JP2019517252A - 二色ナノポア配列決定 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2016年5月31日に出願された米国仮特許出願第62/343,283号、および2016年11月14日に出願された米国仮特許出願第62/421,804号の優先権の利益を主張し、その両方の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
ヌクレオチドの光学的検出は、ナノポア配列決定の分野における技術的困難の一部、例えば、ナノポアの大規模アレイからの独立的なシグナルを収集することの困難に対する有望な解法として提案されている。しかしながら、斯かる解法の実行にとって多数の課題があり、それには、例えば、光学に基づいた単一分子分析に特有のバックグラウンドノイズを克服すること、および光学的標識をヌクレオチドに結合させるための信頼でき、便利な方法を確立することが挙げられる。
一部の実施形態では、一連の光学的シグナルは、分解能限界区域から測定され得、各光学的測定値は、異なる隣接モノマー(ポリマーにおけるその順序は、例えば、成分シグナルが回折限界区域(diffraction limited area)内から生成されるため、単一測定値から決定することができない)からの複数の成分シグナルを含む。これらの状況下で、ポリマーの光学に基づいたナノポア分析は、(i)1つより多い標識モノマーの配列からの重複寄与を含む時系列の光学的測定値を生成し、それにより、単一測定値からのモノマーの順序を決定することを、不可能でないにしても、困難にさせており、(ii)識別可能なシグナルを生成するモノマーについての光学的標識を選択することにより、光学的測定値は、異なる種類のモノマー上の異なる標識からの寄与へ分離することができ、それは、重複測定値が配列情報へ変換されるのを可能にする。
本発明によれば、標識ポリマーがナノポアおよびその関連した励起ゾーンを通って転置するとき、光学的測定値の時間順序セットが記録される。隣接した時点における光学的測定値は、各光学的測定値が隣接したモノマーの標識からの寄与を含有するという意味で重複している。したがって、例えば、3つのモノマーが各時点でシグナルを生成する場合(例えば、ポリマー・・・−A−(B−C−D)−・・・のB、C、およびDが励起ゾーンを通って左から右へ移動する)、および連続的測定の間に、1つのモノマーが励起ゾーンから出て、別のモノマーが励起ゾーンに入る(括弧で示されている)場合(例えば、Aが入って、Dが出る:−(A−B−C)−D・・・)には、2つの連続する光学的測定値は、同じモノマーからの寄与を含有する(この例では、両方の測定値は、BおよびCからの寄与を含む)。上記の例は、ナノポアを通ってのポリマー転置の非常に単純化されたモデルに基づいている;しかしながら、連続重複光学的測定(successive overlapping optical measurement)の概念は、ポリマー転置のより複雑な記載に適用できる。
ナノポアおよびナノポアアレイ
ナノポアおよびポリマーのための標識
定義
Claims (23)
- 二本鎖ポリヌクレオチドを分析する方法であって、
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも2種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップ;
該ヌクレオチドアナログを、同じ少なくとも2種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された相補体を形成するように、該鎖の相補体をコピーするステップ;
該標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを1列縦隊で通過するように、該標識された鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ;
該標識された鎖が該ナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ;
該標識された相補体のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを1列縦隊で通過するように、該標識された相補体を、ナノポアを通して転置させるステップ;
該標識された相補体が該ナノポアを通って転置して相補体光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ;
該鎖光学的シグネチャーおよび該相補体光学的シグネチャーから該二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含む、方法。 - 前記決定するステップが、前記鎖光学的シグネチャーを前記相補体光学的シグネチャーと、該光学的シグネチャーの相補性によりペアリングすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも2種類のヌクレオチドの2つがピリミジンである、請求項1に記載の方法。
- 前記コピーするステップが、プライマー伸長反応により実行される、請求項1に記載の方法。
- 前記鎖および前記相補体が単一のプライマー伸長によりコピーされ得るように、前記二本鎖ポリヌクレオチドの末端にヘアピンアダプタをライゲートするステップをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記コピーするステップが、前記少なくとも2種類のヌクレオチドのことごとく1個1個の代わりに前記ヌクレオチドアナログを用いて前記標識された鎖および前記標識された相補体を形成することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも2種類のヌクレオチドの2つがプリンである、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも2種類のヌクレオチドの少なくとも1つがピリミジンである、請求項1に記載の方法。
- 別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも2種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップ;
