KR101797773B1 - 막횡단 시퀀싱에서 핵산 구축물용 어댑터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 핵산 시퀀싱용 어댑터에 관한 것이다. 어댑터는 시퀀싱을 목적으로 단일 가닥의 핵산 구축물을 생성하는데 사용될 수 있다. 그러한 구축물은 이중 가닥 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 주형으로부터의 가닥을 둘 모두 함유할 수 있다. 또한 본 발명은 어댑터를 이용하여 생성한 구축물, 어댑터 및 구축물의 제조 방법, 뿐만 아니라 이중 가닥 핵산을 시퀀싱하는 방법에 관한 것이다.

Description

막횡단 시퀀싱에서 핵산 구축물용 어댑터 {ADAPTORS FOR NUCLEIC ACID CONSTRUCTS IN TRANSMEMBRANE SEQUENCING}

본 발명은 핵산 시퀀싱용 어댑터에 관한 것이다. 시퀀싱을 목적으로 핵산의 단일 가닥 구축물을 생성하는데 어댑터를 이용할 수 있다. 그러한 구축물은 이중 가닥 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA) 주형으로부터의 가닥을 둘 모두 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 어댑터를 이용하여 생성된 구축물, 어댑터 및 구축물의 제조 방법, 뿐만 아니라 이중 가닥 핵산의 시퀀싱 방법에 관한 것이다.

확률론적 검출은 분석물 분자 및 수용체 사이의 개별적인 결합 이벤트를 관찰하는 것에 의존하여 감지하는 접근법이다. 확률론적 센서는 절연성 막 내에 나노미터 직경의 단일 포어를 배치하고, 분석물 분자의 존재하에서 포어를 통한 전압 구동 이온 수송을 측정하여 제작할 수 있다. 전류에서 요동의 발생 빈도는 포어 내에 결합된 분석물의 농도를 알게 한다. 분석물의 실체는 그의 독특한 전류 신호, 특히 전류 블록의 지속기간 및 정도를 통해 밝혀진다 (문헌 [Braha, O., Walker, B., Cheley, S., Kasianowicz, J. J., Song, L., Gouaux, J. E., and Bayley, H. (1997) Chem.Biol. 4, 497-505]; 및 [Bayley, H., and Cremer, P. S. (2001) Nature 413, 226-230]).

독성 α-용혈소 (α-HL)를 형성하는 조작된 버전의 박테리아 포어가 많은 부류의 분자를 확률론적으로 감지하는데 사용되어 왔다 (문헌 [Bayley, H., and Cremer, P. S. (2001) Nature 413, 226-230]; [Shin, S., H., Luchian, T., Cheley, S., Braha, O., and Bayley, H. (2002) Angew.Chem.Int.Ed. 41, 3707-3709]; 및 [Guan, X., Gu, L.-Q., Cheley, S., Braha, O., and Bayley, H. (2005) ChemBioChem 6, 1875-1881]). 이러한 연구 과정에서, α-HL을 소형 유기 분석물에 직접 결합하도록 조작하는 시도가, 성공 예가 드문, 아주 힘든 일인 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Guan, X., Gu, L.-Q., Cheley, S., Braha, O., and Bayley, H. (2005) ChemBioChem 6, 1875-1881]). 다행히, 비공유적으로 부착되는 분자 어댑터, 특히 시클로덱스트린 (문헌 [Gu, L.-Q., Braha, O., Conlan, S., Cheley, S., and Bayley, H. (1999) Nature 398, 686-690]), 뿐만 아니라 시클릭 펩티드 ([Sanchez-Quesada, J., Ghadiri, M. R., Bayley, H., and Braha, O. (2000) J.Am.Chem.Soc. 122, 11758-11766]) 및 쿠커비투릴 ([Braha, O., Webb, J., Gu, L.-Q., Kim, K., and Bayley, H. (2005) ChemPhysChem 6, 889-892])을 이용하는 다른 전략이 발견되었다. 시클로덱스트린은 α-HL 포어에 일시적으로 수용되어 실질적이지만 불완전하게 채널을 차단시킨다. 시클로덱스트린의 소수성 내부에 결합하는 유기 분석물은 이러한 차단을 증가시켜 분석물이 검출되게 한다 (문헌 [Gu, L.-Q., Braha, O., Conlan, S., Cheley, S., and Bayley, H. (1999) Nature 398, 686-690]).

현재 광범위하게 적용되는 신속하고 저렴한 DNA 또는 RNA 시퀀싱 기술에 대한 필요가 존재한다. 현존 기술은 대량의 핵산을 생산하기 위한 증폭 기술에 의존하고, 신호 검출을 위해 많은 양의 전문적인 형광 화학물질을 요구하기 때문에 대부분 느리고 비싸다. 확률론적 감지는 요구되는 뉴클레오티드 및 시약의 양을 줄임으로써 신속하고 저렴한 DNA 시퀀싱을 제공하는데 잠재력이 있다.

발명의 개요

본 발명자(들)은 놀랍게도 인공적이고 확인가능한 어댑터를 사용하여 이중 가닥 핵산 주형의 가닥을 둘 모두 함유하는 단일 가닥 핵산 구축물을 생성할 수 있음을 밝혀내었다. 주형의 두 가닥은 공유적으로 연결되며, 어댑터에 의해 구분된다 (나뉘어진다). 어댑터는 한 가닥으로부터 다른 가닥으로의 전이점을 확인가능하게 할 뿐만 아니라, 시퀀싱 이전에 구축물이 정제되게 한다. 어댑터는 추가로 구축물 내 가닥이 상이한 공급원을 갖는 것인 유사한 구축물과 본 구축물을 구별되게 할 수 있다. 따라서, 어댑터는 별개의 개별 공급원으로부터 기원한 주형의 멀티플렉스 서열 분석을 가능하게 한다.

어댑터는 특히 이중 가닥 DNA (dsDNA) 및 이중 가닥 RNA (dsRNA)를 시퀀싱하는데 유용하다. 어댑터는 dsDNA 또는 dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥을 둘 모두 함유하는 단일 가닥 구축물을 생성하는데 사용될 수 있다.

어댑터는 일반적으로 쌍으로 사용된다. 쌍에서 양 유형의 어댑터는 회문식 절단 부위의 1/2을 형성하는 이중 가닥 핵산 영역을 포함할 뿐만 아니라, 서로 차별적으로 선택가능하다. 각각의 쌍은 2 유형의 어댑터; 유형 I 및 유형 II를 포함한다. 유형 I 어댑터는 헤어핀 루프를 포함하며, 이는 이중 가닥 핵산 주형 내에서 2 가닥의 공유적 연결을 가능하게 한다. 유형 II 어댑터는 헤어핀 루프를 포함할 수 있지만, 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 이러한 특성의 조합은 이중 가닥 핵산 주형의 양 가닥이 유형 I 어댑터를 통해 공유적으로 연결된 단일 가닥 구축물의 생성 및 정제를 가능하게 한다. 어댑터가 서로 라이게이션되어 형성된 원치않는 구축물은 반응 혼합물로부터 회문식 절단 부위를 이용하여 제거할 수 있다. 유사하게, 두 유형의 어댑터 중 하나 또는 다른 하나를 함유하는 구축물은 반응 혼합물로부터 어댑터의 차별적 선택가능성을 이용하여 단리할 수 있다.

따라서, 본 발명은 이중 가닥 핵산 영역을 포함하는 핵산 시퀀싱용 어댑터를 제공하며, 여기서 상기 영역의 적어도 하나의 말단은 회문식 절단 부위의 1/2을 형성하며, 상기 어댑터는 다른 어댑터와 차별적으로 선택가능하다. 일부 실시양태에서, 상기 영역은 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고, 어댑터는 헤어핀 루프를 포함한다.

또한 본 발명은 이하를 제공한다:

- 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성된 본 발명의 어댑터를 포함하고, 헤어핀 루프 (유형 I) 및 본 발명의 어댑터 (유형 II)를 포함하는 한 쌍의 어댑터 (상기 쌍에서 각각의 유형의 어댑터는 다른 유형과 차별적으로 선택가능하며, 완전한 회문식 절단 부위는 2 유형의 어댑터의 임의의 조합이 서로 라이게이션된 경우에 형성된다);

- 적어도 2 개의 본 발명의 어댑터 집단을 포함하며, 각각의 집단 내 모든 어댑터는 집단에 특이적인 핵산 서열을 포함하는 키트;

- 적어도 하나의 본 발명의 어댑터에 라이게이션된 이중 가닥 핵산을 포함하는 시퀀싱 주형으로서 사용하기 위한 핵산 구축물;

- 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함하는 본 발명의 어댑터를 통해 공유적으로 연결된 2 가닥의 핵산을 포함하는, 시퀀싱 주형으로서 사용하기 위한 단일 가닥 핵산 구축물;

- 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함하는 본 발명의 어댑터를 통해 각 말단에 공유적으로 연결된 2 가닥의 핵산을 포함하는, 시퀀싱 주형으로서 사용하기 위한 원형 핵산 구축물;

- (a) (i) 서로 혼성화되어 회문식 절단 부위의 1/2을 형성할 수 있고 (ii) 또 다른 어댑터의 핵산과 차별적으로 선택가능한 2 종의 핵산을 제공하는 단계; 및

(b) 핵산이 혼성화되게 하는 조건하에서 핵산을 접촉시켜 어댑터를 제조하는 단계

를 포함하는, 본 발명의 어댑터의 제조 방법;

- (a) (i) 서로 혼성화될 수 있는 두 영역, (ii) 또 다른 어댑터의 루프 형성 영역과 차별적으로 선택가능한 루프 형성 영역 및 (iii) 함께 회문식 절단 부위의 1/2을 형성하는 두 말단을 포함하는 단일 가닥 핵산을 제공하는 단계; 및

(b) 상기 두 영역이 혼성화되고 헤어핀 루프가 형성되게 하는 조건에 핵산을 노출시켜 어댑터를 제조하는 단계

를 포함하는, 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함하는 본 발명의 어댑터의 제조 방법;

- (a) 적어도 하나의 본 발명의 어댑터를 2 가닥의 핵산과, 어댑터(들) 및 가닥 사이에 라이게이션을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계; 및

(b) 어댑터가 2 가닥에 라이게이션되게 하여 핵산 구축물을 제조하는 단계

를 포함하는, 본 발명의 핵산 구축물의 제조 방법;

- (a) 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함하는 본 발명의 어댑터를 2 가닥의 핵산과, 어댑터 및 가닥 사이에 라이게이션을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계;

(b) 어댑터가 2 가닥과 공유적으로 연결되게 하는 단계; 및

(c) 공유적으로 연결된 구축물을 변성시켜 단일 가닥 핵산 구축물을 제조하는 단계

를 포함하는, 본 발명의 단일 가닥 핵산 구축물의 제조 방법;

- (a) 헤어핀 루프를 포함하는 적어도 2 개의 본 발명의 어댑터를 2 가닥의 핵산과, 어댑터 및 가닥 사이의 라이게이션을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계; 및

(b) 어댑터가 2 가닥과 각 말단에서 공유적으로 연결되게 하여 원형 핵산 구축물을 제조하는 단계

를 포함하는, 본 발명의 원형 핵산 구축물의 제조 방법;

- (a) 이중 가닥 핵산을 제공하는 단계;

(b) 이중 가닥 핵산을 본 발명의 한 쌍의 어댑터 (여기서 유형 I 어댑터는 절단되거나 틈이 생길 수 없는 것이고, 유형 II 어댑터는 절단되거나 틈이 생길 수 있는 것임)와, 어댑터가 핵산에 라이게이션되게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계;

(c) 라이게이션된 생성물을 유형 II 어댑터와 특이적으로 결합하는 표면과 접촉시키고, 임의의 미결합 생성물은 제거하는 단계;

(d) 표면을 완전한 회문식 절단 부위를 인식하는 효소와 접촉시키고, 임의의 미결합 생성물은 제거하는 단계;

(e) 유형 II 어댑터를 절단시키는 단계;

(f) 단계 (e)에서 생성된 가용성 생성물을 유형 I 어댑터와 특이적으로 결합하는 표면과 접촉시키고, 임의의 미결합 생성물은 제거하는 단계; 및

(g) 단계 (f) 이후 잔류 생성물을 표면으로부터 방출시켜 시퀀싱 구축물을 생성하는 단계

를 포함하는, 서열 구축물의 제조 방법;

- (a) 본 발명의 방법을 수행하는 단계;

(b) 필요한 경우 구축물을 변성시켜 단일 가닥 구축물을 형성하는 단계; 및

(c) 단일 가닥 구축물을 시퀀싱하여 이중 가닥 핵산을 시퀀싱하는 단계

를 포함하는 이중 가닥 핵산의 시퀀싱 방법; 및

- 본 발명의 한 쌍의 어댑터 및 회문식 절단 부위를 절단하는 수단을 포함하는 이중 가닥 핵산의 시퀀싱용 키트.

도 1은 유형 I 어댑터의 한 실시양태를 보여준다. 단일 가닥 DNA 가닥은 단일 가닥 DNA의 대형 헤어핀 루프를 남기고 그 자체에 혼성화되는 자체 상보성을 가지며, 헤어핀 루프는 정제 동안 '유형 I 어댑터' 라이게이션 생성물을 선택적으로 결합시키는데 사용된다. 자체 혼성화된 어댑터의 말단은 유형 I:유형 I, 유형 I:유형 II 또는 유형 II:유형 II에 관계없이 어댑터:어댑터 라이게이션에 의해 생성된 임의의 라이게이션 생성물을 절단하는데 사용되는 1차 제한 엔도뉴클레아제의 1/2를 코딩한다 (화살표, 1^ry).
도 2는 유형 II 어댑터의 한 실시양태를 보여준다. 본 도면 및 모든 후속 도면에서, 유형 II 어댑터는 헤어핀 루프를 포함한다. 단일 가닥 DNA는 비오틴-dT 염기 (별 광채 표시)에 의해 중단되며, 가닥이 자가 혼성화될 경우 이는 단일 가닥 '버블' 영역으로 표출된다. 비오틴은 유형 II 어댑터를 포함하는 라이게이션 생성물 만의 선택가능한 특징이다. 이 어댑터의 이중 가닥 성분은 2차 제한 엔도뉴클레아제의 인식 서열을 포함하며, (유형 I 어댑터와 마찬가지로) 1차 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열의 1/2로 종결되어, 상기한 바와 같이 어댑터:어댑터 라이게이션 생성물의 제거를 가능하게 한다.
도 3은 블런트 말단의 주형 dsDNA (연회색)와 조합된 2 유형의 헤어핀 어댑터 (검정색; 유형 I 및 암회색; 유형 II)를 나타낸다. 박스 A는 하나의 유형 I 및 하나의 유형 II 어댑터가 개입 주형 DNA 서열의 어느 하나의 말단에 라이게이션된 이상적인 상황을 보여준다. 박스 B는 개입 주형이 존재하지 않을 경우, 목적하지 않은 라이게이션 생성물이 생성됨을 보여준다. 라이게이션된 생성물 내의 1차 RE 제한 인식 부위 (실선 박스)의 존재는 목적하지 않은 라이게이션 생성물을 선택적으로 파괴시키는데 유용하다. 유형 II 어댑터 내의 대안적 2차 RE 제한 부위 (점선 박스)는 시퀀싱 주형을 유리시키는데 사용된다 (이하 참조). 'B'는 유형 II 어댑터의 단일 가닥 성분에 포함된 비오틴 모이어티의 존재를 나타낸다.
도 4는 종래의 고 분자량 주형 DNA의 무작위 단편화로 시작되는 폐쇄된 원형 'DNA 덤벨(Dumbell)'의 생성을 보여준다. 생성된 단지 일부의 단편 만이 양 가닥에서 연장가능한 3'OH 언더행을 보유하며, 이는 DNA 폴리머라제에 의해 최종 수선될 수 있다. 훨씬 더 적은 수의 수선된 단편이 양 가닥에 5' PO₄ 말단을 부가적으로 가질 것이다. 개수가 적음에도 불구하고, 임의의 그러한 블런트 말단의 단편은 인공적인 헤어핀 루프 어댑터의 라이게이션을 수용할 것이며, 양 가닥 상에서 엑소뉴클레아제 시퀀싱을 위해 필요한 폐쇄된 원형 주형을 형성할 것이다.
도 5는 유형 I 및 유형 II 어댑터의 라이게이션 이후를 보여준다. 시퀀싱을 위해 목적하는 생성물은 나타낸 절차를 이용하여 정제할 수 있다: 검정색 선은 '유형 I' 어댑터를 나타내고; 암회색 선은 비오티닐화된 '유형 II' 어댑터를 나타내며; 연회색 선은 주형 DNA를 나타낸다. 망사선 화살표는 새로운 플레이트로 옮기지 않고 작업한 것을 나타낸다. 백색 화살표는 이전 웰의 내용물을 새로운 플레이트로 옮김을 나타낸다. (1) 라이게이션 이후, 생성물을 고정된 스트렙타비딘 플레이트로 피펫팅한다. 비오티닐화된 유형 II 어댑터를 보유하는 라이게이션 생성물 만이 결합될 것이다. (2) 플레이트를 세척하면 모든 유형 I/유형 I 라이게이션 생성물 등은 제거될 것이다. (3) '어댑터에 라이게이션된 어댑터'를 1차 제한 엔도뉴클레아제와 인큐베이션하면 '어댑터/어댑터' 생성물은 절단될 것이다. (4) 1차 RE 소화로부터의 모든 제한 잔해를 세척 제거한다. (5) 2차 제한 엔도뉴클레아제가 코딩된 '유형 II 어댑터'와 함께 인큐베이션하면 결합된 유형 II 어댑터 생성물은 절단될 것이다. (6) 2차 RE 소화 생성물을 유형 I 단일 가닥 헤어핀 '버블'에 상보적인 ssDNA가 고정되어 있는 새로운 플레이트로 옮긴다. 5로부터의 RE 단편이 고정된 ssDNA에 혼성화되게 한다. (7) 임의의 미결합 물질을 세척 제거하여 목적하는 '주형 DNA에 라이게이션된 유형 I 어댑터'로서 유지된 종 만을 남긴다. (8) 고정된 DNA에 대한 라이게이션 생성물의 혼성화를 무산시키는 조건 (열, NaOH 또는 당업계 공지의 임의의 다른 수단)을 이용하여, 목적하는 생성물을 후속 변성 및 시퀀싱을 위한 새로운 튜브/플레이트로 옮긴다.
도 6은 포획된 덤벨 구조 (도 1, A)를 유형 II 어댑터의 혼성화된 영역에 코딩된 효소로 처리하면 여기 (좌측)서 묘사한 바와 같은 공유적으로 폐쇄된 구조가 방출됨을 보여준다. 이러한 구조를 변성제로 처리하면 엑소뉴클레아제 I 소화에 영향받기 쉬운 단일 가닥 구조 (우측)가 생성되며, 진행할 경우, 조사하고자 하는 DNA로부터 뉴클레오티드, 연결된 인공 서열 뉴클레오티드 및 이어서 역 상보적 뉴클레오티드가 유리될 것이고, 이를 이미 만들어진 염기 호출(base call)과 비교할 수 있다. 호출의 조합은 보다 나은 품질의 컨센서스 호출을 생성한다.
도 7은 플레이트로부터 회수한 단일 가닥 생성물의 예를 엑소뉴클레아제로 소화시켜, 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드를 유리시키는 것을 보여준다 (이는 어댑터 변형된 α-HL 단백질 포어를 통한 전류 흐름을 변화시킴). '염기'가 방출되고 확인되는 순서는 순차적이다.

서열 목록의 설명

서열 1은 야생형 α-용혈소 (α-HL)의 1개의 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열 2는 야생형 α-HL의 1개의 서브유닛의 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 2 내지 6, 73 내지 75, 207 내지 209, 214 내지 216 및 219 내지 222는 α-헬릭스를 형성한다. 아미노산 22 내지 30, 35 내지 44, 52 내지 62, 67 내지 71, 76 내지 91, 98 내지 103, 112 내지 123, 137 내지 148, 154 내지 159, 165 내지 172, 229 내지 235, 243 내지 261, 266 내지 271, 285 내지 286 및 291 내지 293은 β-가닥을 형성한다. 나머지 모든 비-말단 아미노산, 즉 7 내지 21, 31 내지 34, 45 내지 51, 63 내지 66, 72, 92 내지 97, 104 내지 111, 124 내지 136, 149 내지 153, 160 내지 164, 173 내지 206, 210 내지 213, 217, 218, 223 내지 228, 236 내지 242, 262 내지 265, 272 내지 274 및 287 내지 290은 루프 영역을 형성한다. 아미노산 1 및 294는 말단 아미노산이다.

서열 3은 α-HL M113R/N139Q (HL-RQ)의 1개의 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열 4는 α-HL M113R/N139Q (HL-RQ)의 1개의 서브유닛의 아미노산 서열을 나타낸다. 야생형 α-HL에서 α-헬릭스, β-가닥 및 루프 영역을 형성하는 동일한 아미노산은 이 서브유닛에서 상응하는 영역을 형성한다.

서열 5는 이. 콜라이의 sbcB 유전자로부터 유래된 코돈 최적화 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이는 이. 콜라이의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExoI)를 코딩한다.

