JP2019509039A - 移行反転による冗長ポリマー分析 - Google Patents
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Abstract
本発明は、それぞれが検出領域を有するナノポアを通るポリマーの移行を反転させ、それによって、異なる時間で同じポリマー構造から発生したシグナルを収集可能にすることによって、ポリマーに関して冗長測定を実施するための方法を対象とする。そのような反復測定は、ポリマー構造の最終決定におけるノイズを低減させるために組み合わせる。一部の実施形態では、その異なるヌクレオチドが、取着された区別可能な蛍光標識を有するポリヌクレオチドを、ナノポアアレイのナノポアに通して繰り返し移行させて、同じセグメントからの光シグナルの反復測定をコンパイルするが、これらはヌクレオチド配列の決定を行うよう組み合わせてもよい。
Description
関連出願への相互参照
本願は、2016年2月25日に出願された米国仮特許出願番号第62/299,902号に基づく優先権を主張しており、この仮特許出願の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
本願は、2016年2月25日に出願された米国仮特許出願番号第62/299,902号に基づく優先権を主張しており、この仮特許出願の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
背景
ここ10年にわたって開発されたDNAシークエンシング技術は、生物科学に革命を起こしてきた。例えば、van Dijkら、Trends in Genetics、30巻(9号):418〜426頁(2014年)。しかし、試行当たりのシークエンシングコストの削減、試料調製の単純化、試行時間の短縮、配列リード長の増加、およびデータ解析の改善などを含め、技術の全潜在能力を実現するために克服しなければならない多くの課題が残されたままである。ナノポアをベースにしたシークエンシングなどの、単分子シークエンシング技法は、これらの課題の一部に対処し得るが、これらの手法には、信頼性あるナノ構造の製作、DNA移行速度の制御、低いシグナル対ノイズ比を有する測定、明確なヌクレオチド識別、ならびにナノスケールのセンサーの大きなアレイから得たシグナルの検出および処理など、それら自体の一連の技術的難点がある。例えば、Brantonら、Nature Biotechnology、26巻(10号):1146〜1153頁(2008年)。
上記に鑑み、大量のノイズの存在下で弱いシグナルを検出および測定する問題に対処する方法およびデバイスが利用可能であれば、概してナノポアセンサー技術に有利であり、さらには光学ベースのナノポアシークエンシングなどのその特定の適用例にも有利であろう。
ここ10年にわたって開発されたDNAシークエンシング技術は、生物科学に革命を起こしてきた。例えば、van Dijkら、Trends in Genetics、30巻(9号):418〜426頁(2014年)。しかし、試行当たりのシークエンシングコストの削減、試料調製の単純化、試行時間の短縮、配列リード長の増加、およびデータ解析の改善などを含め、技術の全潜在能力を実現するために克服しなければならない多くの課題が残されたままである。ナノポアをベースにしたシークエンシングなどの、単分子シークエンシング技法は、これらの課題の一部に対処し得るが、これらの手法には、信頼性あるナノ構造の製作、DNA移行速度の制御、低いシグナル対ノイズ比を有する測定、明確なヌクレオチド識別、ならびにナノスケールのセンサーの大きなアレイから得たシグナルの検出および処理など、それら自体の一連の技術的難点がある。例えば、Brantonら、Nature Biotechnology、26巻(10号):1146〜1153頁(2008年)。
上記に鑑み、大量のノイズの存在下で弱いシグナルを検出および測定する問題に対処する方法およびデバイスが利用可能であれば、概してナノポアセンサー技術に有利であり、さらには光学ベースのナノポアシークエンシングなどのその特定の適用例にも有利であろう。
van Dijkら、Trends in Genetics、30巻(9号):418〜426頁(2014年)
Brantonら、Nature Biotechnology、26巻(10号):1146〜1153頁(2008年)
発明の要旨
本発明は、ナノポアを使用する単分子分析における低いシグナル対ノイズ比の測定の問題に対処するための、方法およびデバイスを対象とする。一態様では、本発明の方法およびデバイスは、ナノポアを通るポリマー分析物の反復移行によるノイズの低減を対象とする。
本発明は、ナノポアを使用する単分子分析における低いシグナル対ノイズ比の測定の問題に対処するための、方法およびデバイスを対象とする。一態様では、本発明の方法およびデバイスは、ナノポアを通るポリマー分析物の反復移行によるノイズの低減を対象とする。
一部の態様では、本発明は、下記のステップ:(a)ナノポアアレイを提供するステップであって、各ナノポアが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通をもたらすことが可能であり、かつそれを通して移行するポリマーの少なくとも1つの性質に関するシグナルを提供することが可能であり、ナノポアアレイ中の所定の割合のナノポアがポリマーを含有するステップ;(b)第1のチャンバーから第2のチャンバーに、ナノポアアレイのナノポアを通してポリマーを移行させるステップ;(c)移行するポリマーから順方向シグナルを検出するステップ;(d)ポリマーの移行を反転させるステップ;(e)ナノポアを通るその移行が反転したポリマーから、逆方向シグナルを検出するステップ;(f)順方向および逆方向シグナルから、そのようなポリマーのそれぞれの少なくとも1つの性質を決定するステップによって、ポリマーの特性を分析する方法を対象とする。
他の実施形態では、本発明は、下記のステップ:(a)ナノポアアレイを提供するステップであって、各ナノポアが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通をもたらすことが可能であり、かつその異なる種類のヌクレオチドが、区別可能な光シグナルを発生させる、取着された異なる蛍光標識を有するポリヌクレオチドを提供することが可能であり、したがって異なる種類のヌクレオチドは、その取着された蛍光標識からの光シグナルによって識別され得、ナノポアアレイ中の所定の割合のナノポアがポリヌクレオチドに占有されるステップ;(b)第1のチャンバーから第2のチャンバーに至る方向に、ナノポアアレイのナノポアを通してポリヌクレオチドを移行させるステップ;(c)移行ポリヌクレオチドから順方向光シグナルを検出するステップ;(d)ポリヌクレオチドの移行の方向を反転させるステップ;(e)ナノポアを通るその移行が反転したポリヌクレオチドから、逆方向光シグナルを検出するステップ;ならびに(f)順方向および逆方向光シグナルから、各ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップによって、ポリヌクレオチドを分析する方法を対象とする。
本発明は、ナノポアをベースにした検出システム、特に光学的に標識したポリマーを使用するシステムで、単一ポリマーの特性の低いシグナル対ノイズ測定値の問題を有利に克服するものである。本発明のこれらおよびその他の利点は、いくつかの実現例および適用例で具体化され、そのいくつかが以下におよび本明細書の全体を通してまとめられている。
詳細な説明
本発明は、様々な修正例および代替形態に変更することができるが、それらの具体例を、図面に例として示しており、それらについて詳細に記述する。しかし、本発明は、本発明を、記載される特定の実施形態に限定するものではないことを理解すべきである。対照的に、本発明は、本発明の精神および範囲内に包含される全ての修正例、均等物、および代替例を包含するものとする。例えば、本発明の、特定のナノポアのタイプおよび数、特定の標識、FRETペア、検出スキーム、製作手法は、例示を目的として示される。しかし、その他のタイプのナノポア、ナノポアのアレイ、およびその他の製作技術を利用して、本明細書に論じられるシステムの様々な態様を実施し得るので、本開示は、この点に関して限定するものではないことを認識すべきである。本発明の態様に関する指針は、例えば、その関連ある部分が参照により本明細書に組み込まれる、Cao、Nanostructures & Nanomaterials(Imperial College Press、2004年);Levinson、Principles of Lithography、第2版(SPIE Press、2005年);DoeringおよびNishi編、Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology、第2版(CRC Press、2007年);Sawyerら、Electrochemistry for Chemists、第2版(Wiley Interscience、1995年);BardおよびFaulkner、Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications、第2版(Wiley、2000年);Lakowicz、Principles of Fluorescence Spectroscopy、第3版(Springer、2006年);ならびにHermanson、Bioconjugate Techniques、第2版(Academic Press、2008年)などを含む、当業者に周知の多くの入手可能な参考文献および学術書に見出される。
本発明は、様々な修正例および代替形態に変更することができるが、それらの具体例を、図面に例として示しており、それらについて詳細に記述する。しかし、本発明は、本発明を、記載される特定の実施形態に限定するものではないことを理解すべきである。対照的に、本発明は、本発明の精神および範囲内に包含される全ての修正例、均等物、および代替例を包含するものとする。例えば、本発明の、特定のナノポアのタイプおよび数、特定の標識、FRETペア、検出スキーム、製作手法は、例示を目的として示される。しかし、その他のタイプのナノポア、ナノポアのアレイ、およびその他の製作技術を利用して、本明細書に論じられるシステムの様々な態様を実施し得るので、本開示は、この点に関して限定するものではないことを認識すべきである。本発明の態様に関する指針は、例えば、その関連ある部分が参照により本明細書に組み込まれる、Cao、Nanostructures & Nanomaterials(Imperial College Press、2004年);Levinson、Principles of Lithography、第2版(SPIE Press、2005年);DoeringおよびNishi編、Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology、第2版(CRC Press、2007年);Sawyerら、Electrochemistry for Chemists、第2版(Wiley Interscience、1995年);BardおよびFaulkner、Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications、第2版(Wiley、2000年);Lakowicz、Principles of Fluorescence Spectroscopy、第3版(Springer、2006年);ならびにHermanson、Bioconjugate Techniques、第2版(Academic Press、2008年)などを含む、当業者に周知の多くの入手可能な参考文献および学術書に見出される。
本発明は、検出領域をそれぞれが有するナノポアを通したポリマーの移行を反転させ、それによって、異なる時間で同じポリマー構造またはセグメントから発生したシグナルを収集可能にすることにより、ポリマーの冗長分析を実施するための、方法およびデバイスを対象とする。次いで、そのような反復シグナルを、シグナルのノイズを低減させるために比較するか、または別様に処理してもよい。一態様では、本発明は、それを通してポリマーが通過するときは常に光シグナルが発生する検出領域を、それぞれが有するナノポアのアレイを用いる。この態様の一部の実施形態では、異なるモノマーを、区別可能な光シグナルを生成する異なる光学標識で標識する。一部の実施形態では、ポリマーは核酸ポリマーであり、異なる種類のヌクレオチドは、それらの光学標識により放出された光シグナルからヌクレオチドを識別することが可能な区別可能な光シグナルを生成する、異なる光学標識で標識される。一部の実施形態では、ポリマー分析物は帯電され、移行方向は、ナノポアのアレイを横切る電場の方向によって制御される。
