，其图示出了用于基于包括来自多种光学标记物的光的光学信号的测量来调用(calling)核苷酸序列的步骤。
图7A-图7C图示出了采用两种和三种荧光标记物的实施方案。
发明详述
虽然本发明适于多种修改和替代形式，但其细节已经在附图中通过实例的方式被示出并且将被详细地描述。然而，应当理解，本发明不将本发明限于所描述的特定实施方案。相反，意图覆盖落在本发明的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。例如，为了说明的目的，示出了本发明的特定的纳米孔类型和数目、特定的标记物、FRET对、检测方案、制造方法。然而，应当理解，本公开内容不意图在这方面是限制性的，因为其他类型的纳米孔、纳米孔的阵列和其他制造技术可以被用于实施本文讨论的系统的多个方面。本发明的方面的指南在对本领域普通技术人员熟知的许多可用的参考文献和专著中找到，包括例如Cao,Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press,2004)；Levinson,Principlesof Lithography，第二版(SPIE Press,2005)；Doering和Nishi，编辑，Handbook ofSemiconductor Manufacturing Technology，第二版(CRC Press,2007)；Sawyer等人，Electrochemistry for Chemists，第2版(Wiley Interscience,1995)；Bard和Faulkner,Electrochemical Methods:Fundamentals and Applications，第2版(Wiley,2000)；Lakowicz,Principles of Fluorescence Spectroscopy，第3版(Springer,2006)；Hermanson,Bioconjugate Techniques，第二版(Academic Press,2008)及类似参考文献和专著，这些参考文献和专著的相关部分据此通过引用并入。
在一个方面中，本发明涉及用于使用纳米孔和光学检测来分析多核苷酸例如DNA、RNA及类似物的方法和装置。在一个方面中，本发明采用选择的纳米孔不仅用于限制核苷酸以单个文件(file)的方式移动穿过检测区，而且还用于在易位期间定向荧光标记物，使得它们的吸收偶极子不响应于具有预先确定的偏振状态的激发光束，如图1A中示意性地图示的。每当核苷酸从纳米孔中出现时，它们的荧光标记物获得旋转和移动的自由度，使得它们可以被激发光束激发，以产生在发射的荧光中的跳跃，然后所述跳跃可以被用于识别出现的核苷酸。在某些实施方案中，激发光束的预先确定的偏振状态是其中光束的电矢量大体上正交于核苷酸标记物的特定组的吸收偶极子的状态。在某些实施方案中，预先确定的偏振状态可以包括圆极化(circular polarization)；在其他实施方案中，预先确定的偏振状态可以包括线极化(linear polarization.)。在另外的实施方案中，预先确定的偏振状态可以包括使用的激发光束的数目及其相对于纳米孔(例如，纳米孔的钻孔的轴线)的入射角。在某些实施方案中，可以采用多于一个激发光束，每个激发光束具有其自身的预先确定的偏振状态。在某些实施方案中，预先确定的偏振状态具有大体上与纳米孔中的荧光标记物的吸收偶极子对齐的电场矢量。在其他实施方案中，预先确定的偏振状态具有大体上正交于纳米孔中的荧光标记物的吸收偶极子的电场矢量。在某些实施方案中，预先确定的偏振状态具有与纳米孔中的荧光标记物的吸收偶极子最大地对齐的电场矢量。在其他实施方案中，预先确定的偏振状态具有最大地正交于纳米孔中的荧光标记物的吸收偶极子的电场矢量。
在上文方面中，核苷酸标记物的特定组是被附接至纳米孔内的核苷酸的核苷酸标记物，核苷酸标记物的吸收偶极子已经被限制于受限的定向，这致使标记物大体上不响应于激发光束，然而邻近纳米孔的入口和/或出口的标记物没有被如此限制并且响应于通过具有预先确定的偏振状态的光的激发。在某些实施方案中，本发明的上文方面可以用以下步骤来实施：(a)将具有预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；(b)将多核苷酸易位穿过纳米孔，其中多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中纳米孔在空间上定向荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子大体上不响应于激发光束；(c)当具有荧光标记物的核苷酸离开纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有预先确定的偏振状态的激发光束的激发时，检测由荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及(d)从荧光信号的变化来识别离开纳米孔的核苷酸。在某些实施方案中，预先确定的偏振状态是圆极化，其中包括激发光束的电场矢量的平面大体上垂直于纳米孔的轴线，或大体上垂直于易位穿过纳米孔的方向。在某些实施方案中，当核苷酸离开纳米孔时的荧光信号的变化是荧光数量级的增加，这是由于当荧光标记物的吸收偶极子变为可移动时，荧光标记物变得能够激发和发射。在某些实施方案中，荧光水平的这样的变化在小于1毫秒，或小于0.1毫秒，或小于0.01毫秒的时间段内发生。在某些实施方案中，荧光水平的这样的变化持续直到荧光标记物移出检测体积(detection volume)，或被邻近核苷酸的标记物猝灭，或被漂白。在某些实施方案中，这样的变化持续至少0.01毫秒，或至少0.1毫秒，或至少0.5毫秒。
在另一个方面中，本发明采用如上文的纳米孔不仅用于限制核苷酸以单个文件的方式移动穿过检测区，而且还用于在易位期间定向荧光标记物，使得荧光标记物的吸收偶极子最大地响应于具有预先确定的偏振状态的激发光束，如在图1B中示意性地图示的。在此方面中，每当核苷酸在纳米孔中时，所述核苷酸的荧光标记物产生指示核苷酸的光学信号。在图1B的实施方案中，通过将激发光束(118)以角度θ(133)引导至包括纳米孔(116)的膜(110)来实现激发光束的极化和纳米孔(129)中的荧光标记物的定向的吸收偶极子的对齐，选择角度θ(133)，使得吸收偶极子大体上位于由电场矢量(132)界定的平面内。因为预计多种标记的核苷酸在易位期间占据纳米孔(例如，3种至10种，取决于所使用的特定的纳米孔)，所以收集到的光学信号可以包括来自纳米孔中的某些或所有核苷酸的标记物的单独的光学信号，并且在某些情况下，包括来自纳米孔之外的核苷酸的标记物的光学信号。因此，在这样的实施方案中，可能需要用于分离或以其他方式分析检测到的信号的一个或更多个另外的步骤，以从这样的混合光学信号中获得核苷酸特性(identity)，如下文更充分地描述的。
在上文方面的两个的某些实施方案中，相互猝灭荧光标记物和自猝灭荧光标记物可以被用于减少不期望的光学信号，这进而减少了从混合光学信号中识别单独的核苷酸的困难。如下文更充分地描述的，在这样的实施方案中，选择邻近核苷酸的标记物，使得在纳米孔之外的自由溶液中，邻近核苷酸的标记物猝灭彼此的荧光发射。
初始描述的方面的示例性实施方案在图1A-图1B、图2和图3中图示出。在图1A中，单链多核苷酸(100)被示出从顺式(-)室易位穿过在膜(110)中形成的纳米孔(116)至反式(+)室。通过本发明的方法分析的多核苷酸可以是单链的或双链的。例如，在某些实施方案中，标记的单链多核苷酸通过在标记的前体的存在下使5’-结尾的引物(其可以是来自感兴趣的来源的核酸样品的组分)在模板上延伸来产生，这之后将5’-尾部插入到纳米孔中，并且标记的链在易位的过程中从模板链解链(unzip)。在其他实施方案中，双链延伸产物可以被完整地易位穿过纳米孔，而不解链。在后者实施方案中，可能需要具有比在单链多核苷酸分析物的情况下使用的纳米孔的直径更大的直径的纳米孔。
多核苷酸的核苷酸(100)被图示为沿着主链(102)的填充圆(filled circle)(例如112)或图案化的圆(patterned circle)(例如104)，主链(102)被图示为虚箭头。填充圆代表一种类型的核苷酸(例如A)，而图案填充圆代表不同类型的核苷酸(例如C、G或T，或者在2种标记物实施方案中，相同的标记物可以被附接至所有三种核苷酸)。每种核苷酸具有能够产生指示核苷酸的有区别的荧光信号的荧光标记物(例如106)。在这种情况下，显示两种荧光标记物，“a”(例如105)，其被附接至由填充圆(例如112)表示的核苷酸，和“b”(例如106)，其被附接至由图案化圆(例如104)表示的核苷酸，“a”和“b”表示产生可区分的光学信号的荧光标记物。荧光标记物“a”和“b”各自具有吸收偶极子，所述吸收偶极子定义其中标记物有效地吸收来自具有共对齐的电场矢量(co-aligned electrical field vector)的激发光束的光能的方向。在一个方面中，本发明包括本发明人的认识和理解，即，荧光吸收偶极子和激发光束的偏振状态可以通过纳米孔来配置或定向，以在基于光学的纳米孔测序的情况下优化单种荧光标记物的检测。根据此方面的实施方案，纳米孔(116)被定尺寸，使得纳米孔(116)内的荧光标记物例如标记物“a”和“b”的吸收偶极子在大体上正交于来自激发光束(118)的光的偏振状态的公共方向(common direction)(114)上被定向，该激发光束被示出为被在正交于纳米孔(116)的轴线的平面内旋转的电场矢量(132)圆极化。也就是，来自激发光束(118)的光可以被圆极化，使得电场矢量在垂直于多核苷酸(100)的易位方向(例如，由线102限定)的平面内循环。在其他实施方案中，可以采用具有不同偏振状态的激发光束。
不意图受下文限制，据信由于纳米孔(例如，116)的直径为附接至碱基的荧光标记物的自由旋转提供更小的空间，偶极子的取向发生，并且易位多核苷酸的标记物因此在空间上被限制于特定的定向，以允许穿过纳米孔(在上文方面中，该定向致使多核苷酸的标记物不响应于通过具有预先确定的偏振状态的激发光束的激发)。每当标记的核苷酸进入(107)或离开(115)纳米孔(116)时，待被检测的光学信号受影响，典型地表现为(分别)与核苷酸标记物的波长特性相关的光学信号强度的降低或增加，并且取决于特定实施方案的特征，例如光学系统的细节(例如落射照明、TIR等)、激发光束的方向、检测区的范围(extent)或体积(例如130)、所采用的极化类型、相互猝灭标记物或自猝灭标记物的存在或不存在、标记物漂白的倾向，等等。在某些实施方案中，其中检测区涵盖纳米孔(116)的入口(107)和出口(115)两者，自由旋转状态至定向状态(在进入纳米孔(116)时)和定向状态至自由旋转状态(在离开纳米孔(116和223)时)之间的转变由从检测区(130)收集到的光学信号强度(131)的跳跃反映。有助于这样的跳跃的光学信号的分量的区别特性可以被用于识别进入和/或离开纳米孔(116)的核苷酸。在某些实施方案中，选择特征(例如，检测区或信号收集体积)，使得跳跃，即信号强度的突然变化或快速变化，大体上仅由于离开纳米孔(116)的标记的核苷酸。
