CN103460040B - 突变型孔 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及突变体形式的Msp。本发明还涉及使用Msp进行的核酸表征。
Description
技术领域
本发明涉及突变体形式的Msp。本发明还涉及使用Msp进行的核酸表征。
背景技术
纳米孔传感是一种依靠观察分析物分子和受体之间的个体结合事件的传感方法。纳米孔传感器可通过将纳米尺度的单孔放置在绝缘膜中并测量分析物分子存在下电压驱动的离子转运通过所述孔而建立。分析物的种类通过其特征性的电流信号，特别是电流阻断的持续时间和程度以及电流水平的变化来揭示。
当前在广泛的应用中都需要快速且廉价的核酸（例如DNA或RNA）测序技术。现有技术是慢且昂贵的，主要因为它们依靠扩增技术来产生大量核酸并且需要大量的专门的荧光化学物用于信号检测。纳米孔传感具有通过减少所需要的核苷酸和试剂的量来提供快速且廉价的核酸测序的潜力。
使用纳米孔传感对核酸进行测序的两个必需要素是（1）对核酸运动通过孔的控制以及（2）当核酸聚合物运动通过所述孔时对核苷酸的区分。在过去，为实现核苷酸区分，已经使核酸通过突变型溶血素。这提供了已被表明是序列依赖性的电流信号。还已经表明，大量的核苷酸造成了所观察到的电流，使得在观察到的电流和核酸序列激发之间存在直接关系。
虽然已经通过突变溶血素孔改善了用于核苷酸区分的电流范围，但是如果可以进一步改善核苷酸之间的电流差异，那么测序系统将具有更高的性能。另外已经观察到，当核酸运动通过孔时，一些电流状态显示出大变化。还已经表明，一些突变型溶血素孔展现出比其他溶血素孔更大的变化。虽然这些状态变化可能含有序列特异性信息，但需要产生具有小变化的孔以简化所述系统。还需要减少造成所观察到的电流的核苷酸的数量。
Msp的不同形式为来自耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis.）的孔蛋白。MspA为来自耻垢分枝杆菌的157kDa八聚体孔蛋白。MspA的结构已经由研究者充分发表（Gundlach,Proc Natl Acad Sci U S A.2010Sep14;107(37):16060-5.Epub2010Aug26）。已经鉴定并修饰了一些关键残基以增强所述孔的性质。已经进行了这些突变以使得DNA穿过所述MspA孔。MspB、C和D也是Msp的已知形式。
发明内容
发明人惊奇地证明了，Msp的新突变体展现出改善的性质用于评估特征例如核酸的序列。所述突变体令人惊奇地展现出改善的核苷酸区分。具体地，所述突变体令人惊奇地展现出电流范围增加和状态变化减少，所述电流范围增加使得更容易区分不同的核苷酸，所述状态变化减少可提高信噪比。另外，当核酸运动通过孔时造成电流的核苷酸的数目减少。这使得更容易鉴定核酸运动通过孔时所观察到的电流与所述核酸序列之间的直接关系。
发明人还已经惊奇地表明，当Phi29DNA聚合酶控制核酸运动通过孔时，Msp显示出测序性质改善。具体地，Msp和Phi29DNA聚合酶的偶联可产生三个预料不到的优点。第一，所述核酸以商业上可行且允许有效测序的速率运动通过所述孔。第二，当所述核酸运动通过所述孔时观察到电流范围增加，使得更容易确定所述序列。第三，观察到电流变化减少，从而提高信噪比。
因此，本发明提供了一种突变型Msp单体，其包含SEQ ID NO:2示出的序列的变体，其中所述变体包含至少一个如下的突变：
(a)第88位为天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）或苏氨酸（T）；
(b)第90位为丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）或酪氨酸（Y）；
(c)第105位为亮氨酸（L）或丝氨酸（S）；
(d)第126位为精氨酸（R）；
(e)第75位为丝氨酸（S）；
(f)第77位为丝氨酸（S）；
(g)第59位为精氨酸（R）；
(h)第75位为谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）或苏氨酸（T）；
(i)第77位为谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）或苏氨酸（T）；
(j)第78位为亮氨酸（L）；
(k)第81位为天冬酰胺（N）；
(l)第83位为天冬酰胺（N）；
(m)第86位为丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；
(n)第87位为苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）或亮氨酸（L）；
(o)第88位为酪氨酸（Y）、苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）、精氨酸（R）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或半胱氨酸（C）；
(p)第89位为苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）或亮氨酸（L）；
(q)第90位为亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、组氨酸（H）、苏氨酸（T）、甘氨酸（G）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）、天冬酰胺（N）或半胱氨酸（C）；
(r)第91位为丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）、异亮氨酸（I）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、甘氨酸（G）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）、组氨酸（H）、苏氨酸（T）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）、天冬酰胺（N）或半胱氨酸（C）；
(s)第92位为丙氨酸（A）或丝氨酸（S）；
(t)第93位为丝氨酸（S）、丙氨酸（A）、苏氨酸（T）、甘氨酸（G）；
(u)第94位为亮氨酸（L）；
(v)第95位为缬氨酸（V）；
(w)第96位为精氨酸（R）、天冬氨酸（D）、缬氨酸（V）、天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；
(x)第97位为丝氨酸（S）；
(y)第98位为丝氨酸（S）；
(z)第99位为丝氨酸（S）；
(aa)第100位为丝氨酸（S）；
(bb)第101位为苯丙氨酸（F）；
(cc)第102位为赖氨酸（K）、丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；
(dd)第103位为丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）、甘氨酸（G）或苏氨酸（T）；
(ee)第104位为异亮氨酸；
(ff)第105位为酪氨酸（Y）、丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、组氨酸（H）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）、脯氨酸（P）或半胱氨酸（C）；
(gg)第106位为苯丙氨酸（F）、异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）或丝氨酸（S）；
(hh)第108位为脯氨酸（P）或丝氨酸（S）；
(ii)第118位为天冬酰胺（N）；
(jj)第103位为丝氨酸（S）或半胱氨酸（C）；和
(kk)第10-15、51-60、136-139和168-172位的一个或多个位置为半胱氨酸。
本发明还提供了：
-包含两个或多个共价连接的衍生自Msp的单体的构建体；
-编码本发明的突变体或本发明的构建体的多核苷酸；
-包含相同的本发明的突变型单体的衍生自Msp的同源寡聚体孔；
-包含至少一个本发明的突变型单体的衍生自Msp的异源寡聚体孔，其中所述八个单体的至少一个与其他单体不同；
-一种表征靶核酸序列的方法，包括：
（a）使所述靶序列与本发明的孔以及核酸结合蛋白接触，使得所述蛋白控制所述靶序列运动通过所述孔并且所述靶序列中的部分核苷酸与所述孔相互作用；和
（b）在每次相互作用的过程中测量通过所述孔的电流，从而表征所述靶序列；
-一种对靶核酸序列进行测序的试剂盒，其包含（a）本发明的孔以及（b）核酸处理酶；
-一种对样品中靶核酸序列进行测序的装置，其包含（a）多个本发明的孔以及（b）多个核酸处理酶；
-一种表征靶核酸序列的方法，包括：
（a）使所述靶序列与衍生自Msp的孔以及Phi29DNA聚合酶接触，使得所述聚合酶控制所述靶序列运动通过所述孔并且所述靶序列中的部分核苷酸与所述孔相互作用；和
（b）在每次相互作用的过程中测量通过所述孔的电流从而表征所述靶序列，其中在施加跨所述孔的电压下进行步骤（a）和（b）；
-一种形成用于表征靶核酸序列的传感器的方法，包括：
（a）在所述靶核酸序列的存在下使衍生自Msp的孔与Phi29DNA聚合酶接触；和
（b）跨所述孔施加电压以在所述孔与所述聚合酶之间形成复合体；从而形成用于表征所述靶核酸序列的传感器；
-一种提高Phi29DNA聚合酶的活性速率的方法，包括：
（a）在核酸序列的存在下使所述Phi29DNA聚合酶与衍生自Msp的孔接触；和
（b）跨所述孔施加电压以在所述孔与所述聚合酶之间形成复合体；从而提高Phi29DNA聚合酶的活性速率；
-一种用于表征靶核酸序列的试剂盒，其包含（a）衍生自Msp的孔和（b）Phi29DNA聚合酶；和
-一种用于表征样品中靶核酸序列的装置，包含多个衍生自Msp的孔以及多个Phi29DNA聚合酶。
附图说明
图1示出了单个DNA链移位通过所述纳米孔时单个电流水平的平均停留时间。所述数据收集自多个单分子并按照电流水平被分成四等分。
图2示出了使用Phi29以解链模式使DNA链（SEQ ID NO:15）运动通过MS-(NNNRRK)8纳米孔所获得的电流水平和变化。
图3示出了使用Phi29以解链模式使DNA链（SEQ ID NO:15）运动通过HL-(突变型)7纳米孔所获得的电流水平和变化。
图4示出了在一系列施加的电势（-200mV至200mV）下记录的单个MspA通道的电流水平。
图5示出了基线MspA突变体MS-(B1)8的开孔水平的IV曲线。每条线代表一个孔。
图6示出了MspA突变体MS-(B1-I105Y)8的开孔水平的IV曲线。每条线代表一个孔。
图7示出了MspA突变体MS-(B1-I105N)8的开孔水平的IV曲线。每条线代表一个孔。
图8示出了在180mV下MS-(B1-I105A)8孔的高电导状态（275pA）和低电导状态（150pA）之间的电流改变。
图9示出了当DNA被解链通过所述基线MS-(B1)8孔时产生的电流水平。这些事件的电流范围为约30pA。
图10示出了当DNA被解链通过所述基线MS-(B1-I105A)8孔时产生的电流水平。这些事件的电流范围为约40pA。
图11示出了实施例9和12和15使用的DNA底物设计。
图12示出了实施例10和11使用的DNA底物设计。
图13示出了当在所述MspA单体序列中制造点突变时，对于同样的DNA序列，测序谱如何变化。这些曲线示出了从多个多核苷酸获得的水平的平均谱。A)该图示出了MS-(B1)8孔的测序谱。B)该图示出了MS-(B1-D90Q-D93S-I105A)8孔的测序谱。C)该图示出了MS-(B1-D90Q-Q126R)8孔的测序谱。D)该图示出了MS-(B1-L88N-D90Q-D91M)8孔的测序谱。E)该图示出了MS-(B1-L88N-D90Q-D91S)8孔的测序谱。F)该图示出了MS-(B1-G75S-G77S-L88N-Q126R)8孔的测序谱。
图14示出了实施例13使用的DNA底物设计。
图15示出了由Phi29DNA聚合酶介导的RNA受控移位通过所述MspA突变型孔MS-(B1)8的示例性事件迹线。其下示出了以上迹线中高亮的区域的展开图。
图16示出了孔插入到脂双层。A)示出了由单体寡聚化的MS-(B1)8的孔插入。B)示出了由二聚体寡聚化的MS-(B1-B1)4的孔插入。
图17示出了由解旋酶介导的DNA受控移位通过由单体寡聚化产生的MS-(B1)8突变型孔的示例性事件迹线。其下示出了以上迹线中高亮的区域的展开图。
图18示出了由解旋酶介导的DNA受控移位通过由二聚体寡聚化产生的MS-(B1-B1)4突变型孔的示例性事件迹线。其下示出了以上迹线中高亮的区域的展开图。
图19示出了实施例16使用的DNA底物设计。
图20示出了由解旋酶介导的含有胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的DNA受控移位通过MS-(B1-L88N)8突变型孔的示例性事件迹线。其下示出了以上迹线中高亮的区域的展开图。
序列表描述
SEQ ID NO:1示出了编码NNN-RRK突变型MspA单体的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:2（也称为“B1”）示出了成熟形式的MspA单体的NNN-RRK突变体的氨基酸序列。所述突变体没有信号序列以及氨基末端甲硫氨酸（由起始密码子编码）并且包括如下突变：D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。这些突变使得DNA穿过所述MspA孔。
SEQ ID NO:3示出了编码所述Phi29DNA聚合酶的多核苷酸序列。
SEQ ID NO:4示出了所述Phi29DNA聚合酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5示出了衍生自大肠杆菌（E.coli）的sbcB基因的经密码子优化的多核苷酸序列。其编码大肠杆菌的外切核酸酶I（EcoExo I）。
SEQ ID NO:6示出了大肠杆菌的外切核酸酶I（EcoExo I）的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7示出了衍生自大肠杆菌的xthA基因的经密码子优化的多核苷酸序列。其编码大肠杆菌的外切核酸酶III。
SEQ ID NO:8示出了大肠杆菌的外切核酸酶III的氨基酸序列。该酶以3’–5’方向从双链DNA（dsDNA）的一条链进行5’单磷酸核苷的离散性消化。酶在链上起始需要约4个核苷酸的5’悬突。
SEQ ID NO:9示出了衍生自嗜热栖热菌（T.thermophilus）的recJ基因的经密码子优化的多核苷酸序列。其编码嗜热栖热菌的RecJ酶（TthRecJ-cd）。
SEQ ID NO:10示出了嗜热栖热菌的RecJ酶（TthRecJ-cd）的氨基酸序列。该酶以5’–3’方向从ssDNA进行5’单磷酸核苷的连续消化。酶在链上起始需要至少4个核苷酸。
SEQ ID NO:11示出了衍生自噬菌体λexo（redX）基因的经密码子优化的多核苷酸序列。其编码噬菌体λ外切核酸酶。
SEQ ID NO:12示出了噬菌体λ外切核酸酶的氨基酸序列。所述序列是组装成三聚体的三个相同亚基中的一个。所述酶以5’-3’方向从dsDNA的一条链进行核苷酸的高度连续地消化（http://www.neb.com/nebecomm/products/productM0262.asp）。酶在链上起始优选需要具有5’磷酸的约4个核苷酸的5’悬突。
SEQ ID NO:13-15示出了实施例2使用的序列。
SEQ ID NO:16-18分别示出了成熟形式的MspB、C和D突变体的氨基酸序列。所述成熟形式没有信号序列。
SEQ ID NO:19和20示出了实施例9、12和15使用的序列。
SEQ ID NO:21-23示出了实施例10和11使用的序列。
SEQ ID NO:24-27示出了实施例13使用的序列。
SEQ ID NO:28示出了实施例14使用的成熟形式的MspA单体的NNN-RRK突变体的二聚体的DNA序列。
SEQ ID NO:29示出了实施例14使用的成熟形式的MspA单体的NNN-RRK突变体的二聚体的蛋白质序列。
SEQ ID NO:30、31和32示出了实施例16使用的序列。
SEQ ID NO:33示出了用在SEQ ID NO:29中示出的构建体中的接头序列。
具体实施方式
应理解，所公开的产品和方法的不同应用可根据本领域的具体需要进行修改。还应理解，本文使用的术语目的仅为描述本发明的具体实施方案，并不意欲进行限制。
另外，除非文中另有清楚的说明，当用于本说明书及所附的权利要求中时，单数形式“一个”（“a”、an”和“the”）包括复数指代。因此，例如，提到“一个突变体”包括“多个突变体”，提到“一个替换”包括两个或多个这种替换，提到“一个孔”包括两个或多个这种孔，提到“一个核酸序列”包括两个或多个这种序列，等等。
所有本文引用的出版物、专利和专利申请，不论上文还是下文，都以引用的方式全文纳入本文。
突变型Msp单体
本发明提供了突变型Msp单体。所述突变型Msp单体可用于形成本发明的孔。突变型Msp单体是序列与野生型Msp单体不同且保留了形成孔的能力的单体。用于确认突变型单体形成孔的能力的方法是本领域熟知的并在下文更详细地论述。
所述突变型单体具有改善的核苷酸阅读性质，即呈现出改善的核苷酸捕获和区分。具体地，由所述突变型单体构建的孔比野生型更容易捕获核苷酸和核酸。另外，由所述突变型单体构建的孔呈现出电流范围增加，这使得更容易区分不同的核苷酸，并且所述孔呈现出状态变化减少，这可提高信噪比。另外，当所述核酸运动通过由所述突变体构建的孔时造成电流的核苷酸的数目的减少。这使得更容易鉴定所述核酸运动通过所述孔时所观察到的电流与所述核酸序列之间的直接关系。所述突变体的核苷酸阅读性质的改善经五种主要机制实现，即通过改变：
·空间（增加或减少氨基酸残基的大小）；
·电荷（例如引入+ve电荷以与所述核酸序列相互作用）；
·氢键合（例如引入可以以氢键结合到碱基对的氨基酸）；
·π堆叠（例如引入通过离位电子π系统相互作用的氨基酸）；和/或
.所述孔的结构的改变（例如引入增加孔腔和/或收缩部大小的氨基酸）。
这五种机制的任一种或多种可能是本发明的孔的性质改善的原因。例如，由于空间改变、氢键结合改变和结构改变，本发明的孔可呈现出核苷酸阅读性质改善。