別の態様では、本発明のポリマー分析物は、それらの両端に、挿入後にナノポアの、1つまたはいずれかのオリフィスからポリマー分析物が出て行くのを防止するための停止またはブロック部分を含まない。即ち、本発明のポリマー分析物、特に核酸ポリマー分析物は、ナノポア内を自由に通過し得る自由端を有する。一部の実施形態では、標識されたポリマー分析物は、標識とナノポアボアとの間の相互作用に起因して、および/または移行速度を低減させる特定の目的のために取着された標識またはその他の付加物によって引き起こされた立体障害に起因して、低減された速度で(非標識ポリマー分析物と比較して)ナノポアを通過してもよくまたはそれを通して移行してもよい。そのような付加物は、従来の有機色素の場合と同じ範囲の分子量、例えば200から2000Daの範囲、または200から1200Daの範囲の分子量を有する有機分子であってもよい。これらの実施形態では、試料の調製は、ポリマー分析物の両端にブロック基を必要としないことにより大幅に単純化され、それによって、効率が高まり分析のコストが低下する。以下に論じられるように、移行方向のそれぞれの反転中に一部の分析物はアレイから失われる可能性があるが、そのような損失は、分析用に、より長いポリマー分析物を選択することによって、およびより大きいアレイ、即ち、より多くの数のナノポアを持つアレイを使用することによって、緩和される。一部の実施形態では、図4に示されるように、一本鎖核酸などの長いポリマー分析物(400)は、溶液中で遊離状態にあるときにランダムコイル(402)を形成するが、これらは塩基対合などのポリマー内相互作用を含んでいてもいなくてもよい。一部の実施形態では、十分長いポリマー分析物の移行速度は、そのようなポリマーの末端部分による安定なランダムコイルの形成によって、低減し得る。理論に拘泥するものではないが、ポリヌクレオチドのランダムコイル状態のより大きいエントロピーは、移行中に存在するようなポリヌクレオチドの延長状態に対して復元力をもたらし、それによって移行速度が遅くなると考えられる。そのようなランダムコイルは、移行反転中、特にポリマーの中央部分を横断中に、ポリマーの損失も防止し得る。一部の実施形態は、長さが少なくとも1000モノマーである、または長さが少なくとも10,000モノマーであるメンバーを含む、ポリマー分析物の集団を提供し得る。一部の実施形態は、長さが少なくとも1000ヌクレオチドである、または長さが少なくとも10,000ヌクレオチドである、または長さが少なくとも20,000ヌクレオチドであるメンバーを含む、核酸ポリマーの集団を提供し得る。
図1A〜1Fは、本発明のいくつかの実施形態の態様を示す。図1Aでは、負に帯電したポリマー分析物(100)(例えば、一本鎖ポリヌクレオチド)が、アレイ(102)を横切る電場または電圧差(106)の下で第1のチャンバー(104)内でナノポアアレイ(102)に曝露され、そのためポリマー分析物(100)の拡散は、ナノポア(例えば、110)に向かっておよびそれを通して経て、第2のチャンバー(108)内に付勢される。アレイ(102)の各ナノポアに関連する検出領域、または検出領域からシグナルを収集するための検出器(単数または複数)は、示されていない。検出領域は、電気および/または光シグナルを発生させるために選択され得る。一部の実施形態では、光シグナルは、検出領域で発生し;例えばFRETシグナルは、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第8,771,491号;または国際特許公開WO2014/190322に開示されるものなど、検出領域内でドナー標識ナノポアを通過するアクセプター標識ポリマーによって発生してもよい。あるいは、光学標識は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるHuber、米国特許出願公開第2016/0122812号に開示されるように、ポリマー分析物上の蛍光標識から直接検出され得る。この後者の場合、検出領域は、ナノポア内の拘束状態からナノポアを出た後の消光状態まで光学標識が遷移する、時間間隔によって画定される。消光は、相互に消光する蛍光標識または外来性消光剤、例えば、消光部分が取着されたランダム配列オリゴヌクレオチド(例えば、5〜8量体)を用いることによって、実現され得る。
消光剤は、ナノポアシークエンス条件下で(i)実質的に非蛍光であり、(ii)一本鎖核酸、特に一本鎖DNAに結合し、(iii)非放射的にその他の分子から励起エネルギーを吸収しそれを非放射的に放出する、任意の化合物(または、化合物の組)を含んでいてもよい。一部の実施形態では、消光剤はさらに、一本鎖DNAに非共有的に結合する。広く様々な消光化合物は、シアニンおよびキサンテン色素などの一般的な合成色素の非蛍光誘導体を含むがこれらに限定するものではないものを、本発明で使用するのに入手可能である。消光化合物の選択の際の指針は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,323,337号;および第6,750,024号などに見出すことができる。
一部の実施形態では、任意選択で、ポリマー分析物(100)により占有されるナノポアの部分を、アレイ(102)のナノポア内を通る全電流を測定することによってモニタリングしてもよい。任意の挿入の前に、定常初期電流が記録され得る(112)ので、次いで電場(106)の影響下で第1のチャンバー(104)内にポリマー分析物(何らかの所定の濃度で)を入れた後、アレイ(102)のナノポアのいくらかの平均割合はポリマー分析物に占有されることになり、その結果、アレイ(102)を横断する電流がいくらかの定常状態値(114)まで降下する。同様に、一部の実施形態では、光学標識されたポリマー分析物により占有されるナノポアの部分を、全光シグナルの関数、即ち、アレイ内の全てのナノポアから収集された光シグナルの積分または合計としてモニタリングしてもよい。
一部の実施形態では、そのようなとき、電場(106)の極性を反転させて、ポリマー分析物が移行している方向を変化させてもよい。一部の実施形態では、単一の反転のみ行ってもよい。他の実施形態では、所定の時間間隔で多数回の反転を行ってもよい。一部の実施形態では、均一な、即ち等しい時間間隔の後で複数回の反転を行う。そのような実施形態では、一部のポリマー分析物に関し、ポリマーの同じセグメントが検出領域を多数回通過することになる。一部の実施形態では、複数の反転は偶数回になる。偶数回の反転が終了する一部の実施形態では、ポリマー分析物の正味の移動は、第1のチャンバーから第2のチャンバーまでになる。
図1Cは、ナノポア(111)と、それらのそれぞれのナノポアを通る移行の様々な程度にあるポリマー分析物(116a〜g)(全ては、便宜上同じ長さで示される)とを示す、ナノポアアレイ(102)の破断図を示す。例示のため、任意の所与の時間で、移行を起こす集団内のポリマーに沿ったナノポアの位置はランダムであり、ポリマーの長さに沿ったどの場所でも等しくありそうであることが想定される。そのような条件下、移行方向の第1の反転の前の時間にわたってシグナル検出が開始し進行する場合、失われた可能性があり、移行方向の第1の反転後のシグナル検出には利用できないポリマー(例えば、図1Dのポリマー118)が所定の割合で存在することになる。いくらかの損失が、各反転サイクル中に生じ得る。それぞれのポリマーのセグメント(120)は、反転(122)直前に検出領域からシグナルが収集される。反転後の移行が、同じセグメント(120)上でシグナルを発生させ収集するよう検出領域を通してポリマーを移動させる場合、二組のシグナルが、セグメント内の目的の特性に関して収集される。例えば、ポリマーがアクセプター標識ヌクレオチドを持つ核酸ポリマーであり、かつナノポアのトランス側(例えば、図1A〜B参照)が関連するドナー標識を含む場合、ドナーとアクセプターとの間で発生したFRETシグナルからの二組のデータを収集し得る。次いでそのようなデータを記録し、ヌクレオチドおよび/またはシーケンスコールのシグナル対ノイズ比が増大するようにアライメントしてもよい。
同じポリマーフィーチャーまたはセグメントから冗長データ(モノマー配列情報など)を得る目的の、移行反転のパターンは、広く様々であってもよく;即ち、例えば移行反転の数、反転間の時間間隔、および時間間隔中の移行速度が、広く様々であってもよい。一部の実施形態では、シグナル発生およびデータ収集は連続的であり、したがって所与のポリマーに関するデータは、ポリマーがナノポアに進入するときからナノポアを完全に出る時まで、収集される。一部の実施形態では、ポリマーの進入時間と出て行く時間との間で、少なくとも1回の移行反転が実施される。他の実施形態では、進入時間と出て行く時間との間で、複数回の移行反転が実施される。一部の実施形態では、複数回の移行反転は、1回よりも多い偶数回である。一部の実施形態では、反転後の移行の持続時間は、全ての反転に関して同じであってもよく、したがって冗長データは実質的に同じポリマーセグメントから収集されるようになる。一部の実施形態では、反転後の移行の持続時間は、異なっていてもよい。一部の実施形態では、反転後の移行の異なる持続時間は、予め決定される。一部の実施形態では、移行方向の反転は周期的で、反転およびそれに関連する移行持続時間は同一の対として実施され;即ち、移行方向の反転は、(i)移行方向の反転、およびその後の、第1の持続時間または時間t1での移行と、(ii)移行方向の反転、およびその後の、第2の持続時間または時間t2での移行の、1つまたは複数のサイクルで実施される。一部の実施形態では、第1の時間および第2の時間は等しい。他の実施形態では、t1<t2であり、したがってポリマーは、ラチェットのようにナノポア内を進行する。第1および第2の移行時間の選択は、移行方法(例えば、核酸ポリマーなどの負に帯電したポリマー、電場強度に関する)、ポリマーの長さの平均および標準偏差、検出領域により発生したシグナルのタイプ(例えば、FRETシグナル)、およびシグナルが単一モノマーまたは複数のモノマーのいずれによって発生するのかなどに基づいてもよい。一部の実施形態では、ナノポアアレイを横切る電圧は、移行反転間の異なる時間間隔で異なっていてもよく、またはそのような間隔の最中に、例えばアレイ内でのポリマーの占有を最適化する目的で変化してもよい。このように、移行方向を繰り返し反転させるステップを含む一部の実施形態では、(i)反転間の移行持続時間およびナノポアのアレイを横切る電圧レベルの、周期的変化;(ii)所定の一連の、反転間の移行持続時間およびナノポアアレイを横切る電圧レベルであって、周期的もしくは非周期的でよいもの;または(iii)反転間の移行持続時間、および電圧レベルであって、リアルタイムで自動的に選択され、その結果、例えばアレイ内のナノポアのポリマー占有率などの操作パラメーターが最適化されたものによる、移行反転のパターンを含んでいてもよい。そのようなリアルタイム選択は、分析される集団でのポリマーの特定のサイズ分布に応答してもよい。
図1E〜1Fは、本発明の実現例を示し、核酸ポリマー分析物は、ナノポアにより捕獲され得る一本鎖テールをそれぞれが持つ二本鎖DNAとして第1のチャンバー(104)に配置される。そのような実現例では、ナノポアは、二本鎖DNAではなく一本鎖DNAの移行を可能にするものが選択され;したがって捕獲後に、二本鎖部分は移行中にほどける。上記示された実施形態のように、反転を開始したときにナノポアにおけるポリマーの位置に依存するこの実現例では、ポリマーは、例えば図1Fのポリマー(130および131)によって示されるように、ナノポアアレイから失われ、さらなる測定に利用できなくなる可能性がある。