在某些实施方案中，选择荧光标记物，使得它们当被附接至自由溶液中多核苷酸的邻近核苷酸时自猝灭或相互猝灭；也就是，特别是被用于将标记的多核苷酸易位穿过纳米孔的缓冲溶液。这样的自猝灭荧光标记物或相互猝灭荧光标记物减少背景信号并且限制荧光标记物能够被激发的时间；或者换句话说，它们将其中产生荧光信号的体积限于邻近纳米孔(116)的出口(115)的区域。自猝灭荧光标记物和相互猝灭荧光标记物的用途在美国专利公布2016/0122812中公开，该专利通过引用并入本文。简言之，图2图示出了当采用具有有区别的信号的两种荧光标记物时，自猝灭荧光标记物和相互猝灭荧光标记物的用途。标记的单链多核苷酸(200)被示出易位穿过纳米孔(116)。如在图1中，不同的标记物“a”和“b”被附接至两种不同类型的核苷酸，其再次被表示为填充圆和图案化圆。在这种情况下，选择“a”和“b”，使得当相同的标记物在自由溶液中的邻近核苷酸上时，每种自猝灭，或者当不同的标记物在自由溶液中的邻近核苷酸上时，相互猝灭。纳米孔(116)内的核苷酸(114)的荧光标记物受限制，使得吸收偶极子大体上正交于激发光束(118)的电矢量定向，使得很少或没有激发发生。当核苷酸离开纳米孔(116)时，当多核苷酸(200)移动到反式室的自由溶液中时，在重新采取自猝灭的配置或相互猝灭的配置之前，核苷酸的标记物变为可移动且适于在区域(206)中激发。
如上文提及的，许多光学系统和纳米孔配置可以与本发明一起使用。图3A图示出了一个实施方案的部件，在所述实施方案中，蛋白质纳米孔(300)被布置在脂质双层(302)中，所述脂质双层(102)(进而)被布置成跨过固态膜(306)的孔(304)，所述固态膜(306)包括不透明层(308)(例如金属层)、氮化硅层(310)和硅支撑层(312)。不透明层(308)防止或减少激发光束(314)透射穿过固态膜(306)，在所述固态膜(306)中所述激发光束(314)可以激发不期望的背景荧光。当具有不同标记的单体的多核苷酸(320)(如上文，被图示为填充圆(322)和图案化圆(324))穿过纳米孔(300)时，吸收偶极子(例如305)被定向成致使它们不响应于激发光束(314)。
图3B图示出了与图3A类似的配置，其中量子点(3130)被附接至邻近其反式侧出口的蛋白质纳米孔(300)，使得每当荧光标记物从出口出现(并且获得移动自由度)，它就在量子点(3130)的FRET距离(3128)内。因此，在离开后，荧光标记物变为能够FRET激发。
采用相互猝灭标记物和自猝灭标记物的实施方案
在某些实施方案中，除了猝灭剂之外，还可以使用自猝灭荧光标记物和相互猝灭荧光标记物，以便减少来自离开纳米孔的核苷酸上的标记物的荧光发射之外的荧光发射。这样的荧光标记物的用途在美国专利公布2016/0122812中公开，该专利通过引用并入。在某些实施方案中，单体被标记有荧光标记物，所述荧光标记物当被附接至目标多核苷酸(target polynucleotide)时能够具有至少三种状态：(i)大体上猝灭状态，其中附接的荧光标记物的荧光通过紧密邻近的单体上的荧光标记物来猝灭；例如，当标记的多核苷酸在用于研究和操纵多核苷酸的常规水溶液中处于游离(free)时，被附接至根据本发明的多核苷酸的荧光标记物被大体上猝灭。(ii)空间受限状态，其中标记的多核苷酸被易位穿过纳米孔，使得附接的荧光标记物的自由溶液运动或排列被破坏或受限制，使得存在很少或不存在由荧光标记物产生的可检测的荧光信号，(iii)转变(transition)状态，其中在多核苷酸易位穿过纳米孔的同时，当荧光标记物离开纳米孔时(在“转变间隔”期间)，被附接至多核苷酸的荧光标记物从空间受限状态转变到猝灭状态。
部分地，该实例是以下发现的应用：在转变间隔期间，荧光标记物(在另外大体上充分地标记的且自猝灭的多核苷酸上)能够产生可检测的荧光信号。不受任何基于此发现的理论所限制的意图，据信在转变间隔期间产生的荧光信号是由于从纳米孔出现的荧光标记物中的自由可旋转的偶极子的存在，这致使荧光标记物暂时地能够产生荧光信号，例如在直接激发之后或经由FRET。在空间受限状态以及猝灭状态两者中，偶极子在其旋转自由度方面受限制，从而减少或限制发射的光子的数目。在某些实施方案中，多核苷酸是通常为单链多核苷酸的多核苷酸，例如DNA或RNA，但特别是单链DAN。在某些实施方案中，本发明包括用于通过以下来确定多核苷酸的核苷酸序列的方法：在多核苷酸易位穿过纳米孔时记录当附接的荧光标记物一次一种地离开纳米孔时，由附接的荧光标记物产生的信号。在离开后，在转变间隔期间，每种附接的荧光标记物从纳米孔中的受限状态转变成自由溶液中的多核苷酸上的猝灭状态。换句话说，在某些实施方案中，本发明的方法的步骤包括当每种荧光标记物从纳米孔中的受限状态转变成自由溶液中的多核苷酸上的猝灭状态时，激发每种荧光标记物。如上文提及的，在此转变间隔或时间段期间，荧光标记物能够发射指示其被附接至的核苷酸的可检测的荧光信号。
在某些实施方案中，本发明包括以下发现的应用：可以选择荧光标记物和纳米孔，使得在多核苷酸易位穿过纳米孔期间，被附接至单体的纳米孔荧光标记物被迫进入受限状态，在该受限状态下，所述纳米孔荧光标记物不能(或大体上不能)产生可检测的荧光信号。在某些实施方案中，选择具有带有在从1nm至4nm的范围内的直径的钻孔或腔的纳米孔；在其他实施方案中，选择具有带有在从2nm至3nm的范围内的直径的钻孔或腔的纳米孔。在某些实施方案中，这样的钻孔直径由蛋白质纳米孔来提供。在某些实施方案中，这样的纳米孔被用于迫使荧光标记物进入根据本发明的受限状态，使得每当荧光标记物离开纳米孔，它从大体上不能产生荧光信号转变成通过其可以被诱导以发射的荧光信号可检测且可识别的。因此，当被附接至多核苷酸的单体的序列的每个的荧光标记物在紧密邻近纳米孔出口的区域(“转变区”或“转变体积”或“检测区”)中突然产生荧光信号时，它们可以依次被检测。在某些实施方案中，有机荧光染料被用作具有上文直径的纳米孔的荧光标记物。在某些实施方案中，至少一种这样的有机荧光染料选自由以下组成的组：呫吨染料、罗丹明染料和花青染料。用于确定多核苷酸的单体序列的某些实施方案可以用以下步骤进行：(a)将多核苷酸易位穿过纳米孔，其中多核苷酸的单体被标记有荧光标记物，其中纳米孔将其钻孔内的荧光标记物限制成受限状态，使得大体上没有可检测的荧光信号在其中产生；(b)将具有预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔，以在每种单体的荧光标记物从纳米孔离开时，激发每种单体的荧光标记物；(c)测量由离开的荧光标记物产生的检测区中的荧光信号，以识别荧光标记物被附接至其的单体；(d)猝灭来自检测区外的激发的荧光标记物的荧光信号，以及(d)从荧光信号的序列确定多核苷酸的单体序列。在另外的实施方案中，荧光标记物是FRET对的受体，并且FRET对的一个或更多个供体在出口的FRET距离内被附接至纳米孔。
在某些实施方案中，如上文使用的“大体上猝灭的”意指荧光标记物产生由在相同条件下产生的信号减少至少百分之三十的荧光信号，而不具有邻近相互猝灭的标记物。在某些实施方案中，如上文使用的“大体上猝灭的”意指荧光标记物产生由在相同条件下产生的信号减少至少百分之五十的荧光信号，而不具有邻近相互猝灭的标记物。
在某些实施方案中，目标多核苷酸的核苷酸序列通过进行四种单独的反应来确定，其中目标多核苷酸的拷贝具有用单个荧光标记物标记的其四种不同类型的核苷酸(A、C、G和T)中的每种。在这样的实施方案的变型中，目标多核苷酸的核苷酸序列通过进行四种单独的反应来确定，其中目标多核苷酸的拷贝具有用一个荧光标记物标记的其四种不同类型的核苷酸(A、C、G和T)中的每种，而同时，相同目标多核苷酸上的其他核苷酸被标记有第二荧光标记物。例如，如果第一荧光标记物在第一反应中被附接至目标多核苷酸的A'，那么第二荧光标记物在第一反应中被附接至目标多核苷酸的C'、G'和T'(即，被附接至“非-A”核苷酸)。同样地，在该实例的继续中，在第二反应中，第一标记物被附接至目标多核苷酸的C'，而第二荧光标记物被附接至目标多核苷酸的A'、G'和T'(即，被附接至“非-C”核苷酸)。并且对于核苷酸G和T，也是如此。
相同的标记方案可以根据用于核苷酸类型的子组(subset)的常规术语来表达；因此，在上文实例中，在第一反应中，第一荧光标记物被附接至A'并且第二荧光标记物被附接至B'；在第二反应中，第一荧光标记物被附接至C'并且第二荧光标记物被附接至D'；在第三反应中，第一荧光标记物被附接至G'并且第二荧光标记物被附接至H'；以及在第四反应中，第一荧光标记物被附接至T'并且第二荧光标记物被附接至V'。
在某些实施方案中，聚合物例如多核苷酸或肽可以被标记有被附接至单种类型的单体的单种荧光标记物，例如，多核苷酸的每一个T(或大体上每一个T)被标记有荧光标记物，例如花青染料。在这样的实施方案中，来自多核苷酸的荧光信号的集合(collection)或序列可以形成用于特定多核苷酸的特征或指纹(fingerprint)。在某些这样的实施方案中，这样的指纹可以提供或可以不提供关于待被确定的单体的序列的足够的信息。
在某些实施方案中，本发明的特征是将多核苷酸分析物的大体上所有单体标记有荧光染料或标记物，所述荧光染料或标记物是相互猝灭组的成员。提到标记多核苷酸分析物的术语“大体上所有”的使用是对化学标记技术和酶促标记技术典型地小于100％有效的承认。在某些实施方案中，“大体上所有”意指具有附接的荧光标记物的所有单体的至少80％。在其他实施方案中，“大体上所有”意指具有附接的荧光标记物的所有单体的至少90％。在其他实施方案中，“大体上所有”意指具有附接的荧光标记物的所有单体的至少95％。荧光染料的相互猝灭组具有以下性质：(i)每个成员猝灭每一个成员的荧光(例如，通过FRET或通过静态机制或接触机制)，以及(ii)当被激发并当处于非猝灭状态时，每个成员产生有区别的荧光信号。也就是，如果相互猝灭组由两种染料D1和D2组成，那么(i)D1是自猝灭的(例如通过与另一个D1分子接触猝灭)，并且它被D2猝灭(例如通过接触猝灭)，以及(ii)D2是自猝灭的(例如通过与另一个D2分子接触猝灭)，并且它被D1猝灭(例如通过接触猝灭)。用于选择用于相互猝灭组的荧光染料或荧光标记物的指南可以在以下参考文献中找到，所述参考文献通过引用并入本文：Johansson,Methods in Molecular Biology,335:17-29(2006)；Marras等人，Nucleic Acids Research,30:el22(2002)；及类似参考文献。在某些实施方案中，相互猝灭组的成员包括组分或部分能够堆叠相互作用的有机荧光染料，例如芳香族环结构。荧光染料或标记物的示例性的相互猝灭组可以选自罗丹明染料、荧光素染料和花青染料。在一个实施方案中，相互猝灭组可以包括罗丹明染料TAMRA和荧光素染料FAM。在另一个实施方案中，荧光染料的相互猝灭组可以通过选择来自由以下组成的组中的两种或更多种染料来形成：Oregon Green 488、荧光素-EX、异硫氰酸荧光素、罗丹明红-X、Lissamine罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、一种或更多种BODIPY染料、Texas Red、Oregon Green 514、以及一种或更多种Alexa Fluor。代表性的BODIPY染料包括BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY 581/591、BODIPY TR、BODIPY 630/650以及BODIPY 650/665。代表性的Alexa Fluor包括Alexa Fluor 350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、AlexaFluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、Alexa Fluor 750以及Alexa Fluor 790。