引入体积大的残基例如苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）或组氨酸（H）可增加所述孔的空间。引入芳香族残基例如苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）或组氨酸（H）还可增加所述孔中的π堆叠。引入体积大的残基或芳香族残基还可改变所述孔的结构，例如通过扩大所述孔并增加孔腔和/或收缩部的大小。这在下文中更详细地描述。
本发明的突变型单体包含SEQ ID NO:2中示出的序列的变体。SEQ ID NO:2为所述MspA单体的NNN-RRK突变体。其包括以下突变：D90N、D91N、D93N、D118R、D134R和E139K。SEQID NO:2的变体为具有与SEQ ID NO:2不同的氨基酸序列且保留了其形成孔的能力的多肽。
所述变体包含至少一个如下突变：
(a)第88位为天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）或苏氨酸（T）；
(b)第90位为丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）或酪氨酸（Y）；
(c)第105位为亮氨酸（L）或丝氨酸（S）；
(d)第126位为精氨酸（R）；
(e)第75位为丝氨酸（S）；
(f)第77位为丝氨酸（S）；
(g)第59位为精氨酸（R）；
(h)第75位为谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）或苏氨酸（T）；
(i)第77位为谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）或苏氨酸（T）；
(j)第78位为亮氨酸（L）；
(k)第81位为天冬酰胺（N）；
(l)第83位为天冬酰胺（N）；
(m)第86位为丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；
(n)第87位为苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）或亮氨酸（L）；
(o)第88位为酪氨酸（Y）、苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）、精氨酸（R）、丙氨酸（A）、甘氨酸（G）或半胱氨酸（C）；
(p)第89位为苯丙氨酸（F）、缬氨酸（V）或亮氨酸（L）；
(q)第90位为亮氨酸（L）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、组氨酸（H）、苏氨酸（T）、甘氨酸（G）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）、天冬酰胺（N）或半胱氨酸（C）；
(r)第91位为丝氨酸（S）、谷氨酰胺（Q）、亮氨酸（L）、甲硫氨酸（M）、异亮氨酸（I）、丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、甘氨酸（G）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）、组氨酸（H）、苏氨酸（T）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）、天冬酰胺（N）或半胱氨酸（C）；
(s)第92位为丙氨酸（A）或丝氨酸（S）；
(t)第93位为丝氨酸（S）、丙氨酸（A）、苏氨酸（T）、甘氨酸（G）；
(u)第94位为亮氨酸（L）；
(v)第95位为缬氨酸（V）；
(w)第96位为精氨酸（R）、天冬氨酸（D）、缬氨酸（V）、天冬酰胺（N）、丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；
(x)第97位为丝氨酸（S）；
(y)第98位为丝氨酸（S）；
(z)第99位为丝氨酸（S）；
(aa)第100位为丝氨酸（S）；
(bb)第101位为苯丙氨酸（F）；
(cc)第102位为赖氨酸（K）、丝氨酸（S）或苏氨酸（T）；
(dd)第103位为丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）、甘氨酸（G）或苏氨酸（T）；
(ee)第104位为异亮氨酸；
(ff)第105位为酪氨酸（Y）、丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、天冬酰胺（N）、苏氨酸（T）、苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、组氨酸（H）、甘氨酸（G）、缬氨酸（V）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）、脯氨酸（P）、或半胱氨酸（C）；
(gg)第106位为苯丙氨酸（F）、异亮氨酸（I）、缬氨酸（V）或丝氨酸（S）；
(hh)第108位为脯氨酸（P）或丝氨酸（S）；
(ii)第118位为天冬酰胺（N）；
(jj)第103位为丝氨酸（S）或半胱氨酸（C）；和
(kk)第10-15、51-60、136-139和168-172位的一个或多个位置上为半胱氨酸。
在野生型MspA中，每个单体中的残基88和105在所述孔的内收缩部中形成疏水环。在位置L88和I105上的疏水性残基正好位于所述孔的主收缩部的上方，面向水性通道。这些残基的突变产生了具有显著高于基线（SEQ ID NO:2）的开孔电流。当在这些位置进行突变时所观察到的电流差异显著大于从制备单个突变所预期的电流差异。这种令人惊奇的结果暗示，在这些位置上的突变可能影响所述通道的结构，而不只是这些残基处的局部环境。虽然SEQ ID NO:2基线已被报告显示出宽范围的孔电导，但是其原因还未被很好地理解。第L88和I105位的突变产生了显著高于所述基线孔的主要孔电流水平。另外，这种较高的电导状态是所述突变体的主要构象，这是大电流范围和信噪比提高所需要的。
在第88位引入N、S、Q或T（即上述突变（a））可引入所述孔的内收缩部中可以以氢键结合到核酸中的核苷酸的氨基酸。
每个单体中的残基90和91还可形成所述孔的内收缩部的一部分。每个单体中的残基118存在于所述孔的孔腔内。每个单体中的残基134是所述孔的入口的一部分。
第90位引入S、Q或Y（即上述突变（b））将可引入到所述孔的内收缩部中可以以氢键结合到核酸的核苷酸的氨基酸。
所述变体可包括任意数量的突变（a）-（kk），例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个所述突变。优选的突变组合在下文详述。引入到所述变体中的氨基酸可以是天然存在的或其非天然存在的氨基酸衍生物。引入到所述变体中的氨基酸可以是D-氨基酸。
可将任意数量的半胱氨酸引入到所述变体中。优选在第90、91和103位的一个或多个，例如两个或全部的位置上引入半胱氨酸。这些位置可用于化学连接下文更详细详述的分子连接物。可将任意数量的半胱氨酸，例如2、3、4、5、6或更多个半胱氨酸，引入至位置10-15、51-60、136-139以及168-172处。这些位置存在于所述孔的非保守环区，因此可用于将核酸结合蛋白化学连接至所述孔，如下文更详细地描述的。
在优选的实施方案中，所述变体包含一个或多个以下（A）至（Z）中示出的替换。所述变体可包括任意数量的A至Z中的替换，例如1、2、3、4或5个。
（A）引入（i）第75位丝氨酸（S）、（ii）第77位丝氨酸（S）、（iii）第88位天冬酰胺（N）、（iv）第90位谷氨酰胺（Q）和（V）第126位精氨酸（R）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2、3、4或5个。在每个单体中包括所有四个替换的同源八聚体孔的优点在下表3示出。
（B）引入（i）第90位谷氨酰胺（Q）和（ii）第126位精氨酸（R）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表3示出。
（C）引入（i）第88位天冬酰胺（N）、（ii）第90位谷氨酰胺（Q）和（iii）第126位精氨酸（R）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2或3个。在每个单体中包括所有三个这些替换的同源八聚体孔的优点在下表3示出。
（D）引入（i）第88位丝氨酸（S）和（ii）第90位谷氨酰胺（Q）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表3示出。
（E）引入（i）第88位天冬酰胺（N）和（ii）第90位谷氨酰胺（Q）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表3示出。
（F）引入（i）第90位谷氨酰胺（Q）和（ii）第105位丙氨酸（A）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（G）引入（i）第90位丝氨酸（S）和（ii）第92位丝氨酸（S）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（H）引入（i）第88位苏氨酸（T）和（ii）第90位丝氨酸（S）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（I）引入（i）第87位谷氨酰胺（Q）和（ii）第90位丝氨酸（S）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（J）引入（i）第89位酪氨酸（Y）和（ii）第90位丝氨酸（S）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（K）引入（i）第88位天冬酰胺（N）和（ii）第89位苯丙氨酸（F）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（L）引入（i）第88位天冬酰胺（N）和（ii）第89位酪氨酸（Y）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（M）引入（i）第90位丝氨酸（S）和（ii）第92位丙氨酸（A）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（N）引入（i）第90位丝氨酸（S）和（ii）第94位天冬酰胺（N）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（O）引入（i）第90位丝氨酸（S）和（ii）第104位异亮氨酸（I）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（P）引入（i）第88位天冬氨酸（D）和（ii）第105位赖氨酸（K）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（Q）引入（i）第88位天冬酰胺（N）和（ii）第126位精氨酸（R）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1或2个。在每个单体中包括所有两个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（R）（i）第88位天冬酰胺（N）、（ii）第90位谷氨酰胺（Q）和（iii）第91位精氨酸（R）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2或3个。在每个单体中包括所有三个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（S）引入（i）第88位天冬酰胺（N）、（ii）第90位谷氨酰胺（Q）和（iii）第91位丝氨酸（S）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2或3个。在每个单体中包括所有三个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（T）引入（i）第88位天冬酰胺（N）、（ii）第90位谷氨酰胺（Q）和（iii）第105位缬氨酸（V）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2或3个。在每个单体中包括所有三个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（U）引入（i）第90位谷氨酰胺（Q）、（ii）第93位丝氨酸（S）和（iii）第105位丙氨酸（A）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2或3个。在每个单体中包括所有三个替换的同源八聚体孔的优点在下表2示出。
（V）引入（i）第90位的苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）或组氨酸（H）；（ii）第91位的苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）或组氨酸（H）；以及（iii）第105位的苯丙氨酸（F）、色氨酸（W）、酪氨酸（Y）或组氨酸（H）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2或3个。引入这些大体积芳香族残基可增加所述孔的孔腔和/或收缩部中的空间和π堆叠。它们还可增加所述孔腔和/或收缩部的大小（即扩大所述孔）。
（W）引入（i）第90位的丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、甘氨酸（G）、丙氨酸（A）或缬氨酸（V）；（ii）第91位的丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、甘氨酸（G）、丙氨酸（A）或缬氨酸（V）；以及（iii）第105位的丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、甘氨酸（G）、丙氨酸（A）或缬氨酸（V）中的一个或多个。所述变体可包括这些替换中的1、2或3个。引入较小残基可减少所述孔的孔腔和/或收缩部中的空间。
（X）引入第90位的丝氨酸（S）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）或组氨酸（H）和/或第91位的丝氨酸（S）、精氨酸（R）、赖氨酸（K）或组氨酸（H）。引入带正电残基（R、K或H）可增强所述孔的收缩部和所述核酸序列之间的相互作用。
（Y）引入第90位的丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）、酪氨酸（Y）或组氨酸（H）和/或第91位的丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、天冬酰胺（N）、谷氨酰胺（Q）、酪氨酸（Y）或组氨酸（H）。引入这些残基可增强在所述孔的收缩部和所述核酸序列之间存在的氢键结合。它们还可增加所述孔腔和/或收缩部的大小（即扩大所述孔）。
（Z）在第90、91和103位中的一个或多个位置上引入半胱氨酸。这使得化学基团经半胱氨酸键连接到所述孔。这在上文和下文中有更详细地详述。
优选的变体包括但不限于包含至少一个如下替换的那些：
L88N；L88S；L88Q；L88T；D90S；D90Q；D90Y；I105L；I105S；Q126R；G75S；G77S；G75S，G77S、L88N和Q126R；G75S、G77S、L88N，D90Q和Q126R；D90Q和Q126R；L88N、D90Q和Q126R；L88S和D90Q；L88N和D90Q；E59R；G75Q；G75N；G75S；G75T；G77Q；G77N；G77S；G77T；178L；S81N；T83N；N86S；N86T；I87F：I87V；I87L；L88N；L88S；L88Y；L88F；L88V；L88Q；L88T；I89F；I89V；189L；N90S；N90Q；N90L；N90Y；N91S；N91Q；N91L；N91M；N91I；N91A；N91V；N91G：G92A；G92S；N93S；N93A；N93T；T94L；T95V；A96R；A96D；A96V；A96N；A96S；A96T；P97S；P98S；F99S；G100S；L101F；N102K；N102S；N102T；S103A；S103Q；S103N；S103G；S103T；V104I；1105Y；1105L；I105A；I105Q；I105N；I105S；I105T；T106F；T106I；T106V；T106S；N108P；N108S；D90Q和I105A；D90S和G92S；L88T和D90S；I87Q和D90S；I89Y和D90S；L88N和I89F；L88N和I89Y；D90S和G92A；D90S和I94N；D90S和V104I；L88D和I105K；L88N和Q126R；L88N，D90Q和D91R；L88N、D90Q和D91S；L88N、D90Q和1105V；D90Q、D93S和I105A；N91Y；N90Y和N91G；N90G和N91Y；N90G和N91G；I05G；N90R；N91R；N90R和N91R；N90K；N91K；N90K和N91K；N90Q和N91G；N90G和N91Q；N90Q和N91Q：R118N；N91C；N90C；N90W；N91W；N90K；N91K；N90R；N91R；N90S和N91S；N90Y和I105A；N90G和I105A；N90Q和I105A；N90S和I105A；L88A和I105A；L88S和I105S；L88N和I105N；N90G和N93G：N90G；N93G；N90G和N91A；I105K；I105R；I105V；I105P；I105W；L88R；L88A；L88G；L88N；N90R和I105A；N90S和I105A；L88A和I105A；L88S和I105S；L88N和I105N；L88C；S103C；和I105C。
尤其优选的变体包含1105N。由包含1105N的突变型单体构建的孔具有增加约80％的剩余电流。与不同核苷酸有关的电流改变也会增加。这反映了由包含1105N的突变型单体构建的孔的结构改变。因此，这种孔具有改善的区分核苷酸的能力。
当用于同源八聚体孔时优选的单突变体及其优点在下表1示出。
表1
当用于同源八聚体孔时最优选的突变体及其优点在下表3示出。
