JP2019528065A - 消光剤を使用する光学に基づくナノポア配列決定 - Google Patents

消光剤を使用する光学に基づくナノポア配列決定 Download PDF

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Abstract

本発明は、ナノポアを使用する光学に基づくポリヌクレオチド分析のための方法および組成物を対象とし、検出ゾーンの外側のポリヌクレオチド標識によって発生する偽光学シグナルを低減または消失させるために消光剤が使用される。一部の実施形態では、本発明は、ナノポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、区別できる蛍光シグナルを発生する異なる蛍光標識で標識され、ナノポアがヌクレオチドを拘束して検出ゾーンを一列で通過させるステップと；蛍光標識を励起するステップと；１つまたは複数の非蛍光消光剤を使用して検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；蛍光標識が検出ゾーンを通過すると、蛍光標識から放出された蛍光シグナルを検出するステップと；検出された蛍光シグナルからヌクレオチドの配列を決定するステップとで実施され得る。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年８月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３７７，４０９号の優先権を主張し、その内容全体が本明細書中に参照によって組み込まれる。
ヌクレオチドの光学検出は、例えば、独立したシグナルを大きなナノポアアレイから同時に収集する困難さなどの、ナノポア配列決定の分野における技術的困難さの一部に対する潜在的解決法として提案されている。しかし、光学的アプローチを実行するための多くの問題、特に、移動するポリヌクレオチド上の単一分子標識からの光学シグナルを光学的ノイズの著しいバックグラウンドに対して測定する困難さがある。単一分子からの蛍光シグナルの測定は、様々な状況下で行われている。例えば、フローに基づく高速ＤＮＡ配列決定に関する文献、例えば、Jettら、J. Biomol. Struct.Dyn.、７巻（２号）：３０１〜３０９頁（１９８９年）を含む、Lackowitz、Principles of Fluorescence Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年）；Moernerら、Review of Scientific Instruments、７４巻（８号）：３５９７〜３６１９頁（２００３年）；Michaletら、Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.、３２巻：１６１〜１８２頁（２００３年）。しかし、光学に基づくナノポア配列決定は、ナノメートルスケールの検出ゾーンを通って迅速に移動する無傷のポリヌクレオチド上の標識からの連続する光学シグナルの測定を要するため、新たな問題を提示する。特に、検出ゾーンの外側の光学標識は、収集されたシグナル内のノイズに著しく寄与し得る。
上記に鑑み、光学に基づくナノポア配列決定は、検出ゾーンの外側の標識からの光学的ノイズを消失または低減させるための方法が利用可能であったならば、進歩するであろう。
Jettら、J. Biomol. Struct.Dyn.、７巻（２号）：３０１〜３０９頁（１９８９年） Lackowitz、Principles of Fluorescence Spectroscopy、第３版（Springer、２００６年） Moernerら、Review of Scientific Instruments、７４巻（８号）：３５９７〜３６１９頁（２００３年） Michaletら、Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.、３２巻：１６１〜１８２頁（２００３年）
本発明は、ナノポアを使用する光学に基づくポリヌクレオチド分析のための方法および組成物を対象とする。一態様では、本発明は、検出ゾーンの外側のポリヌクレオチド標識によって発生する偽光学シグナルを低減または消失させるための消光剤の使用を対象とする。
一態様では、本発明は、（ａ）ナノポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、区別できる蛍光シグナルを発生する異なる蛍光標識で標識され、ナノポアがヌクレオチドを拘束して検出ゾーンを一列で通過させるステップと；（ｂ）蛍光標識を励起するステップと；（ｃ）非蛍光消光剤を使用して検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；（ｄ）蛍光標識が検出ゾーンを通過すると、蛍光標識から放出された蛍光シグナルを検出するステップと；（ｅ）検出された蛍光シグナルからヌクレオチドの配列を決定するステップとを含む、ポリヌクレオチドを分析する方法を対象とする。
別の態様では、本発明は、（ａ）第１の側面、第２の側面、およびそれらを通る複数のナノポアを有する固相膜を含むナノポアアレイを提供するステップであって、固相膜が第１のチャンバーと第２のチャンバーを分離し、それにより各ナノポアが第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間の流体連通を提供し、各ナノポアが第２のチャンバーへの出口を有し、二本鎖核酸ではなく一本鎖核酸を通過させるような寸法であり、各ナノポアが、移動するポリヌクレオチドのヌクレオチドを拘束して、その出口にある検出ゾーンを一列で通過させるステップと；（ｂ）ナノポアを通して第１のチャンバーから第２のチャンバーにポリヌクレオチドを移動させるステップであって、異なる種類のヌクレオチドが、区別できる蛍光シグナルを発生する異なる蛍光標識で標識されるように、各ポリヌクレオチドが、そのヌクレオチドに結合させた１つまたは複数の蛍光標識を有するステップと；（ｃ）蛍光標識に励起ビームを照射するステップと；（ｄ）検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを、ポリヌクレオチドに結合する非蛍光消光剤で消光するステップと；（ｅ）検出ゾーン内の蛍光標識からの蛍光シグナルを検出するステップと；（ｆ）検出された蛍光シグナルからポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップとを含む、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法を対象とする。
本発明は、検出ゾーンの外側の蛍光標識によって発生する蛍光シグナルの形態の望ましくない光学的ノイズを抑制するまたは消失させるための消光剤を提供することによって、光学に基づくナノポア配列決定の分野における上記の問題を有利に克服する。本発明のこれらのおよび他の利点は、多くの実施および適用において例示されており、その一部は、以下におよび本明細書の全体にわたって概説される。
図１Ａ〜１Ｂは、ナノポアを使用して蛍光標識を有するポリヌクレオチドを分析する場合の、かかるポリヌクレオチドおよび光学的ノイズの源を示す。
図２Ａ〜２Ｃは、トランスチャンバー、シスチャンバー、ならびにシスチャンバーおよびトランスチャンバーの両方において消光剤を利用する本発明の実施形態を示す。 図２Ａ〜２Ｃは、トランスチャンバー、シスチャンバー、ならびにシスチャンバーおよびトランスチャンバーの両方において消光剤を利用する本発明の実施形態を示す。 図２Ａ〜２Ｃは、トランスチャンバー、シスチャンバー、ならびにシスチャンバーおよびトランスチャンバーの両方において消光剤を利用する本発明の実施形態を示す。
図３は、バックグラウンドまたはＦＲＥＴ励起でのＴＩＲを低減させるための、タンパク質ナノポアおよびナノポアアレイ上の金属層での落射照明を使用する本発明の実施形態を示す。
図４は、共焦点落射照明システムの基本的な構成要素を示す。
図５は、ＦＲＥＴシグナル発生を伴わない、ナノポアアレイ内またはナノポアアレイの近傍における光学標識の励起のためのＴＩＲＦシステムの要素を示す。
図６は、複数の光学標識からの光を含む光学シグナルの測定に基づいてヌクレオチド配列を呼び出すためのステップを示すフローチャートである。
図７Ａ〜図７Ｃは、２つおよび３つの蛍光標識を利用する実施形態を示す。 図７Ａ〜図７Ｃは、２つおよび３つの蛍光標識を利用する実施形態を示す。 図７Ａ〜図７Ｃは、２つおよび３つの蛍光標識を利用する実施形態を示す。
（発明の詳細な説明）
本発明は、様々な修正および代替形態を受け得るが、それらの詳細を図面に例として示しており、これより詳細に記述する。しかし、本発明を、記述される特定の実施形態に限定しようとするものではないことを理解すべきである。それどころか、本発明の精神および範囲内に入る全ての修正例、均等物、および代替例を包含するものである。例えば、本発明の特定のナノポアのタイプおよび数、特定の標識、ＦＲＥＴ対、検出スキーム、製作手法は、例示の目的で示される。しかし本開示は、その他のタイプのナノポア、ナノポアのアレイ、およびその他の製作技術を利用して本明細書で論ずるシステムの様々な態様を実現することができるので、この点に限定するものではないことを理解すべきである。本発明の態様に関する指針は、その関連ある部分が参照により本明細書に組み込まれる、例えば、Ｃａｏ，Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ＆Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ，２００４）；Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ，２００５）；Ｄｏｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｎｉｓｈｉ， Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００７）；Ｓａｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５）；Ｂａｒｄ ａｎｄ Ｆａｕｌｋｎｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，２０００）；Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２００６）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００８）；などを含む、当業者に周知の多くの入手可能な参考文献および論文に見出される。
本発明は、ナノポアおよび光学検出を使用する、ＤＮＡ、およびＲＮＡなどのようなポリヌクレオチドを分析するための方法およびデバイスを対象とする。さらに具体的には、本発明は、ナノポアおよび光学検出を使用する、１つまたは複数のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することを対象とする。一態様では、本発明は、所望の検出ゾーンの外側で励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを抑制するおよび／または消失させるための非蛍光消光剤を使用することによって、収集されたシグナル中の光学的ノイズを低減させることを対象とし、またそれを含む。図１Ａおよび図１Ｂは、本発明のこの態様によって対処する問題を図説する。光学に基づくナノポア配列決定の一部の実施形態では、例えば、（１００）によって示される、標識されたポリヌクレオチドは、試料から得られ得る標的ポリヌクレオチドから生じる。示されるように、標識されたポリヌクレオチド（１００）のヌクレオチドの一部分は、（例えば）２つの蛍光標識「ｆ」（１０２）または「ｇ」（１０４）の一方を結合している。標識されたポリヌクレオチド（１００）および／または同様に標識されたポリヌクレオチドは、例えば固相膜（１０８）中のナノポア（１０６）として表される、ナノポアを通って移動する。ナノポアは、以下により完全に記載するように、広範なフォーマットおよび組成を有し得るが、実質的に同一の機能を実行するように、即ち、標識ポリヌクレオチドのヌクレオチドを拘束して検出ゾーンを一列で通過させるように用いられる。一部の実施形態では、ナノポアは、（ｉ）二本鎖ポリヌクレオチドではなく一本鎖ポリヌクレオチドを通過させること、ならびに／または（ｉｉ）ナノポアの通過の間の蛍光標識の蛍光放出を抑制および／もしくは拘束することを含む、さらなる機能を行い得る。図１Ｂは、シスチャンバー（１１０）からナノポア（１０６）を通ってトランスチャンバー（１１２）へと移動し、落射照明またはエバネッセント波照射を介する直接照明であり得る励起ビーム（１１４）によって照射される、標識されたポリヌクレオチド（１００）を示す。いずれの配置でも、所望の検出ゾーン、例えば検出ゾーン（１２４）の外側の多数の蛍光標識が励起し、その結果、収集されたシグナルは、検出ゾーン（１２４）の外側の、例えば、ナノポア（１０６）に入ろうとするヌクレオチドの蛍光標識を含有する領域（１２０）、および励起された検出ゾーン（１２４）を有するヌクレオチドの蛍光標識を含有する領域（１２６）の、潜在的に多くの蛍光標識からの寄与を含み得る。結果として、収集されたシグナル（１２８）からの配列情報の識別が、非常に困難である。一態様では、本発明は、標識された一本鎖ポリヌクレオチドに対する親和性を有し、それにより所望の検出領域または検出ゾーン（１２４）の外側の領域からの蛍光シグナルを低減または消失させる非蛍光消光剤を提供することによって、この問題に対処する。他の態様では、標識された二本鎖ポリヌクレオチドに対する親和性を有する非蛍光消光剤が、所望の検出ゾーンまたは検出領域の外側の領域からの蛍光シグナルを低減または消失させるために提供され得る。
図２Ａ〜２Ｃは、消光剤がナノポアデバイス、即ち、トランスチャンバーのみ（図２Ａ）、シスチャンバーのみ（図２Ｂ）、またはシスチャンバーおよびトランスチャンバーの両方（図２Ｃ）に適用される場合に対応する、本発明の異なる実施形態を示す。図２Ａでは、シスチャンバー（２０２）から固相膜（２０８）のナノポア（２０６）を通ってトランスチャンバー（２０４）へと移動する、標識されたポリヌクレオチド（２００）が示される。トランスチャンバー（２０４）内には、「Ｑ」で示される非蛍光消光剤（２０５）が浸漬されている。本発明の消光剤は、標識された一本鎖ポリヌクレオチド（２００）の移動条件下で可溶性であり、同一の条件下で、消光剤は、（２００）などの一本鎖ポリヌクレオチドに、実質的な配列特異性を伴わずに結合する。同様に、代替的な実施形態では、本発明の消光剤は、標識された二本鎖ポリヌクレオチドの移動条件下で可溶性であり、同一の条件下で、消光剤は、そのような二本鎖ポリヌクレオチドに、実質的な配列特異性を伴わずに結合する。より完全に以下に記載するように、非対称シアニン色素などの多くの周知の有機色素の誘導体、ならびにそのような化合物とオリゴヌクレオチドとのコンジュゲートおよび／またはそれらの類似体を含む様々な非蛍光消光剤が、本発明とともに使用するために利用可能である。この実施形態では、消光剤のタイプおよび濃度ならびに移動速度の選択によって、検出ゾーン（２１０）が画定される。一部の実施形態では、「検出ゾーン」は、標識されたポリヌクレオチドに関する情報、例えば配列情報がそこから決定される生データを形成するために蛍光シグナルを収集する領域または容積（これは、連続的または非連続的であり得る）を意味する。一部の実施形態では、「検出ゾーン」は、連続的な領域または容積である。検出ゾーン（２１０）の外側のトランスチャンバー（２０４）内の蛍光標識は、トランスチャンバー（２０４）内の標識されたポリヌクレオチド（２００）の一部に結合した消光剤（２０５）によって実質的に消光される。一部の実施形態では、消光剤は、より完全に以下に記載するように、有機色素に基づく１つまたは複数の消光部分にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドまたは類似体を含む。図２Ａの実施形態は、例えば、固相膜（２０８）が不透明層であるかまたはそれを含み、それによってシスチャンバー（２０２）内の蛍光標識が実質的に励起しない場合に、用いられ得る。そのような実施形態では、トランスチャンバーへのナノポアの出口に例えば隣接している検出ゾーンの容積は、これだけに限らないが、標識されたポリヌクレオチドの移動速度、トランスチャンバー内の消光剤濃度、ポリヌクレオチドに対する消光剤の親和性、消光剤の消光効率などを含む因子に依存し得る。
