CN102925549A - 超高处理量光学-纳米孔dna读出平台 - Google Patents

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Abstract

本文描述了分析聚合物分子的方法。这些方法用于以单分子灵敏度高处理量读出DNA和RNA分子。本发明的方法包括：(1)DNA(或RNA)双链的电控制的解链,和(2)使用一种或多种分子信号检测，读出分子的身份(或密码)。本发明还提供了一种超高处理量光学-纳米孔DNA读出平台。

Description

超高处理量光学-纳米孔DNA读出平台
本申请是申请日为2005年8月12日、申请号为200580032954.X、发明名称为“超高处理量光学-纳米孔DNA读出平台”的发明专利申请的分案申请。
发明领域
本发明提供了分析聚合物分子的系统。更具体地，本发明涉及单链多核苷酸分子测序。
背景
自从Watson和Crick于1953年阐明DNA分子的结构以来，遗传研究人员已经试图发现快速且有效的对单个DNA分子测序的方法。在1975至1977年间，Sanger/Barrell和Maxam/Gilbert开发了2种进行DNA测序的新方法，它们代表着测序技术的重大突破。今天广泛使用的所有方法都是基于Sanger/Barrell方法，近23年来DNA测序的发展是对该方法的或多或少的改进。
多核苷酸是包含以线性方式结合到一起的核苷酸的重复单元的聚合分子。多核苷酸的实例是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA聚合物由4种称作腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的不同核苷酸碱基串组成。这些碱基在特定基因中的特定顺序或“序列”，决定着基因编码的蛋白的结构。而且，基因周围的碱基序列典型地含有关于在何种细胞类型中以何种频率产生特定蛋白等的信息。了解基因中和周围的DNA序列，会提供关于基因的结构和功能、它编码的蛋白、它与其它基因和蛋白的关系的有价值的信息。RNA在结构上和化学上与DNA有关，但是，RNA的糖组分是核糖(与DNA不同，后者是脱氧核糖)，且碱基胸腺嘧啶被尿嘧啶取代。
本领域的技术人员会认识到，特定的DNA序列和某些疾病状态之间存在直接的关系。该事实已经促使许多制药公司大量地投入到基因组研究领域，希望发现这些疾病潜在的遗传性质。
序列信息重要的另一个原因是，期望的基于他或她的遗传学序列确定个体对特定疾病的易感性的能力。遗传诊断学领域致力于鉴别其在基因组中的存在与特定障碍或特征的发生有关的核苷酸序列元件。可得到的关于在人群中观察到的基因组序列元件的信息越多，该领域变得越有力。而且，越迅速地测试关于序列元件在总体人群中的流行率和外显率的信息，以及这样的元件在特定个体的基因组中的存在，分析变得越有效。
序列信息有价值的另一个原因是，许多制药公司试图开发针对个体的遗传学特征定制的药物。目的是提供靶向的有效药物，可能使用与施用该药物的特定个体的遗传特性相适应的降低的剂量水平。
大多数目前可得到的核苷酸测序技术如下确定给定多核苷酸链的核苷酸序列：建立不同长度的互补链的集合，使得该集合包括在目标序列的每个碱基处终止、且大小范围从仅几个核苷酸至目标分子全长的分子。然后，通过分析截短的互补链，并确定4种DNA核苷酸中的每一种终止了哪些链，确定目标分子的序列。通过按长度顺序排列截短的分子，构建″梯子″，并读出每个梯级的末端残基，以提供目标多核苷酸序列的互补物。
目前可得到的DNA测序系统非常有力。但是，它们受到它们的速度、它们的复杂性和它们的成本的限制。目前可得到的自动测序仪的速度受到机器不能一次分析序列中超过数百(典型地，约600)核苷酸的限制。考虑到将小于1000碱基长度的链正确地拼接到一起所需的重叠，标准的测序过程必须进行多达7000万次，以便确定人基因组序列(Technology Review 102(2)：64-68 1999 Mar/Apr；在本文中引作参考)。甚至以每天1亿碱基的理论速度，将人基因组测序一次也需要至少一年。利用这些技术，大规模测序不会变成临床工具。为了使遗传诊断学可在临床环境中实践，测序速度必须提高至少3至5个数量级。
现有的测序技术的复杂性源自扩增和修饰待测序的遗传分子的需要。化学地或酶促地进行该修饰，通过许多加热和冷却的循环实现扩增。扩增和修饰待测序的DNA的更为流行的方式之一是，使用聚合酶链式反应(PCR)。PCR包含变性、退火和使用DNA聚合酶延伸的连续循环，并导致DNA的起始链的指数扩增。与循环的每个部分有关的时间长度，取决于液体体积和待扩增的DNA的长度。典型的时间是下述量级：变性步骤10-30秒，退火步骤5-30秒，和延伸步骤1-4分钟。该循环通常进行15至30次。因此，根据待扩增的DNA的长度，常见的PCR时间是1至3小时。限制变性、退火和标记的根本物理过程是：需要的可检测链的数目，进行该过程所需的时间，和酶的持续合成能力。这整个过程耗时，且需要遵循有关操作。
目前，需要更有效的对多核苷酸测序的方法。本发明提供了这样的方法。
简述
本发明指向分析聚合物分子的方法。这些方法用于以单分子灵敏度高处理量读出DNA和RNA分子。本发明的方法包括：(1)DNA(或RNA)双链的电控制的解链，(2)使用一种或多种分子信号检测，读出分子的身份(或密码)，和(3)借助于核酸和杂交探针之间的分子相互作用，有控制地减缓纳米孔穿线(threading)过程(例如，强相互作用探针会导致转移(translocation)速度的进一步降低)。
本发明指向一种测序方法，其包含目标多核苷酸(例如DNA)向设计的多核苷酸聚合物(或简称″设计聚合物″)的转化。该设计聚合物由二进制码编码，后者由检测器读出，从而提供反映原始目标多核苷酸的序列信息。
在本发明的一个实施方案中，将目标双链多核苷酸转化成设计聚合物。在一个方面，加工目标的单链。转化包含用2个设计单体替换目标多核苷酸的每个核苷酸碱基，从而将碱基表达为二进制码。例如，碱基腺嘌呤可以表示为0+0，碱基胞嘧啶可以表示为0+1，碱基鸟嘌呤可以表示为1+0，且碱基胸腺嘧啶可以表示为1+1。在一个特定的方面，每个设计单体是双链多核苷酸序列。每个设计单体代表着″0″或″1″。因此，对于目标多核苷酸的每一个碱基，存在2个对应的双链设计单体。在一个方面，以能反映目标多核苷酸的核苷酸序列的方式连接设计单体，从而形成设计聚合物。在一个方面，将双链设计聚合物转化成单链分子。单链设计聚合物与适当的分子信标杂交，其中每个分子信标包含一个或多个信号分子和一个或多个淬灭分子。
在本发明的一个方面，设计聚合物仅包含2组设计单体：(1)一组设计单体编码″0″，且(2)另一组设计单体编码″1″。在本发明的一个特定方面，仅使用2组分子信标。一组分子信标与代表″0″的设计单体杂交，而第二组分子信标与代表″1″的设计单体杂交。在一个方面，两组分子信标包含独特的信号分子，使得与″0″设计单体杂交的分子信标具有不同于与″1″设计单体杂交的分子信标的信号分子。分子信标与设计聚合物的单个设计单体的杂交，形成信标-设计聚合物复合物(或简称″BDP复合物″)。
在本发明的一个方面，分子信标包含合适的荧光团作为信号分子。在另一个方面，分子信标不仅包含荧光团，还包含淬灭剂。在一个特定的方面，荧光团位于信标的5′端，而淬灭剂位于它的3′端。
本发明的方法采用双螺旋核酸的电驱动解链。通过使用电驱动的纳米孔解链方法，可以维持对解链时间的控制，允许使用例如自淬灭的荧光探针，例如广泛使用的分子信标。有利地，可以使用不同的测量方案，其中淬灭荧光探针，直到通过解链事件设定的它们的读出时刻。
本发明的一个实施方案指向纳米孔系统。在一个方面，纳米孔包含α-溶血素。可以使用本发明的纳米孔，得到多核苷酸的序列信息。可以将BDP复合物引入本发明的纳米孔。在一个方面，存在引入本发明的纳米孔的(BDP复合物的)设计聚合物的3′突出。该3′突出序列可以穿过纳米孔，直到BDP复合物的双链部分与入口孔对合。纳米孔的尺寸是这样的，仅仅单链多核苷酸可以穿过，从而使双链BDP复合物不能进入。可以将电压应用于纳米孔两端，以解链双链BDP复合物。双链的这种解链，有助于从设计聚合物去除分子信标，从而允许信号分子(例如，荧光团)发出它的信号，例如发光。另外，解链允许单链设计聚合物进入和通过纳米孔。可以通过合适的检测器检测信号。适当的时间后，释放的分子信标会自杂交，从而淬灭它自己的信号。
这是一个反覆的过程，施加的电压继续使解链的单链设计聚合物转移通过孔，直到单链设计聚合物的下一部分完全通过，由此发出来自序列中的下一个分子信标的后续信号，由合适的检测器记录另一个信号，然后当从BDP复合物释放时自淬灭。以此方式，可以读出整个设计聚合物。
本发明还涉及可以用于单分子检测的光学系统。该光学系统可以与一个或多个纳米孔系统联合使用。本光学系统包含定制的流动单元，后者具有纳米孔支持物和2个电极。电极用于施加解链过程所需的电场，而支持物能实现玻璃盖玻片附近的磷脂双层的悬浮，从而能使用高倍显微镜物镜对该双层成像。流动单元固定在倒置显微镜的XYZ纳米定位器上，且可以使用平移台移动，以与光轴精确对准。