図2は、本発明の方法によって得られた冗長配列データが、核酸ポリマーの配列分析を改善するのにどのように使用され得るかを示す。この例示では、アクセプター標識または蛍光標識核酸ポリマー(209)のセグメント(210)が、検出領域(236)を有するナノポアを通過する。一部の実施形態では、そのような検出領域は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)がドナーのFRET距離以内のポリヌクレオチド上のアクセプター間に生じ、その後にアクセプターが、このアクセプターが取着しているヌクレオチドを示す蛍光シグナルを放出するように、励起され得るドナーを含んでいてもよい。他の実施形態では、そのような検出領域は、ポリヌクレオチド上の蛍光標識が励起され得る(例えば、消光の一時的な不在による)容積を含んでいてもよい(例えば、ナノポアの出口に)。一部の実施形態では、異なる区別可能なアクセプターシグナルまたは蛍光シグナルは、異なるヌクレオチドごとに発生する。図2では、「T」ヌクレオチドのみから発生したシグナルのデータが示される。ポリマー(209)の移行方向は、図中「配列リードデータ」(238)として示される(やはりTのみから)、生データの例示される時間記録において(221、222、223、および224)でマークされた4回反転する。即ち、データは、3つの順方向シグナルおよび2つの逆方向シグナルに関して示される。直上の例示された生データは、逆方向順序でおよび順方向(または正しい)順序でその配列と交互に示されるセグメント(210)のコピーであり(A(第1の順方向サブ読出し)、B(第1の逆方向サブ読出し)、C(第2の順方向サブ読出し)、D(第2の逆方向サブ読出し)、およびE(第3の順方向サブ読出し)として示される)、その結果、検出領域(236)内を繰り返し通過するときにセグメント(210)ヌクレオチドの「完全」配列読出しが得られる。セグメント(210)のコピーA、B、C、D、およびEは、例示される生データ(238)に該当する。この例示において、セグメント(210)の各ヌクレオチドからのシグナルは、5回の別々の測定で収集される。セグメント(210)の塩基呼出しは、複数のサブ読出しデータA、B、C、D、またはEをアライメントすることによって、配列読出しデータ(238)から得てもよい。一部の実施形態では、サブ読出しの部分集合のみからのデータ、例えば、順方向サブ読出し(A、C、およびE)のみを組み合わせてもよい。他の実施形態では、データに表された根底のヌクレオチド配列が同じ順序になるようにアラインする前に、順方向または逆方向のいずれかのサブ読出し(例えば、232および234)のサブ読出しデータの時間順序を反転させることによって、順方向および逆方向の両方のサブ読出しを使用してもよい。次いで従来のアライメントおよびデータ解析技法を使用して、サブ読出しデータからのセグメント(210)に関する塩基呼出し(240)を発生させる。類似のデータは、標識A、標識C、および標識Gから発生した明確に異なるシグナルのそれぞれに関して、収集され組み合わされてもよい。一部の実施形態では、ポリマー分析物の配列は、これらの分析を組み合わせることによって決定される。
一部の実施形態では、本発明は、下記のステップ:(a)ナノポアアレイを提供するステップであって、各ナノポアが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通をもたらすことが可能であり、かつそれを通して移行するポリマーの少なくとも1つの性質に関するシグナルを提供することが可能であり、ナノポアアレイ中の所定の割合のナノポアが、第1のチャンバーから第2のチャンバーに延びるポリマーを含有するステップ;(b)第1のチャンバーから第2のチャンバーに、ナノポアアレイのナノポアを通してポリマーを移行させ、各移行ポリマーから順方向シグナルを検出するステップ;(c)ポリマーの移行を反転させるステップであって、ナノポアを通るその移行が反転した各ポリマーから逆方向シグナルを検出するステップ;および(d)順方向および逆方向シグナルから、そのようなポリマーのそれぞれの少なくとも1つの性質を決定するステップによって、ポリマーの特性を分析する方法を対象とする。一部の実施形態では、ナノポアアレイを横断する移行方向を反転させるステップは、繰り返し実施してもよい。そのような実施形態では、ポリマー移行の繰り返される反転は、ポリマーを有するナノポアの前記割合が所定レベルを下回るか、または前記反転を所定の回数繰り返すかのいずれかが最初に生じるまで、継続されてもよい。一部の実施形態では、そのような割合は、ポリマーにより占有されかつシグナルを発生させることが可能な、ナノポアの5パーセントもしくはそれ未満でもよく、またはポリマーにより占有されかつシグナルを発生させることが可能な、ナノポアの10パーセントもしくはそれ未満でもよい。一部の実施形態では、所定数の反転は、複数回の反転であってもよく;他の実施形態では、所定数の反転は、4から100回の範囲の反転であってもよい。一部の実施形態では、複数回の反転は、1回よりも多い偶数回である。一部の実施形態では、複数回の反転は、偶数である。一部の実施形態では、反転サイクルが実施され;即ち、何対かの反転が実施される。一部の実施形態では、少なくとも複数の反転サイクルが実施され;または少なくとも2回の反転サイクルが実施され;または少なくとも3回の反転サイクルが実施される。一部の実施形態では、ポリマーはポリヌクレオチドであり、ポリマーの少なくとも1つの性質はヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの少なくとも2つまたはそれよりも多くの異なるヌクレオチドは、そこからヌクレオチドのアイデンティティーを決定し得る、区別可能な光シグナルを発生させる蛍光標識を有する。
一部の実施形態では、本発明は、下記のステップ:(a)第1の面と、第2の面と、それらを通る複数のアパーチャーとを有する固相膜を含むナノポアアレイを提供するステップであって、固相膜が、第1のチャンバーと第2のチャンバーとを切り離して、各アパーチャーが第1のチャンバーと第2のチャンバーとの流体連通をもたらすようにし、各アパーチャーが検出領域を有する、ステップ;(b)第1のチャンバーから第2のチャンバーに向かって、アパーチャーを通してポリマーを移行させるステップであって、各ポリマーが、そこに取着された、ポリマーの特性を示す光シグナルを発生させることが可能な1つまたは複数の光学標識を有するステップ;(c)固相膜の第2の面を照明するステップであって、検出領域内の光学標識が光シグナルを発生させるようにするステップ;(d)検出領域における光学標識からポリマーの特性を示す光シグナルを検出するステップであって、ポリマーデータを生成するステップ;(e)ポリマーの移行を反転させるステップ;(f)ステップ(c)および(d)を繰り返すステップであって、冗長ポリマーデータを生成するステップ;ならびに(g)冗長ポリマーデータから、ポリマーの特性を決定するステップを含む、ポリマーの特性を決定する光学ベースの方法で実施される。上述のように、一部の実施形態では、ポリマーはポリヌクレオチドであり、ポリマーの少なくとも1つの性質はヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、明確に異なる光シグナルを有する異なる蛍光標識が、異なる種類のヌクレオチドモノマーに取着され、したがって異なる種類のヌクレオチドは、異なる光学標識から光シグナルを検出することによって識別されてもよい。一部の実施形態では、少なくとも2つの異なる種類のヌクレオチドが、明確に異なる光シグナルを有する異なる蛍光標識で標識される。
一部の実施形態では、ポリマーは、ポリヌクレオチドまたはタンパク質であってもよい。さらに他の実施形態では、ポリマーは、ポリヌクレオチドであってもよい。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖核酸であってもよい。一部の実施形態では、分析されまたは決定されるポリマーの特性は、ポリマーの、ヌクレオチド配列などのモノマー配列である。一部の実施形態では、ポリマー上の光学標識は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許および米国特許出願公開および国際公開:第8,771,491号;第2013/0203050号;またはWO2014/190322に記載されるような、FRET標識である。一部の実施形態では、アパーチャーは、タンパク質ナノポアを含む。簡単に言うと、一部の実施形態で、FRET標識は、各検出領域で少なくとも1つのFRETドナー標識と少なくとも1つのFRETアクセプター標識とを含み、励起ビームはFRETドナー標識を励起し、それがエネルギーを、ドナー標識からFRET距離以内にあるFRETアクセプター標識に伝達し、それが光シグナルを放出する。典型的には、励起ビームは第2の波長を含み、光シグナルは、第2の波長とは明確に異なる第1の波長を含んで、例えば、落射照明システムの使用が可能になる。一部の実施形態では、検出領域は、第1の面の不透明なコーティングから第2の面に向かって延びてもよく、アパーチャーおよび/またはナノポアの出口のすぐ近位に膜外空間を含んでいてもよい。一部の実施形態では、そのような膜外空間は、ナノポアまたはアパーチャーの出口から50nmを超えて延びず;他の実施形態では、そのような膜外空間は、ナノポアまたはアパーチャーの出口から10nmを超えて延びない。
簡単に言うと、米国特許第8,771,491号に、より十分に記載されるように、一部の実施形態では、アパーチャーおよび/またはナノポアは1つまたは複数のFRETドナーで標識され、ポリマーはそれぞれがFRETアクセプターで標識されて、少なくとも選択されたドナーおよびアクセプターがFRETペアを形成するようになされてもよく;即ち、ドナーの放出スペクトルは少なくとも1つのアクセプターの吸収スペクトルに重なって、その他の条件(例えば、ドナー励起、ドナーおよびアクセプターがFRET距離以内にあること、ならびにドナーおよびアクセプターが適正な相対配向を有することなど)が一致する場合にはFRET相互作用を引き起こすことができるようになる。FRET相互作用では、ドナーの励起エネルギーは非放射的にアクセプターに伝達され、その後、アクセプターは、ドナーの励起エネルギーよりも低いエネルギーを有する光シグナルを放出する。ドナーは通常、レーザーによって発生するように、光ビームで照明することによって励起される。
一部の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるHuberら、米国特許出願公開第2013/0203050号に記載されるように、タンパク質ナノポアは、脂質二重層がない状態でまたはごく少量ある状態で固相膜に挿入されてアレイを形成してもよい。
一部の実施形態では、励起ビームの送出および光シグナルの収集が単一対物レンズを通して生じる落射照明システムを、ポリマー分析物上の標識またはナノポア上のドナーの直接照明に使用してもよい。本発明と共に使用される共焦点落射照明システムの基本的構成要素を、図3に示す。励起ビーム(302)はダイクロイック(304)を通過し、対物レンズ(306)上に至り、励起ビーム(302)を層状化膜(300)上に集束し(310)、そこで標識を直接励起して蛍光シグナルなどの光シグナルを放出し、またはFRET相互作用を介して間接的に励起して光シグナルを放出する。そのような光シグナルは、対物レンズ(306)によって収集され、ダイクロイック(304)に向けられ、そこでは励起ビーム(302)の光が通過するが光シグナルの光(311)を反射するように選択される。反射した光シグナル(311)はレンズ(314)を通過し、ピンホール(316)を通して検出器(318)上に集束する。
(移行速度の制御)
(移行速度の制御)
ナノポアを通したポリヌクレオチドの移行速度の役割およびそれを制御する必要性は、ナノポア技術の分野で認識されており、電流の変化を使用して移行分析物を識別する。広く様々な方法を使用して移行速度を制御しており、これらの方法には、著しい困難なしにリアルタイムで調節することができる(例えば、ナノポアを横切る電圧電位、および温度など)方法と、僅かな困難だけで動作中に調節することができる(反応緩衝剤粘度、タンパク質ナノポアのボアにおける荷電側鎖の存在または不在、反応緩衝剤のイオン性組成物および濃度、ポリヌクレオチド分析物に取着されたまたはハイブリダイズされた速度遅延基、ならびに分子モーターなど)方法との両方、例えば、参照により本明細書に組み込まれるBatesら、Biophysical J.、84巻:2366〜2372頁(2003年);Carsonら、Nanotechnology、26巻(7号):074004(2015年);Yehら、Electrophoresis、33巻(23号):58〜65頁(2012年);Meller、J. Phys. Cond. Matter、15巻:R581〜R607(2003年);Luanら、Nanoscale、4巻(4号):1068〜1077頁(2012年);およびKeyser、J. R. Soc. Interface、8巻:1369〜1378頁(2011年)などが含まれる。一部の実施形態では、本発明の方法が実施されている間、例えば電圧電位または温度など、移行速度の能動的制御のために1つまたは複数のステップが含まれ;他の実施形態では、本発明の方法が実施されている間、例えば反応緩衝剤粘度およびイオン濃度など、能動的に制御されずまたは変化しない移行速度を決定する、1つまたは複数のステップが含まれる。後者に関し、一部の実施形態では、移行速度は、1から60パーセントの範囲でグリセロールまたは均等な試薬の濃度を有する反応緩衝剤を提供することによって選択される。
