KR20170064540A - 합성 프로브의 나노포어 감지에 의한 표적 서열 검출 - Google Patents

합성 프로브의 나노포어 감지에 의한 표적 서열 검출 Download PDF

Info

Publication number
KR20170064540A
KR20170064540A KR1020177011263A KR20177011263A KR20170064540A KR 20170064540 A KR20170064540 A KR 20170064540A KR 1020177011263 A KR1020177011263 A KR 1020177011263A KR 20177011263 A KR20177011263 A KR 20177011263A KR 20170064540 A KR20170064540 A KR 20170064540A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
probe
polynucleotide
nanopore
molecule
dna
Prior art date
Application number
KR1020177011263A
Other languages
English (en)
Inventor
트레보 제이. 모린
다니엘 에이. 헬러
Original Assignee
투 포어 가이즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 투 포어 가이즈, 인코포레이티드 filed Critical 투 포어 가이즈, 인코포레이티드
Publication of KR20170064540A publication Critical patent/KR20170064540A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/107—Modifications characterised by incorporating a peptide nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/164—Methylation detection other then bisulfite or methylation sensitive restriction endonucleases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/631—Detection means characterised by use of a special device being a biochannel or pore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

나노포어를 사용하여 용액에서 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 특이적 서열의 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본원에서 개시된다. 일부 구체예에서, 샘플에서 폴리뉴클레오티드를 확인하거나 폴리뉴클레오티드의 표적 서열을 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본원에서 개시된다.