在下面对某些实施方案的描述中，参考形成本文的一部分的附图，且其中借助对可以实践本发明的特定实施方案的解释进行显示。应当理解，可以使用其它实施方案，且可以进行结构变化，而不脱离本发明的范围。应当理解，在任何结构的情况下，这些图有些简化，因为它们没有显示所绘结构的所有常规细节，而仅仅显示相关元件。另外，尽管在这里显示了特定实施方案，这无意进行限制。
附图简述
图1是目标多核苷酸向设计聚合物的转化的图示，其中：(a)是目标多核苷酸，(b)是分离的目标部分，且(c)是得到的设计聚合物；
图2是参与目标多核苷酸向设计聚合物的转化的循环的图示，其中：(a)是2个设计单体，(b)是设计聚合物，且(c)解释了参与转化目标的循环。
图3是分子信标的图示，其中：(a)是信标的线性化表示，且(b)表示自杂交的信标；
图4是信标-设计聚合物复合物的图示；
图5是信标-设计聚合物与纳米孔的转移过程的图示，其中：(a)显示了参与该转移过程的初始步骤，且(b)解释了该过程的后期阶段；
图6中的图显示了使用主动控制解链10b p发夹DNA的结果，其中：(a)显示了施加的电压和时间(以毫秒计)的关系，且(b)显示了测得的通过孔的离子电流；
图7描述了(A)、(B)、(C)和(D)所示的4个不同的步骤，其发生在样品多核苷酸的典型分析中，其中：上图显示了设计聚合物转移进入和通过纳米孔系统的示意图，中图描绘了光子计数/ms和时间的关系，下图描绘了记录的电压。
图8是与纳米孔系统联合使用的光学系统的示意图；
图9是图8所示的光学系统的放大部分；
图10是制配在特氟隆薄膜中的约30μm孔的SEM图像；
图11中的图显示了以恒定力进行的典型解链事件的前几毫秒(ms)。其中上图显示了施加在孔两端的有控制的电压，而下图显示了由施加的电压引起的孔电流。在t＝0时，DNA进入孔内；
图12中的直方图显示了在V＝120mV和15℃测得的单链DNA(聚(dA)90)的转移时间分布。从约1,500个单个的事件，构建直方图。tT＞tP＝0.5ms(最可能的转移时间)后，通过单指数拟合分布，时间常数0.32ms。
图13中的图显示了恒定电压实验的典型解链事件。上图显示了施加的电压模式，下图是得到的孔电流，而插图显示了在t＝5ms从约1000个独立的解链事件测得的孔电流的典型分布。
图14中的图显示了对于HP1的不同解链电压水平，解链可能性P解链作为t的函数。使用的电压水平：(圆圈)30mV，(正方形)60mV，(三角形)90mV，(倒三角形)120mV和(菱形)150mV；
图15中的图描绘了HP1(实心圆圈)、HP2(三角形)和HP3(正方形)τυ对解链电压Vυ的依赖性。从P解链的指数拟合得到的特征时间量程(图4)作为VU的函数；
图16中的图显示了在4.5V/s的恒定加载速度下进行的恒定加载速度下的典型解链事件，其中上图显示了在时间t＝0时施加的电压，它表示DNA进入孔的触发，而下图显示了在控制的电压变动(ramp)过程中的孔电流；且
图17中的图显示了约1500个解链事件的集合(象在图6中)可以用于得到VU的分布和最可能的解链电压VC。主图：HP1(实心圆圈)HP2(三角形)和HP3(正方形)的作为变动V&函数的VC的半对数图。
详细描述
本发明指向分析聚合物分子的方法。这些方法用于以单分子灵敏度高处理量读出DNA和RNA分子。本发明的方法包括：(1)DNA(或RNA)双链的电控制的解链，(2)使用一种或多种分子信号检测，读出分子的身份(或密码)，和(3)借助于核酸和杂交探针之间的分子相互作用，有控制地减缓纳米孔穿线过程(例如，强相互作用探针会导致转移速度的进一步降低)。
本文描述了两种单分子检测方法的使用：(1)纳米孔检测，和(2)单分子信号探测，例如荧光探测。使用施加于纳米孔的电场的主动控制，可以解链双链多核苷酸，例如双螺旋DNA。双链多核苷酸的这种解链会产生可以通过纳米孔通道的单链元件，而双链部分被不能进入。多核苷酸的单链元件的进入因而有助于它的分析，例如得到序列信息。
本发明的方法包含目标多核苷酸分子向二进制码设计聚合物的转化。目标多核苷酸可以从任何来源得到。在一个方面，目标多核苷酸可以是双链多核苷酸分子，例如双螺旋DNA。其它多核苷酸也在本发明的范围内，包括但不限于RNA和PNA分子。目标多核苷酸可以是单链的。目标分子可以包含天然的和修饰的核苷酸碱基。靶物可以是任何来源。例如，靶物可以是cDNA或gDNA或用于编码超高密度格式的任何信息的人造(合成的)序列。目标多核苷酸可以是部分地或完全地合成的。靶物可以包含天然来源(包括植物和动物)的核苷酸。目标多核苷酸可以是任何长度。例如，大小范围可以从约10个核苷酸碱基至约10万或更多个核苷酸碱基。
参考图1，得到目标多核苷酸10(图1a)。将该目标多核苷酸10进行生化转化。参见，Lexow的美国专利号6,723,513，其所有教导在本文中引作参考。例如，为了说明目的，已经从目标多核苷酸分离了3个核苷酸(图1b)。这3个核苷酸是″G″、″T″和″A″(分别是鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤)。将仅使用这3个核苷酸描述转化过程。
在该转化过程中，使用″1″和″0″，通过二进制码表示每个核苷酸。所以，例如，鸟嘌呤(G)可以用二进制码″1+0″表示，胸腺嘧啶(T)可以表示为″1+1″，腺嘌呤(A)可以表示为″0+0″，和胞嘧啶(C)可以表示为″0+1″。二进制码的″1″和″0″由它们自己的独特的多核苷酸(称作″设计单体″12)表示。参见，图1b。图1b提供了这样的设计单体12的实例。图1b描绘了″0″的设计单体12′和″1″的设计单体12″(设计单体的准确多核苷酸序列可以由操作人员确定)。因此，由于设计聚合物12包含二进制码，存在2个设计单体12′和12″，它们各自代表着″1″或″0″，但不同时代表″1″和″0″。
在图1提供的实施例中，有″0″的设计单体12′和″1″的设计单体12″。由于每个核苷酸用二进制码表示，要求每个核苷酸用2个设计单体表示。例如，鸟嘌呤用二进制码″1+0″表示，因此，鸟嘌呤表示为″1″的设计单体12″和″0″的设计单体12′。但是，设计单体必须以适当的顺序，以便反映它们代表的特定核苷酸。因此对于鸟嘌呤，设计单体12″″1″后面必须是设计单体12′″0″(使用5′-＞3′的常规作图排布)。
设计聚合物14包含以特定顺序排列的设计单体12′和12″。参见，图1c。设计聚合物14的序列反映了原始目标多核苷酸10的核苷酸序列，因为设计单体12′和12″以与在原始目标多核苷酸10中的其同源核苷酸相同的顺序从5′至3′排列。
对于整个多核苷酸分子，可以重复图1所示的过程。为了方便，可以操纵目标多核苷酸的大小，但是，原理是相同的。
本发明的设计单体包含多核苷酸分子。可以改变设计单体的大小。在一个方面，设计单体的大小范围可从约十(10)个核苷酸至约一百(100)个核苷酸。在另一个方面，设计单体是双链多核苷酸。多核苷酸可以是DNA，RNA或PNA。设计单体的核苷酸组分可以是天然的、修饰的或其组合。它们可以选自腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶，其修饰形式等。基于给定方案的参数，操作人员可以构建设计单体。关键是，应当构建至少2个不同的设计单体，以便实现本发明的二进制码特征。
本发明的设计聚合物包含多个设计单体。设计聚合物代表生化转化的目标多核苷酸。设计聚合物和原始目标多核苷酸之间的关系是这样的，操作人员可以仅使用设计聚合物确定原始目标多核苷酸的核苷酸序列。将设计聚合物的设计单体连接到一起，例如，共价连接，形成多核苷酸分子。同样，连接设计单体的顺序是这样的，它们的连接顺序反映了靶物中的核苷酸的原始顺序。
杂合体系统也在本发明的范围内。例如，如果目标多核苷酸是RNA分子，用于构建二进制码的设计单体可以包含脱氧核糖核苷酸。反之同样有效。如果操作人员需要，可以有杂合体构建体。例如，设计单体可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的杂合体。各种杂合体排列变换都在本发明的范围内。
参考图2，可以根据上述方法，加工多核苷酸和寡核苷酸(仅仅大小不同)。图1所述的方法可以是反覆的过程，从而允许寡聚体经历向设计聚合物的转化。图2描绘了这样的方案。对于该实施例，使用21个碱基对的寡聚体16来解释该方法。不同大小的寡聚体在本发明的范围内。例如，可以加工从约10个核苷酸至约5000个核苷酸的寡核苷酸。如前所述，可以使用本领域的技术人员熟知的常规方法，消化相当大长度的多核苷酸，形成更短的寡核苷酸。
图2a描绘了2个设计单体，一个12′代表″0″，且另一个12″代表″1″。在仔细检查后，可以发现2个设计单体12′和12″包含不同的核苷酸序列。在该特定实施例中，每个设计单体包含10个碱基对。现在，这2个设计单体12′和12″可以用于通过二进制码表示目标核苷酸16序列。图2b解释了二进制码分配，图2b还描绘了通过将设计单体12′和12″连接到一起形成的设计聚合物14。设计单体12′和12″的长度和序列是灵活的，这允许定制所得到的设计聚合物14。