上述のように、移行速度は部分的には、ナノポアを横切る電圧差(または電場強度)と、核酸ポリマーがナノポアに曝露される第1のチャンバーの反応混合物中の条件とに依存する。ナノポアによる核酸ポリマー捕獲率は、そのようなポリマーの濃度に依存する。一部の実施形態では、ナノポアシークエンシングに関する従来の反応混合物条件、例えば1M KCl(またはNaClもしくはLiClなどの同等の塩)およびpH緩衝系(例えば、使用されるタンパク質、例えばタンパク質ナノポアまたはヌクレアーゼなどが変性しないことを確実にする)を、本発明と共に用いてもよい。一部の実施形態では、pH緩衝系を使用して、pHを6.8から8.8の範囲の値で実質的に一定に保持してもよい。一部の実施形態では、ナノポアを横切る電圧差は、70から300mVの範囲であってもよい。他の実施形態では、ナノポアを横切る電圧差は、80から200mVの範囲であってもよい。動作に適切な電圧は、従来の測定技法を使用して選択されてもよい。ナノポアを横切る電流(または電圧)は、市販の機器を使用して容易に測定され得る。電圧差は、移行速度が所望の範囲内にあるように選択されてもよい。一部の実施形態では、移行速度の範囲は、秒当たり4000ヌクレオチド未満である速度を含む。一部の実施形態では、移行速度の範囲は、秒当たり1000ヌクレオチド未満である速度を含む。他の実施形態では、移行速度の範囲は、秒当たり10から800ヌクレオチドであり;他の実施形態では、移行速度の範囲は、秒当たり10から600ヌクレオチドであり;他の実施形態では、移行速度の範囲は秒当たり200から800ヌクレオチドであり;他の実施形態では、移行速度の範囲は秒当たり200から500ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、一本鎖核酸に関する上記方法を実施するためのデバイスは、ナノポア(アレイを含んでいてもよい)の両端に電場を確立するために一組の電極を設けることを、典型的には含む。一本鎖核酸は、それらを第1のチャンバー内の電解質(即ち、反応緩衝剤)中に入れることによってナノポアに曝露され、これはチャンバー内に負極を配置することにより層状化膜の「シス」側として構成される。電場の印加により、負の一本鎖核酸はナノポアに捕獲され、層状化膜の他方の側で第2のチャンバーへと移行し、これは正極をチャンバー内に配置することによって膜の「トランス」側として構成される。上述のように、移行速度は部分的には、第1および第2のチャンバー内の電解質のイオン強度、およびナノポアを横切る印加電圧に依存する。光学ベースの検出では、移行速度は、予備較正測定によって、例えば、異なる電圧に関してナノポア当たり異なる予測率でシグナルを発生させる、標識一本鎖核酸の所定の標準を使用して選択されてもよい。このようにDNAシークエンシングの適用例では、初期移行速度は、そのような較正測定からのシグナル率に基づいて、ならびに上記論じた相対シグナル強度分布に基づく尺度に基づいて、選択されてもよい。その結果、そのような測定から、例えばナノポアのアレイ上での信頼性あるヌクレオチド識別を可能にするまたは最大限にする、電圧を選択してもよい。一部の実施形態では、そのような較正は、分析される鋳型の試料(所定の標準配列の代わりに、またはその標準配列に加えて)からの核酸を使用して行ってもよい。一部の実施形態では、そのような較正は、シークエンシングの試行中にリアルタイムで実施されてもよく、印加電圧は、そのような測定値に基づいてリアルタイムで修正されてもよく、その結果、例えばヌクレオチド特異的シグナルの獲得を最大限にすることができる。
(ナノポアアレイ)
(ナノポアアレイ)
上記論じたように、本発明と共に使用されるナノポアは、固相ナノポア、タンパク質ナノポア、あるいはタンパク質ナノポアまたはカーボンもしくはグラフェンナノチューブなどの有機ナノチューブを含むハイブリッドナノポアであって、固相膜に構成されたまたはフレームワークのように構成されたものであってもよい。ナノポアの1つの機能は、ポリヌクレオチドなどのポリマー分析物を拘束することであり、したがってそれらのモノマーは、順々に検出ゾーン(またはシグナル発生領域)を通過するようになる(即ち、ヌクレオチドが検出ゾーンを一度に1つずつまたは単一ファイルで通るようになる)。本発明によれば、ナノポアはアレイで、典型的には平面アレイで提供される。一部の実施形態では、ナノポアのアレイは規則的に、例えば直線パターンまたは六角形パターンなどに配置構成される。一部の実施形態では、ナノポアのアレイはランダムアレイであり、例えば一部の実施形態では、ポアソン分布により記述される通りである。一部の実施形態では、アレイのナノポアは、公知の場所に配置される。一部の実施形態では、ナノポアアレイは複数のナノポアを含む。一部の実施形態では、そのような複数は、少なくとも10個のナノポアを含み、または他の実施形態では少なくとも100個のナノポアを、または他の実施形態では少なくとも1000個のナノポアを含む。さらに他の実施形態では、ナノポアアレイは、10から10,000個の範囲の複数のナノポアを含む。一部の実施形態では、ナノポアの追加の特徴は、二本鎖核酸または等しくバルク状の分子を通さないが一本鎖核酸を通すことを含む。一部の実施形態では、ナノポアの追加の機能は、(i)二本鎖核酸もしくは等しくバルク状の分子を通さないが一本鎖核酸を通すこと、および/または(ii)蛍光シグナルが収集されないよう、蛍光シグナルの発生が抑制されもしくは方向付けられるように、蛍光標識をヌクレオチド上に拘束することを含む。
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスに関連して使用されるナノポアは、規則的にまたは平面上の既知の場所に配置されてもよい、ナノポアのクラスターのアレイなどのアレイの形で提供される。一部の実施形態では、クラスターはそれぞれ、異なるクラスターのナノポアからの光シグナルが、用いられる光検出システムによって区別可能になるように、別々の分解能限界区域内にあるが、同じクラスター内のナノポアからの光シグナルは、用いられる光検出システムによってそのようなクラスター内の特定のナノポアに必ずしも割り当てることができない。
固相ナノポアは、窒化ケイ素(Si3N4)および二酸化ケイ素(SiO2)などを含むがこれらに限定されない様々な材料で製作されてもよい。DNAシークエンシングなど、分析適用例に関するナノポアの製作および動作は、参照により組み込まれる下記の例示的な参考文献に開示されている:Ling、米国特許第7,678,562号;Huら、米国特許第7,397,232号;Golovchenkoら、米国特許第6,464,842号;Chuら、米国特許第5,798,042号;Sauerら、米国特許第7,001,792号;Suら、米国特許第7,744,816号;Churchら、米国特許第5,795,782号;Bayleyら、米国特許第6,426,231号;Akesonら、米国特許第7,189,503号;Bayleyら、米国特許第6,916,665号;Akesonら、米国特許第6,267,872号;Mellerら、米国特許出願公開第2009/0029477号;Howorkaら、国際特許公開WO2009/007743;Brownら、国際特許公開WO2011/067559;Mellerら、国際特許公開WO2009/020682;Polonskyら、国際特許公開WO2008/092760;Van der Zaagら、国際特許公開WO2010/007537;Yanら、Nano Letters、5巻(6号):1129〜1134頁(2005年);Iqbalら、Nature Nanotechnology、2巻:243〜248頁(2007年);Wanunuら、Nano Letters、7巻(6号):1580〜1585頁(2007年);Dekker、Nature Nanotechnology、2巻:209〜215頁(2007年);Stormら、Nature Materials、2巻:537〜540頁(2003年);Wuら、Electrophoresis、29巻(13号):2754〜2759頁(2008年);Nakaneら、Electrophoresis、23巻、2592〜2601頁(2002年);Zheら、J. Micromech. Microeng.、17巻:304〜313頁(2007年);Henriquezら、The Analyst、129巻:478〜482頁(2004年);Jagtianiら、J. Micromech. Microeng.、16巻:1530〜1539頁(2006年);Nakaneら、J. Phys. Condens. Matter、15巻、R1365〜R1393(2003年);DeBloisら、Rev. Sci. Instruments、41巻(7号):909〜916頁(1970年);Clarkeら、Nature Nanotechnology、4巻(4号):265〜270頁(2009年);およびBayleyら、米国特許出願公開第2003/0215881号など。
一部の実施形態では、本発明は、1つまたは複数の光遮断層、即ち1つまたは複数の不透明層を持つ、ナノポアアレイを含む。典型的には、ナノポアアレイは、特に使用される厚さで、例えば50〜100nm未満の厚さで容易に光を透過させる、ケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、または酸化アルミニウムなどの材料の薄いシートに製作される。分析物の電気的検出の場合、このことは問題ではない。しかし、ナノポアを移行する標識分子の光学ベースの検出では、アレイを透過する光は常に、意図される反応部位の外側の材料を励起し、したがって、例えば非特異的バックグラウンド蛍光、またはまだナノポアに進入していない分子の標識からの蛍光などから、光ノイズを発生させる。一態様では、本発明は、励起ビームから光を反射および/または吸収する1つまたは複数の光遮断層をナノポアアレイに設け、それによって、アレイのナノポアに関連した意図される反応部位で発生した光シグナルに関するバックグラウンドノイズを低減させることにより、この問題に対処する。一部の実施形態では、このことにより、意図される反応部位における光学標識を、直接照明によって励起することが可能になる。一部の実施形態では、不透明な層は金属層であってもよい。そのような金属層は、Sn、Al、V、Ti、Ni、Mo、Ta、W、Au、Ag、またはCuを含んでいてもよい。一部の実施形態では、そのような金属層は、Al、Au、Ag、またはCuを含んでいてもよい。さらに他の実施形態では、そのような金属層はアルミニウムまたは金を含んでいてもよく、アルミニウムだけを含んでいてもよい。不透明な層の厚さは、広く様々であってもよく、層を構成する材料の物理的および化学的性質に依存してもよい。一部の実施形態では、不透明な層の厚さは、少なくとも5nm、または少なくとも10nm、または少なくとも40nmであってもよい。他の実施形態では、不透明な層の厚さは、5〜100nmの範囲であってもよく;他の実施形態では、不透明な層の厚さは、10〜80nmの範囲であってもよい。不透明な層は、励起ビームからの光の100パーセントを遮断(即ち、反射または吸収)する必要はない。一部の実施形態では、不透明な層は、励起ビームからの入射光の少なくとも10パーセントを遮断してもよく;他の実施形態では、不透明な層は、励起ビームからの入射光の少なくとも50パーセントを遮断してもよい。
不透明な層またはコーティングは、当技術分野で公知の様々な技法によって、固相膜上に製作されてもよい。材料堆積技法を、化学蒸着、電着、エピタキシー、熱酸化、蒸着およびスパッタリングを含む物理気相成長、ならびに流延なども含めて使用してもよい。一部の実施形態では、原子層堆積を使用してもよく、例えば参照により組み込まれる米国特許第6,464,842号;Weiら、Small、6巻(13号):1406〜1414頁(2010年)がある。
