CN108738340A - 通过转位逆转的冗余聚合物分析 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对聚合物进行冗余测量的方法，所述方法通过逆转聚合物穿过各自具有检测区域的纳米孔的转位来进行，从而允许收集在不同时间从相同聚合物结构产生的信号。此类重复测量被组合以便降低在聚合物结构的最终确定中的噪声。在一些实施方案中，其不同核苷酸附接有可区分的荧光标记物的多核苷酸重复地转位通过纳米孔阵列的纳米孔，以对来自相同区段的光学信号的重复测量进行编译，这些测量可被组合以确定核苷酸序列。

Description

通过转位逆转的冗余聚合物分析
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年2月25日提交的美国临时专利申请号62/299,902的优先权的权益，其内容通过引用全部并入本文。
背景
在过去十年间发展的DNA测序技术已经彻底改变了生物科学，例如van Dijk等人，Trends in Genetics,30(9):418-426(2014)。然而，要实现该技术的全部潜力仍然存在许多需要克服的挑战，包括减少每次运行测序的成本、简化样品制备、缩短运行时间、增加序列读段长度、改进数据分析等。单分子测序技术，例如基于纳米孔的测序，可以解决这些挑战中的一些；然而，这些方法具有它们自身的一组技术难题，例如可靠的纳米结构的制造、DNA转位速率的控制、以低信噪比测量、确定性的核苷酸辨别、来自纳米级传感器的大阵列的信号的检测和处理等等，例如Branton等人,Nature Biotechnology,26(10):1146-1153(2008)。
鉴于上述情况，如果解决在大量噪音的存在下检测和测量弱信号的问题的方法和装置是可获得的，这通常对于纳米孔传感器技术及其特定应用例如基于光学的纳米孔测序将是有利的。
发明概述
本发明涉及用于解决使用纳米孔的单分子分析中的低信噪测量的问题的方法和装置。在一方面，本发明的方法和装置涉及通过聚合物分析物重复通过纳米孔的转位来降低噪声。
在一些方面，本发明涉及通过以下步骤分析聚合物特征的方法：(a)提供纳米孔阵列，其中每个纳米孔能够提供第一腔室和第二腔室之间的流体连通，并能够提供与转位穿过其的聚合物的至少一种性质相关的信号，并且其中纳米孔阵列中的一定百分率的(afraction of)纳米孔包含聚合物；(b)使聚合物穿过纳米孔阵列的纳米孔从第一腔室转位到第二腔室；(c)检测来自正在转位的聚合物的正向信号；(d)逆转聚合物的转位；(e)检测来自其穿过纳米孔的转位被逆转的聚合物的反向信号；(f)根据正向和反向信号确定每个这样的聚合物的至少一种性质。
在其他实施方案中，本发明涉及通过以下步骤分析多核苷酸的方法：(a)提供纳米孔阵列，其中每个纳米孔能够提供第一腔室和第二腔室之间的流体连通，并能够提供其不同种类的核苷酸附接有不同的荧光标记物的多核苷酸，所述不同的荧光标记物产生可区分的光学信号，使得不同种类的核苷酸可以通过来自其所附接的荧光标记物的光学信号被鉴定，并且其中纳米孔阵列中的一定百分率的纳米孔被多核苷酸占据；(b)使多核苷酸以从第一腔室到第二腔室的方向转位穿过纳米孔阵列的纳米孔；(c)检测来自正在转位的多核苷酸的正向光学信号；(d)逆转多核苷酸转位的方向；(e)检测来自其穿过纳米孔的转位被逆转的多核苷酸的反向光学信号；以及(f)根据所述正向和反向光学信号确定每个多核苷酸的核苷酸序列。
本发明有利地克服了在基于纳米孔的检测系统中，特别是那些使用光学标记的聚合物的检测系统中低信噪测量单个聚合物特征的问题。本发明的这些优点和其他优点在许多实施方案和应用中被例示，其中一些在下文并贯穿本说明书被概述。
附图简述
图1A-1F示出了在特定实施方案中的本发明的元件。
图2示出了根据本发明的一个实施方案的冗余数据的获取和使用。
图3示出了可用于本发明的一些实施方案的落射照射系统(epi-illuminationsystem)。
图4示出了其中聚合物分析物包括在其端部形成无规卷曲的聚合物的实施方案。
发明详述
虽然本发明适用于各种修改和替代形式，但其细节已通过举例的方式在附图中被显示并且将被详细描述。然而，应该理解的是，意图并不是将本发明局限于所描述的特定的实施方案。相反，意图是覆盖落入本发明的精神和范围内的所有修改、等效、和替代方案。例如，本发明的特定纳米孔类型和数目、特定标记物、FRET对、检测方案、制造方法是为了说明性目的展示的。然而，应该理解的是，本公开内容在这方面旨在是非限制性的，因为其他类型的纳米孔、纳米孔的阵列、和其他制造技术可被利用以实现本文讨论的系统的各个方面。关于本发明的多个方面的指导见于本领域普通技术人员所熟知的许多可获得的参考文献和论文中，包括，例如，Cao,Nanostructures&Nanomaterials(Imperial College Press,2004)；Levinson,Principles of Lithography，第二版(SPIE Press,2005)；Doering和Nishi,编辑,Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology,第二版(CRCPress,2007)；Sawyer等人,Electrochemistry for Chemists,第2版(WileyInterscience,1995)；Bard和Faulkner,Electrochemical Methods:Fundamentals andApplications,第2版(Wiley,2000)；Lakowicz,Principles of FluorescenceSpectroscopy,第3版(Springer,2006)；Hermanson,Bioconjugate Techniques,第二版(Academic Press,2008)等等，其相关部分在此通过引用并入。
本发明涉及对聚合物进行冗余分析的方法和装置，所述冗余分析通过逆转聚合物通过各自具有检测区域的纳米孔的转位来进行，从而允许收集在不同时间从相同聚合物结构或区段产生的信号。然后可以比较或以其他方式处理这种重复的信号，以便降低信号中的噪声。在一方面，本发明采用纳米孔阵列，每个纳米孔具有检测区域，每当聚合物通过该检测区域时产生光学信号。在该方面的一些实施方案中，不同的单体用产生可区分的光学信号的不同光学标记物标记。在一些实施方案中，聚合物是核酸聚合物，并且不同种类的核苷酸用产生可区分的光学信号的不同光学标记物标记，这允许核苷酸根据它们的光学标记物发出的光学信号被鉴定。在一些实施方案中，聚合物分析物是带电荷的，并且转位方向由跨纳米孔阵列的电场方向控制。
在另一方面，本发明的聚合物分析物在其端部没有防止聚合物分析物在插入后离开纳米孔的一个或任一个口(orifice)的堵塞或阻挡部分。也就是说，本发明的聚合物分析物，特别是核酸聚合物分析物具有可自由穿过纳米孔的自由端部。在一些实施方案中，由于标记物和纳米孔的孔眼(bore)之间的相互作用，和/或由于由标记物和为了降低转位速度的特定目的而附接的其他添加物(adduct)引起的空间限制(steric constraint)，标记的聚合物分析物可以以降低的速度穿过或转位通过纳米孔(如与未标记的聚合物分析物相比)。这样的添加物可以是这样的有机分子，其具有的分子量与常规有机染料的分子量在相同范围内，例如在200至2000Da范围内，或在200至1200Da范围内。在这些实施方案中，由于不需要聚合物分析物端部的阻挡基团，样品制备大大简化，从而提高了分析效率并降低了分析成本。如下文所述，在每次逆转转位方向期间，一些分析物可能从阵列中丢失，但是此类损失可以通过选择更长的聚合物分析物用于分析和通过使用更大的阵列，即具有更大数目的纳米孔的阵列来减轻。在一些实施方案中，如图4中所示，长的聚合物分析物(400)，例如单链核酸，当游离在溶液中时形成无规卷曲(402)，这可包括或可不包括聚合物内相互作用，例如碱基配对。在一些实施方案中，足够长的聚合物分析物的转位速率可以通过由这些聚合物的端部形成稳定的无规卷曲被降低。但是意图不受理论束缚地，认为多核苷酸的无规卷曲状态的较大的熵对多核苷酸在转位期间存在的延伸状态提供了回复力(restoringforce)，从而减慢了转位速度。这种无规卷曲还可以防止在转位逆转期间，特别是在穿行到聚合物的中心部分时丢失聚合物。一些实施方案可以提供聚合物分析物的群体，该群体包含长度为至少1000个单体或长度为至少10,000个单体的成员。一些实施方案可以提供核酸聚合物，该核酸聚合物包含长度为至少1000个核苷酸或长度为至少10,000个核苷酸，或长度为至少20,000个核苷酸的成员。