图2c解释了靶物向设计聚合物的转化循环。目标多核苷酸16可以通过3个酶促步骤A，B，和C循环。在该图解中，每个循环转化3个目标碱基。在该图解中的目标多核苷酸16包含21个碱基对，因此，完全转化靶物需要共7个循环。在图2c中，在该图解中转化上链(粗体)。
酶促步骤A包含用至少2种IIs限制酶(例如NlaIII)消化靶物16，以便产生用于转化和设计聚合物连接的突出。本领域的技术人员容易认识到，使用本领域已知的其它限制酶，可以完成目标多核苷酸的消化。
步骤B是连接步骤，其中将二元设计聚合物序列特异性地结合到目标片段的3′端，所述目标片段在5′端具有对应序列。该步骤包含将目标片段分入单独的孔中，其中孔的数目与被转化的碱基的排列变换数相当(例如，3个碱基的转化需要64个孔)。在每个孔中，存在设计聚合物序列和与应在该特定孔中转化的序列相对应的特异性的适体(未显示)(即，存在设计聚合物向每个片段的3′端的非特异性结合，和适体向正确片段的5′端的特异性连接)。连接后，将孔合并到一个容器中。
步骤C是扩增步骤。进行聚合酶链式反应(PCR)步骤来扩增和选择已经成功地结合到设计聚合物和特异性的适体上的那些片段。
可以大量平行地进行该转化方法，其中在同一个反应中转化数十亿不同的目标分子。参见，美国专利号6,723,513。
一旦形成设计聚合物，将一个或多个信号分子与设计聚合物相结合。在一个方面，信号分子是分子信标。通过本领域的技术人员熟知的方式，得到单链设计聚合物。在适合杂交的条件(例如，通过在下述缓冲液中的缓慢温度淬灭：100mM KCl，1mM MgCl2，10mM Tris-Hcl，pH 8.0)下，将单链设计聚合物与分子信标相混合，形成信标-设计聚合物复合物(BDP复合物)。
图3示意地描绘了典型的分子信标18(参见，Tyagi S，Kramer FR.1996 Molecular beacons：Probes that fluoresce uponhybridization.Nature Biotech.14：303-8；Bonnet G，Tyagi S，Libchaber A，和Kramer FR.1999.Thermodynamic basis of theenhanced specificity of structured DNA probes.Proc.Natl.Acad.Sci.96：6171-76)。分子信标(或简称″信标″)是寡核苷酸，其在寡核苷酸的一个位置(例如，5′端)具有荧光团(″F″)20，且在寡核苷酸的另一个位置(例如，3′端)具有淬灭剂(″Q″)22。参见，图3a。如图3a所示，荧光团20可以发出荧光信号，因为它未受到淬灭剂22的妨碍。但是，因为具有互补的碱基，信标18的5′端和3′端可以自杂交。参见，图3b。当5′和3′端杂交或邻近时，淬灭剂22会淬灭荧光团20，从而阻止发出信号。
在本发明的方法中，使用至少2种不同的分子信标。一种分子信标会与代表″0″的设计单体杂交，而另一种分子信标会与代表″1″的设计单体杂交。与设计单体″0″杂交的分子信标包含不同于与设计单体″1″杂交的分子信标的信号，例如荧光团。例如，分子信标″0″(即，与设计单体″0″杂交的分子信标)可以具有荧光团″F0″，且分子信标″1″可以具有荧光团″F1″，二者发射不同的且可辨别的信号。
在一个方面，信标和设计单体之间的杂交百分比是约90％或更大。在另一个方面，信标与设计单体的杂交百分比是约80％至约90％。在另一个方面，信标与设计单体的杂交百分比是约70％至约80％。在另一个方面，信标与设计单体的杂交百分比是约60％至约70％。
图4描绘了用分子信标″M1″18″或″M0″18′杂交单链设计聚合物24，形成BDP复合物24。在该BDP复合物24中，M1分子信标18″与设计单体″1″12″杂交，而M0分子信标18′与设计单体″0″12′杂交。如图4所示，M1分子信标18″具有荧光团″F1″，而M0分子信标18′具有荧光团″F0″。这2种荧光团发射不同波长信号，例如，F1可以发射蓝光，而F0可以发射橙光。
因为本发明的方法包含目标多核苷酸向基于二进制码的聚合物(即，设计聚合物)的转化，本发明的方法只需要2种荧光团。一种荧光团代表二进制码″0″+″1″的″0″，且另一种荧光团代表″1″。本领域的技术人员会明白，可以使用与本文已经描述的内容一致的其它信号分子。
现在，可以将信标-设计聚合物复合物引入纳米孔系统。可以使用本发明的纳米孔系统，例如，蛋白通道例如细菌α-溶血素(α-HL)，来得到关于多核苷酸的长度和序列的信息，并检测不同分析物向孔的修饰部分的推测结合动力学。参见，Kasianowicz，J.等，1996，PNASUSA，93，13770-3；Akeson，M.，等，1999，Biophys.J.，77，3227-33；Meller，A.，等，2001，PNAS USA，97，1079-1084；和Meller，A.，等，2001，Phys.Rev.Lett，86，3435-38，其所有教导在本文中引作参考。在一个方面，多核苷酸是单链分子，例如单链设计聚合物。重要的是注意到可以使用多个纳米孔，从而允许分析许多设计聚合物，因此分析许多目标多核苷酸。在一个方面，在纳米孔系统中使用的孔的数目范围从5至约10。本领域的技术人员会明白，可以使用更多的孔。
纳米孔系统可以容纳设计聚合物，并基于给定的方案分析它们。纳米孔系统可以包含多种本领域熟知的装置(包括检测器)。纳米孔系统可以与分子(例如受体等)相偶联。
本领域的技术人员会明白，使用本领域熟知的方法，使用化学试剂(或肽)例如制霉菌素；离子载体例如A23187(卡西霉素)，ETH 5234，ETH 157(所有化学试剂都可从Fluka，Ronkonkoma，N.Y.得到)；肽通道例如丙甲菌素等，可以在脂双层中形成化学通道或孔。
在本发明的范围内的纳米孔系统包括在美国专利号5,795,782，美国专利号6,015,714，WO 01/81896Al，和WO 01/81908Al中描述的那些，其教导在本文中引作参考。
本发明的纳米孔系统可以具有孔分子，例如λ噬菌体(LamB)的受体或α-溶血素。用于纳米孔系统的装置包括：(a)离子传导孔或通道；(b)设计聚合物表征所必需的试剂；和(c)记录装置，用于检测随着设计聚合物进入孔和通过孔继续前进，跨孔的离子电导的变化。可以得到许多种其灵敏度足以进行本发明使用的测量的电子装置，且计算机采集速度和储存容量适合序列数据积累的快速速度。
其它孔形成蛋白包括短杆菌肽(例如，来自短芽孢杆菌的短杆菌肽A，B，C，D，或S；可从Fluka，Ronkonkoma，N.Y.得到)；缬氨霉素(来自极暗黄链霉菌；可从Fluka得到)，OmpF，OmpC，或PhoE(来自大肠杆菌、志贺氏菌属和其它肠杆菌科)，Tsx，F菌毛，和线粒体孔蛋白(VDAC)。
在本发明中使用的通道和孔可以改变(例如，最小孔径约2-9nm)。聚合物能从其中拉过的孔径可以是，例如，对于单链DNA，约0.5-2.0nm。
可以存在嵌入同一膜中的多个孔。嵌入同一膜中的许多孔(例如，纳米孔)的组合，或″纳米孔阵列″，本发明所述的光学读出平台能实现相当平行的信号读出。最近，研究人员已经证实，使用现有的ElectronMultiplying CCD照相机，他们可以以＞200帧/秒的帧速，实现256x256象素区域的读出。重要的是，已经证实，可以在该帧速分辨从单个荧光团发出的光。这表明，可以实现高度平行的读出。原则上，使用单个的CCD照相机，可以对制配在固态膜中的100x100孔的阵列成像。因而，与单个纳米孔处理量相比，读出处理量可以提高约4个量级。
人基因组含有约3x109碱基对。能实现快速且廉价的基因组测序的方法必须是高度平行的。在一个方面，本发明的500碱基/秒/纳米孔的读出速度，会在含有100x100孔的单个芯片中产生5x106核苷酸/秒的总读出。这总计将在约10分钟内单次读出整个人基因组，比现有方法提高了4-5个数量级。
改进的电压-门控通道也可以用于本发明(天然地或在去除失活的改进后)，且具有适合例如聚合酶结合(重组的融合蛋白)的物理参数，或具有适合聚合物通过的孔径。改变电压门控通道的失活特征的方法，是本领域熟知的(参见，例如，Pattern，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10905-09(1992)；West，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10910-14(1992)；Auld等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：323-27(1990)；Lopez，等，Neuron，7：327-36(1991)；Hoshi，等，Neuron，7：547-56(1991)；Hoshi，等，Science，250：533-38(1990)，其所有教导在本文中引作参考)。
在本方法的一个方面，纳米孔是α-HL。参见，美国专利号6,528,258，其所有教导在本文中引作参考。