서열 6은 이. 콜라이의 엑소뉴클레아제 I 효소 (EcoExoI)의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 효소는 단일 가닥 DNA (ssDNA)로부터 3' - 5' 방향으로 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드를 연속해서 소화시킨다. 아미노산 60 내지 68, 70 내지 78, 80 내지 93, 107 내지 119, 124 내지 128, 137 내지 148, 165 내지 172, 182 내지 211, 213 내지 221, 234 내지 241, 268 내지 286, 313 내지 324, 326 내지 352, 362 내지 370, 373 내지 391, 401 내지 454 및 457 내지 475는 α-헬릭스를 형성한다. 아미노산 10 내지 18, 28 내지 26, 47 내지 50, 97 내지 101, 133 내지 136, 229 내지 232, 243 내지 251, 258 내지 263, 298 내지 302 및 308 내지 311은 β-가닥을 형성한다. 나머지 모든 비-말단 아미노산, 19 내지 27, 37 내지 46, 51 내지 59, 69, 79, 94 내지 96, 102 내지 106, 120 내지 123, 129 내지 132, 149 내지 164, 173 내지 181, 212, 222 내지 228, 233, 242, 252 내지 257, 264 내지 267, 287 내지 297, 303 내지 307, 312, 325, 353 내지 361, 371, 372, 392 내지 400, 455 및 456은 루프를 형성한다. 아미노산 1 내지 9는 말단 아미노산이다. 효소의 전체적인 폴드로 인해 3개의 영역이 합해져서 문자 C 형태의 분자를 형성하지만, 결정 구조에서 이상이 있는 잔기 355-358이, 이러한 C를 O-유사 모양으로 효과적으로 전환시킨다. 아미노 말단 (1-206)은 엑소뉴클레아제 도메인을 형성하고 DnaQ 슈퍼패밀리와 상동성이 있고, 다음 잔기 (202-354)는 SH3-유사 도메인을 형성하고 카르복실 도메인 (359-475)은 엑소뉴클레아제 도메인을 연장시켜 C-유사 모양의 분자를 형성한다. EcoExoI의 4개의 산성 잔기는 DnaQ 상과의 활성 부위 잔기 (D15, E17, D108 및 D186에 상응함)와 보존된다. 잔기 D15 및 108에 단일 금속 이온이 결합되어 있는 것이 제안된다. DNA의 가수분해는 활성화된 물 분자가 잘리기 쉬운 포스페이트를 공격함으로써 촉매되는 것으로 예상되고, 여기서 H181이 촉매성 잔기이고 뉴클레오티드 기질을 정렬한다.

서열 7은 T. 테르모필루스 (T. thermophilus)의 recJ 유전자로부터 유래된 코돈 최적화된 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이는 T. 테르모필루스의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)를 코딩한다.

서열 8은 T. 테르모필루스의 RecJ 효소 (TthRecJ-cd)의 아미노산 서열을 나타낸다. 이 효소는 ssDNA로부터 5' - 3' 방향으로 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드를 연속해서 소화시킨다. 가닥에서의 효소의 개시는 대략 4개의 뉴클레오티드를 요구한다. 아미노산 19 내지 33, 44 내지 61, 80 내지 89, 103 내지 111, 136 내지 140, 148 내지 163, 169 내지 183, 189 내지 202, 207 내지 217, 223 내지 240, 242 내지 252, 254 내지 287, 302 내지 318, 338 내지 350 및 365 내지 382는 α-헬릭스를 형성한다. 아미노산 36 내지 40, 64 내지 68, 93 내지 96, 116 내지 120, 133 내지 135, 294 내지 297, 321 내지 325, 328 내지 332, 352 내지 355 및 359 내지 363은 β-가닥을 형성한다. 나머지 모든 비-말단 아미노산, 34, 35, 41 내지 43, 62, 63, 69 내지 79, 90 내지 92, 97 내지 102, 112 내지 115, 121 내지 132, 141 내지 147, 164 내지 168, 184 내지 188, 203 내지 206, 218 내지 222, 241, 253, 288 내지 293, 298 내지 301, 319, 320, 326, 327, 333 내지 337, 351 내지 358 및 364는 루프를 형성한다. 아미노산 1 내지 18 및 383 내지 425는 말단 아미노산이다. 결정 구조는 써무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)의 RecJ의 코어 도메인 (잔기 40-463)에 대해서만 분석되었다. RecJ 코어 도메인의 번역의 개시 및 생체내 발현을 확실하게 하기 위해서 그의 아미노 말단에 메티오닌 잔기를 첨가하였고, 이는 결정 구조 정보에서는 없었다. 분석된 구조는 긴 α-헬릭스 (254-287)에 의해 연결된 2개의 도메인, 아미노 (2-253) 및 카르복실 (288-463) 영역을 나타낸다. 촉매 잔기 (D46, D98, H122, 및 D183)는 포스포디에스테르 결합에 친핵성 공격을 위한 단일 2가 금속 이온을 조직화한다. D46 및 H120은 촉매 쌍인 것으로 제시되지만; 이. 콜라이 RecJ에서 임의의 이들 보존된 잔기의 돌연변이는 활성을 없애는 것으로 밝혀졌다.

서열 9는 I-SceI 호밍 엔도뉴클레아제 인식 부위의 서열을 나타낸다.

서열 10은 바람직한 핵산 링커를 생성할 수 있는 핵산 서열을 나타낸다.

서열 11은 바람직한 핵산 링커를 나타낸다. MAL은 말레이미드이다. 이 링커는 서열 14와 조합되어 사용된다.

서열 12는 바람직한 핵산 링커를 나타낸다. MAL은 말레이미드이다. 이 링커는 서열 15와 조합되어 사용된다.

서열 13은 바람직한 핵산 링커를 나타낸다. MAL은 말레이미드이다. 이 링커는 서열 16과 조합되어 사용된다.

서열 14는 바람직한 15량체 핵산 링커를 나타낸다. MAL은 말레이미드이다. 이 링커는 서열 11에 상보적이고 이와 조합되어 사용된다.

서열 15는 바람직한 15량체 핵산 링커를 나타낸다. MAL은 말레이미드이다. 이 링커는 서열 12에 상보적이고 이와 조합되어 사용된다.

서열 16은 바람직한 15량체 핵산 링커를 나타낸다. MAL은 말레이미드이다. 이 링커는 서열 13에 상보적이고 이와 조합되어 사용된다.

본 발명의 상세한 설명

개시된 생성물 및 방법의 여러가지 응용은 당업계의 특정한 요구에 맞추어 질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어는 본 발명의 특정 실시양태를 설명하는 목적만으로 사용되었으며, 제한할 의도가 없다는 것이 또한 이해되어야 한다.

본 명세서 및 하기하는 특허청구범위에서 사용된 의미에 더해, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는, 내용상 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수 대상도 포함한다. 즉, 예를 들면, "구축물"이라 함은 "구축물들"도 포함하고, "막횡단 포어"라 함은 2개 이상의 이러한 포어를 포함하고, "분자 어댑터"라 함은 2개 이상의 이러한 어댑터를 포함하는 등이다.

본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 상기한 것이든 하기한 것이든 관계없이, 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

어댑터

본 발명은 핵산 시퀀싱용 어댑터를 제공한다. 어댑터는 이중 가닥 핵산 영역을 포함한다. 상기 영역의 적어도 하나의 말단은 회문식 절단 부위의 1/2를 형성한다. 어댑터는 다른 어댑터와 차별적으로 선택가능하다. 일부 실시양태에서, 상기 영역은 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 어댑터는 헤어핀 루프를 포함한다. 본 발명의 어댑터는 전형적으로 한 쌍의 어댑터의 일부로서 사용된다.

본 발명의 어댑터는 여러 장점을 갖는다. 어댑터는 이중 가닥 핵산 주형의 양 가닥을 포함하는 목적하는 단일 가닥 시퀀싱 구축물의 구축, 정제 및 최종 방출을 용이하게 한다. 이는 구축물이 시퀀싱될 때, 이중 가닥 핵산 내 각 위치가 단지 한번만 관찰되게 하지 않고, 실제로 2회 조사되게 한다. 이는 핵산 내 각 위치를 관찰하고, 각 위치에서의 양 염기에 대한 총 호출이 단일 관찰시에 가능한 것 보다 더 높은 품질 스코어를 갖게 하는데 보다 큰 확실성을 제공한다. 다시 말하면, 본 발명의 어댑터의 핵심 장점은 이들이 이중 가닥 주형의 각각의 '염기 쌍' 위치가 동일한 '판독 이벤트'의 일부로서 효과적으로 2회 조사되게 한다는 것이다. 이는 생성되는 서열 품질을 결과적으로 매우 훨씬 높이면서, 잘못확인되는 염기 호출 또는 완전한 염기 누락 가능성은 낮춘다.

이는 특히 dsDNA 또는 dsRNA를 시퀀싱하는데 도움이 된다. 본 발명의 어댑터는 dsDNA 및 dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥 둘 모두를 함유하는 구축물의 생성을 가능하게 한다. dsDNA 또는 dsRNA의 각각의 '염기 쌍' 위치는 효과적으로 2회 조사될 수 있다; 한번은 센스 가닥에 대해, 그리고 한번은 안티센스 가닥에 대해.

이와 같이 각 위치를 2회 조사하는 능력은 확률론적 감지를 이용하여 핵산을 시퀀싱할 때 특히 중요하다. 이같은 시퀀싱은 정상적으로는 막횡단 포어에 의해 모든 염기가 차례로 포획되는 것 및 포어를 통해 흐르는 전류가 감소되는 정도를 정확하게 결정할 수 있게 하는 충분히 높은 샘플링 속도에 의존적이다. 모든 염기를 효과적으로 2회 조사할 수 있으면 충분히 높은 속도에서 모든 염기를 포획할 필요가 줄어든다.

또한, 본 발명의 어댑터는 핵산이 확률론적 감지에 적합한 형태로 제공되게 한다. 오직 단일 가닥 핵산만이 막횡단 포어를 통과할 수 있다. 또한, 본원에서 기재하는 시퀀싱 방법의 필수적인 부분인 많은 핵산 취급 효소는 단지 단일 가닥 핵산 만을 취급할 수 있다.

각 위치를 2회 조사할 수 있는 능력은 또한 확률론적 감지를 이용하여 메틸시토신과 티민을 구별하는데 도움이 된다. 이들 두 염기는 막횡단 포어를 통과하고 이와 상호작용할 때 매우 유사한 전류 흔적을 야기한다. 따라서 이는 이들 둘의 구별을 어렵게 할 수 있다. 그러나, 핵산에서 각 위치를 2회 조사하는 것은, 메틸시토신의 상보적인 염기가 구아닌인 반면 티민의 상보적인 염기는 아데닌이므로, 그러한 구별을 가능하게 할 것이다. 메틸시토신은 암을 비롯한 다양한 질환과 물론 관련이 있다.

인공적인 서열, 본 발명의 어댑터는 그의 실제 서열에서 가요성의 정도가 커서, 사용되는 서열에 관능성을 부가할 수 있다. 예를 들어, 어댑터-특이적 서열을 각 어댑터에 부가할 수 있다. 이는 특정 어댑터를 함유하는 구축물을 다른 어댑터를 함유하는 것과 구별되게 한다. 이는 특히 별개의 개별 공급원으로부터 기원한 주형의 멀티플렉스 서열 분석에 도움이 된다.

어댑터는 핵산을 시퀀싱하기 위한 것이다. 어댑터는 바람직하게는 이중 가닥 핵산 주형의 양 가닥을 함유하는 단일 가닥 핵산 구축물을 생성하여 이중 가닥 핵산을 시퀀싱하기 위한 것이다. 어댑터는 보다 바람직하게는 dsDNA 또는 dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥을 둘 모두 함유하는 단일 가닥 핵산 구축물을 생성하여 dsDNA 또는 dsRNA를 시퀀싱하기 위한 것이다.

이중 가닥 핵산 영역

어댑터는 이중 가닥 핵산 영역을 포함한다. 이러한 영역의 존재는 본 발명의 어댑터가 다른 이중 가닥 핵산, 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA에 라이게이션될 수 있음을 의미한다. 본 발명의 어댑터는 또한 그 자체에, 또는 다른 유형의 어댑터와 라이게이션될 수 있다. 이하에서 보다 상세하게 기재하는 바와 같이, 이같은 라이게이션은 완전한 회문식 절단가능한 부위를 형성시킬 것이다. 본 발명의 어댑터가 이중 가닥 핵산에 또는 그 자체에 라이게이션되게 하는데 적합한 조건을 이하에서 논의한다.

이중 가닥 핵산 영역은 임의의 유형의 핵산을 포함할 수 있다. 핵산은 2 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 거대분자이다. 취급되는 핵산은 임의의 뉴클레오티드의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 자연 발생된 것이거나 인공적인 것일 수 있다. 뉴클레오티드는 전형적으로 핵염기, 당 및 적어도 하나의 포스페이트 기를 함유한다. 핵염기는 전형적으로 헤테로시클릭이다. 핵염기는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 퓨린 및 피리미딘을 포함하고, 보다 구체적으로 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실 및 시토신을 포함한다. 당은 전형적으로 펜토스 당이다. 뉴클레오티드 당은, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 리보스 및 데옥시리보스를 포함한다. 뉴클레오티드는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드이다. 뉴클레오티드는 전형적으로 모노포스페이트, 디포스페이트 또는 트리포스페이트를 함유한다. 포스페이트는 뉴클레오티드의 5' 또는 3' 측면에 부착될 수 있다.

뉴클레오티드는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 아데노신 모노포스페이트 (AMP), 아데노신 디포스페이트 (ADP), 아데노신 트리포스페이트 (ATP), 구아노신 모노포스페이트 (GMP), 구아노신 디포스페이트 (GDP), 구아노신 트리포스페이트 (GTP), 티미딘 모노포스페이트 (TMP), 티미딘 디포스페이트 (TDP), 티미딘 트리포스페이트 (TTP), 우리딘 모노포스페이트 (UMP), 우리딘 디포스페이트 (UDP), 우리딘 트리포스페이트 (UTP), 시티딘 모노포스페이트 (CMP), 시티딘 디포스페이트 (CDP), 시티딘 트리포스페이트 (CTP), 시클릭 아데노신 모노포스페이트 (cAMP), 시클릭 구아노신 모노포스페이트 (cGMP), 데옥시아데노신 모노포스페이트 (dAMP), 데옥시아데노신 디포스페이트 (dADP), 데옥시아데노신 트리포스페이트 (dATP), 데옥시구아노신 모노포스페이트 (dGMP), 데옥시구아노신 디포스페이트 (dGDP), 데옥시구아노신 트리포스페이트 (dGTP), 데옥시티미딘 모노포스페이트 (dTMP), 데옥시티미딘 디포스페이트 (dTDP), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP), 데옥시우리딘 모노포스페이트 (dUMP), 데옥시우리딘 디포스페이트 (dUDP), 데옥시우리딘 트리포스페이트 (dUTP), 데옥시시티딘 모노포스페이트 (dCMP), 데옥시시티딘 디포스페이트 (dCDP) 및 데옥시시티딘 트리포스페이트 (dCTP)를 포함한다. 뉴클레오티드는 바람직하게는 AMP, TMP, GMP, CMP, UMP, dAMP, dTMP, dGMP 또는 dCMP로부터 선택된다.

핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)일 수 있다. 핵산은 당업계에 공지된 2 가닥의 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA) 또는 뉴클레오티드 측쇄를 갖는 다른 합성 중합체를 포함할 수 있다. 이중 가닥 핵산 주형을 시퀀싱할 경우, 어댑터 내 핵산은 어댑터가 시퀀싱되는 이중 가닥 핵산에 라이게이션될 수 있도록 선택된다.

이중 가닥 핵산 영역은 2 개의 어댑터가 함께 라이게이션될 때 회문식 절단 부위가 기능적인 한, 임의의 길이일 수 있다. 이 영역은 전형적으로 길이가 40 개 염기 쌍 이하, 예컨대 30 개 염기 쌍 이하, 20 개 염기 쌍 이하 또는 10 개 염기 쌍 이하일 것이다. 이 영역은 바람직하게는 길이가 5 내지 20 개의 염기 쌍이고, 보다 바람직하게는 길이가 6 내지 10 개의 염기 쌍이다.

상기 영역은 2 개의 별개의 단일 가닥 핵산 가닥의 혼성화에 의해 형성될 수 있다. 2 개의 별개의 가닥은 이들이 혼성화되는 한, 동일한 유형의 핵산 또는 상이한 유형의 핵산일 수 있다. 2 개의 별개의 가닥은 상기한 임의의 유형의 핵산일 수 있다. 핵산이 혼성화되게 하는데 적합한 조건은 이하에서 보다 상세하게 논의한다.

이중 가닥 핵산 영역은 바람직하게는 어댑터가 헤어핀 루프를 포함하도록 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역이 혼성화되는 것에 의해 형성된다. 본 발명과 관련하여, 유형 I 어댑터는 헤어핀 루프를 포함한다. 이는 유형 I 어댑터가 이중 핵산 주형의 2 개의 가닥에 공유적으로 연결되도록 한다. 유형 II 어댑터도 헤어핀 루프를 포함할 수 있거나, 또는 포함하지 않을 수 있다. 유형 II 어댑터가 헤어핀 루프를 포함하는 것이 바람직하다. 헤어핀 루프의 형성은 당업계에 공지되어 있다. 헤어핀 루프는 전형적으로 단일 가닥 핵산으로부터 형성된다. 헤어핀 루프는 이중 가닥 핵산 영역을 구성하는 것과 동일한 핵산 유형일 수 있다. 별법적으로, 헤어핀 루프는 이중 가닥 핵산 영역을 구성하는 것과 다른 핵산 유형일 수 있다. 헤어핀 루프는 상기한 임의의 핵산 유형일 수 있다. 이하에서 보다 상세하게 논의하는 바와 같이, 헤어핀 루프는 본 발명의 어댑터의 차별적 선택가능성과 관련될 수 있다. 예를 들어, 헤어핀 루프는 선택가능한 결합 모이어티를 포함할 수 있다.

헤어핀 루프는 임의의 길이일 수 있다. 헤어핀 루프는 전형적으로 길이가 50 개 염기 이하, 예컨대 40 개 염기 이하, 30 개 염기 이하, 20 개 염기 이하 또는 10 개 염기 이하이다. 헤어핀 루프는 바람직하게는 길이가 약 1 내지 50 개, 2 내지 40 개 또는 6 내지 30 개 염기이다. 루프가 어댑터의 차별적 선택가능성과 관련되는 경우, 예컨대 염기가 15 내지 50 개인, 보다 긴 길이의 헤어핀 루프가 바람직하다. 유사하게, 루프가 어댑터의 차별적 선택가능성과 관련이 없는 경우, 예컨대 염기가 1 내지 5 개인, 보다 짧은 길이의 헤어핀 루프가 바람직하다.

헤어핀 루프가 없는 어댑터에서, 이중 가닥 핵산 영역은 2 개의 자유 말단을 가질 것이다. 이들 말단 중 하나 또는 둘 모두는 이중 가닥 핵산 주형에 라이게이션될 수 있다. 적어도 하나의 말단은 회문식 절단 부위의 1/2를 형성한다. 양 말단은 바람직하게는 동일한 회문식 절단 부위의 1/2를 형성한다. 말단 중 하나 또는 둘 모두는 또한 본 발명의 어댑터의 차별적 선택가능성과 관련될 수 있다. 바람직하게는, 어댑터의 한 말단은 이중 가닥 핵산 주형에 라이게이션되어 회문식 절단 부위의 1/2를 형성할 수 있고, 다른 말단은 어댑터의 차별적 선택가능성에 관련된다.

헤어핀 루프가 있는 어댑터에서, 이중 가닥 핵산 영역은 오직 하나의 자유 말단을 가질 것이다. 다른 말단은 헤어핀 루프에 의해 폐쇄된다. 자유 말단은 회문식 절단 부위의 1/2를 형성할 뿐만 아니라, 이중 가닥 핵산 주형에 라이게이션될 수 있다.

이중 가닥 핵산 영역의 자유 말단(들)은 임의의 형태일 수 있다. 말단(들)은 점착성일 수 있다. 다시 말하면, 말단(들)은 염기 쌍을 형성하지 않아야 한다. 점착성 말단(들)은 5' 또는 3' 오버행을 가질 수 있다. 말단(들)은 블런트인 것이 바람직하다. 즉, 말단(들)은 염기 쌍을 형성하는 것이 바람직하다. 특히 회문식 절단 부위의 1/2를 형성하는 영역의 말단(들)은 블런트인 것이 바람직하다.

헤어핀 루프가 없는 어댑터에서, 이중 가닥 핵산 주형에 라이게이션되고 회문식 절단 부위의 1/2를 형성하는 말단은 블런트이며, 어댑터의 차별적 선택가능성과 관련되는 다른 말단은 점착성인 것이 바람직하다.

회문식 절단 부위의 1/2

회문식 절단 부위는 여러 방식으로 절단될 수 있는 핵산 내 회문식 컨센서스 서열이다. 그러한 몇몇 서열이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에서 사용될 수 있다. 바람직한 회문식 절단 부위를 이하에 나타낸다.

회문식 절단 부위의 1/2는 회문식 컨센서스 서열의 정확하게 1/2이다. 다시 말하면, 그 자체와 재조합될 경우 완전한 회문식 절단 부위를 형성하는 회문식 절단 부위의 양이다. 상기 논의한 바와 같이, 회문식 절단 부위의 1/2를 형성하는 말단은 점착성이거나 블런트일 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 서열을 갖는 회문식 절단 부위의 경우:

회문식 절단 부위의 1/2는

또는

또는

일 수 있다.

상기 예에서, 첫번째 회문식 절단 부위의 1/2는 블런트 말단을 갖고, 두 번째의 2 개의 회문식 절단 부위의 1/2는 점착성 말단을 갖는다.

상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 어댑터는 전형적으로 쌍으로 사용되며, 쌍 내 한 유형의 어댑터는 쌍 내 다른 유형의 어댑터와 차별적으로 선택가능하다. 쌍 내 양 유형의 어댑터가 회문식 절단 부위의 1/2를 포함하기 때문에, 한 유형의 어댑터가 동일한 유형 또는 다른 유형의 어댑터와 라이게이션될 경우 완전한 회문식 절단 부위가 형성된다. 예를 들어, 유형 I이 유형 I (유형 I:유형 I)에 라이게이션되는 경우, 유형 II가 유형 II (유형 II:유형 II)에 라이게이션되는 경우 또는 유형 I이 유형 II (유형 I:유형 II)에 라이게이션되는 경우 완전한 회문식 절단 부위가 형성될 것이다. 완전한 회문식 절단 부위의 형성은 라이게이션된 어댑터가 절단되게 한다. 이는 이하에서 보다 상세하게 논의한다.