图1A-1F示出了本发明的数个实施方案的方面。在图1A中，带负电荷的聚合物分析物(100)(例如，单链多核苷酸)在跨阵列(102)的电场或电压差(106)下被暴露于第一腔室(104)中的纳米孔阵列(102)，该电场或电压差(106)使聚合物分析物(100)的扩散偏向并穿过纳米孔(例如，110)并进入第二腔室(108)。未示出与阵列(102)的每个纳米孔相关联的检测区域或用于从检测区域收集信号的检测器。可以选择检测区域来产生电学和/或光学信号。在一些实施方案中，光学信号在检测区域产生；例如，FRET信号可以由受体标记的聚合物经过检测区域中的供体标记的纳米孔时产生，例如，诸如在美国专利8,771,491、国际专利公开WO2014/190322或类似文献中公开的，其通过引用并入本文。可选地，可以从聚合物分析物上的荧光标记物直接检测光学标记物，例如，如在Huber，美国专利公开2016/0122812中公开的，其通过引用并入本文。在后一种情况中，检测区域受时间间隔限定，在该时间间隔中，光学标记物从在纳米孔内的受约束状态转变为离开纳米孔后的猝灭状态。猝灭可以通过采用相互猝灭的荧光标记物或外来猝灭剂，例如附接了猝灭部分的随机序列寡核苷酸(例如，5-8聚体)完成。
猝灭剂可以包含在纳米孔测序条件下(i)基本上无荧光，(ii)与单链核酸，特别是单链DNA相结合，以及(iii)非辐射地从其他分子吸收激发能量并非辐射地释放其的任何化合物(或化合物的组)。在一些实施方案中，猝灭剂进一步与单链DNA非共价结合。各种各样的猝灭化合物可用于本发明，包括但不限于普通合成染料如花青和呫吨染料的非荧光衍生物。可以在美国专利6,323,337、6,750,024和类似参考文献中找到在选择猝灭化合物方面的指导，这些参考文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可选地，被聚合物分析物(100)占据的部分纳米孔可以通过测量通过阵列(102)的纳米孔的总电流来监测。在任何插入之前，可以记录稳定的初始电流(112)，然后在电场(106)的影响下将聚合物分析物(以某个预定浓度)放置在第一腔室(104)中之后，阵列(102)中某平均比例的纳米孔将被聚合物分析物占据，产生跨阵列(102)的电流下降，到达某稳态值(114)。类似地，在一些实施方案中，被光学标记的聚合物分析物占据的部分纳米孔可以作为总光学信号(即，从阵列中所有纳米孔收集的光学信号的积分或总和)的函数来监测。
在一些实施方案中，此时此刻电场(106)的极性可被逆转以改变聚合物分析物进行转位的方向。在一些实施方案中，可以进行仅单次逆转。在其他实施方案中，对于预定时间间隔可进行多次逆转。在一些实施方案中，在均匀的，即相等的时间间隔之后进行多次逆转。在此类实施方案中，对于一些聚合物分析物，聚合物的相同区段将多次穿过检测区域。在一些实施方案中，逆转的多次将是偶数。在完成偶数次逆转的一些实施例中，聚合物分析物的净移动将是从第一腔室到第二腔室。
图1C示出了纳米孔阵列(102)的剖视图，示出了纳米孔(111)和在不同程度上通过其各自的纳米孔转位的聚合物分析物(116a-g)(为了方便，全部以相同长度示出)。为了说明起见，假设在任何给定的时间，纳米孔沿经历转位的群体中的聚合物的位置是随机的，并且同样可能地在沿该聚合物长度的任何地方。在此类条件下，如果信号检测在第一次转位方向逆转之前开始并进行一段时间，将存在一部分聚合物可能被丢失(例如，图1D中的聚合物118)，并且在第一次转位方向逆转之后不可用于信号检测。某些丢失可能发生在每个逆转循环中。从检测区域收集来自各个聚合物的区段(120)的信号，然后立刻进行逆转(122)。如果逆转后的转位使聚合物移动通过检测区域，产生覆盖相同区段(120)的信号并收集所述信号，则在这些区段中收集到针对感兴趣的特征的两组信号。例如，如果聚合物是具有受体标记的核苷酸的核酸聚合物，并且纳米孔的反式侧(例如，参见图1A-B)包含相关联的供体标记物，则可以收集来自在供体和受体之间产生的FRET信号的两组数据。然后，这些数据可以被重新排序和排列，以增加核苷酸和/或序列调用(sequence call)的信噪比。
以获得来自相同的聚合物的特征或区段的冗余数据(例如，单体序列信息)为目的，转位逆转的模式可广泛地变化；也就是说，例如，转位逆转的次数、逆转之间的时间间隔以及在时间间隔期间的转位速度可广泛地变化。在一些实施方案中，信号产生和数据收集是连续的，从而使得对于给定聚合物从其进入纳米孔的时间直到其完全离开纳米孔的时间的数据被收集。在一些实施方案中，在聚合物的进入时间和离开时间之间，实施至少一次转位逆转。在其他实施方案中，在进入时间和离开时间之间，实施多次转位逆转。在一些实施方案中，转位逆转的多次是大于一的偶数。在一些实施方案中，逆转后的转位持续时间对于所有逆转可以是相同的，从而收集来自基本上相同的聚合物区段的冗余数据。在一些实施方案中，逆转后的转位持续时间可以不同。在一些实施方案中，逆转后的不同转位持续时间是预定的。在一些实施方案中，转位方向的逆转是循环性的，其中逆转及其相关的转位持续时间被作为相同的对实施；也就是说，在一个或更多个循环中实现转位方向的逆转，所述一个或更多个循环(i)逆转转位方向，随后是第一持续时间或时间t1的转位，以及(ii)逆转转位方向，随后是第二持续时间或时间t2的转位。在一些实施方案中，第一时间和第二时间是相等的。在其他实施方案中，t1<t2，使得聚合物以棘齿样(rachet-like)方式穿过纳米孔。第一和第二转位时间的选择(例如，对于带负电荷的聚合物，例如核酸聚合物)可以基于转位方法、电场强度、聚合物长度的平均值和标准差、检测区域产生的信号类型(例如FRET信号)(无论信号是由单个单体还是多个单体产生的)，等等。在一些实施方案中，例如，为了优化阵列中聚合物的占据率的目的，跨纳米孔阵列的电压对于转位逆转之间的不同时间间隔可能是不同的，或者在该间隔期间它可以是变化的。因此，在包括重复逆转转位方向的步骤的一些实施方案中，可以包括具有以下(i)、(ii)或(iii)的转位逆转模式：(i)逆转之间的转位持续时间和跨纳米孔阵列的电压水平的周期性变化；(ii)预定系列的逆转之间的可以是周期性或非周期性的转位持续时间和跨纳米孔阵列的电压水平；或(iii)例如，为了优化操作参数，例如阵列中纳米孔的聚合物占用率而被实时自动选择的逆转之间的转位持续时间和电压水平。这样的实时选择可以响应于被分析的群体中聚合物的特定尺寸分布。
图1E-1F示出了本发明的实施方式，其中核酸聚合物分析物作为双链DNA被放置在第一腔室(104)中，每个双链DNA具有可被纳米孔捕获的单链尾部。在此类实施方式中，选择允许单链DNA而不允许双链DNA转位的纳米孔；因此，在捕获后，双链部分在转位期间被解开。如上文图示的实施方案中，在该实施方式中，取决于逆转开始时聚合物在纳米孔中的位置，聚合物可能从纳米孔阵列中丢失，并且变得不能用于进一步测量，例如，如由图1F中的聚合物(130和131)图示的。
图2示出了通过本发明的方法获得的冗余序列数据如何可用于改进核酸聚合物的序列分析。在此图示中，受体标记的或荧光标记的核酸聚合物(209)的区段(210)穿过具有检测区域(236)的纳米孔。在一些实施方案中，这样的检测区域可以包括供体，该供体可以被激发以使得在供体的FRET距离内在多核苷酸上的受体之间发生荧光共振能量转移(FRET)，其后受体发射指示受体所附接的核苷酸的荧光信号。在其他实施方案中，这样的检测区域可以包括一个体积(例如，在纳米孔的出口处)，在该体积内多核苷酸上的荧光标记物可被激发(例如，因为暂时不存在猝灭)。在一些实施方案中，针对每个不同的核苷酸产生不同的且可区分的受体信号或荧光信号。在图2中，示出了来自仅由“T”核苷酸产生的信号的数据。在图中表示为“序列读取数据”(238)(其也是仅来自T)的原始数据的图示时间记录中，聚合物(209)的转位方向在标记为221、222、223和224的四处时间被逆转。也就是说，显示了对于三个正向信号和两个反向信号的数据。紧挨图示原始数据上方的是区段(210)的拷贝，其序列以反向顺序和正向(或正确)顺序交替显示(显示为A(第1正向子读段)、B(第1反向子读段)、C(第2正向子读段)、D(第2反向子读段)和E(第3正向子读段))，以在这些子读段重复穿过检测区域(236)时给出区段(210)核苷酸的“完整”序列读段。区段(210)的拷贝A、B、C、D和E对应于所图示的原始数据(238)。在该图示中，来自区段(210)的每个核苷酸的信号在五次单独的测量中被收集。区段(210)的碱基调用(base call)可以从序列读取数据(238)通过比对多个子读段数据A、B、C、D或E获得。在一些实施方案中，可组合仅来自子读段的子集的数据，例如，仅正向子读段(A、C和E)。在其他实施方案中，正向和反向子读段都可被使用，通过在比对之前逆转正向或反向子读段的子读段数据的时间顺序(例如232和234)，使得数据中呈现的基础核苷酸序列处于相同的顺序。然后，传统的比对和数据分析技术可用于从子读段数据中生成对于区段(210)的碱基调用(240)。对于从标记的A、标记的C和标记的G生成的不同信号中的每一个，类似的数据可以被收集和组合。在一些实施方案中，聚合物分析物的序列通过组合这些分析来确定。