α-HL孔由2个主要部分组成：约2.5nm直径的洞(″孔腔″)和约1.5nm直径的通道(″茎干″)，后者穿过细胞膜。双链多核苷酸域可以进入2.5nm孔腔部分，但是它们不能进入1.5nm通道(dsDNA的直径是约2.2nm)。近来已经证实，使用纳米孔，通过使发夹进入α-HL孔腔，并检测它们的热激活打开所需的时间，可以直接测量短平端DNA发夹(3至8个碱基对)的关闭-打开动力学。发夹的自发打开后，单链DNA进入1.5nm通道，造成短暂的(但是可辨认的)流过孔的离子电流的阻断，从而允许检测从发夹(或双链多核苷酸)进入到它的首次打开的时间间隔。
参考图5，将信标-设计聚合物复合物24′引入纳米孔系统26。如图所示，设计聚合物16″的单链28穿过纳米孔系统26的孔30。在一个方面，单链部分是设计聚合物16″的3′端。设计聚合物16″的单链28移动的驱动力，由跨纳米孔26建立的电场提供。通过使用2个电极，施加电场，并用于″解链″双链信标-设计聚合物复合物24′。该电场也提供供所得到的单链设计聚合物16″进入纳米孔的驱动力。随着解链的发生，分子信标部分32、34在系统26本身的通道30处或附近脱离它们与设计聚合物16″的相互作用。随着第一个前导信标从BDP复合物24′去除，随后的荧光团从第一个信标的淬灭剂释放，从而该荧光团可以发光，并被适当的检测器检测到。例如，图5中的分子信标32具有淬灭剂22″，它会淬灭位于分子信标34上的荧光团F2 20″的信号。当第一个分子信标32被解链并从B-D复合物去除时，荧光团F2 20″会免受淬灭剂22″的影响，从而它可以发出它的信号。参见，图5b。第一个分子信标32会自杂交，因此它的淬灭剂22″部分会淬灭它的荧光团F1 20′。该自淬灭机理会使背景噪音最小化。可以重复该过程，直到已经分析完整个设计聚合物16″。
总之，当施加电压变动来从设计聚合物解链(或融解)杂交的信标时，同时检测和记录(与设计聚合物)杂交的分子信标的最前面的荧光团。如上面所讨论的，在电压变动开始后大约10ms，发生解链，提供足够记录荧光团的时间。解链导致第一个信标的释放和与设计聚合物杂交的下一个荧光团的立即暴露(解淬灭)。释放的信标会立即自杂交，自淬灭它自己的荧光团。检测到(两种颜色中的任一种的)荧光强度的变化，并触发下一次电压变动的应用。重复该循环，直到读出整个设计聚合物。在一个方面，设计聚合物具有发夹。最终的发夹置于设计聚合物的5′端，以迫使分子仅以一个方向(即，单链3′端)进入纳米孔系统。完成设计聚合物进入和通过纳米孔系统的转移后，光学系统(在下面讨论)会感知到聚合物读出已经结束(即DNA穿过了孔)，此时离子电流升高到开孔水平。
使用α-HL孔，已经证实了DNA的更长双链螺旋域(50bp)的力-诱导的解链。参见，Sauer-Budge，A.F.，等，2003，Phys.Rev.Lett.，90，238101，其所有教导在本文中引作参考。发现分子的特征通过时间，这包括单链通过孔滑动加上它们的解链时间，遵循对施加的电压(范围为140-180mV)的指数依赖性。因而，在本发明中施加用于解链信标的电压，可以用作灵敏的控制参数，以确定(沿着DNA的连续信标的)每个解链步骤之间的时间延迟。我们最近的数据详细说明了这一点(图10-15)。
电压控制的解链记载在Biophysical Journal：Mathe J.等.2004 Biophys.J.87，3205-12，其所有教导在本文中引作参考。该文章证实，与长互补单链DNA杂交的短寡核苷酸(约10个碱基)，可以以电压控制的方式在纳米孔内解链，且解链过程的特征时间尺度强烈依赖于电压，而且，可以选择在1-10ms的范围内。该时间尺度是非常重要的，它证实：(a)可以调节DNA在孔中的转移速度，更具体地，通过DNA探针的解链，可以使它减速。转移减速的量，指数式地依赖于DNA和杂交的探针之间的相互作用强度以及施加的电压。因而，通过选择探针的序列，可以实现不同水平的“减速”。还证实，施加的电压可以用于调节解链，从而调节转移速度。DNA转移的减速已经成为该领域长期存在的问题；和(b)研究人员能将转移减速到与单个荧光团光学检测相容的速度范围(0.1-50ms/碱基)。没有该减速，光子噪音会在读出中占优势，其中使用现有的技术不能实现单个荧光团读出。
根据本发明使用的光学试剂包含，例如，当与淬灭剂分子邻近时会被淬灭的荧光分子。可以得到描述荧光和表现出该行为以及这些化合物的特定性质(例如，荧光衰减时间，吸收光谱，发射光谱，耐光性，和量子效率)的其它类型的化合物的广泛文献(参见，例如，Gilbert等，Essentials of Molecular Photochemistry，CRC Press，1991；Laxowicz，JR，Principles of Fluorescence Spectroscopy(第2版)，Kluwer academic 1999；其所有教导在本文中引作参考)。可以得到荧光淬灭的详细描述，例如，Kavarno s等，Chem.Rev.86：401，1986；Wagoner，Methods Enzymol.246：362，1995；Millar，Curr.Opin.Struct.Biol.6：637，1996；Petit等，Biol.Cell 78：1，1993；其所有教导在本文中引作参考。
近年来，单个荧光分子的检测已经取得很多进展(参见，例如，Mathis等.，Bioimaging 5：116-128，1997；Ha等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：6264-6268，June 1996；Goodwin等，Ace.Chem.Res.29：607，1996；Muller等.，Chem.Phy s.Lett.262：716，1996；Sauer等，Chem.Phys.Lett.254：223，1996；其整个教导在本文中引作参考)。这样的分子具有对分子的电环境敏感的特征荧光衰减时间，因此可以通过与改变环境的聚合物的结合来淬灭。
可以用于本发明的荧光团的实例包括TMR和Cy5。可以使用的其它类型的荧光分子是CPM，来自Molecular Probes，Inc.的Alexa系列荧光标记，罗丹明家族，和德克萨斯红。本领域的技术人员已知的其它信号分子也在本发明的范围内。在本发明中可以使用许多其它荧光团，包括在美国专利号6,528,258中列出的那些，其所有教导在本文中引作参考。
可以在本发明中使用的淬灭分子包括Dabcyl，Dabsyl，甲基红和Elle淬灭剂TM。本领域的技术人员已知的其它淬灭剂分子也在本发明的范围内。
在本发明中使用的检测系统取决于使用的光学试剂。检测系统必须能以与本文所述的测序方法有关的时间尺度，检测光学试剂的光学性质的变化。在一个方面，使用荧光团作为光学试剂。因此，合适的荧光检测器是适当的。本领域的技术人员熟知荧光检测器。
参考图6，图(a)显示了施加的电压和时间(以毫秒计)的关系。在对随着单链多核苷酸进入孔，流过单个纳米孔通道的离子电流的实时分析中，触发纳米孔系统的电压变动。在单链多核苷酸进入纳米孔后约0.1ms(如孔电流的突然下降所指示的)，电压降低至″保持″水平，然后它以恒定速度增加。图6b显示了测得的通过孔的离子电流。分子的单链部分进入通道后，孔电流降低至它的封闭水平(开孔电流的约10％，或约10pA)。当电压变动开始时，电流最初停留在它的封闭水平，但是在t约10ms时，电流突然升高至开孔水平，因为双链多核苷酸解链，并迅速穿过孔(孔的穿过持续小于0.05ms)。可以容易地测量解链电压(虚线)。
参考图7，显示了(A)、(B)、(C)和(D)所示的4个不同的步骤，它们发生在样品多核苷酸的典型分析中。可以重复这些步骤，直到完成测序。上图描绘了BDP复合物24″进入和转换通过纳米孔通道30。中图描绘了光子计数/ms和时间的关系。下图描绘了记录的电压。
在步骤(A)，当设计聚合物28′的单链突出随着电场的牵引进入孔30′时，开始读出。由设计聚合物28′的进入导致的流过孔30′的离子电流的突然降低，通过下述方式触发读出：1)使电压从″驱动″水平降低至″保持″水平，并开始第一次电压变动；和2)接通例如用于荧光分析的激光。因为与设计聚合物杂交的第一个信标未被淬灭，会立即产生它的相应荧光水平的升高(显示为中图的光痕迹)。注意到，典型的解链时间是约10ms。在该时刻，从第一个未淬灭的荧光团发出的光子会被适当的检测器记录下来。
在第一个信标32′被解链后，立即开始步骤(B)。分子信标32′的解链会允许单链设计聚合物16″′进一步移动进纳米孔26内。该解链过程通过释放分子信标，导致随后的荧光团解除淬灭。由于热力学力，释放的信标会自动地自杂交，因而信标自己的荧光团会被淬灭。自杂交的信标最终扩散开。有利地，该特征会有助于避免背景噪音或使其最小化。得到的荧光信号(中图)表现出与荧光团34相对应的红色(深色)发射的增加，和与分子信标32′的丢失和自杂交相对应的橙色(浅色)发射的减少。由于信标进行自淬灭的有限时间，第一个信标32′的淬灭中存在小(约50μs)的延迟。在这小的延迟时间中，存在来自荧光团32′和34的荧光强度，其可以用于定位转换，用于触发电压变动。