완전한 회문식 절단 부위는 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 회문식 절단 부위는 전형적으로 길이가 8 내지 50 개의 염기 쌍, 예컨대 적어도 10 개의 염기 쌍, 적어도 12 개의 염기 쌍, 적어도 14 개의 염기 쌍, 적어도 16 개의 염기 쌍, 적어도 20 개의 염기 쌍, 적어도 30 개의 염기 쌍 또는 적어도 40 개의 염기 쌍이다. 시퀀싱 목적으로는 보다 긴 회문식 절단 부위가 더 나은데, 이는 아마도 서열이 유기체의 게놈 내에서 덜 무작위적으로 보일 것이기 때문이다. 완전한 무작위 게놈 서열 (물론 천연에서 발견되지는 않음)에서, 길이가 x 염기 쌍인 회문식 절단 부위는 매 4^x 염기 쌍마다 한번 발견될 것이다.

바람직한 회문식 절단 부위는 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함한다. 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 제한 엔도뉴클레아제 효소에 의해 절단되는 부위이다. 본 발명에서 사용하는데 적합한 제한 엔도뉴클레아제 효소에는, 이것으로 제한되는 것은 아니지만, 효소 분류 (EC) 그룹 3.1.21.4 및 3.1.21.5의 것들이 포함된다.

제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는 자연 발생 제한 엔도뉴클레아제 효소에 의해 절단되는 자연 발생 부위일 수 있다. 별법적으로, 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 및/또는 제한 엔도뉴클레아제는 비-자연 발생의 것일 수 있다. 본 발명에서 사용하기 위해 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 및/또는 제한 엔도뉴클레아제를 조작하는 것은 다양한 장점을 제공한다. 예를 들어, 엔도뉴클레아제를 길고/거나 드문 부위를 절단하도록 조작하는 것은 엔도뉴클레아제가 아마도 조사하고자 하는 이중 가닥 핵산 주형을 갖는 하나 이상의 부위를 덜 "우연히" 절단할 것임을 의미한다.

바람직한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 이하를 포함한다:

및

따라서, 이들 부위의 바람직한 절반에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 이하가 포함된다:

및

차별적 선택가능성

본 발명의 어댑터는 다른 어댑터와 차별적으로 선택가능하다. 본 발명의 어댑터는 본 발명의 다른 유형의 어댑터와 차별적으로 선택가능하다. 유형 I 어댑터는 유형 II 어댑터와 차별적으로 선택가능하다. 차별적인 선택가능성이란 적어도 하나의 특성에 기초하여 한 유형의 어댑터를 다른 유형의 어댑터와 구분 또는 구별할 수 있음을 의미한다. 상이한 유형의 어댑터를 차별적으로 선택하는데 임의의 특성을 이용할 수 있다.

일반적으로, 상이한 유형의 어댑터는 이들이 서로 분리될 수 있기 때문에 차별적으로 선택가능하다. 쌍으로 사용되는 경우, 쌍 내 각 유형의 어댑터는 서로 분리될 수 있다. 예를 들어, 유형 I 어댑터는 유형 II 어댑터와 분리될 수 있고, 그 반대도 가능하다. 이는 이하에서 보다 상세하게 논의하는 본 발명의 방법을 용이하게 한다. 임의의 분리 수단을 사용할 수 있다.

차별적 선택은 바람직하게는 표면에의 차별적이거나 선택적인 결합을 수반한다. 예를 들어, 본 발명의 2 유형의 어댑터는 하나만 표면 A에 결합하고, 다른 하나만 표면 B에 결합하는 경우 물론 차별적으로 선택될 수 있다. 따라서 본 발명의 어댑터는 이들이 특이적으로 표면에 결합한다면 차별적으로 선택가능하다. 어댑터는 이들이 상이한 유형의 어댑터보다 훨씬 큰 정도로 표면에 결합하는 경우, 표면에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 어댑터는 다른 유형의 어댑터는 결합하지 않는 표면에 결합한다. 적합한 표면을 이하에서 보다 상세하게 논의한다.

어댑터는 차별적인 결합에 의해 다른 어댑터와 분리될 수 있는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 2 유형의 어댑터 (예를 들어 유형 A 및 B)는 제1 유형의 어댑터 (유형 A)가 한 표면 (표면 A)에 특이적으로 결합하고, 제2 유형의 어댑터 (유형 B)가 또 다른 표면 (표면 B)에 결합하는 경우, 서로 분리될 수 있다. 2 유형의 어댑터의 혼합물은 라이게이션되지 않은 양 유형의 어댑터, 뿐만 아니라 유형 A:유형 A, 유형 B:유형 B 및 유형 A:유형 B의 라이게이션된 구축물도 함유할 것이다. 상기 혼합물을 표면 A와 접촉시키면 유형 A 어댑터 및 유형 A 어댑터를 포함하는 임의의 구축물이 결합될 것이다. 유사하게, 상기 혼합물을 표면 B와 접촉시키면 유형 B 어댑터 및 유형 B 어댑터를 포함하는 임의의 구축물이 결합될 것이다. 라이게이션된 구축물은 물론 회문식 절단 부위를 이용하여 절단할 수 있다.

어댑터는 바람직하게는 선택가능한 결합 모이어티를 포함한다. 선택가능한 결합 모이어티는 그의 결합 특성에 기초하여 선택될 수 있는 모이어티이다. 따라서, 선택가능한 결합 모이어티는 바람직하게는 표면에 특이적으로 결합되는 모이어티이다. 선택가능한 결합 모이어티는 본 발명에서 사용된 임의의 다른 모이어티에 비해 훨씬 큰 정도로 표면에 결합하는 경우 표면에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 모이어티는 본 발명에서 사용된 다른 모이어티는 결합하지 않는 표면에 결합한다. 존재하는 경우, 헤어핀 루프는 바람직하게는 선택적 결합 모이어티를 포함한다.

적합한 선택적 결합 모이어티는 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 선택적 결합 모이어티에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 비오틴, 핵산 서열, 항체, 항체 단편, 예컨대 Fab 및 ScSv, 항원, 핵산 결합 단백질, 폴리 히스티딘 꼬리 및 GST 태그가 포함된다. 가장 바람직한 선택적 결합 모이어티는 비오틴 및 선택가능한 핵산 서열이다. 비오틴는 아비딘으로 코팅된 표면에 특이적으로 결합한다. 선택가능한 핵산 서열은 상동성 서열로 코팅된 표면에 특이적으로 결합 (즉, 혼성화)한다. 이하에서 이를 보다 상세하게 논의한다. 별법적으로, 선택가능한 핵산 서열은 핵산 결합 단백질로 코팅된 표면에 특이적으로 결합한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 한 쌍의 어댑터 내 한 유형의 어댑터는 비오틴을 포함하고, 다른 유형의 어댑터는 선택가능한 핵산 서열을 포함한다.

서열 확인

바람직한 실시양태에서, 어댑터는 어댑터의 확인을 가능케하는 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열은 이중 가닥 핵산 영역 또는, 존재하는 경우 헤어핀 루프에 존재할 수 있다.

핵산 서열은 전형적으로 길이가 12 개 염기 이하, 예컨대 10 개 염기 이하, 8 개 염기 이하 또는 6 개 염기 이하이다. 이는 어댑터를 포함하는 구축물이 본 발명에 따라 시퀀싱될 때 확인될 수 있는 인식가능한 서열을 포함한다. 헤어핀 루프를 포함하는 어댑터에서, 서열은 조사 및 시퀀싱하고자 하는 2 가닥의 핵산에 연결된 어댑터 부분으로서 확인될 것이다. 헤어핀 루프가 없으면서 절단되거나 틈이 생길 수 있는 어댑터에서, 서열은 전형적으로 이중 가닥 핵산 주형에 라이게이션된 말단 및 절단되거나 틈이 생길 수 있는 어댑터의 지점 사이에 존재한다. 그러한 실시양태에서, 서열은 어댑터가 절단되거나 틈이 생긴 경우에도 이중 가닥 핵산 주형에 라이게이션된 채로 잔류한다.

바람직한 실시양태에서, 핵산 서열은 라이게이션된 2 가닥의 공급원을 확인시킨다. 그러한 실시양태에서, 어댑터는 별개의 개별 공급원으로부터 기원한 주형의 멀티플렉스 서열 분석을 가능하게 한다. 각각의 주형은 각각 주형의 공급원을 확인가능하게 하는 핵산 서열을 포함하는 상이한 어댑터로 지정된다.

절단되거나 또는 틈이 생길 수 있는 어댑터

일부 실시양태에서, 어댑터는 그 자체가 절단되거나 틈이 생길 수 있다. 다시 말하면, 어댑터는 다른 어댑터에 라이게이션될 필요없이 절단되거나 틈이 생길 수 있다. 이중 가닥 핵산 영역은 절단되거나 틈이 생길 수 있고/거나, 존재하는 경우 헤어핀 루프가 절단되거나 틈이 생길 수 있다. 헤어핀 루프가 존재하는 어댑터에서, 회문식 절단 부위의 1/2를 형성하는 어댑터의 말단 (즉, 이중 가닥 서열 주형에 라이게이션되는 어댑터의 말단)은 선택가능한 결합 모이어티로부터 분리될 수 있는 것이 바람직하다. 헤어핀 루프가 없는 어댑터에서, 어댑터의 말단 중 하나 또는 둘 모두는 선택가능한 결합 모이어티로부터 분리될 수 있는 것이 바람직하다.

절단되거나 틈이 생길 수 있는 어댑터는 바람직하게는 하나 이상, 예컨대 2, 3 개 또는 그 보다 많은 절단 또는 틈 부위를 함유한다. 임의의 절단 또는 틈 부위가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 그러한 부위에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 화학적 절단 또는 틈 부위, RNA/DNA 복합 부위, 비-천연 염기 (예를 들어, 우라실) 및 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 및 호밍 엔도뉴클레아제 인식 부위가 포함된다.

절단되거나 틈이 생길 수 있는 어댑터는 보다 바람직하게는 하나 이상의 제한 또는 호밍 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함한다. 제한 또는 호밍 엔도뉴클레아제 인식 부위(들)는 어댑터가 본 발명의 또 다른 어댑터에 라이게이션될 경우에 형성되는 회문식 절단 부위가 아닌 것이 바람직하다. 적합한 제한 또는 호밍 엔도뉴클레아제 인식 부위는 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 호밍 엔도뉴클레아제 인식 부위에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 다음이 포함된다:

어댑터 쌍

본 발명은 또한 본 발명의 어댑터 쌍을 제공한다. 쌍에서 한 유형의 어댑터는 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함한다 (유형 I). 쌍에서 다른 유형의 어댑터는 헤어핀 루프를 가질 수도 있고 갖지 않을 수도 있다 (유형 II). 유형 II 어댑터는 바람직하게는, 역시 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되며 헤어핀 루프를 포함한다. 쌍에서 각각의 유형의 어댑터는 다른 유형과 차별적으로 선택가능하다. 완전한 회문식 절단 부위는 두 유형의 어댑터의 임의의 조합이 서로 라이게이션될 경우에 형성된다. 어댑터는 상기에서 논의한 임의의 것일 수 있다.

유형 I 어댑터는 유형 II 어댑터와 분리될 수 있고, 그 반대도 가능한 것이 바람직하다. 상기한 임의의 분리 방법을 사용할 수 있다. 유형 I 어댑터는 차별적 결합에 의해 유형 II 어댑터와 분리될 수 있는 것이 보다 바람직하다. 유형 I 어댑터는 유형 II 어댑터와 다른 선택가능한 결합 모이어티를 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 바람직하게는, 유형 I 어댑터는 선택가능한 핵산을 포함하며, 유형 II 어댑터는 비오틴을 포함한다. 이들 모든 실시양태는 이하에서 보다 상세하게 논의하는 본 발명의 방법을 용이하게 한다.

또한 유형 I 어댑터는 그 자체가 절단되거나 틈이 생길 수 없고, 유형 II는 그 자체가 절단되거나 틈이 생길 수 있는 것이 바람직하다. 유형 II 어댑터는 상기에서 논의한 임의의 방식으로 절단되거나 틈이 생길 수 있다.

유형 I 어댑터는 어댑터의 확인을 가능하게 하는 핵산 서열을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

가장 바람직한 본 발명의 어댑터 쌍을 하기 표 1에 요약한다.

키트

본 발명은 또한 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함하는 (유형 I) 적어도 2 개의 본 발명의 어댑터 집단을 포함하는 키트를 제공한다. 각 집단 내 모든 어댑터는 집단에 특이적인 핵산 서열을 포함한다. 즉, 집단 내 각각의 어댑터는 어댑터가 그 집단의 일부인지 다른 집단 중 하나의 일부가 아닌지를 확인시켜주는 서열을 포함한다. 2 이상의 집단은 2 이상의 별개의 개별 공급원, 예컨대 2 이상의 유기체로부터 기원한 이중 가닥 핵산 주형의 멀티플렉스 서열 분석을 가능하게 한다. 적합한 유기체는 이하에서 논의한다. 각각의 주형은 각각 주형의 공급원의 확인을 가능하게 하는 핵산 서열을 포함하는 상이한 집단으로 지정된다. 핵산 서열을 확인하는 것은 각 집단마다 다를 것이다. 서열은 전형적으로 각각의 2 이상의 집단의 어댑터에서 동일한 위치에 위치한다. 이는 집단 사이의 효율적인 구별을 가능하게 한다. 어댑터의 확인을 가능하게 하는 핵산 서열은 상기에서 보다 상세하게 논의하였다. 상기에서 논의한 임의의 실시양태를 본 발명의 키트에 적용할 수 있다.

키트는 임의의 개수의 집단, 예컨대 5, 10, 20, 50, 100 개 이상의 집단을 포함할 수 있다.

키트는 바람직하게는 모든 유형 I 어댑터가 유형 II 어댑터와 쌍을 형성하도록 2 이상의 집단의 유형 II 어댑터를 더 포함한다. 어댑터 쌍은 상기에서 보다 상세하게 논의하였다. 상기에서 논의한 임의의 실시양태를 본 발명의 키트에 적용할 수 있다.

본 발명은 또한 한 쌍의 본 발명의 어댑터 및 회문식 절단 부위를 절단하기 위한 수단을 포함하는 이중 가닥 핵산 시퀀싱용 키트를 제공한다. 상기 수단은 전형적으로 상기에서 논의한 바와 같은 효소이다.

본 발명의 키트는 부가적으로, 상기에서 언급한 임의의 실시양태를 수행할 수 있게 하는 하나 이상의 다른 시약 또는 기구를 포함할 수 있다. 그러한 시약 또는 기구로는 하나 이상의 다음과 같은 것이 포함된다: 적합한 완충제(들) (수용액), 대상체로부터 샘플을 수득하기 위한 수단 (예컨대 용기 또는 바늘을 포함하는 기구), 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭, 발현 및/또는 시퀀싱하기 위한 수단, 상기에서 규정한 바와 같은 막, 상기에서 규정한 바와 같은 표면 또는 전압 또는 패치 클램프 장치. 시약은 키트에 건조 상태로 존재할 수 있고, 유체 샘플로 시약을 재현탁시킨다. 키트는 또한 임의로, 키트를 본 발명의 방법에 사용할 수 있도록 하는 지침서 또는 방법을 사용할 수 있는 환자에 관한 상세를 포함할 수 있다. 키트는 임의로 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

핵산 구축물

본 발명은 또한 서열 주형으로서 사용하기 위한 핵산 구축물을 제공한다. 구축물은 이중 가닥 핵산을 시퀀싱하는데 유용하다. 구축물은 일반적으로 적어도 하나의 본 발명의 어댑터에 라이게이션된 2 가닥의 핵산을 포함한다. 이는 전형적으로 결정할 필요가 있는 2 가닥의 핵산 서열이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 본 발명의 어댑터에 라이게이션된 이중 가닥 핵산을 포함하는 시퀀싱 주형으로서 사용하기 위한 핵산 구축물을 제공한다. 구축물은 이중 가닥 핵산의 각 말단에 라이게이션된 2 개의 어댑터를 포함할 수 있다. 구축물은 상기에서 논의한 임의의 어댑터를 포함할 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함하는 본 발명의 어댑터 (유형 I)를 통해 공유적으로 연결된 2 가닥의 핵산을 포함하는 시퀀싱 주형으로서 사용하기 위한 단일 가닥 핵산 구축물을 제공한다. 2 가닥은 전형적으로 이중 가닥 핵산, 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA로부터 유래된다. 구축물은 상기에서 논의한 임의의 유형 I 어댑터를 포함할 수 있다. 그러한 구축물은 상기한 바와 같은 몇몇 장점을 갖는다. 일부 경우에, 단일 가닥 구조의 형성을 위해 구축물을 변성시키는 것이 필요할 수 있다. 핵산을 변성시키는데 적합한 조건은 이하에서 보다 상세하게 논의한다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 2 개의 분리된 단일 가닥 핵산 영역 사이의 혼성화에 의해 형성되고 헤어핀 루프를 포함하는 본 발명의 어댑터 (유형 I)를 통해 각 말단에서 공유적으로 연결된 2 가닥의 핵산을 포함하는 원형 핵산 구축물을 제공한다. 2 가닥은 전형적으로 이중 가닥 핵산, 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA로부터 유래된다. 구축물은 상기에서 논의한 임의의 유형 I 어댑터를 포함할 수 있다.

이러한 모든 실시양태에서, 2 가닥은 바람직하게는 dsDNA 또는 dsRNA의 센스 및 안티센스 가닥이다.

본 발명의 어댑터의 제조 방법

본 발명은 또한 본 발명의 어댑터의 제조 방법을 제공한다. 방법은 (i) 서로 혼성화되어 회문식 절단 부위의 1/2을 형성할 수 있고 (ii) 또 다른 어댑터의 핵산과 차별적으로 선택가능한 2 종의 핵산을 제공하는 것을 포함한다. 이러한 특성은 모두 본 발명의 어댑터와 관련하여 상기에서 상세하게 논의하였다. 핵산을 이들이 혼성화되도록 하는 조건하에서 접촉시키고, 본 발명의 어댑터를 제조한다. 그러한 조건은 이하에서 상세하게 논의한다.

본 발명은 또한 유형 I 어댑터를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 (i) 서로 혼성화될 수 있는 두 영역, (ii) 또 다른 어댑터의 루프 형성 영역과 차별적으로 선택가능한 루프 형성 영역 및 (iii) 함께 회문식 절단 부위의 1/2을 형성하는 두 말단을 포함하는 단일 가닥 핵산을 제공하는 것을 포함한다. 이러한 특성은 모두 본 발명의 어댑터와 관련하여 상기에서 상세하게 논의하였다. 핵산을 두 영역이 혼성화되고 헤어핀 루프가 형성되게 하는 조건에 노출시켜, 유형 I 어댑터를 제조한다.

서로 혼성화될 수 있는 핵산 또는 영역은 바람직하게는 서열 동일성에 기초하여 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 98％, 적어도 99％의 상동성을 공유한다. 핵산 또는 영역은 상보적인 것이 보다 바람직하다 (즉, 서열 동일성에 기초하여 100％ 상동성을 공유).

상동성을 결정하기 위해 당업계의 표준 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, UWGCG 패키지는 예를 들면 그의 디폴트 설정에 사용된 상동성의 계산을 위해 사용될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (문헌 [Devereux et al., (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395]). PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 예를 들면 문헌 [Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300]; [Altschul, S.F et al., (1990) J Mol Biol 215:403-10]에 기재된 바에 따라, 상동성 또는 라인업 서열의 계산 (예컨대 동등한 잔기 또는 상응하는 서열 (전형적으로 그들의 디폴트 설정에 기초함)을 확인하는 것)을 위해 사용될 수 있다.

BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)을 통해 공중이 이용가능하다. 이 알고리즘은 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어와 정렬된 경우, 몇몇 양성-값 역치 스코어 T와 매칭되거나 또는 이를 만족시키는 질문 서열에서 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍 (HSP)을 확인하는 것을 포함한다. T는 근접 단어 스코어 역치를 지칭한다 (문헌 [Altschul et al., 상기 문헌]). 이들 초기의 근접 단어 히트는 이들 함유하는 HSP를 찾기 위한 검색의 개시를 위한 시드 (seed)로서 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성 값으로부터 X의 양만큼 하락하거나; 하나 이상의 음의 값으로 스코어링된 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 스코어가 0 이하로 떨어지거나; 또는 어느 한쪽의 서열의 끝에 도달한 경우, 각각의 방향으로의 단어 히트의 연장이 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 민감도 및 정렬의 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 단어 길이 (W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919] 참조) 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M=5, N=4, 및 두 가닥의 비교를 디폴트로서 사용한다.

BLAST 알고리즘은 두 개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다; 예를 들면, 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787] 참조. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 척도는, 2개의 아미노산 서열 사이에 매치가 우연히 발생할 확률을 나타내는 최소 합계 확률 (P(N))이다. 예를 들면, 첫 번째 서열과 두 번째 서열을 비교한 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만 및 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 서열이 다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.

혼성화를 허용하는 조건은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1995)]). 혼성화는 저 엄격성 조건, 예를 들어 37℃에서 30 내지 35％ 포름아미드의 완충 용액, 1 M NaCl 및 1％ SDS (나트륨 도데실 술페이트)의 존재하에 행할 수 있고, 이어서 50℃에서 1X (0.1650 M Na+) 내지 2X (0.33 M Na+) SSC (표준 시트르산나트륨)로 세척할 수 있다. 혼성화는 중등도의 엄격성 조건, 예를 들어 37℃에서 40 내지 45％ 포름아미드의 완충 용액, 1 M NaCl, 및 1％ SDS의 존재하에 행할 수 있고, 이어서 55℃에서 0.5X (0.0825 M Na+) 내지 1X (0.1650 M Na+) SSC로 세척할 수 있다. 혼성화는 고 염격성 조건, 예를 들어 37℃에서 50％ 포름아미드의 완충 용액, 1 M NaCl, 1％ SDS의 존재하에 행할 수 있고, 이어서 60℃에서 0.1X (0.0165 M Na+) SSC로 세척할 수 있다.