在一些实施方案中，本发明涉及通过以下步骤分析聚合物特征的方法:(a)提供纳米孔阵列，其中每个纳米孔能够提供第一腔室和第二腔室之间的流体连通，并能够提供与转位穿过其的聚合物的至少一种性质相关的信号，并且其中纳米孔阵列中的一定百分率的纳米孔包含聚合物，所述聚合物从第一腔室向第二腔室延伸；(b)使聚合物穿过纳米孔阵列的纳米孔从第一腔室转位到第二腔室并检测来自每个正在转位的聚合物的正向信号；(c)逆转聚合物的转位并检测来自其穿过纳米孔的转位被逆转的每个聚合物的反向信号；以及(d)根据正向和反向信号确定每个这样的聚合物的至少一种性质。在一些实施方案中，可以重复进行逆转跨纳米孔阵列转位的方向的步骤。在此类实施方案中，聚合物转位的重复逆转可以持续到具有聚合物的纳米孔的所述百分率下降到预定水平以下或者所述逆转被重复预定次数，以先发生者为准。在一些实施方案中，这样的百分率可以是被聚合物占据并能够产生信号的纳米孔的5％或更少，或者可以是被聚合物占据并能够产生信号的纳米孔的10％或更少。在一些实施方案中，预定数量的逆转可以是多次逆转；在其他实施方案中，预定数量的逆转可以在从4到100次逆转的范围内。在一些实施方案中，多次逆转是大于一的偶数。在一些实施方案中，逆转的多次是偶数。在一些实施方案中，进行逆转循环；也就是说，进行成对逆转。在一些实施方案中，进行至少多个逆转循环；或者进行至少两个逆转循环；或者进行至少三个逆转循环。在一些实施方案中，聚合物是多核苷酸并且聚合物的至少一种性质是核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸的至少两种或更多种不同核苷酸具有产生可区分的光学信号的荧光标记物，根据所述光学信号可以确定核苷酸的身份。
在一些实施方案中，本发明以基于光学的确定聚合物的特征的方法实施，该方法包括以下步骤：(a)提供包括固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧面、第二侧面和从其穿过的多个孔，其中所述固相膜使第一腔室和第二腔室隔开，使得每个孔提供第一腔室和第二腔室之间的流体连通，并且其中每个孔具有检测区域；(b)使聚合物穿过所述孔从第一腔室转位到第二腔室，每个聚合物具有一个或更多个与其附接的光学标记物，该光学标记物能够产生指示该聚合物的特征的光学信号；(c)照射固相膜的第二侧面，使得光学标记物在检测区域中产生光学信号；(d)在检测区域中检测来自光学标记物的指示聚合物的特征的光学信号，以产生聚合物数据；(e)逆转聚合物的转位；(f)重复步骤(c)和(d)以产生冗余聚合物数据；以及(g)根据所述冗余聚合物数据确定聚合物的特征。如上文，在一些实施方案中，聚合物是多核苷酸并且聚合物的至少一种性质是核苷酸序列。在一些实施方案中，具有不同光学信号的不同荧光标记物被附接到不同种类的核苷酸单体，使得可以通过检测来自不同光学标记物的光学信号来鉴定不同种类的核苷酸。在一些实施方案中，用具有不同光学信号的不同荧光标记物标记至少两种不同种类的核苷酸。
在一些实施方案中，聚合物可以是多核苷酸或蛋白质。仍然在其他实施方案中，聚合物可以是多核苷酸。在另外的实施方案中，多核苷酸可以是单链核酸。在一些实施方案中，被分析或测定的聚合物的特征是聚合物的单体序列，例如核苷酸序列。在一些实施方案中，聚合物上的光学标记物是FRET标记物，例如专利公布8,771,491、US2013/0203050或WO2014/190322中描述的，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，孔包括蛋白质纳米孔。简而言之，在一些实施方案中，在每个检测区域处，FRET标记物包含至少一个FRET供体标记物和至少一个FRET受体标记物，其中激发光束激发FRET供体标记物，其继而将能量转移至在供体标记物的FRET距离内的FRET受体标记物，该受体标记物继而发射光学信号。通常，激发光束包含第二波长并且光学信号包含与第二波长不同第一波长例如，以允许落射照射系统的使用。在一些实施方案中，检测区域可以从第一侧面的不透明涂层向第二侧面延伸，并且包括紧邻孔和/或纳米孔出口的膜外空间。在一些实施方案中，这样的膜外空间从纳米孔或孔的出口延伸不超过50nm；在其他实施方案中，这样的膜外空间从纳米孔或孔的出口延伸不超过10nm。
简而言之，如美国专利8,771,491中更全面地描述的，在一些实施方案中，孔和/或纳米孔可以用一种或更多种FRET供体标记，而聚合物可以各自用FRET受体标记，以使得至少选定的供体和受体形成FRET对；也就是说，供体的发射光谱与至少一个受体的吸收光谱重叠，使得如果满足其他条件(例如供体激发、供体和受体在FRET距离内、供体和受体具有适当的相对取向等等)，则FRET相互作用可以发生。在FRET相互作用中，供体的激发能量被非辐射地转移到受体，其后受体发射具有比供体的激发能量低的能量的光学信号。供体通常通过用例如由激光产生的光束照射它们而被激发。
在一些实施方案中，蛋白质纳米孔可以插入不含或仅含少量脂质双层的固态膜中以形成阵列，如Huber等人的美国专利公开2013/0203050中所描述的，其通过引用并入本文。
在一些实施方案中，其中激发光束递送和光学信号收集通过单个物镜发生的落射照射系统可用于直接照射纳米孔上的聚合物分析物或供体上的标记物。用于本发明的共聚焦落射照射系统的基本部件在图3中示出。激发光束(302)穿过二向色体(304)并到将激发光束(302)聚焦(310)到分层膜(300)上的物镜(306)上，其中标记物被直接激发以发射光学信号，例如荧光信号，或通过FRET相互作用被间接激发以发射光学信号。这样的光学信号被物镜(306)收集，并且被导向二向色体(304)，二向色体被选择为其传递激发光束(302)的光，但反射光学信号(311)的光。被反射的光学信号(311)穿过透镜(314)，透镜(314)通过针孔(316)将其聚焦到检测器(318)上。
控制转位速度
多核苷酸通过纳米孔的转位速度的作用和对其控制的需要在纳米孔技术领域中已经被认识到，其中电流的变化被用于鉴定转位分析物。已经使用了各种各样的方法来控制转位速度，其包括可被无明显难度地实时调整(例如，跨纳米孔的电压电势、温度等等)的方法，以及有难度地只能在运行中调整(反应缓冲液粘度、带电荷的侧链在蛋白质纳米孔的孔眼中的存在或不存在、反应缓冲液的离子组成和浓度、与多核苷酸分析物附接或杂交的减速基团、分子马达等等)的方法两者，例如Bates等人，Biophysical J.,84:2366-2372(2003)；Carson等人，Nanotechnology,26(7):074004(2015)；Yeh等人，Electrophoresis,33(23):58-65(2012)；Meller,J.Phys.Cond.Matter,15:R581-R607(2003)；Luan等人，Nanoscale,4(4):1068-1077(2012)；Keyser,J.R.Soc.Interface,8:1369-1378(2011)等等，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，包括一个步骤或更多个步骤以便有效控制当实施本发明的方法时的转位速度，例如控制电压电势、温度等；在其他实施方案中，包括确定在实施本发明的方法时未被有效控制或改变的转位速度的一个步骤或更多个步骤，例如确定反应缓冲液粘度、离子浓度等。关于后者，在一些实施方案中，通过提供具有在从百分之1到60范围内的甘油或等效试剂的反应缓冲液来选择转位速度。
如上所述，转位速度部分取决于跨纳米孔的电压差(或电场强度)和核酸聚合物于其中被暴露于纳米孔的第一腔室的反应混合物中的条件。纳米孔对核酸聚合物的捕获速率取决于这些聚合物的浓度。在一些实施方案中，用于纳米孔测序的常规反应混合物条件，例如，1M KCl(或等效盐，例如NaCl、LiCl，或类似物)和pH缓冲体系(其例如确保了正被使用的蛋白质，例如蛋白质纳米孔、核酸酶，诸如此类不被变性)可用于本发明。在一些实施方案中，可以使用pH缓冲体系以保持pH基本上恒定在6.8-8.8范围内的值。在一些实施方案中，跨纳米孔的电压差可以在从70mV至300mV的范围内。在其他实施方案中，跨纳米孔的电压差可以在从80mV至200mV的范围内。可以使用常规测量技术来选择适当的操作电压。可以使用可商购的仪器来容易地测量跨纳米孔的电流(或电压)。可以选择电压差使得转位速度在期望的范围内。在一些实施方案中，转位速度的范围包括小于4000个核苷酸/秒的那些速度。在一些实施方案中，转位速度的范围包括小于1000个核苷酸/秒的那些速度。在其他实施方案中，转位速度的范围是从10至800个核苷酸/秒；在其他实施方案中，转位速度的范围是从10至600个核苷酸/秒；在其他实施方案中，转位速度的范围是从200至800个核苷酸/秒；在其他实施方案中，转位速度的范围是从200至500个核苷酸/秒。