在步骤(C)中，存在与第一个信标32′类似的读出，如更浅线所示。注意到，在步骤(C)和(D)之间(读出相同类型的两个信标时)，存在橙色强度的尖峰(浅灰色)。这是因为如上所述的两个荧光团的贡献。以此方式，系统会读出整个设计聚合物。为了阻止设计聚合物16″′从它的5′(而不是3′)进入孔，可以在设计聚合物16″′的转化过程中，添加7个碱基的发夹26。该发夹26最终被解链，允许设计聚合物16″′完全转移进纳米孔系统26的内部或其孔腔中。
本发明还涉及用于确定多核苷酸的序列的装置。本文描述了光学系统300，其用于检测来自在膜嵌入的纳米孔内穿过的单个DNA分子的荧光信号。
图8是可以与本发明的测序方法联合使用的光学系统300的示意图，其中系统300包含检测光学信号所需的元件。更具体地，图8解释了使用一个或多个双分子层膜，光学检测单分子的光学装备。
本发明的光学系统300包含定制的流动单元(flow cell)302，后者包含纳米孔支持物304和2个电极306和308。电极306和308用于施加解链过程所需的电场，而支持物304能实现玻璃盖玻片312附近的磷脂双层310的悬浮，从而能使用高倍显微镜物镜314对双分子层310成像。流动单元302固定在定制的倒置显微镜的XYZ纳米定位器316中，且可以使用平移台移动，以与光轴208精确对准。
从二极管激光器318发出进入光学系统300的光可以激发荧光团。激光器318可以是532nm固态激光器(例如，New Focus3951-20或Point Source iFLEX 2000)，且连有单模式、保持极化的光学纤维320。通过镜子321引导激光束，并使用自制可调节的射束放大器(5x)322放大，并使用镜子324和326和二色镜328(Chroma z532 rdc)，引向物镜314的背光圈(aperture)。
激光束在物镜314的焦点处稍微放大，以允许更大的照明区域。通过使入射放大激光束在显微镜物镜314的入口处稍微散开，实现光束的放大。通过使射束放大器322上的镜头之一相对于另一个移动，使光束在物镜314的焦点处轻微散焦，并实现更大的照明区域(约10μm)。使用相同的物镜314，收集荧光发射，并使用长通道滤光器330(Chroma hq560 lp)过滤。然后，通过支架转移背部照明的冷却的CCD照相机332，或通过首先将光线聚焦到针孔334上，并使针孔成像到用于快速检测的2个雪崩光电二极管点检测器336和338(PerkinElmer SPCM AQR-14)上，使光线成像。光学系统300(不包括激发和发射路径)完全包含在屏蔽的铜盒(未显示)中，以减少电磁噪音拾波。通过使用CCD照相机332，可以使几个孔同时成像，从而倍增检测系统300的处理量。
使用仪器控制和数据获取软件来控制单个分子的自动定位和成像，并用于实时纳米孔力光谱学。荧光和电流数据获取的主触发器是进入纳米孔302的单个分子的封闭的电流信号。硬件电子设备包含3个PC板：用于与PZT控制器接口的快速的数字I/O(PhysikInstrumente PI-E710)，光子计数器板(National InstrumentsPCI-6602)，和快速的A/D板(例如，National InstrumentsPCI-6052E)，后者对离子电流取样，并生成跨孔的可编程的电压梯度。
仪器包含定制的微流体单元，后者用于水平地支持约20μm磷脂双层，并更换缓冲溶液。参考图9，描述了微流体单元402，其包括：(a)石英基片404，(b)定制的聚四氟乙烯(PTFE)膜406，(c)由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的室408，(d)外壳410，和(e)电极412和414。通过机械刻印，将20-30μm光圈(aperture)416制配在PTFE膜406中。插图416解释了膜418和含有RNA分子422的α-HL孔420，其中膜418由光圈(aperture)416支持。
图10显示了制配在PTFE膜406中的约30μm光圈416的SEM图像。膜418悬浮在12μm厚特氟隆膜406内的圆形光圈416中，在玻璃盖玻片424上面约100μm。这能使用60x/1.2N.A.水浸显微镜物镜426(Olympus UPLAPO60XW)，实现膜418的高分辨率荧光成像。这不同于使用油浸的现有设计。使用水浸物镜426(高NA)而不是油浸物镜，会提供更长的工作距离(约250μm)。特氟隆膜406隔开两个小室428和430(各自约50μl)，通过特殊的管道，可以进入它们进行流体更换。2个Ag/Ag-Cl电极412和414与流体室428和430接触，并连接到用于施加跨膜电压的高分辨率膜片箝头段放大器(未显示)(例如Axon Instruments 200U)。
返回图9，使用文献所述的方法(参见，例如，Meller，A.，等.(2000)Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A.97，1079-1084；Meller，A.，等.(2001)Phys.Rev.Lett.86，3435-3438，都引作参考)，将纳米孔(例如，α-HL孔420)嵌入膜418，并使用膜片箝放大器测量流过孔420的离子电流，并实时分析。如上所述，单元402固定在XYZ纳米定位器(例如，Polytec PI-P527.3CL)上，以允许在物镜的视野内精确对准单元402和纳米孔420，并基于对信号的实时分析，侧面地跟踪荧光标记的纳米孔420。
存在至少两种在本发明的范围内的不同的膜单元实施方案。通过将特氟隆膜嵌入定制的具有上流体室和下流体室的PDMS衬垫中，可以制备膜单元。PDMS衬垫容纳在支持塑料帽中。单元是约25mm宽和约3mm厚。它包括可使用管道进入的下室(约10μl)。下室的Ag/AgCl电极和特氟隆膜嵌入PDMS衬垫。单元从底面覆盖着玻璃盖玻片，透过它可以成像。
或者，膜单元可以由2个同心圆筒(上室和下室)组成，它们可以彼此相对地滑动几微米。在上室的底面，通过加热熔合特氟隆膜。上室可以在下室内自由地下滑，直到特氟隆膜靠近盖玻片，且可以用显微镜从下面显像。使用用于支持脂双层的特氟隆膜，可以制配约20μm圆形光圈。下室是约20mm宽的室(6mm高)，并支持着置于它的底面上的薄玻璃盖玻片。该单元连接到流体管道和2个电极。
本发明的一个实施方案指向确定给定的样品基质中的聚合物的数目或量。例如，聚合物可以是多核苷酸。在一个方面，预定的聚合物推定地存在于样品中。在这方面，已知该序列的至少某些部分。该部分的范围可以从约5至约50个或更多个核苷酸。使用本发明的方法，可以设计用于与目标多核苷酸杂交的设计单体，且使用本文所述的纳米孔系统，可以检测和测量目标多核苷酸。
本发明的另一个实施方案指向检测样品基质中的多核苷酸。可以构建对预定的核苷酸序列特异性的设计单体。可以将这些设计单体引入含有多核苷酸的样品中。样品可以是异源的或同源的样品。在本领域的技术人员熟知的适合杂交的条件下，将设计单体引入样品中。然后可以使用本发明的方法，分离和/或加工与预定的设计单体杂交的那些多核苷酸。
通过本发明的方法，可以实现对特定多核苷酸序列的检测。例如，在PCR中使用的聚合酶的保真度不是100％，因此必须监测使用PCR产生的多核苷酸的序列保真度。使用本文所述的方法，操作人员可以验证聚合酶和整个PCR过程的保真度。可以构建预定的设计单体，反映目标多核苷酸的一部分，形成可以随后使用本方法测序的设计聚合物。
一个实施方案指向检测给定的多核苷酸序列中的单个或多个突变。假定目标序列部分地或整个地已知，可以构建设计单体，从而可完成多核苷酸序列的检查。可以在适合杂交的条件下，将设计单体引入具有推定目标多核苷酸的样品基质中，形成设计聚合物。然后，可以对该构建体进行本发明的测序方法。突变可以反映为一个或多个设计单体错配。
本发明的一个实施方案指向信息储存。鉴于本发明对任何多核苷酸序列使用二进制码，可以仅使用二进制码储存核苷酸序列。在一个方面，可以设计编码数字(″0″和″1″)序列的设计聚合物，正如计算机文件一样。在某种意义上，可以将DNA视作静态的、超密的储存介质。本发明的纳米孔系统是取出(读出)序列中编码的信息的有效工具。
本领域的技术人员应当理解，本文所述的方法具有许多实践应用，它们不脱离本发明的范围。
实施例：使用α-HL，纳米孔解链单个DNA发夹分子
为了实现用时间依赖性的电场(例如用测序方法)进行纳米孔测量，已经开发了解链方法。本解链方法使用高电压来优化进入孔的速度，而解链电压保持可变。从而，可以在短时间段(几分钟)内探测数百个单独的分子。该方法允许操作人员在多核苷酸通过的过程中快速地改变跨纳米孔施加的电场。
该解链方法可特别有利地用于研究单个DNA发夹分子的解链动力学，经30mV至150mV的宽电压范围，以不同的加载速度(0.5V/s-100V/s)。而且，该方法允许动态力测量，其中施加恒定加载速度而不是恒定力。这两种互补的测量，允许DNA发夹的微小焓变化分辨低至1kcal/mol。
DNA发夹的纳米孔解链过程中，存在3个连续的步骤：(A)单链DNA突出(50nt)的进入和滑动，直到双链(螺旋)部分自己进入α-HL的2.5nm孔腔；(B)螺旋部分的解链；和(C)解链的单链部分通过孔的转移。