一部の実施形態では、1〜100nmのチャネルまたはアパーチャーは、固体基材、通常は平面基材、例えば膜内に形成されてもよく、それを通して一本鎖DNAなどの分析物が移行するように誘発される。他の実施形態では、2〜50nmのチャネルまたはアパーチャーが、基材内を通して形成され;さらに他の実施形態では、2〜30nmまたは2〜20nmまたは3〜30nmまたは3〜20nmまたは3〜10nmのチャネルまたはアパーチャーが、基材を通して形成される。ナノポアを発生させる固相手法は、堅牢性および耐久性、ならびにナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウエハ規模でナノポアの高密度アレイを製作する能力、脂質ベースの系と比べて優れた機械的、化学的、および熱的特性と、電子または光学的読出し技法と一体化する可能性をもたらす。一方、生物学的ナノポアは、再現可能な狭いボアまたは管腔、特に1〜10ナノメートルの範囲にあるもの、ならびにナノポアの物理的および/または化学的性質を調整するための、およびFRETドナーまたはアクセプターであってもよい蛍光標識などの基または要素を従来のタンパク質工学方法によって直接または間接的に取着するための、技法を提供する。タンパク質ナノポアは、典型的には、機械的支持のための繊細な脂質二重層に依拠し、精密な寸法を持つ固相ナノポアの製作は困難なままである。一部の実施形態では、固相ナノポアは、これらの欠点のいくつかを克服するいわゆる「ハイブリッド」ナノポアを形成するために、生物学的ナノポアと組み合わされてもよく、それによって、固相ナノポアの安定性が生物学的ポアタンパク質の精度にもたらされる。光学的読出し技法では、ハイブリッドナノポアは、データ獲得を大幅に単純化するナノポアの精密な場所を提供する。
一部の実施形態では、クラスターは、アパーチャーのアレイを含有する固相膜によって支持される脂質二重層内に、タンパク質ナノポアを配置することによって形成されてもよい。例えば、そのようなアレイは、固相支持体に製作された(例えば、穿孔されるまたはエッチングされるなど)アパーチャーを含んでいてもよい。そのようなアパーチャーの幾何学的形状は、用いられる製作技法に依存して変化し得る。一部の実施形態では、そのようなアパーチャーのそれぞれは、別々の分解能限界区域に関連付けられまたは包含され;しかし他の実施形態では、多数のアパーチャーが、同じ分解能限界区域内にあってもよい。アパーチャーの断面積は、広く様々であってもよく、異なるクラスター間で同じであっても同じでなくてもよいが、そのような面積は通常、従来の製作手法の結果と実質的に同じである。一部の実施形態では、アパーチャーは、10から200nmの範囲の最小直線状寸法(例えば、円形アパーチャーの場合は直径)を有し、または約100から3×104nm2の範囲の面積を有する。アパーチャーの端から端まで、脂質二重層が配置されていてもよい。アパーチャー当たりのタンパク質ナノポアの分布は、例えば、挿入ステップ中にタンパク質ナノポアの濃度を制御することによって、変化させてもよい。そのような実施形態では、ナノポアのクラスターは、ランダムな数のナノポアを含んでいてもよい。タンパク質ナノポアがアパーチャーにランダムに挿入される一部の実施形態では、平均して1つまたは複数のアパーチャーを含有するクラスターは、ゼロよりも大きい数のタンパク質ナノポアを有し;他の実施形態では、そのようなクラスターは0.25よりも大きい数のタンパク質ナノポアを有し;他の実施形態では、そのようなクラスターは0.5よりも大きい数のタンパク質ナノポアを有し;他の実施形態では、そのようなクラスターは0.75よりも大きい数のタンパク質ナノポアを有し;他の実施形態では、そのようなクラスターは1.0よりも大きい数のタンパク質ナノポアを有する。
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスは、通るアパーチャーのアレイを有するSiN膜などの固相膜を含み、第1のチャンバーと第2のチャンバー(場合によっては「シスチャンバー」および「トランスチャンバー」とも呼ばれる)との間に連通をもたらし、かつ第2のまたはトランスチャンバーに対向する面上に脂質二重層を支持する。一部の実施形態では、そのような固相膜のアパーチャーの直径は、10から200nmの範囲または20から100nmの範囲であってもよい。一部の実施形態では、そのような固相膜はさらに、そのような二重層がトランスチャンバーに対向する面上でアパーチャーに跨る領域で、脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアを含む。一部の実施形態では、そのようなタンパク質ナノポアは、本明細書に記載される技法を使用して、固相膜のシス側から挿入される。一部の実施形態では、そのようなタンパク質ナノポアは、軸に沿ってバレルまたはボアを含みかつ一端に「キャップ」構造を有し他端に「ステム」構造を有する点に関し(Songら、Science、274巻:1859〜1866頁(1996年)の専門用語を使用)、α−溶血素と同一のまたは類似の構造を有する。そのようなタンパク質ナノポアを使用する一部の実施形態では、脂質二重層への挿入は、そのキャップ構造がシスチャンバーに曝露されかつそのステム構造がトランスチャンバーに曝露されるように配向する、タンパク質ナノポアをもたらす。
一部の実施形態では、本発明は、特にポリヌクレオチドの光学ベースのナノポアシークエンシングのために、クラスター内にハイブリッドナノポアを用いてもよい。そのようなナノポアは、タンパク質ナノポアなどのタンパク質バイオセンサーが安定して内部に挿入される、固相オリフィスまたはアパーチャーを含む。荷電ポリマーは、従来のタンパク質工学技法によってタンパク質ナノポア(例えば、アルファ溶血素)に取着されてもよく、その後、印加電場を使用して、タンパク質ナノポアを固相膜のアパーチャー内に案内してもよい。一部の実施形態では、固相基材のアパーチャーは、タンパク質よりも僅かに小さくなるように選択され、それによって、アパーチャー内を通して移行するのを防止する。代わりに、タンパク質は、固相オリフィスに埋め込まれることになる。
一部の実施形態では、ドナー蛍光体をタンパク質ナノポアに取着させる。次いでこの複合体を、タンパク質ナノポアが固相ナノホール内に輸送されてハイブリッドナノポアを形成するまで、固相ナノホールまたはアパーチャーの両端に電場を印加することによって固相アパーチャーまたはナノホール(例えば、直径3〜10nm)に挿入する。ハイブリッドナノポアの形成は、(a)固相ナノホールの部分遮断に基づいて電流の降下を引き起こす、挿入されたタンパク質ナノポアによって、および(b)ドナー蛍光体の光検出によって、検証することができる。
固相または合成ナノポアは、上記引用した参考文献で具体化されるような、様々な方法で調製されてもよい。一部の実施形態では、例えば参照により本明細書に組み込まれるYangら、Nanotechnolgy、22巻:285310(2011年)に開示されるように、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して、様々な材料に合成ナノポアを穿孔してもよい。自立膜になるように加工された薄膜材料、例えば窒化ケイ素の1つまたは複数の領域を支持するチップを、ヘリウムイオン顕微鏡(HIM)チャンバーに導入する。HIMモーター制御を使用して、顕微鏡が低倍率に設定されている間に自立膜をイオンビームの経路に導く。焦点および非点補正を含むビームパラメーターを、自立膜に隣接するが固体基材上の領域で調節する。パラメーターが適正に固定されたら、自立膜領域がイオンビーム走査領域の中心になるようにかつビームがブランクになるように、チップ位置を移動させる。HIM視野は、予想される全てのナノポアパターンを含有するのに十分な、および将来の光学的読出し(即ち、光学倍率、カメラ解像度などに依存する)で役立てるのに十分な寸法(単位 μm)に設定する。次いでイオンビームを、画素ドウェル時間で、全視野の全体を通して1回ラスター走査し、その結果、膜自己蛍光の全てまたはほとんどを除去するのに十分な全イオン用量が得られる。次いで視野を、適正な値(上記使用されるものよりも小さい)に設定して、単一ナノポアまたはナノポアのアレイのいずれかの、リソグラフィーにより画定されたミリングを行う。パターンの画素ドウェル時間は、試料加工前の較正試料の使用を通して決定された、1つまたは複数の所定の直径のナノポアをもたらすように設定する。このプロセス全体を、単一チップ上の所望の領域ごとに、および/またはHIMチャンバー内に導入されたチップごとに繰り返す。
一部の実施形態では、ナノポアは、光学ベースのナノポアシークエンシング法で使用するために取着される、1つまたは複数の標識を有していてもよい。標識は、Forster共鳴エネルギー移動(FRET)ペアのメンバーであってもよい。そのような標識は、有機蛍光体、化学ルミネセンス標識、量子ドット、金属ナノ粒子、および/または蛍光タンパク質を含んでいてもよい。標的核酸は、ヌクレオチド当たり、1つの明確に異なる標識を有していてもよい。ヌクレオチドに取着された標識は、有機蛍光体からなる群から選択されてもよい。ポアタンパク質中の標識取着部位は、従来のタンパク質工学法によって発生させることができ、例えば変異タンパク質は、標識の特異的結合が可能になるものを構成することができる。例として、システイン残基をタンパク質の所望の位置に挿入して、標識を取着するのに使用することができるチオール(SH)基を挿入してもよい。システインは、天然に生ずるアミノ酸に取って代わることができ、または追加のアミノ酸として組み込むことができる。次いでマレイミド活性化標識を、タンパク質ナノポアのチオール残基に、共有結合により取着する。好ましい実施形態では、タンパク質ナノポアへの標識、または核酸上の標識の取着は、可逆的である。切断可能な架橋剤を組み込むことにより、容易に破断可能な化学結合(例えば、S−S結合またはpH不安定結合)を導入し、該当する条件が満たされたときに標識を除去してもよい。
(ナノポアおよび分析物の標識)
(ナノポアおよび分析物の標識)
一部の実施形態では、ナノポアを、1つまたは複数の量子ドットで標識してもよい。特に、一部の実施形態では、1つまたは複数の量子ドットがナノポアに取着されてもよく、または隣接する(およびナノポアの入口または出口からFRET距離以内の)固相支持体に取着されてもよく、分析物上のアクセプターとのFRET反応でドナーとして用いてもよい。量子ドットのそのような使用は周知であり、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,252,303号;第6,855,551号;および第7,235,361号などの科学および特許文献に広く記載されている。
ポア標識として利用され得る量子ドットの一例は、水溶液中で合成することができるCdTe量子ドットである。CdTe量子ドットは、第1級アミンなどの求核基、チオール、またはカルボン酸などの官能基で官能化されてもよい。CdTe量子ドットは、タンパク質ポアの外部にある第1級アミンに、量子ドットを共有結合により連結するのに利用され得る、カルボン酸官能基を有するメルカプトプロピオン酸キャッピング配位子を含んでいてもよい。架橋反応は、生体共役反応の分野の当業者に公知である標準の架橋試薬(ホモ二官能性ならびにヘテロ二官能性)を使用して実現されてもよい。修飾が、ナノポアを通した核酸の移行を損なわないまたは実質的に損なわないことを確実にするのに、注意を払ってもよい。このことは、ドナー標識をナノポアに取着するのに使用される、用いられる架橋剤分子の長さを変えることによって、実現されてもよい。
例えば、天然アルファ溶血素タンパク質のリシン残基131の第1級アミン(Song, L.ら、Science274巻、(1996年):1859〜1866頁)は、1−エチル−3−[3−ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩/N−ヒドロキシスルホスクシンイミド(EDC/NHS)カップリング化学を介してカルボキシ修飾CdTe量子ドットを共有結合するのに使用されてもよい。あるいは、アミノ酸129(トレオニン)をシステインに交換してもよい。天然アルファ溶血素タンパク質中には他のシステイン残基がないので、新たに挿入されたシステインのチオール側基を使用して、他の化学部分に共有結合により取着してもよい。