在一些实施方案中，用于对单链核酸实施上述方法的装置通常包括提供用于建立跨纳米孔的电场的一组电极(其可以构成阵列)。通过将单链核酸放置于第一腔室中的电解质(即反应缓冲液)中使它们暴露于纳米孔，通过在第一腔室中放置负电极，该腔室被配置为层化膜的“顺式”侧。在施加电场时，带负电荷的单链核酸被纳米孔捕获，并转位到位于分层膜另一侧的第二腔室，第二腔室通过将正电极放置在该腔室中而被配置为膜的“反式”侧。如以上提到的，转位速度部分取决于第一腔室和第二腔室中电解质的离子强度以及跨纳米孔施加的电压。在基于光学的检测中，转位速度可以通过例如，使用标记的单链核酸的预定标准物的初步校准测量来选择，所述预定标准物对于不同的电压以不同预期速率/纳米孔生成信号。因此，对于DNA测序应用，初始转位速度可以基于来自以上讨论的此类校准测量的信号速率以及基于相对信号强度分布的测量来选择。因此，根据此类测量，可以选择允许或最大化可靠的核苷酸鉴定的跨纳米孔阵列的电压。在一些实施方案中，可以使用来自被分析的模板样品的核酸(代替预定标准序列或在预定标准序列之外被使用)进行此类校准。在一些实施方案中，可以在测序运行期间实时执行此类校准，并且可以基于此类测量实时改变所施加的电压，例如以最大化核苷酸特异性信号的获取。
纳米孔阵列
如以上讨论的，用于本发明的纳米孔可以是固态纳米孔、蛋白质纳米孔、或包括蛋白质纳米孔的杂化纳米孔或被配置在固态膜或类似的框架中的有机纳米管例如碳纳米管或石墨烯纳米管。纳米孔的一个功能是约束聚合物分析物，例如多核苷酸，使得它们的单体依次通过检测区域(或信号产生区域)(也就是说，使得核苷酸一次一个通过检测区域，或以单个纵列(single file)通过)。根据本发明，纳米孔以阵列形式提供，通常是平面阵列。在一些实施方案中，纳米孔阵列例如，以直线图案、六边形图案等规则地排列。在一些实施方案中，纳米孔阵列是随机阵列，例如，在一些实施方案中，是如泊松分布所描述的随机阵列。在一些实施方案中，阵列的纳米孔被设置在已知位置。在一些实施方案中，纳米孔阵列包括多个纳米孔。在一些实施方案中，该多个包括至少10个纳米孔，或者在其他实施方案中，包括至少100个纳米孔，或者在其他实施方案中，包括至少1000个纳米孔。仍然在其他实施方案中，纳米孔阵列包括从10至10,000范围内的多个纳米孔。在一些实施方案中，纳米孔的另外的特征包括通行单链核酸，而不通行双链核酸，或同等体积的分子。在一些实施方案中，纳米孔的另外的特征包括(i)通行单链核酸，而不通行双链核酸，或同等体积的分子和/或(ii)约束核苷酸上的荧光标记物，从而使荧光信号的产生被抑制或定向，使得荧光信号无法收集。
在一些实施方案中，结合本发明的方法和装置使用的纳米孔以阵列的形式被提供，例如纳米孔簇的阵列，所述阵列可规则地设置在平坦表面上或设置在平坦表面的已知位置上。在一些实施方案中，簇各自处于单独的分辨率受限的区域中，使得来自不同簇的纳米孔的光学信号能够通过所采用的光学检测系统区分，但来自同一簇内的纳米孔的光学信号不一定能够通过采用的光学检测系统被指定到该簇内的特定纳米孔。
固态纳米孔可以用多种材料制造，包括但不限于氮化硅(Si3N4)、二氧化硅(SiO2)等。用于分析应用例如DNA测序的纳米孔的制造和操作被公开于通过引用并入的以下示例性参考文献中：Ling，美国专利7,678,562；Hu等人，美国专利7,397,232；Golovchenko等人，美国专利6,464,842；Chu等人，美国专利5,798,042；Sauer等人，美国专利7,001,792；Su等人，美国专利7,744,816；Church等人，美国专利5,795,782；Bayley等人，美国专利6,426,231；Akeson等人，美国专利7,189,503；Bayley等人，美国专利6,916,665；Akeson等人，美国专利6,267,872；Meller等人，美国专利公布2009/0029477；Howorka等人，国际专利公布WO2009/007743；Brown等人，国际专利公布WO2011/067559；Meller等人，国际专利公布WO2009/020682；Polonsky等人，国际专利公布WO2008/092760；Van der Zaag等人，国际专利公布WO2010/007537；Yan等人，Nano Letters，5(6)：1129-1134(2005)；Iqbal等人，Nature Nanotechnology，2:243-248(2007)；Wanunu等人，Nano Letters，7(6)：1580-1585(1134)；Dekker，Nature Nanotechnology，2:209-215(2007)；Storm等人，NatureMaterials，2:537-540(2003)；Wu等人，Electrophoresis，29(13)：2754-2759(2008)；Nakane等人，Electrophoresis，23：2592-2601(2002)；Zhe等人，J.Micromech.Microeng.,17:304-313(2007)；Henriquez等人，The Analyst,129:478-482(2004)；Jagtiani等人，J.Micromech,Microeng.，16：1530-1539(2006)；Nakane等人，J.Phys.Condens.Matter,15R1365-R1393(2003)；DeBlois等人，Rev.Sci.Instruments,41(7):909-916(1970)；Clarke等人,Nature Nanotechnology,4(4):265-270(2009)；Bayley等人,美国专利公布2003/0215881等等。
在一些实施方案中，本发明包含具有一个或更多个阻光层，即一个或更多个不透明层的纳米孔阵列。通常，纳米孔阵列被制造在薄片材料中，例如硅、氮化硅、氧化硅、氧化铝等，其容易透射光，特别是在所使用的厚度，例如小于50-100nm时。对于分析物的电学检测，这不是问题。然而，在对于标记的分子转位穿过纳米孔的基于光学的检测中，穿过阵列透射的光总是激发期望的反应位点外面的材料，从而产生例如，来自非特异性背景荧光、来自尚未进入纳米孔的分子的标记物的荧光等等的光噪声。在一方面，本发明通过提供具有反射和/或吸收来自激发束的光的一个或更多个阻光层的纳米孔阵列，从而减少对于在与阵列的纳米孔相关的预期反应位点处产生的光学信号的背景噪声来解决此问题。在一些实施方案中，这允许通过直接照射使光学标记物在预期的反应位点中被激发。在一些实施方案中，不透明层可以是金属层。这种金属层可以包括Sn、Al、V、Ti、Ni、Mo、Ta、W、Au、Ag或Cu。在一些实施方案中，这种金属层可以包括Al、Au、Ag或Cu。仍然在其他实施方案中，这种金属层可以包括铝或金，或者可以仅包括铝。不透明层的厚度可以极大地变化，并取决于构成该层的材料的物理性质和化学性质。在一些实施方案中，不透明层的厚度可以是至少5nm、或至少10nm、或至少40nm。在其他实施方案中，不透明的层的厚度可以在5-100nm的范围内；在其他实施方案中，不透明层的厚度可以在从10-80nm的范围内。不透明层不需要阻挡(即反射或吸收)来自激发光束的100％的光。在一些实施方案中，不透明层可阻挡来自激发束的入射光的至少10％；在其他实施方案中，不透明层可以阻挡来自激发束的入射光的至少50％。
不透明层或涂层可以通过本领域已知的各种技术被制造在固态膜上。可以使用材料沉积技术，包括化学汽相沉积、电沉积、外延(epitaxy)、热氧化、物理汽相沉积，包括蒸发和溅射、铸造等。在一些实施方案中，可以使用原子层沉积，例如美国专利6,464,842；Wei等人，Small，6(13)：1406-1414(2010)，其通过引用并入。
在一些实施方案中，1-100nm的通道或孔可穿过固体基底通常为平面基底例如膜而形成，分析物例如单链DNA被诱导转位穿过所述通道或孔。在其他实施方案中，2-50nm的通道或孔穿过基底而形成；并且在另外其他实施方案中，2-30nm、或2-20nm、或3-30nm、或3-20nm、或3-10nm的通道或孔穿过基底而形成。产生纳米孔的固态方法提供稳健性和耐久性以及调整纳米孔的尺寸和形状的能力、在圆片规模上制造高密度纳米孔阵列的能力、与基于脂质的系统相比更佳的机械、化学和热学特性，以及与电学或光学读出技术整合的可能性。另一方面，通过常规蛋白质工程方法，生物纳米孔提供可重复的窄的孔眼或腔，尤其是在1-10纳米范围内的孔眼或腔，以及用于调节纳米孔的物理和/或化学性质的技术以及用于直接地或间接地附接基团或元件，例如荧光标记物的技术，所述荧光标记物可以是FRET供体或受体。蛋白质纳米孔通常依赖精致的脂质双层获得机械支撑，并且具有精确尺寸的固态纳米孔的制造仍然是挑战性的。在一些实施方案中，可以将固态纳米孔与生物纳米孔组合以形成克服这些缺点中的一些的所谓的“杂化”纳米孔，从而提供生物孔蛋白的精确度与固态纳米孔的稳定性。对于光学读出技术，杂化纳米孔提供纳米孔的精确位置，这大大简化了数据采集。