参考图11-17，表征了这些步骤，以便分辨它们在不同电压的典型时间尺度。通过使用主动电压控制方法，可以将突出进入(A部分)与其它步骤解偶联，解开的链的转移时间(C部分)远远短于典型的解链时间，因而可以忽略。
首先，通过证实解链10bp发夹的典型时间尺度实质上比ssDNA的穿过时间长，实验表征了随着电压而变化的与单链DMA(″ssDNA″)穿过孔有关的时间尺度。接着，显示了30-150mV范围内的稳定(或阶跃函数)电压的解链动力学信息，以确定孔内的DNA链上的有效电荷。最后，实验证实了解链动力学对加载速度的依赖性。使用与为其它单个分子(″SM″)解结合实验开发的模型相类似的简单理论模型，解释了数据。
材料和方法
将PAGE-纯化的ssDNA和DNA发夹(Burogentec，San Diego，CA)缓冲在10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.5溶液中，且在测量之前，加热到75℃10分钟，然后冷浸至4℃。发夹分子由3′单链突出(50聚体聚-dA)和10碱基对螺旋部分组成，后者含有间插的6碱基环，其具有下面的序列(自互补的部分标有下划线)：
HP1：5′-GCTCTGTTGCTCTCTCGCAACAGAGC(A)50；(SEQ ID NO.1)
另外，还制备了在从5′端起第5个碱基具有单个(TT)错配的类似发夹(HP2)，其具有下面的序列：
HP2：5′-GCTCTGTTGCTCTCTCGCAACTGAGC(A)50；(SEQ ID NO.2)
以及7碱基对螺旋发夹(HP3)，其具有下面的序列：
HP3：5′-GTCGAACTTTTGTTCGAC(A)50；(SEQ ID NO.3)
(用于重构在水平支持的平面脂双层中的α-HL通道的基本装置和实验方法如上所述。)使用定制的单元设计，将系统的温度维持在15.0±0.1℃。缓冲溶液是1M KCl，10mM Tris-Hcl，pH8.5。在这些条件下，α-HL开孔电导率是正向偏压0.82pS。使用膜片箝放大器(Axopatch 200B，Axon Instruments，Union City，CA)测量离子电流，使用100kHz低通4-极Butterworth滤波器(Krohn Hite3302，Avon，MA)过滤信号。使用DAQ标度盘，以1MHz/22比特将信号数字化。使用National Instruments′LabView，编写所有控制和获取软件。装置配备有反馈回路，用于控制施加的跨膜电压。膜电势对控制电压的步长的反应时间是4±1μs。在(在电压或电压变动设定的给定条件下进行的)每个实验中，典型地收集1,000个解链事件的数据。软件和硬件组合允许高处理量的自动数据获取，所以每个实验的总获取时间是约10分钟。
每个解链事件由三部分组成：1)单链突出穿过和滑动，直到螺旋部分进入α-HL的孔腔内部；2)在低电压，将发夹维持在孔内部；和3)双链DNA的解链。
第一和第二部分被设计用于制备第三部分的系统，所以解链总是在分子相对于孔的特定的构型开始。
如同任何单分子实验，分子或事件之间的变异是不可避免的。存在一组控制测量(下面描述)，且重复解链实验多次，以便减少数据分散。解链部分由2种类型的测量组成：在稳定力下的解链，和以固定的加载速度的解链。在“结果”部分描述了这些实验。
在所有实验中，为前两个部分(滑动和维持)选择的电压和时间不变。图11显示在恒定力下进行的典型解链事件的前几毫秒(ms)。上图显示了施加的随时间而变化的电压，下图是得到的孔电流。该事件从单链聚(dA)端在孔内穿过开始。通过开孔电流的突然降低，检测到多核苷酸进入通道，这引起获取系统的触发，并定义t＝0点(虚线)。在V＝220mV，分子被拉入通道持续时间td＝300μs。选择该时间略微大于40聚体DNA的最可能的转移时间tp，如结果所示。因此，在t＝td，预期大多数DNA发夹会完全进入α-HL孔腔。该假说得到两个独立的补充测量的证实：在第一个实验中，td变化从50至700μs，并基于在t＝td时电压向V＝-120mV的反转，测量逃脱时间的分布。对于td值为50至300μs，要从孔拉开分子需要的典型时间存在单调的增加。但是，对于td＞300μs，曲线饱和至恒定水平，表明DNA的单链突出穿过通道，然后在双链螺旋部分进入孔腔时停止。其它证据来自td过程中封闭的离子电流水平的分析。更具体地，平均电流(对于td＝300μs)表现出两个清楚的峰值：在约6pA处的主要低电流峰，和在正常的聚(dA)封闭水平(约11pA)的第二个峰。低电流峰归因于占据α-HL孔腔的发夹的螺旋部分对孔的额外封闭。
在t＝td＝300μs时，解链的发夹的分数非常少。通过测量在V＝120mV时发夹分子的转移可能性分布，定量该分数(未显示数据)。从该分布估计出，在t＝td＝300μs时，解链的发夹的分数小于0.5％。DNA开始滑动后，在t＝td，将电压降低至低″维持″电势(20mV)持续时间tH＝500μs。发现该电压大得足以将发夹维持在孔腔内，但是太小而不能诱发显著的解链，如下面显示的数据所证实的。为了方便，选择500μs(在分开组的实验中，将发夹维持在孔中长达5秒)。在维持阶段的末尾时，施加解链电压Vυ(或加载速度)V＝dV/dt。
结果
ssDNA的转移时间分布
将每个单个的DNA的转移时间(tT)定义为，从DNA分子的前几个碱基进入α-HL孔的通道部分的内部至该分子从该通道的另一侧离开的时间间隔。通过流过孔的离子电流突然降低至开孔电流的约10％，可以清楚地观察到这些事件。在发夹的情况下，仅DNA的单链3′突出可以进入通道，因为在它的另一端的环太大，不能进入孔。在该情况下，tT是上述的3个连续过程的总和，即tT＝ts1+t解链+ts2，其中ts1是单链突出(聚(dA)50)的滑动时间，ts2是解链的发夹+环(26个碱基)的滑动时间，且t解链是解链时间。
图12显示在V＝120mV和15℃测得的单链DNA(聚(dA)90)的转移时间分布。从约1,500个单个的事件，构建直方图。ssDNA的分布显示了在tP＝0.5ms的突出峰，其用于表征该过程。tT＞tP＝0.5ms(最可能的转移时间)后，通过单指数拟合分布，时间常数为0.32ms。以前的研究证实，tP随碱基的数目线性升高(对于22-聚体和以上)。因此，从聚(dA)90的转移分布，可以估计出ts1～0.5ms x 50/90～0.28ms。注意到，该时间远远小于以类似方式测得的DNA发夹的特征tT(约2-10ms)(未显示数据)。然而，如下所述，可以从解链过程解偶联起始滑动，从而完全消除ts1。
从研究随V而变的聚(dA)的转移时间，可以估计ts2对解链过程的贡献。基于这些测量，估计对于26个核苷酸，ts2在30mV约660μs，且在150mV约100μs。可以从在每个事件中测得的总解链时间中减去随电压而变的ts2的估计值，得到更精确的t解链估计值。该修正较小(见下文)，且不会影响结果。
ts2的测量也会给出每个核苷酸的平均滑动时间的信息(例如，在100mV，6μs)。如下文所示，该时间尺度对于阐明孔内的解链机理是重要的。当发夹进入孔中时，它的解链动力学会受到重新成链和滑动过程之间的竞争的影响(解链的核苷酸可以重新结合发夹或沿着通道滑动，从而阻止重新成链)。如果滑动时间比重新成链时间短，会抑制重新成链。相反地，如果滑动时间长，发夹会在完全解链前经历许多打开-关闭转换。
1.在恒定力下的解链动力学
研究了在稳定电压(或力)下的DNA发夹的解链。将电压的突然变化施加于纳米孔，并测量解链动力学。在该实验中使用的典型电压和电流跟踪如图13所示。DNA在时间t＝0进入通道。如图10所解释的，短暂地将分子拉入并维持在孔中。在t＝0.8ms，施加解链电压(90mV)，但是封闭电流(低水平)，直到在t＝tU＝70ms发生解链，如电流的突然增加所指示的。应用解链电压Vυ后，电流轻微地升高到它的适当的封闭孔水平(参见图11对孔电流的放大)，并保持在该封闭水平，直到t约70ms(从应用解链电压起测量)。在该时刻，电流突然升高到与该电压相对应的开孔电流水平。由于解链的发夹的滑动时间太短，不能在图13的时间尺度上分辨，该转换指示着发夹的解链时刻。使用自动化的方法重复解链过程，其每分钟积累约100个单独的解链事件。
通过计算在时间间隔[0-t]中解链事件已经发生的可能性，分析数据，其中将t＝0定义为应用Vυ的时刻。为了该计算，获取约1000个解链事件，并绘制在以时间t为中心的50μs时间窗中测得的平均孔电流。电流的分布表现出分别与封闭孔和空孔状态有关的2个相当分离的峰(图13中的插图)。通过计算″空孔″(高电流)事件数与事件总数的比例，得到在时间t积累的解链可能性。使用的电压水平是：(圆圈)30mV，(正方形)60mV，(三角形)90mV，(倒三角形)220mV和(菱形)150mV。对不同的Vυ值(30，6O，90，220，和150mV)，重复上述的测量，并应用类似的分析方法。图14显示了说明随探测时间而变的解链11发夹的可能性的数据。对于每个探测时间，将P解链计算为在高电流峰下的事件的数目与事件的总数目的比例(参见图13中的插图)。在短时间(即t＜1ms)，解链可能性非常小，无论Vυ的幅度。在t约10ms，在小和大Vυ值下的解链可能性之间存在显著的差异。因为解链后紧跟着26核苷酸(单链)通过孔的转移，测量的解链时间包括2项：真实的解链时间和26-聚体的滑动时间(ts2)。通过如前所述估计ts2，校正测量。但是，因为校正远远小于解链时间(约1％)，它对结果具有非常小的影响。