如上文，在某些实施方案中，目标多核苷酸的单体序列通过进行单独的反应(对于每种类型的单体一种)来确定，其中目标多核苷酸的拷贝具有被标记有相互猝灭荧光标记物或自猝灭荧光标记物的每种不同类型的单体。在其他实施方案中，目标多核苷酸的单体序列通过进行单独的反应(对于每种类型的单体一种)来确定，其中目标多核苷酸的拷贝具有被标记有不同的相互猝灭荧光标记物的每种不同类型的单体，所述不同的相互猝灭荧光标记物选自相同的相互猝灭组。在其中相互猝灭组仅包含两种染料的实施方案中，那么选择的单体(即，单体X)被标记有第一相互猝灭的染料，并且每一种其他种类的单体(即，非单体X)被标记有来自相同组的第二相互猝灭的染料。因此，该实施方案的步骤产生两种不同荧光信号的序列，一种指示单体X，而另一种指示非单体X。
在某些实施方案中，当被附接至多核苷酸上的(相同种类的)邻近单体例如多核苷酸的邻近核苷酸时，可以使用为自猝灭的单种荧光标记物(例如被附接至包含多种类型单体的多核苷酸中的单种类型的单体)。示例性的自猝灭荧光标记物包括但不限于OregonGreen 488、荧光素-EX、FITC、罗丹明红-X、Lissamine罗丹明B、钙黄绿素、荧光素、罗丹明、BODIPYS以及Texas Red，例如它们在Molecular Probes Handbook，第11版(2010)中公开。
采用猝灭剂的实施方案
在本发明的某些实施方案中，猝灭剂可以被应用于纳米孔装置中以防止不期望的荧光。例如，猝灭剂可以仅存在于反式室中、仅存在于顺式室中或存在于顺式室和反式室两者中(图3C)。在图3C中，图示出了标记的多核苷酸(3200)，将固相膜(3208)的纳米孔(3206)从顺式室(3202)易位至反式室(3204)。浸没在反式室(3204)中的是由“Q”指定的非荧光猝灭剂(3205)。本发明的猝灭剂在用于标记的多核苷酸(3200)的易位条件下是可溶的，并且在相同条件下，猝灭剂结合至单链多核苷酸例如(3200)，而没有实质的序列特异性。如下文更充分地解释的，许多种非荧光猝灭剂可用于本发明，其包括许多熟知的有机染料的衍生物例如不对称花青染料，以及这样的化合物和寡核苷酸和/或其类似物的缀合物。在此实施方案中，猝灭剂的类型和浓度以及易位速度的选择定义检测区(3210)。在某些实施方案中，“检测区”意指从其中收集荧光信号以形成原始数据的区域或体积(其可以是连续的或非连续的)，从所述原始数据确定关于标记的多核苷酸的信息，例如序列信息。检测区(3210)之外的反式室(3204)中的荧光标记物被结合至反式室(3204)中的标记的多核苷酸(3200)的部分的猝灭剂(3205)大体上猝灭。在某些实施方案中，猝灭剂包括基于有机染料，被缀合至一个或更多个猝灭部分的寡核苷酸或类似物，如下文更充分地描述的。当例如固相膜(3208)是不透明层或包括不透明层使得顺式室(3202)中的荧光标记物大体上不被激发时，可以采用仅在反式室中具有猝灭剂的实施方案。
图3D图示出了包括以下元件的实施方案：蛋白质纳米孔(300)，所述蛋白质纳米孔(300)被布置在脂质双层(302)中；固相膜(306)中的具有不透明层(308)的荧光标记物的落射照明，以防止或减少背景荧光；以及猝灭剂(310)，所述猝灭剂(310)被布置在反式室(326)中。如上文，具有荧光地标记的核苷酸的多核苷酸(320)(标记物由“f”来指示，如同(322))从顺式室(324)被易位穿过纳米孔(300)至反式室(326)。寡核苷酸猝灭剂(310)在允许寡核苷酸猝灭剂(328)杂交至从纳米孔(300)出现的多核苷酸(320)的部分的条件(例如浓度、温度、盐浓度和类似条件)下，被布置在反式室(326)中。可以选择纳米孔(300)，使得来自荧光标记物的信号在经过纳米孔期间被抑制，如在Huber等人，美国专利公布US 2016/0076091中描述的，该专利公布通过引用并入本文。因此，当标记的核苷酸从区域(328)中的纳米孔(300)出现时，它们变得不被抑制并且能够产生信号。在大多数形式(如果不是全部形式)的直接照明(例如非-FRET)的情况下，当这样的出现的标记物进一步行进到反式室(326)中时，它们将继续发射荧光，从而大大地有助于收集的信号。在结合至出现的多核苷酸的反式室(326)中的猝灭剂的情况下，这样的发射可以显著地减少，并且可以定义检测区(328)，从所述检测区(328)，可以分析收集的信号，以给出关于多核苷酸(320)的核苷酸序列信息。在某些实施方案中，当标记的多核苷酸移动穿过检测区(328)时，在检测时间段期间，来自单种荧光标记物的荧光信号从检测区(328)检测。在其他实施方案中，在预先确定的时间段期间，多种荧光信号从检测区(328)中的多种荧光标记物收集。在某些实施方案中，这样的检测时间段小于1毫秒，或小于0.1毫秒，或小于0.01毫秒。在某些实施方案中，这样的检测时间段是至少0.01毫秒，或至少0.1毫秒，或至少0.5毫秒。
本发明的猝灭剂包括在纳米孔测序条件下为以下的任何化合物(或化合物的组)：(i)大体上无荧光，(ii)结合至单链核酸，特别是单链DNA，以及(iii)非辐射地吸收来自其他分子的激发能并将其非辐射地释放。在某些实施方案中，猝灭剂还非共价地结合至单链DNA。许多种猝灭化合物可用于在本发明中使用，包括但不限于常用合成染料例如花青染料和呫吨染料的非荧光衍生物，如下文更充分地描述的。选择猝灭化合物的指南可以在美国专利6,323,337；6,750,024及类似参考文献中找到，这些参考文献通过引用并入本文。
在某些实施方案中，猝灭剂可以是单链DNA结合染料，其已经被已知猝灭荧光的重原子(例如溴或碘)共价地改性，或者被已知猝灭荧光的其他基团例如硝基基团或偶氮基团共价地改性。已知结合单链DNA的染料的实例是Sybr Green(Zipper等人，(2004),NucleicAcids Research.32(12))。将硝基基团、溴基团、碘基团和/或偶氮基团并入到cynanineSybr Green结构中提供单链DNA结合基团部分，所述单链DNA结合基团部分将猝灭可以存在于DNA上的荧光标记物。
在某些实施方案中，猝灭剂包含结合部分和一个或更多个猝灭部分。结合部分可以包括结合至单链核酸而不具有实质序列特异性的任何化合物。结合部分可以包括具有改性的键和/或单体的肽或寡核苷酸或类似物。寡核苷酸及其类似物可以经由双链体形成(duplex formation)或经由非碱基配对适配体结合提供结合至多核苷酸。在某些实施方案中，结合部分包括具有在从6个至60个核苷酸的范围内的长度的寡核苷酸或其类似物。这样的寡核苷酸或类似物可以被缀合至一个猝灭部分或多个猝灭部分。在某些实施方案中，被缀合至每个寡核苷酸或类似物的多个猝灭部分是2个或3个。被缀合至结合部分的猝灭部分可以相同或不同。在某些实施方案中，无论结合部分是寡核苷酸或类似物，两个猝灭部分被缀合至其上，一个在寡核苷酸的5’端，并且一个在寡核苷酸的3’端。可以使用常规的键和合成化学来合成具有从2个至3个猝灭部分的寡核苷酸或类似物，例如，如本文引用的参考文献中公开的。
寡核苷酸或类似物可以作为单种物质来提供，或者它们可以作为具有不同序列，并且因此具有不同结合特异性的多种寡核苷酸或类似物的混合物来提供。在某些实施方案中，寡核苷酸或类似物是随机序列聚合物；也就是，它们是作为给定长度的每一个可能序列的混合物来提供。例如，这样的寡核苷酸或类似物可以由下式表示：对于6聚体为“NNNNNN”，或对于8聚体为“NNNNNNNN”，其中N可以是A、C、G或T，或其类似物。
提到寡核苷酸的“类似物”意指包含一种或更多种核苷酸类似物的寡核苷酸。如定义部分中描述的，“核苷酸类似物”是可以具有改性的键部分、糖部分或碱基部分的核苷酸。可以与本发明一起使用的示例性的寡核苷酸类似物包括但不限于肽核酸(PNA)、锁核酸(locked nucleic acid)(LNA)(2’-O-甲基RNA)、硫代磷酸酯寡核苷酸(phosphorothioateoligonucleotide)、桥接核酸(BNA)或类似物。
在某些实施方案中，寡核苷酸结合部分包含通用碱基；也就是，它们包含可以替代四种天然核苷酸中的任何而不将碱基对相互作用去稳定的一种或更多种核苷酸类似物。具有通用碱基性质的核苷酸类似物在Loakes,Nucleic Acids Research,29(12):2437-2447(2001)中被描述，该参考文献通过引用并入本文。在某些实施方案中，寡核苷酸结合部分包括2’-脱氧肌苷、7-脱氮-2’-脱氧肌苷、2-氮杂-2’-脱氧肌苷、3-硝基吡咯核苷酸、5-硝基吲哚核苷酸或类似物。
在某些实施方案中，猝灭剂可以包括两种或更多种化合物的组合，所述化合物一起作用以猝灭单链标记的多核苷酸的不期望的荧光信号。例如，猝灭剂可以包含寡核苷酸(例如聚脱氧肌苷(polydeoxyinosine))和为猝灭剂的单独地双链嵌入剂，所述寡核苷酸可以与标记的多核苷酸形成双链体。因此，每当聚脱氧肌苷结合至标记的多核苷酸时，猝灭嵌入剂结合至产生的双链体并猝灭来自该多核苷酸的荧光信号。
为了本发明的目的，可以可检测地猝灭标记的多核苷酸的荧光标记物的荧光信号的任何合成染料是可接受的猝灭部分。具体地，如在本发明中使用的，猝灭部分具有吸收波段，所述吸收波段呈现出与标记的多核苷酸上的荧光标记物的发射波段至少某些光谱重叠。在比猝灭部分(受体)的最大吸收波长更低或甚至更高的波长发射最大值处发生的荧光标记物(供体)的发射的情况下，此重叠可以发生，条件是存在足够的光谱重叠。通过将供体的发射转移至受体的较高电子态，还可以发生能量转移。本领域普通技术人员通过检查相对于待被使用的荧光标记物的发射光谱的该染料的激发波段来确定给定的猝灭部分的效用。
典型地，本发明中的荧光猝灭通过本发明的荧光标记物和猝灭部分之间的荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer)(FRET或通过电荷转移复合物的形成)发生。供体化合物和受体化合物的光谱和电子性质对观察到的能量转移的程度具有强的影响，标记的多核苷酸上的荧光标记物和淬灭部分之间的分开距离也是如此。随着分开距离增加，荧光猝灭的程度降低。
猝灭部分可以任选地是荧光的，条件是染料的最大发射波长与荧光标记物当结合至标记的多核苷酸时的最大发射波长良好地分开。然而，优选地，当被共价地缀合至寡核苷酸或类似物时，猝灭部分仅是昏暗荧光的，或大体上是非荧光的。如本文使用的，大体上非荧光的指示如关于本文中任何方法所描述的测定溶液中的猝灭部分的荧光效率小于或等于5％，优选地小于或等于1％。在其他实施方案中，共价结合的猝灭部分呈现出小于约0.1，更优选地小于约0.01的量子收率。在某些实施方案中，在不存在共价结合的猝灭部分下，相对于与相同荧光标记物缔合的相同寡核苷酸，与本发明的猝灭寡核苷酸缔合的荧光标记物的荧光被猝灭大于50％。在另一个实施方案中，相对于未标记的寡核苷酸，荧光标记物被猝灭大于90％。在又一实施方案中，相对于未标记的寡核苷酸，核酸染色被猝灭大于95％。