図２Ｂは、消光剤（２０５）がシスチャンバー（２０２）内に配置されることを除いて、図２Ａ中の要素と実質的に同一の要素を示す。この配置は、望ましくないエバネッセント波などの非放射光エネルギーがシスチャンバー（２０２）まで延在し、蛍光標識を励起して、これが蛍光シグナルを発生させ、これが収集される状況下で、望ましい場合がある。シスチャンバー（２０２）内の標識されたポリヌクレオチド（２００）に結合する消光剤（２０５）は、そのような蛍光シグナルを低減または消失させる。一部の実施形態では、消光剤（２０５）とナノポア（２０６）の断面とは、消光剤（２０５）がナノポア（２０６）を通って移動しないように選択される。一部の実施形態では、これは、より完全に以下に記載するように、タンパク質ナノポアα−溶血素と、オリゴヌクレオチドまたはその類似体と１つまたは複数の消光性化合物とのコンジュゲートを含む消光剤とを使用して達成することができる。
図２Ｃは、図２Ａおよび図２Ｂの両方の実施形態について記載された利点を提供する、消光剤（２０５）がシスチャンバー（２０２）およびトランスチャンバー（２０４）の両方に存在する実施形態を示す。
図３は、以下の要素：脂質二重層（３０２）の中に配置されたタンパク質ナノポア（３００）、バックグラウンド蛍光を防止しまたは低減するための固相膜（３０６）中の不透明層（３０８）での蛍光標識の落射照明、およびトランスチャンバー（３２６）内に配置された消光剤（３１０）を含む実施形態を示す。上記のように、蛍光標識されたヌクレオチド（標識を（３２２）のように「ｆ」で示す）を有するポリヌクレオチド（３２０）は、ナノポア（３００）を通ってシスチャンバー（３２４）からトランスチャンバー（３２６）へと移動する。オリゴヌクレオチド消光剤（３１０）は、ナノポア（３００）から現れるポリヌクレオチド（３２０）の部分へのオリゴヌクレオチド消光剤（３２８）のハイブリダイゼーションを可能にする条件（例えば、濃度、温度、塩濃度など）の下で、トランスチャンバー（３２６）内に配置される。ナノポア（３００）は、参照により本明細書に組み込まれるHuberら、米国特許出願公開第２０１６／００７６０９１号に記載されているように、ナノポアを通過する間に蛍光標識からのシグナルが抑制されるように選択され得る。したがって、標識されたヌクレオチドが領域（３２８）においてナノポア（３００）から現れると、これらは抑制されなくなり、シグナルを発生できるようになる。全てでなければ大部分の直接照射の形態（例えば非ＦＲＥＴ）では、そのような現れた標識は、トランスチャンバー（３２６）内にさらに移動する際に蛍光を放出し続け、それにより、収集されたシグナルに大きく寄与する。現れるポリヌクレオチドに結合するトランスチャンバー（３２６）内の消光剤によって、そのような発光を顕著に低減することができ、検出ゾーン（３２８）を画定して、そこから、収集されたシグナルを分析してポリヌクレオチド（３２０）に関するヌクレオチド配列情報を得ることができる。一部の実施形態では、標識されたポリヌクレオチドが検出ゾーンを通って移動する際に、単一の蛍光標識からの蛍光シグナルが検出時間の間に検出ゾーン（３２８）から検出される。他の実施形態では、複数の蛍光シグナルが所定の時間の間に検出ゾーン（３２８）で複数の蛍光標識から収集される。一部の実施形態では、そのような検出時間は、１ミリ秒未満、または０．１ミリ秒未満、または０．０１ミリ秒未満である。一部の実施形態では、そのような検出時間（detection perior）は、少なくとも０．０１ミリ秒、または少なくとも０．１ミリ秒、または少なくとも０．５ミリ秒である。
消光剤
本発明の消光剤は、ナノポア配列決定の条件下で（ｉ）実質的に非蛍光性であり、（ｉｉ）一本鎖核酸、特に一本鎖ＤＮＡに結合し、（ｉｉｉ）他の分子から非放射的に励起エネルギーを吸収し、これを非放射的に放出する任意の化合物（または化合物の組）を含む。一部の実施形態では、消光剤は一本鎖ＤＮＡに非共有結合でさらに結合する。より完全に以下に記載されるように、これだけに限らないが、シアニンおよびキサンテン色素などの一般的な合成色素の非蛍光性誘導体を含む様々な消光性化合物が、本発明とともに使用するために利用可能である。消光性化合物の選択のガイダンスは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３２３，３３７号、米国特許第６，７５０，０２４号などの参考文献に見出され得る。
一部の実施形態では、消光剤は、蛍光を消光することが知られている重原子（臭素またはヨウ素など）によって共有結合で修飾された、またはニトロ基もしくはアゾ基などの蛍光を消光することが知られている他の基によって共有結合で修飾された、一本鎖ＤＮＡ結合性色素であってもよい。一本鎖ＤＮＡに結合することが知られている色素の例は、Ｓｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ（Zipperら、（２００４年）、Nucleic Acid Research、３２巻（１２号））である。シアニンＳｙｂｒ Ｇｒｅｅｎ構造へのニトロ基、臭素基、ヨウ素基、および／またはアゾ基の組み込みによって、ＤＮＡ上に存在するかも知れない蛍光標識を消光する一本鎖ＤＮＡ結合性基部分が得られる。
一部の実施形態では、消光剤は結合部分と１つまたは複数の消光部分とを含む。結合部分には、実質的な配列特異性なしに一本鎖核酸に結合する任意の化合物が含まれ得る。結合部分は、ペプチドもしくはオリゴヌクレオチドまたは修飾された連結部および／もしくはモノマーを有する類似体を含み得る。オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、二重鎖の形成を介して、または非塩基対合アプタマー結合を介して、ポリヌクレオチドへの結合を提供し得る。一部の実施形態では、結合部分は６〜６０ヌクレオチドの範囲の長さを有するオリゴヌクレオチドまたはその類似体を含む。そのようなオリゴヌクレオチドまたは類似体は、１つの消光部分または複数の消光部分にコンジュゲートしてもよい。一部の実施形態では、各オリゴヌクレオチドまたは類似体にコンジュゲートした複数の消光部分は２または３である。結合部分にコンジュゲートした消光部分は同一でも異なっていてもよい。一部の実施形態では、結合部分がオリゴヌクレオチドまたは類似体である場合はいつも、２つの消光部分は、１つがオリゴヌクレオチドの５’末端に、１つがオリゴヌクレオチドの３’末端にコンジュゲートしている。２〜３の消光部分を有するオリゴヌクレオチドまたは類似体は、例えば本明細書に引用した参考文献に開示されているように、従来の連結化学および合成化学を使用して合成することができる。
シスチャンバー内で結合する、消光剤を含む一本鎖オリゴヌクレオチドは、図３のタンパク質ナノポア（３００）で示すものなどの一部のナノポア配置でナノポアを、それが一本鎖核酸のみを移動させるほどに十分に狭くなるよう選択することができ、したがって、ナノポアを移動する間、実際には、移動が進行するにつれて、結合した消光剤が取り除かれるという点で有利であり得る。一部の実施形態では、ナノポアを通過する間の蛍光標識のシグナル発生を抑制し（または検出）、その後の、検出ゾーン（例えば、図３の（３２８））への出口での自由なシグナル発生（または検出能力）を抑制するナノポアが選択され得る。
オリゴヌクレオチドまたは類似体は単一種として提供され、または異なる配列、したがって異なる結合特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドもしくは類似体の混合物として提供され得る。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは類似体はランダム配列ポリマーである。即ち、これらは所与の長さを有するあらゆる可能な配列の混合物として提供される。例えば、そのようなオリゴヌクレオチドまたは類似体は、６マーについては「ＮＮＮＮＮＮ」、または８マーについては「ＮＮＮＮＮＮＮＮ」という式で表すことができ、式中ＮがＡ、Ｃ、ＧもしくはＴ、またはその類似体であってもよい。
オリゴヌクレオチドに関する「類似体」は、１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含有するオリゴヌクレオチドを意味する。定義のセクションに記載するように、「ヌクレオチド類似体」は修飾された連結部分、糖部分、または塩基部分を有し得るヌクレオチドである。本発明とともに使用され得る例示的なオリゴヌクレオチド類似体には、これだけに限らないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）（２’−Ｏ−メチルＲＮＡ）、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、架橋された核酸（ＢＮＡ）などが含まれる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分はユニバーサル塩基を含む。即ち、これらは、塩基対相互作用を不安定化することなしに４つの天然のヌクレオチドのいずれかを置き換えることができる１つまたは複数のヌクレオチド類似体を含有する。ユニバーサル塩基特性を有するヌクレオチド類似体は、参照により本明細書に組み込まれるLoakes、Nucleic Acids Research、２９巻（１２号）、２４３７〜２４４７頁（２００１年）に記載されている。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド結合部分は、２’−デオキシイノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、３−ニトロピロールヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチドなどを含む。
一部の実施形態では、消光剤には、共同で作用して一本鎖標識ポリヌクレオチドの望ましくない蛍光シグナルを消光する２つまたはそれより多い化合物の組合せが含まれ得る。例えば、消光剤には、標識されたポリヌクレオチドと二重鎖を形成し得るオリゴヌクレオチド（例えばポリデオキシイノシン）と、個別に、消光剤である二本鎖インターカレーターとが含まれ得る。したがって、ポリデオキシイノシンが標識されたポリヌクレオチドに結合する場合にはいつも、その結果生じる二重鎖に消光性インターカレーターが結合して、ポリヌクレオチドからの蛍光シグナルを消光する。
標識されたポリヌクレオチドの蛍光標識の蛍光シグナルを検出可能に消光することができる任意の合成色素は、本発明の目的のための許容される消光部分である。具体的には、本発明で使用する場合、消光部分は、標識されたポリヌクレオチド上の蛍光標識の発光バンドと少なくとも一部のスペクトルの重なりを示す吸収バンドを有する。この重なりは、十分なスペクトルの重なりが存在する限り、消光部分（アクセプター）の極大吸収波長よりも低い、またはより高い波長の発光極大において起こる蛍光標識（ドナー）の発光とともに起こり得る。エネルギー移動は、ドナーの発光の、アクセプターのより高い電子状態への遷移を通しても起こり得る。当業者は、使用される蛍光標識の発光スペクトルに関してその色素の励起バンドを調査することによって、所与の消光部分の有用性を決定する。
典型的には、本発明の蛍光消光は、本発明の蛍光標識と消光部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴまたは電荷移動錯体の形成によって）によって起こる。ドナー化合物およびアクセプター化合物のスペクトル特性および電子特性は、標識されたポリヌクレオチド上の蛍光標識と消光部分との間の分離距離と同様に、観察されるエネルギー移動の程度に強い影響を有する。分離距離が増加すると、蛍光消光の程度は減少する。
標識されたポリヌクレオチドに結合したときに色素の極大発光波長が蛍光標識の極大発光波長から十分に分離されている限り、消光部分は必要に応じて蛍光性であり得る。しかし、好ましくは、オリゴヌクレオチドまたは類似体に共有結合でコンジュゲートしている場合には、消光部分は僅かに蛍光性にすぎない、または実質的に非蛍光性である。本明細書において使用する実質的に非蛍光性とは、本明細書の方法のいずれにおいても、記載される通りアッセイ溶液における消光部分の蛍光効率が５パーセント未満またはそれに等しく、好ましくは１パーセント未満またはそれに等しいことを示す。他の実施形態では、共有結合で結合した消光部分は、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満の量子収率を示す。一部の実施形態では、本発明の消光オリゴヌクレオチドに会合した蛍光標識の蛍光は、共有結合で結合した消光部分がない場合の同一の蛍光標識と会合した同一のオリゴヌクレオチドに対して、５０％を超えて消光される。別の実施形態では、蛍光標識は、標識されていないオリゴヌクレオチドに対して９０％を超えて消光される。さらに別の実施形態では、核酸染色は、標識されていないオリゴヌクレオチドに対して９５％を超えて消光される。
一部の実施形態では、消光部分は、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールもしくはベンズインドール、オキサゾールもしくはベンゾオキサゾール、チアゾールもしくはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン、カルボシアニン、カルボスチリル、ポルフィリン、サリシレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、クマリン（ヒドロキシクマリン類およびアミノクマリン類ならびにフッ素化されたおよびスルホン化されたそれらの誘導体を含む）（参照により組み込まれるGeeらへの米国特許第５，８３０，９１２号（１９９８年）およびWangらへの米国特許第５，６９６，１５７号（１９９７号）において記載されているような）、ポリアザインダセン（例えば、全て参照により組み込まれる、Hauglandらへの米国特許第４，７７４，３３９号（１９８８年）、Kangらへの米国特許第５，１８７，２８８号（１９９３年）、Hauglandらへの米国特許第５，２４８，７８２号（１９９３年）、Kangらへの米国特許第５，２７４，１１３号（１９９３年）、Kangらへの米国特許第５，４３３，８９６号（１９９５年）、Wuらへの米国特許第６，００５，１１３号（１９９９年））、キサンテン、オキサジンもしくはベンゾオキサジン、カルバジン（参照により組み込まれるCoreyの米国特許第４，８１０，６３６号（１９８９年））、またはフェナレノンもしくはベンズフェナレノン（参照により組み込まれるBabbらの米国特許第４，８１２，４０９号（１９８９年））であってもよい。