表3-最优选的突变体及其优点
除上文详述的具体突变外，所述变体可包括其他突变。在SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列上，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列是至少50%同源的。更优选地，基于氨基酸同一性，所述变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列在整个序列上可以是至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，更优选至少95%、97%或99%同源的。在100或更多个，例如125、150、175或200或更多个连续氨基酸的序列段上可以有至少80%，例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性（“严格同源性”）。
可使用本领域的标准方法确定同源性。例如，UWGCG Package可提供可以用于计算同源性的BESTFIT程序，例如以其默认设置使用（Devereux et al(1984)Nucleic AcidsResearch12,p387-395）。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或对齐序列（例如鉴定等价残基或相应序列（一般用其默认设置）），例如如Altschul S.F.(1993)J Mol Evol36:290-300；Altschul,S.F et al(1990)J Mol Biol215:403-10中所述。
公众可以通过美国国立生物技术信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得用于执行BLAST分析的软件。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高得分的序列对（HSPs），所述长度W的短字在与数据库序列中相同长度的字比对时匹配或满足某些为正值的阈值得分T。T被称为邻近字得分阈值（Altschul et al,见上文）。这些初步的邻近字命中结果充当起始搜索的种子以寻找含有它们的HSP。所述字命中结果沿着每个序列向两个方向延伸尽量远，只要累积比对得分可以增加。所述字命中结果在每个方向上的延伸在以下情况下停止：所述累积比对得分从其最大达到的值下降数量X；由于一个或多个负得分残基比对的积累，所述累积得分变为零或小于零；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认的字长度（W）11，BLOSUM62得分矩阵（参见Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-10919）比对（B）为50，期望（E）为10，M=5，N=4，并且两条链都比较。
BLAST算法执行两条序列之间相似度的统计分析；参见例如Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5787。由BLAST算法提供的相似度的一种量度是最小总和概率（P（N）），其表示两个氨基酸序列之间碰巧发生匹配的概率。例如，一个序列被认为与另一个序列是相似的，只要比较第一序列与第二序列的最小总和概率低于约1，优选低于约0.1，更优选低于约0.01，最优选低于约0.001。
SEQ ID NO:2为MspA单体的NNN-RRK突变体。与MspA相比，所述变体可包括MspB、C或D单体中的任意突变。成熟形式的MspB、C和D在SEQ ID NO:16-18中示出。尤其地，所述变体可包含存在于MspB中的如下替换:A138P。所述变体可包含一个或多个存在于MspC中的如下替换：A96G、N102E和A138P。所述变体可包含一个或多个存在于MspD中的如下突变：G1缺失、L2V、E5Q、L8V、D13G、W21A、D22E、K47T、I49H、I68V、D91G、A96Q、N102D、S103T、V104I、S136K和G141A。所述变体可包含来自MspB、C和D的一个或多个突变和替换的组合。
可以对SEQ ID NO:2的氨基酸序列进行除了上文详述的那些氨基酸替换以外的氨基酸替换，例如最多达1、2、3、4、5、10、20或30个替换。保守替换用相似化学结构、相似化学性质或相似侧链大小的其他氨基酸代替氨基酸。引入的氨基酸可具有与其代替的氨基酸相似的极性、亲水性、疏水性、碱性、酸性、中性或电荷。或者，保守替换可在原先存在的芳香族或脂肪族氨基酸的位置上引入另一芳香族或脂肪族氨基酸。保守氨基酸改变是本领域熟知的并可根据下表4中定义的20种主要氨基酸的性质进行选择。氨基酸具有相似的极性时，这还可以通过参照表5中氨基酸侧链的亲水性范围来确定。
表4-氨基酸的化学性质
表5-亲水性量表
另外，可将SEQ ID NO:2的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基从上述多肽去除。可去除最多达1、2、3、4、5、10、20或30个残基，或更多个。
变体可包括SEQ ID NO:2的片段。这种片段保留孔形成活性。片段长度可以为至少50、100、150或200个氨基酸。这种片段可用于产生本发明的孔。片段优选包含SEQ ID NO:2的孔形成结构域。片段必须包括SEQ ID NO:2的残基88、90、91、105、118和134之一。一般而言，片段包括SEQ ID NO:2的残基88、90、91、105、118和134的全部。
或者/并且，一个或多个氨基酸可被添加到上文所述的多肽。可以在SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其多肽变体或片段的氨基或羧基末端进行延伸。所述延伸可以非常短，例如长度为1-10个氨基酸。或者，所述延伸可以更长，例如最多达50或100个氨基酸。载体蛋白可以被融合到本发明的氨基酸序列。其他融合蛋白在下文更详细地详述。变体可在SEQ IDNO:2的氨基末端具有甲硫氨酸。
如上所述，变体是具有与SEQ ID NO:2不同的氨基酸序列且保留了其形成孔的能力的多肽。变体一般含有SEQ ID NO:2中负责孔形成的区域。含有β-桶的Msp的孔形成能力由每个亚基中的β-片层提供。SEQ ID NO:2的变体一般包含SEQ ID NO:2中形成β-片层的区域。可以对SEQ ID NO:2中形成β-片层的区域进行一个或多个修饰，只要产生的变体保留其形成孔的能力。SEQ ID NO:2的变体优选包括在其α-螺旋和/或环区域内的一个或多个修饰，例如替换、增加或缺失。
可修饰所述突变型单体以帮助其鉴定或纯化，例如通过添加组氨酸残基（his标签）、天冬氨酸残基（asp标签）、链霉亲和素标签或flag标签，或者通过添加促进其从细胞分泌的信号序列（当多肽天然不含有这种序列时）。引入遗传标签的替代方案是使标签化学反应到所述孔的天然的或设计的位置上。这种方法的实例是使凝胶迁移试剂反应到设计在所述孔的外部的半胱氨酸上。这已经被证明可作为分离溶血素异源寡聚体的方法（ChemBiol.1997Jul;4(7):497-505）。
所述突变型单体可用显示标记物标记。所述显示标记物可以是可使得所述孔被检测到的任何适合的标记物。适合的标记物包括但不限于，荧光分子、放射性同位素例如125I、35S、酶、抗体、抗原、多核苷酸和配体例如生物素。
所述突变型单体可通过合成或重组方式制备。例如，所述孔可通过体外翻译和转录（IVTT）合成。可修饰所述突变型单体的氨基酸序列以使其包括非天然存在的氨基酸或增加所述单体的稳定性。当所述突变型单体通过合成方式产生时，这种氨基酸可在产生过程中引入。所述突变型单体还可以在合成或重组产生后进行改变。
所述突变型单体还可以使用D-氨基酸产生。例如，所述突变型单体可以包含L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。在本领域中产生这种蛋白质或多肽是常规的。
所述突变型单体含有一个或多个特异性修饰以有利于核苷酸区分。所述突变型单体还可含有其他非特异性的修饰，只要它们不干扰孔形成。许多非特异性的侧链修饰是本领域已知的并可以对所述突变型单体的侧链进行这种修饰。这种修饰包括，例如，通过使氨基酸与醛反应然后用NaBH4还原进行的还原性烷基化、用甲基乙酰亚胺进行脒基化或用乙酸酐进行的酰化。
所述突变型单体可使用本领域已知的标准方法产生。编码突变型单体的多核苷酸序列可使用本领域标准方法得到和复制。这种序列在下文更详细地详述。编码突变型单体的多核苷酸序列可使用本领域标准技术在细菌宿主细胞中表达。所述突变型单体可通过从重组表达载体原位表达多肽来在细胞中产生。所述表达载体任选携带诱导型启动子以控制所述多肽的表达。
如下文所述，所述突变型单体可在通过任何蛋白质液相色谱系统从产生孔的生物体纯化后或在重组表达后大规模地产生。有代表性的蛋白质液相色谱系统包括FPLC、AKTA系统、Bio-Cad系统、Bio-Rad BioLogic系统和Gilson HPLC系统。然后，可将所述突变型单体插入到天然存在的或人工的膜以用于本发明。将孔插入到膜的方法在下文详述。
在一些实施方案中，所述突变型单体是化学修饰的。所述突变型单体可在任何位点以任何方式进行化学修饰。所述突变型单体优选通过将分子连接到一个或多个半胱氨酸（半胱氨酸键）、将分子连接到一个或多个赖氨酸、将分子连接到一个或多个非天然氨基酸、对表位进行酶修饰或对末端进行修饰来进行化学修饰。进行这种修饰的适合方法是本领域熟知的。所述突变型单体可通过连接任意分子来进行化学修饰。例如，所述突变型单体可通过连接染料或荧光团来进行化学修饰。
在一些实施方案中，用如下的分子连接物对所述突变型单体进行化学修饰，即所述分子连接物可促进含所述单体的孔与靶核苷酸或靶核酸序列之间的相互作用。存在所述连接物可改善所述孔与所述核苷酸或核酸序列的主客体化学作用，从而改善了所述突变型单体形成的孔的测序能力。主客体化学作用的原则是本领域熟知的。所述连接物影响所述孔的物理或化学性质，改善其与核苷酸或核酸序列的相互作用。所述连接物可改变所述孔的桶或通道的电荷，或特可异性地与所述核苷酸或核酸序列相互作用或与其结合，从而有利于其与所述孔的相互作用。
所述分子连接物优选为环状分子、环糊精、能够进行杂交的物质、DNA结合剂或交互螯合剂、肽或肽类似物、合成聚合物、芳香族平面分子、带正电小分子或能够进行氢键结合的小分子。
所述连接物可以是环状的。环状连接物优选具有与所述孔相同的对称性。所述连接物优选具有八重对称性，因为Msp一般具有围绕中心轴的八个亚基。这在下文中更详细地详述。
所述连接物一般经主客体化学反应与核苷酸或核酸序列相互作用。所述连接物一般能够与核苷酸或核酸序列相互作用。所述连接物包含一个或多个能够与所述核苷酸或核酸序列相互作用的化学基团。所述一个或多个化学基团优选通过非共价相互作用例如疏水性相互作用、氢键结合、范德华力、π-阳离子相互作用和/或静电力与所述核苷酸或核酸序列相互作用。所述一个或多个能够与所述核苷酸或核酸序列相互作用的化学基团优选是带正电的。所述一个或多个能够与所述核苷酸或核酸序列相互作用的化学基团更优选包含氨基。所述氨基可以连接至伯、仲或叔碳原子。所述连接物甚至更优选包含氨基环，例如6、7或8个氨基的环。所述连接物最优选包含八个氨基的环。质子化的氨基的环可以与所述核苷酸或核酸序列中带负电的磷酸基团相互作用。
可通过所述连接物与包含所述突变型单体的孔之间的主客体化学作用来有利于所述连接物在所述孔内正确定位。所述连接物优选包含一个或多个能够与所述孔中一个或多个氨基酸相互作用的化学基团。所述连接物更优选包含一个或多个能够经非共价相互作用例如疏水性相互作用、氢键结合、范德华力、π-阳离子相互作用和/或静电力与所述孔中一个或多个氨基酸相互作用的化学基团。能够与所述孔中一个或多个氨基酸相互作用的化学基团一般为羟基或胺。所述羟基可连接至伯、仲或叔碳原子。所述羟基可与所述孔中不带电的氨基酸形成氢键。可使用可促进所述孔与所述核苷酸或核酸序列之间相互作用的任何连接物。
适合的连接物包括但不限于环糊精、环肽和瓜环（cucurbituril）。所述连接物优选为环糊精或其衍生物。所述环糊精或其衍生物可以是Eliseev,A.V.,and Schneider,H-J.(1994)J.Am.Chem.Soc.116,6081-6088中公开的那些中的任一种。所述连接物更优选为七-6-氨基-β-环糊精（am7-βCD）、6-单脱氧-6-单氨基-β-环糊精（am1-βCD）或七-(6-脱氧-6-胍基)-环糊精（gu7-βCD）。gu7-βCD中的胍基具有比am7-βCD中的伯胺更高的pKa，因此其带更多正电。该gu7-βCD连接物可用于增加所述核苷酸在所述孔中的停留时间，以增加测量的剩余电流的准确度，以及以增加在高温或低数据采集率时的基线检测率。
如果如在下文更详细地详述使用3-(2-吡啶基二硫)丙酸琥珀酰亚胺酯（SPDP）交联剂，那么连接物优选七(6-脱氧-6-氨基)-6-N-单(2-吡啶)二硫丙酰基-β-环糊精（am6amPDP1-βCD）。
更适合的连接物包括γ-环糊精，其包含8个糖单元（因此具有八重对称性）。所述γ-环糊精可含有接头分子或者可被修饰以包含所有或更多的用于上文详述的β-环糊精实例中的修饰糖单元。
所述分子连接物优选共价连接至所述突变型单体。可使用任何本领域已知方法将所述连接物被共价连接至所述孔。一般经化学键连接所述连接物。如果经半胱氨酸键连接所述分子连接物，那么优选已通过替换将一个或多个半胱氨酸引入至所述突变体。当然，本发明的突变型单体可包含第88、90、91、103和105位中的一个或多个位置上的半胱氨酸残基。可通过将分子连接物连接至一个或多个例如2、3、4或5个这种半胱氨酸来对所述突变型单体进行化学修饰。或者，可通过将分子连接至其他位置上引入的一个或多个半胱氨酸来对所述突变型单体进行化学修饰。所述分子连接物优选连接至SEQ ID NO:2的第90、91和103位中的一个或多个位置。
可通过修饰邻近的残基来增强半胱氨酸残基的反应性。例如，侧面的精氨酸、组氨酸或赖氨酸残基的碱性基团会将半胱氨酸巯基的pKa改变为更具反应性的S-基团的pKa。可通过巯基保护基团例如dTNB来保护半胱氨酸残基的反应性。可将它们与所述突变型单体中的一个或多个半胱氨酸残基反应，然后连接接头。所述分子可直接连接至所述突变型单体。优选使用接头例如化学交联剂或肽接头将所述分子连接至所述突变型单体。
适合的化学交联剂是本领域已知的。优选的交联剂包括2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(吡啶-2-基二硫基)丙酸酯、2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(吡啶-2-基二硫基)丁酸酯和2,5-二氧代吡咯烷-1-基8-(吡啶-2-基二硫基)辛酸酯。最优选的交联剂为3-(2-吡啶基二硫)丙酸琥珀酰亚胺酯（SPDP）。一般而言，将所述分子共价连接至所述双功能交联剂，然后将所述分子/交联剂复合体共价连接至所述突变型单体，但还可以将所述双功能交联剂共价连接至所述单体，然后将所述双功能交联剂/单体复合体连接至所述分子。
所述接头优选抗二硫苏糖醇（DTT）。适合的接头包括但不限于基于碘乙酰胺的和基于马来酰亚胺的接头。
在其他实施方案中，可将所述单体连接至核酸结合蛋白。这可形成可用于本发明的测序方法的模块化测序系统。核酸结合蛋白在下文详述。
所述核酸结合蛋白优选共价连接至所述突变型单体。可使用本领域已知的任何方法将所述蛋白共价连接至所述孔。可以将所述单体和蛋白化学融合或在遗传上融合。如果整个构建体从单个多核苷酸序列表达，那么所述单体和蛋白在遗传上融合的。孔与核酸结合蛋白的基因融合在国际申请PCT/GB09/001679（公开为WO2010/004265）中详述。
如果经半胱氨酸键连接所述核酸结合蛋白，那么优选已通过替换将一个或多个半胱氨酸引入至所述突变体。当然，本发明的突变型单体可包含在第10-15、51-60、136-139和168-172位中的一个或多个位置上的半胱氨酸残基。这些位置存在于在同系物中具有低保守性（表明可以容许突变或插入）的环区。因此，它们适于连接核酸结合蛋白。可如上文所述通过修饰来增强半胱氨酸残基的反应性。
所述核酸结合蛋白可直接连接至所述突变型单体或经一个或多个接头连接。可使用国际申请PCT/GB10/000132（公开为WO2010/086602）中描述的杂交接头来将所述分子连接至所述突变型单体。或者，可使用肽接头。肽接头为氨基酸序列。所述肽接头的长度、柔性和亲水性一般被设计为其不会干扰所述单体和分子的功能。优选的柔性肽接头为2-20个，例如4、6、8、10或16个丝氨酸和/或甘氨酸氨基酸的序列段。更优选的柔性接头包括(SG)1、(SG)2、(SG)3、(SG)4、(SG)5和(SG)8，其中S为丝氨酸，G为甘氨酸。优选的刚性接头为2-30个，例如4、6、8、16或24个脯氨酸氨基酸的序列段。更优选的刚性接头包括(P)12，其中P为脯氨酸。
可以用分子连接物和核酸结合蛋白对所述突变型单体进行化学修饰。
构建体
本发明还提供了一种包含两个或多个共价连接的衍生自Msp的单体的构建体。本发明的构建体保留了其形成孔的能力。本发明的一个或多个构建体可用于形成用于表征（例如测序）核酸序列的孔。所述构建体可包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个单体。所述两个或多个单体可以相同或不同。
所述单体不一定为本发明的突变型单体。例如，至少一个单体可包含SEQ ID NO:2中示出的序列。或者，至少一个单体可包含SEQ ID NO:2的变体（基于氨基酸同一性与SEQID NO:2在其全部序列上至少50%同源），但不包括本发明的突变型单体所需要的任何具体突变。更优选地，基于氨基酸同一性，所述变体与SEQ ID NO:2的氨基酸序列在整个序列上可以是至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，更优选至少95%、97%或99%同源的。在优选实施方案中，所述构建体中的至少一个单体是本发明的突变型单体。所述构建体中的全部单体可以都是本发明的突变型单体。所述突变型单体可以相同或不同。在更优选的实施方案中，所述构建体包含两个单体并且所述单体中的至少一个为本发明的突变型单体。
所述单体优选在遗传上融合的。如果整个构建体从单个多核苷酸序列表达，那么所述单体是在遗传上融合的。所述单体的编码序列可以任何方式组合以形成编码所述构建体的单个多核苷酸序列。