Description

합성 프로브의 나노포어 감지에 의한 표적 서열 검출{TARGET SEQUENCE DETECTION BY NANOPORE SENSING OF SYNTHETIC PROBES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 9월 26일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/056,378호의 이익을 주장하며, 이 개시물은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 분야
본 발명은 나노포어 디바이스를 사용하여 표적 서열을 검출하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
"표적 서열 검출"로도 불리는 핵산의 신장부 내 특이적 서열 영역의 검출, 위치 측정, 및 카피 수 결정은 의생명과학 및 기술, 의학, 농학 및 법의학, 뿐만 아니라 다른 분야에도 적용된다. 유전자 및 그것들의 변형, 서열, 위치, 또는 수의 검출은 의학에서 분자 진단의 발전에 중요하다. DNA 마이크로어레이, PCR, 서던 블롯, 및 FISH(형광 제자리 혼성화(Fluorescent in situ Hybridization))는 모두 표적 서열 검출을 수행하거나 이것을 돕는데 사용될 수 있는 방법이다. 이 방법들은 느리고 노동 집약적이며, 제한된 정확도 및 분해능을 가진다. 더 최근의 방법, 예컨대 실시간 PCR 및 차세대 시퀀싱(NGS) 기술은 처리량이 개선되었지만, 여전히 많은 적용을 위한 충분한 분해능을 갖고 있지는 않다.
고체 상태 나노포어는 포어를 가로질러 전압을 인가하고, 분자가 나노포어를 통과할 때 교류 임피던스(current impedance)를 측정함으로써 분자를 검출하는 것으로 입증되었다. 임의의 주어진 나노포어 디바이스의 전체적인 효율은 정확하고 신뢰 가능하게 교류 임피던스를 측정하고 통과하는 다른 유형의 분자들 중에서 구별하는 능력에 의존적이다. 문헌에 제시된 실험들은 포어를 통과하는 DNA 및 RNA 가닥, 및 그것들에서 특이적 서열에 혼성화되는 합성 분자 둘 다의 검출을 입증하였다. 하지만, 특이적 DNA 또는 RNA 서열에서 프로브를 검출하기 위한 고처리량 및 신뢰 가능한 나노포어 디바이스를 생성하는데 이것들을 사용할 수 없었다. 지금까지 개발된 프로브는 신뢰 가능한 서열 검출에 불충분하였다. 그러므로, 나노포어에서 검출을 위해 서열-특이적으로 결합할 수 있는 프로브 및 프로브 복합체의 세트가 필요하다.
샘플에서 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 샘플을 상기 표적 서열에 대한 상기 프로브의 결합을 촉진하는 조건 하에 상기 샘플과 상기 표적 서열을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브를 상기 표적 서열에 대한 상기 프로브의 결합을 촉진하는 조건 하에 접촉시켜서 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체를 형성하는 단계; 상기 샘플을 나노포어 디바이스의 제1 챔버에 로딩하는 단계로서, 상기 나노포어 디바이스는 적어도 하나의 나노포어 및 적어도 상기 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함하며, 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 적어도 하나의 나노포어를 통해 전기적으로 및 유체적으로 교류하고, 상기 나노포어 디바이스는 상기 적어도 하나의 나노포어 각각을 가로질러 독립적으로 제어되는 전압 및 상기 적어도 하나의 나노포어 각각에 관련된 센서를 더 포함하며, 상기 센서는 적어도 하나의 나노포어를 통해 통과하는 물체를 확인하도록 구성되고, 상기 적어도 하나의 나노포어를 통한 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 전위(translocation)는 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체와 관련된 검출 가능한 신호를 제공하는 단계; 및 상기 검출 가능한 신호를 관찰하여, 상기 표적 서열을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드를 검출함으로써 상기 샘플에서 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 상기 적어도 하나의 나노포어를 통해 전압 전위를 발생시키는 단계를 더 포함하는데, 상기 전압 전위는 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체 상에 힘을 발생시켜서 상기 적어도 하나의 나노포어를 통해 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체를 끌어당기며, 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체가 상기 적어도 하나의 나노포어를 통해 전위되어 상기 검출 가능한 신호를 발생시키게 한다.
일부 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이다. 한 구체예에서, 상기 검출 가능한 신호는 전기 신호이다. 한 구체예에서, 상기 검출 가능한 신호는 광신호이다. 한 구체예에서, 상기 프로브는 단백질, 펩티드, 핵산, TALEN, CRISPR, 펩티드 핵산, 또는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로브는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩티드 핵산(PNA), DNA/RNA 하이브리드(hybrid), 폴리펩티드, 또는 임의의 화학적으로 유도된 폴리머로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 프로브는 상기 적어도 하나의 나노포어를 통한 전위 중에 상기 폴리뉴클레오티드에 결합된 프로브의 검출을 용이하게 하도록 구성된 제2 분자에 결합된 PNA 분자를 포함한다. 추가의 구체예에서, 상기 제2 분자는 PEG이다. 추가의 구체예에서, 상기 PEG는 적어도 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6kDa, 7kDa, 8kDa, 9kDa, 또는 10kDa의 분자량을 가진다.
한 구체예에서, 샘플에서 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 상기 방법은 상기 샘플에 프로브와 표적 서열 간의 결합 상호작용을 변화시키는 것으로 의심되는 조건을 적용하는 단계를 더 포함한다. 추가의 구체예에서, 상기 조건은 샘플에서 프로브의 제거, 표적 서열에의 결합에 대하여 프로브와 경쟁하는 작용제의 첨가, 및 초기 pH, 염, 또는 온도 조건의 변화로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프로브에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합을 변형시키도록 구성된 화학적 변형을 포함한다. 추가의 구체예에서, 상기 화학적 변형은 비오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 서몰레이션(summolation), 글리코실화, 인산화 및 산화로 구성된 군으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 상기 프로브는 절단 가능한 결합을 통해 프로브에 커플링된 화학적 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 프로브는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 금속 결합, 반 데르 발스 힘(van der Waals force), 소수성 상호작용, 또는 평면 스태킹 상호작용(planar stacking interaction)을 통해 폴리뉴클레오티드의 표적 서열과 상호작용한다. 한 구체예에서, 샘플에서 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 상기 방법은 샘플을 프로브 또는 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 검출 가능한 라벨과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 두 개의 표적 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 상기 나노포어는 직경이 약 1 nm 내지 약 100 nm이고, 길이가 1 nm 내지 약 100 nm이며, 각각의 챔버는 전극을 포함한다. 한 구체예에서, 상기 나노포어 디바이스는 두 개의 나노포어에서 상기 폴리뉴클레오티드의 이동을 동시에 제어하도록 구성된 적어도 두 개의 나노포어를 포함한다. 한 구체예에서, 샘플에서 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 상기 방법은 프로브-결합부가 나노포어를 통해 통과한 후 나노포어를 통한 상기 폴리뉴클레오티드의 이동이 반전되도록, 상기 검출 가능한 신호에 의한 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 초기 검출 이후 상기 독립적으로 제어되는 전압을 반전시키며, 이로써 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 존재 또는 부재를 다시 확인하는 단계를 더 포함한다.
한 구체예에서, 상기 나노포어 디바이스는 두 개의 나노포어를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 두 개의 나노포어 둘 다에 동시에 위치한다. 추가의 구체예에서, 샘플에서 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 상기 방법은 나노포어를 통해 폴리뉴클레오티드의 전위의 속도를 제어하기 위해 나노포어에 의해 반대 힘이 발생되도록 상기 두 개의 나노포어 각각에서 전압의 크기 및/또는 방향을 조정하는 단계를 포함한다.
또한, 샘플에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법이 본원에서 제공되며, 상기 샘플을 제1 프로브 및 제2 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 프로브는 상기 제1 표적 서열에 대한 상기 제1 프로브의 결합을 촉진하는 조건 하에 상기 폴리뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 프로브는 상기 제2 표적 서열에 대한 상기 제2 프로브의 결합을 촉진하는 조건 하에 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 특이적으로 결합하는 단계; 상기 샘플을 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브에 대한 상기 제3 분자의 결합을 촉진하는 조건 하에 상기 제1 및 제2 프로브가 서로 충분히 근접해있을 때 상기 제1 및 제2 프로브에 동시에 결합하도록 구성되는 제3 분자와 접촉시키며, 이로써 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 제1 프로브, 상기 제2 프로브, 및 상기 제3 분자를 포함하는 융합 복합체를 형성하는 단계; 상기 샘플을 나노포어 디바이스의 제1 챔버에 로딩하는 단계로서, 상기 나노포어 디바이스는 적어도 하나의 나노포어 및 적어도 상기 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함하며, 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 적어도 하나의 나노포어를 통해 전기적으로 및 유체적으로 교류하고, 나노포어 디바이스는 상기 적어도 하나의 나노포어 각각을 가로질러 제어되는 전압 전위 및 상기 적어도 하나의 나노포어 각각에 관련된 센서를 더 포함하며, 상기 센서는 적어도 하나의 나노포어를 통해 통과하는 물체를 확인하도록 구성되고, 상기 적어도 하나의 나노포어를 통한 상기 융합 복합체 전위는 상기 융합 복합체와 관련된 검출 가능한 신호를 제공하는 단계; 및 상기 검출 가능한 신호를 관찰하여 상기 샘플에서 상기 융합 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA이다. 한 구체예에서, 상기 검출 가능한 신호는 전기 신호이다. 한 구체예에서, 상기 검출 가능한 신호는 광신호이다. 한 구체예에서, 상기 충분한 근접함은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개 미만의 뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 상기 제3 분자는 PEG 또는 항체를 포함한다.
한 구체예에서, 상기 제3 분자 및 상기 제1 및 제2 프로브는 ssDNA에 결합되고, 상기 제3 분자에 연결된 상기 ssDNA는 상기 제1 프로브에 연결된 ssDNA의 영역에 상보적인 영역을 포함하고 상기 제2 프로브에 연결된 ssDNA의 영역에 상보적이다. 한 구체예에서, 샘플에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법은 샘플을 제3 분자 또는 융합 복합체에 결합할 수 있는 하나 이상의 검출 가능한 라벨과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
또한 제1 프로브, 제2 프로브, 및 제3 분자를 포함하는 키트가 본원에서 제공되는데, 제1 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드 상의 제1 표적 서열에 결합하도록 구성되고, 제2 프로브는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 상의 제2 표적 서열에 결합하도록 구성되며, 상기 제3 분자는 상기 제1 및 제2 프로브가 상기 제1 및 제2 표적 서열에서 상기 폴리뉴클레오티드에 결합될 때 제1 프로브 및 제2 프로브에 결합하도록 구성되며, 이로써 상기 제1 및 제2 프로브에 대한 상기 제3 분자의 동시 결합을 허용하기에 충분히 근접하게 제1 및 제2 프로브를 위치시킨다.
한 구체예에서, 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브는 단백질, 펩티드, 핵산, TALEN, CRISPR, 펩티드 핵산, 또는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 상기 제3 분자는 PEG 또는 항체를 포함한다. 한 구체예에서, 상기 제3 분자는 상기 프로브에 대한 결합 친화도를 변형시키기 위한 변형을 포함한다.
또한 적어도 두 개의 챔버 및 나노포어를 포함하는 나노포어 디바이스가 본원에서 제공되는데, 상기 디바이스는 상기 나노포어 내에 폴리뉴클레오티드에 결합된 변형된 PNA 프로브를 포함한다.
또한, 두 개의 포어를 통해 대전된 폴리머를 검출하기 위한 이중-포어, 이중-증폭기 디바이스가 본원에서 제공되는데, 디바이스는 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하며, 제1 포어는 상부 챔버 및 중간 챔버를 연결하고, 제2 포어는 중간 챔버 및 하부 챔버를 연결하며, 상기 디바이스는 상기 제1 또는 제2 포어 내 폴리뉴클레오티드에 결합된 변형된 PNA 프로브를 포함한다.
한 구체예에서, 디바이스는 상기 제1 포어 및 상기 제2 포어 둘 다를 통해 상기 대전된 폴리머의 이동을 동시에 제어하도록 구성된다. 한 구체예에서, 변형된 PNA 프로브는 적어도 하나의 PEG 분자에 결합된다. 한 구체예에서, 디바이스는 상부 챔버 및 중간 챔버 사이에서 제1 전압을 제공하고, 중간 챔버 및 하부 챔버 사이에서 제2 전압을 제공하도록 구성된 전력 공급장치를 더 포함하는데, 각각의 전압은 독립적으로 조정 가능하고, 중간 챔버는 두 개의 전압에 대하여 공통 접지에 연결되며, 디바이스는 각각의 포어에서 독립적인 전압 제어 및 전류 측정을 위해 구성된 이중-증폭기 전자장치를 제공하고, 두 개의 전압은 크기가 다를 수도 있으며, 제1 및 제2 포어는 대전된 폴리머가 양 방향으로 및 제어된 방식으로 두 개의 포어를 가로질러 동시에 이동할 수 있도록 구성된다.
제한이 아니라, 단지 예시로 도시되는 도면이 본 개시물의 구체예로서 제공된다.
도 1은 본원에서 개시된 방법의 한 구체예로서 나노포어에서 쌍으로 변형된 프로브에 결합된 표적 분자의 검출을 도시한다.
도 2는 복합체가 나노포어를 통해 전위할 때 생성된 전기 신호에 대하여 표적 분자에 대한 프로브 결합의 효과를 나타낸다.
도 3A 및 도 3B 각각은 각각의 표적 서열에서 폴리뉴클레오티드에 결합된 두 개의 프로브, 및 두 개의 프로브가 스캐폴드(scaffold)에 결합될 때 나노포어에서 프로브 검출을 용이하게 하기 위한 제3 브리징(bridging) 분자(예를 들어, 항체)를 이용한 구체예를 나타낸다.
도 4는 각각의 표적 서열에서 폴리뉴클레오티드에 결합된 두 개의 프로브를 나타내며, 제3 브리징 분자는 PEG이고 두 개의 프로브가 스캐폴드에 충분히 근접하게 결합될 때 프로브 검출을 가능하게 하도록 상보적 ssDNA 링커를 통해 프로브에 부착된다.
도 5는 근접함으로 인해, 예를 들어, 포스터 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 생성된 광신호를 검출할 정도로 충분히 근접하게 각각의 표적 서열의 폴리뉴클레오티드에 결합된 두 개의 프로브를 나타낸다.
도 6A는 형광단 변형된 결합제의 검출을 가능하게 하도록 나노포어 디바이스와 에피형광 현미경(epifluorescence microscope)을 조합한 시스템의 개략도이다. 도 6B는 형광단이 평면 내 두 개의 나노포어 디바이스를 통과할 때 검출기를 통해 보이는 삽도이다. 도 6C는 스캐폴드가 나노포어를 통과할 때 전류 진폭 및 상응하는 형광 신호의 변화를 나타낸다.
도 7은 검출을 돕기 위해, 절단 가능한 기(예를 들어, 형광단)를 가지는 프로브의 결합을 나타낸다.
도 8은 표적 함유 분자에서 독특한 표적 서열에 각각 결합하는, 다른 크기의 프로브를 포함함으로써 본 기술의 다중 능력을 나타낸다. 이 삽도에서, 이중-가닥 DNA는 표적 서열 및 검출되길 바라는 표적 서열에 결합하는 다수의 다른 DNA 결합 프로브를 가진 폴리뉴클레오티드이다.
도 9A는 리간드 전하를 증가시켜서 나노포어에 의한 검출을 용이하게 하도록 변형된 PNA 리간드를 나타낸다. 도 9B는 이중-가닥 DNA가 표적 함유 폴리머 및 검출되길 바라는 표적 서열에 결합하는 다수의 다른 DNA 결합 프로브로서 사용된 예를 나타낸다.
도 10은 다중화된 검출을 허용하기 위해 나노포어를 가로질러 통과할 때 DNA에 결합된 다수의 별개의 서열-특이적 프로브를 나타낸다.
도 11A-C는 나노포어 및 나노포어를 통한 분자의 전위의 대표적인 전류 시그니처 및 집단을 나타낸다. 도 11A에서, 고체 상태 포어 및 전압 경로가 나타난다. 도 11B는 나노포어를 통과하는 분자의 전류 차단 및 체류 시간을 나타낸다. 도 11C는 체류 시간 및 평균 전류 진폭을 기반으로 하여 나노포어를 통과하는 분자의 특징적인 집단을 나타낸다.
도 12A는 DNA 스캐폴드에서 서열의 검출을 허용하도록 더 큰 뉴트라비딘 분자와 복합체를 형성하는 비오틴에 결합된 PNA 프로브의 사용의 예를 나타낸다. 도 12B는 DNA 스캐폴드에서 PNA 프로브에 대한 결합 부위를 나타낸다.
도 13는 미결합 DNA, 유리 뉴트라비딘, 및 DNA 및 뉴트라비딘에 결합되어 복합체를 형성한 PNA-비오틴의 전위를 나타낸다. 분자가 각각의 복합체에 대하여 인가된 전압 하에 나노포어를 통해 전위할 때 얻어진 전류 시그니처(y축 전류, x축 시간)가 또한 나타난다.
DNA/PNA/뉴트라비딘 복합체는 다른 백그라운드 이벤트 유형(예를 들어, 미결합 DNA 단독, 및 뉴트라비딘 단독)보다 검출 가능성이 크고, DNA 이벤트에 결합된 검출 가능한 PNA 프로브(즉 DNA/PNA/뉴트라비딘 복합체)로서 태그될 수 있는 전위 전류 시그니처를 유발한다.
도 14A는 세 개의 집단, DNA 단독(x), 뉴트라비딘 단독(사각형), 및 뉴트라비딘에 부착된 비오틴 프로브와 복합체를 형성한 DNA(원)에서 나노포어를 통한 전위로 인한 기간 및 평균 전도도 이동을 특징으로 하는 이벤트의 산점도를 나타낸다. 도 14B는 상기 기술된 세 개의 집단 각각에 관련된 체류 시간 확률의 히스토그램을 나타낸다. 도 14C는 DNA 단독(레인 2), DNA, 뉴트라비딘에 결합하기 위한 3개의 비오틴 부위를 가진 PNA, 및 뉴트라비딘을 포함하는 샘플(레인 3), DNA, 뉴트라비딘에 결합하기 위한 7개의 비오틴 부위를 가진 PNA, 및 뉴트라비딘을 포함하는 샘플(레인 3), DNA, 뉴트라비딘에 결합하기 위한 16개의 비오틴 부위를 가진 PNA, 및 뉴트라비딘을 포함하는 샘플(레인 3), 및 DNA, 뉴트라비딘에 결합하기 위한 36개의 비오틴 부위를 가진 PNA, 및 뉴트라비딘을 포함하는 샘플(레인 3)의 겔 이동 검정을 나타낸다.
도 15는 DNA 스캐폴드 상의 프로브 결합 부위의 도표를 나타내는데, 여기서 프로브는 VspR 단백질이다.
도 16A는 나노포어를 통과하는 미결합 DNA 분자, 및 나노포어를 통과하는 단일 분자와 관련된 대표적인 전류 시그니처의 다이어그램을 나타낸다. 도 16B는 나노포어를 통과하는 VspR-결합된 DNA 분자, 및 그것의 나노포어 통과와 관련된 대표적인 전류 시그니처를 나타낸다.
도 17은 포어를 통과하는 VspR-결합된 스캐폴드와 일치하는 10개 이상의 대표적인 전류 감쇠 이벤트를 나타낸다.
도 18A는 dsDNA 분자에서 표적 서열에 결합된 PNA-PEG 프로브를 나타낸다. 도 18B는 다음과 같은 샘플을 이용한 겔 이동 검정의 결과를 나타낸다: DNA 단독(레인 1), DNA/PNA(레인 2), DNA/PNA-PEG(10kDa)(레인 3), 및 DNA/PNA-PEG(20kDa)(레인 4). 도 18C는 다음과 같은 샘플을 이용한 겔 이동 검정의 결과를 나타낸다: DNA 마커(레인 1), PNA 프로브와 함께 인큐베이션된 랜덤 DNA 서열(레인 2), 해당 PNA 프로브와 함께 인큐베이션된 표적 서열에서 단일 미스매치를 가진 DNA(레인 3), 및 표적 서열에 특이적인 해당 PNA 프로브와 혼합된 표적 서열을 가진 DNA(레인 4).