在某些实施方案中，猝灭部分可以是芘、蒽、萘、吖啶、二苯乙烯、吲哚或苯并吲哚、噁唑或苯并噁唑、噻唑或苯并噻唑、4-氨基-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)、花青、羰花青(carbocyanine)、喹诺酮基(carbostyryl)、卟啉、水杨酸酯、邻氨基苯甲酸酯、薁、苝、吡啶、喹啉、香豆素(包括羟基香豆素和氨基香豆素，以及其氟化衍生物和磺化衍生物(如在Gee等人(1998)的美国专利第5,830,912号和Wang等人(1997)的美国专利第5,696,157号中描述的，其通过引用被并入)、聚氮杂引达省(polyazaindacene)(例如Haugland等人(1988)的美国专利第4,774,339号；Kang等人(1993)的美国专利第5,187,288号；Haugland等人(1993)的美国专利第5,248,782号；Kang等人(1993)的美国专利第5,274,113号；Kang等人(1995年)的美国专利第5,433,896号；Wu等人(1999)的美国专利第6,005,113号，全部通过引用并入)、呫吨、噁嗪或苯并噁嗪、卡巴嗪(carbazine)(Corey(1989)的美国专利第4,810,636号，通过引用并入)、或苯并酮(phenalenone)或苯并酮(benzphenalenone)(Babb等人(1989)的美国专利第4,812,409号，通过引用并入)。
在其他实施方案中，大体上为非荧光染料的猝灭部分特别地包括偶氮染料(例如DABCYL染料或DABSYL染料及其结构类似物)、三芳基甲烷染料例如孔雀石绿或酚红、4',5z-二醚取代的荧光素(美国专利第4,318,846号(1982))、或不对称的花青染料猝灭剂(PCT国际申请WO 99 37,717(1999))。
在其中猝灭部分是呫吨的实施方案中，合成染料任选地是荧光素、对甲氨基酚(Haugland等人(1993)的美国专利第5,227,487号，通过引用并入)或罗丹明。如本文使用的，荧光素包括苯并荧光素(benzofluorescein)或二苯并荧光素、半萘并荧光素(seminaphthofluorescein)或萘并荧光素。类似地，如本文使用的，对甲氨基酚包括半萘酚罗丹荧(seminaphthorhodafluor)(Haugland等人(1990)的美国专利第4,945,171号，通过引用并入)。呫吨包括呫吨染料的氟化衍生物(国际公布第WO 97/39064号，MolecularProbes,Inc.(1997)，通过引用并入)和呫吨染料的磺化衍生物(国际公布第WO99/15517号，Molecular Probes,Inc.(1999)，通过引用并入)。如本文使用的，噁嗪包括试卤灵(resorufm)、氨基噁嗪酮、二氨基噁嗪及其苯并取代的类似物(benzo-substitutedanalog)。
在另外的实施方案中，猝灭部分是3-氨基呫吨和/或6-氨基呫吨的大体上非荧光衍生物，所述3-氨基呫吨和/或6-氨基呫吨在一个或更多个氨基氮原子处被芳香族环体系或杂芳香族环体系取代，例如如在美国专利6,399,392中描述的，该专利通过引用并入本文。这些猝灭染料典型地具有大于530nm的吸收最大值，具有很少或不具有可观察到的荧光，并且有效地猝灭宽光谱的发光发射，例如通过化学发光团、磷光体或荧光团发射。在一个实施方案中，猝灭染料是被取代的罗丹明。在另一个实施方案中，猝灭化合物是被取代的对甲氨基酚。
在另外的其他实施方案中，猝灭部分可以包括在以下专利中描述的一种或更多种被称为Black Hole QuenchersTM化合物(BHQ)的非荧光猝灭剂，这些专利通过引用并入文本：7,019,129；7,109,312；7,582,432；8,410,025；8,440,399；8,633,307；8,946,404；9,018,369；或9,139,610。
另外的猝灭部分在以下专利中公开，这些专利通过引用并入本文：美国专利6,699,975；6,790,945；和8,114,979。
光学信号检测
在某些实施方案中，其中激发光束递送和光学信号收集通过单个物镜发生的落射照明系统可以被用于聚合物分析物上的标记物或纳米孔上的供体的直接照明。用于与本发明一起使用的共聚焦落射照明系统的基本部件在图4中图示。激发光束(402)被引导至二色体(dichroic)(404)并且被引导到(412)物镜(406)上，所述物镜(406)将激发光束(402)聚焦(410)到分层膜(400)上，在所述分层膜(400)中标记物被直接激发以发射光学信号，例如荧光信号，或者其经由FRET相互作用被间接地激发以发射光学信号。这样的光学信号被物镜(406)收集，并且被引导至二色体(404)，所述二色体(404)被选择使得其通过光学信号(411)的光，但反射激发光束(402)的光。光学信号(411)穿过透镜(414)，所述透镜(414)通过针孔(416)将光学信号(411)聚焦并且聚焦到检测器(418)上。
在某些实施方案中，单体上的标记物可以使用类似于图5中示出的设备通过渐逝场(evanescence field)来激发，在Soni等人，Review of Scientific Instruments,81:014301(2010)；和在美国专利公布2012/0135410中描述的，其通过引用并入本文。在该设备中，在纳米孔或纳米孔阵列的反式侧上的非常窄的第二室允许渐逝场从下面的载玻片的表面延伸，以在纳米孔的入口和出口处两者建立激发区，使得与纳米孔相关的每个光学测量包括来自多种标记的单体的贡献。孔的阵列(500)(其可以包括被插入到脂质双层中的蛋白质纳米孔)可以在氮化硅层(502)中形成，所述氮化硅层(502)可以具有在从20nm-100nm的范围内的厚度。氮化硅层(502)可以在硅支撑层(503)上形成。第二室(506)可以由氮化硅层(502)、确定第二室(506)的高度的二氧化硅层(504)和载玻片(510)的表面(508)形成。二氧化硅层(504)可以具有在从50nm-100nm的范围内的厚度。从表面(508)延伸跨过氮化硅层(502)的期望的渐逝场可以通过以相对于载玻片(510)的合适的角度引导光束(512)使得TIR发生来建立。为了驱动标记的多核苷酸分析物穿过阵列(500)，顺式(-)条件可以在第一室(516)中建立，并且反式(+)条件可以在第二室(506)中建立，其中电极可操作地连接至第一室和第二室(506和521)。
用混合光学信号的序列确定
在某些实施方案中，可以从分辨率受限区测量一系列光学信号，其中每个光学测量包括来自不同的邻近单体的多个分量信号(其在聚合物中的顺序不能由单个测量来确定，因为例如分量信号从衍射受限区内产生)。在这些情形下，聚合物的基于光学的纳米孔分析(i)产生光学测量的时间序列，所述时间序列包括来自多于一种标记的单体的序列的重叠贡献(overlapping contribution)，从而使得难以(如果不是不可能的话)由单个测量确定单体的排序，以及(ii)通过选择用于产生可区分信号的单体的光学标记物，光学测量可以被分成来自不同种类的单体上的不同标记物的贡献，这允许重叠测量被转化成序列信息。
在一个方面中，本发明的方法可以通过以下步骤来实施：(a)将聚合物易位穿过纳米孔，其中聚合物的不同种类的单体被标记有产生可区分的光学信号的不同光学标记物，并且其中纳米孔限制单体将单个文件移动穿过包括多种单体的激发区；(b)当聚合物穿过激发区时，检测来自单体的光学信号的时间序列；(c)从不同类型的单体中分离出光学信号；以及(d)由来自聚合物的分离的光信号的时间序列来确定单体的序列。
根据本发明，当标记的聚合物易位穿过纳米孔及其相关的激发区时，记录光学测量的时间排序组。在每个光学测量包括来自邻近单体的标记物的贡献的意义上，在邻近时间点的光学测量是重叠的。因此，例如，如果三种单体在各自时间点产生信号(例如，聚合物...-A-(B-C-D)-...的B、C和D从左至右移动穿过激发区)，并且如果一种单体离开激发区而另一种单体在连续测量之间进入激发区(由括号指示的)(例如，A进入而D离开：-(A-B-C)-D...)，那么两次连续的光学测量将包括来自相同单体的贡献(在此实例中，两次测量均包括来自B和C的贡献)。上文实例基于聚合物易位穿过纳米孔的非常简化的模型；然而，连续重叠的光学测量的概念适用于更复杂的聚合物易位的描述。
由于在纳米孔处从多种不同的标记的单体的发射源自相同的分辨率受限区，所以关于单体的相对位置信息(特别是序列信息)不能由单个光学测量来确定。然而，由于产生单体特异性信号的标记物的重叠和使用，在某些实施方案中，当其被分成单体特异性信号的多个时间排序组时，序列信息可以由光学信号测量的时间排序组来确定。类似于在杂交测序(sequencing-by-hybridization)(SBH)中使用的以从杂交数据重建目标多核苷酸序列(target polynucleotide sequence)的算法此处可以被用于重建目标多核苷酸，例如美国专利5,002,867；Timp等人，Biophys.J.,102:L37-L39(2012)；或类似参考文献，这些参考文献通过引用并入。(i)时间排序重叠信号和信号以及(ii)它们分成单体特异性分量的限制显著地简化光学检测的情况下的确定步骤。
图6图示出了用于基于纳米孔易位的简单模型由重叠的光学信号的时间排序组来确定单体序列信息的步骤的一个实施方案。简单的模型假定在每个时间步骤的光学测量(除了在聚合物的从纳米孔的入口和出口处)各自包括来自相同数目的单体的信号贡献(在图6中被称为“n元组(n-tuple)”以指示测量将包括来自n种单体的贡献)。应理解，更复杂的模型可以允许每次测量中不同数目的贡献单体、允许易位速速度的局部变化、单体的线性移动的偏离及其他类似现象。也就是，在某些实施方案中，在不同时间的光学测量可以具有来自不同数目的核苷酸的贡献。在某些实施方案中，不同数目的核苷酸沿着目标多核苷酸的片段排序。由图6图示的确定步骤假定标记的聚合物已经穿过纳米孔，并且已经进行了光学测量的时间排序组，包括将光学信号分成单体特异性信号(600)。聚合物的入口和出口被不同地处理，因为在进入和离开后，在激发区中存在必定不同数目的单体。在该实施方案中，假定在这些条件下的初始光学测量和最终光学测量允许初始单体和最终单体由它们的单体特异性信号来直接确定。在其他实施方案中，用于分析的标记的聚合物的制备可以包括在这样的标记的聚合物的一端或两端处插入多种预先确定的标记的核苷酸，用于产生光学信号的已知序列以有助于序列确定步骤的目的。这样的预先确定的标记的核苷酸将类似于Ion Torrent或454测序中的关键序列，例如美国专利7,575,865，该专利通过引用并入。
回到图6，在确定步骤开始时，时间指数(time index)i被设置成0；在当前时间i的候选序列的指数j被设置成1(602)；并且检查单体特异性时间排序光学信号的组的初始n元组(604)。这样的检查包括首先由在时间i的测量来确定与该测量一致的单体的所有可能的n元组，然后由那些n元组来确定哪些合适地重叠候选序列Si。对于与测量一致的组(606)，通过各自合适地重叠的n元组形成新的候选序列Si+1(并且延伸序列Si)。新延伸的候选序列Si+1被存储，并且给出在时间i+1、Ji+1的候选序列的数目的指数被更新(608)。重复此步骤，直到已经检查每一个候选序列Si(610)，并且在每个时间i进行类似的检查，直到已经检查时间排序组中的每个光学测量。
纳米孔和纳米孔阵列