所述单体可以以任何构型在遗传上融合。所述单体可以经其末端氨基酸融合。例如，一个单体的氨基末端可融合至另一个单体的羧基末端。如果从各自包含SEQ ID NO:2示出的序列或其变体的两个或多个单体的基因融合形成所述构建体，那么所述构建体中的第二个及随后的单体（以氨基到羧基方向）可在其氨基末端包含甲硫氨酸（其中每个单体都融合到前一单体的羧基末端）。例如，如果M为包含SEQ ID NO:2示出的序列或变体的单体（没有氨基末端甲硫氨酸），mM为包含SEQ ID NO:2示出的序列或变体的具有氨基末端甲硫氨酸的单体，那么所述构建体可包含序列M-mM、M-mM-mM或M-mM-mM-mM。存在这些甲硫氨酸一般是由于在编码整个构建体的多核苷酸内的编码所述第二个或随后的单体的多核苷酸5’末端的起始密码子（即ATG）的表达。所述构建体中的第一个单体（以氨基到羧基方向）还可包含甲硫氨酸（例如mM-mM、mM-mM-mM或mM-mM-mM-mM）。
所述两个或多个单体可以直接在遗传上融合在一起。优选使用接头在遗传上融合所述单体。所述接头可被设计为限制所述单体的运动性。优选的接头为氨基酸序列（即肽接头）。可以使用上述的任何肽接头。所述构建体优选包含SEQ ID NO:29示出的序列或其变体。SEQ ID NO:29中的每个单体包含SEQ ID NO:2示出的序列或其变体。如上所述，第二个单体还在其氨基酸末端包含甲硫氨酸。两个单体通过肽接头连接。参照SEQ ID NO:2的变体，SEQ ID NO:29的变体可以以上述任何方式从SEQ ID NO:29变化而来。所述接头还可用上述的肽接头修饰或代替。
在另一个优选实施方案中，所述单体是经化学方法融合的。如果亚基和酶是例如经化学交联剂化学连接的，那么所述亚基是化学融合至所述酶的。可以使用上述的任何化学交联剂。所述接头可被连接至本发明的突变型单体中引入中的一个或多个半胱氨酸残基。或者，所述接头可被连接至所述构建体中一个单体的末端。
如果构建体含有不同的单体，可通过保持接头的浓度相对于单体大大过量来阻止所述单体自身的交联。或者，可使用其中使用了两个接头的“锁钥”排列。每个接头的仅一个末端可以反应在一起以形成更长的接头，所述接头的另一个末端各自与不同的单体反应。这种接头描述于国际申请PCT/GB10/000132（公开为WO2010/086602）中。
多核苷酸
本发明还提供了编码本发明的突变型单体的多核苷酸序列。所述突变型单体可以是上述的任何突变型单体。所述多核苷酸序列优选包含在整个序列上基于核苷酸同一性与SEQ ID NO:1的序列至少50%、60%、70%、80%、90%或95%同源的序列。在300或更多个，例如375、450、525或600或更多个连续核苷酸的序列段上，可以有至少80%，例如至少85%、90%或95%的核苷酸同一性（“严格同源性”）。同源性可如上述进行计算。基于遗传密码的简并性，所述多核苷酸序列可以包含与SEQ ID NO:1不同的序列。
本发明还提供了编码本发明的任何在遗传上融合的构建体的多核苷酸序列。如上所述，所述多核苷酸优选包含两个或更多个SEQ ID NO:1示出的序列或其变体。所述多核苷酸序列优选包含SEQ ID NO:28的序列或在整个序列上基于核苷酸同一性与SEQ ID NO:28的序列至少50%、60%、70%、80%、90%或95%同源的序列。在600或更多个，例如750、900、1050或1200或更多个连续核苷酸的序列段上可以有至少80%，例如至少85%、90%或95%的核苷酸同一性（“严格同源性”）。同源性可如上述进行计算。基于遗传密码的简并性，所述多核苷酸序列可包含与SEQ ID NO:28不同的序列。
多核苷酸序列可使用本领域标准方法衍生和复制。编码野生型Msp的染色体DNA可以从产生孔的生物例如耻垢分枝杆菌中提取。编码所述孔亚基的基因可使用包括特异性引物的PCR来扩增。然后，可对所扩增的序列进行定向诱变。适合的定向诱变方法是本领域已知的，包括例如联合链式反应（combine chain reaction）。可使用熟知的技术例如Sambrook,J.and Russell,D.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdEdition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中描述的那些来制备编码本发明的构建体的多核苷酸。
然后，可将所产生的多核苷酸序列纳入到重组复制载体例如克隆载体中。所述载体可用于在相容的宿主细胞中复制所述多核苷酸。因此，可通过将多核苷酸引入复制载体中，将所述载体引入相容的宿主细胞并且在允许所述载体复制的条件下培养所述宿主细胞来制备多核苷酸序列。所述载体可从所述宿主细胞回收。用于克隆多核苷酸的适合宿主细胞是本领域已知的且在下文更详细地描述。
所述多核苷酸序列可以被克隆到适合的表达载体中。在表达载体中，所述多核苷酸序列一般可操作地连接到控制序列，所述控制序列能够通过所述宿主细胞表达所述编码序列。这种表达载体可用于表达孔亚基。
术语“可操作地连接”是指这样的并置，即其中所描述的组分处于允许其以其预期方式起作用的关系中。控制序列“可操作地连接”至编码序列是以这样的方式连接的，即使得所述编码序列的表达在与所述控制序列相容的条件下实现。多个拷贝的相同或不同多核苷酸序列可被引入到所述载体。
然后，所述表达载体可被引入到适合的宿主细胞中。因此，可通过将多核苷酸序列插入表达载体中，将所述载体引入相容的细菌宿主细胞并且在允许所述多核苷酸序列表达的条件下培养所述宿主细胞来产生本发明的突变型单体或构建体。重组表达的单体或构建体可在宿主细胞膜中自组装为孔。或者，可将以这种方式产生的重组孔可从所述宿主细胞除去并插入到另外的膜中。当产生包含至少两个不同亚基的孔时，可如上所述将所述不同亚基在不同的宿主细胞中分开表达，从所述宿主细胞除去并在分开的膜例如兔细胞膜中组装为孔。
所述载体可以是例如提供有复制起点、任选用于表达所述多核苷酸序列的启动子以及任选所述启动子的调节基因的质粒、病毒或噬菌体载体。所述载体可含有一个或多个选择性标记基因，例如四环素抗性基因。启动子和其他表达调节信号可被选择为与所述表达载体设计用于的宿主细胞相容。一般使用T7、trc、lac、ara或λL启动子。
所述宿主细胞一般以高水平表达所述孔亚基。以多核苷酸序列转化的宿主细胞会被选择以与用于转化所述细胞的表达载体相容。所述宿主细胞一般为细菌，优选为大肠杆菌（Escherichia coli.）。有λDE3溶素原的任何细胞，例如C41(DE3)、BL21(DE3)、JM109(DE3)、B834(DE3)、TUNER、Origami和Origami B可以表达包含T7启动子的载体。除了上述条件外，Proc Natl Acad Sci U S A.2008Dec30;105(52):20647-52中引用的任何方法可被用于表达Msp蛋白。
孔
本发明还提供了多种孔。本发明的孔理想地用于表征（例如测序）核酸序列，因为它们可以高灵敏度地区分不同核苷酸。所述孔可令人惊奇地区分DNA和RNA中的四种核苷酸。本发明的孔甚至可以区分甲基化和非甲基化的核苷酸。本发明的孔的碱基分辨率出奇的高。所述孔显示出所有四种DNA核苷酸的几乎完全分开。基于在所述孔中的停留时间和流经所述孔的电流，所述孔还可区分脱氧胞苷一磷酸（dCMP）和甲基-dCMP。
本发明的孔还可在一系列条件下区分不同的核苷酸。具体地，所述孔能在有利于表征（例如测序）核酸的条件下区分核苷酸。本发明的孔可以区分不同核苷酸的程度可以通过改变所施加的电压、盐浓度、缓冲液、温度和添加剂例如脲、甜菜碱和DTT的存在来控制。这使得可以微调所述孔的功能，尤其是在测序时。这在下文中更详细地详述。本发明的孔还可用于从与一个或多个单体的相互作用鉴定核酸聚合物而不是一个核苷酸一个核苷酸地鉴定。
本发明的孔可以是分离的、基本分离的、纯化的或基本纯化的。如果本发明的孔完全没有任何其他组分例如脂质或其他孔，那么其是分离的或纯化的。如果孔与不干扰其预期用途的载体或稀释剂混合，那么其是基本分离的。例如，如果孔以包含少于10%、少于5%、少于2%或少于1%的其他组分（例如脂质或其他孔）的形式存在，那么其是基本分离或基本纯化的。或者，本发明的孔可存在于脂双分子层中。
本发明的孔可以作为单独的或单个的孔而存在。或者，本发明的孔可以以两个或多个孔的同源或异源群而存在。
同源寡聚体孔
本发明还提供了包含相同的本发明的突变型单体的衍生自Msp的同源寡聚体孔。所述同源寡聚体孔优选包含表1、2和3中示出的突变体之一。本发明的同源寡聚体孔理想地用于表征（例如测序）核酸。本发明的同源寡聚体孔可具有上文详述的任何优点。本发明的具体同源寡聚体孔的优点在表1、2和3中示出。
所述同源寡聚体孔可含有任意数量的突变型单体。所述孔一般包含7、8、9或10个相同的突变型单体。所述孔优选包含8个相同的突变型单体。一个或多个例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个所述突变型单体优选是如上文详述化学修饰的。
制造孔的方法在下文更详细地详述。
异源寡聚体孔
本发明还提供了包含至少一个本发明的突变型单体的衍生自Msp的异源寡聚体孔，其中八个单体中的至少一个与其他单体不同。本发明的异源寡聚体孔理想地用于表征（例如测序）核酸。异源寡聚体孔可以使用本领域已知方法（例如Protein Sci.2002Jul;11(7):1813-24）制备。
所述异源寡聚体孔含有足够的单体以形成所述孔。所述单体可以是任意类型。所述孔一般包含7、8、9或10个单体。所述孔优选包含8个单体。
所述孔可包含至少一个包含如下序列的单体：（a）SEQ ID NO:2示出的序列或（b）其不含有本发明的突变型单体所需的突变的变体。适合的变体如上文所详述。在该实施方案中，其余的单体优选为本发明的突变型单体。因此，所述孔可包含9、8、7、6、5、4、3、2或1个本发明的突变型单体。
在优选实施方案中，所述孔包含（a）一个突变型单体和（b）七个相同的单体，其中（a）中的突变型单体与（b）中的相同单体不同。所述（b）中的相同单体优选包含（i）SEQ IDNO:2示出的序列或（ii）不含有本发明的突变型单体中存在的突变的变体。
优选的孔包括但不限于任何如下的孔：
(a)七个包含SEQ ID NO:2示出的序列的单体和一个包含替换N90R、N90K、N90Y、N90Q、N90W或N90C的突变型单体。这些孔具有引入到内收缩部的单个立体氨基酸（Y或W）、单个带电氨基酸（K或R）或单个反应性氨基酸（C）。
(b)七个包含SEQ ID NO:2示出的序列的单体和一个包含替换N91R、N91K、N91Y、N91Q、N91W或N91C的突变型单体。这些孔具有引入内部到收缩部的单个立体氨基酸（Y或W）、单个带电氨基酸（K或R）或单个反应性氨基酸（C）。
(c)七个包含SEQ ID NO:2示出的序列的单体和一个包含替换L88C、S103C或I105C的突变型单体。这些孔具有引入到所述孔的反应性氨基酸。
在另一个优选实施方案中，所有的单体（即10、9、8或7个所述单体）为本发明的突变型单体并且它们中的至少一个与其他不同。在更优选的实施方案中，所述孔包含八个本发明的变体单体并且它们中的至少一个与其他不同。
在所有上文详述的实施方案中，一个或多个例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个所述突变型单体优选被如上文详述化学修饰。优选通过将分子连接至一个或多个所引入的半胱氨酸来对上述优选的孔（a）-（c）进行化学修饰。
制造孔的方法在下文更详细地详述。
含有构建体的孔
本发明还提供了一种包含至少一个本发明的构建体的孔。本发明的构建体包含两个或多个共价连接的衍生自Msp的单体。换句话说，构建体必须含有多于一个的单体。所述孔含有足够的构建体并且必要时含有足够的单体以形成所述孔。例如，八聚体孔可以包含（a）两个构建体，每个包含四个单体或（b）一个构建体，其包含两个单体和六个不形成构建体的一部分的单体。所述孔中至少两个单体为本发明的构建体形式。所述单体可以是任何类型。所述孔一般总计包含7、8、9或10个单体（其中至少两个必须在构建体中）。所述孔优选包含八个单体（其中至少两个必须在构建体中）。
孔一般含有（a）一个包含两个单体的构建体和（b）5、6、7或8个单体。所述构建体可以是上文详述的任何构建体。所述单体可以是上文详述的任何单体，包括本发明的突变型单体。
另一种有代表性的孔包含多于一个本发明的构建体，例如2、3或4个本发明的构建体。这种孔还包含足够的单体以形成所述孔。所述单体可以是上文详述的任何单体。本发明的另一种孔仅包含含有2个单体的构建体，例如孔可包含4、5、6、7或8个含有2个单体的构建体。根据本发明的具体孔包含四个构建体，每个构建体包含2个单体。所述构建体可寡聚体化为具有这样结构的孔，即以使构建体的仅一个单体形成所述孔的桶或孔腔。一般而言，所述构建体的其他单体会在所述孔的桶或孔腔的外部。例如，本发明的孔可包含5、6、7或8个包含2个单体的构建体，其中所述桶或孔腔包含8个单体。
突变可被引入到如上文所述的构建体。所述突变可以是交替的，即两单体构建体内每个单体的突变不同并且所述构建体被组装为同源寡聚体，形成交替修饰。换句话说，包含MutA和MutB的单体被融合并组装以形成A-B:A-B:A-B:A-B孔。或者，所述突变可以是邻近的，即相同的突变被引入到构建体中的两个单体中，然后将其与不同的突变型单体进行寡聚化。换句话说，将包含MutA的单体融合，然后通过与含有MutB的单体进行寡聚化以形成A-A:B:B:B:B:B:B。
在含有构建体的孔中的本发明的一个或多个单体可以如上文详述进行化学修饰。
鉴定个体核苷酸的方法
本发明还提供了表征个体核苷酸的方法。所述方法包括，使所述核苷酸与本发明的孔接触使得所述核苷酸与所述孔相互作用并测量在相互作用过程中通过所述孔的电流，从而表征所述核苷酸。因此，本发明涉及个体核苷酸的纳米孔传感。本发明还提供了鉴定个体核苷酸的方法，包括测量在相互作用过程中通过所述孔的电流，从而确定所述核苷酸的类型。可以使用任何本发明的孔。优选如上文详述以分子连接物对本发明的孔进行化学修饰。
如果所述电流以核苷酸特异性的方式通过所述孔（即如果检测到与核苷酸相关的特征性电流流经所述孔），那么存在所述核苷酸。如果所述电流没有以所述核苷酸特异性的方式流经所述孔，那么不存在所述核苷酸。
本发明可用于区分结构相似的核苷酸，这是基于它们对通过孔的电流的不同影响。根据个体核苷酸与所述孔相互作用时的电流幅度，可以在单分子水平鉴定个体核苷酸。本发明还可用于确定具体的核苷酸是否存在于样品中。本发明还可用于测量样品中具体核苷酸的浓度。
所述方法可以使用其中本发明的孔被插入到膜中的任何适合的膜/孔系统进行。所述方法一般使用（i）包含本发明的孔的人工膜，（ii）分离的、天然存在的包含本发明的孔的膜，或（iii）已经根据本发明修饰的表达孔的细胞来进行。所述方法优选使用人工膜进行。所述膜可包含其他跨膜和/或膜内蛋白以及除本发明的孔外的其他分子。
所述膜可形成离子、核苷酸和核酸流的屏障。根据本发明可以使用任何膜。适合的膜是本领域熟知的。所述膜优选为两亲层。两亲层是由两亲分子例如磷脂形成的层，其具有亲水性和亲脂性。所述两亲物可以是合成的或天然存在的。所述两亲层可以是单层或双层。非天然存在的两亲物和形成单层的两亲物在本领域已知，包括例如嵌段共聚物（Gonzalez-Perez et al.,Langmuir,2009,25,10447-10450）。
所述膜可以是脂双层。适合用于本发明的脂双层可以使用本领域已知方法制造。例如，可以使用Montal and Mueller(1972)的方法形成脂双层膜。脂双层还可以使用国际申请PCT/GB08/000563中描述的方法形成。
本发明的方法可以使用由任何膜脂形成的脂双层进行，所述膜脂包括但不限于磷脂、糖脂、胆固醇、分枝菌酸及其混合物。可以使用国际申请PCT/GB08/000563中描述的任何脂质。
在另一个优选实施方案中，所述膜为固态层。固态层不是生物来源的。换句话说，固态层不是衍生自或分离自生物环境例如生物体或细胞，或合成制造形式的可生物获得的结构。固态层可以由有机和无机材料形成，所述有机和无机材料包括但不限于微电子材料、绝缘材料例如Si3N4、A1203和SiO、有机和无机聚合物例如聚酰胺、塑料例如或弹性体例如双组分加成固化硅橡胶和玻璃。所述固态层可以由单原子层例如石墨烯或仅几个原子厚的层形成。适合的石墨烯层公开于国际申请PCT/US2008/010637（公开为WO2009/035647）。两亲层可以跨越固态孔形成。在本领域中这可被描述为杂合孔形成（Hall etal.,Nat Nanotechnol.,2010,5,874-877）。
用于将孔插入到膜例如脂双层中的方法在本领域已知。例如，所述孔可以以纯化形式悬浮于含有脂双层的溶液中，使得其扩散到所述脂双层并且通过结合到所述脂双层并组装为有功能的状态而插入至所述脂双层中。或者，可使用M.A.Holden,H.Bayley.J.Am.Chem.Soc.2005,127,6502-6503和国际申请PCT/GB2006/001057（公开为WO2006/100484）中描述的“拾取并放置（pick and place）”方法直接将所述孔插入到所述膜中。
本发明的方法一般在体外进行。
个体核苷酸
个体核苷酸是单个的核苷酸。个体核苷酸是没有通过核苷酸键结合到另一个核苷酸或核酸的核苷酸。核苷酸键涉及核苷酸的磷酸基团之一结合到另一个核苷酸的糖基。个体核苷酸一般是没有通过核苷酸键结合到另外的核酸序列的核苷酸，所述核酸序列含有至少5、至少10、至少20、至少50、至少100、至少200、至少500、至少1000或至少5000个核苷酸。例如，所述个体核苷酸已经从靶多核苷酸序列例如DNA或RNA链中消化下来。
本发明的方法可用于鉴定任何核苷酸。所述核苷酸可以是天然存在的或人工的。核苷酸一般含有核碱基、糖和至少一个磷酸基团。所述核碱基一般是杂环的。适合的核碱基包括嘌呤和嘧啶，更具体是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶。所述糖一般为戊糖。适合的糖包括但不限于核糖和脱氧核糖。所述核苷酸一般为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。所述核苷酸一般含有单磷酸、双磷酸或三磷酸。