在一些实施方案中，簇还可以通过将蛋白质纳米孔布置在由含有孔阵列的固相膜支撑的脂质双层中来形成。例如，这样的阵列可以包括被制造(例如钻、蚀刻等)在固相支撑物中的孔。这些孔的几何结构可以根据所采用的制造技术而变化。在一些实施方案中，每个这样的孔与单独的分辨率受限的区域相关联或被其封围；然而，在其他实施方案中，多个孔可以在同一分辨率受限区域内。尽管这些区域通常由于常规制造方法而基本上相同，但不同簇的孔的横截面积可以广泛地变化并且可以相同或不同。在一些实施方案中，孔具有在从10nm至200nm范围内的最小线性尺寸(例如在圆孔的情况下为直径)，或者具有在从约100nm2至3×104nm2范围内的面积。跨这些孔可设置脂质双层。例如，通过在插入步骤期间控制蛋白质纳米孔的浓度，可以改变每个孔的蛋白质纳米孔的分布。在此类实施方案中，纳米孔的簇可以包括随机数目的纳米孔。在蛋白质纳米孔随机插入孔的一些实施方案中，含有一个或更多个孔的簇具有平均大于零的蛋白质纳米孔数；在其他实施方案中，此类簇具有大于0.25的蛋白质纳米孔数；在其他实施方案中，此类簇具有大于0.5的蛋白质纳米孔数；在其他实施方案中，此类簇具有大于0.75的蛋白质纳米孔数；在其他实施方案中，此类簇具有大于1.0的蛋白质纳米孔数。
在一些实施方案中，本发明的方法和装置包括具有贯穿其中的孔的阵列的固相膜，例如SiN膜，所述孔提供第一腔室和第二腔室(有时也称为“顺式腔室”和“反式腔室”)之间的连通并在面向第二腔室或反式腔室的表面上支撑脂质双层。在一些实施方案中，这样的固相膜中的孔的直径可以在10nm至200nm的范围内，或者在20nm至100nm的范围内。在一些实施方案中，此类固相膜还包括被插入到脂质双层中的蛋白质纳米孔，所述蛋白质纳米孔被插入在该双层在面向反式腔室的表面上跨越孔的区域中。在一些实施方案中，使用本文所述的技术将这种蛋白质纳米孔从固相膜的顺式侧面插入。在一些实施方案中，此类蛋白质纳米孔具有与α-溶血素相同或相似的结构，因为它包括沿着轴线的桶或孔眼，并且在一端具有“帽”结构而在另一端具有“茎”结构(使用来自Song等人，Science，274：1859-1866(1996)的术语)。在使用此类蛋白质纳米孔的一些实施方案中，向脂质双层中的插入导致蛋白质纳米孔被取向为使得其帽结构被暴露于顺式腔室而其茎结构被暴露于反式腔室。
在一些实施方案中，本发明可以采用成簇的杂化纳米孔，特别是对于多核苷酸的基于光学的纳米孔测序。此类纳米孔包括固态口(orifice)或孔，蛋白质生物传感器例如蛋白质纳米孔被稳定地插入所述固态口或孔。带电荷的聚合物可通过常规蛋白质工程技术被附着至蛋白质纳米孔(例如α溶血素)，此后所施加的电场可用来将蛋白质纳米孔引导至固态膜中的孔中。在一些实施方案中，固态基底中的孔被选择为略小于蛋白质，从而防止所述蛋白质转位通过孔。替代地，蛋白质将被嵌入到固态口中。
在一些实施方案中，供体荧光团被附接至蛋白质纳米孔。然后通过跨固态纳米孔或孔施加电场将该复合物插入固态孔或纳米孔(例如，直径3-10nm)，直到蛋白质纳米孔被传输到固态纳米洞中以形成杂化纳米孔。杂化纳米孔的形成可通过以下来验证：(a)基于对固态纳米孔的部分阻挡，插入的蛋白质纳米孔导致电流的下降，和(b)供体荧光团的光学检测。
固态纳米孔或合成纳米孔可以以多种方式被制备，如上文引用的参考文献所例示的。在一些实施方案中，可使用氦离子显微镜在多种材料中钻出合成的纳米孔，例如，如Yang等人,Nanotechnolgy,22:285310(2011)公开的，其通过引用并入本文。支撑已经被加工成自持式膜(a free-standing membrane)的薄膜材料例如氮化硅的一个或更多个区域的芯片被引入到氦离子显微镜(HIM)腔室中。HIM的发动机控制器用于在显微镜被设置为低放大率时将自持式膜带入离子束的路径。在靠近自持式膜但在固体基底上的区域，包括焦点和消像散(stigmation)的光束参数被调节。一旦参数被恰当地固定，移动芯片位置使得自持式膜区域被集中在离子束扫描区域上并且光束被消隐。HIM视野被设置为足以包含整个预期的纳米孔图案并且足以在未来的光学读出(即，取决于光学放大率、相机分辨率等)中有用的尺寸(以μm计)。然后，一旦离子束在导致足以移除所有或大部分的膜自体荧光的总离子剂量的像素停留时间(pixel dwell time)下穿过整个视野，将离子束光栅化。然后将视野设置为适当的值(小于上面使用的值)以进行对单个纳米孔或纳米孔阵列的平版印刷限制(lithographically-defined)的碾磨。图案的像素停留时间被设定为产生一个或更多个预定直径的纳米孔，所述一个或更多个预定直径是在样品加工之前通过使用校准样品确定的。对于单个芯片上的每个期望的区域和/或对于被引入到HIM腔室中的每个芯片重复该完整过程。
在一些实施方案中，纳米孔可以具有一个或更多个被附接以在基于光学的纳米孔测序方法中使用的标记物。所述标记物可以是福斯特共振能量传递(FRET)对的成员。此类标记物可以包括有机荧光团、化学发光标记物、量子点、金属纳米颗粒和/或荧光蛋白。靶核酸的每个核苷酸可以具有一个不同的标记物。附接至核苷酸的标记物可以选自由有机荧光团组成的组。孔蛋白质中的标记物附接位点可以通过常规的蛋白质工程方法产生，例如可以构建将允许标记物的特异性结合的突变蛋白。作为示例，可将半胱氨酸残基插入在蛋白质的所需位置处，这插入了可被用于附接标记物的巯基(SH)基团。半胱氨酸可以取代天然存在的氨基酸，或者可以作为额外氨基酸(addition amino acid)被掺入。然后将马来酰亚胺活化的标记物共价附接至蛋白质纳米孔的巯基残基上。在一个优选的实施方案中，标记物与蛋白质纳米孔或标记物与核酸的附接是可逆的。通过施加可裂解的交联剂，引入容易断裂的化学键(例如S-S键或pH不稳定键)，并且在满足相应的条件时可去除标记物。
用于纳米孔和分析物的标记物
在一些实施方案中，纳米孔可以用一个或更多个量子点来标记。特别地，在一些实施方案中，一个或更多个量子点可以被附接至纳米孔，或者被附接至邻近于纳米孔(并且在纳米孔的FRET距离内)的固相支持物，并且在与分析物上的受体的FRET反应中用作供体。量子点的此类应用是众所周知的并且在科学和专利文献中被广泛地描述，例如在美国专利6,252,303、6,855,551、7,235,361等中，其通过引用并入本文。
可以用作孔标记物的量子点的一个实例是可以在水溶液中合成的CdTe量子点。可以用亲核基团例如伯胺、硫醇或官能团例如羧酸官能化CdTe量子点。CdTe量子点可以包括巯基丙酸加帽配体，所述巯基丙酸加帽配体具有可以用于将量子点共价连接至蛋白质孔外部的伯胺的羧酸官能团。交联反应可以使用生物缀合领域的普通技术人员已知的(同双功能以及异双功能)标准交联试剂来完成。可能需要注意确保修饰不会损害或实质上损害核酸通过纳米孔的转位。这可以通过改变所采用的用于将供体标记物附着至纳米孔的交联剂分子的长度来实现。
例如，可使用天然α-溶血素蛋白(Song,L.等人，Science 274，(1996):1859-1866)的赖氨酸残基131的伯胺通过1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐/N-羟基磺基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)偶联化学共价结合羧基修饰的CdTe量子点。可选择地，氨基酸129(苏氨酸)可以被改变成半胱氨酸。由于天然α溶血素蛋白质中没有其他半胱氨酸残基，新插入的半胱氨酸的巯基侧基可以被用于共价附接其他化学部分。
生物聚合物，例如核酸分子或聚合物，可以用一个或更多个受体标记物来标记。对于核酸分子，核酸分子的四种核苷酸或结构单元中的每一种可以用受体标记物来标记，从而对于每个天然存在的核苷酸产生标记的(例如，荧光)对应物。受体标记物可以是能量接受分子的形式，所述能量接受分子可以被附接至转化的核酸的一部分上或整条链上的一个或更多个核苷酸。
可以利用多种方法来标记核酸分子或聚合物的单体或核苷酸。可以在使用原始样品作为模板合成新核酸期间将标记的核苷酸掺入核酸中(“通过合成标记”)。例如，核酸的标记可以通过PCR、全基因组扩增、滚环扩增、引物延伸等或通过本领域普通技术人员已知的上述方法的各种组合和延伸来实现。