他の実施形態では、実質的に非蛍光性の色素である消光部分には、特にアゾ色素（ＤＡＢＣＹＬ色素またはＤＡＢＳＹＬ色素およびそれらの構造的類似体など）、トリアリールメタン色素、例えば、マラカイトグリーンもしくはフェノールレッド、４’，５ｚ−ジエーテル置換フルオレセイン（米国特許第４，３１８，８４６号（１９８２年））、または非対称シアニン色素消光剤（ＰＣＴ国際出願第ＷＯ９９ ３７，７１７号（１９９９年））が含まれる。
消光部分がキサンテンである実施形態では、合成色素は必要に応じてフルオレセイン、ロドール（参照により組み込まれるHauglandらへの米国特許第５，２２７，４８７号（１９９３年））、またはローダミンである。本明細書で使用するフルオレセインには、ベンゾ−もしくはジベンゾフルオレセイン類、セミナフトフルオレセイン類、またはナフトフルオレセイン類が含まれる。同様に、本明細書で使用するロドールには、セミナフトロダフルオル類（参照により組み込まれるHauglandらへの米国特許第４，９４５，１７１号（１９９０年））が含まれる。キサンテン類には、キサンテン色素のフッ素化誘導体（参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ９７／３９０６４号、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９７年））、およびキサンテン色素のスルホン化誘導体（参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ９９／１５５１７号、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９９年））が含まれる。本明細書で使用するオキサジン類には、レゾルフム類（resorufms）、アミノオキサジノン類、ジアミノオキサジン類、およびそれらのベンゾ置換類似体が含まれる。
さらなる実施形態では、消光部分は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，３９９，３９２号に記載されている、１つまたは複数のアミノ窒素原子が芳香族環系または複素芳香族環系によって置換された３−アミノキサンテンおよび／または６−アミノキサンテンの実質的に非蛍光性の誘導体である。これらの消光色素は典型的には５３０ｎｍを超える吸収極大を有し、観察できる蛍光をほとんどまたは全く有さず、化学発光体、リン光体（phosphor）、または蛍光体から放出されるような広範囲にわたる発光（luminescent emission）を効率的に消光する。一実施形態では、消光色素は置換ローダミンである。別の実施形態では、消光化合物は置換ロドールである。
さらに他の実施形態では、消光部分は、参照により本明細書に組み込まれる以下の特許、第７，０１９，１２９号、第７，１０９，３１２号、第７，５８２，４３２号、第８，４１０，０２５号、第８，４４０，３９９号、第８，６３３，３０７号、第８，９４６，４０４号、第９，０１８，３６９号、または第９，１３９，６１０号に記載されている、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）化合物（ＢＨＱ）として公知の、１つまたは複数の非蛍光消光剤を含んでもよい。
さらなる消光部分は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９９，９７５号、第６，７９０，９４５号、および第８，１１４，９７９号に開示されている。
光学シグナルの検出
一部の実施形態では、ポリマー分析物上の標識またはナノポア上のドナーを直接照射するために、励起ビームの送達と光学シグナルの収集が単一の対物レンズを通して起こる落射照明システムが使用され得る。本発明とともに使用する共焦点落射照明システムの基本的な構成要素を図４に示す。励起ビーム（４０２）はダイクロイックミラー（４０４）に向けられて対物レンズ（４０６）上に達し（４１２）、対物レンズ（４０６）は励起ビーム（４０２）を層状膜（４００）上に焦点を合わせ（４１０）、層状膜中で標識は、直接励起されて蛍光シグナルなどの光学シグナルを放出するか、またはＦＲＥＴ相互作用を介して間接的に励起されて光学シグナルを放出する。そのような光学シグナルは対物レンズ（４０６）によって収集され、光学シグナル（４１１）の光は透過するが励起ビーム（４０２）の光は反射するように選択されたダイクロイックミラー（４０４）に向けられる。光学シグナル（４１１）はレンズ（４１４）を通過し、このレンズは、光学シグナルをピンホール（４１６）に通して検出器（４１８）に焦点を合わせる。光学シグナル（４１１）が複数の蛍光標識からの蛍光シグナルを含む場合、さらなる光学的構成要素、フィルター、ビームスプリッター、モノクロメーターなどが、異なる蛍光標識からの異なる蛍光シグナルをさらに分離するために提供され得る。
一部の実施形態では、ヌクレオチド上の標識は、参照により本明細書に組み込まれるSoniら、Review of Scientific Instruments、８１巻：０１４３０１頁（２０１０年）、および米国特許出願公開第２０１２／０１３５４１０号において記載されている、図５で示すものに類似の装置を使用して、エバネッセント場によって励起され得る。この装置では、ナノポアまたはナノポアアレイのトランス側の非常に狭い第２のチャンバーによって、エバネッセント場が、ナノポアの入口および出口の両方で検出ゾーンを確立するための下層のガラススライドの表面から延在することが可能になり、それにより、ナノポアに関連するそれぞれの光学的測定値が、複数の標識されたヌクレオチドからの寄与を含有する。アパーチャーのアレイ（５００）（これは、脂質二重層内に挿入されたタンパク質ナノポアを含み得る）は、２０〜１００ｎｍの範囲の厚みを有し得る窒化ケイ素層（５０２）内に形成され得る。窒化ケイ素層（５０２）は、ケイ素支持層（５０３）に接して形成され得る。第２のチャンバー（５０６）は、窒化ケイ素層（５０２）、第２のチャンバー（５０６）の高さを決定する二酸化ケイ素層（５０４）、およびガラススライド（５１０）の表面（５０８）から形成され得る。二酸化ケイ素層（５０４）は、５０〜１００ｎｍの範囲の厚みを有し得る。窒化ケイ素層（５０２）を通って表面（５０８）から延在する所望のエバネッセント場（５０７）は、ガラススライド（５１０）に対して適切な角度で光ビーム（５１２）を向けてＴＩＲを生じさせることによって、確立され得る。標識されたポリヌクレオチド分析物をアレイ（５００）に通すために、シス（−）状態が第１のチャンバー（５１６）内で確立され得、およびトランス（＋）状態が第２のチャンバー（５０６）内で確立され得、電極が操作可能に第１および第２のチャンバー（５０６および５２１）に接続される。
混合光学シグナルでの配列の決定
一部の実施形態では、一連の光学シグナルは、各光学測定値が、異なる隣接したヌクレオチドからの複数の成分シグナルを含む、分解能限界区域から測定され得る（ポリヌクレオチド中でのその順序は単一の測定からは決定できず、それは、例えば、成分シグナルが回折限界区域内から生じるためである）。これらの状況下では、ポリヌクレオチドの光学に基づくナノポア分析は、（ｉ）２つ以上の標識されたヌクレオチドの配列からの重複する寄与を含む時系列の光学測定値を得、それにより、単一の測定からヌクレオチドの順序を決定することを不可能ではないにしても困難にし、および（ｉｉ）区別できるシグナルを発生するヌクレオチドの光学標識を選択することによって、光学測定値を、異なる種類のヌクレオチド上の異なる標識からの寄与に分離することができ、それによって、重複する測定値を配列情報に変換することを可能にする。
一態様では、本発明の方法は、下記のステップ：（ａ）ナノポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、区別できる光学シグナルを発生する異なる光学標識で標識され、ナノポアがヌクレオチドを拘束して、複数のヌクレオチドを包含する検出ゾーンを一列で通過させ、検出ゾーンが、ポリヌクレオチドに結合した消光剤が存在しないことを特徴とするステップ；（ｂ）ポリヌクレオチドが検出ゾーンを通過すると、ヌクレオチドからの時系列の光学シグナルを検出するステップ；（ｃ）異なる種類のヌクレオチドからの光学シグナルを分離するステップ；および（ｄ）ポリヌクレオチドからの時系列の分離された光学シグナルからヌクレオチドの配列を決定するステップによって行うことができる。
本発明によると、標識されたポリヌクレオチドがナノポアおよびその付随する検出ゾーンを通って移動するとき、時間順の光学測定値の組が記録される。隣接する時点の光学測定値は、各光学測定値が隣接するヌクレオチドの標識からの寄与を含有するという意味で、重複している。したがって、例えば、３つのヌクレオチドが各時点でシグナルを発生するならば（例えば、検出ゾーンを左から右に通過するポリヌクレオチド・・・−Ａ−（Ｂ−Ｃ−Ｄ）−・・・のＢ、Ｃ、およびＤ）、また、連続する測定の間で、１つのヌクレオチドが検出ゾーンを出て別のヌクレオチドが検出ゾーン（括弧で示される）に入るならば（例えば、Ａが入りＤが出る：−（Ａ−Ｂ−Ｃ）−Ｄ・・・）、２つの連続する光学測定値は、同一のヌクレオチドからの寄与を含有する（この例において、両測定値は、ＢおよびＣからの寄与を含む）。上記の例は、ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動の非常に簡略化したモデルに基づくものであるが、連続する重複する光学測定の概念は、ポリヌクレオチド移動のさらに複雑な説明に適用可能である。
ナノポアでの複数の異なる標識されたヌクレオチドからの発光は、同一の分解能限界区域に由来するため、ヌクレオチドについての相対的位置情報（特に、配列情報）は、単一の光学測定からは決定することができない。しかし、重複、およびヌクレオチド特異的なシグナルを発生する標識の使用が理由で、一部の実施形態では、配列情報は、時間順の光学シグナル測定値の組が複数の時間順のヌクレオチド特異的なシグナルの組に分けられる場合、時間順の光学シグナル測定値の組から決定され得る。標的ポリヌクレオチド配列をハイブリダイゼーションデータから再構築するためのシーケンシング・バイ・ハイブリダイゼーション（ＳＢＨ）において使用されるものに類似のアルゴリズムを使用して、ここで標的ポリヌクレオチドを再構築することができる。例えば、参照により組み込まれる、米国特許第５，００２，８６７号、Timpら、Biophys. J.、１０２巻：Ｌ３７〜Ｌ３９頁（２０１２年）など。（ｉ）時間順の重複するシグナルとシグナル、ならびに（ｉｉ）ヌクレオチド特異的成分へのそれらの分離、という制約によって、光学検出のケースでの決定ステップが大きく単純化する。
図６は、ナノポア移動の単純モデルに基づく時間順の重複する光学シグナルの組からヌクレオチド配列情報を決定するステップの一実施形態を示す。単純モデルは、各時間ステップ（ポリヌクレオチドがナノポアに入る時点およびナノポアから出る時点を除く）での光学測定値が、それぞれ、同数のヌクレオチド（図６では、測定がｎ個のヌクレオチドからの寄与を含有することを示すために「ｎタプル（n-tuple）」と呼ぶ）からのシグナル寄与を含有すると仮定する。さらに複雑なモデルによって、各測定における異なる数の寄与ヌクレオチド、移動速度の局所的変動、ヌクレオチドの直線状の動きにおける偏差などの現象が可能になり得ることが理解される。即ち、一部の実施形態では、異なる時間での光学測定値は、異なる数のヌクレオチドからの寄与を有し得る。一部の実施形態では、異なる数のヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのセグメントに沿って順序付けられる。図６によって例示される決定ステップは、標識されたポリヌクレオチドがナノポアを通過していること、および光学シグナルからヌクレオチド特異的なシグナルへの分離を含む時間順の光学測定の組が行われていることを仮定する（６００）。ポリヌクレオチドの流入および流出（entry and exit of a polynucleotide）は流入する際および流出する際には検出ゾーン内に異なる数のヌクレオチドが必ず存在するため、異なるように処理される。この実施形態では、これらの条件下での最初および最後の光学測定によって、最初および最後のヌクレオチドをそれらのヌクレオチド特異的なシグナルから直接決定することが可能になると仮定される。他の実施形態では、分析のための標識されたポリヌクレオチドの調製は、配列決定ステップを補助するための公知の一連の光学シグナルを発生させる目的で、そのような標識されたポリヌクレオチドの一方または両方の末端に複数の所定の標識されたヌクレオチドの挿入を含み得る。そのような所定の標識されたヌクレオチドは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔまたは４５４配列決定における鍵となる配列に類似する。例えば、参照により組み込まれる米国特許第７，５７５，８６５号。
図６に戻ると、決定ステップの開始時点で、時間インデックスｉはゼロに設定され、現時点ｉでの候補配列についてのインデックスｊは１に設定され（６０２）、ヌクレオチド特異的な時間順の光学シグナルの組の最初のｎタプルが試験される（６０４）。そのような試験は、時点ｉでの測定値から、測定値と一致する全ての考えられるヌクレオチドのｎタプルをまず決定し、次いで、これらのｎタプルから、どのｎタプルが候補配列Ｓｉに正確に重複するかを決定することを含む。測定値と一致する組についてのそれぞれの正確に重複するｎタプルによって、新たな候補配列Ｓｉ＋１が形成される（そして、配列Ｓｉが伸長する）（６０６）。新たな伸長した候補配列Ｓｉ＋１は保存され、時点ｉ＋１での候補配列の数を与えるインデックスＪｉ＋１がアップデートされる（６０８）。このステップは、全ての候補配列Ｓｉが試験されるまで反復され（６１０）、時間順の組の中の各光学測定値が試験されるまで、類似の試験が各時点ｉで行われる。
ナノポアおよびナノポアアレイ
本発明とともに使用するナノポアは、固体状態のナノポア、タンパク質ナノポア、または、タンパク質ナノポアもしくは有機ナノチューブ、例えば固体状態の膜もしくは同様のフレームワーク中に配置されたカーボンナノチューブもしくはグラフェンナノチューブを含む、ハイブリッドナノポアであってもよい。ナノポアの重要な特徴には、標識されたポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド分析物を拘束し、それによりそのモノマーがシグナル発生領域（または同様に、励起ゾーン、検出ゾーンなど）を順に通過することが含まれる。即ち、ナノポアは、ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチド分析物の動きを拘束し、それにより、ヌクレオチドが検出ゾーン（または励起領域）を一列で通過する。一部の実施形態では、ナノポアの追加的な機能には、（ｉ）二本鎖核酸もしくは同等に嵩高な分子を通過させずに一本鎖核酸を通過させること、および／または（ｉｉ）ヌクレオチド上の蛍光標識を拘束し、それにより、蛍光シグナル発生が抑制される、もしくは収集されないように方向付けられることが含まれる。