适合的核苷酸包括但不限于，腺苷一磷酸（AMP）、腺苷二磷酸（ADP）、腺苷三磷酸（ATP）、鸟苷一磷酸（GMP）、鸟苷二磷酸（GDP）、鸟苷三磷酸（GTP）、胸苷一磷酸（TMP）、胸苷二磷酸（TDP）、胸苷三磷酸（TTP）、尿苷一磷酸（UMP）、尿苷二磷酸（UDP）、尿苷三磷酸（UTP）、胞苷一磷酸（CMP）、胞苷二磷酸（CDP）、胞苷三磷酸（CTP）、环腺苷一磷酸（cAMP）、环鸟苷一磷酸（cGMP）、脱氧腺苷一磷酸（dAMP）、脱氧腺苷二磷酸（dADP）、脱氧腺苷三磷酸（dATP）、脱氧鸟苷一磷酸（dGMP）、脱氧鸟苷二磷酸（dGDP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胸苷一磷酸（dTMP）、脱氧胸苷二磷酸（dTDP）、脱氧胸苷三磷酸（dTTP）、脱氧尿苷一磷酸（dUMP）、脱氧尿苷二磷酸（dUDP）、脱氧尿苷三磷酸（dUTP）、脱氧胞苷一磷酸（dCMP）、脱氧胞苷二磷酸（dCDP）和脱氧胞苷三磷酸（dCTP）、所述核苷酸优选为AMP、TMP、GMP、UMP、dAMP、dTMP、dGMP或dCMP。
所述核苷酸可以衍生自核酸序列例如核糖核酸（RNA）或脱氧核糖核酸的消化。可以使用本领域已知的任何方法消化核酸序列。适合的方法包括但不限于使用酶或催化剂的方法。核酸的催化消化公开于Decket al.,Inorg.Chem.,2002;41:669-677。
来自单个核酸序列的个体核苷酸可以以有顺序方式与所述孔接触，以对所述核酸的全部或部分测序。对核酸测序在下文中更详细地详述。
所述核苷酸一般是未修饰的，例如当所述核苷酸衍生自核酸序列的消化时。或者，所述核苷酸可以被修饰或损伤。所述核苷酸一般被甲基化或氧化。可用显示标记物标记所述核苷酸。所述显示标记物可以是可使得所述核苷酸被检测到的任何适合的标记物。适合的标记物包括荧光分子、放射性同位素例如125I、35S和接头例如生物素。
所述核苷酸一般存在于任何适合的生物样品中。适合的生物样品如上文所详述。
孔和核苷酸之间的相互作用
所述核苷酸可以与所述膜任一侧的孔接触。所述核苷酸可被引入到在所述膜任一侧的孔中。所述核苷酸可以与所述膜的一侧接触，这使得所述核苷酸通过所述孔到所述膜的另一侧。例如，所述核苷酸与所述孔的末端（其在其天然环境中允许离子或小分子例如核苷酸进入到所述孔的桶或通道中）接触，使得所述核苷酸可以通过所述孔。在这种情况中，当所述核苷酸通过所述孔的桶或通道跨越所述膜时，其与所述孔和/或连接物相互作用。或者，所述核苷酸可以与所述膜的一侧接触，这使得核苷酸与孔经所述连接物相互作用或连同所述连接物一起相互作用，从所述孔分离并保留在所述膜的同一侧。本发明提供了其中连接物的位置固定的孔。因此，所述核苷酸优选与所述孔的允许所述连接物与所述核苷酸相互作用的末端接触。
所述核苷酸可以以任何方式在任何位点与所述孔相互作用。如上文详述，所述核苷酸优选可逆地经所述连接物或连同所述连接物一起结合到所述孔。所述核苷酸最优选在其通过跨越所述膜的孔时可以可逆地经所述连接物或连同所述连接物一起结合到所述孔。所述核苷酸还可在其通过跨越所述膜的孔时可以可逆地通过所述连接物或连同所述连接物一起结合到所述孔的桶或通道。
在核苷酸和所述孔相互作用过程中，所述核苷酸以该核苷酸特有的方式影响流经所述孔的电流。例如，具体核苷酸会降低流经所述孔的电流持续特定的平均时间并至具体的程度。换句话说，对于具体核苷酸流经所述孔的电流是特征性的。可以进行对照实验来确定具体核苷酸对流经所述孔的电流的影响。然后，可以将在测试样品上实施本发明的方法得到的结果与这种对照实验得到的结果相比较，以鉴定所述样品中的具体核苷酸或确定具体核苷酸是否存在于所述样品中。电流流经所述孔的频率以指示具体核苷酸的方式受影响，这可被用于确定该核苷酸在样品中的浓度。还可计算样品中不同核苷酸的比例。例如，可以计算dCMP与甲基-dCMP的比例。
装置
所述方法可以使用适于研究膜/孔系统（其中本发明的孔被插入到膜中）的任何装置进行。所述方法可以使用适于纳米孔传感的任何装置进行。例如，所述装置包含含有水性溶液的腔室以及将所述腔室分为两部分的屏障物。所述屏障物具有孔，在所述孔中形成含有所述孔的膜。通过引入核苷酸到所述腔室中，所述核苷酸可以与所述孔接触。所述核苷酸可被引入到所述腔室的两个部分的任一部分。
所述方法可以使用国际申请PCT/GB08/000562中描述的装置进行。
本发明的方法包括在所述孔与所述核苷酸相互作用过程中测量通过所述孔的电流。因此，所述装置还包含能够施加电位并测量跨越所述膜和孔的电信号的电路。所述方法可以使用膜片箝或电压箝进行。所述方法优选涉及电压箝的使用。
样品
核苷酸存在于任何适合的样品中。本发明一般在已知含有或被怀疑含有所述核苷酸的样品上进行。本发明可以在含有一种或多种类型未知的核苷酸的样品上进行。或者，本发明可以在样品上进行以确认已知或预计在样品中存在的一种或多种核苷酸的类型。
所述样品可以是生物样品。本发明可以在从任何生物或微生物获得或提取的样品上在体外进行。所述生物或微生物一般为原核的或真核的并且通常属于五界之一：植物界、动物界、真菌界、无核原生物界和原生生物界。本发明可以在从任何病毒获得或提取的样品上在体外进行。所述样品优选为流体样品。所述样品一般包含患者的体液。所述样品可以是尿、淋巴、唾液、粘液或羊水但优选为血液、血浆或血清。一般而言，所述样品是人来源的，但是可选择地其可以来自另外的哺乳动物例如商业养殖的动物例如马、牛、绵羊或猪或者可选择地可以是宠物例如猫或狗。或者，植物来源的样品一般获得自经济作物，例如谷物、豆类、水果或蔬菜，例如小麦、大麦、燕麦、芸苔、玉米、大豆、水稻、香蕉、苹果、番茄、马铃薯、葡萄、烟草、黄豆、小扁豆、甘蔗、可可、棉花、茶、咖啡。
所述样品可以是非生物样品。所述非生物样品优选为流体样品。非生物样品的实例包括外科流体、水例如饮用水、海水或河水以及用于实验室测试的试剂。
所述样品一般在进行测定之前可通过例如离心或通过膜来处理，所述膜可滤除不想要的分子或细胞例如红细胞。可以在取得样品后立即进行测量。一般还可将所述样品储藏（优选低于-70℃）然后进行测定。
条件
本发明的方法包括在所述孔与所述核苷酸相互作用过程中测量通过所述孔的电流。用于测量通过跨膜蛋白质孔的离子电流的适合条件是本领域已知的并且公开于实施例中。实施所述方法时，跨越所述膜和孔施加有电压。使用的电压一般为–400mV至+400mV。所使用的电压范围优选具有选自-400mV、-300mV、-200mV、-150mV、-100mV、-50mV、-20mV和0mV的下限，并具有独立地选自+10mV、+20mV、+50mV、+100mV、+150mV、+200mV、+300mV和+400mV的上限。所使用的电压更优选为100mV至240mV的范围，最优选为160mV至240mV的范围。本发明的孔可通过使用增加的施加电位来提高对不同核苷酸的辨别力。
所述方法一般在任何碱金属氯化物盐的存在下进行。在上述示例性装置中，所述盐存在于所述腔室的水性溶液中。一般使用氯化钾（KCl）、氯化钠（NaCl）或氯化铯（CsCl）。优选KCl。所述盐浓度一般为0.1-2.5M、0.3-1.9M、0.5-1.8M、0.7-1.7M、0.9-1.6M或1M-1.4M。所述盐浓度优选为150mM至1M。高盐浓度可提供高的信噪比并使得指示核苷酸存在的电流相对于正常的电流波动背景被鉴定出来。如果在酶的存在下进行核苷酸检测，例如当对核酸测序时，可以使用较低盐浓度。这在下文中更详细地详述。
一般在缓冲液的存在下进行所述方法。在上文详述的示例性装置中，所述缓冲液存在于所述腔室的水性溶液中。任何缓冲液可用于本发明的方法。一种适合的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。所述方法一般在4.0-12.0、4.5-10.0、5.0-9.0、5.5-8.8、6.0-8.7或7.0-8.8或7.5-8.5的pH下进行。所使用的pH优选约7.5。
所述方法一般在0-100℃、15-95℃、16-90℃、17-85℃、18-80℃、19-70℃或20-60℃进行。所述方法可以在室温进行。所述方法优选在支持酶功能的温度，例如约37℃进行。
表征核酸的方法
本发明还提供了表征靶核酸序列的方法。可以确定靶核酸序列中的一个或多个特征。所述方法可包括测量所述靶核酸序列的2、3、4或5或更多个特征。所述一个或多个特征优选选自（i）所述靶核酸序列的长度，（ii）所述靶核酸序列的类型，（iii）所述靶核酸序列的序列，（iv）所述靶核酸序列的二级结构以和（v）所述靶核酸序列是否被修饰。根据本发明可以确定（i）至（v）的任意组合。
对于（i），所述核酸序列的长度可以使用所述靶核酸序列与所述孔之间的相互作用数目来测量。
对于（ii），可以以多种方式测量所述核酸序列的类型。所述核酸序列的类型可以与测量所述靶核酸序列的序列结合进行测量，或者在不测量所述靶核酸序列的序列的情况下进行测量。前者是直接的；所述核酸被测序从而被鉴定。后者可以以几种方式完成。例如，可以测量核酸序列中具体基序的存在（不测量所述多核苷酸的其余序列）。或者，所述方法中具体电信号的测量可以鉴定来自具体来源的靶核酸序列。
对于（iii），可以如前所述确定核酸序列的序列。适合的测序方法，尤其是使用电测量的那些方法描述于Stoddart D et al.,Proc Natl Acad Sci,12;106(19):7702-7、Lieberman KR et al,J Am Chem Soc.2010;132(50):17961-72和国际申请WO2000/28312中。
对于（iv），可以以多种方式测量二级结构。例如，可以使用停留时间的改变或流经所述孔的电流的改变来测量二级结构。
本发明还提供了一种评估靶核酸序列的序列的方法。本发明还提供了一种对靶核酸序列测序的方法。
核酸是包含两个或更多个核苷酸的大分子。所述核苷酸可以是上文详述的任何核苷酸。
在一个实施方案中，所述方法包括（a）使所述靶序列与本发明的孔以及核酸结合蛋白接触，使得蛋白可控制所述靶序列通过所述孔的运动并且所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用，和（b）在每次相互作用过程中测量通过所述孔的电流从而表征所述靶序列（例如评估其序列或对其测序）。因此，所述方法包括在核苷酸通过所述桶或通道时对靶核酸序列中一部分核苷酸进行纳米孔传感，以表征（例如测序）所述靶序列。
在另一个实施方案中，所述方法包括（a）使靶序列与本发明的孔和外切核酸酶接触，使得所述外切核酸酶从所述靶序列的一个末端消化个体核苷酸；（b）使所述核苷酸与所述孔接触，使得所述核苷酸与所述连接物相互作用；（c）在所述相互作用过程中测量通过所述孔的电流，从而表征核苷酸；和（d）在所述靶序列的同一末端重复步骤（a）至（c），从而表征所述靶序列。因此，所述方法包括以连续方式对靶核酸序列中一部分核苷酸进行纳米孔传感以表征所述靶序列。在优选实施方案中，所述方法涉及对所述靶核酸序列进行测序并且步骤（a）包括确定所述核苷酸的类型。个体核苷酸如上文所述。
本发明的孔尤其适于这些方法，因为它们展现出核苷酸辨别力改善。具体地，它们展现出电流范围增加，这使得更容易区分不同的核苷酸，并且展现出状态变化减少，这可提高信噪比。另外，对于之前的实施方案，当核酸运动通过孔时产生电流的核苷酸数降低。这使得更容易鉴定核酸运动通过孔时所观察到的电流和所述核酸序列之间的直接关系。如上文所详述，本发明的孔优选以（1）分子连接物和/或（2）核酸结合蛋白或外切核酸酶进行化学修饰。
可以使用这种方法表征（例如测序）所述靶核酸序列的全部或仅一部分。所述核酸序列可以是任意长度。例如，所述核酸序列的长度可以为至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250、至少300、至少400或至少500个核苷酸。所述核酸序列的长度可以为1000或更多个核苷酸或5000或更多个核苷酸。所述核酸序列可以是天然存在的或人工的。例如，所述方法可被用于验证制备的寡核苷酸的序列。所述方法一般在体外进行。
所述方法可以使用其中孔被插入到膜中的任何适合的膜/孔系统进行。一般使用上文公开的任何系统、装置或条件进行所述方法。
如上文所述，如果提高温度，则可以在低盐浓度下实现良好的核苷酸区分。除了提高溶液温度外，可以使用多种其他策略以增加所述溶液的电导并同时维持适合酶活性的条件。一种这样的策略是使用脂双层以分开两种不同浓度的盐溶液，低盐浓度的盐在酶的一侧，较高浓度的在对侧。这种方法的一个实例是在膜的顺面使用200mM的KCl，在反侧腔室中使用500mM KCl。在这些条件下，通过所述孔的电导预期大致等价于正常条件下的400mMKCl，而如果放置在顺面，所述酶仅经受200mM。使用非对称的盐条件的另一个可能益处是跨越所述孔诱导的渗透梯度。这种水的净流动可用于将核苷酸拉到所述孔中以进行检测。使用中性渗透物例如蔗糖、甘油或PEG可以实现类似的效果。另一种可能是使用具有相对低水平的KCl的溶液并且依靠携带额外电荷且对酶活性有较低破坏的物质。
要分析的靶序列可以与已知的保护性化学物结合以保护所述序列在本体溶液中时免受所述结合蛋白或外切核酸酶的作用。然后，所述孔可用于除去所述保护性化学物。这可以通过如下方式来实现：使用在施加的电位下不与所述孔、结合蛋白或酶杂交的保护基（WO2008/124107）或使用当接近所述孔时可被所述结合蛋白或酶除去的保护性化学物（JAm Chem Soc.2010Dec22;132(50):17961-72）。
链测序
链测序涉及核酸聚合物受控且逐步地移位通过孔。本发明的孔可用于链测序。本发明的一种方法使用核酸结合蛋白以控制所述靶序列运动通过所述孔。这种蛋白的实例包括但不限于核酸处理酶，例如核酸酶、聚合酶、拓扑异构酶、连接酶和解旋酶以及非催化性结合蛋白例如被SCOP（蛋白质的结构分类）分类为核酸结合蛋白超家族（50249）的那些。所述结合蛋白可以是单链结合蛋白（SSB）。
核酸是包含两个或更多个核苷酸的大分子。被所述蛋白结合的核酸可以包含任意组合的任何核苷酸。所述核苷酸可以是上文详述的任何核苷酸。所述核酸可以是脱氧核糖核酸（DNA）或核糖核酸（RNA）。所述核酸可以是本领域已知的任何合成核酸，例如肽核酸（PNA）、甘油核酸（GNA）、苏糖核酸（TNA）、锁核酸（LNA）或具有核苷酸侧链的其他合成聚合物。被所述蛋白结合的核酸可以是单链的，例如cDNA、RNA、GNA、TNA或LNA，或者可以是双链的，例如DNA。结合单链核酸的蛋白质可被用于对双链DNA测序，只要所述双链DNA被解离为单链，然后被所述蛋白结合。
所述核酸结合蛋白优选为核酸处理酶。核酸处理酶是能够与核酸相互作用并改变核酸的至少一种性质的多肽。所述酶可通过切割所述核酸形成个体核苷酸或更短的核苷酸链（例如二核苷酸或三核苷酸）来改变所述核酸。所述酶可通过将所述核酸定向或运动到特定位置来改变所述核酸。所述核酸处理酶不需要展现出酶活性，只要其能够结合所述靶序列并控制其运动通过所述孔。例如，所述酶可被改变以除去其酶活性或可在阻止其作为酶起作用的条件下使用。这种条件在下文更详细地详述。
所述核酸处理酶优选衍生自溶核酶。用于所述核酸处理酶的构建体中的酶更优选衍生自酶分类（EC）组3.1.11、3.1.13、3.1.14、3.1.15、3.1.16、3.1.21、3.1.22、3.1.25、3.1.26、3.1.27、3.1.30和3.1.31中任一组的成员。所述酶可以是任何描述于国际申请PCT/GB10/000133（公开为WO2010/086603）中的那些酶。
优选的酶为聚合酶、外切核酸酶、解旋酶和拓扑异构酶例如回旋酶。适合的酶包括但不限于来自大肠杆菌的外切核酸酶I（SEQ ID NO:6）、来自大肠杆菌的外切核酸酶III（SEQ ID NO:8）、来自嗜热栖热菌的RecJ（SEQ ID NO:10）和噬菌体λ外切核酸酶（SEQ IDNO:12）及其变体。包含SEQ ID NO:10示出的序列或其变体的三个亚基可相互作用以形成三聚物外切核酸酶。所述酶优选基于Phi29DNA聚合酶（SEQ ID NO:4）。
SEQ ID NO:4、6、8、10或12的变体是具有从SEQ ID NO:4、6、8、10或12的氨基酸序列变化而来并保留核酸结合能力的氨基酸序列的酶。所述变体可以包括促进核酸结合和/或促进其在高盐浓度和/或室温下的活性的改变。
在SEQ ID NO:4、6、8、10或12的氨基酸序列的全长上，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列至少50%同源。更优选地，基于氨基酸同一性，所述变体多肽与SEQ ID NO:4、6、8、10或12的氨基酸序列在整个序列上可以至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，更优选至少95%、97%或99%同源。在200或更多个，例如230、250、270或280或更多个连续氨基酸的序列段上可以有至少80%，例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性（“严格同源性”）。同源性可如上文所述确定。参照SEQ IDNO:2，所述变体可以以上文详述的任何方式不同于野生型序列。所述酶可以如上所文所详述共价地连接到所述孔。
所述酶不需要像进行个体核苷酸测序那样接近所述孔腔，因为在核苷酸到达所述孔的传感部分的系列中不可能紊乱。
单链DNA测序的两个策略是DNA移位通过所述纳米孔，从顺面到反面以及从反面到顺面，顺着或逆着施加电位。最有利的链测序机制是单链DNA在施加的电位下受控移位通过所述纳米孔。可渐进或持续地对双链DNA起作用的外切核酸酶可在所述孔的顺面使用以在施加的电势下将其余的单链送入，或者在反向电位下在反面使用。同样，可解开双链DNA的解旋酶也可以类似的方式使用。还可能存在需要链移位逆着所施加电位的测序应用，所述DNA必须首先被所述酶在反向电位或没有电位的情况下“捕捉”。结合之后顺着所述电位然后被转换回来，所述链将从顺面到反面通过所述孔并被所述电流保持为展开的构象。所述单链DNA外切核酸酶或单链DNA依赖的聚合酶可以起到分子马达的作用以将最近移位的单链以受控制的逐步方式从反面到顺面，逆着所施加的电位拉回通过所述孔。
基于外切核酸酶的方法
在一个实施方案中，表征靶核酸序列的方法涉及使所述靶序列与外切核酸酶接触。上文详述的任何外切核酸酶可以用于所述方法。所述外切核酸酶从所述靶序列的一个末端释放个体核苷酸。所述酶可以如上文所详述共价地连接到所述孔。
外切核酸酶是通常抓住核酸序列的一个末端并从该末端一次消化所述序列的一个核苷酸的酶。所述外切核酸酶可以以5’到3’方向或3’到5’方向消化核酸。所述外切核酸酶结合的核酸的末端一般通过选择所使用的酶和/或使用本领域已知方法确定。在核酸序列任一末端的羟基或帽结构一般可被用于阻止或有利于外切核酸酶结合到所述核酸序列的具体末端。
所述方法涉及使所述核酸序列与外切核酸酶接触，使得从所述核酸的末端以使得可如上文详述表征或鉴定一部分核苷酸的速率消化所述核苷酸。这么做的方法是本领域熟知的。例如，埃德曼（Edman）降解被用于从多肽的末端连续消化单个氨基酸，使得可以使用高效液相色谱（HPLC）鉴定它们。类似的方法可以用于本发明。