生体ポリマー、例えば核酸分子またはポリマーは、1つまたは複数のアクセプター標識で標識されてもよい。核酸分子の場合、核酸分子の4つのヌクレオチドまたはビルディングブロックのそれぞれをアクセプター標識で標識してもよく、それによって、それぞれ天然に生ずるヌクレオチドの標識(例えば、蛍光)対応物を創出してもよい。アクセプター標識は、変換された核酸の一部または鎖全体にある1つまたは複数のヌクレオチドに取着することができる、エネルギー受容分子の形をとってもよい。
様々な方法が、核酸分子またはポリマーのモノマーまたはヌクレオチドを標識するのに利用されてもよい。標識されたヌクレオチドを、鋳型として当初の試料を使用して、新しい核酸の合成中に核酸に組み込んでもよい(「合成による標識」)。例えば核酸の標識は、PCR、全ゲノム増幅、ローリングサークル増幅、またはプライマー伸長などを介して、あるいは当業者に公知の上記方法の様々な組合せおよび拡張例を介して、実現されてもよい。
標識は、求核剤(アミン、チオールなど)などの反応性基を含んでいてもよい。次いで天然の核酸には存在しないそのような求核剤を使用して、NHSエステル、マレイミド、エポキシ環、イソシアネートなどのアミンまたはチオール反応化学を介して蛍光標識を取着することができる。そのような求核反応性蛍光色素(即ち、NHS色素)は、種々の供給元から容易に商用として入手可能である。核酸を小さい求核剤で標識する利点は、「合成による標識」手法を使用したときの、そのような標識ヌクレオチドの組込みの高効率にある。バルク状に蛍光標識された核酸ビルディングブロックは、新たに合成されるDNAへの重合プロセス中の標識の立体障害に起因して、ポリメラーゼによって不十分に組み込まれる可能性がある。
2種またはそれよりも多くの相互消光色素が使用されるときは常に、そのような色素は直交取着化学を使用してDNAに取着され得る。例えばNHSエステルは、第1級アミンに非常に特異的に反応させるのに使用することができ、またはマレイミドがチオール基と反応することになる。第1級アミン(NH2)またはチオール(SH)で修飾されたヌクレオチドは、市販されている。これらの比較的小さい修飾は、ポリメラーゼ媒介型DNA合成に容易に組み込まれ、NHSまたはマレイミドのいずれかの修飾色素を使用して後続の標識反応に使用することができる。そのような直交リンカー化学を選択し使用するための指針は、Hermanson(上記引用)に見出される。
典型的な取着位置に関する追加の直交取着化学は、銅で触媒される反応および非触媒反応に関してHuisgen型付加環化;アルケンに酸化ニトリル付加環化を加えたもの、例えばGutsmiedlら、Org. Lett.、11巻:2405〜2408頁(2009年)に開示されるもの;Diels−Alder付加環化、例えば、Seeligら、Tetrahedron Lett.、38巻:7729〜7732頁(1997年)に開示されるもの;カルボニルライゲーション、例えば、Casiら、J. Am. Chem. Soc.、134巻:5887〜5892頁(2012年)に開示されるもの;Shaoら、J. Am. Chem. Soc.、117巻:3893〜3899巻(1995年);Rideout、Science、233巻:561〜563頁(1986年);Michael付加、例えば、Brinkley、Bioconjugate Chemistry、3巻:2〜13頁(1992年)に開示されるもの;天然の化学ライゲーション、例えば、Schulerら、Bioconjugate Chemistry、13巻:1039〜1043頁(2002年)に開示されるもの;Dawsonら、Science、266巻:776〜779頁(1994年)に開示されるもの;または活性エステルを介したアミド形成、例えば、Hermanson(上記引用)に開示されるものを含む。
核酸鎖中の1、2、3、または4個のヌクレオチドの組合せは、それらの標識された対応物と交換されてもよい。標識されたヌクレオチドの様々な組合せは、並行してシークエンシングすることができ、例えば、供給源の核酸またはDNAを、4種の単一標識試料に加えて2つの標識されたヌクレオチドの組合せで標識し、その結果、合計10種の種々に標識された試料核酸分子またはDNA(G、A、T、C、GA、GT、GC、AT、AC、TC)が得られることになる。得られた配列パターンは、冗長配列読出しにおける重なり合ったヌクレオチドの位置に起因して、より正確な配列アライメントを可能にし得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどのポリマーは、単一種類のモノマーに取着された単一蛍光標識で標識されてもよく、例えば、ポリヌクレオチドの全てのT(または実質的に全てのT)は、蛍光標識、例えばシアニン色素で標識される。そのような実施形態では、ポリマーからの蛍光シグナルの収集または配列は、特定のポリマーに関するサインまたはフィンガープリントを形成してもよい。一部のそのような実施形態では、そのようなフィンガープリントは、決定されるモノマーの配列に関して十分な情報を提供しても提供しなくてもよい。
一部の実施形態では、本発明の特徴は、相互消光する組のメンバーである蛍光色素または標識による、ポリマー分析物の実質的に全てのモノマーの標識である。標識ポリマー分析物に関する「実質的に全ての」という用語の使用は、化学および酵素標識技法が典型的には100パーセント未満の効率であることを認めることである。一部の実施形態では、「実質的に全て」は、全てのモノマーの少なくとも80パーセントが、取着された蛍光標識を有することを意味する。他の実施形態では、「実質的に全て」は、全てのモノマーの少なくとも90パーセントが、取着されたに蛍光標識を有することを意味する。他の実施形態では、「実質的に全て」は、全てのモノマーの少なくとも95パーセントが、取着された蛍光標識を有することを意味する。
核酸分子などのポリマーをシークエンシングするための方法は、膜または膜様構造またはその他の基材に挿入されたナノポアまたはポアタンパク質(または合成ポア)を提供することを含む。ポアの基部またはその他の部分は、1つまたは複数のポア標識で修飾されてもよい。基部は、ポアのトランス側を指してもよい。任意選択で、ポアのシスおよび/またはトランス側は、1つまたは複数のポア標識で修飾されてもよい。分析されまたはシークエンシングされる核酸ポリマーは、標識されたタイプの核酸ポリマーを生成するための鋳型として使用してもよく、この場合、得られるポリマー中の4つのヌクレオチドの1つまたは最大で4つ全てのヌクレオチドはヌクレオチドの標識類似体(単数または複数)で置き換えられる。電場はナノポアに印加され、標識された核酸ポリマーをナノポア内に押し遣り、一方、外部単色光源またはその他の光源を使用してナノポアを照明し、それによってポア標識を励起してもよい。核酸の標識されたヌクレオチドがナノポアの内部を通過し、ナノポアから出て行き、またはナノポアに進入した後または前に、エネルギーはポア標識からヌクレオチド標識に伝達されるので、その結果、より低いエネルギー放射線が放出される。次いでヌクレオチド標識放射線を、共焦点顕微鏡の装置またはその他の光検出システムまたは光学顕微鏡法システムであって当業者に公知の単分子検出が可能であるシステムによって、検出する。そのような検出システムの例には、共焦点顕微鏡法、落射照明蛍光顕微鏡法、および全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法などが含まれるがこれらに限定するものではない。一部の実施形態では、落射照明蛍光顕微鏡法が用いられる。
エネルギーは、標識モノマーがナノポアから出て行き、ナノポアに進入し、またはナノポアを通過した後または前に、ポリマーのアクセプター標識モノマー(例えば、ヌクレオチド)のアクセプター標識がドナー標識と相互作用するとき、ポアまたはナノポアドナー標識(例えば、量子ドット)からポリマー(例えば、核酸)上のアクセプター標識に伝達されてもよい。例えばドナー標識は、ナノポアのシスもしくはトランス側または表面のナノポアに位置決めされまたは取着され、その結果、標識されたモノマーがナノポアから出て行きかつナノポアチャネルまたは開口の外側のドナー標識の近傍または近位に配置されるまで、ドナー標識とアクセプター標識との間の相互作用またはエネルギー移動が生じないようにしてもよい。その結果、標識間の相互作用、ドナー標識からアクセプター標識へのエネルギー移動、アクセプター標識からのエネルギーの放出、および/またはアクセプター標識からのエネルギーの放出の測定もしくは検出が、ナノポア内を走る、例えばナノポアのシスまたはトランス側にあるシスまたはトランスチャンバー内部を走る、通路、チャネル、または開口の外側で行われてもよい。モノマーのアクセプター標識から放出されるエネルギーの測定または検出は、モノマーを識別するのに利用してもよい。
ナノポア標識は、標識が目に見えまたは露出して標識の励起または照明が容易になるように、ナノポアの通路、チャネル、または開口の外側に位置決めされてもよい。ドナー標識とアクセプター標識との間の相互作用およびエネルギー移動、ならびにエネルギー移動の結果としてのアクセプター標識からのエネルギーの放出は、ナノポアの通路、チャネル、または開口の外側で生じてもよい。これは、例えば光検出または測定デバイスを介して、アクセプター標識からのエネルギーまたは光の放出の検出または測定の容易さおよび正確さを促進させ得る。
ドナー標識は、様々な手法でおよび/またはナノポア上の様々な部位に取着されてもよい。例えばドナー標識は、ナノポアの一部または単位に直接または間接的に取着されまたは接続されてもよい。あるいは、ドナー標識はナノポアに隣接して位置決めされてもよい。
ポリマー(例えば、核酸)の各アクセプター標識モノマー(例えば、ヌクレオチド)は、内部でポリマーが移行するナノポアまたはチャネルの出口の上にもしくは隣に位置決めされまたは直接もしくは間接的に取着されたドナー標識と、順次相互作用することができる。ドナー標識とアクセプター標識との間の相互作用は、ナノポアチャネルまたは開口の外側で、例えばアクセプター標識モノマーがナノポアを出た後にまたはモノマーがナノポアに進入する前に生じてもよい。相互作用は、例えばアクセプター標識モノマーがナノポアを通過し、進入し、または出て行く間に、ナノポアチャネルまたは開口の内部または部分的に内部で生じてもよい。
核酸の4つのヌクレオチドの1つが標識されるとき、単一ヌクレオチド標識放出から生じる時間依存性シグナルは、核酸配列中の標識ヌクレオチドの位置に対応した配列に変換される。次いでプロセスを、別々の試料中の4つのヌクレオチドのそれぞれに関して繰り返し、次いで4つの部分配列を位置合わせして、全核酸配列を組み立てる。
多色標識核酸(DNA)配列を分析するとき、1つまたは複数のドナー標識から、核酸分子上に存在し得る4つの明確に異なるアクセプター標識のそれぞれへのエネルギー移動は、4つの明確に異なる波長または色(それぞれ、4つのヌクレオチドの1つに関連付けられる)で発光をもたらすことができ、直接配列読出しが可能になる。
ドナー標識(場合によっては、本明細書では「ポア標識」とも呼ぶ)は、ナノポアを通した核酸の移行を損なう閉塞を引き起こすことなく、ナノポアのアパーチャーに可能な限り近くに(例えば、出口で)配置されてもよい。ポア標識は、様々な適切な性質および/または特徴を有していてもよい。例えばポア標識は、特定の要件を満たすエネルギー吸収特性を有していてもよい。ポア標識は、例えば約0から1000nmまたは約200から500nmに及ぶ、大きい放射線エネルギー吸収断面を有していてもよい。ポア標識は、アクセプター標識などの核酸標識のエネルギー吸収よりも高い、特定のエネルギー範囲内で、放射線を吸収してもよい。ポア標識の吸収エネルギーは、エネルギー移動が2つの標識間で生じ得る距離を制御するために、核酸標識の吸収エネルギーに対して調整されてもよい。ポア標識は、少なくとも106から109回の励起およびエネルギー移動サイクルで安定であり機能的であってもよい。