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスと併せて使用されるナノポアは、平面上に規則的に配置され得るナノポアのクラスターのアレイのような、アレイの形態で提供される。一部の実施形態では、異なるクラスターのナノポアからの光学シグナルが、用いられる光学検出システムによって区別可能であるように、クラスターはそれぞれ個別の分解能限界区域内にあるが、同じクラスター内のナノポアからの光学シグナルは、用いられる光学検出システムによって、そのようなクラスター内の特定のナノポアに必ずしも割り当てることができる必要はない。
固体状態のナノポアは、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）および二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）などを含むがこれらに限定されない様々な材料において製作されてもよい。ＤＮＡ配列決定などの分析の適用例に関するナノポアの製作および動作は、参照により組み込まれる以下の例示的な参考文献に開示されている：Ｌｉｎｇ，米国特許第７，６７８，５６２号；Ｈｕ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，３９７，２３２号；Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，４６４，８４２号；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，７９８，０４２号；Ｓａｕｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，００１，７９２号；Ｓｕ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，７４４，８１６号；Ｃｈｕｒｃｈ ｅｔ ａｌ，米国特許第５，７９５，７８２号；Ｂａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，４２６，２３１号；Ａｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第７，１８９，５０３号；Ｂａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，９１６，６６５号；Ａｋｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ，米国特許第６，２６７，８７２号；Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，米国特許公開第２００９／００２９４７７号；Ｈｏｗｏｒｋａ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２００９／００７７４３；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２０１１／０６７５５９；Ｍｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２００９／０２０６８２；Ｐｏｌｏｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２００８／０９２７６０；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚａａｇ ｅｔ ａｌ，国際特許公開ＷＯ２０１０／００７５３７；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５（６）：１１２９−１１３４（２００５）；Ｉｑｂａｌ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：２４３−２４８（２００７）；Ｗａｎｕｎｕ ｅｔ ａｌ，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，７（６）：１５８０−１５８５（２００７）；Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２：２０９−２１５（２００７）；Ｓｔｏｒｍ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，２：５３７−５４０（２００３）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２９（１３）：２７５４−２７５９（２００８）；Ｎａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，２３：２５９２−２６０１（２００２）；Ｚｈｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．，１７：３０４−３１３（２００７）；Ｈｅｎｒｉｑｕｅｚ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ，１２９：４７８−４８２（２００４）；Ｊａｇｔｉａｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｍｅｃｈ．Ｍｉｃｒｏｅｎｇ．，１６：１５３０−１５３９（２００６）；Ｎａｋａｎｅ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｏｎｄｅｎｓ．Ｍａｔｔｅｒ，１５ Ｒ１３６５−Ｒ１３９３（２００３）；ＤｅＢｌｏｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，４１（７）：９０９−９１６（１９７０）；Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４（４）：２６５−２７０（２００９）；Ｂａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ，米国特許公開第２００３／０２１５８８１号；など。
一部の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の光遮蔽層、即ち１つまたは複数の不透明層を有するナノポアアレイを含む。典型的には、ナノポアアレイはケイ素、窒化ケイ素、酸化ケイ素、酸化アルミニウムなどの材料の薄いシートとして製造され、これらは特に使用される厚み、例えば５０〜１００ｎｍ未満で容易に光を透過する。分析物の電気的検出にはこれは問題ではない。しかし、ナノポアを通過する標識された分子の光学に基づく検出においては、アレイを通して透過される光は意図された反応部位の外側の材料を常に励起し、それにより、例えば非特異的バックグラウンド蛍光、ナノポアにまだ入っていない分子の標識からの蛍光などの光学的ノイズを発生させる。一態様では、本発明は、励起ビームからの光を反射および／または吸収する１つまたは複数の光遮蔽層を有するナノポアアレイを提供し、それによりアレイのナノポアに付随する意図された反応部位において発生する光学シグナルへのバックグラウンドノイズを低減することによって、この問題に対処する。一部の実施形態では、意図された反応部位における光学標識が直接照明によって励起されることがこれによって可能になる。一部の実施形態では、不透明層は金属層であってもよい。そのような金属層はＳｎ、Ａｌ、Ｖ、Ｔｉ、Ｎｉ、Ｍｏ、Ｔａ、Ｗ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含んでよい。一部の実施形態では、そのような金属層はＡｌ、Ａｕ、ＡｇまたはＣｕを含んでよい。さらに他の実施形態では、そのような金属層はアルミニウムもしくは金を含んでよく、またはアルミニウムのみを含んでもよい。不透明層の厚みは広く変化してもよく、層を構成する材料の物理的および化学的特性による。一部の実施形態では、不透明層の厚みは少なくとも５ｎｍ、または少なくとも１０ｎｍ、または少なくとも４０ｎｍであってもよい。他の実施形態では、不透明層の厚みは５〜１００ｎｍの範囲であってもよく、他の実施形態では、不透明層の厚みは１０〜８０ｎｍの範囲であってもよい。不透明層は励起ビームからの光を１００パーセント遮蔽する（即ち反射しまたは吸収する）必要はない。一部の実施形態では、不透明層は励起ビームからの入射光を少なくとも１０パーセント遮蔽してもよく、他の実施形態では、不透明層は励起ビームからの入射光を少なくとも５０パーセント遮蔽してもよい。
不透明層またはコーティングは、当該技術分野で公知の種々の手法によって固体状態の膜上に製作することができる。化学蒸着法、電着、エピタキシー、熱酸化、蒸発およびスパッタリングなどの物理蒸着法、キャスティングなどの材料堆積手法を使用することができる。一部の実施形態では、原子層堆積を使用することができる。例えば参照により組み込まれる米国特許第６，４６４，８４２号；Weiら、Small、６巻（１３号）、１４０６〜１４１４頁（２０１０年）。
一部の実施形態では、１〜１００ｎｍのチャネルまたはアパーチャーが固体基材、通常は平面基材、例えば、膜を通って形成されてよく、一本鎖ＤＮＡなどの分析物がそこを通って移動するように誘発される。別の実施形態では、２〜５０ｎｍのチャネルまたはアパーチャーが基材を通って形成され、さらに別の実施形態では、２〜３０ｎｍ、または２〜２０ｎｍ、または３〜３０ｎｍ、または３〜２０ｎｍ、または３〜１０ｎｍのチャネルまたはアパーチャーが基材を通って形成される。ナノポアを生成する固体状態の手法は、堅牢で耐久性を提供すると同時にナノポアのサイズおよび形状を調整する能力、ウェハー規模でナノポアの高密度アレイを製作する能力、脂質ベースの系に比べて優れた機械的、化学的および熱的特性、ならびに電子または光学的読出し技法と一体化する可能性を提供する。一方、生物学的ナノポアは、再現性のある狭いボアまたは管腔、特に１〜１０ナノメートルの範囲にあるもの、ならびに従来のタンパク質を設計製作する方法によって、ナノポアの物理的および／または化学的性質を調整するための、かつＦＲＥＴドナーまたはアクセプターであってもよい蛍光標識などの基または要素を直接または間接的に結合させるための技法を提供する。タンパク質ナノポアは、典型的には、機械的支持体に関する繊細な脂質二重層に依拠し、精密な寸法を持つ固体状態のナノポアの製作は、依然として難しいままである。一部の実施形態では、固体状態のナノポアは、生物学的ナノポアと組合されていわゆる「ハイブリッド」ナノポアを形成し、これは、これらの欠点のいくつかを克服し、そうすることで固体状態のナノポアの安定性に生物学的ポアタンパク質の精密さを提供する。光学的読出し技法では、ハイブリッドナノポアが、ナノポアの精密な場所を提供し、このことがデータ獲得を大幅に単純化する。
一部の実施形態では、クラスターは、アパーチャーのアレイを含有する固相膜によって支持された脂質二重層内に、タンパク質ナノポアを配置することによって形成されてもよい。例えば、そのようなアレイは、固相支持体に製作された（例えば、穴を開けられ、またはエッチングされるなど）アパーチャーを含んでいてもよい。そのようなアパーチャーの幾何形状は、用いられる製作技法に応じて変わってもよい。一部の実施形態では、そのようなアパーチャーのそれぞれは、個別の分解能限界区域に関連付けられ、または包含され；しかし他の実施形態では、多数のアパーチャーが同じ分解能限界区域内にあってもよい。アパーチャーの断面積は、広く様々であってもよく、異なるクラスター間と同じでもそうでなくてもよいが、そのような面積は通常、従来の製作手法の結果と実質的に同じである。一部の実施形態では、アパーチャーは、１０から２００ｎｍの範囲の最小線寸法（例えば、円形アパーチャーの場合には直径）を有し、または約１００から３×１０４ｎｍ２の範囲の面積を有する。アパーチャーを横切って、脂質二重層が配置されてもよい。アパーチャー当たりのタンパク質ナノポアの分布は、例えば挿入ステップ中にタンパク質ナノポアの濃度を制御することによって、様々にしてもよい。そのような実施形態では、ナノポアのクラスターは、ランダムな数のナノポアを含んでいてもよい。タンパク質ナノポアがアパーチャーにランダムに挿入される一部の実施形態では、平均して１つまたは複数のアパーチャーを含有するクラスターは、ゼロよりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、０．２５よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、０．５よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、０．７５よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有し；他の実施形態では、そのようなクラスターは、１．０よりも大きい所定の数のタンパク質ナノポアを有する。
一部の実施形態では、本発明の方法およびデバイスは、ＳｉＮ膜などの固相膜を含み、それを通るアパーチャーのアレイを有して、第１のチャンバーと第２のチャンバー（場合によっては、「シスチャンバー」および「トランスチャンバー」とも呼ぶ）との間に連通を設け、第２のまたはトランスチャンバーに面する表面に脂質二重層を支持する。一部の実施形態では、そのような固相膜内のアパーチャーの直径は、１０から２００ｎｍの範囲または２０から１００ｎｍの範囲にあってもよい。一部の実施形態では、そのような固相膜は、そのような二重層がトランスチャンバーに面する表面のアパーチャーに跨る領域で、脂質二重層に挿入されたタンパク質ナノポアをさらに含む。一部の実施形態では、そのようなタンパク質ナノポアは、本明細書に記述される技法を使用して、固相膜のシス側から挿入される。一部の実施形態では、そのようなタンパク質ナノポアは、軸に沿ってバレルまたはボアを含み、かつ一端に「キャップ」構造を有し他端に「ステム」構造をするという点で（Ｓｏｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：１８５９〜１８６６頁（１９９６年）からの専門用語を使用する）、α−溶血素と同一のまたは類似の構造を有する。そのようなタンパク質ナノポアを使用する一部の実施形態では、脂質二重層への挿入は、そのキャップ構造がシスチャンバーに向けて露出し、かつそのステム構造がトランスチャンバーに向けて露出するように配向するタンパク質ナノポアをもたらす。
一部の実施形態では、本発明は、特にポリヌクレオチドの光学ベースのナノポア配列決定をするために、クラスターにおいてハイブリッドナノポアを用いてもよい。そのようなナノポアは、固体状態のオリフィスまたはアパーチャーを含み、その中に、タンパク質ナノポアなどのタンパク質バイオセンサーを安定して挿入する。帯電したポリヌクレオチドは、従来のタンパク質工学技術によってタンパク質ナノポア（例えば、アルファ溶血素）に結合させてもよく、その後、印加電場が、タンパク質ナノポアを固体状態の膜のアパーチャー内に案内するのに使用されてもよい。一部の実施形態では、固体状態の基材におけるアパーチャーは、タンパク質よりも僅かに小さくなるように選択され、これによってタンパク質がアパーチャーを移動するのを妨げる。代わりに、タンパク質は、固体状態のオリフィスに埋め込まれることになる。