通过单指数函数，拟合图14所示的解链可能性分布，产生在不同电压水平的特征解链时间τυ。在图15中，分别针对HP1(实心圆圈)、HP2(三角形)和HP 3(正方形)绘制了τυ对解链电压Vυ的依赖性。注意到，从直线拟合可以看出，τυ指数式地依赖于Vυ。从修改的Kramers速度模型，可以预期该依赖性：(24)τυ(Vυ)＝τ0e(-Vu/Vβ)，其中
Figure BDA00002035278300271
是0电压转换时间，Eb是发夹离解的能量屏障，且Vβ＝kBT/Qeff。图11中的直线斜率给出了Vβ＝22±2mV的单个值，其可以用于估计有效的DNA电荷Qeff≈1.13±0.1Oe。该电荷与跨α-HL通道的约22个核苷酸有关，因此，每个核苷酸的有效电荷是：1.13/12＝0.094e。从拟合与垂直轴相交的截距，可以推断τυ(O)(在0力时)的值。实验结果证实，HP1的τυ(O)＝2.1±0.2s，对HP2为1.2±0.1s，且对HP 3为0.34±0.05s。
2.在恒定加载速度下的解链动力学
利用主动控制方法，可以施加任意的时间-依赖性的电压V(t)，以测量键断裂的动力学。更具体地，典型地在恒定加载速度或变动
Figure BDA00002035278300273
下进行力光谱学测量。在下面的段落中，首先显示了对于任何给定的
Figure BDA00002035278300274
解链电压的预期分布的衍生结果，和临界电压(或最可能的解链电压)对的依赖性。分析遵循适合纳米孔情况的Evans和Ritchie的方法。结果对于大加载速度与该简化模型一致，但是在低速度偏离该模型。假定理想化的沿着施加的力的方向的1D能量分布，具有单一能量屏障。在平衡时(没有施加力)，将关闭的发夹状态表示为能量分布的深的最小值，通过能量屏障Eb与打开状态分开。为了使发夹解链，分子必须跨越该能量屏障。在有偏电压(或力)存在下，屏障降低，并根据τ(V)＝τ0e(-V/Vβ)修改Kramers时间(τ0)，其中τ0和Vβ如前面所定义。在这里，V＝V(t)是时间依赖性的。每单位时间内在t和t+dt之间已经发生解链的可能性，由
Figure BDA00002035278300281
给出。该公式可以表达为
Figure BDA00002035278300282
给出解链电压的分布：
p ( V ) = 1 τ 0 V · exp [ V V β - V β τ 0 V · ( exp ( V V β ) - 1 ) ] - - - ( 1 )
将临界解链电压Vc定义为该分布的最大值，它是：
V c = V β ln [ τ 0 V · V β ] - - - ( 2 )
图16显示了在4.5V/s的恒定加载速度下进行的典型解链事件。上图描绘了施加的电压，下图显示了孔电流。通过电压变动过程中电流的跳越，从封闭孔电流水平至开孔电流水平，可以容易地观察到解链。从每个事件直接得到解链电压VU。象在前面的实验中一样，使DNA开始进入孔(即，滑动0.3ms，且将分子维持在孔内0.5ms)。应用电压变动后，电流维持在封闭水平，但是在t约22ms(从开始变动时测量)，解开的链迅速地滑过孔，存在孔电流的急剧增加。从曲线中，可以直接测量解链电压Vυ(在该情况下，130mV)。滑动时间(ts2)使得表观解链时间(并从而使Vυ)稍微更长。但是，如上面所讨论的，这是非常小的影响：在这里所示的情况下，ts2是约0.12ms，因此而校正是0.12/22＝0.005，观察时间的小分数。
为了得到足够的统计量，对于任何给定的变动值，重复解链实验至少1,000次。图17的插图给出了测量的Vυ值的典型分布。分布与方程1(插图中的实线)非常接近。分布的峰是最可能的解链力(或临界电压，Vc)。重复测量，以得到对于HP1，对于HP2(含有单个错配的发夹)和对于HP3(7碱基对螺旋)，Vc对0.5-100V/s范围内的电压变动的依赖性。在图14的半对数图中显示了数据(对于HP1，HP2和HP3，分别是圆圈，三角形和正方形)。在中和高电压变动(5-100V/s)，Vc遵循方程2预测的对
Figure BDA00002035278300291
的对数依赖性。根据方程2，图17中的直线的斜率简单地是Vβ.。从该对数拟合，HP1的Vβ·＝24.7±1.0mV，HP2的是22.5±1.1mV，且HP3的是23.3±1.9mV，与上述的恒定电压测量非常一致。如从Vβ仅仅依赖于孔内的DNA的有效电荷的事实所预期的，所有分子产生几乎相同的斜率。注意到，在更低的变动方案中，数据偏离方程2预测的简单对数依赖性。下面讨论了该偏离。将数据(对于变动＞1.6V/s)与方程2拟合，产生HP1和HP2各自的τυ(0)＝0.72s和0.49s，这些值小于使用恒定电压方法得到的值。
以前的研究已经证实，可以将进入2.4nm α-HL孔腔的短平端DNA发夹的关闭-打开动力学描述为单步骤过程，产生与跳过接近于计算的整个发夹的自由焓的能量屏障相对应的时间尺度。在这些实验中，几乎没有或根本没有施加力来使分子变性，因为平端DNA不能进入α-HL通道部分。在电流实验中，从DNA发夹的一端伸出的单链突出在通道内穿过，从而偏离发夹的动力学，推测是由于在该链上施加力。
主动控制方法已经允许将在220mV或以上进行的解链测量延伸至更小的电压，从而填充0力和强力极限之间的间隙。在任何给定的电压V，可以通过QeffV/d估计施加在该DNA链上的力，其中Qeff是通道内的ssDNA的有效电荷，且d约5nm是通道长度。注意到，甚至在相对小的电压(小偏压力)，在孔内未配对的链几乎同样快速的前进，会阻止热“熔化的”碱基对的快速重退火。从转移实验估计特征ssDNA滑动时间。该″棘轮″机理可以将整个发夹的解链分成几个连续步骤。因而，预期在该情况下15总解链时间显著短于0偏压动力学。
实验证实，在恒定力下测得的特征解链时间(τυ)随解链电压水平Vυ指数式地衰退。发现直线拟合的斜率独立于发夹序列(并从而独立于它们的焓)，允许估计通道内的ssDNA片段上的有效电荷。指数拟合在Vυ＝0的截距，提供τυ(O)的估计值。有趣地将这些值与发夹的完全封闭到完全变性转换相关的计算的平衡时间尺度进行对比。在1M Na+使用mf old server，对于HP1得到AG°＝-16.4kcal/mol，对于HP2得到-12.2kcal/mol，产生以小时计的近似(完全封闭至打开)时间尺度。相反地，估计产生τυ(0)约1s，短几个数量级。时间尺度的这种差异，与上述的″棘轮″构思相一致。更具体地，如果通过2个(而不是1个)热激活步骤(每个约5个碱基)发生纳米孔解链，总时间会减少至秒级。
通过2个独立的方案，恒定力或固定的加载速度，估计1.5nmα-HL通道内的ssDNA上的有效电荷。两种方法都产生对于孔内的链1.13e或每个核苷酸0.094e的有效电荷，表明通道中的DNA的负电荷被带正电荷的钾离子的″缩合″和α-HL通道内壁上极性基团的存在有效地平衡，这与以前的结果一致。该有效电荷可以用于计算在任何给定V的力。
动态力测量与上述的图象一致。在高加载速度(变动＞2V/s)，通过力导致的势垒高度的快速变化，确定解链时间(并从而确定Vc)。在该限度中，系统不会经历许多打开-关闭转换，且Vc与
Figure BDA00002035278300301
成正比。对于小
Figure BDA00002035278300302
值，存在向另一个方案的软交叉，其特征在于临界电压对加载速度的弱依赖性。在该方案中，电压保持足够低足够长的时间，以允许系统在关闭和打开状态之间变动，直到最后的解链。
图17中的对数曲线的斜率，给出了如方程2所定义的Vβ。拟合参数与使用恒定力方法得到的值非常一致。另外，将拟合向
Figure BDA00002035278300303
(即，
Figure BDA00002035278300304
)的外推，可以用于估计所述2个发夹的τυ(O)。从动力学测量得到的值始终小于在恒定力得到的外推值(大约差2倍)。注意到，与HP1和HP2相对应的曲线移位大约20mV。使用测得的在DNA上的有效电荷，可以将该变化解释为约1kBT(约0.6kcal/mol)的能量差。
尽管已经参考不同的实施方案描述了本发明，应当认识到，在所附权利要求书的精神和范围内，本发明也存在许多种类的进一步的和其它的实施方案。
本发明的优选实施方式：
1.分析一种或多种目标多核苷酸分子的方法，包括：
(a)使用所述目标多核苷酸作为模板，设计一种或多种设计单体，其中单个设计单体进一步与″0″或″1″相对应，其中2个单独的设计单体与预定的核苷酸碱基相对应，且其中所述单个设计单体具有一个或多个信号分子；
(b)通过连接多个所述的设计单体，形成一种或多种设计聚合物；
(c)重复步骤(a)和(b)，直到构建出一种或多种预定的设计聚合物；