본 발명의 구축물의 제조 방법

본 발명은 또한 본 발명의 구축물을 제조하는 다양한 방법을 제공한다. 본 발명의 구축물은 상기에서 논의하였다. 본 발명의 임의의 구축물은 이들 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 구축물의 제조 방법을 제공한다. 방법은 적어도 하나의 본 발명의 어댑터를 2 가닥의 핵산과, 어댑터(들) 및 가닥 사이에 라이게이션을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함한다. 상기에서 논의한 임의의 어댑터를 이용할 수 있다. 2 가닥은 전형적으로 이중 가닥 핵산, 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA로부터 유래된다. 핵산을 라이게이션시키는데 적합한 조건은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 조건으로 50 mM 트리스 HCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 10 mM 디티오트레이톨, pH 7.5 및 25℃가 포함되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 이어서, 어댑터(들)이 2 가닥과 라이게이션되게 하여 핵산 구축물을 제조한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 단일 가닥 핵산 구축물의 제조 방법을 제공한다. 방법은 유형 I 어댑터를 2 가닥의 핵산과, 어댑터 및 가닥 사이에 라이게이션을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함한다. 상기에서 논의한 임의의 유형 I 어댑터를 이용할 수 있다. 2 가닥은 전형적으로 이중 가닥 핵산, 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA로부터 유래된다. 핵산을 라이게이션시키는데 적합한 조건은 상기에서 논의되었다. 어댑터가 2 가닥의 각 말단에 공유적으로 연결되게 한다. 이어서, 공유적으로 연결된 구축물을 변성시켜 단일 가닥 핵산 구축물을 제조한다. 핵산을 변성시키는데 적합한 조건에는 pH, 온도 및 이온 강도가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 원형 핵산 구축물의 제조 방법을 제공한다. 방법은 적어도 2 개의 유형 I 어댑터를 2 가닥의 핵산과, 어댑터 및 가닥 사이에 라이게이션을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 것을 포함한다. 적어도 2 개의 유형 I 어댑터는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기에서 논의한 임의의 유형 I 어댑터를 이용할 수 있다. 2 가닥은 전형적으로 이중 가닥 핵산, 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA로부터 유래된다. 핵산을 라이게이션시키는데 적합한 조건은 상기에서 논의되었다. 이어서, 어댑터가 2 가닥의 각 말단에 공유적으로 연결되게 하여, 원형 핵산 구축물을 제조한다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 서열 구축물의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 유형 I 어댑터를 통해 공유적으로 연결된 2 가닥의 이중 가닥 핵산을 포함하는 단일 가닥 핵산 구축물이 제조되게 한다. 이 방법은 이중 가닥 핵산을 제공하는 것을 포함한다. 제공되는 것으로는 바람직하게는 무작위적으로 단편화된 주형 핵산이 포함된다. 이중 가닥 핵산의 말단은 수선되어 블런트 말단으로 형성될 수 있다. 상기에서 논의한 임의의 핵산을 이용할 수 있다. 방법은 전형적으로 서열이 공지되지 않은 이중 가닥 핵산을 이용하여 수행된다. 별법적으로, 방법은 서열이 공지되거나 예상될 수 있는 이중 가닥 핵산을 이용하여 수행된다.

방법은 임의의 유기체 또는 미생물로부터 수득되거나 추출된 이중 가닥 핵산에 대해 시험관내에서 수행될 수 있다. 유기체 또는 미생물은 전형적으로 원핵, 진핵 또는 고세균이며, 전형적으로 5 계: 식물계, 동물계, 진균계, 모네라계 및 원생생물계 중 하나에 속한다. 방법은 임의의 바이러스로부터 수득되거나 추출된 이중 가닥 핵산에 대해 시험관내에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 이중 가닥 핵산은 인간 기원이지만, 별법적으로 또 다른 포유동물, 예컨대 말, 소, 양 또는 돼지와 같은 상업적으로 사육되는 것으로부터 유래될 수 있거나 또는 별법적으로 고양이 또는 개와 같은 애완동물로부터 유래될 수 있다.

이중 가닥 핵산은 전형적으로 상기 방법을 거치기 이전에, 예를 들어 원심분리 또는 원치않는 분자 또는 세포, 예컨대 적혈구를 여과 제거하는 막을 통과시키는 것에 의해 처리된다. 이중 가닥 핵산은 취득 즉시 사용할 수 있다. 또한 이중 가닥 핵산은 전형적으로 상기 방법을 거치기 이전에 바람직하게는 -70℃ 미만에서 보관할 수 있다.

이중 가닥 핵산은 바람직하게는 dsDNA 또는 dsRNA이다.

이중 가닥 핵산을 본 발명의 유형 I 및 유형 II 어댑터 쌍과, 어댑터가 핵산에 라이게이션되게 하는 조건하에서 접촉시킨다. 유형 II 어댑터는 상기에서 논의한 바와 같이 그 자체가 절단되거나 틈이 생길 수 있다. 핵산을 라이게이션시키는데 적합한 조건은 상기에서 논의하였다. 적합한 유형 I 어댑터 및 유형 II 어댑터의 쌍도 상기에서 논의하였다.

이어서, 라이게이션된 생성물을 절단되거나 틈이 생길 수 있는 유형 II 어댑터와 특이적으로 결합하는 표면과 접촉시킨다. 유형 II 어댑터를 함유하는 임의의 구축물이 표면에 결합될 것이다. 적합한 표면으로는 금속 (특히 금), 아가로스, 덱스트란, 폴리스티렌, 유리, 실리카 (결합된 것 및 미결합된 것) 및 셀룰로스가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 표면은 유형 II 어댑터 상의 선택가능한 결합 모이어티에 특이적으로 결합한다. 가장 바람직하게는, 표면은 아비딘으로 코팅된다.

이어서, 임의의 미결합된 생성물을 제거한다. 이는 전형적으로 표면을 적합한 완충제로 세척하는 것에 의해 이루어진다. 적합한 완충제로는 적합한 이온 농도의 트리스, HEPES 및 MOPS가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 이 단계는 유형 I 어댑터가 유형 I 어댑터에 라이게이션되어 형성된 모든 구축물 (유형 I:유형 I)을 제거한다.

이어서, 표면을 완전한 회문식 절단 부위를 인식하는 효소와 접촉시킨다. 적합한 효소는 상기에서 논의하였다. 이 단계는 어댑터 대 어댑터, 즉, 유형 I:유형 II 또는 유형 II:유형 II의 라이게이션으로부터 형성된 임의의 잔류 (즉, 결합된) 구축물을 절단할 것이다.

다시, 임의의 미결합 생성물을 전형적으로는 세척에 의해 제거한다. 이 단계는 이중 가닥 핵산을 함유하는 단리물 또는 구축물 내의 오직 유형 II 어댑터 만이, 그리고 적어도 하나의 유형 II 어댑터가 표면에 결합된 채로 잔류하게 한다.

이어서, 유형 II 어댑터를 절단시킨다. 이를 행하는 방법은 상기에서 논의하였다. 이 단계는 표면으로부터 이중 가닥 핵산 및 적어도 하나의 유형 II 어댑터를 함유하는 구축물이 방출되게 한다.

이어서, 가용성 생성물을 절단되거나 틈이 생길 수 없는 유형 I 어댑터에 특이적으로 결합하는 표면과 접촉시킨다. 유형 I 어댑터를 함유하는 임의의 잔류 구축물이 표면에 결합한다. 각각의 구축물은 유형 I 어댑터를 통해 한쪽 말단에 공유적으로 연결된 이중 가닥 핵산을 함유할 것이다. 상기 표면은 바람직하게는 유형 I 어댑터 상의 선택가능한 결합 모이어티에 특이적으로 결합한다. 상기 표면은 보다 바람직하게는 유형 I 어댑터 내 선택가능한 핵산 서열과의 서열 동일성에 기초하여 적어도 80％, 예컨대 적어도 90％, 적어도 95％ 또는 적어도 99％ 상동성인 핵산 서열로 코팅된다. 상기 표면은 가장 바람직하게는 유형 I 어댑터 내 선택가능한 핵산 서열과 상보적인 핵산 서열로 코팅된다. 다시, 미결합된 생성물을 제거한다.

최종적으로, 표면으로부터 임의의 잔류 생성물을 방출시킨다. 이들 방출된 생성물은 본 발명의 시퀀싱 구축물이며, 이중 가닥 핵산은 유형 I 어댑터를 통해 한쪽 말단에 공유적으로 연결되어 있다. 구축물은 또한 이중 가닥 핵산의 말단에 유형 II 어댑터의 단편을 함유할 수 있다.

생성된 구축물은 단일 가닥 구축물의 형성을 위해 변성될 필요가 있을 수 있다. 이중 가닥 핵산을 변성시키는데 적합한 조건은 상기에서 논의하였다.

이중 가닥 핵산 시퀀싱 방법

본 발명은 또한 이중 가닥 핵산의 시퀀싱 방법을 제공한다. 상기 방법은 핵산 구축물을 제조하기 위한 것으로 상기에서 기재한 방법 중 하나를 수행하는 것을 포함한다. 구축물은 유형 I 어댑터를 통해 공유적으로 연결된 2 가닥의 핵산, 바람직하게는 DNA 또는 RNA를 함유한다. 필요한 경우, 구축물을 변성시켜 단일 가닥 구축물을 형성한다. 이를 행하기 위한 조건은 상기에서 기재하였다.

이어서, 단일 가닥 구축물을 시퀀싱한다. 단일 가닥 구축물의 시퀀싱은 한 가닥, 유형 I 어댑터 및 다른 가닥의 서열을 순서대로 제공할 것이다. 가닥은 물론 반대 방향의 배향으로 존재할 것이다. 일부 실시양태에서, 유형 II 어댑터의 단편도 또한 단일 가닥 핵산 구축물 내에 존재할 수 있다.

본 발명의 방법은 이중 가닥 핵산 내 각각의 위치가 2회 (즉, 각 가닥이 1회) 조사되기 때문에 유리하다. 본 방법은 바람직하게는 메틸시토신을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 이중 가닥 핵산을 시퀀싱하는 것을 포함한다. 유형 I 어댑터가 이중 가닥 핵산의 공급원을 확인시켜주는 핵산 서열을 포함할 경우, 이는 또한 본 발명의 방법에 의해 인식될 것이다.

이들 방법을 이용하여 구축물 전체 또는 단지 일부를 시퀀싱할 수 있다. 구축물은 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 구축물은 길이가 적어도 10, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150, 적어도 200, 적어도 250, 적어도 300, 적어도 400 또는 적어도 500 개 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 방법은 전형적으로 시험관내에서 수행된다.

모든 염기의 조사를 이중으로 효과적으로 행하는 것에 의해, 본 발명은 현존하는 모든 2 세대 시퀀싱 화학 및 개발 중인 다음 세대 시퀀싱 기술의 데이터 품질을 개선시킬 수 있다. 단일 가닥 핵산 구축물의 임의의 시퀀싱 방법을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 적합한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법으로는, 생거 (또는 디데옥시) 방법, 막삼-길버트 (화학적 절단) 방법, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)의 SOLiD (라이게이션에 의한 시퀀싱을 이용함), 발광물 게놈 분석기 (증폭된 주형에 대해 형광 가역적 종결자 화학을 이용함), 454 게놈 시퀀서 FLX (증폭된 주형에 대해 파이로시퀀싱 화학을 이용함), 헬리코스 헬리스콥(Helicos Heliscope) (비증폭된 (어댑터 변형된) 주형에 대해 형광 가역적 종결자 화학에 의한 진정한 단일 분자 시퀀싱을 이용함), 바이오나노매트릭스(Bionanomatrix) (에칭된 채널 내 염기의 전자 식별), 다나허 모션(Danaher Motion) ('폴로니(polony)' 시퀀싱), 링비타에(LingVitae) ('디자인 중합체' 시퀀싱), 형광 뉴클레오티드 DNA 중합에 의한 퍼시픽 바이오사이언시스(Pacific BioSciences)의 단일 분자 시퀀싱 및 비시겐(Visigen)의 시퀀싱 (DNA 중합 반응 동안 공여자와 수용자의 FRET 상호작용에 의한 시퀀싱)이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

또한, 막횡단 포어를 사용하여 핵산 분자를 시퀀싱할 수 있는 다수의 방법이 존재한다. 한 방법은 엑소뉴클레아제 효소, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 접근법에서, 엑소뉴클레아제 효소는 표적 핵산 가닥으로부터 뉴클레오티드를 연속적으로 떼어내는데 사용된다. 이어서, 뉴클레오티드가 검출되고, 그것이 방출되는 순서대로 포어에 의해 식별되어, 본래 가닥의 서열이 판독된다.

핵산을 시퀀싱하는 또 다른 방법은 인가된 전위와 조합되어 표적 핵산 가닥을 포어를 통해 밀거나 당기는 효소를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 접근법에서, 이온 전류는 표적 가닥 내의 뉴클레오티드가 포어를 통과함에 따라 변동된다. 전류의 변동은 가닥의 서열을 나타낸다.

핵산 가닥을 시퀀싱하는 세번째 방법은 포어 검출기에 아주 근접하여 폴리머라제의 부산물을 검출하는 것이다. 이러한 접근법에서, 뉴클레오시드 포스페이트 (뉴클레오티드)를 표지화하여, 포스페이트 표지된 종이 뉴클레오티드 가닥에의 폴리머라제 첨가시에 방출되도록 하고, 포스페이트 표지된 종이 포어에 의해 검출되도록 한다. 포스페이트 종은 각각의 뉴클레오티드에 대해 특정 표지를 함유한다. 뉴클레오티드가 핵산 가닥에 순차적으로 첨가됨에 따라, 염기 첨가의 부산물이 검출된다. 포스페이트 표지된 종이 검출되는 순서는 핵산 가닥의 서열을 결정하는데 사용될 수 있다.

이들 세가지 방법 중 임의의 것을 사용하여 본 발명에 따라 시퀀싱할 수 있다.

한 바람직한 실시양태에서, 시퀀싱은 (i) 엑소뉴클레아제를 갖고 분자 어댑터가 공유적으로 부착되어 있는 막횡단 포어와 구축물을 접촉시켜, 엑소뉴클레아제가 구축물의 한쪽 말단으로부터 개개의 뉴클레오티드를 소화시키도록 하는 단계; (ii) 뉴클레오티드를 포어와 접촉시켜 뉴클레오티드가 분자 어댑터와 상호작용하도록 하는 단계; (iii) 상호작용 동안 포어를 통과한 전류를 측정하여 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 단계; 및 (iv) 구축물의 동일한 말단에서 단계 (i) 내지 (iii)을 반복하여, 표적 서열의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행된다. 따라서, 상기 방법은 구축물 내의 일부 뉴클레오티드를 연속적인 방식으로 확률론적으로 감지하여 구축물을 시퀀싱하는 것을 포함한다. 개개의 뉴클레오티드는 이하에서 기재한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 시퀀싱은 (i) 핵산 취급 효소가 부착되어 있는 막횡단 포어와 구축물을 접촉시켜, 효소가 포어를 통해 구축물을 밀거나 당기게 하고, 구축물 내의 일부 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하게 하는 단계; 및 (ii) 각각의 상호작용 동안 포어를 통과한 전류를 측정하여 구축물의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수행된다. 따라서, 상기 방법은 뉴클레오티드가 연속적인 방식으로 배럴 또는 채널을 통과함에 따라 구축물 내의 일부 뉴클레오티드를 확률론적으로 감지하여 구축물을 시퀀싱하는 것을 포함한다.

막횡단 포어

막횡단 포어는 인가된 전위에 의해 구동된 이온이 막의 한쪽에서 막의 다른 쪽으로 흐르게 하는 포어이다. 포어는 바람직하게는 뉴클레오티드가 인가된 전위를 따라 막의 한쪽으로부터 다른 쪽으로 흐르게 한다. 포어는 바람직하게는 핵산, 예컨대 DNA 또는 RNA가 포어를 통해 밀거나 당겨지게 한다.

포어는 바람직하게는 막횡단 단백질 포어이다. 막횡단 단백질 포어는 인가된 전위에 의해 구동된 이온이 막의 한쪽으로부터 막의 다른 쪽으로 흐르게 하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 집합이다.

포어는 단리되거나, 실질적으로 단리되거나, 정제되거나, 또는 실질적으로 정제될 수 있다. 포어는 그것이 임의의 다른 성분, 예컨대 지질 또는 다른 포어로부터 완전히 유리될 경우 단리되거나 정제된다. 포어는 그것이 의도하는 용도에 영향을 미치지 않을 담체 또는 희석제와 혼합되었을 경우 실질적으로 단리된다. 예를 들어, 포어는 그것이 다른 성분, 예컨대 지질 또는 다른 포어를 10％ 미만, 5％ 미만, 2％ 미만 또는 1％ 미만으로 포함하는 형태로 존재하는 경우 실질적으로 단리되거나 실질적으로 정제된다. 포어는 전형적으로 지질 이중층으로 존재한다.

포어는 단량체 또는 올리고머일 수 있다. 포어는 바람직하게는 여러개의 반복되는 서브유닛, 예컨대 6, 7 또는 8 개의 서브유닛으로 구성된다. 포어는 보다 바람직하게는 7량체 포어이다. 포어는 전형적으로 이온이 흐를 수 있는 배럴 또는 채널을 포함한다. 포어의 서브유닛은 전형적으로 중심 축을 둘러싸고, 가닥이 막횡단 β 배럴 또는 채널 또는 막횡단 α-헬릭스 다발 또는 채널이 되게 한다.

포어의 배럴 또는 채널은 전형적으로 뉴클레오티드 또는 핵산과의 상호작용을 용이하게 하는 아미노산을 포함한다. 이들 아미노산은 바람직하게는 배럴 또는 채널의 수축점 근처에 위치한다. 포어는 전형적으로 하나 이상의 양으로 하전된 아미노산, 예컨대 아르기닌, 리신 또는 히스티딘을 포함한다. 이들 아미노산은 전형적으로 포어 및 뉴클레오티드 또는 핵산 사이의 상호작용을 용이하게 한다. 뉴클레오티드 검출은 어댑터에 의해 용이해질 수 있다. 이것은 이하에서 보다 상세하게 논의한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 포어는 β-배럴 포어, α-헬릭스 다발 포어 또는 고체 상태 포어일 수 있다. β-배럴 포어는 β-가닥으로부터 형성된 배럴 또는 채널을 포함한다. 적합한 β-배럴 포어는 β-독소, 예컨대 α-용혈소, 탄저균 독소 및 백혈구독, 및 박테리아의 외막 단백질/포린, 예컨대 미코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 포린 A (MspA), 외막 포린 F (OmpF), 외막 포린 G (OmpG), 외막 포스포리파제 A 및 네이세리아(Neisseria) 자가수송 (autotransporter) 지단백질 (NalP)을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. α-헬릭스 다발 포어는α-헬릭스로부터 형성된 배럴 또는 채널을 포함한다. 적합한 α-헬릭스 다발 포어는 내막 단백질 및 α 외막 단백질, 예컨대 WZA를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

적합한 고체 상태 포어로는 질화규소 포어, 이산화규소 포어 및 그래핀 포어가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 그 밖의 적합한 고체 상태 포어 및 이를 생성하는 방법이 미국 특허 제6,464,842호, WO 03/003446, WO 2005/061373, 미국 특허 제7,258,838호, 미국 특허 제7,466,069호, 미국 특허 제7,468,271호 및 미국 특허 제7,253,434호에서 논의되어 있다.

포어는 바람직하게는 α-용혈소 (α-HL)로부터 유래된다. 야생형 α-HL 포어는 7 개의 동일한 단량체 또는 서브유닛으로 형성된다 (즉, 이것은 7량체임). α-용혈소의 1 개의 야생형 단량체 또는 서브유닛의 서열을 서열 2에 나타낸다. 포어는 바람직하게는 서열 2에 나타낸 서열 또는 그의 변이체의 7 개의 서브유닛을 포함한다. 서열 2의 아미노산 1, 7 내지 21, 31 내지 34, 45 내지 51, 63 내지 66, 72, 92 내지 97, 104 내지 111, 124 내지 136, 149 내지 153, 160 내지 164, 173 내지 206, 210 내지 213, 217, 218, 223 내지 228, 236 내지 242, 262 내지 265, 272 내지 274, 287 내지 290 및 294는 루프 영역을 형성한다. 서열 2의 잔기 113 및 147은 α-HL의 배럴 또는 채널의 수축점의 일부를 형성한다.

서열 2의 변이체는 서열 2와는 다른 아미노산 서열을 갖는 서브유닛이고, 이는 그의 포어 형성 능력을 보유한다. 포어를 형성하는 변이체의 능력은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 검정할 수 있다. 예를 들면, 변이체는 다른 적절한 서브유닛과 함께 막으로 삽입될 수 있고, 올리고머화되어 포어를 형성하는 그의 능력이 결정될 수 있다.

변이체는 핵산 취급 효소에의 공유적 부착 또는 그와의 상호작용을 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 효소에의 부착을 용이하게 하는 하나 이상의 반응성 시스테인 잔기를 포함한다. 예를 들면, 변이체는 서열 2의 위치 8, 9, 17, 18, 19, 44, 45, 50, 51, 237, 239 및 287 및/또는 아미노 또는 카르복시 말단 중 하나 이상에서 시스테인을 포함할 수 있다. 바람직한 변이체는 서열 2의 위치 8, 9, 17, 237, 239 및 287의 잔기의 시스테인에 의한 치환체가 포함된다 (K8C, T9C, N17C, K237C, S239C 또는 E287C).