固体状態または合成によるナノポアは、上記引用した参考文献に例示されるような様々な方法で調製され得る。一部の実施形態では、例えば参照により本明細書に組み込まれるＹａｎｇら、Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ、２２巻：２８５３１０頁（２０１１年）に開示されるように、ヘリウムイオン顕微鏡を使用して様々な材料に合成ナノポアを開けてもよい。自立型膜に加工された薄膜材料、例えば窒化ケイ素の１つまたは複数の領域を支持するチップを、ヘリウムイオン顕微鏡（ＨＩＭ）チャンバーに導入する。顕微鏡を低倍率に設定しながら、ＨＩＭモーター制御を使用して自立型膜をイオンビームの経路に導く。焦点および非点補正を含むビームパラメーターを、自立型膜に隣接するが固体基材上にある領域で調節する。パラメーターを適正に固定したら、自立型膜領域がイオンビームスキャン領域の中心になるようにかつビームがブランクされるように、チップ位置を移動させる。ＨＩＭの視野を、予想されるナノポアパターン全体を含有するのに十分な、かつ将来の光学読出しに役立てるのに十分な（即ち、光学倍率、カメラ解像度などに依存する）寸法（単位μｍ）に設定する。次いでイオンビームを、画素ドウェル時間で全視野を通して１回ラスター処理し、その結果、膜自動蛍光の全てまたはほとんどを除去するのに十分な全イオン線量が得られる。次いで視野を、適正な値（上記にて使用された場合よりも小さい）に設定して、単一ナノポアまたはナノポアのアレイのいずれかの、リソグラフィーにより画定されたミリングを行う。パターンの画素ドウェル時間は、試料加工前に較正試料の使用を通して決定された、１つまたは複数の所定の直径のナノポアをもたらすように設定する。この全プロセスを、単一チップ上でそれぞれ所望の領域で、および／またはＨＩＭチャンバーに導入された各チップごとに、繰り返す。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチドなど）を分析するための上記の方法を実施するためのデバイスは、典型的には、層状膜とナノポアとを横断する電場を確立するための一組の電極を含む。一本鎖核酸は、チャンバー内に陰極を配置することによって層状膜の「シス」側として配置された第１のチャンバー内の電解質の中に配置することによってナノポアに曝される。電場を印加すると、陰荷電を有する一本鎖核酸はナノポアに捕捉され、第２のチャンバー内に陽極を配置することによって膜の「トランス」側として配置された層状膜の反対側の第２のチャンバーに移動する。移動速度は、第１および第２のチャンバー内の電解質のイオン強度ならびにナノポアを横断して印加された電圧に部分的に依存する。光学に基づく検出においては、移動速度は、異なる電圧に対してナノポア当たりの予想される異なる速度でシグナルを発生する標識された一本鎖核酸の所定の標準を例えば使用する、予備的較正測定によって選択され得る。したがって、ＤＮＡ配列決定用途では、移動速度は、そのような較正測定からのシグナル速度に基づいて選択され得る。したがって、そのような測定から、例えばナノポアのアレイにわたって信頼できるヌクレオチドの同定が可能になるか最大化される電圧が選択され得る。一部の実施形態では、そのような較正は（所定の標準配列の代わりに、またはそれに加えて）、分析されるテンプレートの試料からの核酸を使用して行うことができる。一部の実施形態では、そのような較正は配列決定ランの間にリアルタイムで行ってもよく、印加する電圧は、例えばヌクレオチド特異的シグナルの取得を最大化するために、そのような測定に基づいてリアルタイムで改変してもよい。
ナノポアを通るポリヌクレオチドの移動速度の制御は、配列情報を得ることができるデータの収集を可能にするために必要である。移動速度は、ナノポアを横断する電圧差（または電場強度）、および、核酸ポリヌクレオチドが（例えば第１のチャンバーの１つの壁を構成する固相膜の中に配置された）ナノポアに曝される第１のチャンバーの反応混合物における条件に、部分的に依存する。ナノポアによる核酸ポリヌクレオチドの捕捉速度は、そのようなポリヌクレオチドの濃度に依存する。一部の実施形態では、ナノポア配列決定のための従来の反応混合物の条件、例えば１Ｍ ＫＣｌ（またはＮａＣｌ、ＬｉＣｌなどの等価の塩）およびｐＨ緩衝システム（これは例えば、使用するタンパク質、例えばタンパク質ナノポア、ヌクレアーゼなどが変性しないことを保証する）が、本発明とともに用いられ得る。一部の実施形態では、ｐＨ緩衝システムは、ｐＨを６．８から８．８の範囲の値に実質的に一定に保つために使用され得る。一部の実施形態では、ナノポアを横断する電圧差は７０から２００ｍＶの範囲であってもよい。他の実施形態では、ナノポアを横断する電圧差は８０から１５０ｍＶの範囲であってもよい。操作のための適切な電圧は、従来の測定手法を使用して選択され得る。ナノポアを横断する電流（または電圧）は、市販の機器を使用して容易に測定できる。電圧差は、移動速度が所望の範囲内になるように選択され得る。一部の実施形態では、移動速度の範囲は、１秒当たり１０００ヌクレオチド未満の速度を含む。他の実施形態では、移動速度の範囲は、１秒当たり１０から８００ヌクレオチドであり、他の実施形態では、移動速度の範囲は、１秒当たり１０から６００ヌクレオチドであり、他の実施形態では、移動速度の範囲は、１秒当たり２００から８００ヌクレオチドであり、他の実施形態では、移動速度の範囲は、１秒当たり２００から５００ヌクレオチドである。
相互消光標識および自己消光標識を用いる実施形態
上述のように、一部の実施形態では、ナノポアを出るヌクレオチド上の標識からの発光以外の蛍光の放出を低減するために、消光剤に加えて自己消光および相互消光蛍光標識を使用することができる。そのような蛍光標識の使用は、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０１２２８１２号に開示されている。一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドに結合している間に少なくとも３つの状態であることが可能な蛍光標識で、モノマーを標識する：（ｉ）実質的に消光した状態であって、結合した蛍光標識の蛍光が、すぐ隣りに隣接したモノマーの蛍光標識消光した状態；例えば、本発明によるポリヌクレオチドに結合した蛍光標識は、標識されたポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを研究し、操作するための従来の水溶液中で遊離しているとき、実質的に消光している。（ｉｉ）立体的に拘束された状態であって、自由溶液の運動または結合した蛍光標識のアライメントが破壊されまたは限定されて、蛍光標識から発生する検出可能な蛍光シグナルがほとんどまたは全くなくなるように、標識されたポリヌクレオチドが、ナノポアを移動している状態。（ｉｉｉ）遷移状態であって、ポリヌクレオチドがナノポアを移動しながら、蛍光標識がナノポアから出て行くときに（「遷移インターバル」中）、ポリヌクレオチドに結合した蛍光標識が、立体的に拘束された状態から消光状態に遷移する状態。
一部では、この例は、遷移インターバル中に、通常は蛍光標識（そうでなければ実質的に完全に標識され自己消光するポリヌクレオチド上の）が検出可能な蛍光シグナルを発生することが可能であるという発見の適用である。この発見を裏付けるいかなる理論にも限定するものではないが、遷移インターバルの間に発生した蛍光シグナルは、自由に回転可能な双極子起因すると考えられる。この発見を裏付けるいかなる理論にも限定するものではないが、遷移インターバルの間に発生した蛍光シグナルは、ナノポアから出現する、蛍光標識中の自由に回転可能な双極子の存在に起因すると考えられ、そのため蛍光標識は、例えば直接励起後に、またはＦＲＥＴを介する励起を介して蛍光シグナルを発生させることが一時的に可能になる。立体的拘束された状態ならびに消光状態では、共に、双極子はその回転自由度が限定され、それによって、放出される光子の数が低減しまたは限定される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドであり、通常は一本鎖ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであるが、特に一本鎖ＤＮＡである。一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがナノポアを通って移動するときに、結合した蛍光標識が１つずつナノポアから出て行くとき、その蛍光標識により発生したシグナルを記録することによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するための方法を含む。出る際に、結合した蛍光標識のそれぞれは、ナノポアにおける拘束状態から、自由溶液中のポリヌクレオチドでの消光状態へと、遷移インターバルの間に遷移する。言い換えれば、一部の実施形態では、本発明の方法のステップは、ナノポア中の拘束状態から自由溶液中のポリヌクレオチド上での消光状態へと遷移するときに、各蛍光標識を励起することを含む。上述のように、この遷移インターバルまたは期間の間に、蛍光標識は、それが結合するヌクレオチドを示す、検出可能な蛍光シグナルを放出することが可能である。
一部の実施形態では、本発明は、ポリヌクレオチドがナノポアを通って移動する間に、モノマーに結合した蛍光標識を強制的に拘束状態にして、蛍光標識が検出可能な蛍光シグナルを生成することができなくなる（または実質的にできなくなる）ように、蛍光標識およびナノポアを選択することができる、という発見の適用を含む。一部の実施形態では、ナノポアは、直径が１から４ｎｍの範囲にあるボアまたは管腔を有するように選択され；他の実施形態では、ナノポアは、直径が２から３ｎｍの範囲にあるボアまたは管腔を有するものが選択される。一部の実施形態では、そのようなボアの直径は、タンパク質ナノポアによって提供される。一部の実施形態では、そのようなナノポアは、本発明に従って、蛍光標識を強制的に拘束状態にするために使用され、したがって蛍光標識がナノポアから出るときはいつでも、蛍光シグナルを実質的に発生させることができない状態から、放出を誘発させることができる蛍光シグナルによって検出可能で識別可能な状態へと遷移する。このように、ポリヌクレオチドのモノマーの配列のそれぞれに結合した蛍光標識は、ナノポアの出口のすぐ隣りに隣接する領域で（「遷移ゾーン」または「遷移容積」または「検出ゾーン」）蛍光シグナルを突然発生させるので、逐次検出することができる。一部の実施形態では、有機蛍光色素を、上記直径のナノポアとともに蛍光標識として使用する。一部の実施形態では、少なくとも１つのそのような有機蛍光色素は、キサンタン色素、ローダミン色素、およびシアニン色素からなる組から選択される。ポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するための一部の実施形態は、下記のステップ：（ａ）ナノポアを通ってポリマーを移動させるステップであって、ポリヌクレオチドのモノマーが蛍光標識で標識され、検出可能なシグナルがその中で実質的に発生しないように、ナノポアがそのボア内の蛍光標識を拘束状態に拘束するステップと；（ｂ）ナノポアから出る際、各モノマーの蛍光標識を励起するステップと；（ｃ）検出ゾーンにおいて、出て行く蛍光標識によって発生した蛍光シグナルを測定して、蛍光標識が結合するモノマーを識別するステップと；（ｄ）検出ゾーンの外で励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと：（ｄ）蛍光シグナルの配列からポリヌクレオチドのモノマー配列を決定するステップとで実施される。さらなる実施形態では、蛍光標識はＦＲＥＴ対のアクセプターであり、ＦＲＥＴ対の１つまたは複数のドナーが、出口からＦＲＥＴ距離内のナノポアに結合する。
一部の実施形態では、上記使用される「実質的に消光した」は、蛍光標識が、同じ条件下であるが隣接した互いに消光する標識なくして発生したシグナルから、少なくとも３０パーセント低減した蛍光シグナルを発生させることを意味する。一部の実施形態では、上記使用される「実質的に消光した」は、蛍光標識が、同じ条件下であるが隣接した互いに消光する標識なくして発生したシグナルから、少なくとも５０パーセント低減した蛍光シグナルを発生させることを意味する。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４つの個別の反応を実施することによって決定され、これらの反応では、標的ポリヌクレオチドのコピーが、単一蛍光標識で標識された、その４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）のそれぞれを有する。そのような実施形態の変形例では、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、４つの個別の反応を実施することによって決定され、これらの反応では、標的ポリヌクレオチドのコピーが、１つの蛍光標識で標識されたその４つの異なる種類のヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ）のそれぞれを有し、それと同時に、同じ標的ポリヌクレオチドのその他のヌクレオチドは第２の蛍光標識で標識される。例えば、第１の蛍光標識が、第１の反応で標的ポリヌクレオチドのＡに結合する場合、第２の蛍光標識は、第１の反応において標的ポリヌクレオチドのＣ、Ｇ、およびＴ（即ち、「非Ａ」ヌクレオチド）に結合する。同様に、この例の続きとして、第２の反応では、第１の標識は、標的ポリヌクレオチドのＣに結合し、第２の蛍光標識は、標的ポリヌクレオチドのＡ、Ｇ、およびＴ（即ち、「非Ｃ」ヌクレオチド）に結合する。以下、ヌクレオチドＧおよびＴについても同様である。
同じ標識スキームは、ヌクレオチド型のサブセットに関する従来の専門用語の観点から表すことができ；したがって上記例において、第１の反応では、第１の蛍光標識がＡに結合し、第２の蛍光標識がＢに結合し；第２の反応では、第１の蛍光標識がＣに結合し、第２の蛍光標識がＤに結合し；第３の反応では、第１の蛍光標識がＧに結合し、第２の蛍光標識がＨに結合し；第４の反応では、第１の蛍光標識がＴに結合し、第２の蛍光標識がＶに結合する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはペプチドなどのポリマーを、単一の種類のモノマーに結合させた単一蛍光標識で標識し、例えば、ポリヌクレオチドの全てのＴ（または実質的に全てのＴ）が、蛍光標識、例えばシアニン色素で標識される。そのような実施形態では、ポリヌクレオチドからの蛍光シグナルの収集または配列が、特定のポリヌクレオチドに関するシグネチャーまたはフィンガープリントを形成し得る。一部のそのような実施形態では、そのようなフィンガープリントは、決定されるべきモノマーの配列に関する十分な情報を提供してもしなくてもよい。