一部の実施形態では、モノマーの配列に取着された光学標識をそれぞれが有するポリマーを分析するためのデバイスは、下記の要素を含んでいてもよい:(a)第1のチャンバーと第2のチャンバーとを切り離す固相膜内のナノポアアレイであって、ナノポアアレイのナノポアはそれぞれが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通をもたらし、かつクラスターに配置構成され、したがって、ナノポアの異なるクラスターのそれぞれは、異なる分解能限界区域内に配置されるようになされており、かつ各クラスターは、1よりも大きいまたは平均値がゼロよりも大きいランダムな変数であるいくつかのナノポアを含むようになされている、ナノポアアレイ;(b)第1のチャンバー内のポリマーを、ナノポアアレイのナノポアを通して第2のチャンバーに移動させるための、ポリマー移行システム;および(c)光学標識が分解能限界区域内のナノポアから出て行くときは常に、ポリマーに取着された光学標識により発生した光シグナルを収集するための、検出システム。
定義
定義
「FRET」または「Forsterまたは蛍光共鳴エネルギー移動」は、励起したドナー蛍光体から基底状態にあるアクセプター蛍光体への非放射性双極子−双極子エネルギー移動メカニズムを意味する。FRET相互作用におけるエネルギー移動速度は、アクセプターの吸収スペクトルに対するドナーの放出スペクトルの、スペクトル重なりの程度、ドナーの量子収率、ドナーおよびアクセプター遷移双極子の相対配向、ならびにドナー分子とアクセプター分子との間の距離に依存する、Lakowitz、Principles of Fluorescence Spectroscopy、第3版、(Springer、2006年)。特定の目的のFRET相互作用は、アクセプターに移動し、今度は光子としてアクセプターにより放出される、周波数がそのドナーを励起する光の周波数よりも低い、エネルギーの一部分をもたらすものである(即ち、「FRETシグナル」)。「FRET距離」は、FRETドナーとFRETアクセプターとの間の距離であって、その距離にわたってFRET相互作用が生じることができかつ検出可能なFRETシグナルがFRETアクセプターにより生成される、距離を意味する。
「ナノポア」は、所定のまたは識別可能な順序で基材内の分析物の通過を可能にする、またはポリマー分析物の場合には、所定のまたは認識可能な順序で基材内のポリマー分析物のモノマー単位の通過を可能にする、基材内に位置決めされた任意の開口を意味する。後者の場合、所定のまたは認識可能な順序は、ポリマー中のモノマー単位の一次配列であってもよい。ナノポアの例には、タンパク質性またはタンパク質をベースにしたナノポア、合成または固相ナノポア、および内部に埋め込まれたタンパク質ナノポアを有する固相ナノポアを含むハイブリッドナノポアが含まれる。ナノポアは、1〜10nmまたは1〜5nmまたは1〜3nmの内径を有していてもよい。タンパク質ナノポアの例には、アルファ溶血素、電圧依存性ミトコンドリアポリン(VDAC)、OmpF、OmpC、MspA、およびLamB(マルトポリン)、例えば参照により本明細書に組み込まれるRhee, M.ら、Trends in Biotechnology、25巻(4号)(2007年):174〜181頁;Bayleyら(上記引用);およびGundlachら、米国特許出願公開第2012/0055792号などに開示されたものが含まれるが、これらに限定するものではない。単一核酸分子の移行を可能にする任意のタンパク質ポアを、用いてもよい。ナノポアタンパク質は、ポアの外部の特定の部位で、またはポア形成タンパク質を構成する1つもしくは複数のモノマー単位の外部の特定の部位で、標識されてもよい。ポアタンパク質は、アルファ溶血素、MspA、電圧依存性ミトコンドリアポリン(VDAC)、アンスラックスポリン、OmpF、OmpC、およびLamB(マルトポリン)などであるがこれらに限定されないタンパク質の群から選択される。固相ホールへのポアタンパク質の一体化は、荷電ポリマーをポアタンパク質に取着することによって実現される。電場を印加した後、荷電複合体を電気泳動的に固相ホール内に引き込む。合成ナノポア、または固相ナノポアは、様々な形の固体基材として創出されてもよく、その例には、シリコーン(例えば、Si3N4、SiO2)、金属、金属酸化物(例えば、Al2O3)プラスチック、ガラス、半導体材料、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定するものではない。合成ナノポアは、脂質二重層膜内に位置決めされた生体タンパク質ポアより安定であってもよい。合成ナノポアは、重合エポキシなどであるがこれらに限定されない適切な基材に埋め込まれたカーボンナノチューブを使用することによって、創出されてもよい。カーボンナノチューブは、均一な、十分定められた化学的および構造的性質を有することができる。様々なサイズのカーボンナノチューブは、1から数百ナノメートルに及ぶものを得ることができる。カーボンナノチューブの表面電荷は約ゼロであることが公知であり、その結果、ナノポアを通した核酸の電気泳動輸送は、単純かつ予測可能になる(Ito, T.ら、Chem. Commun. 12巻(2003年):1482〜83頁)。合成ナノポアの基材表面は、タンパク質ポアの共有結合による取着が可能になるように、または光学的ナノポアシークエンシングに適切な表面特性が得られるように、化学修飾されてもよい。そのような表面修飾は、共有結合または非共有結合にすることができる。ほとんどの共有結合修飾は、最も一般的なプロトコールが記述される、オルガノシラン堆積を含む:1)水性アルコールからの堆積。これは、シリル化された表面を調製するための最も容易な方法である。95%エタノール−5%水の溶液を、酢酸でpH4.5〜5.5に調節する。シランを撹拌しながら添加して、2%の最終濃度を得る。加水分解およびシラノール基形成の後、基材を2〜5分間添加する。濯いだ後、エタノールに短時間浸漬することにより、過剰な材料が含まれない。シラン層の硬化は、摂氏110度で5〜10分間である。2)気相成長。化学蒸着法により、乾燥非プロトン性条件下、シランを基材に付着させることができる。これらの方法は、単層堆積を好む。密閉チャンバーの設計では、基材を、5mmの蒸気圧が実現されるよう十分な温度に加熱する。あるいは、シラン蒸発が観察されるまで真空を印加することができる。3)スピンオン堆積。スピンオン付着は、最大限の官能化および多層堆積を好む加水分解条件下で、または単層堆積を好む乾燥条件下で、行うことができる。一部の実施形態では、単一ナノポアを、本発明の方法と共に用いる。他の実施形態では、複数のナノポアを用いる。後者の実施形態のいくつかでは、複数のナノポアは、固相膜などの通常は平面基材中に配置される、ナノポアのアレイとして用いられる。ナノポアアレイのナノポアは、規則的に間隔を空けて、例えば直線的パターンで配置されてもよく、またはランダムに間隔を空けて配置されてもよい。好ましい実施形態では、ナノポアは、平面固相基材の直線的パターンとして規則的に間隔を空けて配置される。
「ペプチド」、「ペプチド断片」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、またはペプチドに関する「断片」は、本明細書では同義に使用され、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基の単一非分岐鎖で構成される化合物を指す。ペプチドまたはポリペプチド中のアミノ酸は、ポリエチレングリコール、色素、ビオチン、ハプテン、または同様の部分を含むがこれらに限定されない様々な部分で誘導体化されてもよい。タンパク質またはポリペプチドまたはペプチド中のアミノ酸残基の数は、広く様々に変えてもよい;しかし一部の実施形態では、本明細書で言及されるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、2から70個のアミノ酸残基を有していてもよく;他の実施形態では、それらは2から50個のアミノ酸残基を有していてもよい。他の実施形態では、本明細書で言及されるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、数十個のアミノ酸残基、例えば20から最大1000個またはそれよりも多くのアミノ酸残基、例えば1200個を有していてもよい。さらに他の実施形態では、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、またはこれらの断片は、10から1000個のアミノ酸残基を有していてもよく;または20から500個のアミノ酸残基を有していてもよく;または20から200個のアミノ酸残基を有していてもよい。
「ポリマー」は、直鎖状に接続された複数のモノマーを意味する。通常、ポリマーは、例えばA、C、G、およびTのモノマーを含むポリヌクレオチドとして、または複数種類のアミノ酸を含むポリペプチドとして、複数のタイプのモノマーを含む。モノマーは、ヌクレオシドおよびその誘導体または類似体と、アミノ酸およびその誘導体および類似体とを含んでいてもよいがこれらに限定するものではない。一部の実施形態では、ポリマーがポリヌクレオチドであり、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合またはその類似体によって接続される。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は同義で使用され、それぞれ、ヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、ワトソン・クリック型の塩基対合、塩基スタッキング、またはフーグスティーンもしくは逆フーグスティーン型の塩基対合など、モノマー間相互作用の規則的なパターンとして天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能である。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間結合は、天然に生じていてもよく、またはその類似体であってもよく、例えば天然に生じるまたは天然に生じない類似体であってもよい。天然に生じない類似体は、PNA、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合、蛍光体またはハプテンなどの標識を取着可能にする連結基を含有する塩基を含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用が、ポリメラーゼによる伸長またはリガーゼによるライゲーションなどの酵素加工を必要とするときは常に、それらの場合のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、任意のまたはいくつかの場所で、ヌクレオシド間結合、糖部分、または塩基のある特定の類似体を含有しないと考えられることを、当業者なら理解されよう。ポリヌクレオチドは、典型的にはそのサイズが、通常は「オリゴヌクレオチド」と呼ばれるときの数個のモノマー単位、例えば5〜40個から、数千個のモノマー単位に及ぶ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ATGCCTG」などの文字の配列(大文字または小文字)によって表されるときは常に、文脈から他に指示されずまたは明らかにされない限り、ヌクレオチドが左から右に5’→3’の順序にあり、「A」はデオキシアデノシンを示し、「C」はデオキシシチジンを示し、「G」はデオキシグアノシンを示し、「T」はチミジンを示し、「I」はデオキシイノシンを示し、「U」はウリジンを示すことが理解されよう。他に記述しない限り、専門用語および原子番号付けの慣習は、StrachanおよびRead、Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss、New York、1999年)に開示されたものに従うことになる。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された4つの天然のヌクレオシド(例えば、DNAに関してはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはRNAに関してはそれらのリボース対応物)を含むが、ポリヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド類似体を含んでいてもよく、例えば修飾塩基、糖、またはヌクレオシド間結合が含まれる。酵素が、活性に関して特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基材要件を有する場合、例えば一本鎖DNAまたはRNA/DNA二重鎖などを有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基材に関する適切な組成物の選択は、特にSambrookら、Molecular Cloning、第2版(Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1989年)などの学術書および同様の参考文献からの指針により、十分に当業者の範囲内にあることが、当業者に明らかである。同様にオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖形態または二本鎖形態(即ち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの二重鎖、およびそのそれぞれの相補体)のいずれかを指してもよい。用語の用法の文脈から、どの形態が意図されるのかまたは両方の形態が意図されるのか否かは、当業者には明らかであろう。