변이체는 효소의 유전적 융합이 용이해지도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 삽입 부위에 인접한 하나 이상의 잔기를 변형, 예컨대 결실시켜 효소 및/또는 링커의 삽입을 용이하게 할 수 있다. 효소가 서열 2의 루프 2에 삽입되는 경우, 서열 2의 잔기 D45, K46, N47, H48, N49 및 K50 중 하나 이상을 결실시킬 수 있다.

변이체는 또한 뉴클레오티드와의 임의의 상호작용을 용이하게 하는 변형 또는 이하에서 논의하는 바와 같이 분자 어댑터의 배향을 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다. 변이체는 또한 분자 어댑터의 공유적 부착을 용이하게 하는 변형을 함유할 수 있다.

특히, 변이체는 바람직하게는 서열 2의 위치 139에서 글루타민을 갖는다. 변이체는 바람직하게는 서열 2의 위치 113에서 아르기닌을 갖는다. 변이체는 바람직하게는 서열 2의 위치 119, 121 또는 135에서 시스테인을 갖는다. 서열 4는 위치 113에서 아르기닌을 갖는 것 (M113R)과 위치 139에서 글루타민을 갖는 것 (N139Q)을 제외하고 서열 2의 서열을 나타낸다. 서열 4 또는 그의 변이체는 본 발명에 따른 포어를 형성하기 위해 사용될 수 있다.

변이체는 유기체, 예를 들면 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 박테리아에 의해 자연적으로 발현될 수 있거나, 또는 박테리아, 예컨대 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)에 의해 재조합적으로 발현될 수 있는 자연적 발생 변이체일 수 있다. 변이체에는 또한 재조합 기술에 의해 생성된 비-자연적 발생 변이체가 포함된다. 서열 2 또는 4의 아미노산 서열의 총장에 걸쳐, 변이체는 바람직하게는 아미노산 동일성을 기준으로 해당 서열에 대해 적어도 50％ 상동일 것이다. 보다 바람직하게는, 변이체 폴리펩티드는 전체 서열에 걸쳐서 서열 2 또는 4의 아미노산 서열에 대해서 아미노산 동일성을 기준으로 적어도 55％, 적어도 60％, 적어도 65％, 적어도 70％, 적어도 75％, 적어도 80％, 적어도 85％, 적어도 90％ 및 보다 바람직하게는 적어도 95％, 97％ 또는 99％ 상동일 수 있다. 200 개 이상, 예를 들면 230, 250, 270 또는 280 개 이상의 인접 아미노산의 스트레치에 걸쳐, 적어도 80％, 예를 들면 적어도 85％, 90％ 또는 95％의 아미노산 동일성이 존재할 수 있다 ("경질 상동성").

아미노산 치환은 상기에서 논의한 것에 더하여, 서열 2 또는 4의 아미노산 서열에 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30 개까지의 치환이 이루어질 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들면 하기 표 2에 따라 이루어질 수 있다.

서열 2의 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기는 부가적으로 상기 기재된 폴리펩티드로부터 결실될 수 있다. 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 또는 30 개까지의 잔기 또는 그 이상이 결실될 수 있다.

변이체는 서열 2 또는 4의 단편일 수 있다. 그러한 단편은 포어 형성 활성을 보유한다. 단편은 적어도 50, 100, 200 또는 250 개의 아미노산 길이일 수 있다. 단편은 바람직하게는 서열 2 또는 4의 포어 형성 도메인을 포함한다. 단편은 전형적으로 서열 2 또는 4의 잔기 119, 121, 135, 113 및 139를 포함한다.

하나 이상의 아미노산이 상기 기재된 폴리펩티드에 별법적으로 또는 부가적으로 첨가될 수 있다. 연장은 서열 2 또는 4 또는 그의 변이체 또는 단편의 아미노산 서열의 아미노 말단 또는 카르복시 말단에서 제공될 수 있다. 연장은 상당히 짧은, 예를 들면 1 내지 10 개의 아미노산 길이일 수 있다. 별법적으로, 연장은 보다 긴, 예를 들면 50 또는 100 개까지의 아미노산일 수 있다. 담체 단백질은 포어 또는 변이체에 융합될 수 있다.

상기에서 논의한 바와 같이, 서열 2 또는 4의 변이체는 서열 2 또는 4와는 다른 아미노산 서열을 갖는 서브유닛이고, 포어를 형성하는 능력을 보유한다. 변이체는 전형적으로 포어 형성에 관련된 서열 2 또는 4의 영역을 함유한다. β-배럴을 함유하는 α-HL의 포어 형성 능력은 각각의 서브유닛에서 β-가닥에 의해 제공된다. 서열 2 또는 4의 변이체는 전형적으로 β-가닥을 형성하는 서열 2의 영역을 포함한다. β-가닥을 형성하는 서열 2 또는 4의 아미노산은 상기에서 논의하였다. 생성된 변이체가 포어를 형성하는 그의 능력을 보유하는 한, 하나 이상의 변형이 β-가닥을 형성하는 서열 2 또는 4의 영역에 대해 이루어질 수 있다. 서열 2 또는 4의 β-가닥 영역에 대해 이루어질 수 있는 특이적 변형은 상기에서 논의하였다.

서열 2 또는 4의 변이체는 바람직하게는 그의 α-헬릭스 및/또는 루프 영역 내에서 하나 이상의 변형, 예컨대 치환, 첨가 또는 결실을 포함한다. α-헬릭스 및 루프를 형성하는 아미노산은 상기에서 논의하였다.

변이체는 예를 들면, 그의 확인 또는 정제를 돕는 히스티딘 또는 아스파르트산 잔기의 첨가에 의해, 또는 세포로부터 그의 분비를 촉진하는 신호 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있고, 폴리펩티드는 그러한 서열을 천연적으로는 함유하지 않는다.

포어는 표출 표지로 표지될 수 있다. 표출 표지는 포어가 검출되게 하는 임의의 적합한 표지일 수 있다. 적합한 표지로는 형광 분자, 방사성동위원소, 예를 들어 ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오티드 및 리간드, 예컨대 비오틴이 포함되나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

포어는 포어 생성 유기체, 예컨대 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 단리할 수 있거나, 또는 합성적으로 또는 재조합 방법으로 만들 수 있다. 예를 들어, 포어를 시험관내 번역 및 전사에 의해 합성할 수 있다. 포어의 아미노산 서열은 비-자연발생 아미노산을 포함하도록, 또는 포어의 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 포어를 합성 방법으로 생성하는 경우, 그러한 아미노산은 생성 동안 도입될 수 있다. 포어는 또한 합성 또는 재조합 생성 이후에 변경될 수 있다.

포어는 또한 D-아미노산을 이용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, 포어는 L-아미노산 및 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 그러한 단백질 또는 펩티드를 생성하는 당업계에서 통상적인 것이다.

포어는 또한 그 밖의 비특이적 화학적 변형이 포어 형성 능력에 영향을 미치지 않는 한, 비특이적 화학적 변형을 함유할 수 있다. 다수의 비특이적 측쇄 변형이 당업계에 공지되어 있고, 포어의 측쇄에 적용될 수 있다. 그러한 변형에는, 예를 들어 알데히드와 반응시킨 후 NaBH₄로 환원시키는 것에 의한 아미노산의 환원성 알킬화, 아세트산메틸에 의한 아미딘화 또는 아세트산 무수물에 의한 아실화가 포함된다. 포어에 대한 변형은 각각의 서브유닛이 발현된 후에 이루어질 수 있거나, 또는 서브유닛을 이용하여 포어를 형성한 후에 이루어질 수 있다.

포어는 당업계 공지의 표준 방법을 이용하여 생성할 수 있다. 당업계의 표준 방법을 이용하여 포어 또는 포어 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리 및 복제할 수 있다. 포어 또는 포어 서브유닛을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 당업계의 표준 기술을 이용하여 박테리아 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 재조합 발현 벡터로부터 폴리펩티드를 계내 발현시켜 포어를 세포 내에서 생성할 수 있다. 발현 벡터는 임의로 폴리펩티드의 발현을 제어하기 위한 유도가능한 프로모터를 보유한다.

포어는 포어 생성 유기체로부터 임의의 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 의한 정제 이후에, 또는 이하에서 기재하는 바와 같은 재조합 발현 이후에 대규모로 생성할 수 있다. 전형적인 단백질 액체 크로마토그래피 시스템으로는, FPLC, AKTA 시스템, 바이오-캐드 시스템, 바이오-래드 바이오로직 시스템 및 길슨 HPLC 시스템이 포함된다.

핵산 취급 효소

핵산 취급 효소는 적어도 하나의 핵산 특성과 상호작용하고 이를 변형시킬 수 있는 폴리펩티드이다. 효소는 핵산을 절단하여 개개의 뉴클레오티드가 형성되게 하거나, 또는 더 짧은 뉴클레오티드 사슬, 예컨대 디- 또는 트리뉴클레오티드로 형성되게 하여 변형시킬 수 있다. 효소는 핵산을 배향시키거나 특정 위치로 이동시켜 변형시킬 수 있다. 상기에서 논의한 임의의 핵산이 효소에 의해 취급될 수 있다.

효소에 의해 취급되는 핵산은 바람직하게는 단일 가닥이다. 효소에 의해 취급되는 핵산은 이중 가닥, 예컨대 dsDNA 또는 dsRNA일 수 있다. 단일 가닥 핵산을 취급하는 핵산은 이중 가닥 DNA가 효소에 의해 취급되기 전에 화학적으로 또는 열적으로 단일 가닥으로 해리되는 한, 이중 가닥 DNA를 시퀀싱하는데 사용될 수 있다.

핵산 취급 효소의 3차 구조가 공지되어 있는 것이 바람직하다. 효소의 3 차원 구조의 인식은 본 발명의 방법에서 그의 기능을 용이하게 하도록 효소를 변형시키는 것을 가능하게 한다.

효소는 임의의 크기일 수 있고, 임의의 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 효소는 올리고머, 예컨대 이량체 또는 삼량체일 수 있다. 효소는 바람직하게는 하나의 단량체로 형성된 소형의 구형 폴리펩티드이다. 그러한 효소는 취급하기가 쉽고, 특히 포어 또는 포어 서브유닛의 서열에 융합되거나 삽입될 경우 포어 또는 포어 서브유닛의 포어 형성 능력을 덜 방해할 것이다.

효소의 아미노 및 카르복시 말단은 바람직하게는 아주 근접해있다. 효소의 아미노 및 카르복시 말단은 보다 바람직하게는 효소의 동일한 표면 상에 존재한다. 이같은 실시양태는 효소가 포어 또는 포어 서브유닛의 서열에 삽입되는 것을 용이하게 한다. 예를 들어, 효소의 아미노 및 카르복시 말단이 아주 근접해있는 경우, 각각은 포어 또는 포어 서브유닛의 서열 내 인접 아미노산에 유전적 융합에 의해 부착될 수 있다.

또한 효소의 활성 부위의 위치 및 기능이 공지되어 있는 것이 바람직하다. 이는 효소의 활성을 막는 활성 부위에 변형이 이루어지는 것을 방지한다. 이는 또한, 구축물 내 일부의 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하는 방식으로 효소가 구축물을 취급하도록 효소가 포어에 부착되게 한다. 효소 그 자체는 전류의 흐름을 차단하지 않으면서, 효소의 활성 부위가 포어의 배럴 또는 채널의 개구부를 형성하는 포어 부분에 가능한 한 가까이 위치하도록 하는 것이 유익하다. 효소가 핵산을 배향할 수 있는 방식을 인식하는 것은 또한 효과적인 포어-효소 구축물이 설계되게 한다.

구축물 내 대부분의 뉴클레오티드가 확률론적 감지에 의해 정확하게 확인되도록, 효소는 뉴클레오티드를 식별하는 것과 상용가능한 완충제 배경에서 핵산을 취급해야만 한다. 효소는 바람직하게는 정상 생리학적 수준을 훨씬 초과한 염 농도, 예컨대 100 mM 내지 2000 mM에서 적어도 잔여 활성을 갖는다. 효소는 보다 바람직하게는 그의 활성이 높은 염 농도에서 증가되도록 변형된다. 효소는 또한 그의 진행성, 안정성 및 보관 수명이 개선되도록 변형될 수 있다.

적합한 변형은 극한 미생물(extremphile), 예컨대 호염성, 중등도의 호염성 박테리아, 호열성 및 중등도의 호염성 유기체로부터의 핵산 취급 효소의 특성화, 뿐만 아니라 중온성 또는 호열성 엑소뉴클레아제의 내염성, 안정성 및 온도 의존성을 변경시키는 것에 대한 방향적 진화 접근법으로부터 결정될 수 있다.

효소는 또한 바람직하게는 10℃ 내지 60℃의 온도, 예컨대 실온에서 적어도 부분적인 활성을 보유한다. 이는 실온을 비롯한 다양한 온도에서 구축물의 핵산이 시퀀싱되게 한다.

핵산 취급 효소는 바람직하게는 뉴클레오티드분해 효소이다. 핵산 취급 효소는 보다 바람직하게는 임의의 효소 분류 (EC) 그룹 3.1.11, 3.1.13, 3.1.14, 3.1.15, 3.1.16, 3.1.21, 3.1.22, 3.1.25, 3.1.26, 3.1.27, 3.1.30 및 3.1.31의 구성원이다. 핵산 취급 효소는 보다 바람직하게는 하기 효소 중 어느 하나이다:

● 3.1.11.- 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엑소데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.11.1 엑소데옥시리보뉴클레아제 I.

○ 3.1.11.2 엑소데옥시리보뉴클레아제 III.

○ 3.1.11.3 엑소데옥시리보뉴클레아제 (람다-유도된 것).

○ 3.1.11.4 엑소데옥시리보뉴클레아제 (파지 SP3-유도된 것).

○ 3.1.11.5 엑소데옥시리보뉴클레아제 V.

○ 3.1.11.6 엑소데옥시리보뉴클레아제 VII.

● 3.1.13.- 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엑소리보뉴클레아제.

○ 3.1.13.1 엑소리보뉴클레아제 II.

○ 3.1.13.2 엑소리보뉴클레아제 H.

○ 3.1.13.3 올리고뉴클레오티다제.

○ 3.1.13.4 폴리(A)-특정 리보뉴클레아제.

○ 3.1.13.5 리보뉴클레아제 D.

● 3.1.14.- 3'-포스포모노에스테르를 생성하는 엑소리보뉴클레아제.

○ 3.1.14.1 효모 리보뉴클레아제.

● 3.1.15.- 5' 포스포모노에스테르를 생성하는 리보- 또는 데옥시리보핵산에 의해 활성화되는 엑소뉴클레아제

○ 3.1.15.1 독 엑소뉴클레아제.

● 3.1.16.- 3' 포스포모노에스테르를 생성하는 리보- 또는 데옥시리보핵산에 의해 활성화되는 엑소뉴클레아제

○ 3.1.16.1 비장 엑소뉴클레아제.

● 3.1.21.- 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엔도데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.21.1 데옥시리보뉴클레아제 I.

○ 3.1.21.2 데옥시리보뉴클레아제 IV (파지-T(4)-유도된 것).

○ 3.1.21.3 유형 I 부위 특이적 데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.21.4 유형 II 부위 특이적 데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.21.5 유형 III 부위 특이적 데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.21.6 CC-선호 엔도데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.21.7 데옥시리보뉴클레아제 V.

● 3.1.22.- 5'-포스포모노에스테르 이외의 것을 생성하는 엔도데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.22.1 데옥시리보뉴클레아제 II.

○ 3.1.22.2 아스페르길루스(Aspergillus) 데옥시리보뉴클레아제 K(1).

○ 3.1.22.3 진입부가 옮겨진 것: 3.1.21.7.

○ 3.1.22.4 교차 접합 엔도데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.22.5 데옥시리보뉴클레아제 X.

● 3.1.25.- 변경된 염기에 특이적인 부위 특이적 엔도데옥시리보뉴클레아제.

○ 3.1.25.1 데옥시리보뉴클레아제 (피리미딘 이량체).

○ 3.1.25.2 진입부가 옮겨진 것: 4.2.99.18.

● 3.1.26.- 5'-포스포모노에스테르를 생성하는 엔도리보뉴클레아제.

○ 3.1.26.1 피사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum) 리보뉴클레아제.

○ 3.1.26.2 리보뉴클레아제 알파.

○ 3.1.26.3 리보뉴클레아제 III.

○ 3.1.26.4 리보뉴클레아제 H.

○ 3.1.26.5 리보뉴클레아제 P.

○ 3.1.26.6 리보뉴클레아제 IV.

○ 3.1.26.7 리보뉴클레아제 P4.

○ 3.1.26.8 리보뉴클레아제 M5.

○ 3.1.26.9 리보뉴클레아제 (폴리-(U)-특이적).

○ 3.1.26.10 리보뉴클레아제 IX.

○ 3.1.26.11 리보뉴클레아제 Z.

● 3.1.27.- 5'-포스포모노에스테르 이외의 것을 생성하는 엔도리보뉴클레아제.

○ 3.1.27.1 리보뉴클레아제 T(2).

○ 3.1.27.2 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 리보뉴클레아제.

○ 3.1.27.3 리보뉴클레아제 T(1).

○ 3.1.27.4 리보뉴클레아제 U(2).

○ 3.1.27.5 췌장 리보뉴클레아제.

○ 3.1.27.6 엔테로박터(Enterobacter) 리보뉴클레아제.

○ 3.1.27.7 리보뉴클레아제 F.

○ 3.1.27.8 리보뉴클레아제 V.

○ 3.1.27.9 tRNA-인트론 엔도뉴클레아제.

○ 3.1.27.10 rRNA 엔도뉴클레아제.

● 3.1.30.- 5' 포스포모노에스테르를 생성하는 리보- 또는 데옥시리보핵산에 의해 활성화되는 엔도리보뉴클레아제

○ 3.1.30.1 아스페르길루스 뉴클레아제 S(1).

○ 3.1.30.2 세라티아 마르세스센스(Serratia marcescens) 뉴클레아제.

● 3.1.31.- 3' 포스포모노에스테르를 생성하는 리보- 또는 데옥시리보핵산에 의해 활성화되는 엔도리보뉴클레아제

○ 3.1.31.1 미크로코쿠스(Micrococcal) 뉴클레아제.

효소는 가장 바람직하게는 핵산을 절단하여 개개의 뉴클레오티드를 형성하는 엑소뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제이다. 엑소데옥시리보뉴클레아제의 장점은 이들이 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 둘 모두에서 활성화되고, 5' - 3' 또는 3' - 5' 방향으로 염기를 가수분해한다는 것이다.

개개의 뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드이다. 개개의 뉴클레오티드는 임의의 결합, 예컨대 포스포디에스테르 결합에 의해 또 다른 뉴클레오티드 또는 핵산에 결합되지 않은 것이다. 포스포디에스테르 결합은 뉴클레오티드의 포스페이트 기 중 하나가 또 다른 뉴클레오티드의 당 기에 결합된 것을 포함한다. 개개의 뉴클레오티드는 전형적으로 적어도 5, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 500, 적어도 1000 또는 적어도 5000 개 뉴클레오티드의 또 다른 핵산 서열에 임의의 방식으로 결합되지 않은 것이다.

방법에 사용하는데 바람직한 효소에는 이. 콜라이로부터의 엑소뉴클레아제 I (서열 6) 및 T. 테르모필루스로부터의 RecJ (서열 8) 및 이들의 변이체가 포함된다. 엑소뉴클레아제 효소는 바람직하게는 서열 6 및 8에 나타낸 임의의 서열 또는 그의 변이체를 포함한다. 서열 6 또는 8의 변이체는 서열 6 또는 8의 그것과는 다른 아미노산 서열을 갖고 핵산 취급능은 보유한 효소이다. 변이체의 핵산 취급능은 당업계 공지의 임의의 방법을 이용하여 검정할 수 있다. 예를 들어, 변이체 또는 변이체가 부착된 포어는 핵산의 특이적 서열을 취급하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 효소는 핵산의 취급을 용이하게 하고/거나 높은 염 농도 및/또는 실온에서 그의 활성을 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다. 효소는 포어 또는 포어 서브유닛에의 공유적 부착이나 그와의 상호작용을 용이하게 하는 변형을 포함할 수 있다. 상기에서 논의한 바와 같이, 링커와의 비특이적 반응을 회피하도록 효소에서 접근가능한 시스테인을 제거할 수 있다. 별법적으로, 예를 들어 유전적으로 융합된 펩티드 링커의 일부로서 하나 이상의 반응성 시스테인을 효소에 도입하여, 포어 또는 포어 서브유닛에 대한 부착을 용이하게 할 수 있다.

변이체는 상기 논의한 바와 같이 서열 2 변이체가 서열 2 또는 4와 다른 것과 동일한 정도로 서열 6 또는 8과 다를 수 있다.

서열 6 또는 8의 변이체는 그의 핵산 취급 활성을 보유한다. 변이체는 전형적으로 핵산 취급 활성과 관련이 있는 서열 6 또는 8의 영역을 함유한다. 서열 6 및 8의 촉매 도메인은 상기에서 논의하였다. 서열 6 또는 8의 변이체는 바람직하게는 적절한 촉매 도메인을 포함한다. 변이체 서열 6 또는 8은 전형적으로 적절한 촉매 도메인 바깥쪽에 하나 이상의 변형, 예컨대 치환, 부가 또는 결실을 포함한다.

서열 6 또는 8의 바람직한 변이체는 본 출원과 동시에 출원된 공동-계류 중인 출원에 기재되어 있고 [J A Kemp & Co Ref: N.106566; Oxford Nanolabs Ref: ONL IP 007], 이는 본원에 참고로 포함된다. 상기 출원에서의 모든 교시내용은 본 발명에 동일하게 적용될 수 있다.