一部の実施形態では、本発明の特徴は、互いに消光する組のメンバーである蛍光色素または標識による、ポリヌクレオチド分析物の実質的に全てのモノマーの標識付けである。ポリヌクレオチド分析物の標識付けに関連する「実質的に全ての」という用語の使用は、化学的および酵素標識技法が典型的には１００パーセント未満で効率的であることを認めることである。一部の実施形態では、「実質的に全ての」は、全てのモノマーの少なくとも８０パーセントに蛍光標識が結合していることを意味する。他の実施形態では、「実質的に全ての」は、全てのモノマーの少なくとも９０パーセントに蛍光標識が結合していることを意味する。他の実施形態では、「実質的に全ての」は、全てのモノマーの少なくとも９５パーセントに蛍光標識が結合していることを意味する。相互に消光する組の蛍光色素には、以下の性質がある：（ｉ）各メンバーは、全てのメンバーの蛍光を消光し（例えば、ＦＲＥＴによってまたは静止もしくは接触機構によって）、（ｉｉ）各メンバーは、励起したとき、および非消光状態にあるときに、明確な蛍光シグナルを発生する。即ち、互いに消光する組が２種の色素、Ｄ１およびＤ２からなる場合、（ｉ）Ｄ１は自己消光し（例えば、別のＤ１分子と接触消光することによって）、またＤ２によって消光し（例えば、接触消光によって）、（ｉｉ）Ｄ２は自己消光し（例えば、別のＤ２分子との接触消光によって）、またＤ１によって消光する（例えば、接触消光によって）。互いに消光する組に関して蛍光色素または標識を選択するための指針は、参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に見出すことができる：Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３５巻：１７〜２９頁（２００６年）；およびＭａｒｒａｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０巻：ｅ１２２（２００２年）など。一部の実施形態では、互いに消光する組のメンバーは、芳香環構造などの、相互作用を積み重ねることが可能な成分または部分である有機蛍光色素を含む。例示的な互いに消光する組の蛍光色素または標識は、ローダミン色素、フルオレセイン色素、およびシアニン色素から選択され得る。一実施形態では、互いに消光する組は、ローダミン色素、ＴＡＭＲＡ、およびフルオレセイン色素、ＦＡＭを含んでいてもよい。別の実施形態では、互いに消光する組の蛍光色素は、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ＥＸ、フルオレセインイソチオシアネート、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、Ｃａｌｃｅｉｎ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、１つまたは複数のＢＯＤＩＰＹ色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ５１４、および１つまたは複数のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒからなる群から２種またはそれ超の色素を選択することによって形成されてもよい。代表的なＢＯＤＩＰＹ色素には、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、およびＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５が含まれる。代表的なＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒには、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０、４０５、４３０、４８８、５００、５１４、５３２、５４６、５５５、５６８、５９４、６１０、６３３、６３５、６４７、６６０、６８０、７００、７５０、および７９０が含まれる。
上述のように、一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが互いに、または自己消光する蛍光標識で標識された異なる種類のモノマーをそれぞれ有する、個別の反応を実施することによって決定される（それぞれの種類のモノマーごとに１つ）。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドのモノマー配列は、標的ポリヌクレオチドのコピーが、同じ互いに消光する組から選択される、異なる互いに消光する蛍光標識で標識された異なる種類のモノマーのそれぞれを有する、個別の反応を実施することによって決定される（それぞれの種類のモノマーごとに１つ）。互いに消光する組が２種の色素のみを含む実施形態では、選択されたモノマー（即ち、モノマーＸ）は、第１の相互消光色素で標識され、他の全ての種類のモノマー（即ち、非モノマーＸ）は、同じ組からの第２の互いに消光する色素で標識される。このように、実施形態のステップは、一連の２つの異なる蛍光シグナル、モノマーＸを示すシグナルと、非モノマーＸを示す別のシグナルを発生させる。
一部の実施形態では、単一蛍光標識（例えば、多数の種類のモノマーを含むポリヌクレオチド中の、単一の種類のモノマーに結合させた）は、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドなど、ポリヌクレオチド上の隣接するモノマー（同じ種類の）に結合させたときに自己消光するものが使用されてもよい。例示的な自己消光蛍光標識には、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、フルオレセイン−ＥＸ、ＦＩＴＣ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ−Ｘ、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、カルセイン、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹＳ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄであって、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１１版（２０１０年）に開示されたものが含まれるが、これらに限定されない。
２つまたは３つの光学標識を利用する実施形態
一部の実施形態では、僅か２つの異なる種類のヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方における選択された種類のヌクレオチドについての区別できる光学シグナルを発生させる異なる光学標識で標識される。例えば、各標的ポリヌクレオチドの相補鎖のＣおよびＴを、標識された類似体によって置き換えることができ、この場合、Ｃ類似体およびＴ類似体の標識は異なる光学シグナルを発生し得る。標識された鎖がナノポアを通って移動することによって、光学的シグネチャーが次いで発生し、ナノポアでは鎖のヌクレオチドが拘束されて光学検出領域を連続的に通過し、この検出領域で、その標識によって光学シグナルが発生する。一部の実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方からの光学的シグネチャーからの情報を組み合わせて、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定される。
一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの選択された種類のヌクレオチドは、核酸ポリメラーゼを使用する伸長反応において、標識されたヌクレオチド類似体によって置き換えられる。標的ポリヌクレオチドの標識された鎖はナノポアを通って移動し、ナノポアでは鎖のヌクレオチドが拘束されて光学検出領域を一列で通過し、この検出領域で、ヌクレオチドは励起して光学シグナルを発生させる。個々の鎖についての光学シグナルの収集物を、本明細書では、鎖の光学的シグネチャーと呼ぶ。鎖およびその相補鎖（即ち、センス鎖およびアンチセンス鎖）が例えばヘアピンアダプターを介して連結している一部の実施形態では、単一の光学的シグネチャーには、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方のヌクレオチド上の光学標識からの光学シグナルが含まれ得る。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの異なる鎖が、２つの異なる光学的シグネチャーを個別に発生させ得、このシグネチャーが、上記のような分析のために組み合わされ得るか、または共に使用され得る。そのような個別に分析された鎖は、光学的シグネチャーの発生後に、例えば分子タグ（これは、例えば、位置、長さ、および配列パターン、ならびに容易な会合を可能にするための多様性が知られている標的ポリヌクレオチドに結合したオリゴヌクレオチドセグメントであり得る）を使用して会合され得る。以下に記述するように、本発明の光学的シグネチャーは、参照により本明細書に組み込まれる、Huberら、米国特許出願公開第２０１６００７６０９１号によって記載されているように、各検出間隔で検出されたシグナルが、分解能限界区域または解像限界容積内での複数の光学標識の放出の寄与を含み得るという点で、即ち、それが（例えば）混合ＦＲＥＴシグナルであり得るという点で、混合光学シグナルを含み得る。
上記のように、一部の実施形態では、本発明の方法は、下記のステップ：（ａ）二本鎖ポリヌクレオチドの鎖をコピーして、異なる光学標識を有するヌクレオチド類似体を、少なくとも２種類のヌクレオチドについて置換して、標識された鎖を形成するステップと；（ｂ）鎖の相補鎖をコピーして、前記ヌクレオチド類似体を、同一の少なくとも２種類のヌクレオチドについて置換して、標識された相補鎖を形成するステップと；（ｃ）ナノポアを通って標識された鎖を移動させて、標識された鎖のヌクレオチドを検出ゾーンに一列で通過させ、検出ゾーンで光学標識が励起して光学シグナルを発生するステップと；（ｄ）検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；（ｅ）標識された鎖がナノポアを通って移動すると光学標識からの時系列の光学シグナルを検出して、鎖の光学的シグネチャーをもたらすステップと；（ｆ）ナノポアを通って標識された相補鎖を移動させて、標識された相補鎖のヌクレオチドを励起ゾーンに一列で通過させ、励起ゾーンで光学標識が励起して光学シグナルを発生するステップと；（ｇ）検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；（ｈ）標識された相補鎖がナノポアを通って移動すると光学標識からの時系列の光学シグナルを検出して、相補鎖の光学的シグネチャーをもたらすステップと；（ｉ）鎖の光学的シグネチャーおよび相補鎖の光学的シグネチャーから二本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するステップとで実施され得る。一部の実施形態では、２種類のヌクレオチドは標識されており、それは、ＣおよびＴ、ＣおよびＧ、ＣおよびＡ、ＴおよびＧ、ＴおよびＡ、またはＧおよびＡであり得る。一部の実施形態では、ピリミジンヌクレオチドが標識される。他の実施形態では、プリンヌクレオチドが標識される。一部の実施形態では、鎖の選択された種類のヌクレオチドが、核酸ポリメラーゼを使用するプライマー伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドの標識された類似体ｄＮＴＰを組み込むことによって標識される。他の実施形態では、鎖の選択された種類のヌクレオチドが、異なる種類のヌクレオチドへの異なる標識の結合をその後の反応で可能にする直行反応性の官能性で類似体ｄＮＴＰが誘導体化される伸長反応において、選択された種類のヌクレオチドの類似体ｄＮＴＰを組み込むことによって標識される。この後者の標識アプローチは、参照により本明細書に組み込まれるJettら、米国特許第５，４０５，７４７号において開示されている。
一部の実施形態では、３種類のヌクレオチドが標識され、これには、第１の光学標識でのＣの標識、第２の光学標識でのＴの標識、ならびに第３の光学標識でのＧおよびＡの標識が含まれ得る。他の実施形態では、以下のヌクレオチド群が、以下に示すように標識され得る：それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＣおよびＧの標識、ならびに第３の光学標識でのＴおよびＡの標識；それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＣおよびＡの標識、ならびに第３の光学標識でのＴおよびＧの標識；それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＴおよびＧの標識、ならびに、第３の光学標識でのＣおよびＡの標識；それぞれ第１の光学標識および第２の光学標識でのＡおよびＧの標識、ならびに、第３の光学標識でのＴおよびＣの標識。
一部の実施形態では、光学標識は、ナノポアに会合するドナーからのエネルギー移動後に蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）シグナルを発生する、蛍光アクセプター分子である。一部の実施形態では、さらに以下に記載するように、ドナーは、例えば、量子ドット、ナノダイヤモンドなどの、光学的に活性なナノ粒子であり得る。アクセプター分子とドナーとの特定の組合せの選択は、当業者にとって設計上の選択である。一部の実施形態では、その一部を以下でより完全に記載するように、単一の量子ドットをナノポアに結合させ、この量子ドットが、その波長が通常はより短い波長に（即ち、より青方の波長に）十分に分離されておりそのためアクセプターによって発生するＦＲＥＴシグナルに寄与しない励起ビームを使用することで励起して、蛍光を発する。同様に、ＦＲＥＴ相互作用を容易にするために、その発光波長が両アクセプター分子の吸収帯に重複する量子ドットが選択される。一部の実施形態では、２つのドナーがナノポアの各励起ゾーンについて使用され得、ここで、それぞれの発光波長は、アクセプター分子の異なる一方の吸収帯に最適に重複するように選択される。
図７Ａでは、二本鎖標的ポリヌクレオチド（７００）（配列番号１）は、センス鎖（７０１）および相補的なアンチセンス鎖（７０２）からなり、それに対して、従来の方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Weissmanら、米国特許第６，２８７，８２５号；Schmittら、米国特許出願公開第２０１５／００４４６８号の方法を使用して、「Ｙ」アダプター（７０４）および（７０６）がライゲーションされる（７０３）。アダプター（それぞれ７０４および７０６）のアーム（７０８）および（７１０）は、プライマー（７１６）および（７１８）がアニーリングされる（７０５）プライマー結合部位を含む。二本鎖部分（７１２）および（７１４）はタグ配列を含み得、例えば、一方または両方が、例えば、鎖のそれぞれの光学的シグネチャーから配列情報を得るための、後の鎖の再会合に使用され得る所定の長さおよび組成のランダマーを含み得る。プライマー（７１６）および（７１８）をアニーリングした後、これらを、（例えば図説するように）標識されたｄＵＴＰ類似体（標識は、組み込まれたヌクレオチドにおいて白丸で示される）および標識されたｄＣＴＰ類似体（標識は、組み込まれたヌクレオチドにおいて黒丸で示される）、ならびに天然の標識されていないｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの存在下で、核酸ポリメラーゼによって伸長することができる（７０７）（標識されていないｄＴＴＰも標識されていないｄＣＴＰも存在せず、そのため、伸長した鎖では類似体は完全に置換されている）。ＧおよびＡ上での標識の不在は、組み込まれたヌクレオチドの上のダッシュで示される。ノイズを伴わない理想的な検出システムでは、白丸、黒丸、およびダッシュのこの配列が、示されるセンス鎖およびアンチセンス鎖がナノポアの励起ゾーンを通過するとそれらによって発生する光学的シグネチャーの良好な描写である。