与本发明一起使用的纳米孔可以是固态纳米孔、蛋白质纳米孔或混合纳米孔(hybrid nanopore)，所述混合纳米孔包括蛋白质纳米孔或有机纳米管例如碳纳米管或石墨烯纳米管，这些纳米孔被配置在固态膜或类似框架中。纳米孔的重要特征包括限制聚合物分析物，例如多核苷酸，(i)使得它们的单体依次穿过信号产生区(或激发区或类似区域)，以及(ii)使得单体上的标记物的吸收偶极子被定向。也就是，纳米孔限制聚合物分析物例如多核苷酸的移动，使得单体例如核苷酸以单个文件穿过检测区(或激发区或类似区域)，并且使得单体上的标记物被定向或对齐(align)，使得它们可以被选择性地致使不响应于通过选择激发光束的偏振状态的激发。在某些实施方案中，纳米孔的另外的特征包括使单链核酸通过，而不使双链核酸，或等效大体积分子通过。
在某些实施方案中，与本发明的方法和装置结合使用的纳米孔被设置成阵列的形式，例如纳米孔的簇的阵列，其可以被规则地布置在平的表面上。在某些实施方案中，簇各自在单独的分辨率受限区中，使得来自不同簇的纳米孔的光学信号通过所采用的光学检测系统可区分，但来自相同簇内的纳米孔的光学信号不一定通过所采用的光学检测系统被分配至这样的簇内的特定的纳米孔。
固态纳米孔可以以多种材料来制造，所述材料包括但不限于氮化硅(Si3N4)、二氧化硅(SiO2)及类似材料。用于分析应用例如DNA测序的纳米孔的制造和操作在以下示例性的参考文献中公开，所述参考文献通过引用并入：Ling，美国专利7,678,562；Hu等人，美国专利7,397,232；Golovchenko等人，美国专利6,464,842；Chu等人，美国专利5,798,042；Sauer等人，美国专利7,001,792；Su等人，美国专利7,744,816；Church等人，美国专利5,795,782；Bayley等人，美国专利6,426,231；Akeson等人，美国专利7,189,503；Bayley等人，美国专利6,916,665；Akeson等人，美国专利6,267,872；Meller等人，美国专利公布2009/0029477；Howorka等人，国际专利公布WO2009/007743；Brown等人，国际专利公布WO2011/067559；Meller等人，国际专利公布WO2009/020682；Polonsky等人，国际专利公布WO2008/092760；Van der Zaag等人，国际专利公布WO2010/007537；Yan等人，Nano Letters,5(6):1129-1134(2005)；Iqbal等人，Nature Nanotechnology,2:243-248(2007)；Wanunu等人，Nano Letters,7(6):1580-1585(2007)；Dekker,Nature Nanotechnology,2:209-215(2007)；Storm等人，Nature Materials,2:537-540(2003)；Wu等人，Electrophoresis,29(13):2754-2759(2008)；Nakane等人，Electrophoresis,23:2592-2601(2002)；Zhe等人，J.Micromech.Microeng.,17:304-313(2007)；Henriquez等人，The Analyst,129:478-482(2004)；Jagtiani等人，J.Micromech.Microeng.,16:1530-1539(2006)；Nakane等人，J.Phys.Condens.Matter,15R1365-R1393(2003)；DeBlois等人，Rev.Sci.Instruments,41(7):909-916(1970)；Clarke等人，Nature Nanotechnology,4(4):265-270(2009)；Bayley等人，美国专利公布2003/0215881；及类似参考文献。
在某些实施方案中，本发明包括具有一个或更多个光阻挡层，也就是一个或更多个不透明层的纳米孔阵列。典型地，纳米孔阵列以薄的材料片材来制造，例如硅、氮化硅、氧化硅、氧化铝或类似物，这些材料容易地透射光，特别是在使用的厚度，例如小于50nm-100nm。对于分析物的电学检测，这不是问题。然而，在易位纳米孔的标记的分子的基于光学的检测中，透射穿过阵列的光总是激发意图的反应位点之外的材料，从而产生光学噪音，例如来自非特异性背景荧光、来自尚未进入纳米孔的分子的标记物的荧光或类似物。在一个方面中，本发明通过以下来解决此问题：提供具有一个或更多个光阻挡层的纳米孔阵列，从而降低在与阵列的纳米孔相关的意图的反应位点处产生的光学信号的背景噪音，所述一个或更多个光阻挡层反射和/或吸收来自激发光束的光。在某些实施方案中，这允许意图的反应位点中的光学标记物通过直接照明被激发。在某些实施方案中，不透明层可以是金属层。这样的金属层可以包含Sn、Al、V、Ti、Ni、Mo、Ta、W、Au、Ag或Cu。在某些实施方案中，这样的金属层可以包含Al、Au、Ag或Cu。在另外其他的实施方案中，这样的金属层可以包含铝或金，或者可以仅包含铝。不透明层的厚度可以广泛地变化，并且取决于包含该层的材料的物理性质和化学性质。在某些实施方案中，不透明层的厚度可以是至少5nm，或至少10nm，或至少40nm。在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从5nm-100nm的范围内；在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从10nm-80nm的范围内。不透明层不需要阻挡(即反射或吸收)来自激发光束的100％的光。在某些实施方案中，不透明层可以阻挡来自激发光束的入射光的至少10％；在其他实施方案中，不透明层可以阻挡来自激发光束的入射光的至少50％。
不透明层或涂层可以通过本领域已知的多种技术被制造在固态膜上。可以使用材料沉积技术，包括化学气相沉积、电沉积、外延、热氧化、物理气相沉积(包括蒸发和溅射)、浇铸及类似技术。在某些实施方案中，可以使用原子层沉积，例如美国专利6,464,842；Wei等人，Small,6(13):1406-1414(2010)，它们通过引用并入。
在某些实施方案中，可以穿过固体基底通常是平面基底例如膜形成1nm-100nm的通道或孔，穿过所述固体基底，分析物例如单链DNA被诱导易位。在其他实施方案中，穿过基底形成2nm-50nm的通道或孔；并且在另外其他的实施方案中，如果穿过基底形成，那么形成2nm-30nm、或2nm-20nm、或3nm-30nm、或3nm-20nm、或3nm-10nm的通道或孔。产生纳米孔的固态方法提供强健性(robustness)和耐用性，以及调节纳米孔的大小和形状的能力，在薄片标度(wafer scale)制造高密度纳米孔的阵列的能力，与基于脂质的系统相比优越的机械特性、化学特性和热特性，以及与电子或光学读出技术集成的可能性。另一方面，生物纳米孔提供特别是在1纳米-10纳米范围内的可再现的窄的钻孔或腔，以及用于定制纳米孔的物理性质和/或化学性质的技术和用于通过常规的蛋白质工程方法直接地或间接地附接基团或元素例如荧光标记物的技术，所述荧光标记物可以是FRET供体或FRET受体。蛋白质纳米孔典型地依赖于用于机械支撑的精细的脂质双层，并且具有精确尺寸的固态纳米孔的制造仍然是有挑战性的。在某些实施方案中，固态纳米孔可以与生物纳米孔组合以形成克服这些缺点中的某些的所谓的“混合”纳米孔，从而提供具有固态纳米孔的稳定性的生物孔蛋白(biological pore protein)的精度。对于光学读出技术，混合纳米孔提供纳米孔的精确位置，这大大地简化数据采集。
在某些实施方案中，簇还可以通过将蛋白质纳米孔布置在由包含孔的阵列的固相膜支撑的脂质双层中来形成。例如，这样的阵列可以包括在固相支撑物中制造(例如钻孔、蚀刻或类似方法)的孔。这样的孔的几何形状可以取决于所采用的制造技术而变化。在某些实施方案中，每个这样的孔与单独的分辨率受限区相关或由单独的分辨率受限区涵盖；然而，在其他实施方案中，多个孔可以在相同的分辨率受限区内。孔的横截面积可以广泛地变化，并且可以与或可以不与不同簇之间相同，尽管这样的面积通常与常规的制造方法的结果大体上相同。在某些实施方案中，孔具有在从10nm至200nm的范围内的最小线性尺寸(例如在圆形孔的情况下的直径)，或者具有在从约100nm2至3x104nm2的范围内的面积。跨过孔可以布置脂质双层。每个孔的蛋白质纳米孔的分布可以例如通过在插入步骤期间控制蛋白质纳米孔的浓度而变化。在这样的实施方案中，纳米孔的簇可以包括随机数目的纳米孔。在其中蛋白质纳米孔随机地插入到孔中的某些实施方案中，包括一个或更多个孔的簇平均具有大于零的蛋白质纳米孔的数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.25的蛋白质纳米孔的数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.5的蛋白质纳米孔的数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于0.75的蛋白质纳米孔的数目；在其他实施方案中，这样的簇具有大于1.0的蛋白质纳米孔的数目。
在某些实施方案中，本发明的方法和装置包括固相膜，例如SiN膜，所述固相膜具有穿过其中的孔的阵列，所述孔提供第一室和第二室(有时还被称为“顺式室”和“反式室”)之间的连通，并且支撑在面向第二室或反式室的表面上的脂质双层。在某些实施方案中，这样的固相膜中的孔的直径可以在10nm至200nm的范围内，或者在20nm至100nm的范围内。在某些实施方案中，这样的固相膜还包括蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔被插入到区域中的脂质双层中，在所述区域中，这样的双层跨越面向反式室的表面上的孔。在某些实施方案中，使用本文描述的技术，从固相膜的顺式侧插入这样的蛋白质纳米孔。在某些实施方案中，这样的蛋白质纳米孔具有与α-溶血素相同或类似的结构，因为它包括沿着轴的筒(barrel)或钻孔，并且在一端具有“帽”结构，而在另一端具有“茎”结构(使用来自Song等人，Science，274:1859-1866(1996)的术语)。在使用这样的蛋白质纳米孔的某些实施方案中，插入到脂质双层中导致蛋白质纳米孔被定向，使得其帽结构被暴露于顺式室，而其茎结构被暴露于反式室。
在某些实施方案中，本发明可以采用呈簇的混合纳米孔(hybrid nanopore)，特别是对于多核苷酸的基于光学的纳米孔测序。这样的纳米孔包括固态穿孔(orifice)或孔，例如蛋白质纳米孔，蛋白质生物传感器被稳定地插入在其中。带电荷的聚合物可以通过常规的蛋白质工程技术被附接至蛋白质纳米孔(例如α溶血素)，其后施加的电场可以被用于将蛋白质纳米孔指导到固态膜中的孔中。在某些实施方案中，固态基底中的孔被选择为略微小于蛋白质，从而防止其易位穿过孔。而是，蛋白质将被嵌入到固态穿孔中。