标记物可以包括反应性基团，例如亲核试剂(胺、硫醇等)。然后可以使用天然核酸中不存在的这些亲核试剂通过胺或硫醇反应性化学物质例如NHS酯、马来酰亚胺、环氧环、异氰酸酯等来附接荧光标记。此类亲核反应性荧光染料(即NHS-染料)是容易从不同来源商购获得的。用小的亲核试剂标记核酸的优点在于，当使用“通过合成标记”方法时此类标记的核苷酸的高效率掺入。由于聚合过程期间标记物的空间位阻，大的荧光标记的核酸构件可能被不理想地通过聚合酶掺入新合成的DNA。
每当使用两种或更多种相互猝灭的染料时，可使用正交附接化学(orthogonalattachment chemistry)将这些染料附接至DNA。例如，NHS酯可被用于与伯胺非常特异性地反应，或马来酰亚胺将与巯基基团反应。伯胺(NH2)或巯基(SH)修饰的核苷酸均可商购获得。这些相对小的修饰容易被掺入聚合酶介导的DNA合成中，并可被用于使用NHS或马来酰亚胺修饰的染料的后续标记反应。对于选择和使用这种正交接头化学的指导可见于Hermanson(上文引用的)。
用于常规附接位置的其他正交附接化学包括用于铜催化反应和非催化反应的Huisgen-型环加成；烯加氧化腈的环加成，例如如在Gutsmiedl等人，Org.Lett.,11:2405-2408(2009)公开的；Diels-Alder环加成，例如在Seelig等人，Tetrahedron Lett.,38:7729-7732(1997)中公开的；羰基连接，例如在Casi等人，J.Am.Chem.Soc,134:5887-5892(2012)；Shao等人，J.Am.Chem.Soc,117:3893-3899(1995)；Rideout，Science，233：561-563(1986)中公开的；迈克尔加成，例如在Brinkley，Bioconjugate Chemistry，3：2-13(1992)中公开的；天然化学连接，例如在Schuler等人，Bioconjugate Chemistry,13:1039-1043(2002)；Dawson等人，Science,266:776-779(1994)中公开的；或通过活化酯的酰胺形成，例如在Hermanson(上文引用的)中公开的。
核酸链中的1、2、3或4种核苷酸的组合可以与它们的标记的对应物交换。标记的核苷酸的各种组合可以被平行测序，例如除了四种单一标记的样品之外用2种标记的核苷酸的组合标记源核酸或DNA，这将导致总共10种不同标记的样品核酸分子或DNA(G、A、T、C、GA、GT、GC、AT、AC、TC)。由于冗余序列读出中重叠的核苷酸位置，得到的序列模式可以允许更准确的序列比对。在一些实施方案中，聚合物例如多核苷酸或多肽可以用附接至单一种类的单体的单一荧光标记物来标记，例如，多核苷酸的每个T(或基本上每个T)用荧光标记物例如花青染料来标记。在此类实施方案中，来自聚合物的荧光信号集合或顺序可以形成特定聚合物的特征或指纹。在一些此类实施方案中，这些指纹可以或可以不提供对于待确定的单体的序列的足够信息。
在一些实施方案中，本发明的特征是用荧光染料或作为相互猝灭的组的成员的标记物来标记聚合物分析物的基本上全部单体。关于标记聚合物分析物的术语“基本上全部”的使用是承认化学标记技术和酶标记技术通常低于100％有效。在一些实施方案中，“基本上全部”意指全部单体的至少80％附接有荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上全部”意指全部单体的至少90％附接有荧光标记物。在其他实施方案中，“基本上全部”意指全部单体的至少95％附接有荧光标记物。
用于对聚合物例如核酸分子测序的方法包括提供插入膜或膜样结构或其他基底中的纳米孔或孔蛋白质(或合成孔)。孔的基部(base)或其他部分可以用一种或更多种孔标记来修饰。基部可以指孔的反式侧面。任选地，孔的顺式侧面和/或反式侧面可以用一种或更多种孔标记物来修饰。待分析的或待测序的核酸聚合物可被用作用于产生标记形式的核酸聚合物的模板，其中所得聚合物中四种核苷酸中的一种或至多全部四种核苷酸被核苷酸的标记的类似物所取代。对纳米孔施加电场，所述电场迫使标记的核酸聚合物穿过纳米孔，同时外部单色光源或其他光源可被用来照射纳米孔，从而激发孔标记物。在核酸的标记的核苷酸穿过、离开或进入纳米孔时、之后或之前，能量从孔标记物被转移到核苷酸标记物，这导致发射较低能量辐射。然后通过共聚焦显微镜装备或本领域普通技术人员已知的胜任单分子检测的其他光学检测系统或光学显微术系统检测核苷酸标记物的辐射。此类检测系统的实例包括但不限于共聚焦显微术、落射照射荧光显微术(epi-illuminationfluorescence microscopy)、全内反射荧光(TIRF)显微术等等。在一些实施方案中，使用了落射照射荧光显微术。
当聚合物的受体标记的单体(例如核苷酸)的受体标记物与供体标记物在标记的单体离开、进入或穿过纳米孔时、之后或之前相互作用时，能量可从孔或纳米孔供体标记物(例如，量子点)转移到聚合物(例如，核酸)上的受体标记物。例如，供体标记物可以定位在纳米孔上或者在纳米孔的顺式侧面或反式侧面或表面上附接于纳米孔，使得供体标记物和受体标记物之间的相互作用或能量转移直到标记的单体离开纳米孔并进入纳米孔通道或开口外部的供体标记物的附近或邻近区域时才发生。结果是，标记物之间的相互作用、从供体标记物到受体标记物的能量转移、能量从受体标记物的发射、和/或对从受体标记物发射的能量的测量或检测可以发生在贯穿纳米孔的通路、通道或开口的外面，例如在纳米孔的顺式侧面或反式侧面的顺式腔室或反式腔室内。对从单体的受体标记物发射的能量的测量或检测可被用来鉴定该单体。
纳米孔标记物可以位于纳米孔的通路、通道或开口的外面，使得标记物可以是可见的或被暴露以有利于标记物被激发或照射。供体标记物和受体标记物之间的相互作用和能量转移以及由于能量转移而引起的受体标记物的能量发射可以发生在纳米孔的通路、通道或开口的外面。这可以促进例如通过光学检测或测量装置检测或测量来自受体标记物的能量发射或光发射的容易性和准确性。
供体标记物可以以各种方式附接并且/或者附接在纳米孔上的多个位点。例如，供体标记物可以被直接地或间接地附接或连接到纳米孔的一个部分或单元。可选择地，供体标记物可被定位为邻近纳米孔。
聚合物(例如，核酸)的每个受体标记的单体(例如核苷酸)可以与定位在聚合物所转位通过的纳米孔或通道的出口上或邻近所述出口或直接地或间接地附接至所述出口的供体标记物顺序地相互作用。供体标记物和受体标记物之间的相互作用可以发生在纳米孔通道或开口的外面，例如在受体标记的单体离开纳米孔之后或在单体进入纳米孔之前。相互作用可发生在纳米孔通道或开口内或部分地发生在纳米孔通道或开口内，例如，当受体标记的单体穿过、进入或离开纳米孔时。
当核酸的四种核苷酸之一被标记时，由单个核苷酸标记物发射产生的时间依赖性信号被转化成与核酸序列中标记的核苷酸的位置相对应的序列。然后针对独立的样品中的四种核苷酸中的每一种重复该过程，并然后比对四个部分性序列以组装整个核酸序列。
当分析多色标记的核酸(DNA)序列时，从一种或更多种供体标记物到可能存在于核酸分子上的四种不同受体标记物中的每一个的能量转移可导致在四种不同波长或颜色(每个与四种核苷酸中的一种相关)处的光发射，这允许直接的序列读出。
供体标记物(在本文中有时也称为“孔标记物”)可被放置为尽可能靠近纳米孔的孔(例如，在出口处)，而不会引起妨碍核酸转位通过纳米孔的阻塞(occlusion)。孔标记物可以具有多种合适的性能和/或特征。例如，孔标记物可具有符合特定要求的能量吸收性质。孔标记物可以具有大的辐射能量吸收截面，范围例如从约0nm至1000nm或从约200nm至500nm。孔标记物可吸收比核酸标记物，例如受体标记物的能量吸收更高的特定能量范围内的辐射。可相对于核酸标记物的吸收能量调节孔标记物的吸收能量，以控制能量在两个标记物之间可能发生转移的距离。孔标记物对于至少106个至109个激发和能量转移循环可以是稳定的并且有功能的。
在一些实施方案中，用于分析各自具有附接至单体序列的光学标记物的聚合物的装置可以包括以下元件：(a)在分隔第一腔室和第二腔室的固相膜中的纳米孔阵列，其中纳米孔阵列的纳米孔各自提供第一腔室和第二腔室之间的流体连通并且被成簇布置，使得纳米孔的每个不同簇被布置在不同的分辨率限制的区域内，并且使得每个簇包括的纳米孔数量大于1或者是具有大于0的平均值的随机变量；(b)用于使第一腔室中的聚合物通过纳米孔阵列的纳米孔移动到第二腔室的聚合物转位系统；以及(c)用于在每当光学标记物离开分辨率受限区域内的纳米孔时收集由附接至聚合物的光学标记物产生的光学信号的检测系统。
定义