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二重鎖を形成した後に、核酸合成の開始点として作用することが可能でありかつ伸長した二重鎖が形成されるように鋳型に沿ってその3’末端から伸長することが可能である、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、DNAまたはRNAポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼにより実施される。伸長プロセスで付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーは、DNAポリメラーゼにより伸長される。プライマーは通常、14から40ヌクレオチドの範囲、または18から36ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば単一プライマーを使用する線形増幅反応、または2つまたはそれよりも多くのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に用いられる。特定の適用例に関してプライマーの長さおよび配列を選択するための指針は、参照により組み込まれる下記の参考文献:Dieffenbach編、PCR Primer: A Laboratory Manual、第2版(Cold Spring Harbor Press、New York、2003年)により明らかにされるように、当業者に周知である。
ポリヌクレオチドに関する「配列決定(sequence determination)」、「シークエンシング(sequencing)」、または「ヌクレオチド配列を決定すること(determining a nucleotide sequence)」などの用語は、ポリヌクレオチドの部分的なならびに完全な配列情報の決定を含む。即ち、この用語は、例えば標的ポリヌクレオチドのまさにAおよびCの配列など、完全集合の4つの天然ヌクレオチド、A、C、G、およびTの部分集合の配列を含む。即ち、この用語は、標的ポリヌクレオチド内の4種類のヌクレオチドの1つ、2つ、3つ、または全てのアイデンティティー、順序、および場所の決定を含む。一部の実施形態では、用語は、標的ポリヌクレオチド内の4つのタイプのヌクレオチドの2つ、3つ、または全てのアイデンティティー、順序、および場所の決定を含む。一部の実施形態では、配列決定は、その配列がバイナリーコードとして表されるように、例えば「c−(非c)(非c)c−(非c)−c...」などを表す「100101...」として表されるように、標的ポリヌクレオチド「catcgc...」内の単一タイプのヌクレオチド、例えばシトシンの順序および場所を明らかにすることによって実現されてもよい。一部の実施形態では、用語は、標的ポリヌクレオチドのフィンガープリントとしての役割をする、標的ポリヌクレオチドの配列を含んでいてもよく;即ち、一組のポリヌクレオチド内の標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスを一意的に識別する配列、例えばセルによって表される全ての異なるRNA配列を含んでいてもよい。
本開示は、記述される特定の形態の範囲に限定するものではなく、本明細書に記載される変形例の、代替例、修正例、および均等物を包含するものである。さらに、本開示の範囲は、本開示に鑑みて当業者に明らかになり得る他の変形例を完全に包含する。本発明の範囲は、添付される特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (24)
- ナノポアアレイによってポリマーの特性を分析する方法であって、
(a)ナノポアアレイを提供するステップであって、各ナノポアが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通をもたらすことが可能であり、かつそれを通して移行するポリマーの少なくとも1つの性質に関するシグナルを提供することが可能であり、前記ナノポアアレイ中の所定の割合のナノポアがポリマーを含有するステップ、
(b)前記第1のチャンバーから前記第2のチャンバーに、前記ナノポアアレイのナノポアを通してポリマーを移行させるステップ、
(c)前記移行ポリマーから順方向シグナルを検出するステップ、
(d)ポリマーの前記移行を反転させるステップ、
(e)ナノポアを通るその移行が反転したポリマーから、逆方向シグナルを検出するステップ、
(f)前記順方向および逆方向シグナルから、そのようなポリマーのそれぞれの少なくとも1つの性質を決定するステップ
を含む方法。 - 前記ステップ(b)から(e)までを繰り返す、請求項1に記載の方法。
- ポリマーを有するナノポアの前記割合が所定レベルを下回るか、または所定の反転回数に到達するかのいずれかが最初に生じるまで、前記ステップ(b)から(e)までを繰り返す、請求項2に記載の方法。
- ポリマーを有するナノポアの前記割合が、前記ナノポアアレイを通る全電流の関数として、および/または前記順方向シグナルおよび逆方向シグナルが光シグナルであるときには常に前記ナノポア内の全てのナノポアから収集された全光シグナルの関数として、決定される、請求項3に記載の方法。
- 前記ステップ(b)および(c)の持続時間が、前記ステップ(d)および(e)の持続時間に実質的に等しい、請求項2に記載の方法。
- 前記ポリマーが、それぞれが前記第1のチャンバーから前記第2のチャンバーに、前記ナノポアアレイのナノポアを通して移動することが可能になるように、自由端を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマーがポリヌクレオチドであり、前記少なくとも1つの性質がヌクレオチド配列である、請求項2に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、区別可能な光シグナルを発生させる、取着された異なる蛍光標識を有し、異なる種類のヌクレオチドが、その取着された蛍光標識からの光シグナルによって識別され得る、請求項7に記載の方法。
- 前記ナノポアを移行する前記ポリヌクレオチドが、前記第1のチャンバーおよび前記第2のチャンバー内でランダムコイルを形成する、請求項7に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも1000ヌクレオチドの長さを有する、請求項9に記載の方法。
- 前記ポリマーがポリペプチドであり、前記少なくとも1つの性質がペプチド配列である、請求項2に記載の方法。
- 前記ポリペプチドの少なくとも2つの異なる種類のアミノ酸残基が、区別可能な光シグナルを発生させる、取着された異なる蛍光標識を有し、前記異なる種類の標識アミノ酸残基は、その取着された蛍光標識からの光シグナルによって識別され得る、請求項11に記載の方法。
- ポリマーの特性を決定する方法であって、
(a)第1の面と、第2の面と、それらを通る複数のアパーチャーであって、それぞれが少なくとも1つのナノポアを含んでいる複数のアパーチャーとを有する固相膜を含むナノポアアレイを提供するステップであって、前記固相膜が、第1のチャンバーと第2のチャンバーとを切り離して、各ナノポアが前記第1のチャンバーと前記第2のチャンバーとの間に流体連通をもたらすようにし、各ナノポアが、前記固相膜の前記第2の面上に検出領域を有するステップ、
(b)前記第1のチャンバーから前記第2のチャンバーに向かって、前記ナノポアを通してポリマーを移行させるステップであって、各ポリマーは、そこに取着された、前記ポリマーの特性を示す光シグナルを発生させることが可能な1つまたは複数の光学標識を有するステップ、
(c)前記固相膜の前記第2の面を照明するステップであって、前記検出領域内の光学標識が光シグナルを発生させるようにするステップ、
(d)前記検出領域内の前記光学標識から前記ポリマーの特性を示す光シグナルを検出するステップであって、ポリマーデータを生成するステップ、
(e)前記ポリマーの前記移行を反転させるステップ、
(f)ステップ(c)および(d)を繰り返すステップであって、冗長ポリマーデータを生成するステップ、ならびに
(g)前記ポリマーデータおよび前記冗長ポリマーデータから、前記ポリマーの前記特性を決定するステップ
を含む方法。 - 前記ステップ(e)および(f)を繰り返す、請求項13に記載の方法。
- 前記ポリマーがポリヌクレオチドであり、前記少なくとも1つの性質がヌクレオチド配列である、請求項14に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、区別可能な光シグナルを発生させる、取着された異なる蛍光標識を有し、異なる種類のヌクレオチドが、その取着された蛍光標識からの光シグナルによって識別され得る、請求項15に記載の方法。
- 前記ナノポアを移行する前記ポリヌクレオチドが、前記第1のチャンバーおよび前記第2のチャンバー内でランダムコイルを形成する、請求項16に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも1000ヌクレオチドの長さを有する、請求項17に記載の方法。
- ナノポアアレイによってポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
(a)ナノポアアレイを提供するステップであって、各ナノポアが、第1のチャンバーと第2のチャンバーとの間に流体連通をもたらすことが可能であり、かつその異なる種類のヌクレオチドが、区別可能な光シグナルを発生させる、取着された異なる蛍光標識を有するポリヌクレオチドを提供することが可能であり、異なる種類のヌクレオチドが、その取着された蛍光標識からの光シグナルによって識別され得、前記ナノポアアレイ中の所定の割合のナノポアが、ポリヌクレオチドにより占有されるステップ、
(b)前記第1のチャンバーから前記前記第2のチャンバーに至る方向に、前記ナノポアアレイのナノポアを通してポリヌクレオチドを移行させるステップ、
(c)前記移行するポリヌクレオチドから順方向光シグナルを検出するステップ、
(d)前記ポリヌクレオチドの移行の前記方向を反転させるステップ、
(e)ナノポアを通るその移行が反転した前記ポリマーから、逆方向光シグナルを検出するステップ、ならびに
(f)前記順方向および逆方向シグナルから、各ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップ
を含む方法。 - 前記ステップ(b)から(e)までを繰り返すステップをさらに含む、請求項19に記載の方法。
- 前記ナノポアを移行する前記ポリヌクレオチドが、前記第1のチャンバーおよび前記第2のチャンバー内でランダムコイルを形成する、請求項20に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのそれぞれが、少なくとも1000ヌクレオチドの長さを有する、請求項21に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドを有するナノポアの前記割合が所定レベルを下回るか、または所定の反復回数に達するかのいずれかが最初に生じるまで、前記ステップ(b)から(e)までを繰り返す、請求項20に記載の方法。
- ポリヌクレオチドを有するナノポアの前記割合が、前記ナノポアアレイを通る全電流の関数および/または前記ナノポアアレイ内の全てのナノポアから収集された全光シグナルの関数として決定される、請求項23に記載の方法。
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