도 19A는 아래 도시된 분자로서 각각의 전류 시그니처가 인가된 전압 하에 나노포어를 통해 전위하는 대표적인 전류 시그니처 이벤트를 나타낸다. 도 19B는 세 개의 집단, DNA/bisPNA(사각형), DNA/bisPNA-PEG 5kDa(원), 및 DNA/bisPNA-PEG 10kDa(다이아몬드)에서 나노포어를 통한 전위로 인해 기간 및 평균 전도도 이동을 특징으로 하는 이벤트의 산점도를 나타낸다. 도 19C는 상기 기술된 세 개의 집단 각각에 관련된 평균 전도도 이동 확률의 히스토그램을 나타낸다. 도 19D는 상기 기술된 세 개의 집단 각각에 관련된 이벤트 기간 확률의 히스토그램을 나타낸다.
도 20A는 DNA 분자에 결합된 PNA-PEG 프로브의 전위와 관련된 대표적인 이벤트 시그니처를 나타낸다. 도 20B는 박테리아 DNA 및 PNA-PEG 프로브를 포함하는 샘플의 나노포어에서 각각 기록된 이벤트에 대한 평균 전도도 이동 대 기간 플롯을 나타낸다. 도 20C 및 도 20D는 각각의 이벤트의 평균 전도도 이동 및 기간에 의해 검출된 이들 이벤트를 특성화하기 위해 해당하는 히스토그램을 나타낸다. 도 20E는 다음과 같은 겔 이동 검정의 결과를 나타낸다: 100bp 래더(레인 1), PNA-PEG 프로브와 함께 인큐베이션된 야생형 cftr 서열을 가진 300 bp DNA(레인 2), 및 PNA-PEG 프로브와 함께 인큐베이션된 cftr ΔF508 서열을 가진 300bp DNA(레인 3).
도 21A는 겔 이동 검정의 결과를 나타내는데, 레인 1은 bisPNA-PEG가 결합되지 않은 S. mitis 박테리아 DNA를 포함하고, 레인 2는 부위-특이적 bisPNA-PEG가 결합된 S. mitis DNA를 포함한다. 도 21B는 연이은 두 번의 실험에서 기록된 모든 이벤트에 대하여 세로축 상의 평균 전도도 이동(dG) 대 가로축 상의 기간의 산점도를 나타낸다. 제1 샘플은 PEG-변형된 PNA 프로브를 가진 박테리아 DNA(DNA/bisPNA-PEG)를 포함하였다. 제2 샘플은 박테리아 DNA 단독을 포함하였다.
일부 또는 모든 도면은 예시를 위한 개략도이며; 따라서, 그것들이 반드시 도시된 요소들의 실제 상대적 크기 또는 위치를 도시하는 것은 아니다. 도면은 하기 청구범위의 범위 또는 의미를 제한하지 않으면서, 명백한 이해를 가진 하나 이상의 구체예를 예시할 목적으로 제공된다.
이 출원 전반에 걸쳐, 본 명세서는 본 영양소, 조성물, 및 방법의 다양한 구체예를 나타낸다. 기술된 다양한 구체예는 다양한 예시적 실시예를 제공하는 것을 의미하며 대안의 종에 대한 설명으로 해석되어서는 안 된다. 오히려 본원에서 제공된 다양한 구체예의 설명은 범위가 중복될 수 있음을 알아야 한다. 본원에서 논의된 구체예는 단지 예시일 뿐이며 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
또한, 본 개시물 전반에 걸쳐, 다양한 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서는 확인 인용에 의해 참조된다. 이 간행물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 개시물은 본 발명이 적용되는 기술의 상태를 더 충분히 기술하기 위해 본 개시물에 참고로 포함된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 단수형 "한", "하나" 및 "그"는 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "전극"은 복수의 전극을 포함하며, 그 혼합물을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "포함하는"은 디바이스 및 방법이 인용된 구성요소 또는 단계를 포함하지만, 다른 것들을 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. "본질적으로 구성되는"은 디바이스 및 방법을 한정하도록 사용될 때 조합에 대하여 임의의 본질적인 중요성을 가지는 다른 구성요소 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. "구성되는"은 다른 구성요소 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. 이 전환 용어들 각각에 의해 한정되는 구체예들은 본 발명의 범위 내에 있다.
범위를 포함하는, 모든 수 명칭, 예를 들어, 거리, 크기, 온도, 시간, 전압 및 농도는, 파라미터의 측정에서 통상적인 실험적 변화를 포함하도록 의도되는 근사치이며, 상기 변화는 기술된 구체예의 범위 내에 있도록 의도된다. 항상 명확하게 진술되는 것은 아니지만, 모든 수 명칭은 용어 "약"에 의해 선행되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 항상 명확하게 진술되는 것은 아니지만, 본원에서 기술된 구성요소는 단지 예시일 뿐이고 이러한 것들의 균등물이 업계에 공지되어 있는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "나노포어"(또는, "포어")는 본원에서 사용된 바와 같이 두 개의 부피를 분리하는 막의 단일 나노-스케일 개구부를 말한다. 포어는, 예를 들어, 지질 이중층 막에 삽입된 단백질 채널일 수 있거나, 또는 드릴링(drilling), 에칭(etching)에 의해 또는 얇은 고체 상태 기판, 예컨대 질화규소(silicon nitride) 또는 이산화규소(silicon dioxide) 또는 그래핀 또는 이들 또는 다른 물질들의 조합 층을 통한 전압-펄스 방법을 사용하여 조작될 수 있다. 기하학적으로는, 포어의 직경은 0.1nm 내지 1 마이크론(micron)의 크기이며; 포어의 길이는 막 두께에 의해 결정되며, 이 막 두께는 나노미터 미만, 또는 최대 1 마이크론 이상일 수 있다. 수백 나노미터보다 더 두꺼운 막에 대하여, 나노포어는 "나노 채널"이라고 불릴 수도 있다.
본원에서 사용된, 용어 "나노포어 기구"는 하나 이상의 나노포어와 단일 분자 이벤트를 감지하기 위한 회로가 (병렬로 또는 직렬로) 조합된 디바이스를 말한다. 구체적으로는, 나노포어 기구는 민감성 전압-클램프 증폭기를 사용하여 포어를 통해 전류를 측정하면서 포어 또는 포어들을 가로질러 특정 전압을 인가한다. 단일 대전된 분자, 예컨대 이중-가닥 DNA(dsDNA)가 전기영동에 의해 포어를 통해 캡쳐되고 구동된 경우, 측정된 전류는 시프트하며, 이는 캡쳐 이벤트(즉, 나노포어를 통한 분자의 전위, 또는 나노포어에서 분자의 캡쳐), 및 이벤트의 시프트량(전류 진폭) 및 기간이 나노포어에서 캡쳐된 분자를 특성화하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 실험 중에 많은 이벤트를 기록한 후, 이벤트 분포를 분석하여 시프트량(즉, 전류 시그니처)에 따라 해당하는 분자를 특성화한다. 따라서, 나노포어는 생체 분자를 감지하기 위한 단순하고, 라벨이 필요 없으며, 순수하게 전기적인 단일 분자 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이벤트"는 나노포어를 통해 검출 가능한 분자 또는 분자 복합체의 전위 및 그것과 관련된 측정을 말한다. 이벤트는 전류, 기간, 및/또는 나노포어에서 분자의 검출의 다른 특성에 의해 한정될 수 있다. 유사한 특성을 가진 복수의 이벤트는 동일하거나 유사한 특성(예를 들어, 벌크, 전하)을 가진 분자 또는 복합체의 집단을 나타낸다.
분자적 검출
본 개시물은 분자의 검출 및 정량을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 또한, 본 방법 및 시스템은 표적 분자에 결합하는 프로브의 친화도를 측정하도록 구성될 수 있다. 또한, 이러한 검출, 정량, 및 측정은 다중화된 방식으로 수행될 수 있으며, 이는 효율을 크게 증가시킨다.
도 1은 개시된 방법 및 시스템의 한 구체예의 예시를 제공한다. 더 구체적으로는, 본 시스템은 검출되거나 정량화되기를 바라는 표적 모티프(101)를 함유하는 표적 함유 분자(102)를 포함한다. 프로브(103)는 표적 함유 분자(102) 상의 특이적 결합 모티프(101)에 결합할 수 있다. 표적 함유 폴리뉴클레오티드 상에 존재하는 프로브(107)의 검출을 돕기 위해 별도의 분자가 추가될 수 있다.
그러므로, 모두 용액에 존재하는 경우, 프로브(103)는 표적 모티프(101)에 대한 프로브의 특이적 인식을 통해 표적 모티프에 결합한다. 이러한 결합은 프로브 및 표적 서열을 포함하는 복합체의 형성을 유발한다.
형성된 복합체(101/103 또는 101/103/107)는 디바이스의 내부 공간을 3개의 부피로 분리하는 두 개의 포어(105 및 106), 및 포어를 통과하는 물체를 확인하도록 구성된 포어에 인접한 센서를 포함하는 디바이스(104)에 의해 검출될 수 있다. 이 구체예는 직렬로 두 개의 나노포어를 구비한 이중 나노포어 디바이스이다. 일부 구체예에서, 나노포어 디바이스는 나노포어를 가로질러 전류 흐름을 측정하기 위한 회로와 함께 나노포어를 가로질러 제어된 전압(일부 구체예에서, 이 전압은 독립적으로 제어되고 클램핑될 수 있다)을 전달하기 위한 전자적 구성요소를 포함한다. 전압은 제어된 방식으로 폴리뉴클레오티드를 포어를 가로질러 한 부피에서 다른 부피로 이동시키도록 조정될 수 있다. 폴리핵산은 대전되거나 전하를 함유하도록 변형되고, 포어를 가로질러 인가된 전위 또는 전압 차동은 전압 필드(voltage field)에 노출된 대전된 분자에서 정전기력의 인가를 통해 대전된 스캐폴드의 이동을 용이하게하고 제어한다. 도 1은 이중 나노포어 디바이스를 나타내지만, 상기 기술된 원칙들은 단일 나노포어 디바이스를 사용하는 본 발명의 다른 구체예에도 적용될 수 있다. 별도로 명시되지 않는 한, 포어 또는 나노포어 또는 나노포어 디바이스에 대한 참고자료는 본 발명의 사상 내에서 단일, 이중 또는 다중-포어 디바이스를 포함하는 것으로 의도된다.
형성된 복합체를 포함하는 샘플이 나노포어에 로딩될 때, 나노포어는 표적 함유 분자가 포어를 통과하도록 구성될 수 있다. 표적 모티프가 포어 내에 있거나 또는 포어에 인접할 때, 표적 모티프의 결합 상태는 센서에 의해 검출될 수 있다.
표적 모티프의 "결합 상태"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 결합 모티프가 프로브에 의해 점유되는지를 말한다. 본질적으로, 결합 상태는 결합되거나 결합되지 않은 상태이다. 또한, (i) 표적 모티프는 유리되고 프로브에 결합되지 않거나(도 2에서 201 및 204 참조), (ii) 표적 모티프는 프로브에 결합된다(도 2에서 202 및 205 참조). 추가적으로, 다른 크기의 프로브 또는 다른 프로브 결합 부위를 가진 프로브는 하나 이상의 표적 서열이 하나의 표적 함유 분자에서 검출될 수 있도록 추가적인 전류 프로파일(예를 들어, 도 2에서 203 및 206 참조)을 제공하는데 사용될 수 있다.
표적 모티프의 결합 상태의 검출은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 한 양태에서, 각각의 상태의(즉, 점유되거나 점유되지 않는) 표적 모티프의 다른 크기에 의해, 표적 모티프가 포어를 통과할 때, 다른 크기는 포어를 가로질러 다른 전류를 발생시킨다. 이 점에 있어서, 전력원에 연결되어 전류를 검출할 수 있는 전극이 감지 기능을 제공할 수 있기 때문에, 별도의 센서가 검출에 필요하지 않다. 그러므로, 두 개의 전극이 "센서"의 역할을 할 수 있다.
일부 양태에서, 작용제(예를 들어, 도 1에서 107)가 검출을 부가하기 위해 복합체에 추가된다. 이 작용제는 프로브 또는 폴리뉴클레오티드/프로브 복합체에 결합할 수 있다. 한 양태에서, 작용제는 검출을 용이하게 하기 위해, 음전하이든 양전하이든, 전하를 포함한다. 또 다른 양태에서, 작용제는 검출을 용이하게 하기 위해 크기를 부가한다. 또 다른 양태에서, 작용제는 검출 가능한 라벨, 예컨대 형광단을 포함한다.
이러한 맥락에서, 결합된 상태(ii)의 확인은 표적 함유 분자 내 표적 서열이 프로브와 복합체를 형성한다는 것을 나타낸다. 다시 말하면, 표적 서열이 검출된다.
또 다른 구체예에서, 결합된 분자는 임피던스 변화에 의해 결합된 분자를 개별적으로 검출하기 위해서 이격되어 있으며, 각각의 결합된 분자는 인근의 결합된 분자에 의해 마스킹되지 않는 임피던스 값을 제공한다.
한 구체예에서, 결합된 프로브는 적어도 1 nm의 거리만큼(즉, 핵산-기반 폴리뉴클레오티드에 대하여 대략 3 bp) 떨어져 있다. 또 다른 구체예에서, 결합된 프로브는 적어도 10 nm의 거리만큼(즉, 핵산-기반 폴리뉴클레오티드에 대하여 대략 33 bp) 떨어져 있다. 또 다른 구체예에서, 결합된 프로브는 적어도 100 nm의 거리만큼(즉, 핵산-기반 폴리뉴클레오티드에 대하여 대략 333 bp) 떨어져 있다. 또 다른 구체예에서, 결합된 프로브는 적어도 500 nm의 거리만큼(즉, 핵산-기반 폴리뉴클레오티드에 대하여 대략 1666 bp) 떨어져 있다.
일부 양태에서, 상기 방법은 폴리뉴클레오티드에 결합되면 서로 충분히 가까운 경우에, 제3 분자에 결합할 수 있는 두 개의 독립적인 프로브를 가지는 단계를 더 포함한다. 이 제3 분자의 결합은 다른 전위 전류 시그니처를 제공하므로, 이는 두 개의 독립적인 프로브가 아주 근접하다는 증거를 제공한다.
프로브가 아주 가까이에서 결합하는지를 결정하는 메커니즘은 본 발명자들이 단일 염기쌍 미스매치를 구별할 수 있고, 단일 뉴클레오티드 다형성(또는 단일 뉴클레오티드 돌연변이)를 가진 대립유전자, 및 더 긴 프로브를 검출할 수 있게 하여 게놈에서 독특한 위치를 확립하기 위한 마커로서 작용하는 짧은 프로브를 사용할 수 있게 한다. 한 구체예에서, 본 발명자들은 특정 서열이 특정 표적 유전자와 관련되어 있는지를 결정하기 위해서 조합된 두 개의 프로브를 사용한다. 또 다른 구체예에서, 이 방법은 게놈의 영역에 대한 마커로서 프로브를 사용함으로써 구조적 재배열을 결정하는데 사용된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명자들은 특정 서열이 화학적으로(후생유전학적으로, 예를 들어 메틸화, 하이드록시메틸화) 변형되고 특정 표적 유전자와 관련되어 있는지를 결정하기 위해 조합된 두 개의 프로브를 사용한다.
한 구체예에서, 제3 분자는 적어도 두 개의 프로브가 폴리뉴클레오티드(304)에 결합되고 서로 상당히 가까운 경우(0.01 nm - 50 nm) 단지 프로브(305 및 306)에만 결합하는 항체이다(도 3A). 또 다른 구체예에서, 항체(301)에 대한 에피토프의 절반은 각각의 프로브 분자(302 및 303)에 연결되어(공유 결합에 의한 부착, 이온성, H-결합, 등을 통해) 항체 결합이 매우 근접하게 위치한 두 개의 에피토프에 의존적이게 되며, 이는 프로브가 서로 충분히 가깝다는 것을 나타낸다(도 3B). 한 구체예에서, 각각의 프로브는 PNA 분자이고, 각각의 PNA 분자는 항체에 대한 결합 에피토프의 세그먼트를 포함하거나 이것에 부착된다(공유 결합에 의한 부착, 이온성, H-결합, 등). 이 구체예에서, 부분적 에피토프는 폴리뉴클레오티드와 복합체를 형성하도록 항체가 결합하기에 충분히 가까이에 있어야 한다.
또 다른 구체예에서, PEG 분자(310)는 제3 분자로서 매우 근접하게 두 개의 프로브(302 및 303)에 결합하는데 사용되고 폴리뉴클레오티드(304)에 결합된다. 일부 구체예에서, PEG는 충분한 벌크, 전하, 또는 존재할 때 독특한 시그니처를 허용하는 다른 특징들을 제공하도록 변형된다(도 4). 일부 구체예에서, PEG는 매우 근접한 프로브에 대한 결합 친화도를 증가시키도록 변형된다. PEG 상에서 이 결합 변형은, 예를 들어, PEG의 각각의 단부에서 각각의 프로브에 부착된 유리 단일-가닥 DNA(ssDNA)와 상보적인 ssDNA 분자일 수 있다. 한 구체예에서, 프로브에의 PEG 결합에 필요한 에너지 장벽은 두 개의 ssDNA 올리고가 프로브에 부착된 그것들의 상보적 서열에 결합될 때만 충족된다(도 4). 따라서, PEG가 걸쳐있는 거리에 있는 프로브는 PEG/프로브/폴리뉴클레오티드 복합체의 검출을 통해 나노포어에서 검출되는 반면, 멀리 떨어져 있는 것들은 그렇지 않다. 당업자는 ssDNA가 합성 핵산 유사체, 예컨대 PNA로 또는 RNA에 의해 치환될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
일부 양태에서, 두 개의 독립적인 프로브는 그것들이 매우 가까이에서 폴리뉴클레오티드에 결합되면 검출을 허용하도록 변형된다. 한 구체예에서, 프로브에 대한 변형은 단일 프로브/폴리뉴클레오티드 복합체가 제2 프로브에 매우 근접하지 않으면서 나노포어를 통과할 때 전류 시그니처로부터 구별되는 바와 같이, 프로브가 매우 가까이에서 폴리뉴클레오티드에 결합되어 나노포어를 통과할 때 전류 시그니처를 변화시키기 위한 프로브의 이온 변화를 포함한다. 한 구체예에서, 두 개의 프로브에 양전하를 추가하는 것은(예를 들어, 2-하이드록시에틸티오설포네이트(MTSET)로 프로브를 라벨링함으로써) 멀리 떨어져 있는 폴리뉴클레오티드에 결합하는 것과는 달리, 두 개의 프로브가 폴리뉴클레오티드를 따라 공간적으로 충분히 가깝고 전하의 효과가 부가될 때 다른 전위 전류 시그니처를 제공한다.
일부 양태에서, 본 방법은 표적 집단에서 단 하나의 독특한 서열에 대한 결합을 가능하게 하도록 충분히 길지만, 단일 염기쌍 미스매치만이 존재하는 경우 표적 부위에 결합하지 않는 능력을 갖는 프로브를 사용하는 단계를 더 포함한다. 이는 PNA 프로브를 사용할 때 가능하다. 문헌(Strand-Invasion of Extended, Mixed-Sequence B-DNA by γPNAs, G. He, D. Ly et. al., J Am Chem Soc. 2009 September 2; 131(34): 12088-12090. doi:10.1021/ja900228j)에 제시된 바와 같이, 20 bp 감마-PNA 프로브는 완전히 일치된 표적 서열에 효율적으로 결합할 수 있지만, 표적 서열 및 프로브 서열이 단 하나의 염기라도 다를 때는 결합이 폐지된다. 31억 개의 염기를 함유하는 인간 게놈을 고려할 때, 20개의 염기쌍 서열은 무작위로 0.003회 발생할 가능성이 있다. 따라서, 조사 중인 특이적 서열에 결합하도록 설계된 20개의 염기쌍 프로브는 원치 않는 위치에 결합하여 위양성(false positive)을 제공할 가능성이 매우 낮다. 도 19C 및 21 내에 함유된 예들은 PNA 및 PNA-PEG 프로브가 단지 상보적 서열에만 선택적으로 결합한다는 것을 보여준다.
일부 양태에서, 본 방법은 두 개의 프로브가 충분히 가까이에서 폴리뉴클레오티드에 부착될 때 검출 가능한 신호를 방출하는 요소들을 포함하는 두 개의 독립적인 프로브를 가지는 단계를 더 포함한다. 한 구체예에서, 각각의 프로브는 형광단으로 라벨링된다(예를 들어, 도 5(315, 316) 참조). 방출 스펙트럼은 프로브가 검출 가능한 신호를 발생시킬 정도로 충분히 가까이에 있을 때 검출기(317)에 의해 검출된다. 한 구체예에서, 두 개의 프로브는 다른 색깔의 형광단으로 라벨링된다. 프로브가 가까이에 있을 때, 외부 센서, 예컨대 카메라 또는 현미경으로 검출될 수 있는 색깔이 함께 이미화될 것이며(또는 블렌딩되어 새로운 색깔을 제공할 것이다), 이는 두 개의 프로브가 공간적으로 가깝다는 증거가 된다. 관련된 구체예에서, FRET (또는 BRET) 유형 검출을 사용하여, 예를 들어 가까이에 있을 때 하나의 형광 라벨링된 프로브가 다른 하나의 에너지 방출 스펙트럼에 영향을 미칠 정도로 두 개의 프로브가 근접했는지를 결정한다.
일부 구체예에서, 검출 가능한 라벨은 형광단이다. 형광단을 검출하기 위해서, 유리 커버를 구비한, 평면으로 제작된 나노포어 디바이스는 이중 전류 진폭 및 형광 신호 검출을 가능하게 하도록 에피형광 현미경과 조합될 수 있다. 도 6A는 이러한 디바이스가 추가된 형광단 라벨을 검출하는데 어떻게 사용될 수 있는지를 보여준다. 나노포어 디바이스는 에피형광 현미경의 대물렌즈 아래에 배치된다. 나노포어 측정이 수행될 때, 이 현미경은 나노포어 영역을 계속해서 이미지화한다. 나노포어 영역은 형광단의 여기 스펙트럼에 해당하는 파장만이 통과되도록 필터링되는 광역 여기 공급원에 의해 조사된다. 이색성 필터(dichroic filter)는 다른 모든 파장을 반영하는 한편 형광단의 방출 스펙트럼에 해당하는 파장의 전송을 선택적으로 허용한다. 형광단 변형된 결합 분자가 나노포어를 통과할 때 형광단은 여기 스펙트럼을 흡수하고 방출 스펙트럼을 재방출한다. 검출기 전방의 방출 필터는 단지 형광단의 방출 스펙트럼에 해당하는 파장만이 검출된다는 것을 보장한다. 따라서 검출기는 형광단이 나노포어를 통과할 때만 신호를 가질 것이다. 도 6B는 형광단의 방출 중에 현미경으로 보이는 나노포어 디바이스의 평면도를 나타낸다. 도 6C는 형광단의 검출이 나노포어의 신호와 함께 사용될 수 있는지를 나타낸다. 두 개의 신호의 사용은 생체 분자의 검출시 신뢰도를 향상시킨다.
일부 양태에서, 본 방법은 센서에 의해 검출되지만, 절단 가능한 링커를 사용하여 프로브에 부착되는 대상물을 가진 프로브를 사용하는 단계를 더 포함한다. 따라서 나노포어에서 서로 구별될 수 있는 프로브 세트는 표적 함유 폴리뉴클레오티드에 결합된다. 상기 프로브 세트가 나노포어에서 검출되면, 대상물이 절단되고 또한 절단 가능한 검출 대상물을 가진 새로운 세트의 프로브가 추가된다(도 7). 모든 서열 정보가 캡쳐된 표적 분자로부터 추출될 때까지 추가/절단/세척 주기는 계속될 수 있다. 프로브 검출을 돕는 분자의 예는 상기 기술된다. 절단 가능한 링커의 예는 환원성 절단 가능한 링커(TCEP에 의해 절단된 이황화 링커), 산성 절단 가능한 링커(히드라존/히드라지드 결합), 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 서열, 엔도뉴클레아제(부위 특이적 제한 효소)에 의해 절단되는 핵산 링커, 염기 절단 가능한 링커, 또는 광 절단 가능한 링커이다[Leriche, Geoffray, Louise Chisholm, and Alain Wagner. "Cleavable linkers in chemical biology." Bioorganic & medicinal chemistry 20, no. 2 (2012): 571-582].