“FRET”或“或荧光共振能量转移”意指从激发的供体荧光团至基态的受体荧光团的非放射性的偶极子-偶极子能量转移机制。FRET相互作用中的能量转移速率取决于供体的发射光谱与受体的吸收光谱的光谱重叠的程度、供体的量子产率、供体和受体跃迁偶极的相对取向、以及供体分子和受体分子之间的距离，Lakowitz，Principles ofFluorescence Spectroscopy，第三版(Springer，2006)。特别感兴趣的FRET相互作用是导致一部分能量被转移到受体，继而作为光子被受体以低于激发其供体的光的频率(即“FRET信号”)的频率发射的那些FRET相互作用。“FRET距离”是指可以发生FRET相互作用并且FRET受体可以产生可检测的FRET信号的FRET供体和FRET受体之间的距离。
“纳米孔”是指位于基底中的允许分析物以预定的或可辨别的顺序通过基底，或者在聚合物分析物的情况下，允许聚合物分析物的单体单元以预定的或可辨别的顺序通过基底的任何开口。在后一种情况下，预定的或可辨别的顺序可以是单体单元在聚合物中的原始顺序。纳米孔的实例包括蛋白质性纳米孔或基于蛋白质的纳米孔、合成纳米孔或固态纳米孔、并且包括其中嵌入有蛋白质纳米孔的固态纳米孔的杂化纳米孔。纳米孔可以具有1-10nm或1-5nm或1-3nm的内径。蛋白质纳米孔的实例包括但不限于，α溶血素、电压-依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、OmpF、OmpC、MspA和LamB(麦芽糖孔蛋白)，例如在Rhee，M.等人，Trendsin Biotechnology，25(4)(2007)：174-181；Bayley等人(上文引用的)；Gundlach等人，美国专利公布2012/0055792等中所公开的，其通过引用并入本文。可以使用任何允许单个核酸分子转位的蛋白质孔。纳米孔蛋白质可以在孔外部的特定位点处或在构成该孔形成蛋白质的一个或更多个单体单元的外部的特定位点处被标记。孔蛋白质选自例如但不局限于以下的蛋白质的组：α-溶血素、MspA、电压依赖性线粒体孔蛋白(VDAC)、炭疽孔蛋白、OmpF、OmpC和LamB(麦芽糖孔蛋白)。通过将带电荷的聚合物附接至孔蛋白质来实现孔蛋白质到固态孔中的整合。在施加电场后，带电荷的复合物通过电泳被拉入固态孔中。合成纳米孔或固态纳米孔可以被创建在各种形式的固体基底中，固体基底的实例包括但不限于硅酮(例如Si3N4、SiO2)、金属、金属氧化物(例如Al2O3)、塑料、玻璃、半导体材料、及其组合。合成纳米孔可能比定位于脂质双层膜中的生物蛋白质孔更稳定。合成纳米孔还可以通过使用嵌入合适的基底例如但不限于聚合的环氧树脂中的碳纳米管来创建。碳纳米管可以具有相同且明确的化学性质和结构性质。可以获得各种尺寸的碳纳米管，范围从一纳米到几百纳米。已知碳纳米管的表面电荷约为零，并且作为结果，电泳输送核酸通过纳米孔变得简单和可预测(Ito，T.等人，Chem.Commun.12(2003):1482-83)。合成纳米孔的基底表面可以被化学修饰以允许蛋白质孔的共价附接或使得表面性质适用于光学纳米孔测序。此类表面修饰可以是共价的或非共价的。大多数共价修饰包括有机硅烷沉积，对于有机硅烷沉积描述了最常见的操作方案：1)从含水酒精中沉积。这是用于制备甲硅烷基化表面的最容易的方法。用乙酸将95％乙醇-5％水的溶液调节至pH 4.5-5.5。在搅拌下添加硅烷以产生2％的最终浓度。水解和硅烷醇基团形成后，持续2-5分钟添加基底。通过简单地在乙醇中浸渍来冲洗掉多余的材料。硅烷层的固化在110摄氏度持续5-10分钟。2)汽相沉积。硅烷可以通过化学汽相沉积方法在干燥的质子惰性条件下被施加到基底上。这些方法有利于单层沉积。在封闭的腔室设计中，基底被加热至足以达到5mm蒸汽压的温度。可选择地，可以施加真空，直到观察到硅烷蒸发。3)旋涂沉积(spin-on deposition)。旋涂应用可以在有利于最大官能化和多层沉积的水解条件下或在有利于单层沉积的干燥条件下来进行。在一些实施方案中，本发明的方法采用单个纳米孔。在其他实施方案中，采用多个纳米孔。在后一种实施方案的一些实施方案中，多个纳米孔作为纳米孔阵列被采用，所述纳米孔阵列通常被布置在平面基底例如固相膜中。纳米孔阵列的纳米孔可以被规则地例如以直线模式间隔开，或者可以被随机地间隔开。在一个优选的实施方案中，在平面固相基底中纳米孔被以直线模式规则地间隔开。
关于肽的“肽”、“肽片段”、“多肽”、“寡肽”或“片段”在本文中被同义地使用并且指的是由通过肽键连接的氨基酸残基的单一无分枝的链组成的化合物。肽或多肽中的氨基酸可以用各种部分来衍生化，所述各种部分包括但不限于聚乙二醇、染料、生物素、半抗原、或类似部分。蛋白质或多肽或肽中氨基酸残基的数目可以广泛地变化；然而，在一些实施方案中，本文提及的蛋白质或多肽或肽可以具有从2个氨基酸残基至70个氨基酸残基；并且在其他实施方案中，其可以具有从2个氨基酸残基至50个氨基酸残基。在其他实施方案中，本文提及的蛋白质或多肽或肽可以具有从几十个氨基酸残基，例如20个氨基酸残基，至多达成千或更多个氨基酸残基，例如1200个氨基酸残基。仍然在其他实施方案中，蛋白质、多肽、肽、或其片段可具有从10个氨基酸残基至1000个氨基酸残基；或者其可以具有从20个氨基酸残基至500个氨基酸残基；或者其可以具有从20个氨基酸残基至200个氨基酸残基。
“聚合物”是指连接成直链的多个单体。通常，聚合物包括多于一种类型的单体，例如，作为多核苷酸包括A、C、G和T，或作为多肽包括多于一种氨基酸。单体可以包括但不限于核苷及其衍生物或类似物以及氨基酸及其衍生物和类似物。在一些实施方案中，聚合物是多核苷酸，其中核苷单体通过磷酸二酯键或其类似物连接。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”可互换地使用并且各自指核苷酸单体的线性聚合物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用例如沃森-克里克型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen类型的碱基配对等的常规模式特异性结合至天然多核苷酸。此类单体及其核苷间键可以是天然存在的，或者可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包含PNA、硫代磷酸酯核苷间键、含有允许标记物例如荧光团或半抗原附接的连接基团的碱基等。每当寡核苷酸或多核苷酸的应用要求酶促加工，例如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等，普通技术人员将理解，在那些情况下，寡核苷酸或多核苷酸在任何位置或某些位置处将不含有核苷间键、糖部分或碱基的某些类似物。多核苷酸的尺寸范围通常从几个单体单元例如5-40(此时其通常被称为“寡核苷酸”)到数千个单体单元。除非另有说明或从上下文明显的，每当多核苷酸或寡核苷酸以字母(大写或小写字体)序列表示时，例如“ATGCCTG”，应该理解的是该核苷酸是以从左到右的5’→3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另有说明，术语和原子编号惯例将遵循在Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss,New York,1999)中公开的那些。通常，多核苷酸包括通过磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如用于DNA的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或用于RNA的它们的核糖对应物)；然而，其也可以包括非天然核苷酸类似物，例如包括修饰的碱基、糖或核苷间键。本领域技术人员清楚，在酶的活性具有对特定的寡核苷酸或多核苷酸底物例如单链DNA、RNA/DNA双链体等的要求的情况下，，则对于寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成的选择完全在普通技术人员的知识范围内，特别是有了来自论文，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，第二版(Cold Spring HarborLaboratory，New York，1989)以及类似的参考文献的指导。同样地，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其各自的互补物的双链体)。普通技术人员根据术语使用的上下文清楚哪个形式或是否两种形式都是期望的。