포어를 통해 구축물을 밀거나 당길 수 있는 바람직한 효소로는, 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, 헬리카제 및 토포이소머라제, 예컨대 기라제가 포함된다. 폴리머라제는 바람직하게는 임의의 효소 분류 (EC) 그룹 2.7.7.6, 2.7.7.7, 2.7.7.19, 2.7.7.48 및 2.7.7.49의 구성원이다. 폴리머라제는 바람직하게는 DNA-의존성 DNA 폴리머라제, RNA-의존성 DNA 폴리머라제, DNA-의존성 RNA 폴리머라제 또는 RNA-의존성 RNA 폴리머라제이다. 헬리카제는 바람직하게는 임의의 효소 분류 (EC) 그룹 3.6.1.- 및 2.7.7.-의 구성원이다. 헬리카제는 바람직하게는 ATP-의존성 DNA 헬리카제 (EC 그룹 3.6.1.8), ATP-의존성 RNA 헬리카제 (EC 그룹 3.6.1.8) 또는 ATP-비의존성 RNA 헬리카제이다. 토포이소머라제는 바람직하게는 임의의 효소 분류 (EC) 그룹 5.99.1.2 및 5.99.1.3의 구성원이다.

효소는 표출 표지로 표지될 수 있다. 표출 표지는 상기한 것 중 임의의 것일 수 있다.

효소는 효소 생산 유기체, 예컨대 이. 콜라이, T. 테르모필루스 또는 박테리오파지로부터 단리되거나, 또는 합성적으로 또는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 효소는 상기 및 하기에서 기재하는 바와 같이 시험관내 번역 및 전사에 의해 합성될 수 있다. 효소는 상기에서 기재한 바와 같이 정제 이후에 대규모로 생성될 수 있다.

효소의 포어에의 공유적 부착

구축물을 효과적으로 시퀀싱하기 위해, 구축물 내 일부 뉴클레오티드가 연속적인 방식으로 확인되는 것을 보장하는 것이 중요하다. 효소의 고정된 속성은 구축물 내 일부 뉴클레오티드가 포어를 통해 흐르는 전류에 영향을 미친다는 것을 의미한다.

포어에 부착된 효소는 구축물 내 일부 뉴클레오티드가 포어, 바람직하게는 포어의 배럴 또는 채널과 상호작용하는 방식으로 구축물을 취급한다. 이어서, 뉴클레오티드는 상호작용 동안 뉴클레오티드가 포어를 통해 흐르는 전류에 영향을 미치는 상이한 방식에 기초하여 식별된다.

효소의 고정된 속성은 구축물이 포어에 의해 특이적인 방식으로 취급됨을 의미한다. 예를 들어, 각각의 뉴클레오티드는 구축물의 한쪽으로부터 연작용 방식으로 소화될 수 있거나, 또는 구축물이 포어를 통해 밀거나 당겨질 수 있다. 이는 구축물 내 일부 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하는 것 및 확인되는 것을 보장한다. 핵산을 시퀀싱할 때 임의의 신호 중단이 없는 것이 중요하다. 또한, 효소 및 포어의 고정된 속성은 이들이 함께 보관될 수 있음을 의미하며, 그로 인해 즉시 사용형 센서의 생산이 가능하다.

바람직한 실시양태에서, 엑소뉴클레아제 효소, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제는 구축물로부터 일부 뉴클레오티드가 방출되어 포어의 배럴 또는 채널과 상호작용하도록 포어에 부착된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 포어를 통해 구축물을 밀거나 당길 수 있는 효소는 구축물이 포어의 배럴 또는 채널을 통해 밀거나 당겨져서 구축물 내 일부 뉴클레오티드가 배럴 또는 채널과 상호작용하도록 포어에 부착된다. 이러한 실시양태에서, 뉴클레오티드는 하나를 초과하는, 예컨대 2, 3 또는 4 개의 블록 또는 그룹으로 포어와 상호작용할 수 있다. 적합한 효소로는 폴리머라제, 뉴클레아제, 헬리카제 및 토포이소머라제, 예컨대 기라제가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 각각의 실시양태에서, 효소는 바람직하게는 포어의 배럴 또는 채널의 개구부와 아주 근접한 부위에서 포어에 부착된다. 효소는 보다 바람직하게는 그의 활성 부위가 포어의 배럴 또는 채널의 개구부를 향하여 배향되도록 포어에 부착된다. 이는 구축물의 일부 뉴클레오티드가 배럴 또는 채널 내에 공급됨을 의미한다. 효소는 바람직하게는 포어의 시스 측면에 부착된다.

포어는 효소에 부착된다. 포어는 효소에 하나를 초과하는, 예컨대 2 또는 3 개의 지점에서 부착될 수 있다. 포어를 하나를 초과하는 지점에서 효소에 부착시키는 것은 효소의 이동성을 제약하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 다중 부착은 효소가 회전하는 자유를 제약하거나, 포어 또는 포어 서브유닛으로부터 벗어나는 효소의 능력을 제약하기 위해 사용될 수 있다.

포어는 효소에 부착될 때 단량체 형태일 수 있다 (발현 후 변형). 별법적으로, 포어는 효소에 부착될 때 올리고머 포어일 수 있다 (올리고머화 후 변형).

포어 또는 포어 서브유닛은 당업계 공지의 임의의 방법을 이용하여 효소에 부착시킬 수 있다. 포어 또는 포어 서브유닛 및 효소는 별개로 생성된 후 서로 부착될 수 있다. 2 성분은 임의의 배열로 부착될 수 있다. 예를 들어, 이들은 말단 (즉, 아미노 또는 카르복시 말단) 아미노산을 통해 부착될 수 있다. 적합한 배열로는, 효소의 아미노 말단이 포어 또는 포어 서브유닛의 카르복시 말단에 부착된 것 및 그 반대가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 별법적으로, 2 성분은 그들 서열 내 아미노산을 통해 부착될 수 있다. 예를 들어, 효소는 포어 또는 포어 서브유닛의 루프 영역 내의 하나 이상의 아미노산에 부착될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 효소의 말단 아미노산은 포어 또는 포어 서브유닛의 루프 영역 내 하나 이상의 아미노산에 부착된다. 말단 아미노산 및 루프 영역은 상기에서 논의하였다.

한 바람직한 실시양태에서, 포어 또는 포어 서브유닛은 효소에 유전적으로 융합된다. 포어 또는 포어 서브유닛은 전체 구축물이 단일의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 발현된 경우 효소에 유전적으로 융합된다. 포어 또는 포어 서브유닛 및 효소의 코딩 서열은 임의의 방식으로 합해져서 구축물을 코딩하는 단일의 폴리뉴클레오티드 서열을 형성할 수 있다.

포어 또는 포어 서브유닛 및 효소는 임의의 배열로 유전적으로 융합될 수 있다. 포어 또는 포어 서브유닛 및 효소는 그들의 말단 아미노산을 통해 융합될 수 있다. 예를 들어, 효소의 아미노 말단은 포어 또는 포어 서브유닛의 카르복시 말단에 융합될 수 있고, 그 반대도 가능하다. 효소의 아미노산 서열은 바람직하게는 포어 또는 포어 서브유닛의 아미노산 서열에 인 프레임으로 부가된다. 다시 말하면, 효소는 바람직하게는 포어 또는 포어 서브유닛의 서열 내에 삽입된다. 이같은 실시양태에서, 포어 또는 포어 서브유닛 및 효소는 전형적으로 2 지점, 즉 효소의 아미노 및 카르복시 말단 아미노산을 통해 부착된다. 효소가 포어 또는 포어 서브유닛의 서열 내에 삽입될 경우, 효소의 아미노 및 카르복시 말단 아미노산은 아주 근접하여 위치하며, 포어 또는 포어 서브유닛의 서열 내의 인접 아미노산에 각각 부착되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 효소는 포어 또는 포어 서브유닛의 루프 영역에 삽입된다. 특히 바람직한 실시양태에서, 효소는 서열 2의 아미노산, 18 및 19, 44 및 45 또는 50 및 51 사이에 삽입된다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 포어 또는 포어 서브유닛은 효소에 화학적으로 융합된다. 포어 또는 포어 서브유닛은, 예를 들어 링커 분자를 통해 2 부분이 화학적으로 부착될 경우, 효소에 화학적으로 융합된다. 적합한 방법으로는 hex-his 태그, Ni-NTA, 스트렙타비딘에의 비오틴 결합, 항원에의 항체 결합, 1급 아민 커플링, 글루타티온에의 GST 태그 결합, 덱스트린에의 MBP 태그 결합, IgG에의 단백질 A 결합, 티올 사이의 반응, 핵산 혼성화 링커 및 시스테인 연결이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. DNA 혼성화 링커 및 시스테인 연결은 이하에서 보다 상세하게 논의한다. 포어 또는 포어 서브유닛은 바람직하게는 효소에 공유적으로 부착된다.

포어는 포어 형성 능력을 보유하여야 한다. 포어의 포어 형성 능력은 전형적으로 그의 α-헬릭스 및 β-가닥에 의해 제공된다. β-배럴 포어는 β-가닥으로부터 형성된 배럴 또는 채널을 포함하는 반면, α-헬릭스 다발 포어는 α-헬릭스로부터 형성된 배럴 또는 채널을 포함한다. α-헬릭스 및 β-가닥은 전형적으로 루프 영역에 의해 연결된다. 포어 형성 능력에 영향을 미치는 것을 피하기 위해, 효소는 바람직하게는 포어 또는 포어 서브유닛의 루프 영역에 유전적으로 융합되거나 또는 포어 또는 포어 서브유닛의 루프 영역에 삽입된다. 특정 서브유닛의 루프 영역은 상기에서 보다 상세하게 논의하였다. 바람직한 실시양태에서, 효소는 서열 2의 아미노산 8, 9, 17, 18, 19, 44, 45, 50 및 51 중 하나 이상에 부착된다.

유사하게, 구축물은 효소의 핵산 취급능을 보유하며, 이는 또한 전형적으로 그의 2차 구조 성분 (α-헬릭스 및 β-가닥) 및 3차 구조 성분에 의해 제공된다. 효소의 핵산 취급능에 악영향을 미치는 것을 피하기 위해, 효소는 바람직하게는 그의 2차 또는 3차 구조에 영향을 미치지 않는 잔기나 영역을 통해 포어 또는 포어 서브유닛에 유전적으로 융합되거나, 또는 포어 또는 포어 서브유닛에 삽입된다.

포어 또는 포어 서브유닛은 효소에 직접적으로 부착될 수 있다. 포어 또는 포어 서브유닛은 바람직하게는 하나 이상, 예컨대 2 또는 3 개의 링커에 의해 효소에 부착된다. 하나 이상의 링커는 효소의 이동성을 제약하도록 설계될 수 있다. 링커는 포어, 포어 서브유닛 서브유닛 및/또는 효소 내의 하나 이상의 반응성 시스테인 잔기, 반응성 리신 잔기 또는 비천연 아미노산에 부착될 수 있다. 적합한 링커는 당업계에 널리 공지되어 있다. 적합한 링커에는 화학적 가교제 및 펩티드 링커가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 링커는 아미노산 서열 (즉 펩티드 링커) 또는 핵산 혼성화 링커이다. 펩티드 또는 핵산 혼성화 링커의 길이, 가요성 및 친수성은 전형적으로 포어 또는 포어 서브유닛 및 효소의 기능을 방해하지 않도록 설계된다. 바람직한 가요성 펩티드 링커는 2 내지 20 개, 예컨대 4, 6, 8, 10 또는 16 개의 세린 및/또는 글리신 아미노산 스트레치이다. 보다 바람직한 가요성 링커에는 (SG)₁, (SG)₂, (SG)₃, (SG)₄, (SG)₅ 및 (SG)₈이 포함되며, 여기서 S는 세린이고 G는 글리신이다. 바람직한 경성 링커는 2 내지 30 개, 예컨대 4, 6, 8, 16 또는 24 개의 프롤린 아미노산 스트레치이다. 보다 바람직한 경성 링커로는 (P)₁₂가 포함되며, 여기서 P는 프롤린이다.

핵산 혼성화 링커는 상기에서 논의한 임의의 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 당업계 공지의 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA) 또는 임의의 합성 핵산, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA), 글리세롤 핵산 (GNA), 트레오스 핵산 (TNA), 잠금 핵산 (LNA) 또는 그 밖의 뉴클레오티드 측쇄를 갖는 합성 중합체를 포함할 수 있다. 링커는 또한 혼성화되었을때 서로 반응하도록 변형될 수 있다. 별법적으로, 링커가 서로 혼성화되었을 때 링커가 가교연결되도록 작용제를 사용할 수 있다.

바람직한 핵산 혼성화 링커는 서열 10의 5' 말단으로부터의 첫번째 15, 25 또는 35 뉴클레오티드에 상응한다. 링커는 바람직하게는 또한 3' 말단에 TT를 가져서 가외의 가요성을 제공한다. 3' 말단에서, 링커는 링커가 핵산 결합 단백질 또는 표면에 부착되도록 하는 말레이미드와 같은 기를 갖는다. 말레이미드 변형된올리고뉴클레오티드는 시중에서, 예를 들어 ATDBio 사에서 구할 수 있다. 보다 바람직한 링커를 서열 11, 12 및 13에 나타낸다. 상보적인 링커는 서열 14, 15 및 16에 나타낸다. 서열 11, 12 또는 13은 핵산 결합 단백질 및 표면 중 하나에 부착될 수 있고, 상보적인 링커 (각각 서열 14, 15 또는 16)는 핵산 결합 단백질 및 표면 중 다른 하나에 부착된다. 핵산 결합 단백질 및 표면은 이어서, 링커와 혼성화되는 것에 의해 함께 부착될 수 있다.

다른 바람직한 화학적 가교제를 이하의 표 3에 나타낸다.

링커는 먼저 포어 또는 포어 서브유닛에 부착된 후 효소에 부착되거나, 효소에 먼저 부착된 후 포어 또는 포어 서브유닛에 부착되거나, 또는 효소 및 포어 또는 포어 서브유닛에 동시에 부착될 수 있다. 링커가 포어 또는 포어 서브유닛에 부착되었을 때, 이는 단량체 서브유닛이거나, 2 이상의 단량체의 올리고머의 일부이거나, 또는 완전한 올리고머 포어의 일부일 수 있다. 링커는 반응시켜 임의의 정제 단계 이후에 임의의 미결합 링커를 제거하는 것이 바람직하다.

포어 또는 포어 서브유닛을 효소에 부착시키는 바람직한 방법은 시스테인 연결을 통하는 것이다. 이는 시스테인 잔기가 말단에 제시된 이관능성 화학적 링커 또는 폴리펩티드 링커에 의해 매개될 수 있다. α-HL (서열 2)은 천연 시스테인 잔기가 결여되어 있으므로, 서열 2의 서열에 시스테인을 도입하는 것은 효소가 서브유닛에 제어된 상태로 공유적으로 부착되게 한다. 시스테인은 다양한 위치, 예컨대 서열 2의 위치 K8, T9 또는 N17 또는 서열 2의 카르복시 말단에 도입될 수 있다. 임의의 이관능성 링커의 길이, 반응성, 특이성, 강성 및 가용성은 효소가 서브유닛과 관련하여 정확하게 위치하고, 서브유닛 및 효소 둘 모두의 기능이 유지되도록 설계될 수 있다. 적합한 링커로는 비스말레이미드 가교제, 예컨대 1,4-비스(말레이미도)부탄 (BMB) 또는 비스(말레이미도)헥산이 포함된다. 이관능성 링커의 한 가지 결점은 효소가 어떤 추가의 표면 접근가능한 시스테인 잔기를 함유하지 않는 것이 요구된다는 것인데, 이는 이에 대한 이관능성 링커의 결합이 제어되지 않을 수 있고 기질 결합 또는 활성에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 효소가 여러개의 접근가능한 시스테인 잔기를 함유하는 경우, 변형이 효소의 폴딩이나 활성에 영향을 미치지 않게 하면서, 효소를 변형시켜 이를 제거하는 것이 요구될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 반응성 시스테인은 효소에 유전적으로 부착된 펩티드 링커 상에 존재한다. 이는 효소로부터 다른 접근가능한 시스테인 잔기를 제거하기 위해 추가의 변형이 반드시 필요하지 않을 것임을 의미한다. 시스테인 잔기의 반응성은 예를 들어 펩티드 링커 상의 인접 잔기를 변형시키는 것에 의해 향상될 수 있다. 예를 들어, 염기성 기인 플랭킹 아르기닌, 히스티딘 또는 리신 잔기는 시스테인 티올 기의 pKa를 보다 반응성인 S^- 기의 그것으로 변화시킬 것이다. 시스테인 잔기의 반응성은 티올 보호기, 예컨대 dTNB에 의해 보호될 수 있다. 이는 링커가 부착되기 전에, 단량체로서 또는 올리고머의 일부로서 효소 또는 포어 또는 포어 서브유닛의 하나 이상의 시스테인 잔기와 반응할 수 있다.

포어, 포어 서브유닛 또는 효소의 그들 자신에 대한 가교 연결은 링커의 농도를 막대하게 과량인 포어, 포어 서브유닛 및/또는 효소 중에서 유지시킴으로써 방지할 수 있다. 별법적으로, 2 개의 링커를 이용하여 "자물쇠 및 열쇠" 정렬을 이용할 수 있다. 예를 들어, 클릭 화학(click chemistry), 예컨대 아지드 알킨 휘스겐(Huisgen) 고리화첨가를 이용하여 포어 또는 포어 서브유닛이 효소에만 결합되게 하고, 그 자체나 그 반대로는 결합되지 않게 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기의 표 3에 나타낸 아지드-PEG-말레이미드 및 알킨-PEG-말레이미드 링커를 이용한다. 하나는 포어 또는 포어 서브유닛에 부착되고, 다른 하나는 효소에 부착된다. 이는 결합이 포어 또는 포어 서브유닛과 효소 사이에서만 일어나게 한다.

각각의 링커의 단 하나의 말단만이 함께 반응하여 보다 긴 링커를 형성할 수 있고, 링커의 다른 말단은 각각 다른 구축물의 일부 (즉, 서브유닛 또는 단량체)와 반응한다.

공유적 부착 부위는 효소가 구축물을 구축물 내 일부 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하는 방식으로 취급하도록 선택된다. 이어서 뉴클레오티드는 그것이 상호작용 동안 포어를 통해 흐르는 전류에 상이한 방식으로 영향을 미치는 것에 기초하여 식별된다.

효소는 바람직하게는 구축물을 포함하는 포어의 시스 측면의 일부를 형성하는 포어 또는 포어 서브유닛의 일부에 부착된다. 전기생리학에서, 시스 측면은 통상에 의하면 접지 측면이다. 용혈소 포어가 전기생리학적 장치에 정확하게 삽입될 경우, Cap 영역은 시스 측면 상에 존재한다. 양전위 하에서, 뉴클레오티드는 확률론적 감지에 사용되는 포어의 시스로부터 트랜스 측면으로 이동할 것임은 잘 알려져 있다. 포어의 시스 측면에 효소를 위치시키는 것은 서열 내 일부 뉴클레오티드가 포어의 배럴 또는 채널에 진입하여 그와 상호작용하도록 구축물을 취급가능하게 한다. 바람직하게, 서열 내 적어도 20％, 적어도 40％, 적어도 50％, 적어도 80％ 또는 적어도 90％의 뉴클레오티드가 포어의 배럴 또는 채널에 진입하여 그와 상호작용한다.

공유적 부착 부위 및 방법은 바람직하게는 효소의 이동성에 제약이 가해지도록 선택된다. 이는 구축물 내 일부 뉴클레오티드가 포어와 상호작용하는 방식으로 효소가 구축물을 취급하는데 도움이 된다. 예를 들어, 효소가 이동하는 능력을 제약하는 것은 그의 활성 부위가 포어의 배럴 또는 채널의 개구부를 형성하는 포어 또는 포어 서브유닛 부분을 향하여 영구적으로 배향되게 할 수 있음을 의미한다. 효소의 이동성은 효소가 포어 또는 포어 서브유닛에 부착되는 지점의 개수를 증가시키는 것 및/또는 특이적 링커를 사용하는 것에 의해 제약될 수 있다.

분자 어댑터

일부 실시양태에서, 포어는 포어와 뉴클레오티드 또는 구축물 사이의 상호작용을 용이하게 하는 분자 어댑터를 포함한다. 어댑터의 존재는 포어 및, 구축물로부터 방출되거나 구축물 내에 존재하는 뉴클레오티드의 주객 화학(host-guest chemistry)을 개선시킨다. 주객 화학의 원리는 당업계에 널리 공지되어 있다. 어댑터는 포어의 물리적 또는 화학적 특성에 영향을 미쳐 뉴클레오티드와의 상호작용을 개선시킨다. 어댑터는 전형적으로 포어의 배럴 또는 채널의 전하를 변경시키거나, 또는 뉴클레오티드와 특이적으로 상호작용하거나 그에 결합하여 포어와의 상호작용을 용이하게 한다.

어댑터는 구축물로부터 방출되거나 구축물 내에 존재하는 뉴클레오티드와 포어 사이의 상호작용을 매개한다. 뉴클레오티드는 바람직하게는 어댑터를 통해 또는 어댑터와 연결되어 포어에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오티드는 가장 바람직하게는 막을 가로질러 포어를 통과하면서 어댑터를 통해 또는 어댑터와 연결되어 포어에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오티드는 또한 막을 가로질러 포어를 통과하면서 어댑터를 통해 또는 어댑터와 연결되어 포어의 배럴 또는 채널에 가역적으로 결합할 수 있다. 어댑터는 바람직하게는 배럴 또는 채널을 조여서 그것이 뉴클레오티드와 상호작용하게 할 수 있다.