표적 모티프
표적 서열 검출 방법이 적용되는 핵산 및 폴리펩티드에 대하여, 표적 결합 모티프는 프로브 분자에 의해 인식 가능한 뉴클레오티드 또는 펩티드 서열일 수 있다. 표적 모티프는 화학적으로 변형되거나(예를 들어, 메틸화되거나) 또는 다른 분자(예를 들어 활성화제 또는 억제제)에 의해 점유될 수도 있고, 프로브의 성질에 따라, 표적 모티프의 상태가 설명될 수 있다. 일부 양태에서, 표적 서열은 폴리뉴클레오티드에 프로브를 결합시키기 위한 화학적 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 화학적 변형은 아세틸화, 메틸화, 서몰레이션, 글리코실화, 인산화, 비오티닐화, 및 산화로 구성된 군으로부터 선택된다.
프로브 분자
본 기술에서, 프로브 분자는 표적-함유 폴리뉴클레오티드에 대한 결합에 의해 검출되거나 정량화된다.
본원에서 사용된 프로브는 폴리뉴클레오티드 상의 일정 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 것으로 이해되며, 그 부위는 서열 또는 구조를 특징으로 한다. 프로브 분자의 예는 PNA(단백질 핵산), 비스-PNA, 감마-PNA, PNA의 크기 또는 전하를 증가시키는 PNA-컨쥬게이트를 포함한다. 프로브 분자의 다른 예는 천연 또는 재조합 단백질, 단백질 융합체, 단백질의 DNA 결합 도메인, 펩티드, 핵산, 올리고 뉴클레오티드, TALEN, CRISPR, PNA(단백질 핵산), 비스-PNA, 감마-PNA, 크기, 전하, 형광성, 또는 기능성을 증가시키는 PNA-컨쥬게이트(예를 들어, 라벨링된 올리고), 또는 임의의 다른 PNA 유도된 폴리머, 및 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 프로브는 γ-PNA를 포함한다. γ-PNA는, 구체적으로는 N-(2-아미노에틸)글리신 백본의 γ-위치에서, 펩티드-유사 백본에서의 단순한 변형을 가지므로, 키랄 중심을 생성한다(Rapireddy S., et al., 2007. J. Am. Chem. Soc., 129:15596-600; He G, et al., 2009, J. Am. Chem. Soc., 131:12088-90; Chema V, et al., 2008, Chembiochem 9:2388-91; Dragulescu-Andrasi, A., et al., 2006, J. Am. Chem. Soc., 128:10258-10267). 비스-PNA와 달리, γ-PNA는 서열 제한 없이 dsDNA에 결합할 수 있으며, 이는 두 개의 DNA 가닥 중 하나를 추가의 혼성화에 접근 가능하도록 놔둔다.
일부 양태에서, 프로브의 기능은 보체 염기쌍에 의해 표적 서열을 가진 폴리뉴클레오티드에 혼성화하여 안정한 복합체를 형성하는 것이다. PNA 분자는 추가적으로 추가적인 분자에 결합되어 충분히 큰 횡단면 표면적을 가지는 복합체를 형성하여 비-프로브-결합된 폴리뉴클레오티드의 섹션에 해당하는 평균 신호 진폭인, 백그라운드를 초과하는 신호 진폭의 검출 가능한 변화 또는 대비를 생성할 수도 있다.
PNA 분자에 대한 폴리뉴클레오티드 표적 서열의 결합 안정성은 나노포어 디바이스에 의해 검출되기 위해서 중요하다. 결합 안정성은 표적-함유 폴리뉴클레오티드가 나노포어를 통해 전위되는 기간에 걸쳐 유지되어야 한다. 안정성이 약하거나 불안정한 경우, 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드로부터 분리될 수 있으며 표적-함유 폴리뉴클레오티드가 나노포어를 통해 빠져나갈 수 있기 때문에 검출되지 않을 것이다.
특정 구체예에서, 프로브의 예는 PNA 일부가 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 인식하고 컨쥬게이트 일부가 다른 PNA-컨쥬게이트 간의 크기/형태/전하 차이를 증가시키는 PNA-컨쥬게이트이다.
도 8에서 예시된 바와 같이, 리간드 A, B, C 및 D는 각각 DNA 분자 상의 부위에 특이적으로 결합하고, 이들 리간드는 너비, 길이, 크기 및/또는 전하에 의해 확인되고 서로 구별될 수 있다. 그들의 해당 부위가 각각 A, B, C 및 D로서 표시되는 경우, 리간드의 확인은 상기 DNA 서열, 부위 및 순서의 구성 측면에서, A-B-C-D의 계시로 이어진다.
상이한 반응성 모이어티는 리간드에 통합되어 라벨이 컨쥬게이션될 수도 있는 화학적 핸들을 제공할 수도 있다. 반응성 모이어티의 예는 1차 아민, 카르복시산, 케톤, 아미드, 알데히드, 보론산, 히드라존, 티올, 말레이미드, 알콜, 및 히드록실기, 및 비오틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
도 9A는 리간드 전하를 증가시켜서, 나노포어에 의한 검출을 용이하게 하도록 변형된 PNA 리간드를 나타낸다. 구체적으로, PNA 분자의 염기와 표적 DNA의 염기 사이에서 상보적 염기쌍 및 후그스틴 염기쌍(Hoogsteen base pairing)에 의해 표적 DNA 서열에 결합하는, 이 리간드는, 백본에 통합된 시스테인 잔기를 가지며, 이는 라벨링용 유리 티올 화학적 핸들을 제공한다. 본원에서, 시스테인은 말레이미드 링커를 통해 펩티드 2-아미노에틸메탄티오설포네이트(MTSEA)에 라벨링되며, 이는 라벨/펩티드가 리간드의 전하를 증가시키기 때문에 리간드가 표적 서열에 결합되는지를 검출하기 위한 수단을 제공한다. 더 큰 전하는 라벨링되지 않은 PNA와 비교하여 포어를 통한 전류 흐름의 더 큰 변화를 초래한다.
일부 양태에서, 샘플에 존재하는 리간드 결합된 폴리뉴클레오티드 및 다른 백그라운드 분자 사이에서 변화의 대비를 증가시키기 위해서, 리간드(예를 들어, PNA)의 전체적인 크기를 변화시키기 위한 슈도-펩티드(pseudo-peptide) 백본에 대한 변형이 이루어져서 대비를 증가시킨다. 예를 들어, 도 9B를 참조하면, 이것은 펩티드의 N-말단 아민을 통해 펩티드(303)로의 컨쥬게이션을 가능하게 하도록 SMCC 링커(302)로 변형된, 시스테인 잔기(301)가 통합된 PNA를 나타낸다. 리간드의 라벨링을 통한 전하의 추가에 더하여(예를 들어, 도 9A에서와 같이), 비-극성 아미노산 대신에 더 많이 대전된 아미노산의 선택은 PNA의 전하를 증가시키는 역할을 할 수 있다. 이에 더하여, 작은 입자, 분자, 단백질, 펩티드, 또는 폴리머(예를 들어, PEG)는 리간드 및 표적-함유 폴리뉴클레오티드 복합체의 벌크 또는 횡단면 표면적을 향상시키기 위해 슈도-펩티드 백본에 컨쥬게이션될 수 있다. 향상된 벌크는 증가된 벌크로부터 발생한 임의의 차동 신호가 쉽게 검출될 수 있도록 신호 진폭 대비를 개선하는 역할을 한다. 작은 입자, 분자, 단백질, 또는 펩티드의 예는 슈도-펩티드 백본에 컨쥬게이션될 수 있으며, 알파-나선 형성 펩티드, 나노미터(예를 들어 3 nm) 크기의 금 입자 또는 막대, 양자점, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 분자의 컨쥬게이션 방법은 업계에, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,180,816호, 제6,423,685호, 제6,706,252호, 제6,884,780호, 및 제7,022,673호에 널리 공지되어 있으며, 이것은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
상기 구체예는 시스테인 잔기를 통한 PEG 라벨링을 기술하지만, 다른 잔기가 사용될 수도 있다. 예를 들어, 리신 잔기는 NHS-에스터 및 유리 아민을 사용하여 연결 화학이 가능하도록 시스테인 잔기와 쉽게 교체된다. 또한, PEG는 2기능성 링커 및 PNA 사이에서 다른 벌크-부가 구성요소, 유사 덴드론(Dendrons), 비드, 또는 막대와 쉽게 교체될 수 있거나, 또는 덴드론에 직접적으로 커플링될 수 있다. 당업자는 아미노산이 교환될 수 있다는 점에서 이 시스템과 상기 특정 아미노산, 예를 들어 세린 반응성 아이소시아네이트에 대하여 변형된 연결 화학의 유연성을 인식할 것이다. 이 반응에 사용될 수 있는 연결 화학의 몇 가지 예는 하기 표에서 나열된다.
연결 화학
반응성 기 표적 작용기
아릴 아지드 비선택적 또는 1차 아민
카르보디이미드 아민/카르복실
히드라지드 탄수화물
히드록시메틸 포스핀 아민
이미도에스터 아민
이소시아네이트 히드록실
카르보닐 히드라진
말레이미드 설피드릴(sulfhydryl)
NHS-에스터 아민
PFP-에스터 아민
소랄렌(psoralen) 티민
피리딜 이황화 설피드릴
비닐 설폰 설피드릴 아민, 히드록실
도 3A, 3B, 4, 5, 9A, 9B 및 18A는 검출을 용이하게 하거나 두 개의 프로브가 가까이에 있는지를 검출하기 위해 프로브 크기를 증가시키거나, 에피토프를 함유하거나, ssDNA 올리고머를 함유하거나, 형광단, 추가적인 전하, 또는 추가적인 크기를 함유하도록 변형된 PNA 프로브를 나타낸다.
상이한 반응성 모이어티는 프로브에 통합되어 라벨이 컨쥬게이션될 수도 있는 화학적 핸들을 제공할 수 있다. 반응성 모이어티의 예는 1차 아민, 카르복시산, 케톤, 아미드, 알데히드, 보론산, 히드라존, 티올, 말레이미드, 알콜, 및 히드록실기, 및 비오틴을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
화학적 핸들을 통합시키는 일반적인 방법은 프로브의 백본에 특이적 아미노산을 포함하는 것이다. 예는 시스테인(티올레이트 제공), 리신(유리 아민 제공), 트레오닌(히드록실 제공), 글루탐산염(glutamate) 및 아스파르트산염(aspartate)(카르복시산 제공)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상이한 유형의 라벨은 반응성 모이어티를 사용하여 추가될 수 있다. 이것들은 다음과 같은 라벨을 포함한다:
1. 프로브의 크기를 증가시키는 라벨, 예를 들어, 비오틴/스트렙타비딘, 펩티드, 핵산
2. 프로브의 전하를 변화시키는 라벨, 예를 들어, 대전된 펩티드(6xHIS), 또는 단백질(예를 들어, 카리브도톡신(charybdotoxin)), 또는 작은 분자 또는 펩티드(예를 들어, MTSET)
3. 프로브를 변화시키거나 프로브에 형광성을 추가하는 라벨, 예를 들어, 일반적인 형광단, FITC, 로다민(Rhodamine), Cy3, Cy5.
4. 제3 분자에 결합하는 에피토프 또는 상호작용 부위를 제공하는 라벨, 예를 들어, 항체 결합용 펩티드.
다중화
일부 구체예에서, 같은 종류의 프로브를 포함하는 대신에, 상기 기술된 바와 같이, 독특한 부위 또는 표적 모티프에 각각 결합하는 상이한 프로브의 컬렉션이 첨가된다.
이러한 설정으로, 다수의 상이한 프로브가 같은 표적 함유 폴리뉴클레오티드 내에서 다수의 상이한 표적 부위를 검출하는데 사용될 수 있다. 도 10은 이러한 방법을 도시한다. 본원에서, 이중-가닥 DNA(1002)는 다수의 상이한 표적 모티프, 1003의 두 개의 카피, 1004의 두 개의 카피, 및 1005의 한 개의 카피를 함유한다.
각각 독특한 전류 프로파일을 제공하는 프로브(1006, 1007, 및 1008)를 사용함으로써(예를 들어, 크기를 다르게 함으로써), 본 기술은 같은 분자 내에서 상이한 표적 모티프를 검출할 수 있으며, 표적 모티프 검출을 다중화하는 수단을 제공한다. 또한, 각각의 독특한 프로브 중 몇 개가 결합되는지를 열거함으로써, 각 표적의 수(또는 카피 수)가 결정될 수 있다. 결합에 영향을 주는 조건을 조정함으로써, 시스템은 더 상세한 결합 동적 정보를 얻을 수 있다.
유사하게, 다중화는 상이한 속성을 가지고 임의의 수의 조합으로 짜맞춰진 프로브의 컬렉션을 가지고 있음으로써 달성될 수 있으며, 유일한 필요조건은 상이한 서열에 결합하는 프로브가 서로 구별 가능해야 한다는 것이다. 예를 들어, 실험은 크기로 구별 가능한 프로브 및 크기로 구별 가능한 추가적인 프로브를 사용할 수 있다(도 9A, 9B 및 19).
추가적인 다중화 방법은 다른 종의 핵산의 컬렉션을 함유하는 샘플에서 정보를 얻기 위해 서로의 고정된 위치의 공지된 서열에서 폴리뉴클레오티드에 결합하는 프로브를 설계하는 단계를 수반한다. 이 방법의 예로서, 본 발명자들이 공지된 서열의 세 개의 상이한 박테리아에 대하여 수원을 테스트하는 경우, 본 발명자들은 두 개의 프로브를, 종 A에 대해서는 1000개의 염기쌍만큼 떨어져서, 종 B에 대해서는 3000 bp만큼 떨어져서, 종 C에 대해서는 5000개의 염기쌍만큼 떨어져서 위치시킬 수 있다. 1000개의 염기쌍 및 3000개의 염기쌍만큼 떨어져 있는 프로브가 검출된 경우, 종 A 및 B가 존재하지만, 종 C는 검출 가능한 정도로는 존재하지 않은 것이다. 공간을 설계하는 이 같은 방법은 또한 특정 표적 샘플에서 공지된 또는 돌연변이된 서열의 다중 검출에 사용될 수 있다.
나노포어 디바이스
나노포어 디바이스는, 제공된 바와 같이, 디바이스의 내부 공간을 두 개의 부피로 분리하는 구조에서 개구부를 형성하는 포어를 포함하고, 예를 들어, 센서를 이용하여 포어를 통과하는 물체를 확인하도록(예를 들어, 물체를 나타내는 파라미터의 변화를 검출함으로써) 구성된다. 본원에서 기술된 방법에 사용된 나노포어 디바이스는 또한 PCT 공보 제WO/2013/012881호에서 개시되며, 그 전문이 참고로서 본원에 포함된다.
나노포어 디바이스에서 포어(들)는 나노 스케일 또는 마이크로 스케일이다. 한 양태에서, 각각의 포어는 작거나 큰 분자 또는 미생물을 통과시키는 크기를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 1 nm이다. 또는, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 또는 100 nm이다.
한 양태에서, 포어는 직경이 약 100 nm 이하이다. 또는, 포어는 직경이 약 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm, 또는 10 nm 이하이다.
일부 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 2000 nm, 3000 nm, 5000 nm, 10000 nm, 20000 nm, 또는 30000 nm이다. 한 양태에서, 포어는 직경이 약 100000 nm 이하이다. 또는, 포어는 직경이 약 50000 nm, 40000 nm, 30000 nm, 20000 nm, 10000 nm, 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 또는 1000 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm인 직경을 가진다.
일부 양태에서, 나노포어 디바이스에서 포어(들)는 큰 미생물 또는 세포를 검출하기 위해 더 큰 스케일로 되어 있다. 한 양태에서, 각각의 포어는 큰 세포 또는 미생물을 통과시키는 크기를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100 nm이다. 또는, 각 포어는 직경이 적어도 약 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1000 nm, 1100 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm, 1500 nm, 1600 nm, 1700 nm, 1800 nm, 1900 nm, 2000 nm, 2500 nm, 3000 nm, 3500 nm, 4000 nm, 4500 nm, 또는 5000 nm이다.
한 양태에서, 포어는 직경이 약 100,000 nm 이하이다. 또는, 포어는 직경이 약 90,000 nm, 80,000 nm, 70,000 nm, 60,000 nm, 50,000 nm, 40,000 nm, 30,000 nm, 20,000 nm, 10,000 nm, 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 또는 1000 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 100 nm 내지 약 10000 nm, 또는 약 200 nm 내지 약 9000 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 8000 nm, 또는 약 400 nm 내지 약 7000 nm, 또는 약 500 nm 내지 약 6000 nm, 또는 약 1000 nm 내지 약 5000 nm, 또는 약 1500 nm 내지 약 3000 nm인 직경을 가진다.
일부 양태에서, 나노포어 디바이스는 포어를 가로질러 폴리머 스캐폴드를 이동시키는 수단 및/또는 포어를 통과하는 물체를 확인하는 수단을 더 포함한다. 더 상세한 설명은 하기 제공되며, 2-포어 디바이스의 맥락에서 기술된다.
단일-포어 나노포어 디바이스와 비교하여, 2-포어 디바이스는 포어를 가로질러 폴리머 스캐폴드의 이동 속도 및 방향의 양호한 제어를 제공하도록 더 쉽게 구성될 수 있다.
특정 구체예에서, 나노포어 디바이스는 복수의 챔버를 포함하며, 각각의 챔버는 적어도 하나의 포어를 통해 인접한 챔버와 교류한다. 이들 포어 중에서, 두 개의 포어, 즉 제1 포어 및 제2 포어는, 폴리머 스캐폴드의 적어도 일부가 제1 포어 밖으로 및 제2 포어로 이동하도록 배치된다. 또한, 디바이스는 이동 중에 폴리머 스캐폴드를 확인할 수 있는 센서를 포함한다. 한 양태에서, 이러한 확인은 폴리머 스캐폴드의 개개의 구성요소를 확인하는 단계를 수반한다. 또다른 양태에서, 상기 확인은 폴리머 스캐폴드에 결합된 융합 분자 및/또는 표적 피분석물을 확인하는 단계를 포함한다. 단일 센서가 이용될 때, 단일 센서는 포어를 가로질러 이온 전류를 측정하기 위해 포어의 양 단부에 배치된 두 개의 전극을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 단일 센서는 전극 이외의 구성요소를 포함한다.
한 양태에서, 디바이스는 두 개의 포어를 통해 연결된 세 개의 챔버를 포함한다. 세 개 이상의 챔버를 구비한 디바이스는 3-챔버 디바이스의 양 측면에, 또는 세 개의 챔버 중 임의의 두 개 사이에 하나 이상의 추가적인 챔버를 포함하도록 쉽게 설계될 수 있다. 유사하게, 챔버를 연결하기 위해서 둘 이상의 포어가 디바이스 내에 포함될 수 있다.
한 양태에서, 다수의 폴리머 스캐폴드가 한 챔버에서 그 다음 챔버로 동시에 이동하도록 두 개의 인접한 챔버 사이에는 두 개 이상의 포어가 존재할 수 있다. 이러한 다중 포어 설계는 디바이스에서 폴리머 스캐폴드 분석의 처리량을 향상시킬 수 있다.
일부 양태에서, 디바이스는 폴리머 스캐폴드를 한 챔버에서 또 다른 챔버로 이동시키는 수단을 더 포함한다. 한 양태에서, 이러한 이동은 제1 포어 및 제2 포어 둘 다를 동시에 가로질러 폴리머 스캐폴드의 로딩으로 이어진다. 또 다른 양태에서, 상기 수단은 두 개의 포어를 통해, 같은 방향으로, 폴리머 스캐폴드의 이동을 또한 가능하게 한다.
예를 들어, 3-챔버 2-포어 디바이스("2-포어" 디바이스)에서, 각각의 챔버는 별도의 전압이 챔버 사이에서 각각의 포어를 가로질러 인가될 수 있도록 전력 공급 장치에 연결하기 위한 전극을 함유할 수 있다.
본 개시물의 구체예에 따라, 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 디바이스가 제공되며, 상부 챔버는 제1 포어를 통해 중간 챔버와 교류하고, 중간 챔버는 제2 포어를 통해 하부 챔버와 교류한다. 이러한 디바이스는 이중-포어 디바이스(Dual-Pore Device)라는 제목의 미국 공개 번호 제2013-0233709호에서 앞서 개시된 차원 또는 다른 특성들 중 어느 것도 가질 수 있으며, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
도 7A에서 제시된 바와 같이 일부 구체예에서는, 디바이스가 상부 챔버 (705)(챔버 A), 중간 챔버(704)(챔버 B), 및 하부 챔버(703)(챔버 C)를 포함한다. 챔버들은 두 개의 분리 층 또는 막(701 및 702)에 의해 분리되며 각각은 별도의 포어(711 또는 712)를 가진다. 또한, 각각의 챔버는 전력 공급장치에 연결하기 위한 전극(721, 722 또는 723)을 함유한다. 상부, 중간 및 하부 챔버의 주석은 상대적인 측면에서의 주석이고, 예를 들어, 상부 챔버가 지면에 대해서 중간 또는 하부 챔버보다 위에 배치되거나, 또는 그 반대를 나타내는 것은 아니다.
각각의 포어(711 및 712)는 독립적으로 작거나 큰 분자 또는 미생물이 통과하는 크기를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 1 nm이다. 또는, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 또는 100 nm이다.
한 양태에서, 포어는 직경이 약 100 nm 이하이다. 또는, 포어는 직경이 약 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm, 또는 10 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm인 직경을 가진다.
다른 양태에서, 각각의 포어는 직경이 적어도 약 100 nm, 200 nm, 500 nm, 1000 nm, 2000 nm, 3000 nm, 5000 nm, 10000 nm, 20000 nm, 또는 30000 nm이다. 한 양태에서, 각각의 포어는 직경이 50,000 nm 내지 100,000 nm이다. 한 양태에서, 포어는 직경이 약 100000 nm 이하이다. 또는, 포어는 직경이 약 50000 nm, 40000 nm, 30000 nm, 20000 nm, 10000 nm, 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 또는 1000 nm 이하이다.
일부 양태에서, 포어는 실질적으로 둥근 형태를 가진다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 둥근"은 형태의 적어도 약 80 또는 90%가 원형인 형태를 말한다. 일부 구체예에서, 포어는 형태가 사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형, 또는 육각형이다.