固态纳米孔或合成的纳米孔可以以多种方式来制备，如上文引用的参考文献中例示的。在某些实施方案中，氦离子显微镜可以被用于在多种材料中钻孔合成的纳米孔，例如，如由Yang等人，Nanotechnolgy,22:285310(2011)公开的，该参考文献通过引用并入本文。支撑薄膜材料例如氮化硅的一个或更多个区域的芯片被引入至氦离子显微镜(HIM)室，所述薄膜材料已经被加工成自支撑膜(free-standing membrane)。当显微镜被设置用于低放大率时，HIM电机控制器被用于将自支撑膜带到离子束的路径中。包括焦点和像散(stigmation)的光束参数在邻近自支撑膜的区域处但是在固体基底上被调节。在参数已经被合适地固定后，芯片位置被移动，使得自支撑膜区域以离子束扫描区域为中心，并且光束被遮蔽。HIM视场被设置成足以包括全部预期的纳米孔图案并足以在将来的光学读出(即取决于光学放大率、相机分辨率等)中有用的尺寸(以μm计)。离子束然后在像素停留时间穿过整个视场被光栅化一次，这导致足以除去全部或大部分膜自发荧光的总离子剂量。然后，视场被设置成合适的值(小于上文使用的值)，以进行单个纳米孔或纳米孔的阵列的光刻定义的碾磨(lithographically-defined milling)。该图案的像素停留时间被设置成导致一个或更多个预先确定的直径的纳米孔，所述直径在样品加工之前通过使用校准样品来确定。对于单个芯片上的每个期望的区域和/或对于被引入到HIM室中的每个芯片，重复此整个过程。
在某些实施方案中，用于实施用于分析聚合物(例如单链多核苷酸)的上文方法的装置典型地包括一组电极，所述一组电极用于跨过分层膜和纳米孔建立电场。通过将单链核酸放置在第一室中的电解质中，单链核酸被暴露于纳米孔，所述第一室通过在该室中放置负电极被配置为分层膜的“顺式”侧。在施加电场后，带负电的单链核酸被纳米孔捕获，并被易位至分层膜的另一侧上的第二室，所述第二室通过在该室中放置正电极被配置为膜的“反式”侧。易位的速度部分地取决于第一室和第二室中的电解质的离子强度以及跨过纳米孔的施加电压。在基于光学的检测中，易位速度可以通过初步校准测量来选择，例如，使用对于不同电压，以不同的每纳米孔的预计的速率产生信号的预先确定的标记的单链核酸的标准物。因此，对于DNA测序应用，易位速度可以基于来自这样的校准测量的信号速率来选择。因此，从这样的测量，可以选择允许或最大化可靠的核苷酸识别的电压，例如在纳米孔的阵列上。在某些实施方案中，这样的校准可以使用来自待被分析的模板的样品的核酸进行(替代预先确定的标准序列，或除了预先确定的标准序列之外)。在某些实施方案中，这样的校准可以在测序运行期间实时进行，并且基于这样的测量，施加的电压可以被实时修改，例如，以最大化核苷酸特异性信号的采集。
控制聚合物穿过纳米孔的易位速度对于允许可以从其中获得序列信息的数据收集是必要的。易位速度部分地取决于跨过纳米孔的电压差(或电场强度)和第一室的反应混合物中的条件，在所述第一室中核酸聚合物被暴露于纳米孔(例如，被布置在构成第一室的一个壁的固相膜中)。纳米孔对核酸聚合物的捕获速率取决于这样的聚合物的浓度。在某些实施方案中，用于纳米孔测序的常规的反应混合物条件可以与本发明一起使用，例如1MKC1(或等效盐，例如NaCl、LiCl或类似物)和pH缓冲体系(例如，其确保待使用的蛋白质，例如蛋白质纳米孔、核酸酶或类似物不变性)。在某些实施方案中，pH缓冲体系可以被用于将pH大体上保持恒定在6.8至8.8的范围内的值。在某些实施方案中，跨过纳米孔的电压差可以在从70mV至200mV的范围内。在其他实施方案中，跨过纳米孔的电压差可以在从80mV至150mV的范围内。可以使用常规的测量技术来选择合适的用于操作的电压。可以使用可商购的仪器容易地测量跨过纳米孔的电流(或电压)。可以选择电压差，使得易位速度在期望的范围内。在某些实施方案中，易位速度的范围包括那些小于每秒1000个核苷酸的速度。在其他实施方案中，易位速度的范围是从每秒10个至800个核苷酸；在其他实施方案中，易位速度的范围是从每秒10个至600个核苷酸；在其他实施方案中，易位速度的范围是从每秒200个至800个核苷酸；在其他实施方案中，易位速度的范围是从每秒200个至500个核苷酸。
采用两种或三种光学标记物的实施方案
在某些实施方案中，少至两种不同类型的核苷酸被标记有不同的光学标记物，所述光学标记物产生在目标多核苷酸的有义链和反义链两者中的所选择种类的核苷酸的可区分的光学信号。例如，每种目标多核苷酸的互补链的C'和T'可以被标记的类似物替代，其中C类似物和T类似物的标记物能够产生有区别的光学信号。然后，通过将标记的链易位穿过纳米孔产生光学特征，在所述纳米孔中，该链的核苷酸受限制以顺序地穿过其中造成其标记物产生光学信号的光学检测区。在某些实施方案中，来自有义链和反义链两者的光学特征的信息被组合以确定目标多核苷酸的核苷酸序列。
在某些实施方案中，在使用核酸聚合酶的延伸反应中，目标多核苷酸的所选择种类的核苷酸被标记的核苷酸类似物替代。目标多核苷酸的标记的链被易位穿过纳米孔，所述纳米孔限制链的核苷酸将单个文件移动穿过光学检测区，在所述光学检测区中它们被激发，使得它们产生光学信号。用于单独的链的光学信号的集合(collection)在本文中被称为链的光学特征。在某些实施方案中，在链及其互补体(即有义链和反义链)例如经由发夹衔接子(hairpin adaptor)来连接的情况下，单个光学特征可以包括来自有义链和反义链两者的核苷酸上的光学标记物的光学信号。在其他实施方案中，目标多核苷酸的不同链可以单独地产生两种不同的光学特征，所述光学特征可以组合或一起使用，用于分析，如上文提及的。这样的单独地分析的链可以在产生光学特征后缔合，例如，通过使用分子标签(molecular tag)(其可以是，例如以已知的位置、长度和序列模式并且允许准备缔合的多样性被附接至目标多核苷酸的寡核苷酸片段)。如下文提到的，本发明的光学特征可以包括混合光学信号，也就是，在每个检测间隔中检测到的信号可以包括来自在分辨率受限区或体积内发射的多种光学标记物的贡献；也就是，它们可以(例如)是混合的FRET信号，如Huber等人，美国专利公布US20160076091描述的，该专利公布通过引用并入本文。
如上文提及的，在某些实施方案中，本发明的方法可以用以下步骤来实施：(a)拷贝双链多核苷酸的链，使得用具有有区别的光学标记物的核苷酸类似物替代至少两种类型的核苷酸，以形成标记的链；(b)拷贝链的互补体，使得用所述核苷酸类似物替代相同的至少两种类型的核苷酸，以形成标记的互补体；(c)将标记的链易位穿过纳米孔，使得标记的链的核苷酸将单个文件穿过其中激发光学标记物以产生光学信号的激发区；(d)当标记的链易位穿过纳米孔以产生链光学特征时，检测来自光学标记物的光学信号的时间序列；(e)将标记的互补体易位穿过纳米孔，使得标记的互补体的核苷酸将单个文件穿过其中激发光学标记物以产生光学信号的激发区；(f)当标记的互补体易位穿过纳米孔以产生互补体光学特征时，检测来自光学标记物的光学信号的时间序列；(g)由链光学特征和互补体光学特征来确定双链多核苷酸的序列。在某些实施方案中，标记两种类型的核苷酸，它们可以是C'和T'、C’和G’、C’和A’、T’和G’、T’和A’、或者G’和A’。在某些实施方案中，嘧啶核苷酸被标记。在其他实施方案中，嘌呤核苷酸被标记。在某些实施方案中，通过在使用核酸聚合酶的引物延伸反应中并入所选择种类的核苷酸的标记的类似物dNTP来标记链的所选择种类的核苷酸。在其他实施方案中，通过在延伸反应中并入所选择种类的核苷酸的类似物dNTP来标记链的所选择种类的核苷酸，其中类似物dNTP被正交反应性官能团衍生化，所述官能团允许在随后的反应中不同的标记物附接至不同种类的核苷酸。此后者标记方法在Jett等人，美国专利5,405,747中公开，该专利通过引用并入本文。
在某些实施方案中，标记三种类型的核苷酸，其可以包括用第一光学标记物标记C'，用第二光学标记物标记T'，以及用第三光学标记物标记G'和A'。在其他实施方案中，以下核苷酸组可以如指示来标记：分别用第一光学标记物和第二光学标记物来标记C'和G’，并且用第三光学标记物来标记T’和A’；分别用第一光学标记物和第二光学标记物来标记C'和A’，并且用第三光学标记物来标记T’和G’；分别用第一光学标记物和第二光学标记物来标记T'和G’，并且用第三光学标记物来标记C'和A’；分别用第一光学标记物和第二光学标记物来标记A’和G’，并且用第三光学标记物来标记T’和C'。
在某些实施方案中，光学标记物是荧光受体分子，所述荧光受体分子在来自与纳米孔缔合的供体的能量转移后产生荧光共振能量转移(FRET)信号。在某些实施方案中，如下文另外描述的，供体可以是光学活性纳米颗粒，例如量子点、纳米金刚石(nanodiamond)或类似物。受体分子和供体的特定组合的选择是本领域普通技术人员的设计选择。在某些实施方案中，其中的某些在下文中更充分地描述，单个量子点被附接至纳米孔，并且使用激发光束激发以发荧光，所述激发光束的波长被充分地分开，通常是较低的(即较蓝)，使得其不有助于由受体产生的FRET信号。同样地，选择量子点，所述量子点的发射波长与两种受体分子的吸收波段重叠以有助于FRET相互作用。在某些实施方案中，两种供体可以被用于纳米孔的每个激发区，其中选择每种供体的发射波长以最佳地重叠不同受体分子的吸收波段。
在图7A中，双链目标多核苷酸(700)由有义链(701)和互补的反义链(702)组成，使用常规的方法例如Weissman等人，美国专利6,287,825；Schmitt等人，美国专利公布US2015/004468(它们通过引用并入本文)，将“Y”衔接子(704)和(706)连接至有义链(701)和互补的反义链(702)。衔接子(分别地，704和706)的臂(708)和(710)包括引物(716)和(718)被退火(705)至的引物结合位点。双链部分(712)和(714)可以包括标签序列，例如，一个或两个双链部分可以包括具有预先确定的长度和组成的随机寡核苷酸，所述随机寡核苷酸可以被用于稍后的链的再缔合，例如以从链的各自光学特征获得序列信息。在退火引物(716)和(718)后，它们可以在(例如，如图示的)标记的dUTP类似物(如在并入的核苷酸中的空心圆(open circle)示出的标记物)和标记的dCTP类似物(如在并入的核苷酸中的填充圆示出的标记物)以及天然的未标记的dNTP和dNTP(没有未标记的dTTP也没有未标记的dCTP存在，使得类似物在延伸的链中被完全替代)的存在下，通过核酸聚合物酶来延伸(707)。G’和A'上的标记物的不存在上文并入的核苷酸上以虚线图示出。在没有噪音的理想检测系统中，空心圆、填充圆和虚线的序列将是当指示的有义链和反义链穿过纳米孔的激发区时由它们产生的光学特征的良好表示。
在图7B中，图示出了用于采用三种标记物的可选择的实施方案的延伸产物(720)和(722)。如上文，并入的标记的dUTP类似物被示出为空心圆，而并入的标记的dCTP类似物被示出为填充圆。并入的标记的dTP类似物和并入的标记的dGTP类似物被示出为填充的菱形。