어댑터는 전형적으로는 시클릭이다. 어댑터는 바람직하게는 포어와 동일한 대칭을 갖는다. 포어가 7량체인 (예를 들어, 14 가닥이 막횡단 β 배럴에 제공된 중심 축 주변에 7 개의 서브유닛을 갖는) 경우, 전형적으로 7 폴드 대칭을 갖는 어댑터가 사용된다. 마찬가지로, 포어가 6량체 (예를 들어, 12 가닥이 막횡단 β 배럴에 제공되거나 또는 12 가닥 β 배럴인 중심 축 주변에 6 개의 서브유닛을 갖는) 경우, 전형적으로 6 폴드 대칭을 갖는 어댑터가 사용된다. 포어와 뉴클레오티드 사이의 상호작용을 용이하게 하는 임의의 어댑터를 이용할 수 있다. 적합한 어댑터로는 시클로덱스트린, 시클릭 펩티드 및 쿠커비투릴이 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 어댑터는 바람직하게는 시클로덱스트린 또는 그의 유도체이다. 어댑터는 보다 바람직하게는 헵타키스-6-아미노-β-시클로덱스트린 (am₇-βCD), 6-모노데옥시-6-모노아미노-β-시클로덱스트린 (am₁-βCD) 또는 헵타키스-(6-데옥시-6-구아니디노)-시클로덱스트린 (gu₇-βCD)이다. 하기 표 4는 포어 및 어댑터의 바람직한 조합을 보여준다.

어댑터는 바람직하게는 포어에 공유적으로 부착된다. 어댑터는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 포어에 공유적으로 부착될 수 있다. 어댑터는 포어에 직접적으로 부착될 수 있다. 어댑터는 바람직하게는 이관능성 가교제를 이용하여 포어에 부착된다. 적합한 가교제가 당업계에 널리 공지되어 있다. 바람직한 가교제로는 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 3-(피리딘-2-일디술파닐)프로파노에이트, 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 4-(피리딘-2-일디술파닐)부타노에이트 및 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 8-(피리딘-2-일디술파닐)옥타노에이트가 포함된다. 가장 바람직한 가교제는 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP)이다. 전형적으로, 어댑터는 어댑터/가교제 복합체가 포어에 공유적으로 부착되기 이전에 이관능성 가교제에 공유적으로 부착되지만, 이관능성 가교제/포어 복합체가 어댑터에 부착되기 이전에 이관능성 가교제가 포어에 공유적으로 부착되는 것이 또한 가능하다. 공유적 부착 부위는 어댑터가 구축물로부터 방출되거나 구축물 내에 존재하는 뉴클레오티드와 포어의 상호작용을 용이하게 하여 뉴클레오티드의 검출을 가능하게 하도록 선택된다. α-HL에 기초한 포어의 경우, 포어의 배럴 또는 채널 내 어댑터의 정확한 배향 및 포어에 대한 어댑터의 공유적 부착은 서열 2에 대한 특정 변형을 사용하여 용이하게 할 수 있다. 특히, 포어의 모든 서브유닛은 바람직하게는 서열 2의 위치 139에 글루타민을 갖는다. 포어의 하나 이상의 서브유닛은 서열 2의 위치 113에 아르기닌을 가질 수 있다. 포어의 하나 이상의 서브유닛은 서열 2의 위치 119, 121 또는 135에 시스테인을 가질 수 있다.

포어 및 뉴클레오티드 사이의 상호작용

방법은 핵산 취급 효소, 예컨대 엑소뉴클레아제가 부착된 포어가 막에 삽입되어 있는 임의의 적합한 막/포어 시스템을 이용하여 행할 수 있다. 상기 방법은 전형적으로 (i) 핵산 취급 효소, 예컨대 엑소뉴클레아제가 부착되어 있는 포어를 포함하는 인공 막, (ii) 핵산 취급 효소, 예컨대 엑소뉴클레아제가 부착되어 있는 포어를 포함하는 단리된 자연 발생 막, 또는 (iii) 핵산 취급 효소, 예컨대 엑소뉴클레아제가 부착된 포어를 발현하는 세포를 이용하여 수행한다. 상기 방법은 바람직하게는 인공 막을 이용하여 수행한다. 막은 변형된 포어에 더하여 다른 막횡단 및/또는 막내 단백질 뿐만 아니라 다른 분자를 포함할 수 있다.

막은 이온, 뉴클레오티드 및 핵산의 흐름에 대한 장벽을 형성한다. 막은 바람직하게는 지질 이중층이다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 지질 이중층은 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 지질 이중층 막은 몬탈 및 뮐러(Montal and Mueller, (1972))의 방법을 이용하여 형성할 수 있다. 지질 이중층은 또한 국제 출원 번호 PCT/GB08/000563 및 PCT/GB07/002856에 기재되어 있는 방법을 이용하여 형성할 수 있다.

본 발명의 방법은 인지질, 당지질, 콜레스테롤 및 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 임의의 막으로부터 형성된 지질 이중층을 이용하여 수행할 수 있다. 국제 출원 번호 PCT/GB08/000563에 기재되어 있는 임의의 지질을 이용할 수 있다.

막, 예컨대 지질 이중층에 포어를 삽입하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 그러한 방법 중 일부를 상기에서 논의하였다.

뉴클레오티드 또는 구축물은 막의 어느 한쪽 측면에서 포어와 접촉할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 구축물은 막의 어느 한쪽 측면의 포어에 도입될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 구축물은 전형적으로 효소가 포어에 부착된 막 쪽에 접촉된다. 이는 상기 방법동안 효소가 구축물을 취급가능하게 한다.

구축물의 일부 뉴클레오티드는 포어의 배럴 또는 채널을 통해 막을 통과하면서 포어 및/또는 어댑터와 상호작용한다. 별법적으로, 구축물이 엑소뉴클레아제에 의해 소화될 경우, 뉴클레오티드는 어댑터를 통해 또는 어댑터와 연결되어 포어와 상호작용하고, 포어로부터 해리되고, 같은 측면의 막 상에 잔류할 수 있다. 상기 방법은 어댑터의 배향이 고정되어 있는 포어를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 그러한 실시양태에서, 뉴클레오티드는 바람직하게는 어댑터가 배향된 쪽을 향해 포어의 말단과 접촉한다. 가장 바람직하게는, 뉴클레오티드는 뉴클레오티드와 상호작용하는 어댑터의 일부가 배향된 쪽을 향해 포어의 말단과 접촉한다.

뉴클레오티드는 임의의 방식으로, 임의의 부위에서 포어와 상호작용할 수 있다. 상기에서 논의한 바와 같이, 뉴클레오티드는 바람직하게는 어댑터를 통해 또는 어댑터와 연결되어 포어에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오티드는 가장 바람직하게는 막을 가로질러 포어를 통과하면서 어댑터를 통해 또는 어댑터와 연결되어 포어에 가역적으로 결합한다. 뉴클레오티드는 또한 막을 가로질러 포어를 통과하면서 어댑터를 통해 또는 어댑터와 연결되어 포어의 배럴 또는 채널에 가역적으로 결합할 수 있다.

뉴클레오티드와 포어 사이의 상호작용 동안, 뉴클레오티드는 해당 뉴클레오티드에 특이적인 방식으로 포어를 통해 흐르는 전류에 영향을 미친다. 예를 들어, 특정 뉴클레오티드는 특정 평균 시간 동안 그리고 특정 범위까지 포어를 통해 흐르는 전류를 감소시킬 것이다. 다시 말하면, 포어를 통해 흐르는 전류는 특정 뉴클레오티드마다 구분된다. 대조군 실험을 행하여 포어를 통해 흐르는 전류에 대한 특정 뉴클레오티드의 효과를 결정할 수 있다. 이어서 시험 샘플에 대해 본 발명의 방법을 행한 결과를 그러한 대조군 실험으로부터의 결과와 비교하여 특정 뉴클레오티드를 확인할 수 있다.

장치

방법은 핵산 취급 효소가 부착된 포어가 막에 삽입되어 있는 막/포어 시스템을 조사하는데 적합한 임의의 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 상기 방법은 확률론적 감지에 적합한 임의의 장치를 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 장치는 수용액을 포함하는 챔버 및 챔버를 두 섹션으로 분리시키는 장벽을 포함한다. 장벽은 포어를 함유하는 막이 형성된 개구부를 갖는다. 뉴클레오티드 또는 구축물은 핵산을 챔버에 도입하는 것에 의해 포어와 접촉될 수 있다. 핵산은 챔버의 2 개의 섹션 중 어느 하나에 도입될 수 있지만, 바람직하게는 효소를 함유하는 챔버 섹션에 도입된다.

방법은 국제 출원 번호 PCT/GB08/000562에 기재되어 있는 장치를 이용하여 행할 수 있다.

방법은 뉴클레오티드와의 상호작용 동안 포어를 통해 흐른 전류를 측정하는 것을 포함한다. 따라서, 장치는 또한 전위를 인가하고, 막 및 포어를 가로질러 전기 신호를 측정할 수 있는 전기 회로를 포함한다. 방법은 패치 클램프 또는 전압 클램프를 이용하여 행할 수 있다. 방법은 바람직하게는 전압 클램프를 이용하는 것을 포함한다.

조건

본 발명의 방법은 구축물의 뉴클레오티드와의 상호작용 동안 포어를 통해 흐른 전류를 측정하는 것을 포함한다. 막횡단 포어를 통해 이온 전류를 측정하는데 적합한 조건은 당업계에 공지되어 있고, 실시예에서 개시한다. 방법은 막 및 포어를 가로질러 전압을 인가하여 행한다. 사용되는 전압은 전형적으로 -400 mV 내지 +400 mV이다. 사용되는 전압은 바람직하게는 -400 mV, -300 mV, -200 mV, -150 mV, -100 mV, -50 mV, -20 mV 및 0 mV로부터 선택된 하한 및 +10 mV, +20 mV, +50 mV, +100 mV, +150 mV, +200 mV, +300 mV 및 +400 mV으로부터 독립적으로 선택된 상한을 갖는 범위의 것이다. 사용되는 전압은 보다 바람직하게는 120 mV 내지 170 mV 범위의 것이다. 인가되는 전위를 달리하여, 본 발명의 포어로 상이한 뉴클레오티드를 식별하는 것을 증가시킬 수 있다.

방법은 임의의 알칼리 금속 클로라이드 염의 존재하에서 행한다. 상기에서 논의한 예시적인 장치에서, 염은 챔버 내 수용액 중에 존재한다. 염화 칼륨 (KCl), 염화 나트륨 (NaCl) 또는 염화 세슘 (CsCl)을 전형적으로 이용한다. KCl이 바람직하다. 염 농도는 전형적으로 0.1 내지 2.5 M, 0.3 내지 1.9 M, 0.5 내지 1.8 M, 0.7 내지 1.7 M, 0.9 내지 1.6 M 또는 1 M 내지 1.4 M이다. 높은 염 농도는 높은 신호 대 잡음 비율을 제공하고, 정상 전류 변동의 배경에 대비하여 뉴클레오티드의 존재를 나타내는 전류가 확인되게 한다. 그러나, 효소가 기능할 수 있기 위해서는 보다 낮은 염 농도를 사용해야 할 수 있다.

방법은 전형적으로 완충제의 존재하에 수행된다. 상기에서 논의한 예시적인 장치에서, 완충제는 챔버 내 수용액 중에 존재한다. 임의의 완충제를 방법에 사용할 수 있다. 하나의 적합한 완충제는 트리스 HCl 완충제이다. 방법은 전형적으로 pH 4.0 내지 10.0, 4.5 내지 9.5, 5.0 내지 9.0, 5.5 내지 8.8, 6.0 내지 8.7 또는 7.0 내지 8.8 또는 7.5 내지 8.5에서 행한다. 사용되는 pH는 바람직하게는 약 7.5이다.

방법은 전형적으로 0℃ 내지 100℃, 15℃ 내지 95℃, 16℃ 내지 90℃, 17℃ 내지 85℃, 18℃ 내지 80℃, 19℃ 내지 70℃, 또는 20℃ 내지 60℃에서 행한다. 방법은 실온에서 행할 수 있다. 방법은 바람직하게는 효소 기능을 지지하는 온도, 예컨대 약 37℃에서 행한다. 온도가 증가되면 낮은 염 농도에서 양호한 뉴클레오티드 식별을 달성할 수 있다. 그러나, 더 낮은 온도, 특히 실온 미만의 온도는 체류 시간을 길게 하고, 따라서 보다 높은 정도의 정확성을 얻는데 사용될 수 있다.

용액 온도를 증가시키는 것에 더하여, 효소 활성에 적합한 조건은 유지하면서 용액의 전도도를 증가시키기 위해 사용할 수 있는 다수의 다른 전략이 존재한다. 한가지 그러한 전략은 2 가지의 상이한 염 용액의 농도, 효소쪽의 낮은 염 농도 및 반대쪽의 보다 높은 농도를 나누는데 지질 이중층을 사용하는 것이다. 이러한 접근법의 한 예는 막의 시스 측면에는 200 mM의 KCl을, 트랜스 챔버에는 500 mM KCl을 사용한다. 이러한 조건에서, 포어를 통한 전도도는 정상 조건하에서의 400 mM KCl에 거의 동등할 것으로 예상되며, 시스 측면에 배치될 경우 효소 만이 200 mM을 겪는다. 비대칭 염 조건을 이용하는 것에 의한 또 다른 가능한 이점은 포어를 가로질러 유도되는 삼투 구배이다. 이러한 물의 순 흐름은 검출을 위해 뉴클레오티드를 포어로 당기는데 이용될 수 있다. 유사한 효과를 중성 삼투질, 예컨대 수크로스, 글리세롤 또는 PEG를 이용하여 달성할 수 있다. 또 다른 가능성은 KCl 수준이 비교적 낮은 용액을 사용하고, 효소 활성에 덜 지장을 주는 부가적인 전하 운반 종에 의존하는 것이다.

엑소뉴클레아제-기반 방법

한 실시양태에서, 시퀀싱 방법은 구축물을 엑소뉴클레아제 효소, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제가 부착된 포어와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기에서 논의한 임의의 엑소뉴클레아제 효소를 본 방법에 사용할 수 있다. 엑소뉴클레아제는 구축물의 한 말단으로부터 개개의 뉴클레오티드를 방출한다. 엑소뉴클레아제는 전형적으로 핵산 서열의 한 말단에 결합하여 그 말단으로부터 한번에 하나의 뉴클레오티드 서열을 소화시키는 효소이다. 엑소뉴클레아제는 5'에서 3' 방향 또는 3'에서 5' 방향으로 핵산을 소화시킬 수 있다. 엑소뉴클레아제가 결합되는 핵산의 말단은 전형적으로 사용되는 효소의 선택 및/또는 당업계에 공지된 방법을 이용하는 것을 통해 결정된다. 핵산 서열의 어느 하나의 말단의 히드록실 기 또는 캡 구조는 전형적으로 엑소뉴클레아제가 핵산 서열의 특정 말단에 결합하는 것을 방지하거나 용이하게 하는데 사용될 수 있다.

방법은 구축물을 엑소뉴클레아제와 접촉시켜, 상기에서 논의한 바와 같이 일부 뉴클레오티드의 식별을 가능하게 하는 속도로 뉴클레오티드가 구축물의 말단으로부터 소화되게 하는 것을 포함한다. 이를 행하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 말단으로부터 단일의 아미노산을 연속적으로 소화시키는데 에드만 분해(Edman degradation)를 이용하여, 이들이 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 확인될 수 있도록 한다. 상응하는 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다.

엑소뉴클레아제가 돌연변이에 의해 변경될 수 있는 속도를 야생형 효소와 비교하였다. 시퀀싱 방법에서 엑소뉴클레아제 활성의 적합한 속도는 초당 0.5 내지 1000 뉴클레오티드, 초당 0.6 내지 500 뉴클레오티드, 초당 0.7 내지 200 뉴클레오티드, 초당 0.8 내지 100 뉴클레오티드, 초당 0.9 내지 50 뉴클레오티드 또는 초당 1 내지 20 또는 10 뉴클레오티드를 소화시키는 것을 포함한다. 속도는 바람직하게는 초당 1, 10, 100, 500 또는 1000 뉴클레오티드이다. 엑소뉴클레아제 활성의 적합한 속도는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 활성의 최적화 속도가 감소되거나 개선된 변이체 엑소뉴클레아제를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

포어를 통한 DNA 밀고 당기기

가닥 시퀀싱은 핵산 중합체를 포어를 통해 제어된 상태로 단계적으로 전위시키는 것을 포함한다. 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 가수분해하거나, 중합시키거나, 또는 가공하는 한, 대부분의 DNA 취급 효소를 본 출원에서 사용하는데 적합하다. 바람직한 효소는 폴리머라제, 뉴클레아제, 헬리카제 및 토포이소머라제, 예컨대 기라제이다. 뉴클레오티드가 포어의 감지 모이어티에 도달하는 시리즈에서 무질서해질 가능성이 없기 때문에 효소 모이어티는 개개의 뉴클레오티드 시퀀싱과 관련하여 포어 루멘에 아주 근접하여 위치할 것이 요구되지 않는다.

단일 가닥 DNA 시퀀싱을 위한 두 가지 전략은 전위를 인가하거나 또는 인가된 전위에 대하여 DNA를 나노포어를 통해 시스에서 트랜스 및 트랜스에서 시스 둘 모두로 전위시키는 것이다. 가닥 시퀀싱을 위한 가장 유익한 메카니즘은 전위를 인가하면서 나노포어를 통해 단일 가닥 DNA를 제어하며 전위시키는 것이다. 이중 가닥 DNA에 대해 계속해서 또는 연속적으로 작용하는 엑소뉴클레아제를 인가된 전위하에서 잔류 단일 가닥이 공급되도록 포어의 시스 측면에서 사용하거나, 또는 역 전위하에서 트랜스 측면에서 사용할 수 있다. 유사하게, 이중 가닥 DNA를 푸는 헬리카제를 또한 유사한 방식으로 사용할 수 있다. 또한, 인가된 전위에 대해 가닥 전위를 요구하는 시퀀싱 적용 가능성이 존재하지만, DNA는 역 전위 또는 전위가 존재하지 않는 조건 하에서 효소에 의해 먼저 "포착"되어야 한다. 이어서 결합 이후에 전위가 되돌려지면, 가닥은 포어를 통해 시스에서 트랜스로 통과할 것이고, 전류 흐름에 의해 연장된 형태로 유지될 것이다. 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 또는 단일 가닥 DNA 의존성 폴리머라제는 방금 전위된 단일 가닥을 인가된 전위에 대하여 포어를 통해 제어된 단계적 방식으로 트랜스에서 시스로 후퇴되게 하는 분자 모터로서 작용할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명한다:

1 실시예

1.1 시퀀싱 주형의 생성

목적하는 주형은 이중 가닥 (dsDNA) 주형 단편의 블런트 말단에 인공 헤어핀 어댑터 (본 문서에서 "유형 I 어댑터" 및 "유형 II 어댑터"라 칭함)를 라이게이션시켜 생성하였다. 어댑터는 목적하는 단일 가닥 시퀀싱 주형의 구축, 정제 및 최종 방출을 용이하게 하도록 설계된 인공적이며 화학적으로 합성된 DNA 서열이다. 서열을 인공화하면, 이들 어댑터는 그의 실제 서열에서 큰 정도의 가요성을 가지며, 따라서 사용되는 서열에 관능성이 구비될 수 있다.

1.2 유형 I 어댑터

유형 I 어댑터 (도 1)은 단일 가닥 DNA (ssDNA) 올리고뉴클레오티드로서 합성하였고, 여기서 5' 말단 뉴클레오티드는 3' 말단 뉴클레오티드에 상보적이어서 적절한 조건하에서 분자내 혼성화가 일어나 dsDNA 영역 및 ssDNA '버블' 영역을 갖는 블런트 말단의 DNA '헤어핀 루프'가 생성되도록 하였다. 이중 가닥 혼성화 영역은 (예를 들어) '드문 절단' 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열의 1/2를 나타내는 염기 서열로 종결된다. '버블' 영역은 상보적 ssDNA 서열이 구비된 지지 표면 또는 비드 상에 구조의 포획을 위한 혼성화가능한 '후크' 및 구조를 함유하는 임의의 라이게이션 생성물을 제공할 수 있는 단일 가닥 서열이다. '버블' 영역은 또한 특정 유형 I 어댑터를 또 다른 달리 동일한 유형 I 어댑터와 식별되게 하는 서열을 함유할 수 있어서, 주형 DNA로부터 유래된 라이게이션 생성물을 다른 개체와 멀티플렉스 분석이 가능하게 한다.

1.3 유형 II 어댑터

유형 II 어댑터 (도 2)는 기본 구조에서 긴 올리고뉴클레오티드의 분자내 혼성화 생성물인 유형 I 어댑터와 다르지 않다. 형성된 구조는 또한 유형 I 어댑터 헤어핀의 말단에 제시되는 회문식 드문 절단 제한 효소의 1/2을 나타내는 말단을 갖는다. 부가적으로, 유형 II 어댑터의 이중 가닥 영역은 구분되는 드문 절단 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 (도 2에서 2^ry)을 함유한다. 어댑터는 또한 어댑터를 확인하는데 사용될 수 있는 서열을 함유할 수 있으며, 이는 회문식 드문 절단 제한 효소의 1/2를 나타내는 말단 (도 2에서 1^ry) 및 구분되는 드문 절단 제한 엔도뉴클레아제의 인식 서열 (도 2에서 2^ry)의 사이에 위치한다. 유형 II 어댑터의 단일 가닥 DNA의 버블 영역은 그 역시 선택가능한 마커를 보유하지만 (이는 [비오틴-dT] 형태이며, 유형 II 어댑터를 함유하는 임의의 라이게이션 생성물이 스트렙타비딘이 고정된 표면에 포획될 수 있도록 함), 유형 I 어댑터의 그것보다 현저하게 더 작을 수 있다.

1.4 게놈 주형

고 분자량 게놈 주형으로부터, 다수의 방법으로 시퀀싱 주형을 제조할 수 있다. 확립된 방법은 무작위 단편화 및 전단된 DNA의 블런트 말단으로의 말단 수선으로; 이는 용인되고 신뢰할 만한 방법이며, 제안된 주형 생성 계획은 이것이 선택 방법일 것으로 예상되게 한다. 그러나, 변형에 의해 기재된 기술을 변형시켜 '점착성' 말단을 비롯한 대안적 말단을 생성하는 다른 단편화 방법을 수용할 수 있다.