각각의 포어(711 및 712)는 독립적으로 깊이(즉, 두 개의 인접한 부피 사이에서 연장되는 포어의 길이)를 가진다. 한 양태에서, 각각의 포어는 적어도 약 0.3 nm인 깊이를 가진다. 또는, 각각의 포어는 적어도 약 0.6 nm, 1 nm, 2 nm, 3 nm, 4 nm, 5 nm, 6 nm, 7 nm, 8 nm, 9 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm, 14 nm, 15 nm, 16 nm, 17 nm, 18 nm, 19 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 또는 90 nm인 깊이를 가진다.
한 양태에서, 각각의 포어는 약 100 nm 이하인 깊이를 가진다. 또는, 상기 깊이는 약 95 nm, 90 nm, 85 nm, 80 nm, 75 nm, 70 nm, 65 nm, 60 nm, 55 nm, 50 nm, 45 nm, 40 nm, 35 nm, 30 nm, 25 nm, 20 nm, 15 nm, 또는 10 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm인 깊이를 가진다.
일부 양태에서, 나노포어는 막을 통해 연장된다. 예를 들어, 포어는 지질 이중층 막에 삽입된 단백질 채널일 수도 있거나 또는 드릴링, 에칭에 의해, 또는 고체-상태 기판, 예컨대 이산화규소, 질화규소, 그래핀, 또는 이들 또는 다른 물질들의 조합으로 형성된 층을 통해 포어를 형성함으로써 조작될 수도 있다. 일부 양태에서, 나노포어의 길이 또는 깊이는 두 개의 별도의 부피를 연결하는 채널을 형성하기 위해서 충분히 크다. 일부 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 또는 900 nm 보다 깊다. 일부 양태에서, 각각의 포어의 깊이는 2000 nm 또는 1000 nm 이하이다.
한 양태에서, 포어는 약 10 nm 내지 약 1000 nm 사이의 거리만큼 이격되어 있다. 일부 양태에서, 포어 간 거리는 1000 nm, 2000 nm, 3000 nm, 4000 nm, 5000 nm, 6000 nm, 7000 nm, 8000 nm, 또는 9000 nm 보다 길다. 일부 양태에서, 포어는 30000 nm, 20000 nm, 또는 10000 nm 이하 만큼 이격되어 있다. 한 양태에서, 상기 거리는 적어도 약 10 nm, 또는 적어도 약 20 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 또는 300 nm이다. 또 다른 양태에서, 상기 거리는 약 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nm, 150 nm, 또는 100 nm 이하이다.
또 다른 양태에서, 포어 간 거리는 약 20 nm 내지 약 800 nm, 약 30 nm 내지 약 700 nm, 약 40 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 300 nm이다.
두 개의 포어는 포어가 챔버 간 유체 교류를 허용하고 규정된 크기 및 포어 간의 거리를 갖는 한 임의의 위치에 배열될 수 있다. 한 양태에서, 포어는 상호 간에 직접적인 차단이 없도록 배치된다. 한 양태에서는, 도 7A에서 도시된 바와 같이, 포어가 실질적으로 같은 축에 있다.
한 양태에서, 도 7A에서 나타난 바와 같이, 디바이스는, 챔버(703, 704, 및 705)의 전극(721, 722, 및 723)을 통과하여, 하나 이상의 전력 공급장치에 연결된다. 일부 양태에서, 전력 공급장치는 전압-클램프 또는 패치-클램프를 포함하며, 이것들은 각각의 포어를 가로질러 전압을 공급하고 각각의 포어를 통해 독립적으로 전류를 측정할 수 있다. 이 양태에서, 전력 공급장치 및 전극 구성은 중간 챔버를 두 전력 공급장치에 대한 공통 접지로 설정할 수 있다. 한 양태에서, 전력 공급장치 또는 공급장치들은 상부 챔버(705)(챔버 A)와 중간 챔버(704)(챔버 B) 사이에서 제1 전압(V1), 및 중간 챔버(704) 및 하부 챔버 703(챔버 C) 사이에서 제2 전압(V2)을 인가하도록 구성된다.
일부 양태에서, 제1 전압(V1) 및 제2 전압(V2)는 독립적으로 조정 가능하다. 한 양태에서, 중간 챔버는 두 개의 전압에 대한 접지인 것으로 조정된다. 한 양태에서, 중간 챔버는 중간 챔버의 각각의 포어 및 전극 사이에서 전도도를 제공하기 위한 매질을 포함한다. 한 양태에서, 중간 챔버는 중간 챔버의 각각의 포어 및 전극 사이에서 저항을 제공하기 위한 매질을 포함한다. 이러한 저항을 나노포어 저항에 비해 충분히 작게 유지하는 것은 포어를 가로질러 두 개의 전압 및 전류를 분리시키는데 유용하며, 이는 전압의 독립적인 조정에 도움이 된다.
전압의 조정은 챔버에서 대전된 입자의 이동을 제어하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 두 전압이 같은 극성으로 설정될 때, 적절히 대전된 입자는 순차적으로 상부 챔버에서 중간 챔버로 그리고 하부 챔버로, 또는 그 반대로 이동될 수 있다. 일부 양태에서, 두 전압이 반대 극성으로 설정될 때, 대전된 입자는 상부 또는 하부 챔버에서 중간 챔버로 이동되어 거기에 머물 수 있다.
디바이스에서 전압의 조정은 두 개의 포어를 동시에 교차할 정도로 충분히 긴 큰 분자, 예컨대 대전된 폴리머 스캐폴드의 이동을 제어하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 양태에서, 분자의 이동 방향 및 속도는 하기 기술된 바와 같이 전압의 상대적 규모 및 극성에 의해 제어될 수 있다.
디바이스는 액체 샘플, 특히 생물학적 샘플, 및/또는 나노제조에 적합한 물질을 보유하기에 적합한 물질을 함유할 수 있다. 한 양태에서, 이러한 물질은 유전체 물질, 예컨대 규소, 질화규소, 이산화규소, 그래핀, 탄소 나노튜브, TiO2, HfO2, Al2O3, 또는 다른 금속 층, 또는 이 물질들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 양태에서, 예를 들어, 약 0.3 nm 두께의 그래핀 막의 단일 시트는 포어-함유 막으로서 사용될 수 있다.
미세유체이고 2-포어 미세유체 칩 구현체를 수용하는 디바이스는 다양한 수단 및 방법에 의해 제조될 수 있다. 두 개의 평행한 막으로 구성된 미세유체 칩에 대하여, 두 개의 막은 단일 빔에 의해 동시에 드릴링되어 두 개의 동심형 포어를 형성할 수 있지만, 임의의 적합한 정렬 기술과 협력하여 막의 각 측면에서 다른 빔을 사용하는 것이 또한 가능하다. 일반적으로, 하우징(housing)은 챔버 A-C의 밀봉된 분리를 보장한다. 도 7B에서 나타난 바와 같은 한 양태에서, 하우징은 전압 전극(721, 722, 및 723)과 나노포어(711 및 712) 사이에서 최소한의 접근 저항성을 제공하여, 각각의 전압이 원칙적으로는 각각의 포어를 가로질러 인가된다는 것을 보장할 것이다.
한 양태에서, 디바이스는 스페이서로 연결된 두 개의 평행한 막으로 구성된 미세유체 칩("이중-코어 칩"으로 라벨링됨)을 포함한다. 각각의 막은 막의 중심을 통해 단일 빔으로 드릴링된 포어를 함유한다. 또한, 디바이스는 바람직하게는 칩용 Teflon® 하우징을 가진다. 하우징은 챔버 A-C의 밀봉된 분리를 보장하고 전극에 대하여 최소한의 접근 저항성을 제공하여 각각의 전압이 원칙적으로는 각각의 포어를 가로질러 인가된다는 것을 보장한다.
더 구체적으로는, 포어-함유 막은 5-100 nm 두께의 규소, 질화규소, 또는 이산화규소 창을 구비한 투과 전자 현미경(TEM) 그리드로 제조될 수 있다. 스페이서는 절연체, 예컨대 SU-8, 포토레지스트(photoresist), PECVD 옥시드, ALD 옥시드, ALD 알루미나, 또는 증착된 금속 물질, 예컨대 Ag, Au, 또는 Pt를 사용하여, 그리고 막 사이에서 챔버 B의 수성 부분 외의 작은 부피를 점유하여 막을 분리시키는데 사용될 수 있다. 홀더는 챔버 B의 가장 큰 용적을 차지하는 수성 조에 배치된다. 챔버 A 및 C는 막 밀봉을 야기하는 더 큰 직경 채널(접근 저항성이 적음)에 의해 접근 가능하다.
집속 전자 또는 이온 빔은 막을 통해 포어를 드릴링하여, 자연적으로 포어를 정렬시키는데 사용될 수 있다. 포어는 또한 각각의 층에 집속된 정확한 빔을 적용함으로써 더 작은 크기로 제조될 수 있다(축소될 수 있다). 임의의 단일 나노포어 드릴링 방법은 또한 막의 두께 및 주어진 방법에 대하여 가능한 드릴 깊이를 고려하여, 두 개의 막에서 포어의 쌍을 드릴링하는데 사용될 수 있다. 미리 정해진 깊이로 마이크로-포어를 사전 드릴링 한 후 막의 나머지를 통해 나노포어를 사전 드릴링 함으로써, 또한 막 두께를 더 개선하는 것이 가능하다.
또 다른 양태에서, 하이브리드 포어를 형성하기 위해 고체-상태 나노포어로의 생물학적 나노포어의 삽입은 2-포어 방법에서 하나 또는 두 개의 포어에 사용될 수 있다. 생물학적 포어는 이온 전류 측정의 민감도를 증가시킬 수 있고, 예를 들어, 시퀀싱을 위해, 단지 단일 가닥 폴리뉴클레오티드가 2-포어 디바이스에서 캡쳐되고 제어되어야 할 때 유용하다.
디바이스의 포어에 존재하는 전압에 의해서, 대전된 분자는 챔버 사이의 포어를 통해 이동될 수 있다. 이동 속도 및 방향은 전압의 규모 및 극성에 의해 제어될 수 있다. 또한, 두 전압 각각이 독립적으로 조정될 수 있기 때문에, 대전된 분자의 이동 방향 및 속도는 각 챔버에서 정교하게 제어될 수 있다.
한 예는 두 개의 포어의 깊이 및 두 개의 포어 간의 거리를 포함하는 조합된 거리보다 더 긴 길이를 가지는 대전된 폴리머 스캐폴드, 예컨대 DNA에 관한 것이다. 예를 들어, dsDNA에 의한 길이는 약 340 nm이고, 이는 20 nm로 격리된 두 개의 10 nm-깊이 포어에 걸친 40 nm보다 실질적으로 더 길다. 첫 번째 단계에서, 폴리뉴클레오티드는 상부 또는 하부 챔버에 로딩된다. 약 7.4의 pH의 생리학적 조건 하에서 음전하에 의해서, 폴리뉴클레오티드는 전압이 인가되는 포어를 가로질러 이동될 수 있다. 그러므로, 두 번째 단계에서, 같은 극성으로 및 같거나 유사한 규모로 두 개의 전압이 포어에 인가되어 순차적으로 두 개의 포어를 가로질러 폴리뉴클레오티드를 이동시킨다.
폴리뉴클레오티드가 제2 포어에 도달할 때 쯤에, 전압 중 하나 또는 둘 다가 변화될 수 있다. 두 포어 간의 거리가 폴리뉴클레오티드의 길이보다 더 짧도록 선택되기 때문에, 폴리뉴클레오티드가 제2 포어에 도달할 때, 또한 제1 포어 내에 있다. 그러므로, 도 7C에서 도시된 바와 같이, 제1 포어에서 전압 극성의 신속한 변화는 제2 포어로부터 폴리뉴클레오티드를 끌어당기는 힘을 발생시킬 것이다.
두 개의 포어가 동일한 전압-힘 영향을 가지고 |V 1 | = |V 2 | + δV인 것으로 가정하면, 값 δV > 0(또는 < 0)은 |V 1 |(또는 V 2 ) 방향으로 조정 가능한 운동에 대하여 조정될 수 있다. 실제로는, 각각의 포어에서 전압-유도된 힘은 V 1 = V 2 와 동일하지 않을 것이지만, 교정 실험은 주어진 2-포어 칩에 대하여 동일한 인력을 발생시키는 적절한 바이어스 전압(bias voltage)을 확인할 수 있으며; 상기 바이어스 전압 주위의 변화가 방향 제어에 사용될 수 있다.
제1 포어에서 전압-유도된 힘의 규모가 제2 포어에서 전압-유도된 힘보다 작으면, 폴리뉴클레오티드는 제2 포어를 향해, 느린 속도로 두 개의 포어를 계속해서 교차할 것이다. 이러한 관점에서, 폴리뉴클레오티드의 이동 속도 및 방향은 두 전압의 극성 및 규모에 의해 제어될 수 있음을 알 수 있다. 하기 더 기술되는 바와 같이, 이동의 이러한 정교한 제어는 광범위하게 적용된다.
따라서, 한 양태에서, 나노포어 디바이스를 통해 대전된 폴리머 스캐폴드의 이동을 제어하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 상기 구체예 중 어느 것의 디바이스의 상부 챔버, 중간 챔버 또는 하부 챔버 중 하나에서 대전된 폴리머 스캐폴드를 포함하는 샘플을 로딩하는 단계로서, 디바이스는 상부 챔버와 중간 챔버 사이에 제1 전압, 및 중간 챔버와 하부 챔버 사이에 제2 전압을 제공하는 하나 이상의 전력 공급장치에 연결되는 단계; (b) 폴리머 스캐폴드가 챔버 사이로 이동함으로써, 제1 및 제2 포어 둘 다를 가로질러 폴리머 스캐폴드를 위치시키도록 초기 제1 전압 및 초기 제2 전압을 설정하는 단계; 및 (c) 중간 챔버로부터 제1 전압 및 제2 전압이 대전된 폴리머 스캐폴드를 끌어당기는 힘을 발생시키도록(전압-경쟁 방식) 제1 전압 및 제2 전압을 조정하는 단계로서, 두 전압은 제어된 조건 하에서 규모가 달라서, 대전된 폴리머 스캐폴드가 양 방향으로 및 제어된 방식으로 두 포어를 가로질러 이동하는 단계를 수반한다.
단계 (c)에서 전압-경쟁 방식을 입증하기 위해서, 각각의 포어에서 각각의 전압에 의해 가해지는 상대적인 힘이 사용된 각각의 2-포어 디바이스에 대하여 결정되어야 하고, 이는 폴리뉴클레오티드의 운동에 대한 다른 전압 값의 영향의 관찰에 의한 교정 실험으로 실행될 수 있는데, 이것은 폴리뉴클레오티드에서 공지된 위치 및 검출 가능한 특징들을 감지함으로써 측정될 수 있으며, 이러한 특징들의 예는 이 개시물에서 하기 더 상세히 설명된다. 힘이 각각의 공통 전압에서 동등하면, 예를 들어, 각각의 포어(접지된 중간 챔버에 비해 상부 및 하부 챔버에서 공통 극성을 가짐)에서 같은 전압 값의 사용은 열 교반의 부재 하에 제로 넷 운동(zero net motion)을 생성한다(브라운 운동(Brownian motion)의 존재 및 영향이 하기 논의됨). 힘이 각각의 공통 전압에서 동등하지 않으면, 같은 힘을 달성하는 것은 공통 전압에서 더 약한 힘을 겪는 포어에서 더 큰 전압의 확인 및 사용을 수반한다. 전압-경쟁 방식에 대한 교정은 각각의 2-포어 디바이스에 대하여 및 각각의 포어를 통과할 때 힘에 영향을 미치는 특징을 가진 특정 대전된 폴리머 또는 분자에 대하여 실행될 수 있다.
한 양태에서, 대전된 폴리머 스캐폴드를 함유하는 샘플은 상부 챔버에 로딩되고, 초기 제1 전압은 대전된 폴리머 스캐폴드를 상부 챔버에서 중간 챔버로 끌어당기도록 설정되고, 초기 제2 전압은 폴리머 스캐폴드를 중간 챔버에서 하부 챔버로 끌어당기도록 설정된다. 유사하게, 샘플은 처음에 하부 챔버에 로딩될 수 있고, 대전된 폴리머 스캐폴드는 중간 챔버 및 상부 챔버로 끌어당겨질 수 있다.
또 다른 양태에서, 대전된 폴리머 스캐폴드를 함유하는 샘플은 중간 챔버에 로딩되고, 초기 제1 전압은 대전된 폴리머 스캐폴드를 중간 챔버에서 상부 챔버로 끌어당기도록 설정되고, 초기 제2 전압은 대전된 폴리머 스캐폴드를 중간 챔버에서 하부 챔버로 끌어당기도록 설정된다.
한 양태에서, 단계 (c)에서 조정된 제1 전압 및 제2 전압은 규모가 두 전압 간의 차이/차동의 약 10배 내지 약 10,000배 만큼 높다. 예를 들어, 두 전압은 각각 90 mV 및 100 mV일 수 있다. 두 전압의 규모, 약 100 mV는 그것들 간의 차이/차동, 10 mV의 약 10배이다. 일부 양태에서, 전압의 규모는 적어도 전압 간의 차이/차동의 적어도 약 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 400배, 500배, 1000배, 2000배, 3000배, 4000배, 5000배, 6000배, 7000배, 8000배 또는 9000배 만큼 높다. 일부 양태에서, 전압의 규모는 전압 간의 차이/차동의 약 10000배, 9000배, 8000배, 7000배, 6000배, 5000배, 4000배, 3000배, 2000배, 1000배, 500배, 400배, 300배, 200배, 또는 100배 이하 만큼 높다.
한 양태에서, 단계 (c)에서 제1 전압 및 제2 전압에 대한 실시간 또는 온라인 조정은 최대 수백 메가헤르츠의 클럭 속도(clock rate)로, 전용 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하는 활성 제어 또는 피드백 제어에 의해 수행된다. 제1 또는 제2 또는 두 전압의 자동화된 제어는 제1 또는 제2 또는 두 이온 전류 측정의 피드백을 기반으로 한다.
센서
특정 구체예에서, 본 발명의 나노포어 디바이스는 표적 모티프의 결합 상태의 확인을 수행하기 위해 하나 이상의 센서를 포함한다.
디바이스에 사용된 센서는 분자 또는 입자, 예컨대 대전된 폴리머를 확인하는데 적합한 임의의 센서일 수 있다. 예를 들어, 센서는 전류, 전압, pH, 대전된 폴리머와 관련된 광학적 특징 또는 체류 시간 또는 대전된 폴리머의 하나 이상의 개개의 구성요소를 측정함으로써 대전된 폴리머를 확인하도록 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 센서는 분자 또는 입자, 특히 대전된 폴리머(예를 들어, 폴리머뉴크렐오티드)가 포어를 통해 이동할 때 포어를 통과하는 이온 전류를 측정하기 위해 포어의 양 측면에 배치된 전극의 쌍을 포함한다.
특정 구체예에서, 센서는 폴리머 또는 폴리머의 구성요소(또는 유닛)의 광학적 특징을 측정한다. 이러한 측정의 한 예는 특정 유닛 특유의 흡수대의 적외선(또는 자외선) 분광법에 의한 확인을 포함한다.
체류 시간 측정이 사용될 때, 체류 시간은 감지 디바이스를 통과하는데 걸린 시간의 길이를 기반으로 하여 특정 유닛에 대한 유닛의 크기와 연관성이 있을 것이다.
일부 구체예에서, 센서는 각각의 프로브와의 특징적인 비-공유 결합을 형성하는 시약으로 기능화된다. 이와 관련하여, 갭은 더 크고 효과적인 측정을 허용할 수 있다. 예를 들어, 5 nm 갭은 대략 5 nm를 측정하는 프로브/표적 복합체를 검출하는데 사용될 수 있다. 기능화된 센서를 이용한 터널 감지는 "인식 터널링(recognition tunneling)"이라고 불린다. 인식 터널링을 이용하는 주사 터널링 현미경(STM)을 사용하여, 표적 모티프에 결합된 프로브가 쉽게 확인된다.
그러므로, 본 기술의 방법은 각각 하나 또는 두 개의 나노포어 채널에 또는 포어 사이에 위치한, 하나 이상의 인식 터널링 부위로의 대전된 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA)의 전달 속도를 제어할 수 있고, 전압 제어는 각각의 프로브/표적 복합체가 확인에 충분한 기간 동안 각각의 부위에 있음을 보장할 수 있다.
디바이스의 센서 및 본 개시물의 방법은 금, 백금, 그래핀, 또는 탄소, 또는 다른 적합한 물질을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 센서는 그래핀으로 만들어진 부품을 포함한다. 그래핀은 도체 및 절연체의 작용을 할 수 있으므로, 그래핀을 통하고 나노포어를 가로지르는 터널링 전류는 전위 DNA를 시퀀싱할 수 있다.
일부 구체예에서, 터널 갭은 약 1 nm 내지 약 20 nm인 너비를 가진다. 한 양태에서, 갭의 너비는 적어도 약 1 nm, 또는 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 또는 15 nm이다. 또 다른 양태에서, 갭의 너비는 약 20 nm 이하, 또는 약 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2 nm 이하이다. 일부 양태에서, 너비는 약 1 nm 내지 약 15 nm, 약 1 nm 내지 약 10 nm, 약 2 nm 내지 약 10 nm, 약 2.5 nm 내지 약 10 nm, 또는 약 2.5 nm 내지 약 5 nm이다.
일부 구체예에서, 센서는 전기 센서이다. 일부 구체예에서, 센서는 프로브가 독특한 형광 시그니처를 생성하는 라벨을 가질 때 형광 검출 수단을 검출한다. 유출구에서 방사선원은 상기 시그니처를 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명이 상기 구체예와 함께 기술되는 한편, 전술된 기술내용 및 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라 설명하려는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다른 양태, 이점 및 변형은 본 발명이 속한 업계의 당업자에게 분명해질 것이다.
실시예
실시예 1 - 고체-상태 나노포어 실험에서 DNA 단독
나노포어 기구는 개방형 포어를 통해 이온 전류(I0)를 측정하는 동안 포어를 가로질러 전압 V를 인가하기 위해 민감한 전압-클램프 증폭기를 사용한다. 단일 대전된 분자, 예컨대 이중-가닥 DNA(dsDNA)가 전기영동에 의해 캡쳐되고 포어를 통해 구동될 때, 측정된 전류는 I0에서 IB로 이동하고, ΔI = I0 - IB 및 기간 tD를 사용하여 이벤트를 특성화하였다. 실험 중에 많은 이벤트를 기록한 후, ΔI 대 tD 플롯에서 이벤트의 분포를 분석하여 플롯의 집단에서 해당 분자를 특성화한다. 이렇게 하여, 나노포어는 생체 분자 감지를 위해 간단하고, 라벨이 필요 없고, 순수하게 전기적인 단일-분자 방법을 제공한다.
질화규소(SiN) 기판에서 제조된 단일 나노포어는 100 nm 두께 SiN 막에서 40 nm 직경 포어이고 고체-상태 나노포어의 예로서 나타난다(도 11A). 도 11B에서, 대표적인 전류 추적은 1M KCl을 함유하는 버퍼에서 200 mV에서 10 nm 두께 SiN의 11 nm 직경 나노포어를 통해 단일 파일 방식(폴딩되지 않음)으로 통과하는 5.6 kb dsDNA에 의해 유발된 차단 이벤트를 나타낸다. 전류는 DNA가 0.3 M 이상의 KCl 농도에서 포어를 통과할 때 감소하는 반면, DNA가 0.3 M보다 낮은 KCl 농도에서 포어를 통과할 때 증가한다. 평균 개방 채널 전류는 I0 = 9.6 nA이며, 평균 이벤트 진폭은 IB = 9.1 nA이고, 평균 이벤트 기간은 tD = 0.064 ms이다. dsDNA 분자의 전위에서 나노포어를 통한 진폭 이동은 ΔI = I0 - IB = 0.5 nA이다. 도 11C에서, 산점도는 16분 동안 기록된 1301개의 이벤트 모두에 대한 |ΔI| 대 tD를 나타낸다.
실시예 2 - 표적 서열 검출을 위한 PNA 및 비오틴을 포함하는 캡쳐 분자