可以在以下参考文献中找到选择标记的核苷酸种类、用于将它们附接至碱基的标记物和连接基的种类以及在dNTP类似物的存在下用于延伸反应的核酸聚合物酶的指南，所述参考文献通过引用并入：Goodman等人，美国专利5,945,312；Jett等人，美国专利5,405,747；Muehlegger等人，美国专利公布US2004/0214221；Giller等人，Nucleic AcidsResearch,31(10):2630-2635(2003)；Tasara等人，Nucleic Acids Research,31(10):2636-2646(2003)；Augustin等人，J.Biotechnology,86:289-301(2001)；Brakmann,Current Pharmacuetical Biotechnology,5(1):119-126(2004)；及类似参考文献。用于与本发明一起使用的示例性的核酸聚合酶包括但不限于Vent exo、Taq、E.coli Pol I、Tgoexo、Klenow片段exo、Deep Vent exo、及类似酶。在某些实施方案中，示例性的核酸聚合酶包括但不限于Event exo和Klenow片段exo。用于dNTP类似物的示例性的荧光标记物包括但不限于Alexa 488、AMCA、Atto 655、Cy3、Cy5、Evoblue 30、荧光素、Gnothis blue 1、Gnothis blue 2、Gnothis blue 3、Dy630、Dy635、MR121、罗丹明、罗丹明绿、Oregon Green、TAMA及类似物。用于dUTP类似物的示例性的荧光标记物包括但不限于Alexa 488、AMCA、Atto 655、Cy3、Cy5、Dy630、Dy665、Evoblue30、Evoblue 90、荧光素、Gnothis blue 1、Gnothis blue 2、Gnothis blue 3、MR121、Oregon Green、罗丹明、罗丹明绿、TAMA及类似物。用于dCTP类似物的示例性荧光标记物包括但不限于Atto 655、Cy5、Evoblue 30、Gnothis Blue 3、罗丹明、罗丹明绿、TAMA及类似物。用于dATP类似物的示例性的荧光标记物包括但不限于Atto 655、Cy5、Evoblue 30、Gnothis Blue 3、罗丹明绿及类似物。用于dGTP类似物的示例性的荧光标记物包括但不限于Evoblue 30、Gnothis Blue 3、罗丹明绿及类似物。用于dUTP类似物和dCTP类似物的示例性的荧光标记物的对包括但不限于(TAMRA、罗丹明绿)、(Atto 655、Evoblue 30)、Evoblue 30、Atto 655)、(Evoblue 30、Gnothis blue 3)、(Evoblue 30、罗丹明绿)、(Gnothis blue 1、罗丹明绿)、(Gnothis blue2、Atto 655)、Gnothis blue 3、Cy5)及类似物。
图7C图示出了其中使用两种标记物并且有义链和反义链借助于发夹衔接子(703)连接的实施方案，例如如在美国专利公布US 2015/0152492和US 2012/0058468中教导的，这些专利公布通过引用并入本文。尾衔接子(tailed adaptor)(732)和发夹衔接子(730)被连接至目标多核苷酸(700)。在引物(734)的变性和退火后，延伸反应产生延伸产物(735)，所述延伸产物(735)包括节段(736)、链(701)和节段(738)的标记的互补体、链(701)的标记的反向互补体。在延伸产物(735)易位穿过纳米孔并产生光学特征后，可以确定目标多核苷酸(700)的序列。任选地，发夹(730)的序列可以被选择，使得在延伸反应期间，并入预先确定的标记物的图案，其可以被用于有助于光学特征的分析，例如通过指示节段(736)在何处结束和节段(738)在何处开始或类似分析。
定义
“渐逝场”意指非传播电磁场；也就是，它是其中Poynting矢量的平均值是零的电磁场。
“FRET”或“或荧光共振能量转移”意指从激发的供体荧光团至基态的受体荧光团的非辐射偶极子-偶极子能量转移机制。FRET相互作用中的能量转移的速率取决于供体的发射光谱与受体的吸收光谱的光谱重叠的程度、供体的量子收率、供体和受主转变偶极子的相对定向以及供体分子和受主分子之间的距离，Lakowitz,Principles ofFluorescence Spectroscopy，第三版(Springer，2006)。特别感兴趣的FRET相互作用是导致能量的一部分被转移至受体的FRET相互作用，其进而由受体作为光子发射，其中频率低于激发其供体的光的频率(即“FRET信号”)。“FRET距离”意指FRET供体和FRET受体之间的距离，在该距离内，FRET相互作用可以发生，并且可检测的FRET信号由FRET受体产生。
“试剂盒”指的是用于递送用于进行本发明的方法的材料或试剂的任何递送系统。在反应测定的上下文中，这样的递送系统包括允许将反应试剂(例如在适当的容器中的荧光标记物，例如相互猝灭的荧光标记物、荧光标记物连接剂、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液、用于进行测定的书面说明等)从一个位置储存、运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒包括一个或更多个包含相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如盒)。这样的内容物可以被一起或单独地递送至预期的接收者。例如，第一容器可以包含用于在测定中使用的酶，而第二容器或更多个容器包含相互猝灭的荧光标记物。
“纳米孔”意指被定位在基底中的任何开口，所述开口允许分析物以预先确定的顺序或可辨别的顺序穿过基底，或者在聚合物分析物的情况下，允许其单体单元以预先确定的顺序或可辨别的顺序穿过基底。在后者情况下，预先确定的顺序或可辨别的顺序可以是聚合物中的单体单元的主要顺序。纳米孔的实例包括蛋白质的或基于蛋白质的纳米孔、合成纳米孔或固态纳米孔、以及包含具有嵌入其中的蛋白质纳米孔的固态纳米孔的混合纳米孔。纳米孔可以具有1nm-10nm或1nm-5nm或1nm-3nm的内径。蛋白质纳米孔的实例包括但不限于α-溶血素、电压依赖性线粒体孔蛋白(voltage-dependent mitochondrial porin)(VDAC)、OmpF、OmpC、MspA和LamB(麦芽糖孔蛋白(maltoporin))，例如在Rhee,M.等人，Trends in Biotechnology,25(4)(2007):174-181；Bayley等人(上文引用的)；Gundlach等人，美国专利公布2012/0055792；及类似文献中公开的，这些文献通过引用并入本文。可以使用允许单种核酸分子的易位的任何蛋白质孔。纳米孔蛋白可以在孔的外部的特定位点处，或者在构成孔形成蛋白(pore forming protein)的一个或更多个单体单元外部的特定位点处被标记。孔蛋白选自蛋白质的组，例如但不限于α-溶血素、MspA、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、Anthrax孔蛋白、OmpF、OmpC以及LamB(麦芽糖孔蛋白)。孔蛋白集成到固态空穴(hole)中通过将带电荷的聚合物附接至孔蛋白来实现。在施加电场后，带电荷的复合物被电泳地拉到固态空穴中。合成纳米孔或固态纳米孔可以以多种固体基底的形式产生，其实例包括但不限于有机硅(例如Si3N4、SiO2)、金属、金属氧化物(例如Al2O3)、塑料、玻璃、半导体材料及其组合。合成纳米孔可以比被定位在脂质双层膜中的生物蛋白孔更稳定。还可以通过使用被嵌入在合适的基底例如但不限于聚合的环氧树脂中的碳纳米管来产生合成纳米孔。碳纳米管可以具有均匀且明确定义的化学性质和结构性质。可以获得在从一纳米至数百纳米的范围的多种大小的碳纳米管。已知碳纳米管的表面电荷是约零，并且因此，核酸穿过纳米孔的电泳传输变得简单且可预测(Ito T.等人，Chem.Commun.12(2003):1482-83)。合成纳米孔的基底表面可以被化学改性，以允许蛋白质孔的共价附接，或致使适合于光学纳米孔测序的表面性质。这样的表面改性可以是共价的或非共价的。大多数共价改性包括有机硅烷沉积，对于所述有机硅烷沉积，描述最常见的方案：1)从含水醇中沉积。这是用于制备甲硅烷基化表面最可行的方法。用乙酸将95％乙醇-5％水溶液调节至pH4.5-5.5。在搅拌下，添加硅烷，以产生2％最终浓度。在水解和硅烷醇基团形成后，添加基底持续2min-5min。之后，通过短暂地浸渍在乙醇中冲洗掉过量的材料。硅烷层的固化在110摄氏度持续5min-10min。2)气相沉积。通过化学气相沉积方法，硅烷可以在干燥的非质子条件下被施加至基底。这些方法有利于单层沉积。在封闭室设计中，基底被加热至足够的温度，以实现5mm蒸汽压。可选择地，真空可以被施加，直到观察到硅烷蒸发。3)旋涂沉积。在有利于最大官能化和多层沉积的水解条件下或有利于单层沉积的干燥条件下，可以进行旋涂施加。在某些实施方案中，单个纳米孔与本发明的方法一起使用。在其他实施方案中，使用多个纳米孔。在后者实施方案的某些中，多个纳米孔被用作纳米孔的阵列，通常被布置在平面基底，例如固相膜中。纳米孔阵列的纳米孔可以被规则地间隔开，例如，以直线图案间隔开，或者可以被随机地间隔开。在优选的实施方案中，纳米孔在平面固相基底中以直线图案被规则地间隔开。
“纳米结构”(与“纳米标度结构”和“纳米标度特征”互换地使用)意指具有在几纳米至几百纳米例如从1纳米至1000纳米的范围内的至少一个尺寸的结构。在某些应用中，这样的范围是从2纳米至500纳米；在其他应用中，这样的范围是从3纳米至500纳米。纳米结构的形状和几何形状可以广泛地变化，并且包括但不限于纳米孔(nanopore)、纳米孔(nanowell)、纳米颗粒以及特别适合于进行反应序列的任何其他方便的形状。在某些实施方案中，纳米结构可以是在操作上与固相膜相关的蛋白质纳米孔。某些纳米结构，例如纳米孔(nanopore)和纳米孔(nanowell)，可以在较大的常用基底例如固相膜或其他固体中形成，以形成纳米孔(nanopore)或纳米孔(nanowell)的阵列。特别感兴趣的纳米结构是能够支持或包括化学反应、物理反应(例如FRET)、酶促反应和/或结合反应或这样的反应的序列的纳米结构。在某些实施方案中，纳米结构，例如纳米孔(nanowell)封闭小于1纳升(10x-9升)、小于1皮升或小于1毫微微升(femtoliter)的体积。在其他实施方案中，单独的纳米孔(nanowell)的每个提供小于1000仄升(zeptoliter)、100仄升、80仄升、或小于50仄升、或小于1仄升、或甚至小于100yactoliter的体积。在某些实施方案中，纳米孔(nanowell)包括零模式波导。