所述外切核酸酶发挥功能的速率一般慢于野生型外切核酸酶的最佳速率。在本发明的方法中所述外切核酸酶的适合活性速率包括每秒消化0.5-1000个核苷酸，每秒消化0.6-500个核苷酸，每秒消化0.7-200个核苷酸，每秒消化0.8-100个核苷酸，每秒消化0.9-50个核苷酸或每秒消化1-20或10个核苷酸，所述速率优选为每秒1、10、100、500或1000个核苷酸。外切核酸酶活性的适合速率可以以多种方式实现。例如，本发明可以使用具有降低的最佳活性速率的变体外切核酸酶。
Msp和Phi29DNA聚合酶
在优选实施方案中，使用衍生自Msp的孔和Phi29DNA聚合酶进行表征，例如链测序。所述方法包括（a）使所述靶序列与衍生自Msp的孔和Phi29DNA聚合酶接触，使得所述聚合酶控制所述靶序列运动通过所述孔并且所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用，和（b）在每次相互作用过程中测量通过所述孔的电流，从而表征（例如确定）所述靶序列的序列，其中进行步骤（a）和（b）时跨越所述孔施加有电压。当所述靶序列与Phi29DNA聚合酶和衍生自Msp的孔接触时，所述靶序列首先与Phi29DNA聚合酶形成复合体。当跨越所述孔施加电压时，所述靶序列/Phi29DNA聚合酶复合体与所述孔形成复合体并且控制所述靶序列运动通过所述孔。
该实施方案具有三个意料之外的优点。第一，所述靶序列以商业上可行且允许有效测序的速率运动通过孔。所述靶序列比其运动通过溶血素孔更快地运动通过所述Msp孔。第二，当所述核酸运动通过孔时观察到电流范围增加，使得更容易确定所述序列。第三，当具体孔和聚合酶一起使用时观察到电流变化减少，从而提高信噪比。
可表征或测序上文所述的任何核酸序列。至少部分的所述核酸序列优选是双链。
所述孔可以是上文详述的任何孔。所述孔优选为本发明的孔。所述孔可以包含八个含有SEQ ID NO:2、16、17或18示出的序列或其变体的单体。所述孔不一定包括本发明的任何突变。
野生型Phi29DNA聚合酶具有聚合酶和外切核酸酶活性。其还可以在恰当条件下解开双链核酸。因此，所述酶可以以三种模式工作。这在下文中更详细地详述。
所述Phi29DNA聚合酶可包含SEQ ID NO:4示出的序列或其变体。SEQ ID NO:4的变体是具有从SEQ ID NO:4的氨基酸序列变化而来并保留核酸结合活性的氨基酸序列的酶。所述变体必须在下文详述的三种模式中的至少一种下工作。优选地，所述变体在全部三种模式下工作。所述变体可以包括有利于处理核酸和/或有利于其在高盐浓度和/或室温下的活性的改变。
在SEQ ID NO:4的氨基酸序列的全长上，基于氨基酸同一性，变体优选与该序列至少40%同源。更优选地，基于氨基酸同一性，所述变体多肽与SEQ ID NO:4的氨基酸序列在整个序列上可以至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%，更优选至少95%、97%或99%同源。在200或更多个，例如230、250、270或280或更多个连续氨基酸的序列段上可以有至少80%，例如至少85%、90%或95%的氨基酸同一性（“严格同源性”）。同源性可如上文所述确定。参照SEQ ID NO:2，所述变体可以以上述任何方式不同于野生型序列。所述酶可以如上文所详述共价地连接到所述孔。
该优选实施方案可以使用上文详述的任何系统、装置或条件。所述盐浓度一般为0.15M至0.6M。所述盐优选KCl。
所述方法可以基于所述Phi29DNA聚合酶的三种模式以三种优选方式之一进行。每种方式包括对所述序列进行校对读取的方法。第一，所述方法优选使用Phi29DNA聚合酶作为聚合酶来进行。在该实施方案中，步骤（a）和（b）在游离核苷酸和酶辅因子的存在下进行，使得所述聚合酶使所述靶序列逆着施加的电压产生的场运动通过所述孔。所述靶序列以5’到3’方向运动。所述游离核苷酸可以是上文详述的个体核苷酸的任一种或多种。所述酶辅因子是使得所述Phi29DNA聚合酶作为聚合酶或外切核酸酶发挥功能的因子。所述酶辅因子优选为二价金属阳离子。所述二价金属阳离子优选为Mg2+、Mn2+、Ca2+或Co2+。所述酶辅因子最优选为Mg2+。所述方法优选还包括（c）除去所述游离核苷酸，使得所述聚合酶使所述靶序列顺着施加的电压产生的场运动通过所述孔（即以3’到5’方向）并且所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用，和（d）在每次相互作用过程中测量通过所述孔的电流，从而对步骤（b）中获得的靶序列的序列进行校对读取，其中步骤（c）和（d）进行时跨越所述孔也施加有电压。
第二，所述方法优选使用Phi29DNA聚合酶作为外切核酸酶来进行。在该实施方案中，其中步骤（a）和（b）在不存在游离核苷酸但存在酶辅因子下进行，使得所述聚合酶使所述靶序列顺着施加的电压产生的场运动通过所述孔。所述靶序列以3’到5’方向运动。所述方法优选还包括（c）添加游离核苷酸，使得所述聚合酶使所述靶序列逆着施加的电压产生的场运动通过所述孔（即以5’到3’方向）并且所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用，和（d）在每次相互作用过程中测量通过所述孔的电流，从而对步骤（b）中获得的靶序列的序列进行校对读取，其中步骤（c）和（d）进行时跨越所述孔也施加有电压。
第三，所述方法优选使用Phi29DNA聚合酶以解链模式进行。在该实施方案中，步骤（a）和（b）在不存在游离核苷酸和酶辅因子下进行，使得所述聚合酶控制所述靶序列顺着施加的电压产生的场运动通过所述孔（因为所述靶序列被解开）。在该实施方案中，所述聚合酶像制动器一样起作用，阻止所述靶序列在所施加的电压得的影响下太快地运动通过所述孔。所述方法优选还包括（c）降低跨越所述孔施加的电压，使得所述靶序列以与步骤（a）和（b）中相反的方向运动通过所述孔（即因为其再退火），并且所述靶序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用，和（d）在每次相互作用过程中测量通过所述孔的电流，从而对步骤（b）中获得的靶序列的序列进行校对读取，其中步骤（c）和（d）进行时跨越所述孔也施加有电压。
本发明还提供了一种形成用于对靶核酸序列测序的传感器的方法，包括（a）使衍生自Msp的孔与Phi29DNA聚合酶在所述靶核酸序列的存在下接触，（b）跨越所述孔施加电压以形成所述孔和所述聚合酶之间的复合体，从而形成用于对所述靶核酸序列测序的传感器。本发明还提供了一种提高Phi29DNA聚合酶的活性速率的方法，包括使所述Phi29DNA聚合酶与衍生自Msp的孔在核酸序列的存在下接触，并且跨越所述孔施加电压以形成所述孔和所述聚合酶之间的复合体，从而提高Phi29DNA聚合酶的活性速率。
试剂盒
本发明还提供了用于表征（例如测序）靶核酸序列的试剂盒。一个试剂盒包含（a）本发明的孔和（b）核酸处理酶。另一个试剂盒包含（a）衍生自Msp的孔和（b）Phi29DNA聚合酶。参照本发明的方法在上文详述的任何实施方案同样适用于本发明的试剂盒。
本发明的试剂盒可额外地包含一种或多种能够使上述任何实施方案实施的其他试剂或仪器。这种试剂或仪器包括如下的一种或多种：适合的缓冲液（水性溶液）、从受试者获得样品的工具（例如包含针的管或器具）、扩增和/或表达多核苷酸序列的工具、如上定义的膜或电压箝或膜片箝装置。试剂可以以干燥状态存在于所述试剂盒中，使得流体样品重悬所述试剂。所述试剂盒还可任选地包含能够使所述试剂盒用于本发明的方法的说明书或关于所述方法可以用于的患者的详细说明。所述试剂盒可任选地包含核苷酸。
装置
本发明还提供了一种用于表征（例如测序）样品中的靶核酸序列的装置。所述装置可包含（a）多个本发明的孔以及（b）多个核酸处理酶。或者，本发明可以包含多个衍生自Msp的孔和多个Phi29DNA聚合酶。所述装置可以是用于分析分析物的任何常规装置，例如阵列或芯片。
所述装置优选包含：
能够支持所述多个孔并可操作以使用所述孔和酶进行核酸表征或测序的传感器装置；
-至少一个用于容纳用于进行所述表征或测序的材料的贮器；
-配置用于将材料可控制地从至少一个贮器供应到所述传感器装置的流控技术系统；和
-多个用于接受各个样品的容器，被配置用于将所述样品选择性地从所述容器供应到所述传感器装置的流控技术系统。所述装置可以是描述于国际申请PCT/GB10/000789（公开为WO2010/122293）、国际申请PCT/GB10/002206（未公开）或国际申请PCT/US99/25679（公开为WO00/28312）中的任一种。
如下实施例解释本发明：
实施例1
同源寡聚体是其中所有单体单元均相同的孔。因为所述单体单元会自组装，所以这是产生的最简单的构建体。发明人用于改善碱基阅读性质的策略可被分为如下类别：
●空间（增加或减少氨基酸残基的大小)
●电荷（引入+ve电荷以与DNA相互作用）
●氢键合（可以以氢键结合到碱基对的残基)
●π堆叠（通过离位π电子系统相互作用的氨基酸）
增加空间/π堆叠（所有均为NNN-RRK背景）：
空间-替换为大体积残基（例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、组氨酸）
π堆叠-替换为芳香族残基（例如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、组氨酸）
在以下所有的表（6-11）中，示出了对SEQ ID NO:2所作的突变。B1=SEQ ID NO:2。
表6
| MS-(B1-D91Y)8 | 大体积的酪氨酸在收缩部处。 |
| MS-(B1-D90G/D91Y)8 | 大体积的酪氨酸在收缩部处、桶减小。 |
| MS-(B1-D90Y/D91G)8 | 大体积的酪氨酸在收缩部处、桶减小。 |
| MS-(B1-I05Y)8 | 突变恰好在桶上方以增加尺寸。 |
空间减小—替换为较小体积的残基（例如丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸）
表7
| MS-(B1-D90G/D91G)8 | 桶中的空间减少 |
| MS-(B1-I05A)8 | 突变恰好在桶上方以减少尺寸。 |
| MS-(B1-I05G)8 | 突变恰好在桶上方以减少尺寸。 |
电荷—替换为带正电的残基（例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸）
表8
| MS-(B1-D90R)8 | 带电的精氨酸在收缩部处。 |
| MS-(B1-D91R)8 | 带电的精氨酸在收缩部处。 |
| MS-(B1-D90R/D91R)8 | 双精氨酸在收缩部处。 |
| MS-(B1-D90K)8 | 带电的赖氨酸在收缩部处。 |
| MS-(B1-D91K)8 | 带电的赖氨酸在收缩部处。 |
| MS-(B1-D90K/D91K)8 | 双赖氨酸在收缩部处。 |
氢键合—替换为有键合能力的残基（例如天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、组氨酸）
表9
| MS-(B1-D90Q)8 | 谷氨酰胺在收缩部处。 |
| MS-(B1-D91Q)8 | 谷氨酰胺在收缩部处。 |
| MS-(B1-D90Q/D91G)8 | 谷氨酰胺在收缩部处，尺寸减少。 |
| MS-(B1-D90G/D91Q)8 | 谷氨酰胺在收缩部处，尺寸减少。 |
| MS-(B1-D90Q/D91Q)8 | 双谷氨酰胺在收缩部处。 |
表10
| MS-(B1-D118N)8 | 除去管腔中间的电荷。 |
| MS-(B1-D118A)8 | 除去管腔中间的电荷。 |
同源寡聚体还可被修饰以含有反应基团，然后可对其进行化学修饰。
表11
| MS-(B1-D91C)8 | 在桶处添加半胱氨酸。 |
| MS-(B1-D90C) | 在桶处添加半胱氨酸。 |
实施例2
可以组合不同的单体单元以形成新的寡聚体孔。当所述寡聚体含有多于一种不同亚基时（例如MS-(MutA)6(MutB)1(MutC)1），所述孔为异源寡聚体。异源寡聚体一般仅具有一个修饰的单元（例如MS-(MutA)7(MutB)1）。还可以形成其他比例的异源寡聚体（例如MS-(MutA)6(MutB)2）。亚基还可包括SEQ ID NO:2。
异源寡聚体的优点是可以对所述孔作单个的化学改变（而不是将改变引入到每个单体单元）。这种对所述结构的改变相比同源寡聚体来说不太急剧并且可以使得在同源寡聚体不能引入残基的位置上将残基引入到所述孔。与多个单元相比，与所述DNA相互作用的单个残基可能是有利的（例如异源八聚体上的单个Arg，与八聚体上的八个Arg相比）。突变体还可被组合以在相同的残基上产生不同的效果，这种实例之一是减小七个单元的尺寸，同时增加一个的尺寸（例如MS-(D90G)8(D90Y)1）。
突变体设计规则与上述的同源寡聚体的规则类似。
引入单个空间残基
表12
引入单个带电残基
表13
引入单个反应残基
表14
实施例3
引入用于化学修饰的单个反应残基。
表15
实施例4
下表概括了本发明的突变型孔。第一个表涉及同源寡聚体，第二个表涉及异源寡聚体。
表16
表17
实施例5—MspA与HL相比
发明人已经将作为分子马达的Phi29DNA聚合酶（DNAP）与突变型MspA纳米孔结合以使得可控制DNA链运动通过所述孔。跨越所述孔施加电压，从在所述纳米孔任一侧的盐溶液中离子运动产生了电流。随着所述DNA运动通过所述孔，通过所述孔的离子流随着所述DNA而改变。这种信息已被表明是序列依赖性的。
发明人比较了变体形式的溶血素与MspA，尤其是MS-(B1)8。与溶血素（HL）相比，MspA的电流范围更大。另外，当DNA的链穿入所述孔时，MspA的电流范围也更大。
发明人已经表明，通过将所述MspA和Phi29DNAP放在一起，MspA具有了许多预料不到的令人惊奇的特征。主要不同是：
1.与HL相比链运动更快（解链模式）。
2.当使链运动通过所述孔时电流范围增大。
3.与HL突变体相比电流水平的变化减小。
链运动更快
134mer ssDNA模板（SEQ ID NO:13）与84mer ssDNA（SEQ ID NO:14）杂交以形成具有50mer ssDNA5’悬臂的84mer dsDNA模板。使用Phi29DNAP以解链模式使这条链运动通过MS-(B1)8MspA突变体和溶血素突变体。需要运行两次；一次在400mM KCl下，另一次在600mMKCl下，都在室温，有10mM Hepes，pH8.0，1mM EDTA，1mM DTT。对每个突变型构建体优化所施加的电位；HL以220mV运行，MspA以180mV运行。
提取电流水平作为所述DNA在酶结合状态的事件，对这些事件建立索引并记录所述事件的电流水平、持续时间和变化。
对于所有的解链运行，解链的速度在所述链中是不一致的。这可以通过计算所述事件持续时间（由事件索引分四等分）的平均值来表明（图1）。第一个四分之一提供了持续时间比之后的四分之一长很多的事件，这对于HL和MspA来说都是如此。对于第一个四分之一，对于MspA来说在400mM KCl下平均事件长度是最短的，对于HL来说600mM下是最短的。但是，在Q2、Q3和Q4中，对于两种盐条件所述MspA都产生了更短的事件。假定信噪比是足够的，短事件是合乎需要的，因为它们指示了所述DNA链快速运动通过所述孔，因此可增加实验通量。
电流范围增大和变化减小
在此描述的纳米孔实验中，所述电流水平主要依赖于盐浓度、施加的电压和温度。以设定的物理条件：600mM KCl、10mM Hepes、1mM EDTA、1mM DTT、pH8.0、+220mV，使用Phi29DNA聚合酶以解链模式比较了HL和MS-(B1)8MspA突变体。该实验中使用的DNA是具有34mer单链5’悬臂的100mer发夹（SEQ ID NO:15）。在室温进行所述运行。
提取电流水平作为所述DNA在酶结合状态的事件，对这些事件建立索引并记录所述事件的电流水平、持续时间和变化（图2和3）。
从这些实验清楚地看到，与电流范围为约20pA的HL突变体相比，所述MspA突变体给出了约50pA的显著更大的电流范围（图2和3）。大电流范围是有利的，因为其提供了更大的信噪比并使得更容易区分不同的电流状态。这对其中N个碱基可产生电流信号，导致4N个可能的电流状态的测序应用是尤其有利的。
与HL相比，MspA突变体的状态变化也减小了。这可被以上的迹线中事件的标准差所表明（图2和3）。对于上述链，MspA链的所有事件之间的平均标准差为3.6，相比之下HL为4.5。需要小的状态变化以使得可精确估计事件电流水平。
实施例6—MS-(B1)8基线与MS-(B1-I105)8突变体的开孔电流比较
MspA孔的电流水平可通过突变所述蛋白中的I105位置而控制。发明人已经证明，由于对所述MspA单体作了单个突变，所述开孔电流可增加达超过80%。
在如下条件下：400mM KCl、10mM Hepes、pH8.0、室温，将单个通道插入到脂质膜中。在施加的-200mV到200mV电位范围内记录开孔电流水平以产生IV曲线。对多个孔重复所述实验以评估所述样本的分布。可以看见IV曲线运行的数据的实例（图4）。
在发明人的实验中，基线MS-(B1)8突变体产生了在+160mV下具有约150pA的开孔电流的孔（图5）。
用MS-(B1-I105Y)8突变体重复所述实验，其展现出大量的具有更高剩余电流的孔。对于这些通道，开孔电流在+160mV下为约200pA（图6）。
用MS-(B1-I105N)8突变体重复所述实验，其展现出两个主要的电流水平分布。16个孔中的十个给出了紧凑分布的更高的剩余电流。对于这些通道，开孔电流在+160mV下为约280pA（图7）。
实施例7—自发改变电导的MS-(B1-I105A)8孔
在电记录实验中已经观察到MspA突变体孔可自发改变电导。
使用MS-(B1-I105A)8突变体孔，按实施例6所述获得电测量结果。
单个MspA突变体孔能够在高和低电导状态之间自发地交替改变（图8）。这表明，对MspA作出的所述突变使得出现在基线MS-(B1)8孔中很少观察到的构象改变。可能在I105位置的突变使所述孔的高电导状态稳定。
实施例8—当DNA运动通过基线MS-(B1)8孔和MS-(B1-I105A)8孔时比较DNA电流
以设定的物理条件：400mM KCl、10mM Hepes、1mM EDTA、1mM DTT、pH8.0、+180mV，使用Phi29DNA聚合酶以解链模式比较了MS-(B1)8孔和MS-(B1-I105N)8孔。该实验中使用的DNA是具有34mer单链5’悬臂的100mer发夹（SEQ ID NO:15）。在室温进行所述运行。