본 발명자들은 조작된 폴리머 스캐폴드에 의해 용액 내 화합물의 결합 검출을 허용하는 방법을 입증하였다. 본 발명자들은 뉴트라비딘에 결합하는 비오틴 모이어티를 함유하도록 변형된 PNA 프로브를 제공한다. 뉴트라비딘은 벌크를 증가시키므로 PNA를 큰 나노포어(예를 들어, 15-30 nm 직경)에서 검출 가능하게 만든다. 특히, 본 발명자들은 12-mer 펩티드-핵산(PNA) 프로브 분자에 결합하도록 5.6 kb dsDNA 스캐폴드를 조작하였으며, 각각의 PNA 프로브는 각각 뉴트라비딘에 결합되는 3개의 비오티닐화된 부위를 가진다(도 12A). 본 발명자들은 PNA 프로브에 결합하는 25개의 별개의 부위(결합 모티프)를 갖도록 dsDNA 스캐폴드를 조작하였다(도 12B). 본 발명자들은 폴리머 스캐폴드 단독, 유리 뉴트라비딘, 또는 프로브/DNA 복합체를 포함하는 용액을 제공하였다(도 13). 각 집단으로부터 얻어진 전류 이벤트 시그니처는 DNA/PNA/뉴트라비딘 복합체가 다른 백그라운드 이벤트 유형(예를 들어, 미결합 DNA 단독, 뉴트라비딘 단독, PNA/뉴트라비딘 단독)보다 검출 가능성이 큰 전위 전류 시그니처를 유발하므로 이는 나노포어에서 확인될 수 있음을 나타낸다(도 13). 이 실시예에서, 본 발명자들은 DNA/PNA/뉴트라비딘 복합체가 높은 신뢰도로 나노포어로 검출될 수 있음을 보여준다.
특이적 DNA 서열에 결합하는 프로브는 스캐폴드 전반에 걸쳐 25번 반복되는 독특한 서열(GAAAGTGAAAGT, uSeq1)에 결합하는 단백질 핵산 분자(PNA)이다. 실험에 사용된 PNA는 서열 GAA*AGT*GAA*AGT을 갖는데, 여기서 *는 비오틴이 리신 아미노산에 커플링하여 감마 위치에서 PNA 백본으로 통합되고, 따라서 각각의 PNA는 세 개의 비오틴 분자를 가지며 잠재적으로는 3개의 뉴트라비딘 분자에 결합함(PNABio)을 나타낸다. PNA를 결합시키기 위해서, 60 nM 스캐폴드를 95℃로 2분 동안 가열하고, 60℃로 냉각시키고 15 mM NaCl에서 1시간 동안 스캐폴드 상의 가능한 PNA-결합 부위에 대하여 10x 초과량의 PNA와 함께 인큐베이션시킨 다음 4℃로 냉각시켰다. 초과량 PNA를 10 mM Tris pH 8.0에 대하여 2시간 동안 투석하였다(20k MWCO, Thermo Scientific). 이 DNA/PNA 복합체를 그 후 스캐폴드에 결합된 가능한 비오틴 부위에 10배 초과량의 뉴트라비딘 단백질(Pierce/Thermo Scientific)로 라벨링한다(투석 중에 PNA의 60% 감소를 가정함). 반응물을 상기 기술된 바와 같이 전기영동하여 순도, 농도, 및 잠재적 응집을 평가한다.
도 14A-B는 다음과 같은 3가지 별도의 실험으로부터 ΔI 대 tD 분산을 비교하는 데이터를 나타낸다: DNA 단독(D), 뉴트라비딘 단독(N), 및 D/P/N 시약(DPN). D/P/N 실험에서 가장 큰 |ΔI| 이벤트는 D/P/N 복합체에 기인하며(도 13), 이는 결합 상태(즉, 미결합, PNA를 가지는 스캐폴드, 및 PNA 및 결합된 뉴트라비딘을 가지는 스캐폴드)를 기반으로 하여 태그 이벤트에 대한 간단한 기준을 제공한다. 구체적으로는, 본 발명자들은 상기 이벤트에 대하여 |ΔI| > 4nA인 경우 D/P/N 복합체에 해당하는 이벤트를 표시할 수 있다. 도 14A의 데이터 세트에 대하여, D/P/N 실험의 이벤트 중 9.3%(390)가 |ΔI|> 4nA인데 반해, 대조군에서 단지 0.46%의 D 및 0.16%의 N 이벤트만이 4 nA를 초과한다. 1M KCl 및 인가된 200 mV에서 7 nm 직경 포어를 이용한 별도의 실험에서(데이터 미도시), 0.4 nM 농도로 PNA 및 뉴트라비딘을 이용한 대조군에서는, 어떠한 이벤트도 4 nA를 초과하지 않았다(0%). 본 발명자들의 수학적 기준을 적용하면, 확률 변수 Q = {표시된 이벤트의 일부}는 이항 분포를 가지고, 이러한 및 다른 통계적 모델링 도구를 사용하여, 본 발명자들은 Q = 9.29 ± 1.15%로 설정된 이 데이터에 대한 99% 신뢰 구간을 산출할 수 있다. 9.29% > 0.46%(최대 위양성 %)가 Q에 대한 99% 신뢰 구간 내에서 충분히 만족되기 때문에, 본 발명자들은 양성 테스트 결과를 가지며, 8분 이내에 데이터를 수집한다. 사실, 같은 99% 신뢰도는 이 데이터 세트에 대해 데이터의 처음 60초 만으로도 달성된다. 겔 이동은 스캐폴드 DNA 이동이 뉴트라비딘 의존적 방식에서 지연됨을 나타내고(도 14C); 이 결과는 모든 DNA가 라벨링되고 거의 균질한 집단이 생성되는 것으로 보이기 때문에, 본 발명자들이 이 예비 실험에서 10x 농도를 사용하도록 안내한다.
실시예 3 - DNA 스캐폴드에 결합하는 VspR 단백질 및 나노포어 검출
VspR 단백질은 서열 특이적 방식으로 높은 마이크로 몰 친화도로 dsDNA에 직접적으로 결합하는 비브리오 콜레라(V. cholerae)의 90 kDa 단백질이다(참고문헌: Yildiz, Fitnat H., Nadia A. Dolganov, and Gary K. Schoolnik. "VpsR, a Member of the Response Regulators of the Two-Component Regulatory Systems, Is Required for Expression of Biosynthesis Genes and EPSETr-Associated Phenotypes in Vibrio cholerae O1 El Tor." Journal of bacteriology 183, no. 5 (2001): 1716-1726 참조). 나노포어 기술을 사용하는 표적 서열 검출의 이 실시예에서, VspR은 부위-특이적 DNA 결합 도메인을 가진 프로브 분자로서 작용한다. 이 실험에서, 본 발명자들은 DNA에서 특이적 서열이 존재함을 검출하기 위해 단백질을 사용하는 모델로서 DNA 스캐폴드 상의 VspR의 검출을 확인하였다. DNA 스캐폴드는 10개의 VspR 특이적 결합 부위를 함유하였다(도 15). dsDNA 결합에 대한 VspR의 친화도를 보존하기 위해서, 본 발명자들은 나노포어를 통한 VspR-결합된 스캐폴드 전위가 나노포어를 통한 전류 흐름을 향상시키는 염 농도인 0.1 M KCl을 사용하였다(도 16). 본 발명자들은 기록 버퍼에서 18 nM의 농도, 및 라벨링(결합 단계) 중에는 180 nM의 농도로 VspR 단백질을 함유하는 용액을 제공하였다. 이것은 DNA 상의 결합 부위에 대하여 VspR 단백질의 18x 초과량의 결과를 가져온다. 실험을 pH 8.0(VspR 단백질의 pI는 5.8이다)에서 실행하였다. Kd 및 DNA 농도를 고려하여, 단지 0.1-1%의 DNA가 VspR에 의해 완전히 점유되어야 하며, 부분적으로는 더 높은 퍼센트가 점유되고, 일부 미공지된 나머지 퍼센트의 DNA는 전적으로 결합되지 않는다. 또한, 나노포어 실험 중 용액에는 유리 VspR 단백질이 존재한다.
두 개의 대표적인 이벤트는 도 16A 및 도 16B에서 나타난다. VspR을 이용한 실험에서, VspR 농도는 18 nM(1.6 mg/L), 10nM의 결합 부위였다. 스캐폴드 농도는 1 nM이었으며 6.6초마다 캡쳐를 발생시킨다. 포어 크기는 직경 및 길이가 15 nm이다. 전압은 -100 mV이며, 음전압은 음전류를 생성하고, 따라서 상향 시프트는 VspR-결합된 DNA 이벤트(도 16B)에 대하여 나타난 바와 같이 감쇠 이벤트에 해당하는 반면, 하향 시프트는 미결합 DNA 스캐폴드 이벤트(도 16A)에서 나타난 바와 같이 양성 시프트를 생성한다. 이것은 도 2에서 이상화된 신호 패턴 및 조건과 일치하며, DNA 이벤트(도 16A)는 융합 분자-결합된 DNA 이벤트(도 16B)와 비교하여 더 빠른 기간 및 반대 극성을 가진다. 따라서, 이 도면에서의 중요한 관찰은 VspR-결합된 이벤트가 미결합 DNA 이벤트와 비교하여 반대의 신호 극성을 가지므로 특이적 DNA 서열이 존재한다는 것을 쉽게 검출 가능하다는 것을 나타낸다. 도 17은 포어를 통과하는 VspR-결합된 스캐폴드와 일치하는 10개 이상의 대표적인 전류 감쇠 이벤트를 나타낸다. 기록하는 10분 동안 90개의 이러한 이벤트가 있으며, 이는 6.6 초 당 1개의 VspR-결합된 이벤트에 해당한다. 이벤트는 진폭이 50 내지 150 pA이고 기간이 0.2 내지 2 밀리초인 감쇠였다. 명시된 바와 같이, 도 16-17에서 하향 이벤트는 전류 향상 이벤트에 해당하고 상향 이벤트는 전류 감쇠 이벤트에 해당하며, 디스플레이 목적을 위해서 베이스라인이 0에 맞춰지더라도 이러한 이동 방향은 보존된다.
실시예 4 - 서열 특이적 프로브 합성 및 표적 서열 결합
이 실시예에서, 본 발명자들은 원하는 표적 서열에 대한 결합을 위해 PNA 프로브의 생성을 보여주며, PNA에 부가된 특징들은 나노포어에서 증가된 검출의 민감도를 허용한다.
본 발명자들은 3개의 시스테인 잔기를 함유하는 bisPNA 프로브를 생성하였다. bisPNA 프로브는 표적 DNA 분자 상의 이 표적 서열의 위치에서 CTTTCCC의 표적 서열을 포함하는 DNA 서열에 결합할 수 있는 PNA의 서열을 포함한다. bisPNA 프로브는 또한 나노포어에서 표적 DNA 분자에 부착된 프로브의 검출을 증가시키기 위해 bisPNA 프로브 상의 3개의 시스테인 잔기에서 말레이미도(maleimido)-PEG-Me로 라벨링하였다. 100배 초과량의 링커(메틸-PEG(10kDa)-말레이미드)를 환원 조건 하에 bisPNA(Lys-Lys-Cys-PEG3-JTTTJJJ-PEG-Cys-PEG-CCCTTTC-PEG-Cys-Lys-Lys)와 함께 인큐베이션하여 PNA-PEG 프로브를 생성하였다. 링커의 말레이미드 부분은 pH 7.4에서 PNA의 유리 티올과 반응하며, 따라서 PEG화된-PNA를 생성한다. 리신의 첨가는 특이적 동족 DNA 서열에 대한 시약 친화도를 증가시키므로 높은 염 조건(1 M LiCl) 하에서 결합된 채로 유지할 수 있게 한다. dsDNA 분자 상의 표적 서열에 결합된 PNA-PEG 프로브는 도 18A에 나타난다.
DNA 분자에서 표적 서열에 대한 DNA-PEG 프로브의 결합을 확인하기 위해서, 본 발명자들은 다른 버전의 PEG 프로브를 DNA와 함께 인큐베이션하여 얻어진 용액을 사용하여 겔 이동 검정을 수행하였다. 이 검정을 위해서, 본 발명자들은 도 18B에서 나타난 바와 같이 4가지 샘플을 사용하였다. 레인 1은 DNA 단독이고, 레인 2는 DNA + PNA이고, 레인 3은 DNA + PNA-PEG(10kDa)이고, 레인 4는 DNA + PNA-PEG(20kDa)이다. 레인 2-4에서의 상향 이동은 DNA에 결합되는 bisPNA 종과 일치한다. 원형 종은 DNA/PNA-PEG이고, 박스형 종은 라벨링 실험에서 잔류 PNA(PEG 없음)로서 존재하는 레인 3 및 4의 DNA/PNA이다. 겔 이동 검정의 결과는 표적 서열을 함유하는 DNA와 PNA에 PEG의 부착에 관계없이 표적 서열에 상보적인 동족 DNA 서열을 가진 PNA 프로브의 복합체 형성을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 나노포어에서 검출될 수 있는 서열-특이적 프로브의 성공적인 복합체 형성을 확인하였다.
그 후, 본 발명자들은 표적 DNA 서열에 대한 PNA 프로브의 특이성을 보여주기 위한 검정을 수행하였다. 본원에서, 본 발명자들은 PNA 프로브(PEG 없음)를, 표적 서열이 없는 DNA(레인 2), PNA 프로브와의 단일 염기 미스매치를 포함하는 표적 서열을 가진 DNA(레인 3), 및 완전한 표적 서열을 가진 DNA(레인 4)를 포함하는 샘플과 함께, 인큐베이션하였고, 각각의 샘플을 겔 이동 검정을 사용하여 분석하였는데, 이 결과는 도 18C에서 나타난다. 레인 1은 DNA 마커이다. 이 결과에 나타난 바와 같이, 정확히 표적 서열이 일치하는 DNA(레인 4)가 PNA에 결합하는 한편, 단일 염기 미스매치 서열을 포함하는 표적 서열을 가진 DNA(레인 3), 및 표적 서열이 없는 DNA(표적 서열 대신에 랜덤 서열)(레인 2)는 PNA 결합을 나타내지 않는다. 그러므로, 겔 이동 검정은 PNA가 표적 서열을 포함하는 DNA에 특이적으로 결합하며, 표적 서열에서 단일 미스매치를 가진 DNA에 조차 결합하지 않는다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - 변형된 서열-특이적 프로브를 사용하여 나노포어에서 표적 서열 검출
이 실시예에서, 본 발명자들은 PEG 변형된 서열-특이적 PNA 프로브에 결합된 표적 서열을 포함하는 DNA 분자의 검출을 보여준다.
본 발명자들은 PEG 부착 및 PEG 길이에 기초하여 상이한 벌크성을 갖도록 세 가지 상이한 PNA 프로브를 제공하였다. 다음과 같은 세 가지 타입의 프로브를 사용하였다: 1) PEG 없는 PNA, 2) 5 kDa PEG에 결합된 PNA, 3) 10kDa PEG에 결합된 PNA. 각각의 프로브를 표적 서열을 포함하는 DNA와 혼합시켰고 나노포어에서 PNA 프로브에 결합된 DNA를 검출하였다. 샘플에서 각각의 복합체의 농도는 1M LiCl 버퍼에서 2nM이었다. 샘플을 나노포어 디바이스에서 100mV의 인가된 전압 하에 실행하였다. 결과는 도 19A-19E에서 나타난다.
도 19A에서, 관찰된 대표적인 개개의 이벤트는 프로브의 각 유형에 결합된 DNA에 대하여 나타난다. DNA/bisPNA 이벤트의 이벤트 시그니처는 좌측에 나타난다. 각각의 PNA에 결합된 최대 3개의 PEG, 및 5 kDa 크기의 PEG를 가지는 DNA/bisPNA-PEG 복합체의 이벤트 시그니처는 중간에 나타난다. 각각의 PNA에 결합된 최대 3개의 PEG, 및 10 kDa 크기의 PEG를 가지는 DNA/bisPNA-PEG 복합체의 이벤트 시그니처는 우측에 나타난다. 각각에 대한 이벤트 시그니처를 확인된 복합체의 전위 중에 나노포어를 통한 전류 차단에 의해 측정하였다. 도 19A에서, 분자 도면은 시각적 비교를 위해 크기가 조정된 선형 PEG 및 DNA를 나타낸다. 프로브 크기(벌크)가 증가함에 따라, 이벤트 시그니처가 변화된다.
본 발명자들은 이벤트 집단을 분석하였고 각각의 데이터 세트의 모든 이벤트에 대하여 평균 전도도 이동(dG) 대 기간의 산점도를 생성하였다. 본 발명자들은 도 19B에서 나타난 바와 같이 실험으로부터 이벤트 평균 전도도(전압으로 나눈 평균 전류 이동) 대 이벤트 기간(너비)의 산점도를 생성하였다. 플롯은 DNA/PNA, DNA/PNA-PEG(5kDa), 및 DNA/PNA-PEG(10kDa)가 이벤트 기간 및 평균 전도도를 기반으로 하여 별개의 중첩 집단을 제공한다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 다른 복합체들 사이에서 각각의 이벤트에 대한 평균 전도도 이동(dG)의 관찰된 차이를 나타내기 위한 히스토그램을 생성하였다(도 19C). 본 발명자들은 또한 다른 복합체 사이에서 이벤트 기간의 관찰된 차이를 나타내기 위한 히스토그램을 생성하였다(도 19D).
실시예 6 - 나노포어에서 인간 낭포성 섬유종을 검출하기 위해 돌연변이된 cftr 유전자 표적 서열의 검출
본 발명자들은 표적 서열에 대한 변형된 PNA의 결합의 특이성 및 나노포어 디바이스에서 프로브를 사용하여 표적 서열을 검출하는 능력을 확인하였다. 본 발명자들은 환자의 샘플에서 돌연변이를 유발하는 질환, 구체적으로는 낭포성 섬유종을 검출하기 위해 나노포어 디바이스에서 변형된 PNA 프로브의 사용을 고려하였다.
본 발명자들은 낭포성 섬유종을 유발하는 돌연변이(ΔF508)를 가진 cftr 유전자를 포함하는 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하는 PNA 분자를 포함하는 변형된 PNA 프로브(PNA-PEG 프로브)를 생성하였다(실시예 4에서 기술된 방법에 따라). PNA 프로브에 결합된 PEG는 5 kDa였다. 낭포성 섬유종 질환 돌연변이를 함유하는 DNA를 돌연변이에 특이적인 PEG화된 PNA와 함께 인큐베이션하였다. 그 이후 샘플을 26 nm 포어를 가진 나노포어 디바이스에 배치하였고 나노포어를 통한 전위 이벤트를 기록하고 분석하였다.
DNA 분자에 결합된 PNA-PEG 프로브의 전위와 연관된 전위 이벤트 시그니처를 돌연변이(ΔF508)를 유발하는 낭포성 섬유종을 함유하는 DNA를 가진 샘플에서 관찰하였다. 대표적인 이벤트 시그니처는 도 20A에서 나타난다. DNA 단독 또는 DNA/PNA 단독(즉, PEG-PNA 없음)을 가진 샘플을 사용한 실험은 백그라운드보다 높은 전위 이벤트를 제공하지 않으며, 이는 DNA에 결합된 PNA-PEG 프로브를 정확하게 확인하는 포어의 능력, 및 본원에서 제공된 변형된 프로브에 의해 검출이 향상되었음을 나타낸다. 표적 돌연변이 유전자 및 PNA-PEG 프로브를 가진 샘플로부터 기록된 이벤트 세트에 대하여, 이벤트는 평균 전도도 이동 및 기간을 특징으로 하여 분석되었다. 도 20B는 각각의 기록된 이벤트에 대한 평균 전도도 이동 대 기간 플롯을 보여준다. 도 20C 및 도 20D는 각각의 이벤트의 평균 전도도 이동 및 기간에 의해 검출된 이벤트를 특성화하기 위해 해당하는 히스토그램을 보여준다. 분석된 데이터는 나노포어를 통한 DNA/PNA-PEG(5kDa) 복합체 전위에 대한 예상 데이터와 일치하였으며, 이는 나노포어 디바이스에서 cftr 돌연변이 표적 서열의 성공적인 결합 및 확인을 나타낸다.
본 발명자들은 또한 야생형 cftr 서열을 가진 300bp DNA를 포함하는 샘플(레인 2) 및 ΔF508 cftr 유전자 돌연변이를 가진 300bp DNA를 포함하는 샘플(레인 3)과 함께 ΔF508 cftr 유전자 돌연변이에 특이적인 PNA-PEG(5kDa) 프로브를 포함하는 샘플에서 겔 이동 검정을 수행하였다(도 20E). 이 데이터는 PNA-PEG 프로브가 단지 ΔF508 표적 서열에만 특이적으로 결합하며, 야생형 서열에는 결합하지 않음을 보여준다.
그러므로, 본 발명자들은 단일 염기 cftr 유전자 돌연변이(ΔF508)를 포함하는 DNA를 성공적으로 검출하였고, 인간 환자의 진단 또는 치료 지시를 포함하여 샘플에서 다중핵산의 특이적 서열을 검출하기 위한 본원의 시스템의 사용을 입증하였다.
실시예 7 - 나노포어에서 PNA-PEG 프로브를 이용한 감염성 박테리아 검출
이 실시예에서, 본 발명자들은 나노포어 디바이스를 사용하여 샘플 내 박테리아 DNA의 존재를 검출하기 위해 변형된 프로브의 사용을 확인하였다.
본 발명자들은 스타필로코쿠스 미티스(Staphylococcus mitis) 박테리아 DNA에 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 분자를 이용하여 프로브를 합성하였다. bisPNA는 S. mitis 박테리아 종에 특이적인 서열에 상보적인 서열을 함유한다.
이 검정에서, PNA 프로브는 박테리아 DNA에 결합될 때 나노포어에서 검출이 허용되도록 10kDa PEG에 결합된다. 본 발명자들은 PNA 프로브와 박테리아 DNA를 혼합하고 샘플에서 겔 이동 검정을 수행하여 결합을 관찰하였다. 도 21A는 겔 이동 검정의 결과를 나타내는데, 레인 1은 PNA 프로브가 없는 박테리아 DNA를 포함하고, 레인 2는 PNA 프로브를 가진 박테리아 DNA를 포함한다. 관찰 결과는 PNA/PEG(10kDa) 프로브가 S. mitis 박테리아 DNA에 결합됨을 보여준다.
그 다음에 본 발명자들은 나노포어에서 검출을 위해 두 가지 샘플을 제조하였다. 제1 샘플은 PEG-변형된 PNA 프로브를 가진 박테리아 DNA(DNA/bisPNA-PEG)를 포함하였다. 제2 샘플은 박테리아 DNA 단독을 포함하였다. 본 발명자들은 두 번의 연이은 실험에서 나노포어 디바이스를 통해 이 샘플들을 실행하였고, 얻어진 이벤트를 분석하였다. 도 21B는 두 번의 연이은 실험에서 기록된 모든 이벤트에 대하여 세로축 상의 평균 전도도 이동(dG) 대 가로축 상의 기간의 산점도를 나타낸다. 태그된 샘플 1(사각형) 및 태그되지 않은 샘플 2(원)를 특징으로 하는 이벤트가 나타난다.
태그된 분자는 백그라운드 역가(점선)보다 일관되게 높은 한편, 태그되지 않은 분자는 점선보다 낮으며 백그라운드 집단과 일치한다. 다양한 백그라운드 실험(PEG 없는 DNA/PNA, 여과된 혈청 등)의 분자 집단을 사용하여 태그된 이벤트를 표시하는 역가(선)를 확립하였다. 백그라운드 이벤트는 본원에서 도시되지 않는다. 샘플에서 박테리아 DNA의 정확한 검출을 위해서, DNA는 고도로 부위-특이적인 프로브를 사용하여 태그되어야 한다.
이러한 결과는 S. mitis 박테리아 DNA의 PNA/PEG 결합된 집단이 백그라운드 이벤트로부터 확인 가능하지만 DNA 단독 또는 DNA/PNA 단독은 그렇지 않음을 보여준다. 따라서, 변형된 PNA-PEG 서열 특이적 프로브는 샘플에서 S. mitis DNA의 존재 또는 부재의 확실한 검출을 가능하게 한다.
다른 구체예
사용된 단어들은 제한보다는 설명의 단어들이고, 더 광범위한 양태에서 본 발명의 진정한 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않는 한 첨부된 청구범위의 범위 내에서 변화가 이루어질 수도 있음을 이해해야 한다.
본 발명이 여러 기술된 구체예에 대하여 어느 정도의 길이로 및 어느 정도의 특이성을 가지고 기술되는 한편, 임의의 이러한 특정 사항 또는 구체예 또는 임의의 특정 구체예에 제한되는 것이 아니라, 선행 기술의 관점에서 이러한 청구범위의 가정 광범위한 가능한 해석을 제공함으로, 본 발명의 의도된 범위를 효과적으로 포함하도록 첨부된 청구범위를 참조하여 해석되어야 한다.
모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 본원에서 언급된 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 논쟁이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서는 조절될 것이다. 이에 더하여, 섹션 표제, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 의도는 아니다.
<110> TWO PORE GUYS, INC. <120> TARGET SEQUENCE DETECTION BY NANOPORE SENSING OF SYNTHETIC PROBES <130> IF17P069US <150> US 62/056,378 <151> 2014-09-26 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 1 gaaagtgaaa gt 12 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 2 His His His His His His 1 5

