JP5190263B2 - 超高スループットの光学−ナノ細孔dna読み取りプラットフォーム - Google Patents
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Description
本発明は、ポリマー分子を分析するためのシステムを提供する。詳しくは、本発明は、一本鎖のポリヌクレオチド分子の配列決定に関する。
WatsonおよびCrickが1953年にDNA分子の構造を解明して以来、遺伝学研究者は、個々のDNA分子を配列決定する、迅速かつ効率的な方法を見出そうとしてきた。Sanger/BarrellおよびMaxam/Gilbertは、1975と1977との間に、配列決定技術において、主要なブレークスルーを代表する2つの新規のDNA配列決定法を開発した。現在広範に使用される方法は全て、Sanger/Barrell法に基づき、最近23年間におけるDNA配列決定の開発は、大体、この方法の改変であった。
Technology Review、1999 Mar/Apr 102(2):64〜68
本発明は、ポリマー分子を分析するため方法に関する。これらの方法は、単一の分子の感度でのDNA分子およびRNA分子の高スループットな読み取りに使用される。本発明の方法は、以下を包含する:(1)DNA(またはRNA)二本鎖の電気的に制御された解離(unzipping)、(2)1つ以上の分子シグナル検出を使用する、分子の正体(identity)(またはコード)の読み取り、および(3)核酸とハイブリダイズしたプローブとの間の分子の相互作用(例えば、強力に相互作用するプローブは、移行速度にさらなる低下を生じる)による、ナノ細孔通過プロセス(nano pore threading process)の制御された減速。
本発明は、ポリマー分子を分析する方法に関する。これらの方法は、単一の分子の感度での、DNA分子およびRNA分子の高スループットな読み取りに使用される。本発明の方法は、以下を包含する:(1)DNA(またはRNA)二本鎖の電気的に制御された解離、(2)1つ以上の分子シグナル検出を使用する分子の正体(またはコード)の読み取り、および(3)核酸とハイブリダイズしたプローブとの間の分子の相互作用(例えば、強力に相互作用するプローブは、移行速度にさらなる低下を生じる)による、ナノ細孔通過プロセスの制御された減速。
時間依存的な電場によるナノ細孔測定(例えば、配列決定法)を可能にするために、解離法を開発した。本解離法は、解離電圧を可変にしたまま、細孔への侵入速度を最適化する高い電圧を使用する。したがって、数百の個々の分子を、短い間の時間(数秒間)で調べることができる。本方法は、ポリヌクレオチドの通過の間に、熟練者が、ナノ細孔を横切って印加される電場を迅速に変化させることを可能にする。
PAGEで精製されたssDNAおよびDNAヘアピン(Eurogentec,San Diego,CA)を、10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.5溶液中で緩衝化させ、測定の前に、10分間、75℃まで加熱し、その後、4℃まで急冷した。ヘアピン分子は、3’の一本鎖の突出(50マーのポリ−dA)、以下の配列(自己相補的な部分には下線が施してある)を有し、介在する6塩基ループを含む10bpのヘリックス部分から構成されている:
(ssDNAのトランスロケーション時間の分布)
各々個々のDNAのトランスロケーション時間(tT)は、α−HLの細孔のチャネル部分内へ最初の数塩基のDNA分子の侵入から、チャネルの他方の側から分子が抜け出るまでの時間間隔として規定される。これらの事象は、開口細孔電流の約10%までの、細孔を通って流れるイオン電流の急激な低下により明確に観察される。ヘアピンの場合に、DNAは、その一本鎖の3’突出によりチャネルに侵入することしかできない。なぜなら、その他方の末端のループは、細孔に侵入するには大きすぎるからである。この場合において、tTは、上記の3つの連続的なプロセスの合計である(すなわち、tT=ts1+tunzip+ts2、ここで、ts1は、一本鎖の突出(ポリ(dA)50)のスライド時間であり、ts2は、解離したヘアピン+ループ(26塩基)のスライド時間であり、そしてtunzipは解離時間である)。
定常電圧(または、力)でのDNAヘアピンの解離を研究した。電圧の急激な変化をナノ細孔を横切って印加し、そして解離動態を測定した。この実験で使用した代表的な電圧および電流のトレースを図13に示す。DNAは、時間t=0でチャネルに侵入する。図10に説明されるように、分子は、短時間の間、細孔内に引き込まれ、保持される。t=0.8msにおいて、解離電圧(90mV)を印加するが、解離がt=tU=70ms(電流の急激な上昇により示される)で生じるまで、電流はブロックされる(より低いレベル)。解離電圧VUを印加すると、電流は、その適切な閉鎖細孔レベルまでわずかに上昇し(細孔電流の拡大図については、図11を参照のこと)、t〜70ms(解離電圧の印加から測定される)まで、この閉鎖レベルに留まった。この時点において、電流は、この電圧に対応する開口細孔電流レベルまで急激に上昇した。解離したヘアピンのスライド時間は、図13の時間スケールで決定するには短すぎるので、この移行は、ヘアピンの解離の瞬間を示す。1分間あたり約100回の個別の解離事象を累積する自動化手順を使用して、解離プロセスを反復した。
能動的な制御法によって、任意の時間依存的な電圧V(t)を印加して、結合の切断の動態を測定することができる。特に、力分光法の測定を、代表的に、一定の負荷速度または
Claims (40)
- 標的ポリヌクレオチドを分析する方法であって、該方法は:
(a)複数の設計モノマーを提供する工程であって、ここで、1つ以上の設計モノマーは、所定のヌクレオチド塩基と対応し、設計モノマーの各々は、1つ以上のシグナル分子と関連付けられる、工程;
(b)リガーゼ酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に対応する配列内に複数の設計モノマーを連結することにより、設計ポリマーを形成する工程;
(c)該設計モノマーと関連付けられたシグナル分子を、該設計ポリマーにアニーリングさせて、設計ポリマー−シグナル複合体を形成する工程;および