(d)通过在适合杂交的条件下，混合所述设计聚合物和信号分子，形成设计聚合物-信号复合物；和
(e)对(d)所述的复合物进行分析。
2.项目1的方法，其中所述目标多核苷酸选自DNA，RNA和PNA。
3.项目2的方法，其中所述目标多核苷酸是DNA。
4.项目3的方法，其中所述DNA是cDNA或gDNA。
5.项目2的方法，其中所述目标多核苷酸选自单链，双链，或二者的组合。
6.项目1的方法，其中所述目标多核苷酸可以是真核生物的或原核生物的。
7.项目1的方法，其中所述目标多核苷酸是植物的或动物的。
8.项目1的方法，其中所述目标多核苷酸可以具有约10个核苷酸碱基至约100,000个核苷酸碱基的大小。
9.项目1的方法，其中所述设计单体包含一个或多个核苷酸碱基。
10.项目9的方法，其中所述设计单体的核苷酸碱基的范围从约1个核苷酸碱基至约100个核苷酸碱基。
11.项目9的方法，其中所述设计单体的核苷酸碱基的范围从约5个核苷酸碱基至约10个核苷酸碱基。
12.项目9的方法，其中所述设计单体可以包含DNA，RNA或PNA。
13.项目1的方法，其中将所述目标多核苷酸的每个单独的单元用二进制码表示。
14.项目13的方法，其中所述单独的单元选自腺嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶及其修饰形式。
15.项目13的方法，其中所述二进制码包含″0″和″1″，其中所述″0″和″1″的特定排列与所述单个单元相对应。
16.项目1的方法，其中所述设计聚合物包含以与所述目标多核苷酸相对应的特定顺序排列的一个或多个设计单体。
17.项目1的方法，其中所述信号分子与所述设计单体杂交。
18.项目17的方法，其中所述信号分子和所述设计单体之间的杂交百分比是约90％或更大。
19.项目17的方法，其中所述信号分子和所述设计单体之间的杂交百分比是约80％至约90％。
20.项目17的方法，其中所述信号分子和所述设计单体之间的杂交百分比是约70％至约80％。
21.项目17的方法，其中所述信号分子和所述设计单体之间的杂交百分比是约60％至约70％。
22.项目1的方法，其中所述信号分子是分子信标。
23.项目22的方法，其中所述分子信标包含一个或多个荧光团和一个或多个淬灭剂。
24.项目23的方法，其中所述信标的5′端的核苷酸序列与所述信标的3′端的核苷酸序列互补。
25.项目1的方法，其中存在2个分子信标，其中每个信标与特定的设计单体相对应。
26.项目25的方法，其中第一个分子信标与第一个设计单体相对应，且其中第二个分子信标与第二个设计单体相对应。
27.项目1的方法，其中步骤(a)和(b)形成产生所述设计聚合物的循环。
28.项目27的方法，其中所述设计聚合物在1个循环后包含6个设计单体，从而在完成每个循环后，所述设计聚合物延伸至少6个设计单体。
29.项目28的方法，其中所述设计单体在所述设计聚合物中彼此共价连接。
30.项目1的方法，其中步骤(b)中所述的设计聚合物是双链多核苷酸分子。
31.项目1的方法，其中步骤(d)中所述的设计聚合物是部分地或完全地单链的。
32.项目1的方法，其中步骤(e)还包括，将所述设计聚合物-信号复合物引入纳米孔系统。
33.项目32的方法，其中所述纳米孔系统包含多个纳米孔和一个或多个检测系统。
34.项目33的方法，其中所述纳米孔包含一个或多个通道和脂双层。
35.项目34的方法，其中所述纳米孔选自α-溶血素，λ噬菌体的受体，短杆菌肽，缬氨霉素，大肠杆菌，志贺氏菌属，Tsx，F菌毛，线粒体孔蛋白。
36.项目35的方法，其中所述纳米孔是α-溶血素。
37.项目36的方法，其中所述α-溶血素包含孔腔和通道。
38.项目37的方法，其中所述孔腔的直径是约2.5nm。
39.项目37的方法，其中所述通道具有约1.5nm直径。
40.项目34的方法，其中所述通道具有约0.5nm至约2.0nm的孔径。
41.项目32的方法，还包括使所述设计聚合物-信号复合物解链，从而使所述设计聚合物的单链部分进入并通过所述纳米孔系统的通道。
42.项目41的方法，其中所述解链是跨所述纳米孔系统建立的电场的结果。
43.项目41的方法，其中跨所述纳米孔系统的电场促进所述单链设计聚合物移动进入并通过所述通道。
44.项目41的方法，其中解链过程导致一个或多个信号分子的释放。
45.项目44的方法，其中所述释放的信号分子包含能发射出可检测能量的分子和淬灭分子，其中所述释放的信号分子自杂交，从而淬灭所述发射分子。
46.项目45的方法，其中所述发射分子是荧光团。
47.项目46的方法，其中所述荧光团选自TMR，Cy5，CPM等。
48.项目46的方法，其中所述淬灭分子选自Dabcyl，Dabsyl，甲基红，Elle淬灭剂等。
49.项目1的方法，其中步骤(e)所述的分析包括检测来自所述信号分子的能量。
50.项目49的方法，其中所述检测包括荧光检测。
51.项目33的方法，其中所述检测系统是光学检测系统。
52.项目51的方法，其中所述光学检测系统是荧光检测器。
53.分析一种或多种目标多核苷酸分子的方法，包括：
(a)使用所述目标多核苷酸作为模板，设计一种或多种设计单体，其中单个设计单体进一步与″0″或″1″相对应，其中2个单独的设计单体与预定的核苷酸碱基相对应，且其中所述单个设计单体具有一个或多个信号分子；
(b)通过连接多个所述的设计单体，形成一种或多种设计聚合物；
(c)重复步骤(a)和(b)，直到构建出一种或多种预定的设计聚合物；
(d)通过在适合杂交的条件下，混合所述设计聚合物和信号分子，形成设计聚合物-信号复合物；
(e)将(d)所述的复合物引入纳米孔系统，在其中所述复合物解链，且其中所述设计聚合物的单链部分进入并通过所述纳米孔系统；和
(f)分析(e)所述的单链设计聚合物。

Claims (26)

1.一种组合物，包含：
可杂交探针聚合物，包括以对应于目标多核苷酸的核苷酸序列的顺序连接在一起的多个可杂交探针单体，其中所述可杂交探针聚合物中的一个或多个可杂交探针单体与所述目标多核苷酸的一个或多个预订的核苷酸碱基相对应；
多个可淬灭荧光探针，每个可淬灭荧光探针包含核苷酸序列、荧光团和淬灭剂，其中：
每个可淬灭荧光探针与可杂交探针聚合物中的一个可杂交探针单体杂交；并且
除了末端可淬灭荧光探针之一的荧光团外，每个荧光团被临近可淬灭荧光探针的淬灭剂所淬灭。
2.权利要求1的组合物，其中所述目标多核苷酸选自DNA和RNA。
3.权利要求2的组合物，其中所述目标多核苷酸是DNA。
4.权利要求3的组合物，其中所述DNA是cDNA或gDNA。
5.权利要求1的组合物，其中所述可淬灭荧光探针中的核酸包括DNA，RNA和/或PNA。
6.权利要求1的组合物，其中所述可杂交探针单体包括DNA，RNA和/或PNA。
7.权利要求6的组合物，其中所述可杂交探针单体的核苷酸碱基的范围是从约5个核苷酸碱基至约20个核苷酸碱基。
8.权利要求1的组合物，其中所述目标多核苷酸中的每个核苷酸用可杂交探针单体的二进制码表示。
9.权利要求8的组合物，其中所述目标多核苷酸中的核苷酸选自腺嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶，鸟嘌呤，胸腺嘧啶及其修饰形式。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含多个不同的可淬灭荧光探针，每个探针包含不同的荧光团，其中每个探针与不同的可杂交探针单体杂交。
11.权利要求10的组合物，其中所述组合物包含2种不同的可淬灭荧光探针。
12.权利要求1的组合物，其中所述可淬灭荧光探针在分离中自淬灭。
13.权利要求12的组合物，其中所述可淬灭荧光探针是分子信标。
14.权利要求13的组合物，其中所述分子信标的5′端的核苷酸序列部分与所述分子信标的3′端的核苷酸序列部分相互补。
15.权利要求1的组合物，进一步包含纳米孔系统。
16.权利要求15的组合物，其中所述纳米孔系统包含多个纳米孔和一个或多个检测系统。
17.权利要求15的组合物，其中所述纳米孔包含在合成的有机或无机薄膜中产生的一个或多个纳米孔。
18.权利要求15的组合物，其中所述纳米孔的孔径是约2.5nm至约9nm。
19.权利要求16的组合物，其中所述纳米孔系统包括纳米孔阵列。
20.权利要求15的组合物，其中所述纳米孔系统包括一个或多个通道和脂双层。
21.权利要求16的组合物，其中所述纳米孔系统中的纳米孔选自α-溶血素，λ噬菌体的受体，短杆菌肽，缬氨霉素，OmpF，OmpC，PhoE，Tsx，F菌毛，线粒体孔蛋白(VDAC)。
22.全力企业21的组合物，其中所述纳米孔是α-溶血素。
23.权利要求22的组合物，其中所述α-溶血素包含孔腔和通道。
24.权利要求23的组合物，其中所述孔腔的直径是约2.5nm。
25.权利要求23的组合物，其中所述通道具有约1.5nm直径。
26.权利要求25的组合物，其中所述通道具有约0.5nm至约2.0nm的孔径。
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