Claims (39)

  1. 샘플에서 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 검출하는 방법으로서,
    a) 상기 샘플과 상기 표적 서열을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프로브를 상기 표적 서열에 대한 상기 프로브의 결합을 촉진하는 조건 하에 접촉시켜서 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체를 형성하는 단계;
    b) 상기 샘플을 나노포어 디바이스의 제1 챔버에 로딩하는 단계로서, 상기 나노포어 디바이스는 적어도 하나의 나노포어 및 적어도 상기 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함하며, 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 적어도 하나의 나노포어를 통해 전기적으로 및 유체적으로 교류하고, 상기 나노포어 디바이스는 상기 적어도 하나의 나노포어 각각을 가로질러 독립적으로 제어되는 전압 및 상기 적어도 하나의 나노포어 각각에 관련된 센서를 더 포함하며, 상기 센서는 적어도 하나의 나노포어를 통해 통과하는 물체를 확인하도록 구성되고, 상기 적어도 하나의 나노포어를 통한 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 전위는 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체와 관련된 검출 가능한 신호를 제공하는 단계; 및
    c) 상기 검출 가능한 신호를 관찰하여, 상기 표적 서열을 포함하는 상기 폴리뉴클레오티드를 검출함으로써 상기 샘플에서 상기 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 신호는 전기 신호인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 신호는 광신호인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 단백질, 펩티드, 핵산, TALEN, CRISPR, 펩티드 핵산, 또는 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩티드 핵산(PNA), DNA/RNA 하이브리드, 폴리펩티드, 또는 화학적으로 유도된 폴리머로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 상기 적어도 하나의 나노포어를 통한 전위 중에 상기 폴리뉴클레오티드에 결합된 프로브의 검출을 용이하게 하도록 구성된 제2 분자에 결합된 PNA 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제2 분자는 PEG인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PEG는 적어도 1 kDa, 2 kDa, 3 kDa, 4 kDa, 5 kDa, 6kDa, 7kDa, 8kDa, 9kDa, 또는 10kDa의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 샘플에 상기 프로브와 상기 표적 서열 간의 결합 상호작용을 변화시키는 것으로 의심되는 조건을 적용하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 조건은 샘플에서 프로브의 제거, 표적 서열에의 결합에 대하여 프로브와 경쟁하는 작용제의 첨가, 및 초기 pH, 염, 또는 온도 조건의 변화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 프로브에 대한 폴리뉴클레오티드의 결합을 변형시키도록 구성된 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화학적 변형은 비오티닐화, 아세틸화, 메틸화, 서몰레이션(summolation), 글리코실화, 인산화 및 산화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 절단 가능한 결합을 통해 프로브에 커플링된 화학적 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 금속 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호작용, 또는 평면 스태킹 상호작용을 통해 폴리뉴클레오티드의 표적 서열과 상호작용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 샘플을 프로브 또는 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체에 결합시킬 수 있는 하나 이상의 검출 가능한 라벨과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 적어도 두 개의 표적 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 나노포어는 직경이 약 1 nm 내지 약 100 nm이고, 길이가 1 nm 내지 약 100 nm이며, 각각의 챔버는 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 나노포어 디바이스는 모든 나노포어에서 상기 폴리뉴클레오티드의 이동을 동시에 제어하도록 구성된 적어도 두 개의 나노포어를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 프로브-결합부가 나노포어를 통해 통과한 후 나노포어를 통한 상기 폴리뉴클레오티드의 이동이 반전되도록, 상기 검출 가능한 신호에 의한 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 초기 검출 이후 상기 독립적으로 제어되는 전압을 반전시키며, 이로써 폴리뉴클레오티드-프로브 복합체의 존재 또는 부재를 다시 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 나노포어 디바이스는 두 개의 나노포어를 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 두 개의 나노포어 둘 다에 동시에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 나노포어를 통해 폴리뉴클레오티드의 전위의 속도를 제어하기 위해 나노포어에 의해 반대 힘이 발생되도록 상기 두 개의 나노포어 각각에서 전압의 크기 및/또는 방향을 조정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 샘플에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 검출하는 방법으로서,
    a) 상기 샘플을 제1 프로브 및 제2 프로브와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 프로브는 상기 제1 표적 서열에 대한 상기 제1 프로브의 결합을 촉진하는 조건 하에 상기 폴리뉴클레오티드의 제1 표적 서열에 특이적으로 결합하고, 상기 제2 프로브는 상기 제2 표적 서열에 대한 상기 제2 프로브의 결합을 촉진하는 조건 하에 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 표적 서열에 특이적으로 결합하는 단계;
    b) 상기 샘플을 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브에 대한 상기 제3 분자의 결합을 촉진하는 조건 하에 상기 제1 및 제2 프로브가 서로 충분히 근접해있을 때 상기 제1 및 제2 프로브에 동시에 결합하도록 구성되는 제3 분자와 접촉시키며, 이로써 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 제1 프로브, 상기 제2 프로브, 및 상기 제3 분자를 포함하는 융합 복합체를 형성하는 단계;
    c) 상기 샘플을 나노포어 디바이스의 제1 챔버에 로딩하는 단계로서, 상기 나노포어 디바이스는 적어도 하나의 나노포어 및 적어도 상기 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함하며, 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 적어도 하나의 나노포어를 통해 전기적으로 및 유체적으로 교류하고, 나노포어 디바이스는 상기 적어도 하나의 나노포어 각각을 가로질러 제어되는 전압 전위 및 상기 적어도 하나의 나노포어 각각에 관련된 센서를 더 포함하며, 상기 센서는 적어도 하나의 나노포어를 통해 통과하는 물체를 확인하도록 구성되고, 상기 적어도 하나의 나노포어를 통한 상기 융합 복합체 전위는 상기 융합 복합체와 관련된 검출 가능한 신호를 제공하는 단계; 및
    d) 상기 검출 가능한 신호를 관찰하여 상기 샘플에서 상기 융합 복합체의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 검출 가능한 신호는 전기 신호인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 검출 가능한 신호는 광신호인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 충분히 근접함은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 또는 500개 미만의 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제23항에 있어서, 상기 제3 분자는 PEG 또는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 제3 분자 및 상기 제1 및 제2 프로브는 ssDNA에 결합되고, 상기 제3 분자에 연결된 상기 ssDNA는 상기 제1 프로브에 연결된 ssDNA의 영역에 상보적인 영역을 포함하며 상기 제2 프로브에 연결된 ssDNA의 영역에 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제23항에 있어서, 상기 샘플을 제3 분자 또는 융합 복합체에 결합시킬 수 있는 하나 이상의 검출 가능한 라벨과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제1 프로브, 제2 프로브, 및 제3 분자를 포함하는 키트로서, 제1 프로브는 표적 폴리뉴클레오티드 상의 제1 표적 서열에 결합하도록 구성되고, 제2 프로브는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 상의 제2 표적 서열에 결합하도록 구성되며, 상기 제3 분자는 상기 제1 및 제2 프로브가 상기 제1 및 제2 표적 서열에서 상기 폴리뉴클레오티드에 결합될 때 제1 프로브 및 제2 프로브에 결합하도록 구성되며, 이로써 상기 제1 및 제2 프로브에 대한 상기 제3 분자의 동시 결합을 허용하기에 충분히 근접하게 제1 및 제2 프로브를 위치시키는, 키트.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제1 프로브 및 상기 제2 프로브는 단백질, 펩티드, 핵산, TALEN, CRISPR, 펩티드 핵산, 또는 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  33. 제31항에 있어서, 상기 제3 분자는 PEG 또는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  34. 제31항에 있어서, 상기 제3 분자는 상기 프로브에 대한 결합 친화도를 변형시키기 위한 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. 적어도 두 개의 챔버 및 나노포어를 포함하는 나노포어 디바이스로서, 상기 디바이스는 상기 나노포어 내 폴리뉴클레오티드에 결합된 변형된 PNA 프로브를 포함하는 나노포어 디바이스.
  36. 두 개의 포어를 통해 대전된 폴리머를 검출하는 이중-포어, 이중-증폭기 디바이스로서, 디바이스는 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하며, 제1 포어는 상부 챔버 및 중간 챔버를 연결하고, 제2 포어는 중간 챔버 및 하부 챔버를 연결하며, 상기 디바이스는 상기 제1 또는 제2 포어 내 폴리뉴클레오티드에 결합된 변형된 PNA 프로브를 포함하는 디바이스.
  37. 제36항에 있어서, 상기 디바이스는 상기 제1 포어 및 상기 제2 포어 둘 다를 통해 상기 대전된 폴리머의 이동을 동시에 제어하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 디바이스.
  38. 제36항에 있어서, 상기 변형된 PNA 프로브는 적어도 하나의 PEG 분자에 결합되는 것을 특징으로 하는 디바이스.
  39. 제36항에 있어서, 디바이스는 상부 챔버 및 중간 챔버 사이에서 제1 전압을 제공하고, 중간 챔버 및 하부 챔버 사이에서 제2 전압을 제공하도록 구성된 전력 공급장치를 더 포함하는데, 각각의 전압은 독립적으로 조정 가능하고, 중간 챔버는 두 개의 전압에 대하여 공통 접지에 연결되며, 디바이스는 각각의 포어에서 독립적인 전압 제어 및 전류 측정을 위해 구성된 이중-증폭기 전자장치를 제공하고, 두 개의 전압은 크기가 다를 수도 있으며, 제1 및 제2 포어는 대전된 폴리머가 양 방향으로 및 제어된 방식으로 둘 모두의 포어를 가로질러 동시에 이동할 수 있도록 구성되는 것을 특징으로 하는 디바이스.
KR1020177011263A 2014-09-26 2015-09-28 합성 프로브의 나노포어 감지에 의한 표적 서열 검출 KR20170064540A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462056378P 2014-09-26 2014-09-26
US62/056,378 2014-09-26
PCT/US2015/052729 WO2016049657A1 (en) 2014-09-26 2015-09-28 Target sequence detection by nanopore sensing of synthetic probes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170064540A true KR20170064540A (ko) 2017-06-09