(d)ナノ細孔を使用して該複合体の一方の末端から該シグナル分子を順次除去することによる、該複合体を分析に供する工程であって、該複合体からの該シグナル分子の除去は、該標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチド塩基配列を同定するために用いられるシグナルのパターンを生成する、工程、
を包含する、方法。 - 前記標的ポリヌクレオチドが、DNA、RNAおよびPNAからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチドがDNAである、請求項2に記載の方法。
- 前記DNAが、cDNAまたはgDNAのいずれかである、請求項3に記載の方法。
- 前記設計モノマーが、5ヌクレオチド塩基〜10ヌクレオチド塩基に及ぶヌクレオチド塩基の範囲を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記設計モノマーが、DNA、RNAまたはPNAを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの各々が、二進コードにより表される、請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドが、アデニン、シトシン、ウラシル(uricil)、グアニンおよびチミンからなる群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記二進コードが2つの分子ビーコンから構成され、ここで、該分子ビーコンの特定の配列が、前記ヌクレオチドに対応する、請求項7に記載の方法。
- 前記シグナル分子が前記設計モノマーにハイブリダイズされる、請求項1に記載の方法。
- 前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、90%以上である、請求項10に記載の方法。
- 前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、80%〜90%の間である、請求項10に記載の方法。
- 前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、70%〜80%の間である、請求項10に記載の方法。
- 前記シグナル分子と前記設計モノマーとの間のハイブリダイゼーションのパーセントが、60%〜70%の間である、請求項10に記載の方法。
- 前記シグナル分子が分子ビーコンである、請求項1に記載の方法。
- 前記分子ビーコンが、1つ以上のフルオロフォアと1つ以上のクエンチャーとを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記分子ビーコンの5’末端上のヌクレオチド配列が、該分子ビーコンの3’末端上のヌクレオチド配列と相補的である、請求項16に記載の方法。
- 2つの分子ビーコンが存在し、各々の分子ビーコンが特定の設計モノマーに対応する、請求項15に記載の方法。
- 第一の分子ビーコンが第一の設計モノマーに対応し、第二の分子ビーコンが第二の設計モノマーに対応する、請求項18に記載の方法。
- ナノ細孔システムへ前記設計ポリマー−シグナル分子複合体を導入する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ細孔システムが、複数のナノ細孔と1つ以上の検出システムとを備える、請求項20に記載の方法。
- 前記ナノ細孔システムが、1つ以上のチャネルと脂質二重層とを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記ナノ細孔が、α溶血素、バクテリオファージλに対するレセプター、グラミシジン、バリノマイシン、OmpF、OmpC、PhoE、Tsx、F線毛およびミトコンドリアポーリン(VDAC)からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記ナノ細孔がα溶血素である、請求項23に記載の方法。
- 前記α溶血素が前庭とチャネルとを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記前庭が、2.5nmの直径を有する、請求項25に記載の方法。
- 前記チャネルが、1.5nmの直径を有する、請求項25に記載の方法。
- 前記チャネルが、0.5nm〜2.0nmの範囲に及ぶ細孔サイズを有する、請求項22に記載の方法。
- 電圧を使用して前記ナノ細孔システム内のナノ細孔を通して前記設計ポリマーをトランスロケーションさせることによる前記設計ポリマー−シグナル分子複合体の解離をさらに包含し、ここで、該設計ポリマーの一本鎖部分が、前記ナノ細孔システムのチャネルに侵入し、それを通過する、請求項20に記載の方法。
- 前記解離が、前記ナノ細孔システムを横切って確立された電場によりもたらされる、請求項29に記載の方法。
- 前記チャネルへ、かつ該チャネルを通っての前記一本鎖の設計ポリマーの移動が、前記ナノ細孔システムを横切る電場により促進される、請求項29に記載の方法。
- 前記解離プロセスが1つ以上のシグナル分子の遊離をもたらす、請求項29に記載の方法。
- 前記遊離されたシグナル分子が、検出可能なエネルギーを放出する分子とクエンチャー分子とを含み、該遊離されたシグナル分子が自己ハイブリダイズし、それにより該放出する分子をクエンチする、請求項32に記載の方法。
- 前記放出する分子がフルオロフォアである、請求項33に記載の方法。
- 前記フルオロフォアが、TMR、Cy5およびCPMからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記クエンチング分子が、ダブシル(Dabcyl)、ダブシル(Dabsyl)、および、メチルレッドからなる群より選択される、請求項34に記載の方法。
- 工程(d)の分析が、前記シグナル分子からのエネルギーの検出を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記検出が蛍光の検出を包含する、請求項37に記載の方法。
- 前記検出システムが光学的な検出システムである、請求項21に記載の方法。
- 前記光学的な検出システムが蛍光検出器である、請求項39に記載の方法。
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