1.5 무작위적으로 단편화되고 말단 수선된 주형 DNA에의 어댑터의 라이게이션

전단된 DNA 단편은 양 가닥에 5' PO₄ 및 3' OH를 가질 것이다. 주형의 탈인산화는 주형 단편의 반복배열화를 방지할 것이지만, 5' 인산화된 어댑터의 라이게이션시, 남은 틈을 수선해야 하는 과제가 생길 것이다. 인산화된 주형 DNA를 함유하는 과 농도의 어댑터를 사용하는 것은 주형:주형 라이게이션의 가능성은 제한할 것이지만, 삽입된 주형이 전혀 없는 수많은 라이게이션 생성물이 제조되게 할 것이다 (도 3 및 도 4).

유형 I, 유형 II 및 블런트 말단의 주형의 임의의 조합에 의해 다양한 상이한 라이게이션 생성물이 생성될 것이다:

● 어댑터 - 어댑터 생성물

○ 유형 I - 유형 I은 스트렙타비딘에 결합되지 않을 것이고, 임의의 RE 처리 전에 제거될 것이다.

○ 유형 I - 유형 II는 스트렙타비딘에 결합될 것이지만, 1차 RE 소화에 의해 분해될 것이다.

○ 유형 II - 유형 I은 스트렙타비딘에 결합될 것이지만, 1차 RE 소화에 의해 분해될 것이다.

○ 유형 II - 유형 II는 스트렙타비딘에 결합될 것이고, 스트렙타비딘 지지 비드에 가교될 수 있지만, 1차 RE 소화에 의해 분해될 것이다.

● 어댑터 - dsDNA 주형 - 어댑터 생성물

○ 유형 I - dsDNA 주형 - 유형 I은 스트렙타비딘에 결합되지 않을 것이고, 임의의 RE 처리 전에 제거될 것이다.

○ 유형 I - dsDNA 주형 - 유형 II는 스트렙타비딘에 결합될 것이고, 1차 RE 소화에서 존속할 것이며, 2차 RE 소화시에 목적하는 생성물을 방출할 것이다.

○ 유형 II - dsDNA 주형 - 유형 I은 스트렙타비딘에 결합될 것이고, 1차 RE 소화에서 존속할 것이며, 2차 RE 소화시에 목적하는 생성물을 방출할 것이다.

○ 유형 II - dsDNA 주형 - 유형 II는 스트렙타비딘에 결합될 것이고, 스트렙타비딘 지지 비드에 가교될 수 있으며, 1차 RE 소화에서 존속할 것이지만, 2차 RE 소화시에 '단일 가닥' 주형 생성물 (공유적으로 연결되지 않은 것)을 방출할 것이다.

1.6 목적하는 시퀀싱 주형의 단리

목적하는 단일 가닥 생성물의 능률적인 정제 전략을 제시한다 (도 5). 라이게이션 반응 후, 유형 II 어댑터가 혼입된 모든 덤벨 구조는 고정된 스트렙타비딘 표면 상에서 포획되고 (유형 II 어댑터 상에 존재하는 비오틴 모이어티에 의함), 이때 유형 I 어댑터 만을 함유하는 임의의 구조는 미결합된 채로 남으므로, 세척 제거할 수 있다. 결합된 유형 II 어댑터 구조를 1차 제한 엔도뉴클레아제로 처리하면 임의의 개입 주형 DNA가 존재하지 않는 2 개의 어댑터의 라이게이션에 의해 형성된 결합 생성물이 절단될 것이다. 이어서, 모든 방출된 단편을 세척 제거하고, 반면 목적하는 생성물은 플레이트에 결합된 채로 유지된다. 2차 제한 효소를 적용하면, 라이게이션 생성물이 단지 하나의 유형 II 어댑터를 갖는 것이든 또는 양 말단이 유형 II 어댑터를 갖는 것이든 관계없이 포획된 유형 II 어댑터 서열 내의 결합된 단편이 절단될 것이다. 방출 생성물은 목적하는 공유적으로 폐쇄된 구조이거나 (모든 방출된 구조의 2/3가 이 형태일 것임), 또는 유형 II:주형:유형 II 라이게이션 생성물로부터 유래된 선형화된 서열일 것이다 (방출된 생성물의 1/3이 이 형태일 것임). 목적하는 공유적으로 폐쇄된 구조의 비폐쇄된 말단은 유형 II 어댑터로부터 유래될 것이며, 이는 어댑터를 확인하는데 사용할 수 있는 서열을 함유할 수 있다.

이들 방출된 서열을 유형 I '버블' 서열에 상보적인 단일 가닥 DNA 서열이 존재하는 새로운 플레이트로 옮기면, 유형 I:주형:유형 II 라이게이션 생성물로부터 유래된 DNA 종들 만이 포획될 수 있을 것이다. 세척시 임의의 다른 DNA 단편이 제거될 것이고, 목적하는 공유적으로 폐쇄된 유형 I:주형:유형 II 나머지 종 만이 남을 것이며, 이어서 이를 플레이트로부터 방출시키고 (열, 알칼리 세척) 변성시켜 엑소뉴클레아제 시퀀싱을 준비할 수 있다.

상기 정제 계획은 자동화가 가능하며, 오직 하나의 생성물 종을 전달함에 있어서 시퀀싱 반응에 바람직하다. 이 생성물은 단순 알칼리 세척에 의해 고정된 항-유형 I 어댑터 버블 플레이트로부터 방출될 수 있고, 그 후 변성된 주형 DNA (도 6)는 예를 들어 이. 콜라이 단일 가닥 결합 단백질을 함유하는 완충제 용액의 존재하에서 중성화될 수 있으며, 변성된 ssDNA에 결합될 경우 이. 콜라이 엑소뉴클레아제 I의 반응 진행성 유지를 위한 필수 조건인 그의 단일 가닥 형태가 유지될 것이다.

1.7 목적하는 시퀀싱 주형의 엑소뉴클레아제 시퀀싱

목적하는 구조의 생성시에, 단일 가닥의 3' 말단에 결합하여 소화시키는 엑소뉴클레아제를 이용하여 엑소뉴클레아제 시퀀싱하는 것을 따를 수 있을 것이다. 방출된 5' 모노포스페이트 뉴클레오시드는 포어에서 확인될 것이며, 이하에 상응하는 염기 서열이 (이상적으로) 순서대로 나타날 것이다 (도 7):

● 서열 시작: 유형 II 어댑터의 잔여 서열, 이는 아마도 어댑터를 확인하는데 사용할 수 있는 서열을 함유할 것임.

● 게놈 서열: 주형 DNA의 서열 (센스 가닥).

● 유형 I 공통: 유형 I 어댑터의 서열 (이는 또한 '포획' 서열임).

● 유형 I 식별자: 멀티플렉스 시퀀싱 반응에서 라이게이션 생성물을 특이적으로 확인하는데 사용되는 유형 I 어댑터의 서열.

● Comp. 게놈 서열: 주형 DNA의 서열 (안티센스 가닥, 따라서 이미 생성된 센스 가닥 서열과 역 상보적임).

● 서열 끝: 유형 II 어댑터의 잔여 서열 (먼저 시퀀싱된 염기의 역 상보), 이는 아마도 어댑터를 확인하는데 사용할 수 있는 서열을 함유할 것임.

서열 목록

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agcagataac ttccttgatc ctaacaaagc aagttctcta 660 ttatcttcag ggttttcacc agacttcgct acagttatta ctatggatag aaaagcatcc 720 aaacaacaaa caaatataga tgtaatatac gaacgagttc gtgatgatta ccaattgcat 780 tggacttcaa caaattggaa aggtaccaat actaaagata aatggacaga tcgttcttca 840 gaaagatata aaatcgattg ggaaaaagaa gaaatgacaa at 882 <210> 2 <211> 293 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala 85 90 95 Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr 100 105 110 Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp 115 120 125 Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile 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Sequence <220> <223> amino acid sequence of one subunit of alpha-HL M113R/N139Q (HL-RQ) <400> 4 Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser 1 5 10 15 Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn 20 25 30 Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln 50 55 60 Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp 65 70 75 80 Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala 85 90 95 Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr 100 105 110 Arg Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp 115 120 125 Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Gln Val Ser Ile Gly His 130 135 140 Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro 145 150 155 160 Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn 165 170 175 Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly 180 185 190 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Asn Asp Asp Gly 145 150 155 160 Leu Pro Ser Phe Arg Leu Glu His Leu Thr Lys Ala Asn Gly Ile Glu 165 170 175 His Ser Asn Ala His Asp Ala Met Ala Asp Val Tyr Ala Thr Ile Ala 180 185 190 Met Ala Lys Leu Val Lys Thr Arg Gln Pro Arg Leu Phe Asp Tyr Leu 195 200 205 Phe Thr His Arg Asn Lys His Lys Leu Met Ala Leu Ile Asp Val Pro 210 215 220 Gln Met Lys Pro Leu Val His Val Ser Gly Met Phe Gly Ala Trp Arg 225 230 235 240 Gly Asn Thr Ser Trp Val Ala Pro Leu Ala Trp His Pro Glu Asn Arg 245 250 255 Asn Ala Val Ile Met Val Asp Leu Ala Gly Asp Ile Ser Pro Leu Leu 260 265 270 Glu Leu Asp Ser Asp Thr Leu Arg Glu Arg Leu Tyr Thr Ala Lys Thr 275 280 285 Asp Leu Gly Asp Asn Ala Ala Val Pro Val Lys Leu Val His Ile Asn 290 295 300 Lys Cys Pro Val Leu Ala Gln Ala Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Ala 305 310 315 320 Asp Arg Leu Gly Ile Asn Arg Gln His Cys Leu Asp Asn Leu Lys Ile 325 330 335 Leu Arg Glu Asn Pro Gln Val Arg Glu Lys Val Val Ala Ile Phe Ala 340 345 350 Glu Ala Glu Pro Phe Thr Pro Ser Asp Asn Val Asp Ala Gln Leu Tyr 355 360 365 Asn Gly Phe Phe Ser Asp Ala Asp Arg Ala Ala Met Lys Ile Val Leu 370 375 380 Glu Thr Glu Pro Arg Asn Leu Pro Ala Leu Asp Ile Thr Phe Val Asp 385 390 395 400 Lys Arg Ile Glu Lys Leu Leu Phe Asn Tyr Arg Ala Arg Asn Phe Pro 405 410 415 Gly Thr Leu Asp Tyr Ala Glu Gln Gln Arg Trp Leu Glu His Arg Arg 420 425 430 Gln Val Phe Thr Pro Glu Phe Leu Gln Gly Tyr Ala Asp Glu Leu Gln 435 440 445 Met Leu Val Gln Gln Tyr Ala Asp Asp Lys Glu Lys Val Ala Leu Leu 450 455 460 Lys Ala Leu Trp Gln Tyr Ala Glu Glu Ile Val 465 470 475 <210> 7 <211> 1275 <212> DNA <213> Thermus thermophilus <400> 7 atgtttcgtc gtaaagaaga tctggatccg ccgctggcac tgctgccgct gaaaggcctg 60 cgcgaagccg ccgcactgct ggaagaagcg ctgcgtcaag gtaaacgcat tcgtgttcac 120 ggcgactatg atgcggatgg cctgaccggc accgcgatcc tggttcgtgg tctggccgcc 180 ctgggtgcgg atgttcatcc gtttatcccg caccgcctgg aagaaggcta tggtgtcctg 240 atggaacgcg tcccggaaca tctggaagcc tcggacctgt ttctgaccgt tgactgcggc 300 attaccaacc atgcggaact gcgcgaactg ctggaaaatg gcgtggaagt cattgttacc 360 gatcatcata cgccgggcaa aacgccgccg ccgggtctgg tcgtgcatcc ggcgctgacg 420 ccggatctga aagaaaaacc gaccggcgca ggcgtggcgt ttctgctgct gtgggcactg 480 catgaacgcc tgggcctgcc gccgccgctg gaatacgcgg acctggcagc cgttggcacc 540 attgccgacg ttgccccgct gtggggttgg aatcgtgcac tggtgaaaga aggtctggca 600 cgcatcccgg cttcatcttg ggtgggcctg cgtctgctgg ctgaagccgt gggctatacc 660 ggcaaagcgg tcgaagtcgc tttccgcatc gcgccgcgca tcaatgcggc ttcccgcctg 720 ggcgaagcgg aaaaagccct gcgcctgctg ctgacggatg atgcggcaga agctcaggcg 780 ctggtcggcg aactgcaccg tctgaacgcc cgtcgtcaga ccctggaaga agcgatgctg 840 cgcaaactgc tgccgcaggc cgacccggaa gcgaaagcca tcgttctgct ggacccggaa 900 ggccatccgg gtgttatggg tattgtggcc tctcgcatcc tggaagcgac cctgcgcccg 960 gtctttctgg tggcccaggg caaaggcacc gtgcgttcgc tggctccgat ttccgccgtc 1020 gaagcactgc gcagcgcgga agatctgctg ctgcgttatg gtggtcataa agaagcggcg 1080 ggtttcgcaa tggatgaagc gctgtttccg gcgttcaaag cacgcgttga agcgtatgcc 1140 gcacgtttcc cggatccggt tcgtgaagtg gcactgctgg atctgctgcc ggaaccgggc 1200 ctgctgccgc aggtgttccg tgaactggca ctgctggaac cgtatggtga aggtaacccg 1260 gaaccgctgt tcctg 1275 <210> 8 <211> 425 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 8 Met Phe Arg Arg Lys Glu Asp Leu Asp Pro Pro Leu Ala Leu Leu Pro 1 5 10 15 Leu Lys Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg 20 25 30 Gln Gly Lys Arg Ile Arg Val His Gly Asp Tyr Asp Ala Asp Gly Leu 35 40 45 Thr Gly Thr Ala Ile Leu Val Arg Gly Leu Ala Ala Leu Gly Ala Asp 50 55 60 Val His Pro Phe Ile Pro His Arg Leu Glu Glu Gly Tyr Gly Val Leu 65 70 75 80 Met Glu Arg Val Pro Glu His Leu Glu Ala Ser Asp Leu Phe Leu Thr 85 90 95 Val Asp Cys Gly Ile Thr Asn His Ala Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu 100 105 110 Asn Gly Val Glu Val Ile Val Thr Asp His His Thr Pro Gly Lys Thr 115 120 125 Pro Pro Pro Gly Leu Val Val His Pro Ala Leu Thr Pro Asp Leu Lys 130 135 140 Glu Lys Pro Thr Gly Ala Gly Val Ala Phe Leu Leu Leu Trp Ala Leu 145 150 155 160 His Glu Arg Leu Gly Leu Pro Pro Pro Leu Glu Tyr Ala Asp Leu Ala 165 170 175 Ala Val Gly Thr Ile Ala Asp Val Ala Pro Leu Trp Gly Trp Asn Arg 180 185 190 Ala Leu Val Lys Glu Gly Leu Ala Arg Ile Pro Ala Ser Ser Trp Val 195 200 205 Gly Leu Arg Leu Leu Ala Glu Ala Val Gly Tyr Thr Gly Lys Ala Val 210 215 220 Glu Val Ala Phe Arg Ile Ala Pro Arg Ile Asn Ala Ala Ser Arg Leu 225 230 235 240 Gly Glu Ala Glu Lys Ala Leu Arg Leu Leu Leu Thr Asp Asp Ala Ala 245 250 255 Glu Ala Gln Ala Leu Val Gly Glu Leu His Arg Leu Asn Ala Arg Arg 260 265 270 Gln Thr Leu Glu Glu Ala Met Leu Arg Lys Leu Leu Pro Gln Ala Asp 275 280 285 Pro Glu Ala Lys Ala Ile Val Leu Leu Asp Pro Glu Gly His Pro Gly 290 295 300 Val Met Gly Ile Val Ala Ser Arg Ile Leu Glu Ala Thr Leu Arg Pro 305 310 315 320 Val Phe Leu Val Ala Gln Gly Lys Gly Thr Val Arg Ser Leu Ala Pro 325 330 335 Ile Ser Ala Val Glu Ala Leu Arg Ser Ala Glu Asp Leu Leu Leu Arg 340 345 350 Tyr Gly Gly His Lys Glu Ala Ala Gly Phe Ala Met Asp Glu Ala Leu 355 360 365 Phe Pro Ala Phe Lys Ala Arg Val Glu Ala Tyr Ala Ala Arg Phe Pro 370 375 380 Asp Pro Val Arg Glu Val Ala Leu Leu Asp Leu Leu Pro Glu Pro Gly 385 390 395 400 Leu Leu Pro Gln Val Phe Arg Glu Leu Ala Leu Leu Glu Pro Tyr Gly 405 410 415 Glu Gly Asn Pro Glu Pro Leu Phe Leu 420 425 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of the I-SceI homing endonuclease recognition site <400> 9 tagggataac agggtaat 18 <210> 10 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic sequence from which preferred nucleic acid linkers can be generated <400> 10 tgtgttctat gtcttattct tacttcgtta ttcttgtctc tattctgttt atgtttcttg 60 tttgtta 67 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred nucleic acid linker <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> linked to -(CH2)4-maleimide <400> 11 tgtgttctat gtctttt 17 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred nucleic acid linker <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> linked to -(CH2)4-maleimide <400> 12 tgtgttctat gtcttattct tactttt 27 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred nucleic acid linker <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> linked to -(CH2)4-maleimide <400> 13 tgtgttctat gtcttattct tacttcgtta ttctttt 37 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred 15mer nucleic acid linker <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> linked to -(CH2)4-maleimide <400> 14 aagacataga acacatt 17 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred 15mer nucleic acid linker <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> linked to -(CH2)4-maleimide <400> 15 aagtaagaat aagacataga acacatt 27 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a preferred 15mer nucleic acid linker <220> <221> misc_feature <222> (37)..(37) <223> linked to -(CH2)4-maleimide <400> 16 aagaataacg aagtaagaat aagacataga acacatt 37

Claims (34)

1. (a) 이중 가닥 핵산 주형의 2 가닥이 어댑터를 통해 공유적으로 연결된 구축물을 제공하는 단계이며, 어댑터는 단일 가닥 핵산의 2 개의 별개 영역 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중 가닥 핵산 영역 및 헤어핀 루프를 포함하는 것인 단계,
   (b) 구축물을 변성시켜 단일 가닥 구축물을 형성하는 단계,
   (c) 구축물을 막횡단 포어 및 핵산 취급 효소와 접촉시켜서 상기 효소가 포어를 통해 구축물을 제어된 상태로 단계적으로 전위시키고 구축물 내의 뉴클레오티드 부분이 포어와 상호작용하게 하는 단계, 및
   (d) 각각의 상호작용 동안 포어를 통과한 전류를 측정하여, 이중 가닥 핵산 주형의 서열을 결정하는 단계
   를 포함하는, 이중 가닥 핵산 주형의 시퀀싱 방법.
2. (a) 이중 가닥 핵산의 2 가닥이 어댑터를 통해 공유적으로 연결된 구축물을 제공하는 단계이며, 어댑터는 단일 가닥 핵산의 2 개의 별개 영역 사이의 혼성화에 의해 형성된 이중 가닥 핵산 영역 및 헤어핀 루프를 포함하는 것인 단계,
   (b) 구축물을 변성시켜 단일 가닥 구축물을 형성하는 단계,
   (c) 막횡단 포어에 공유적으로 부착된, 엑소뉴클레아제 및 상기 구축물로부터 방출되거나 구축물 내에 존재하는 뉴클레오티드와 포어 사이의 상호작용을 매개하는 분자 어댑터를 갖는 막횡단 포어와 구축물을 접촉시켜서 상기 엑소뉴클레아제가 구축물의 한쪽 말단으로부터 개개의 뉴클레오티드를 소화시키도록 하는 단계,
   (d) 뉴클레오티드를 포어와 접촉시켜, 뉴클레오티드가 상기 분자 어댑터와 상호작용하도록 하는 단계,
   (e) 상호작용 동안 포어를 통과한 전류를 측정하여, 뉴클레오티드의 실체를 결정하는 단계, 및
   (f) 구축물의 동일한 말단에서 단계 (c) 내지 (e)를 반복하여, 이중 가닥 핵산 주형의 서열을 결정하는 단계
   를 포함하는, 이중 가닥 핵산 주형의 시퀀싱 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 구축물이
   (a) 어댑터를 이중 가닥 핵산 주형의 2 가닥과, 어댑터와 2 가닥 사이에 라이게이션을 가능하게 하는 조건하에서 접촉시키는 단계, 및
   (b) 어댑터가 2 가닥과 공유적으로 연결되게 하는 단계
   를 포함하는 방법에 의해 제공되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 핵산 취급 효소가 폴리머라제, 엑소뉴클레아제, 헬리카제, 토포이소머라제 또는 기라제인 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   (a) 막횡단 포어가 단백질 포어이거나, 또는
   (b) 막이 인공 막인 방법.
6. 제5항에 있어서, 단백질 포어가 α-용혈소 또는 MspA로부터 유래된 것인 방법.
7. 제5항에 있어서, 인공 막이 지질 이중층인 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이중 가닥 핵산 주형이 이중 가닥 DNA (dsDNA) 또는 이중 가닥 RNA (dsRNA)이거나, 이중 가닥 핵산 주형이 메틸시토신을 함유하는 것인 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (b)에서, 구축물이 화학적으로 또는 열적으로 단일 가닥으로 해리되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 핵산 취급 효소가 막횡단 포어에 공유적으로 부착되어 있는 것인 방법.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 어댑터가 차별적이거나 선택적인 결합을 기준으로 또 다른 어댑터와 차별적으로 선택가능한 것인 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단일 가닥 핵산의 2 개의 별개 영역이 동일한 유형의 핵산 또는 상이한 유형의 핵산인 방법.
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