図７Ｂでは、３つの標識を利用する代替的な実施形態での伸長産物（７２０）および（７２２）が示される。上記のように、組み込まれた標識されたｄＵＴＰ類似体は白丸で示され、組み込まれた標識されたｄＣＴＰ類似体は黒丸で示される。組み込まれた標識されたｄＡＴＰ類似体およびｄＧＴＰ類似体は、黒いダイヤ形として示される。
標識するためのヌクレオチドの種類、それを塩基に結合させるための標識およびリンカーの種類、ならびにｄＮＴＰ類似体の存在下での伸長反応のための核酸ポリメラーゼの選択におけるガイダンスは、参照により組み込まれる以下の参考文献、Goodmanら、米国特許第５，９４５，３１２号；Jettら、米国特許第５，４０５，７４７号；Muehleggerら、米国特許出願公開第２００４／０２１４２２１号；Gillerら、Nucleic Acids Research、３１巻（１０号）：２６３０〜２６３５頁（２００３年）；Tasaraら、Nucleic Acids Research、３１巻（１０号）：２６３６〜２６４６頁（２００３年）；Augustinら、J. Biotechnology、８６巻：２８９〜３０１頁（２００１年）；Brakmann、Current Pharmacuetical Biotechnology、５巻（１号）：１１９〜１２６頁（２００４年）などに見出すことができる。本発明とともに使用するための例示的な核酸ポリメラーゼには、これだけに限らないが、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｔａｑ、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｐｏｌ Ｉ、Ｔｇｏ ｅｘｏ−、Ｋｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−などが含まれる。一部の実施形態では、例示的な核酸ポリメラーゼには、これだけに限らないが、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−およびＫｌｅｎｏｗ断片ｅｘｏ−が含まれる。ｄＮＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー１、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー２、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６３５、ＭＲ１２１、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれる。ｄＵＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＭＣＡ、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｄｙ６３０、Ｄｙ６６５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｅｖｏｂｌｕｅ ９０、フルオレセイン、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー１、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー２、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、ＭＲ１２１、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれる。ｄＣＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、ローダミン、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、ＴＡＭＲＡなどが含まれる。ｄＡＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ａｔｔｏ ６５５、Ｃｙ５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎなどが含まれる。ｄＧＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識には、これだけに限らないが、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎなどが含まれる。ｄＵＴＰ類似体およびｄＣＴＰ類似体のための例示的な蛍光標識対には、これだけに限らないが、（ＴＡＭＲＡ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、（Ａｔｔｏ ６５５、Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ａｔｔｏ ６５５）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３）、（Ｅｖｏｂｌｕｅ ３０、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、（Ｇｎｏｔｈｉｓブルー１、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ）、（Ｇｎｏｔｈｉｓブルー２、Ａｔｔｏ ６５５）、（Ｇｎｏｔｈｉｓブルー３、Ｃｙ５）などが含まれる。
図７Ｃは、２つの標識が使用され、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０１５２４９２号および米国特許出願公開第２０１２／００５８４６８号において教示されているように、センス鎖およびアンチセンス鎖がヘアピンアダプター（７３０）によって連結している、実施形態を説明する。尾状アダプター（７３２）およびヘアピンアダプター（７３０）は、標的ポリヌクレオチド（７００）（配列番号１）にライゲーションされる。プライマー（７３４）の変性およびアニーリングの後、伸長反応によって、セグメント（７３６）、鎖（７０１）およびセグメント（７３８）の標識された相補鎖、鎖（７０１）の標識された逆相補鎖を含む、伸長産物（７３５）が生成する。伸長産物（７３５）がナノポアを通って移動し、光学的シグネチャーが発生した後、標的ポリヌクレオチド（７００）（配列番号１）の配列を決定することができる。必要に応じて、所定のパターンの標識が伸長反応の間に組み込まれるようにヘアピン（７３０）の配列を選択してもよく、これは、例えば、どこでセグメント（７３６）が終了し、どこでセグメント（７３８）が開始するかなどを示すことによって、光学的シグネチャーの分析の補助に使用することができる。
キット
本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを含み得る。一部の実施形態では、キットは、標的ポリヌクレオチドに結合させた蛍光標識によって発生する蛍光シグナルの消光に適した１つまたは複数の消光剤を含む。例えば、キットは、その吸収帯が標的ポリヌクレオチド上の蛍光標識の発光帯に最も重複する消光剤を含むように設計され得る。一部の実施形態では、キットの消光剤は、消光部分にコンジュゲートしたポリヌクレオチド結合部分を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド結合部分は、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドまたはその類似体を含む。一部の実施形態では、キットの消光剤は、所定の濃度で提供される。一部の実施形態では、消光剤のそのような所定の濃度は、検出ゾーンの容積を決定するように選択される。
定義
「エバネッセント場」は、非伝播性の電磁場を意味し、即ち、これは、ポインティング・ベクトルの平均値がゼロである電磁場である。
「ＦＲＥＴ」または「Ｆｏｒｓｔｅｒまたは蛍光共鳴エネルギー移動」は、励起されたドナーフルオロフォアから基底状態のアクセプターフルオロフォアへの非放射性双極子−双極子エネルギー移動メカニズムを意味する。ＦＲＥＴ相互作用におけるエネルギー移動の速度は、ドナーの放出スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとのスペクトルの重なりの程度、ドナーの量子収率、ドナーおよびアクセプターの遷移双極子の相対的な配向、ならびにドナー分子とアクセプター分子との間の距離に依存し、Ｌａｋｏｗｉｔｚ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、第３版、（Springer、２００６年）がある。特定の目的のＦＲＥＴ相互作用は、アクセプターに伝達され、次にそのドナーを励起する光の周波数よりも低い周波数で、光子としてアクセプターにより放出される、エネルギーの一部をもたらすものである（即ち、「ＦＲＥＴシグナル」）。「ＦＲＥＴ距離」は、ＦＲＥＴ相互作用を引き起こすことができ、かつ検出可能なＦＲＥＴシグナルがＦＲＥＴアクセプターによって生成される、ＦＲＥＴドナーとＦＲＥＴアクセプターとの間の距離を意味する。
「キット」は、本発明の方法を実施するために材料または試薬を送達するための任意の送達システムを指す。反応アッセイの文脈では、そのような送達システムは、１つの位置から別の位置への反応試薬（例えば蛍光標識、例えば、適切な容器内の、相互に消光する蛍光標識、蛍光標識結合剤、酵素、消光剤など）の保存、輸送、または送達を可能にするシステムおよび／もしくは化合物（例えば、希釈剤（dilutant）、界面活性剤、担体など）、ならびに／またはサポート材料（例えば、バッファ、アッセイを行うための文書による指示など）を含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／またはサポート材料を含有する１つまたは複数の封包物（例えば箱）を含む。そのような内容物は、目的のレシピエントに、共にまたは個別に送達することができる。例えば、第１の容器はアッセイで使用するための酵素を含有していてよく、一方、第２のまたはさらなる容器は、相互に消光する蛍光標識および／または消光剤を含有する。
「ナノポア」は、基材が所定のまたは識別可能な順序で分析物を通る、またはポリマー分析物の場合、そのモノマー単位が所定のまたは識別可能な順序で基材を通るのを可能にする、基材に位置決めされた任意の開口を意味する。後者の場合、所定のまたは識別可能な順序は、ポリマー中のモノマー単位の一次配列であってもよい。ナノポアの例には、タンパク質様またはタンパク質ベースのナノポア、合成または固体状態のナノポア、およびタンパク質ナノポアがその内部に埋め込まれている固体状態のナノポアを含むハイブリッドナノポアが含まれる。ナノポアは、内径が１〜１０ｎｍまたは１〜５ｎｍまたは１〜３ｎｍであってもよい。タンパク質ナノポアの例には、アルファ−溶血素、電圧依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、ＭｓｐＡ、およびＬａｍＢ（マルトポリン）、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｈｅｅ，Ｍ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２５巻（４号）（２００７年）：１７４〜１８１頁；Ｂａｙｌｅｙら（前掲）；Ｇｕｎｄｌａｃｈら、米国特許公開第２０１２／００５５７９２号などに開示されているものが含まれるが、これらに限定されない。単一核酸分子の通過を可能にする任意のタンパク質ポアを用いてもよい。ナノポアタンパク質は、ポアの外側の特定の部位で、またはポア形成タンパク質を構成する１つまたは複数のモノマー単位の外側の特定の部位で標識されてもよい。ポアタンパク質は、アルファ−溶血素、ＭｓｐＡ、電圧依存性ミトコンドリアポリン（ＶＤＡＣ）、アンスラックスポリン、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＣ、およびＬａｍＢ（マルトポリン）などであるがこれらに限定されないタンパク質の群から選択される。固体状態のホールへのポアタンパク質の一体化は、帯電したポリマーをポアタンパク質に結合することによって実現される。電場を印加した後、帯電した複合体を、電気泳動によって固体状態のホールに引き込む。合成ナノポアまたは固体状態のナノポアは、様々な形態の固体基材中に創出されてもよく、その例には、シリコーン（例えば、Ｓｉ３Ｎ４、ＳｉＯ２）、金属、金属酸化物（例えば、Ａｌ２Ｏ３）、プラスチック、ガラス、半導体材料、およびこれらの組合せが含まれるがこれらに限定されない。合成ナノポアは、脂質二重層膜内に位置決めされた生物学的タンパク質ポアよりも安定と考えられる。合成ナノポアは、重合エポキシなどであるがこれに限定されない適切な基材に埋め込まれたカーボンナノチューブを使用することによって、創出されてもよい。カーボンナノチューブは、均一で十分定められた化学的および構造的性質を有することができる。１から数１００ナノメートルに及ぶ様々なサイズのカーボンナノチューブを得ることができる。カーボンナノチューブの表面電荷は、約ゼロであることが公知であり、その結果、ナノポアを通る核酸の電気泳動輸送は単純かつ予測可能になる（Ｉｔｏ，Ｔ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２巻（２００３年）：１４８２〜８３頁）。合成ナノポアの基材表面は、タンパク質ポアの共有結合による結合が可能になるようにまたは表面特性を光学ナノポア配列決定に適切なものにするように、化学修飾されてもよい。そのような表面修飾は、共有結合または非共有結合にすることができる。ほとんどの共有結合による修飾は、オルガノシラン堆積を含み、それに関する最も一般的なプロトコールが記述されている：１）水性アルコールからの堆積。これはシリル化表面を調製するための最も容易な方法である。９５％エタノール−５％水の溶液を、酢酸でｐＨ４．５〜５．５に調節する。シランを、撹拌しながら添加して、２％の最終濃度が得られる。加水分解およびシラノール基形成の後、基材を２〜５分間添加する。濯いだ後、過剰な材料は、エタノール中に短時間浸漬することによってなくなる。シラン層の硬化は、摂氏１１０度で５〜１０分である。２）気相堆積。乾燥非プロトン性条件下、化学気相堆積法によって、シランを基材に付着させることができる。これらの方法は、単層堆積が容易である。閉鎖チャンバーのデザインで、５ｍｍの蒸気圧が達成されるような十分な温度に基材を加熱する。あるいは、シランの蒸発が観察されるまで、真空を印加することができる。３）スピンオン堆積。スピンオン付着は、最大源の官能化および多層堆積が好まれる加水分解条件下で、または単層堆積が好まれる乾燥条件下で行うことができる。一部の実施形態では、単一ナノポアが本発明では用いられる。他の実施形態では、複数のナノポアが用いられる。後者の実施形態のいくつかでは、複数のナノポアを、ナノポアのアレイとして用い、これらは固相膜などの平面基材に通常は堆積される。ナノポアアレイのナノポアは、規則的に、例えば直線的なパターンで、間隔を空けて配置されてもよく、またはランダムに間隔を空けて配置されてもよい。好ましい実施形態では、ナノポアは、平面状の固相基材において、直線上のパターンとして規則的に間隔を空けて配置される。