“聚合物”意指被连接成直链的多种单体。通常，聚合物包含多于一种类型的单体，例如如包含A'、C'、G'和T'的多核苷酸，或者包含多于一种类型的氨基酸的多肽。单体可以包括而不限于核苷及其衍生物或类似物以及氨基酸及其衍生物和类似物。在某些实施方案中，聚合物是多核苷酸，由此核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物连接。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换地使用，并且各自意指核苷酸单体的直链聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用(monomer-to-monomerinteraction)的规律模式被特异性地结合至天然多核苷酸，例如Watson-Crick型碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen型碱基配对或类似模式。这样的单体及其核苷间的键可以是天然存在的，或者可以是其类似物，例如天然存在的类似物或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括PNA、硫代磷酸酯核苷间的键、包含允许标记物的附接的连接基团的碱基例如荧光团、或半抗原及类似物。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶加工时，例如通过聚合酶的延伸、通过连接酶的连接或类似加工，普通技术人员将理解，在这些情况下，寡核苷酸或多核苷酸在任何位置或某些位置处将不包含核苷间的键、糖部分或碱基的某些类似物。当多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”时，它们的大小典型地在从几个单体单元，例如5个-40个，至几千个单体单元的范围内。每当多核苷酸或寡核苷酸由字母序列(大写或小写)例如“ATGCCTG”表示时，将理解，核苷酸从左至右以5'→3'顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷，除非另外指示或从上下文明显的。除非另外提到的，否则术语和原子编号惯例将遵循在Strachan和Read,Human Molecular Genetics2(Wiley-Liss,New York,1999)中公开的那些。通常，多核苷酸包括由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如对于DNA，脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，或者对于RNA，它们的核糖对应物)；然而，它们还可以包括非天然核苷酸类似物，例如包括改性的碱基、糖或核苷间的键。对于本领域技术人员清楚的是，在对于活性，酶具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求，例如单链DNA、RNA/DNA双链体或类似物的情况下，那么对于寡核苷酸底物或多核苷酸底物的合适组成的选择良好地在本领域普通技术人员的知识内，特别是在来自专著的指导下，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1989)及类似文献。同样地，寡核苷酸和多核苷酸可以指的是单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其各自互补体的双链体)。将对于本领域普通技术人员清楚的是，哪一种形式或两种形式是否意图来自该术语使用的上下文。
“引物”意指天然的或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体时能够充当核酸合成的初始点，并且从其3’端沿着模板延伸，使得形成延伸的双链体。引物的延伸通常在核酸聚合酶例如DNA聚合酶或RNA聚合酶下进行。延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列确定。通常，引物由DNA聚合酶延伸。引物通常具有在从14个至40个核苷酸的范围内，或在从18个至36个核苷酸的范围内的长度。引物被用于多种核酸扩增反应，例如使用单种引物的线性扩增反应，或使用两种或更多种引物的聚合酶链反应。用于选择用于特定应用的引物的长度和序列的指南对于本领域普通技术人员是熟知的，如通过以下参考文献证明的，该参考文献通过引用并入：Dieffenbach，编辑，PCR Primer:A LaboratoryManual第2版(Cold Spring Harbor Press,New York,2003)。
“分辨率受限区”是纳米孔(nanopore)阵列或纳米孔(nanowell)阵列的表面区域，在该区域内，单独的特征或光发射源不能通过光学信号检测系统来区别。不意图受理论限制，这样的分辨率受限区由光学系统的分辨率限值(resolution limit)(有时还被称为“衍射限值”或“衍射屏障”)确定。这样的限值由发射源的波长和光学部件确定，并且可以由d＝λ/NA来定义，其中d是可以分辨的最小特征，λ是光的波长，并且NA是被用于使光聚焦的物镜的数值孔径。因此，每当两种或更多种纳米孔在分辨率受限区内并且两种或更多种光学信号在各自纳米孔处产生时，光学检测系统不能区分或确定哪些光学信号来自哪个纳米孔。根据本发明，纳米孔阵列的表面可以被分配或再分成对应于分辨率受限区的非重叠区或大体上非重叠区。对应于分辨率受限区的这样的再分的大小可以取决于所采用的特定的光学检测系统。在某些实施方案中，每当光发射源在可见光谱内时，分辨率受限区在从300nm2至3.0μm2的范围内；在其他实施方案中，分辨率受限区在从1200nm2至0.7μm2的范围内；在其他实施方案中，分辨率受限区在从3×104nm2至0.7μm2的范围内，其中前述的区域范围指的是纳米孔(nanopore)阵列或纳米孔(nanowell)阵列的表面。在某些实施方案中，可见光谱意指在从约380nm至约700nm的范围内的波长。
关于多核苷酸的“序列确定”、“测序”或“确定核苷酸序列”或类似术语包括多核苷酸的部分序列信息以及全部序列信息的确定。也就是，该术语包括四种天然核苷酸A、C、G和T的完整组的子组的序列，比如例如，目标多核苷酸的仅A'和C'的序列。也就是，该术语包括目标多核苷酸内的四种类型的核苷酸中的一种、两种、三种或全部的同一性、排序和位置的确定。在某些实施方案中，该术语包括目标多核苷酸内的四种类型的核苷酸中的两种、三种或全部的同一性、排序和位置的确定。在某些实施方案中，序列确定可以通过识别目标多核苷酸“catcgc……”内的单种类型的核苷酸例如胞嘧啶的排序和位置来完成，使得其序列被表示为代表“c-(非c)(非c)c-(非c)-c……”的二进制编码，例如“100101……”，及类似物。在某些实施方案中，该术语还可以包括用作用于目标多核苷酸的指纹的目标多核苷酸的子序列；也就是，唯一地识别多核苷酸的组内的目标多核苷酸或目标多核苷酸的类别的子序列，例如所有通过细胞表达的不同RNA序列。
本公开内容不意图限于陈述的特定形式的范围，而是意图覆盖本文描述的变型的替代物、修改和等效物。另外，鉴于本公开内容，本公开内容的范围完全涵盖可以对本领域技术人员变得明显的其他变型。本发明的范围仅由所附的权利要求限制。

Claims (19)

1.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：
将具有预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；
将多核苷酸易位穿过所述纳米孔，其中所述多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中所述纳米孔在空间上定向所述荧光标记物，使得在易位期间，所述吸收偶极子大体上不响应于所述激发光束；
当具有荧光标记物的核苷酸离开所述纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有所述预先确定的偏振状态的所述激发光束的激发时，检测由所述荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及
由荧光信号的变化来识别离开所述纳米孔的核苷酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸上的所述荧光标记物发射有区别的荧光信号。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物被相互猝灭。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述易位的步骤包括在一种或更多种猝灭剂的存在下易位。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米孔包括蛋白质纳米孔。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述预先确定的偏振状态具有电场矢量，并且其中所述纳米孔中的所述荧光标记物的所述吸收偶极子大体上正交于所述预先确定的偏振状态的所述电场矢量。
7.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：
将包括预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；
将多核苷酸易位穿过所述纳米孔，其中所述多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中所述纳米孔在空间上定向所述荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子最大地响应于通过处于所述预先确定的偏振状态的所述激发光束的激发；
检测由所述纳米孔中的核苷酸上的所述荧光标记物产生的光学信号；以及
由所述光学信号来识别所述多核苷酸的核苷酸。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸上的所述荧光标记物发射有区别的荧光信号。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述荧光标记物被相互猝灭。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述易位的步骤包括在一种或更多种猝灭剂的存在下易位。
11.如权利要求7所述的方法，其中所述纳米孔包括蛋白质纳米孔。
12.如权利要求7所述的方法，其中所述预先确定的偏振状态具有电场矢量，并且其中所述纳米孔中的所述荧光标记物的所述吸收偶极子大体上与所述预先确定的偏振状态的所述电场矢量对齐。
13.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：
将包括预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；
将多核苷酸易位穿过纳米孔，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸被标记有不同的荧光标记物，每种荧光标记物具有吸收偶极子并发射可区别的光学信号，并且其中所述纳米孔在空间上定向所述荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子最大地响应于通过处于预先确定的偏振状态的所述激发光束的激发；
当所述多核苷酸穿过所述纳米孔时，从所述纳米孔中的多种核苷酸中检测光学信号的时间排序组；
将来自不同种类的核苷酸的光学信号分开，以形成光学信号的核苷酸特异性时间排序组；以及
由所述光学信号的核苷酸特异性时间排序组确定核苷酸的序列。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述确定的步骤包括从由所述光学信号的核苷酸特异性时间排序组确定的核苷酸的重叠片段形成候选序列。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸上的所述荧光标记物发射有区别的荧光信号。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述荧光标记物被相互猝灭。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述易位的步骤包括在一种或更多种猝灭剂的存在下易位。
18.如权利要求13所述的方法，其中所述纳米孔包括蛋白质纳米孔。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述预先确定的偏振状态具有电场矢量，并且其中所述纳米孔中的所述荧光标记物的所述吸收偶极子大体上与所述预先确定的偏振状态的所述电场矢量对齐。
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