提取电流水平作为所述DNA在酶结合状态的事件，对这些事件建立索引并记录所述事件的电流水平、持续时间和变化。
在这些条件下，所述DNA链运动通过MS-(B1)8突变体的电流水平范围为约30pA（图9）。使用MS-(B1-I105A)8突变体重复同样的实验，对同样的DNA链展示出的电流水平范围为约40pA（图10）。需要MS-(I105A)8突变体的更大电流范围，以区分核苷酸在所述纳米孔内的结合。
实施例9—MS-(B1)8基线与MS-(B1-L88N)8突变体的信号噪声比较
MspA孔的噪声水平可通过突变所述MspA单体序列中的L88位置来控制。已经证明，由于对所述MspA单体作单个突变，所述噪声水平可被减少达19%。
该实施例通过使用解旋酶控制完整DNA链运动通过纳米孔，以移位模式比较了MS-(B1)8孔和MS-(B1-L88N)8孔。
材料
设计引物以扩增PhiX174的约400bp片段。这些引物的5'末端各自包括50个核苷酸的非互补区，其为10个核苷酸的同聚物区段的同聚物序列段或重复单元。这些充当所述链受控移位通过纳米孔的标识符，以及确定移位的方向性。另外，正向引物的5'末端被“加帽”以包括四个2'-O-甲基-尿嘧啶（mU）核苷酸，反向引物的5'末端被化学磷酸化。然后，这些引物修饰可使得使用λ外切核酸酶进行仅反义链占优势的受控消化。所述mU加帽可保护正义链不受核酸酶消化，同时反义链5’的PO4促进消化。因此，在以λ外切核酸酶孵育后，现在仅双链体的正义链作为单链DNA（ssDNA）保持完整。然后，按前所述PAGE纯化所产生的ssDNA。
用于该实验的DNA底物设计在图11示出（SEQ ID NO:19和20（下文示出序列和标签））。所述DNA底物由来自PhiX的ssDNA的400个碱基区段组成，带有50T5’前导序列以帮助被所述纳米孔捕获。退火到该链紧接50T前导序列之后的是含有3'胆固醇标签（3’胆固醇-TEG）的引物以在所述双层的表面富集所述DNA，并因此改善捕获效率。
SEQ ID NO:19
mUmUmUmUTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTTGTTTCTGTTGGTGCTGATATTGCTTTTGATGCCGACCCTAAATTTTTTGCCTGTTTGGTTCGCTTTGAGTCTTCTTCGGTTCCGACTACCCTCCCGACTGCCTATGATGTTTATCCTTTGAATGGTCGCCATGATGGTGGTTATTATACCGTCAAGGACTGTGTGACTATTGACGTCCTTCCCCGTACGCCGGGCAATAACGTTTATGTTGGTTTCATGGTTTGGTCTAACTTTACCGCTACTAAATGCCGCGGATTGGTTTCGCTGAATCAGGTTATTAAAGAGATTATTTGTCTCCAGCCACTTAAGTGAGGTGATTTATGTTTGGTGCTATTGCTGGCGGTATTGCTTCTGCTCTTGCTGGTGGCGCCATGTCTAAATTGTTTGGAGGCGGTC
SEQ ID NO:20（加有3’胆固醇-TEG标签）
GCAATATCAGCACCAACAGAAACAACCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT/3CholTEG/
实验方法
缓冲溶液：400mM NaCl、10mM Hepes pH8.0、1mM ATP、1mM MgCl2、1mM DTT
纳米孔：MS(B1)8MspA；
MS(B1-L88N)8MspA
酶：解旋酶
从插入到1,2-二植烷基-丙三基-3-磷酸胆碱脂（1,2-diphytanoyl-glycero-3-phosphocholine lipid，Avanti Polar Lipids）双层中的单个MspA纳米孔获得了电测量结果。经Montal-Mueller技术在20μm厚的PTFE膜（在定制的Delrin腔室中）中跨越约100μm直径的孔形成双层，分开两份1mL缓冲溶液。所有实验在所述的缓冲溶液中进行。在配备有1440A数字化仪的Axopatch200B放大器（Molecular Devices）上测量单通道电流。Ag/AgCl电极被连接到所述缓冲溶液使得使顺面区室（向其中加入纳米孔和酶/DNA）连接到Axopatch前级探头的地极，反面区室连接到所述前级探头的活性电极。
在所述双层中完成MS(B1)8或MS(B1-L88N)8的单孔后，将DNA多核苷酸（SEQ IDNO:19和20）和解旋酶加入到100μL缓冲液中并预孵育5分钟（DNA=1.5nM、酶=1μM）。将该预孵育混合物加入到所述电生理学腔室的顺面区室中的900μL缓冲液中，以起始所述MspA纳米孔中解旋酶-DNA复合体的捕获（以得到DNA=0.15nM、酶=0.1μM的终浓度）。根据需要通过向所述顺面区室中加入二价金属（1mM MgCl2）和NTP（1mM ATP）来起始解旋酶ATP酶活性。在+140mV的恒定电位下进行实验。提取电流水平作为所述DNA在酶结合状态的事件，对这些事件建立索引并记录所述事件的电流水平、持续时间和变化。
使用所述MspA孔MS-(B1)8，所检测到的事件的31.08%在施加的+140mV电位下具有>2.0的标准差（另外的数据概括在表18中）。以所述MS-(B1-L88N)8突变体重复所述实验，其中所检测到的事件仅12.38%在施加的+140mV电位下呈现出>2.0的标准差（另外的数据概括在表18中）。因此，在所述MspA单体序列中的L88处的点突变降低了所观察到的噪声范围达19%。
表18
实施例10—MS-(B1)8基线与MS-(B1-L88N)8、MS-(B1-L88S)8和MS-(B1-L88Q)8突
变体的信号噪声比较
MspA孔的噪声水平可通过突变所述蛋白中的L88位置而改变。已经证明，由于对所述MspA单体作单个突变，所述噪声水平可被减小。
该实施例通过使用Phi29DNA聚合酶来控制完整DNA链运动通过纳米孔，以解链模式比较了MS-(B1)8孔和MS-(B1-L88N)8、MS-(B1-L88S)8和MS-(B1-L88Q)8孔。在该实施例中描述的用于所有实验中的DNA底物设计在图12示出（SEQ ID NO:21、22和23）。用如下示出的IDT Int间隔物9（iSp9）和3’胆固醇-TEG（3CholTEG）给SEQ ID NO:23加标签。在室温、+180mV的施加电位下进行所述运行。
SEQ ID NO:23:
CAGCGATGGAGATAC/iSp9//3CholTEG/
实验方法
缓冲溶液：400mM KCl、10mM Hepes pH8.0、1mM EDTA、1mM DTT
纳米孔：MS(B1)8MspA；
MS(B1-L88N)8MspA；
MS(B1-L88S)8MspA；
MS(B1-L88Q)8MspA；
酶：Phi29DNA聚合酶SEQ ID NO:4
按实施例9所述获得电测量结果。在所述双层中完成MS(B1)8、MS(B1-L88N)8、MS(B1-L88S)8或MS(B1-L88Q)8的单孔后，将DNA多核苷酸（SEQ ID NO:21、22和23）和Phi29DNA聚合酶加入到100μL缓冲液中并预孵育5分钟。将该预孵育混合物加入到所述电生理学腔室的顺面区室中的900μL缓冲液中以起始所述MspA纳米孔中聚合酶-DNA复合体的捕获（以得到DNA=0.5nM、酶=0.1μM的终浓度）。以+180mV的恒定电位进行实验。对所述DNA在酶结合状态时观察到的电流水平建立索引，并记录所述电流水平、其持续时间和变化。
在实验中，基线MS-(B1)8突变体在+180mV下呈现出高水平的噪声（标准差>2.0的为76.15%，见表19）。测试的在位置L88处具有单点突变的其他三个突变体(MS-(B1-L88N)8、MS-(B1-L88S)8和MS-(B1-L88Q)8在相同的DNA链序列上全部都观察到比所述基线孔更低的噪声水平（见表19）。因此，可以通过在MspA单体序列中应用位置L88处的点突变来降低信号噪声。
表19
| 孔 | 平均S.D | 中位数S.D | S.D.的%＞2 |
| MS-(B1)8 | 3.26 | 2.89 | 76.15 |
| MS-(B1-L88N)8 | 3.22 | 2.60 | 74.18 |
| MS-(B1-L88S)8 | 3.12 | 2.33 | 71.71 |
| MS-(B1-l88Q)8 | 3.30 | 2.46 | 74.19 |
实施例11—MS-(B1)8基线与其他MspA突变体的总信号范围比较
可以通过突变MspA蛋白单体序列中的多个位置增加MspA孔的信号范围。
该实施例通过使用Phi29DNA聚合酶来控制完整DNA链运动通过纳米孔，以解链模式比较了MS-(B1)8孔和如下的孔——MS-(B1-D90Q)8、MS-(B1-I105L)8、MS-(B1-I105Y)8、MS-(B1-I89Y-D90S)8、MS-(B1-N86T)8和MS-(B1S103G)8孔。在该实施例中描述的用于所有实验中的DNA底物设计在图12示出（SEQ ID NO:21、22和23）。上文示出了加有标签iSp9和3CholTEG的SEQ ID NO:23。在室温、施加的+180mV电位下进行所述运行。对所述DNA在酶结合状态时观察到的电流水平建立索引，并记录所述电流水平、其持续时间和变化。
实验方法
缓冲溶液：400mM KCl、10mM Hepes pH8.0、1mM EDTA、1mM DTT
纳米孔：MS(B1)8MspA；
MS(B1-D90Q)8MspA；
MS-(B1-I105L)8MspA；
MS-(B1-I105Y)8MspA；
MS-(B1-I89Y-D90S)8MspA；
MS-(B1-N86T)8MspA；
MS-(B1-S103G)8MspA；
酶：Phi29DNA聚合酶SEQ ID NO:4
按实施例10所述获得电测量结果。在所述双层中完成MS(B1)8、MS(B1-D90Q)8、MS(B1-I105L)8、MS(B1-I105Y)8、MS-(B1-I189Y-D90S)8、MS-(B1-N86T)8或MS-(B1-S103G)8的单孔后，将DNA多核苷酸（SEQ ID NO:21、22和23）和Phi29DNA聚合酶加入到100μL缓冲液中并预孵育5分钟。将该预孵育混合物加入到所述电生理学腔室的顺面区室中的900μL缓冲液中，以起始所述MspA纳米孔中聚合酶-DNA复合体的捕获（以得到DNA=0.5nM、酶=0.1μM的终浓度）。在+180mV的恒定电位下进行实验。对所述DNA在酶结合状态时观察到的电流水平建立索引，并记录所述电流水平、其持续时间和变化。
在所述实验中，基线MS-(B1)8突变体在+180mV下呈现出35pA的最大范围（表20）。测试的其他6个突变体（MS-(B1-D90Q)8、MS-(B1I105L)8、MS-(B1-I105Y)8、MS-(B1-I89Y-D90S)8、MS-(B1-N86T)8和MS-(B1S103G)8）在相同的DNA链序列上全部都观察到比所述基线孔更大的最大范围（见表20）。因此，可以通过在MspA单体序列中的多个位置应用点突变来增加信号范围。
表20
实施例12—MS-(B1)8基线与其他MspA突变体的总测序谱比较
可以通过突变MspA蛋白单体序列中的多个位置来控制MspA孔的测序谱。
该实施例通过使用解旋酶来控制完整DNA链运动通过纳米孔，以移位模式比较了MS-(B1)8孔和MS-(B1-D90Q-D93S-I105A)8、MS-(B1-D90Q-Q126R)8、MS-(B1-L88N-D90Q-D91M)8、MS-(B1-L88N-D90Q-D91S)8和MS-(B1-G75S-G77S-L88N-Q126R)8孔。
实验方法
缓冲溶液：400mM NaCl、10mM Hepes pH8.0、1mM ATP、1mMMgCl2、1mM DTT
纳米孔：MS(B1)8MspA；
MS(B1-D90Q-D93S-I10SA)8MspA；
MS(B1-D90Q-Q126R)8MspA；
MS(B1-L88N-D90Q-D91M)8MspA；
MS(B1-L88N-D90Q-D91S)8MspA；
MS(B1-G75S-G77SL88N-Q126R)8MspA；
酶：解旋酶
按实施例9所述进行实验设置。在所述双层中完成MS-(B1)8、MS-(B1-D90Q-D93S-I105A)8、MS-(B1-D90Q-Q126R)、MS-(B1-L88N-D90Q-D91M)8、MS-(B1-L88N-D90Q-D91S)8或MS-(B1-G75S-G77S-L88N-Q126R)8的单孔后，将DNA多核苷酸（SEQ ID NO:19和20（序列和标签如上文所示））和解旋酶加入到100μL缓冲液中并预孵育5分钟（DNA=1.5nM、酶=1μM）。将该预孵育混合物加入到所述电生理学腔室的顺面区室中的900μL缓冲液中，以起始所述MspA纳米孔中解旋酶-DNA复合体的捕获（以得到DNA=0.15nM、酶=0.1μM的终浓度）。根据需要通过向所述顺面区室中加入二价金属（1mM MgCl2）和NTP（1mM ATP）以起始解旋酶ATP酶活性。在+140mV的恒定电位下进行实验。对所述DNA在酶结合状态时观察到的电流水平建立索引，并记录所述电流水平、其持续时间和变化。
在所述实验中，基线MS-(B1)8突变体产生了图13a所示的测序谱。用以下突变体MS-(B1-D90Q-D93S-I105A)8、MS-(B1-D90Q-Q126R)、MS-(B1-L88N-D90Q-D91M)8、MS-(B1-L88N-D90Q-D91S)8和MS-(B1-G75S-G77S-L88N-Q126R)8重复所述实验，其呈现出多种不同的测序谱（见图13b-f）。因此，通过在MspA单体序列的多个位置作点突变，有可能改变所检测到的测序谱。
实施例13—使用MS-(B1)8基线孔分析RNA链序列
该实施例描述了MspA基线孔MS-(B1)8与Phi29DNA聚合酶结合可如何用于对RNA的链测序。
该实施例通过使用Phi29DNA聚合酶来控制完整RNA链运动通过纳米孔，以解链模式使用MS-(B1)8孔。用于该实验的RNA/DNA杂合体底物设计在图14示出（SEQ ID NO:24和25）。SEQ ID NO:24和25在下文提供（RNA为粗体）。在室温，施加的+180mV电位下进行所述运行。
SEQ ID NO:24：
5’OH-
CCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCCCCCCCCCCCCC
SEQ ID NO:25（加有胆固醇标签)：5’Ph0s-
A-3’Chal
材料
为了合成所述RNA/DNA杂交链（长度为120mer），有必要将SEQ ID NO:24和25连接在一起。这通过如下方式实现的，即使用互补DNA接头链SEQ ID NO:26以使所述两条链紧密接近，在此它们随后连接在一起，形成所述120mer DNA/RNA杂合体SEQ ID NO:27。
SEQ NO:27（加有胆固醇标签；RNA为粗体）：
5'OH-
CCCCCCCCCCCCCCCACCCCCCCCCCCCCCCCCC A-3'Chol
实验方法
缓冲溶液：400mM KCl、10mM Hepes pH8.0、1mM EDTA、1mM DTT
纳米孔：MS(B1)8MspA；
酶：Phi29DNA聚合酶SEQ ID NO:4
按实施例10所述获得电测量结果。在所述双层中完成MS(B1)8的单孔后，将DNA多核苷酸（SEQ ID NO:24和25）和Phi29DNA聚合酶加入到100μL缓冲液中并预孵育5分钟。将该预孵育混合物加入到所述电生理学腔室的顺面区室中的900μL缓冲液中，以起始所述MspA纳米孔中聚合酶-DNA复合体的捕获（以得到DNA=0.2nM、酶=0.2μM的终浓度）。在+180mV的恒定电位进行实验。提取电流水平作为所述DNA在酶结合状态的事件，对这些事件建立索引并记录所述事件的电流水平、持续时间和变化。
在所述实验中，与作为分子马达的Phi29DNA聚合酶结合的基线MS-(B1)8突变体被观察到在所述RNA链穿过所述孔时可检测到不同的电流水平。然后，这些电流信号被用于确定所述靶的序列。在Phi29DNA聚合酶解链模式中代表性RNA移位事件在图15示出。
实施例14—MspA二聚体和寡聚化以形成孔
该实施例描述了MspA二聚体的制备和寡聚化。
制备二聚体
MspA NNNRRK单体蛋白由184个氨基酸残基组成。设计单个多肽以制备二聚体形式的MspA-NNNRRK蛋白。
编码所述184个残基MspA-NNNRRK多肽的DNA序列被经短的DNA接头序列连接到编码所述相同多肽链的第二DNA序列。所述接头DNA序列编码SGSGSGDDDDDDDDSGSGSS（SEQ IDNO:33；显示为-(SG)3-D8-(SG)2(SS)-）。在紧接所述第一个碱基之前添加起始密码子（ATG），在最后的碱基之后添加编码两个终止密码子（TAATAG）的DNA。因此，编码MspA-NNNRRK-(SG)3-D8-(SG)2(SS)-MspA-NNNRRK的完整DNA序列在SEQ ID NO:28示出。
所述DNA在GenScript USA Inc合成并被克隆到pT7载体中用于表达目的。
通过使用用于环状DNA的大肠杆菌T7-S30提取物系统（Promega），通过体外偶联转录和翻译（IVTT）产生蛋白。
将没有半胱氨酸的完全1mM氨基酸混合物和没有甲硫氨酸的完全1mM氨基酸混合物等体积混合获得产生高浓度蛋白质所需要的工作氨基酸溶液。将所述氨基酸混合物（2.5.0μL）、预混合溶液（10μL）、[35S]L-甲硫氨酸（0.5μL）和利福平（2μL，50mg/mL）与质粒DNA（4μL，400ng/mL）和T7S30提取物（7.5μL）混合。在37℃进行合成90分钟，以产生25μLMspA-NNNRRK单体和二聚体的IVTT蛋白。反应后，将样品以25000g离心10分钟并丢弃上清。将片状沉淀物以100μL MBSA（10mM MOPS，150mM NaCl，pH7.4，含有1mg/mLBSA）洗涤并重悬在25μL Lamellae样品缓冲液中。将样品在10%凝胶上进行SDS-PAGE。将所述凝胶在80℃干燥45分钟并曝光到X-射线胶片2小时。所述凝胶显示出2条不同的带，一条对应所述MspA二聚体，一条对应所述MspA单体。
单体和二聚体寡聚化