“引物”是指天然或合成的寡核苷酸，其在与多核苷酸模板形成双链体后能够作为核酸合成的起始点起作用并且从其3'端沿模板被延伸，从而形成延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶例如DNA或RNA聚合酶来进行。在延伸过程中添加的核苷酸的顺序由模板多核苷酸的序列决定。引物通常通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有从14个核苷酸至40个核苷酸范围内或从18个核苷酸至36个核苷酸范围内的长度。引物被用在各种核酸扩增反应中，例如使用单一引物的线性扩增反应，或采用两种或更多种引物的聚合酶链式反应。对于选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导为本领域普通技术人员所熟知，如通过引用并入的以下参考文献所证明的：Dieffenbach，编辑，PCR Primer：A Laboratory Manual，第二版(Cold Spring Harbor Press，New York，2003)。
关于多核苷酸的“序列确定”、“测序”或“确定核苷酸序列”等术语包括对多核苷酸的部分以及全部序列信息的确定。也就是说，这些术语包括四种天然核苷酸A、C、G和T的完整的集的子集的序列，诸如，例如仅具有A和C的靶多核苷酸的序列。也就是说，这些术语包括确定靶多核苷酸内的四种类型的核苷酸中的一种、两种、三种或全部的身份、顺序和位置。在一些实施方案中，这些术语包括确定靶多核苷酸内的四种类型的核苷酸中的两种、三种或全部的身份、顺序和位置。在一些实施方案中，序列确定可以通过以下来完成：鉴定靶多核苷酸“catcgc...”内单一类型的核苷酸例如胞嘧啶的顺序和位置，使得其序列被表示为二进制代码，例如“100101...”代表“c-(非c)(非c)c-(非c)-c...”等等。在一些实施方案中，这些术语还可以包括靶多核苷酸的子序列，其充当该靶多核苷酸的指纹，即独特地鉴定一组多核苷酸例如细胞表达的全部不同的RNA序列内的一个靶多核苷酸或一类靶多核苷酸的子序列。
本公开内容不旨在局限于所阐述的特定形式的范围，而是旨在覆盖本文描述的变化的替代、修改和等同形式。此外，本公开内容的范围完全包含鉴于本公开内容对于本领域技术人员而言可能变得明显的其他变型。本发明的范围仅由所附权利要求书来限制。

Claims (24)

1.一种通过纳米孔阵列分析聚合物特征的方法，包括：
(a)提供纳米孔阵列，其中每个纳米孔能够提供第一腔室和第二腔室之间的流体连通，并能够提供与转位穿过其的聚合物的至少一种性质相关的信号，并且其中所述纳米孔阵列中的一定百分率的纳米孔包含聚合物；
(b)使聚合物穿过所述纳米孔阵列的纳米孔从所述第一腔室转位到所述第二腔室；
(c)检测来自正在转位的聚合物的正向信号；
(d)逆转聚合物的转位；
(e)检测来自其穿过纳米孔的转位被逆转的聚合物的反向信号；
(f)根据所述正向信号和反向信号确定每个这样的聚合物的至少一种性质。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤(b)至(e)被重复。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述步骤(b)至(e)被重复，直到具有聚合物的纳米孔的所述百分率下降到预定水平以下或者达到预定数量的逆转，以先发生者为准。
4.如权利要求3所述的方法，其中具有聚合物的纳米孔的所述百分率被确定为通过所述纳米孔阵列的总电流的函数和/或每当所述正向信号和反向信号是光学信号时从所述纳米孔阵列中的所有纳米孔收集的总光学信号的函数。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述步骤(b)和(c)的持续时间基本上等于所述步骤(d)和(e)的持续时间。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物具有自由端部，使得每个聚合物能够通过所述纳米孔阵列的纳米孔从所述第一腔室移动到所述第二腔室。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述聚合物是多核苷酸，且所述至少一种性质是核苷酸序列。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸附接有不同的荧光标记物，所述不同的荧光标记物产生可区分的光学信号，使得不同种类的核苷酸可以通过来自其所附接的荧光标记物的光学信号被鉴定。
9.如权利要求7所述的方法，其中转位穿过所述纳米孔的所述多核苷酸在所述第一腔室和所述第二腔室中形成无规卷曲。
10.如权利要求9所述的方法，其中每个所述多核苷酸具有至少1000个核苷酸的长度。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述聚合物是多肽，且所述至少一种性质是肽序列。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述多肽的至少两个不同种类的氨基酸残基附接有不同的荧光标记物，所述不同的荧光标记物产生可区分的光学信号，使得不同种类的被标记的氨基酸残基可以通过来自其所附接的荧光标记物的光学信号被鉴定。
13.一种确定聚合物特征的方法，所述方法包括：
(a)提供包括固相膜的纳米孔阵列，所述固相膜具有第一侧面、第二侧面和从其穿过的多个孔，每个孔包括至少一个纳米孔，其中所述固相膜使第一腔室和第二腔室隔开，使得每个纳米孔提供所述第一腔室和所述第二腔室之间的流体连通，并且其中每个纳米孔在所述固相膜的所述第二侧面上具有检测区域；
(b)使聚合物穿过纳米孔从所述第一腔室转位到所述第二腔室转位，每个聚合物具有一个或更多个与其附接的光学标记物，所述光学标记物能够产生指示所述聚合物的特征的光学信号；
(c)照射所述固相膜的所述第二侧面，使得光学标记物在所述检测区域中产生光学信号；
(d)在所述检测区域中检测来自所述光学标记物的指示所述聚合物的特征的光学信号，以产生聚合物数据；
(e)逆转所述聚合物的转位；
(f)重复步骤(c)和(d)以产生冗余聚合物数据；以及
(g)根据所述聚合物数据和所述冗余聚合物数据确定所述聚合物的特征。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述步骤(e)和(f)被重复。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述聚合物是多核苷酸，且所述至少一种性质是核苷酸序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸附接有不同的荧光标记物，所述不同的荧光标记物产生可区分的光学信号，使得不同种类的核苷酸可以通过来自其所附接的荧光标记物的光学信号被鉴定。
17.如权利要求16所述的方法，其中转位穿过所述纳米孔的所述多核苷酸在所述第一腔室和所述第二腔室中形成无规卷曲。
18.如权利要求17所述的方法，其中每个所述多核苷酸具有至少1000个核苷酸的长度。
19.一种通过纳米孔阵列确定多核苷酸的核苷酸序列的方法，包括：
(a)提供纳米孔阵列，其中每个纳米孔能够提供第一腔室和第二腔室之间的流体连通，并能够提供其不同种类的核苷酸附接有不同的荧光标记物的多核苷酸，所述不同的荧光标记物产生可区分的光学信号，使得不同种类的核苷酸可以通过来自其所附接的荧光标记物的光学信号被鉴定，并且其中所述纳米孔阵列中的一定百分率的纳米孔被多核苷酸占据；
(b)使多核苷酸以从所述第一腔室到所述第二腔室的方向转位穿过所述纳米孔阵列的纳米孔；
(c)检测来自正在转位的多核苷酸的正向光学信号；
(d)逆转所述多核苷酸转位的方向；
(e)检测来自其穿过纳米孔的转位被逆转的多核苷酸的反向光学信号；以及
(f)根据所述正向光学信号和反向光学信号确定每个多核苷酸的核苷酸序列。
20.如权利要求19所述的方法，还包括重复所述步骤(b)至(e)的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中转位穿过所述纳米孔的所述多核苷酸在所述第一腔室和所述第二腔室中形成无规卷曲。
22.如权利要求21所述的方法，其中每个所述多核苷酸具有至少1000个核苷酸的长度。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述步骤(b)至(e)被重复，直到具有所述多核苷酸的纳米孔的所述百分率下降到预定水平以下或者达到预定数量的重复，以先发生者为准。
24.如权利要求23所述的方法，其中具有多核苷酸的纳米孔的所述百分率被确定为通过所述纳米孔阵列的总电流的函数和/或从所述纳米孔阵列中的所有纳米孔收集的总光学信号的函数。
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