Family

ID=55582170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177011263A KR20170064540A (ko) 2014-09-26 2015-09-28 합성 프로브의 나노포어 감지에 의한 표적 서열 검출

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20170349940A1 (ko)
EP (1) EP3198036A4 (ko)
JP (1) JP6702951B2 (ko)
KR (1) KR20170064540A (ko)
CN (1) CN107002140A (ko)
AU (2) AU2015319825A1 (ko)
CA (1) CA2962234A1 (ko)
IL (1) IL251274A0 (ko)
MX (1) MX2017003790A (ko)
RU (1) RU2681822C2 (ko)
WO (1) WO2016049657A1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190122120A (ko) * 2017-10-18 2019-10-29 울산대학교 산학협력단 동형2기능성 이미도에스터를 이용한 병원체 농축 방법
KR20200055493A (ko) * 2018-11-13 2020-05-21 고려대학교 산학협력단 마이크로 포어를 이용한 생체 분자 검출 장치
KR20200142831A (ko) 2019-06-13 2020-12-23 한국과학기술원 표적 dna 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 dna의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 dna의 정량 방법
KR20220069865A (ko) 2020-11-20 2022-05-27 한국과학기술원 표적 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산의 검출 방법

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8870950B2 (en) 2009-12-08 2014-10-28 Mitral Tech Ltd. Rotation-based anchoring of an implant
US11653910B2 (en) 2010-07-21 2023-05-23 Cardiovalve Ltd. Helical anchor implantation
EP4166111A1 (en) 2013-01-24 2023-04-19 Cardiovalve Ltd. Ventricularly-anchored prosthetic valves
KR102245192B1 (ko) * 2013-05-06 2021-04-29 온테라 인크. 나노포어를 이용한 표적 검출
ES2704902T3 (es) 2013-05-06 2019-03-20 Two Pore Guys Inc Un método de detección de objetivos biológicos usando un nanoporo y un agente de unión a proteínas de fusión
EP3013983B1 (en) 2013-06-25 2023-02-15 Prognosys Biosciences, Inc. Spatially encoded biological assays using a microfluidic device
AU2015355546B2 (en) 2014-12-03 2021-10-14 Agilent Technologies, Inc. Guide RNA with chemical modifications
CA3162308A1 (en) 2015-02-05 2016-08-11 Cardiovalve Ltd. Prosthetic valve with axially-sliding frames
KR102648489B1 (ko) 2015-04-06 2024-03-15 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna
CA2982146A1 (en) 2015-04-10 2016-10-13 Spatial Transcriptomics Ab Spatially distinguished, multiplex nucleic acid analysis of biological specimens
US10531866B2 (en) 2016-02-16 2020-01-14 Cardiovalve Ltd. Techniques for providing a replacement valve and transseptal communication
US20190033286A1 (en) * 2016-02-25 2019-01-31 Quantapore, Inc. Redundant polymer analysis by translocation reversals
EP3436818A4 (en) * 2016-03-31 2019-11-06 Ontera Inc. DIFFERENTIATION, THROUGH NANOPORES, OF TARGET POLYNUCLEOTIDES FROM FRAGMENTATION SAMPLE BACKGROUND AND USEFUL LOAD LINK
US11486873B2 (en) 2016-03-31 2022-11-01 Ontera Inc. Multipore determination of fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US10669579B2 (en) 2016-07-15 2020-06-02 International Business Machines Corporation DNA sequencing with stacked nanopores
CA3031187A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 Cardiovalve Ltd. Prosthetic valve with concentric frames
EP3800469A1 (en) * 2016-10-24 2021-04-07 Ontera Inc. Fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample
US10888421B2 (en) 2017-09-19 2021-01-12 Cardiovalve Ltd. Prosthetic heart valve with pouch
US10890560B2 (en) 2018-05-21 2021-01-12 International Business Machines Corporation Forming nanoscale pores in a semiconductor structure utilizing nanotubes as a sacrificial template
EP3844306A2 (en) * 2018-08-28 2021-07-07 10X Genomics, Inc. Increasing spatial array resolution
US11519033B2 (en) 2018-08-28 2022-12-06 10X Genomics, Inc. Method for transposase-mediated spatial tagging and analyzing genomic DNA in a biological sample
JP2021536261A (ja) * 2018-09-07 2021-12-27 オンテラ インコーポレイテッド ナノ細孔デバイスを使用して分子を検出するためのセンシング組成物、方法、およびデバイス
EP3894587A1 (en) 2018-12-10 2021-10-20 10X Genomics, Inc. Resolving spatial arrays by proximity-based deconvolution
US11649485B2 (en) 2019-01-06 2023-05-16 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
US11926867B2 (en) 2019-01-06 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Generating capture probes for spatial analysis
WO2020243579A1 (en) 2019-05-30 2020-12-03 10X Genomics, Inc. Methods of detecting spatial heterogeneity of a biological sample
CN110488013B (zh) * 2019-07-26 2023-02-28 东南大学 结合纳米孔技术的肿瘤标志miRNA检测装置及方法
EP4025711A2 (en) 2019-11-08 2022-07-13 10X Genomics, Inc. Enhancing specificity of analyte binding
CN114885610A (zh) 2019-12-23 2022-08-09 10X基因组学有限公司 使用rna模板化连接进行空间分析的方法
US11702693B2 (en) 2020-01-21 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods for printing cells and generating arrays of barcoded cells
US11732299B2 (en) 2020-01-21 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Spatial assays with perturbed cells
US11898205B2 (en) 2020-02-03 2024-02-13 10X Genomics, Inc. Increasing capture efficiency of spatial assays
US11732300B2 (en) 2020-02-05 2023-08-22 10X Genomics, Inc. Increasing efficiency of spatial analysis in a biological sample
US11891654B2 (en) 2020-02-24 2024-02-06 10X Genomics, Inc. Methods of making gene expression libraries
WO2021216708A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using targeted rna depletion
WO2021237087A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Spatial analysis to detect sequence variants
WO2021236929A1 (en) 2020-05-22 2021-11-25 10X Genomics, Inc. Simultaneous spatio-temporal measurement of gene expression and cellular activity
WO2021242834A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 10X Genomics, Inc. Method for resetting an array
CN111778244B (zh) * 2020-05-29 2023-10-27 南京邮电大学 一种结合金纳米球的DNA探针及其在基于固态纳米孔检测Hg2+中的应用
EP4162074B1 (en) 2020-06-08 2024-04-24 10X Genomics, Inc. Methods of determining a surgical margin and methods of use thereof
WO2021252591A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 10X Genomics, Inc. Methods for determining a location of an analyte in a biological sample
US20210396762A1 (en) * 2020-06-19 2021-12-23 Encodia, Inc. Methods for peptide analysis employing multi-component detection agent and related kits
WO2021263111A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 10X Genomics, Inc. Spatial analysis of dna methylation
US11981960B1 (en) 2020-07-06 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Spatial analysis utilizing degradable hydrogels
US11761038B1 (en) 2020-07-06 2023-09-19 10X Genomics, Inc. Methods for identifying a location of an RNA in a biological sample
US11981958B1 (en) 2020-08-20 2024-05-14 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using DNA capture
US11926822B1 (en) 2020-09-23 2024-03-12 10X Genomics, Inc. Three-dimensional spatial analysis
US11827935B1 (en) 2020-11-19 2023-11-28 10X Genomics, Inc. Methods for spatial analysis using rolling circle amplification and detection probes
WO2022140028A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and systems for capturing probes and/or barcodes
CN114686577A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 苏州罗岛纳米科技有限公司 一种dna序列检测方法及dna序列检测设备
CN112795628B (zh) * 2021-02-05 2024-02-23 南京邮电大学 基于固态纳米孔传感器的miRNA检测方法、检测探针及试剂盒
WO2023034489A1 (en) 2021-09-01 2023-03-09 10X Genomics, Inc. Methods, compositions, and kits for blocking a capture probe on a spatial array
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
CN114487045B (zh) * 2022-01-26 2023-05-09 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 一种检测T2毒素的CRISPR-Cas14a响应型光电化学传感检测方法和试剂盒

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5667974A (en) * 1995-06-07 1997-09-16 Abbott Laboratories Method for detecting nucleic acid sequences using competitive amplification
GB9803382D0 (en) * 1998-02-19 1998-04-15 Secr Defence Detection system
US6287772B1 (en) * 1998-04-29 2001-09-11 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences
WO2000056937A2 (en) * 1999-03-25 2000-09-28 Hyseq, Inc. Solution-based methods and materials for sequence analysis by hybridization
EP1130113A1 (en) * 2000-02-15 2001-09-05 Johannes Petrus Schouten Multiplex ligation dependent amplification assay
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US6451588B1 (en) * 2000-06-30 2002-09-17 Pe Corporation (Ny) Multipartite high-affinity nucleic acid probes
EP1497464A4 (en) * 2002-04-23 2006-01-11 Us Genomics Inc COMPOSITIONS AND METHODS RELATED TO TWO-ARM NUCLEIC ACID EFFERS
GB0223563D0 (en) * 2002-10-10 2002-11-20 Secr Defence Detection system
US20070178470A1 (en) * 2003-12-12 2007-08-02 Infectio Recherche Inc. System for charge-based detection of nucleic acids
US20050136408A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 May Tom-Moy Methods and systems for characterizing a polymer
CN102925549A (zh) * 2004-08-13 2013-02-13 哈佛学院院长等 超高处理量光学-纳米孔dna读出平台
US20060073489A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-06 Gangqiang Li Nanopore separation devices and methods of using same
US20060194222A1 (en) * 2004-10-20 2006-08-31 Stratagene California Triplex probe compositions and methods for polynucleotide detection
EP1688150A1 (en) * 2005-02-08 2006-08-09 Novo Nordisk A/S Process for the preparation of alkoxyamine functionalised poly ethylene glycols
WO2007120265A2 (en) * 2005-11-14 2007-10-25 Applera Corporation Coded molecules for detecting target analytes
US20100291548A1 (en) * 2006-03-12 2010-11-18 Applera Corporation Methods of Detecting Target Nucleic Acids
GB0605584D0 (en) * 2006-03-20 2006-04-26 Olink Ab Method for analyte detection using proximity probes
KR101685208B1 (ko) * 2007-06-19 2016-12-09 스트라토스 지노믹스 인코포레이티드 확장에 의한 고성능 핵산 서열분석
US8852864B2 (en) * 2008-01-17 2014-10-07 Sequenom Inc. Methods and compositions for the analysis of nucleic acids
WO2009140666A2 (en) * 2008-05-15 2009-11-19 Ribomed Biotechnologies, Inc. METHODS AND REAGENTS FOR DETECTING CpG METHYLATION WITH A METHYL CpG BINDING PROTEIN (MBP)
WO2011028494A2 (en) * 2009-08-24 2011-03-10 Trustees Of Boston University Label-free sensing of pna-dna complexes using nanopores
US9121823B2 (en) * 2010-02-19 2015-09-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania High-resolution analysis devices and related methods
AU2011220578B2 (en) * 2010-02-26 2014-09-25 Ventana Medical Systems, Inc. Polytag probes
GB201021499D0 (en) * 2010-12-20 2011-02-02 Loxbridge Res Llp Detection of quantative genetic differnces
CA2944478A1 (en) * 2011-07-20 2013-01-24 The Regents Of The University Of California Dual-pore device
WO2013056241A2 (en) * 2011-10-14 2013-04-18 Pacific Biosciences Of California, Inc. Real-time redox sequencing
CN103451265A (zh) * 2012-05-31 2013-12-18 凯晶生物科技(苏州)有限公司 电场作用下用微孔阵列固液相捕获单分子模板dna的方法
US20140099726A1 (en) * 2012-10-10 2014-04-10 Two Pore Guys, Inc. Device for characterizing polymers
US9605309B2 (en) * 2012-11-09 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Nucleic acid sequencing using tags
ES2704902T3 (es) * 2013-05-06 2019-03-20 Two Pore Guys Inc Un método de detección de objetivos biológicos usando un nanoporo y un agente de unión a proteínas de fusión
US10048245B2 (en) * 2013-06-25 2018-08-14 Two Pore Guys, Inc. Multiplexed biomarker quantitation by nanopore analysis of biomarker-polymer complexes
CN106471369B (zh) * 2014-05-05 2019-11-15 奥特拉公司 利用纳米细孔的目标检测
US9983191B2 (en) * 2015-03-11 2018-05-29 Two Pore Guys, Inc. Nanopore detection of small molecules through competition assays

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190122120A (ko) * 2017-10-18 2019-10-29 울산대학교 산학협력단 동형2기능성 이미도에스터를 이용한 병원체 농축 방법
US11753636B2 (en) 2017-10-18 2023-09-12 Infusion Tech Method for enriching pathogen, using homobifunctional imidoester
KR20200055493A (ko) * 2018-11-13 2020-05-21 고려대학교 산학협력단 마이크로 포어를 이용한 생체 분자 검출 장치
WO2020101347A1 (ko) * 2018-11-13 2020-05-22 고려대학교 산학협력단 마이크로 포어를 이용한 생체 분자 검출 장치
KR20200142831A (ko) 2019-06-13 2020-12-23 한국과학기술원 표적 dna 검출용 조성물과 이를 이용한 표적 dna의 검출 방법 및 이를 이용한 표적 dna의 정량 방법
KR20220069865A (ko) 2020-11-20 2022-05-27 한국과학기술원 표적 핵산 검출용 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산의 검출 방법

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015319825A1 (en) 2017-04-27
AU2022201705A1 (en) 2022-04-07
EP3198036A4 (en) 2018-08-08
JP6702951B2 (ja) 2020-06-03
CN107002140A (zh) 2017-08-01
JP2017529089A (ja) 2017-10-05
MX2017003790A (es) 2017-08-07
US20170349940A1 (en) 2017-12-07
WO2016049657A1 (en) 2016-03-31
EP3198036A1 (en) 2017-08-02
US20220195501A1 (en) 2022-06-23
IL251274A0 (en) 2017-05-29
RU2017114160A3 (ko) 2018-10-26
CA2962234A1 (en) 2016-03-31
RU2681822C2 (ru) 2019-03-12
RU2017114160A (ru) 2018-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220195501A1 (en) Targeted Sequence Detection by Nanopore Sensing of Synthetic Probes
US20200348293A1 (en) Target Detection with Nanopore
US11946102B2 (en) Coupling method
US20240124915A9 (en) Methods for delivering an analyte to transmembrane pores
US10495628B2 (en) Multiplexed biomarker quantitation by nanopore analysis of biomarker-polymer complexes
US20160266089A1 (en) Target Detection with Nanopore
US20190055592A1 (en) Nanopore Discrimination of Target Polynucleotides from Sample Background by Fragmentation and Payload Binding
Shoji et al. Spatially resolved chemical detection with a nanoneedle-probe-supported biological nanopore
CN106471369A (zh) 利用纳米细孔的目标检测
Mereuta et al. Nanopore-assisted, sequence-specific detection, and single-molecule hybridization analysis of short, single-stranded DNAs

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application