在合成脂质囊泡的存在下分别进行所述二聚体和单体的表达以有利于寡聚化。使用了五种组分脂质混合物（10:10:20:30:30比例的PS:SM:PE:PC:胆固醇，25mg/mL）。将50μL脂质混合物在1.5mL eppendorf管中以25000g离心10分钟，丢弃上清。将没有半胱氨酸的完全1mM氨基酸混合物和没有甲硫氨酸的完全1mM氨基酸混合物等体积混合，以获得产生高浓度蛋白质所需要的工作氨基酸溶液。将膜片状沉淀物用氨基酸混合物（10.0μL）、预混合溶液（40μL）、[35S]L-甲硫氨酸和利福平（2μL，50mg/mL）重悬。加入质粒DNA（16μL，400ng/mL）和T7S30提取物（30.0μL）以起始合成。在37℃进行合成90分钟，以产生100μL IVTT蛋白。将IVTT反应样品离心（25000g，10分钟）并将所产生的膜片状沉淀物以MBSA洗涤，然后在7.5%凝胶上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将所述凝胶在watman3M纸上在50℃干燥3小时并曝光到X-射线胶片2小时。所述凝胶显示出寡聚化的MspA二聚体的8条不同的带，所有所述带在SDS PAGE中都比所述寡聚化的单体迁移得慢。
用于双层实验的蛋白纯化
将来自二聚体寡聚化实验的三条蛋白带从所述凝胶切除并进行纯化。使用放射自显影图作为模板，切下条带并在缓冲液（150-200μL的25mM Tris.HCl，pH8.0）中再水合。除去纸并使用研杵将所述凝胶块压碎。通过以25000×g离心10分钟使所述浆状物过滤通过QIAshredder柱（Qiagen）。然后，将从所述单体水平的第三条带得到的蛋白用于实施例15中描述的电生理学实验。
实施例15—比较从所述单体寡聚化的MS-(B1)8与从所述二聚体寡聚化的MS-(B1-
B1)4
该实施例通过使用解旋酶来控制完整DNA链（SEQ ID NO:19和20（序列和标签如上所示））运动通过纳米孔，以移位模式比较了从所述单体（SEQ ID NO:2）寡聚化的MS-(B1)8孔和从所述二聚体（SEQ ID NO:29）寡聚化的MS-(B1-B1)4孔。
实验方法
缓冲溶液：400mM NaCl、10mM Hepes pH8.0、1mM ATP、1mM MgCl2、1mM DTT
纳米孔：MS-(B1)8；
MS-(B1-B1)4
酶：解旋酶
使用镀银的128孔硅芯片（规格75μm直径，20μm深度和250μm间距）（WO2009/077734）获得电测量结果。最初将芯片以20mL乙醇洗涤，然后以20mL dH2O洗涤，然后以20mL乙醇洗涤，然后进行CF4等离子处理。然后，将使用的芯片通过浸涂进行预处理、真空密封并储存在4℃。使用之前将所述芯片回暖至室温至少20分钟。
双层通过使溶于1M KCl、10mM Tris，pH7.5中的3.6mg/mL1,2-二植烷基-丙三基-3-磷酸胆碱脂质（DPhPC，Avanti Polar Lipids，AL，USA）系列段以0.45μL/s横穿所述芯片来形成。最初，脂质段（250μL）流过所述芯片，然后是100μL空气段。然后是被100μL的空气段分开的两个另外的155μL和150μL的脂质溶液段通过所述芯片。双层形成后，用3mL缓冲液以3μL/s的流速冲洗所述腔室。用1.0pF的整合电容在10kHz下进行双层形成的电记录。
使用从所述单体寡聚化的MS-(B1)8孔或从所述二聚体寡聚化的MS-(B1-B1)4孔在10mM Tris、1mM EDTA，pH8.0中制备生物纳米孔的溶液。施加+180mV的控制电位，所述溶液流过所述芯片，使孔进入双层。然后，使采样率和整合电容分别维持在10kHz和1.0pF，将施加的电位降低至0。
运行施加+180mV保持电位的控制程序。将DNA多核苷酸（SEQ ID NO:19和20）和解旋酶预孵育5分钟。然后，使该预孵育混合物（包括MgCl2和ATP）流过所述芯片，以起始所述MspA纳米孔中解旋酶-DNA复合体的捕获（以得到DNA=1.5nM、酶=10nM的终浓度）。在+180mV的恒定电位下进行实验。提取电流水平作为所述DNA在酶结合状态的事件。对这些事件建立索引并记录所述事件的电流水平、持续时间和变化。
在所述实验中，从所述二聚体寡聚化形成的基线MS-(B1-B1)4突变体孔与从所述单体寡聚化形成的MS(B1)8孔一样有效地插入到脂双层中（见图16，示出了MS(B1)8和MS-(B1-B1)4的孔插入）。当所述单体和二聚体寡聚化的孔与作为分子马达的解旋酶结合时，有可能在所述DNA链穿过所述孔时检测到不同的电流水平。图17（从所述单体寡聚化形成的MS-(B1)8孔）和图18（从所述二聚体寡聚化形成的MS-(B1-B1)4孔）中示出了解旋酶移位模式中代表性的DNA移位事件。因此，从所述二聚体单元寡聚化的MS-(B1-B1)4孔突变体被发现是与从所述单体单元寡聚化的MS-(B1)8孔突变体一样好的孔。
实施例16—使用MS-(B1-L88N)8突变体MspA孔来从5-甲基胞嘧啶区分胞嘧啶
该实施例描述了MspA的MS-(B1-L88N)8突变体孔可以如何用于从胞嘧啶的表观遗传修饰的碱基5-甲基胞嘧啶区分胞嘧啶。该实验中使用的DNA底物设计在图19示出，具有如下序列：
TTTTTTTTT/idSp/TTTTTTTTmCTTTTTTTTCTTTTTTTTmCGTTTTTTTTCGTTTTTTTTGTATCTCCATCGCTGCCCCCTTTTTCCCCCTTTTT
（其为在5’末端有9T核苷酸和IDT Int d间隔物（idSp）的SEQ ID NO:30）。mC表示5-甲基胞嘧啶
GGCACCGATGGAGATACTTGAGGCGAGCCGTCAA(SEQ ID NO:31)和
5Cho1TEG/TTGACCGCTCGCCTC（有5’胆固醇-TEG标签的SEQ ID NO:32）。
材料
为形成图19所示的DNA链构建体，有必要将SEQ ID NO:30、31和32杂交在一起。这通过同时预孵育全部三条链来进行。
实验方法
缓冲溶液：1M KCl、10mM Hepes pH8.0、1mM ATP、1mM MgCl2、1mM DTT
纳米孔：MS(B1-L88N)8MspA
酶：解旋酶
按实施例9所述进行实验设置。在所述双层中完成MS-(B1-L88N)8的单孔后，将DNA多核苷酸（SEQ ID NO:30、31和32）和解旋酶加入到50μL缓冲液中并预孵育5分钟（DNA=5nM、酶=100μM）。将该预孵育混合物加入到所述电生理学腔室的顺面区室中的950μL缓冲液中，以起始所述MspA纳米孔中解旋酶-DNA复合体的捕获（以得到DNA=5nM、酶=100nM的终浓度）。根据需要通过向所述顺面区室中加入二价金属（1mM MgCl2）和NTP（1mM ATP）来起始解旋酶ATP酶活性。在+120mV的恒定电位下进行实验。提取电流水平作为所述DNA在酶结合状态的事件。对这些事件建立索引并记录所述事件的电流水平、持续时间和变化。
在所述实验中观察到，当在解旋酶的控制下移位通过所述MS-(B1-L88N)8孔时，胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶产生了不同的电流水平（见图20）。因此，使用这种突变形式的MspA有可能从胞嘧啶的表观遗传修饰的碱基5-甲基胞嘧啶区分胞嘧啶。
Claims (24)
1.一种包含SEQ ID NO:2示出的序列的变体的突变型Msp单体，其中所述变体包含替换L88N。
2.权利要求1的突变型Msp单体，其中所述变体还包含至少一种如下的替换：G75S、G77S和Q126R。
3.权利要求1或2的突变型Msp单体，其中所述变体还包含所有如下的替换：G75S、G77S和Q126R。
4.权利要求1的突变型Msp单体，其中所述变体还包含至少一种如下的突变：
(a)第90位为丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)或酪氨酸(Y)；
(b)第105位为亮氨酸(L)或丝氨酸(S)；
(c)第59位为精氨酸(R)；
(d)第78位为亮氨酸(L)；
(e)第81位为天冬酰胺(N)；
(f)第83位为天冬酰胺(N)；
(g)第86位为丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
(h)第87位为苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)或亮氨酸(L)；
(i)第89位为苯丙氨酸(F)、缬氨酸(V)或亮氨酸(L)；
(j)第90位为亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)或半胱氨酸(C)；
(k)第91位为丝氨酸(S)、谷氨酰胺(Q)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、异亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)、组氨酸(H)、苏氨酸(T)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、天冬酰胺(N)或半胱氨酸(C)；
(l)第92位为丙氨酸(A)或丝氨酸(S)；
(m)第93位为丝氨酸(S)、丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)；
(n)第94位为亮氨酸(L)；
(o)第95位为缬氨酸(V)；
(p)第96位为精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、缬氨酸(V)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
(q)第97位为丝氨酸(S)；
(r)第98位为丝氨酸(S)；
(s)第99位为丝氨酸(S)；
(t)第100位为丝氨酸(S)；
(u)第101位为苯丙氨酸(F)；
(v)第102位为赖氨酸(K)、丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；
(w)第103位为丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、甘氨酸(G)或苏氨酸(T)；
(x)第104位为异亮氨酸；
(y)第105位为酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、苏氨酸(T)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、组氨酸(H)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、脯氨酸(P)、或半胱氨酸(C)；
(z)第106位为苯丙氨酸(F)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)或丝氨酸(S)；
(aa)第108位为脯氨酸(P)或丝氨酸(S)；
(bb)第118位为天冬酰胺(N)；
(cc)第103位为丝氨酸(S)或半胱氨酸(C)；和
(dd)第10-15、51-60、136-139和168-172位中的一个或多个位置上为半胱氨酸。
5.权利要求1的突变体，其中所述变体包含一种或多种如下的替换：
(a)第75位丝氨酸(S)、第77位丝氨酸(S)、第88位天冬酰胺(N)、第90位谷氨酰胺(Q)和第126位精氨酸(R)；
(b)(i)第90位谷氨酰胺(Q)和(ii)第105位丙氨酸(A)中的一个或多个；
(c)(i)第90位丝氨酸(S)和(ii)第92位丝氨酸(S)中的一个或多个；
(d)(i)第87位谷氨酰胺(Q)和(ii)第90位丝氨酸(S)中的一个或多个；
(e)(i)第89位酪氨酸(Y)和(ii)第90位丝氨酸(S)中的一个或多个；
(f)(i)第90位丝氨酸(S)和(ii)第92位丙氨酸(A)中的一个或多个；
(g)(i)第90位丝氨酸(S)和(ii)第94位天冬酰胺(N)中的一个或多个；
(h)(i)第90位丝氨酸(S)和(ii)第104位异亮氨酸(I)中的一个或多个；
(i)(i)第90位谷氨酰胺(Q)、(ii)第93位丝氨酸(S)和(iii)第105位丙氨酸(A)中的一个或多个；
(j)(i)第90位的苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)，(ii)第91位的苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)以及(iii)第105位的苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)中的一个或多个；
(k)(i)第90位的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或缬氨酸(V)，(ii)第91位的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或缬氨酸(V)以及(iii)第105位的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)或缬氨酸(V)中的一个或多个；
(l)第90位的丝氨酸(S)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)和/或第91位的丝氨酸(S)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)；
(m)第90位的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)和/或第91位的丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、酪氨酸(Y)或组氨酸(H)；和
(n)第90、91和103位中的一个或多个位置上的半胱氨酸。
6.权利要求1的突变体，其中所述变体还包含至少一种如下的替换：
7.权利要求1的突变体，其中所述突变体是化学修饰的。
8.权利要求7的突变体，其中(i)所述突变体通过连接分子到一个或多个半胱氨酸、连接分子到一个或多个赖氨酸、连接分子到一个或多个非天然氨基酸、表位的酶修饰或末端修饰来进行化学修饰；(ii)所述突变体通过连接分子到一个或多个半胱氨酸来进行化学修饰，并且所述一个或多个半胱氨酸已通过替换引入所述突变体；(iii)所述突变体通过连接分子到一个或多个半胱氨酸、连接分子到一个或多个赖氨酸或连接分子到一个或多个非天然氨基酸来进行化学修饰，并且所述分子为(a)有利于包含所述单体的孔与靶核苷酸或靶核酸序列之间的相互作用的分子连接物或(b)核酸结合蛋白；(iv)所述突变体通过连接分子到一个或多个半胱氨酸、连接分子到一个或多个赖氨酸或连接分子到一个或多个非天然氨基酸来进行化学修饰，并且所述连接经接头；或者(v)所述突变体通过连接分子到一个或多个半胱氨酸、连接分子到一个或多个赖氨酸或连接分子到一个或多个非天然氨基酸来进行化学修饰，并且所述分子被连接到SEQ ID NO:2的第90、91和103位中的一个或多个位置。
9.包含两个或多个共价连接的衍生自Msp的单体的构建体，其中至少一个所述单体为权利要求1所述的突变型孔。
10.权利要求9的构建体，其中(a)所述两个或多个单体相同或不同；(b)至少一个单体包含SEQ ID NO:2示出的序列；(c)至少一个所述单体为权利要求1限定的突变型单体；(d)所述构建体包含两个单体并且至少一个所述单体为权利要求1限定的突变体；(e)所述单体是在遗传上融合的；或(f)所述单体经接头连接。
11.编码权利要求1的突变体或权利要求9的构建体的多核苷酸。
12.包含相同的权利要求1的突变型单体的衍生自Msp的同源寡聚体孔。
13.权利要求12的同源寡聚体孔，其中所述孔包含八个相同的权利要求1的突变型单体。
14.包含至少一个权利要求1的突变型单体的衍生自Msp的异源寡聚体孔，其中所述异源寡聚体孔包含8个单体并且所述八个单体的至少一个与其他单体不同。
15.权利要求14的异源寡聚体孔，其中
(i)所述孔包含八个权利要求1的突变型单体并且它们中的至少一个与其他的不同；
(ii)所述孔包含至少一个含有SEQ ID NO:2示出的序列的单体；
(iii)所述孔包含(a)一个突变型单体和(b)七个相同单体，其中(a)中的突变型单体与(b)中的相同单体不同；或
(iv)所述孔包含：(a)七个包含SEQ ID NO:2示出的序列的单体和一个包含替换N90R、N90K、N90Y、N90Q、N90W或N90C的权利要求1的突变型单体，(b)七个包含SEQ ID NO:2示出的序列的单体和一个包含替换N91R、N91K、N91Y、N91Q、N91W或N91C的权利要求1的突变型单体，或者(c)七个包含SEQ ID NO:2示出的序列的单体和一个包含替换L88C、S103C或I105C的权利要求1的突变型单体。
16.权利要求12或14的孔，其中至少一个所述突变型单体是化学修饰的。
17.包含至少一个权利要求9的构建体的孔。
18.权利要求17的孔，其包含
四个各自包含两个单体的构建体并且至少一个所述单体是权利要求1限定的突变体；或者
一个包含权利要求1限定的突变型单体的构建体和六个各自包含(i)SEQ ID NO:2示出的序列或(ii)权利要求1限定的SEQ ID NO:2的变体的单体。
19.权利要求17的孔，其中至少一个所述构建体是化学修饰的。
20.一种表征靶核酸序列的方法，包括：
(a)使所述靶核酸序列与权利要求12、14或17的孔以及核酸结合蛋白接触，使得所述蛋白控制所述靶核酸序列运动通过所述孔并且所述靶核酸序列中的一部分核苷酸与所述孔相互作用；和
(b)在每次相互作用的过程中测量通过所述孔的电流，从而表征所述靶核酸序列。
21.权利要求20的方法，其中表征所述靶核酸序列包括评估所述靶核酸序列的序列或对所述靶核酸序列测序。
22.用于表征靶核酸序列的试剂盒，其包含(a)权利要求12、14或17的孔以及(b)核酸处理酶。
23.用于表征样品中靶核酸序列的装置，其包含(a)多个权利要求12、14或17的孔以及(b)多个核酸处理酶。
24.权利要求23的装置，其中所述装置包含：
能够支持所述多个孔并可操作以使用所述孔和酶进行核酸表征的传感器装置；
至少一个用于容纳用于进行所述表征的材料的贮器；
被配置用于将材料从至少一个贮器可控制地供应到所述传感器装置的流控技术系统；和
多个用于接受各个样品的容器，被配置用于将所述样品从所述容器选择性地供应到所述传感器装置的流控技术系统。
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