該標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを1列縦隊で通過するように、該標識された鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ;
該標識された鎖が該ナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ;
該鎖光学的シグネチャーを参照光学的シグネチャーと比較することにより、該鎖光学的シグネチャーから該二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含む、ポリヌクレオチドを同定する方法。 - 前記鎖がヒトゲノム由来であり、少なくとも100ヌクレオチド長であり、前記参照光学的シグネチャーがヒトゲノム配列に由来する、請求項9に記載の方法。
- 前記鎖が微生物ゲノム由来であり、少なくとも100ヌクレオチド長であり、前記参照光学的シグネチャーが微生物ゲノム配列に由来する、請求項9に記載の方法。
- 前記微生物ゲノムが細菌ゲノムである、請求項11に記載の方法。
- 前記鎖がウイルスゲノム由来であり、少なくとも100ヌクレオチド長であり、前記参照光学的シグネチャーがウイルスゲノム配列に由来する、請求項9に記載の方法。
- 遺伝子発現を測定する方法であって、
mRNAの試料を得るステップ;
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも2種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された第1鎖を形成するように、mRNAの鎖を逆転写するステップ;
該標識された鎖のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを1列縦隊で通過するように、該標識された第1鎖を、ナノポアを通して転置させるステップ;
該標識された第1鎖が該ナノポアを通って転置して第1鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ;
該第1鎖光学的シグネチャーを参照光学的シグネチャーと比較することにより、該第1鎖光学的シグネチャーから該mRNA鎖を同定するステップ
を含む、方法。 - 前記mRNAの前記試料がヒト試料である、請求項14に記載の方法。
- 前記同定するステップが、前記第1鎖光学的シグネチャーを、ヒトゲノム配列および/またはヒトメッセンジャーRNA配列の参照光学的シグネチャーと比較することを含む、請求項15に記載の方法。
- 遺伝子発現を測定する方法であって、
mRNAの試料を得るステップ;
mRNAの鎖を逆転写して、第1のDNA鎖を生じるステップ;
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも2種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識されたcDNAを形成するように、該第1のDNA鎖を転写するステップ;
該標識されたcDNAのヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを1列縦隊で通過するように、該標識されたcDNAを、ナノポアを通して転置させるステップ;
該標識されたcDNAが該ナノポアを通って転置してcDNA光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを検出するステップ;
該cDNA光学的シグネチャーを参照光学的シグネチャーと比較することにより、該cDNA光学的シグネチャーから該mRNA鎖の配列を決定するステップ
を含む、方法。 - 前記決定するステップが、前記cDNA光学的シグネチャーを、ヒトゲノム配列および/またはヒトメッセンジャーRNA配列の参照光学的シグネチャーと比較することを含む、請求項17に記載の方法。
- 集団の二本鎖ポリヌクレオチドを分析する方法であって、
別個の光学的標識を有するヌクレオチドアナログを、少なくとも2種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された鎖を形成するように、各二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーするステップであって、各二本鎖ポリヌクレオチドが所定の最小限の長さを有する、ステップ;
該ヌクレオチドアナログを、同じ少なくとも2種類のヌクレオチドの代わりに用いて、標識された相補体を形成するように、該鎖の相補体をコピーするステップ;
該標識された鎖および該標識された相補体のヌクレオチドが、光学的標識が励起されて光学的シグナルを生成する励起ゾーンを1列縦隊で通過するように、該標識された鎖および該標識された相補体を、ナノポアを通して別々に転置させるステップ;
該標識された鎖が該ナノポアを通って転置して鎖光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナル、および、該標識された相補体が該ナノポアを通って転置して相補体光学的シグネチャーを生じるときの該光学的標識からの時系列の光学的シグナルを、別々に検出するステップ;
各二本鎖ポリヌクレオチドからの該鎖光学的シグネチャーと該相補体光学的シグネチャーとを関連付けるステップであって、所定の最小限の長さが、そのような関連付けが少なくとも90パーセントの確率で正しくなるように選択される、ステップ;
該関連付けられた鎖光学的シグネチャーと該相補体光学的シグネチャーから各二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップ
を含む、方法。 - 前記集団が、ヒトゲノム、細菌ゲノム、または単細胞型真核生物のゲノムのDNA断片を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記DNA断片の長さが、それぞれ、少なくとも100塩基対である、請求項20に記載の方法。
- 前記DNA断片の長さが、100塩基対から10,000塩基対までの範囲である、請求項21に記載の方法。
- 前記集団が、1015個未満の別個の二本鎖DNAを含む、請求項19に記載の方法。
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