「ポリマー」は、直鎖状に接続された複数のモノマーを意味する。通常、ポリマーは、複数のタイプのモノマーを、例えばＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴを含むポリヌクレオチドとして、または複数の種類のアミノ酸を含むポリペプチドとして含む。モノマーは、ヌクレオシドおよびその誘導体または類似体、ならびにアミノ酸およびその誘導体および類似体を、限定することなく含んでいてもよい。一部の実施形態では、ポリマーは、ヌクレオシドモノマーがホスホジエステル結合によって接続されているポリヌクレオチド、またはその類似体である。
「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、それぞれヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマー、またはその類似体を意味する。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを構成するモノマーは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対合、塩基スタッキング、またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎもしくは可逆的Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対合などの、モノマー間相互作用の規則的なパターンを経て天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することが可能である。そのようなモノマーおよびそれらのヌクレオシド間連結は、天然に生じてもよく、またはその類似体、例えば、天然に存在するか、または天然に存在しない類似体であってもよい。天然に存在しない類似体は、ＰＮＡ、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結、およびフルオロフォアまたはハプテンなどの標識の結合を可能にする連結基を含有する塩基などを含んでいてもよい。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に際してポリメラーゼによる伸長またはリガーゼによるライゲーションなどの酵素処理を必要とするときにはいつでも、当業者には、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがそれらの場合に任意のまたはいくつかの位置でヌクレオシド間連結、糖部分、または塩基の類似体を含有しなくてもよいことを理解するであろう。ポリヌクレオチドは、典型的にはそのサイズが、それらが通常「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる場合には、数モノマー単位、例えば５〜４０単位から、数千モノマー単位に及ぶ。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字（大文字または小文字）の配列によって表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順序であり、文脈から他に指示されずまたは明らかにされない限り、「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｉ」はデオキシイノシンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことが理解されよう。他に記述されない限り、専門用語および原子付番規則は、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年）に開示されたものに従うことになる。通常、ポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された４種の天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡに関してはデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンであり、またはＲＮＡに関してはそれらのリボース対応物である）を含み；しかし、それらは、例えば修飾された塩基、糖、またはヌクレオチド間の結合を含む非天然ヌクレオチド類似体を含んでいてもよい。酵素が、活性に関して特定のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基材要件、例えば一本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖などを有する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基材に適切な組成物の選択は、特にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９年）などの論文および同様の参考文献による指針により、十分に当業者の知識の範囲内にあることは、当業者には明らかである。同様に、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、一本鎖の形態または二本鎖の形態（即ち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの二重鎖と、そのそれぞれの相補体）を指してもよい。どの形態が意図されるのかまたは両方の形態が意図されるのか否かは、用語の使用の文脈から、当業者には明らかであろう。
「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートとの二重鎖の形成に際して、核酸合成の開始点として作用することができ、その３’末端からテンプレートに沿って伸長されて、それにより伸長された二重鎖を形成することができる、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどの核酸ポリメラーゼによって行なわれる。伸長プロセスにおいて添加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは通常、１４〜４０ヌクレオチドの範囲、または１８〜３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは種々の核酸増幅反応、例えば単一のプライマーを使用する直線的増幅反応、または２つもしくはそれより多いプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に用いられる。特定の用途のためのプライマーの長さおよび配列の選択のガイダンスは、参照により組み込まれる以下の参考文献：Dieffenbach編、PCR Primer:A Laboratory Manual、第２版（Cold Spring Harbor Press、New York、２００３年）で証明されるように、当業者には周知である。
「分解能限界区域」は、その中では個々の特徴または発光源を光学シグナル検出システムによって区別することができない、ナノポアアレイまたはナノウェルアレイの表面の一区域である。理論に拘束されることは意図しないが、そのような分解能限界区域は、光学システムの解像限界（「回折限界」または「回折障壁」とも呼ばれることがある）によって決定される。そのような限界は、発光源の波長と光学成分とによって決定され、式中、ｄが、解像され得る最小の特徴であり、λが光の波長であり、ＮＡが光を集めるために使用される対物レンズの開口数である、ｄ＝λ／ＮＡによって定義され得る。したがって、２つまたはそれを超えるナノポアが分解能限界区域内にあり、２つまたはそれを超える光学シグナルがそれぞれのナノポアで発生する場合はいつも、光学検出システムは、どの光学シグナルがどのナノポアに由来したかを区別または決定することができない。本発明によると、ナノポアアレイの表面は、分解能限界区域に対応する、重複していない領域または実質的に重複していない領域に分割または細分され得る。分解能限界区域に対応するそのような細分化のサイズは、利用する特定の光学検出システムに依存し得る。一部の実施形態では、発光源が可視スペクトル内にある場合はいつも、分解能限界区域は３００ｎｍ２から３．０μｍ２の範囲内であり、他の実施形態では、分解能限界区域は１２００ｎｍ２から０．７μｍ２の範囲内であり、他の実施形態では、分解能限界区域は３×１０４ｎｍ２から０．７μｍ２の範囲内であり、ここで、区域の前記範囲は、ナノポアアレイまたはナノウェルアレイの表面に関してのものである。一部の実施形態では、可視スペクトルは、約３８０ｎｍから約７００ｎｍの範囲内の波長を意味する。
ポリヌクレオチドに言及する際の「配列決定」、「配列決定すること」または「ヌクレオチド配列を決定すること」または同様の用語は、ポリヌクレオチドの部分的ならびに完全な配列情報の決定を含む。すなわち、上記用語は、４種の天然ヌクレオチド、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの全ての組のサブセットの配列、例えば標的ポリヌクレオチドのＡおよびＣのみの配列などを含む。即ち用語は、標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの４つのタイプの１つ、２つ、３つ、または全ての同一性、順序、および場所を決定することを含む。一部の実施形態では、用語は、標的ポリヌクレオチド内のヌクレオチドの４つのタイプの２つ、３つ、または全ての同一性、順序、および場所を決定することを含む。一部の実施形態では、配列決定は、標的ポリヌクレオチド「ｃａｔｃｇｃ．．．」内のヌクレオチドの単一タイプ、例えばシトシンの、順序および場所を識別することによって実現されてもよく、したがってその配列は、「ｃ−（非ｃ）（非ｃ）ｃ−（非ｃ）−ｃ．．．」などを表すバイナリーコード、例えば「１００１０１．．．」として表されるようになる。一部の実施形態では、用語は、標的ポリヌクレオチドのフィンガープリントとしての役割をする標的ポリヌクレオチドの配列を含んでいてもよく；即ち、一組のポリヌクレオチド内の標的ポリヌクレオチドまたは標的ポリヌクレオチドのクラスを独自に識別する配列であり、例えばセルによって表される全ての異なるＲＮＡ配列である。
本開示は、記述される特定の形態の範囲を限定するものではなく、本明細書に記述される変形例の代替例、修正例、および均等物を包含するものとする。さらに、本開示の範囲は、本開示に鑑み当業者に明らかになり得るその他の変形例を、完全に包含する。本発明の範囲は、添付される特許請求の範囲によってのみ限定される。

Claims (22)

  1. ポリヌクレオチドを分析する方法であって、
    ナノポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるステップであって、該ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、区別できる蛍光シグナルを発生する異なる蛍光標識で標識され、該ナノポアが該ヌクレオチドを拘束して検出ゾーンを一列で通過させるステップと；
    該蛍光標識を励起するステップと；
    非蛍光消光剤を使用して該検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；
    該蛍光標識が該検出ゾーンを通過すると、前記蛍光標識から放出された蛍光シグナルを検出するステップと；
    該検出された蛍光シグナルからヌクレオチドの配列を決定するステップと
    を含む方法。
  2. 前記非蛍光消光剤が、少なくとも１つの消光部分を結合したオリゴヌクレオチドを含み、前記ナノポアが一本鎖核酸のみを移動させ、それにより、該非蛍光消光剤が前記ポリヌクレオチドに結合する場合にはいつも、該非蛍光消光剤が、移動の間に該ポリヌクレオチドから除去される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ナノポアが出口を有し、前記検出ゾーンが、該出口に隣接しそれを包含する容積を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ポリヌクレオチドがある移動速度を有し、前記検出ゾーンの前記容積が、前記出口での該ポリヌクレオチドの該移動速度および前記非蛍光消光剤の濃度によって決定される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記非蛍光消光剤が二本鎖インターカレーターを含み、前記ナノポアが一本鎖核酸のみを移動させ、それにより、該非蛍光消光剤が前記ポリヌクレオチド内にインターカレートする場合にはいつも、該非蛍光消光剤が、移動の間に該ポリヌクレオチドから除去される、請求項１に記載の方法。
  6. ポリヌクレオチドを分析する方法であって、
    出口を有するナノポアを通ってポリヌクレオチドを移動させるステップであって、該ポリヌクレオチドの異なる種類のヌクレオチドが、区別できる蛍光シグナルを発生する異なる蛍光標識で標識され、該ナノポアが該ヌクレオチドを拘束して該ナノポアの該出口にある検出ゾーンを一列で通過させるステップと；
    該蛍光標識を励起するステップと；
    該ポリヌクレオチドに結合する非蛍光消光剤を使用して該検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを消光するステップと；
    該蛍光標識が該検出ゾーンを通過すると、該蛍光標識から放出された蛍光シグナルを検出するステップと；
    該検出された蛍光シグナルからヌクレオチドの配列を決定するステップと
    を含む方法。
  7. 前記非蛍光消光剤が、少なくとも１つの消光部分を結合させたオリゴヌクレオチドを含み、前記ナノポアが一本鎖核酸のみを移動させ、それにより、該非蛍光消光剤が前記ポリヌクレオチドに結合する場合にはいつも、該非蛍光消光剤が、移動の間に該ポリヌクレオチドから除去される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記検出ゾーンが、前記出口に隣接しそれを包含する容積を含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記ポリヌクレオチドがある移動速度を有し、前記検出ゾーンの前記容積が、前記出口での該ポリヌクレオチドの該移動速度および前記非蛍光消光剤の濃度によって決定される、請求項８に記載の方法。
  10. ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法であって、
    （ａ）第１の側面、第２の側面、およびそれらを通る複数のナノポアを有する固相膜を含むナノポアアレイを提供するステップであって、該固相膜が第１のチャンバーと第２のチャンバーを分離し、それにより各ナノポアが該第１のチャンバーと該第２のチャンバーとの間の流体連通を提供し、各ナノポアが該第２のチャンバーへの出口を有し、二本鎖核酸ではなく一本鎖核酸を通過させるような寸法であり、各ナノポアが、移動するポリヌクレオチドのヌクレオチドを拘束して、その出口で検出ゾーンを一列で通過させるステップと；
    （ｂ）該ナノポアを通して該第１のチャンバーから該第２のチャンバーにポリヌクレオチドを移動させるステップであって、異なる種類のヌクレオチドが、区別できる蛍光シグナルを発生する異なる蛍光標識で標識されるように、各ポリヌクレオチドが、そのヌクレオチドに結合させた１つまたは複数の蛍光標識を有するステップと；
    （ｃ）該蛍光標識に励起ビームを照射するステップと；
    （ｄ）該検出ゾーンの外側の励起された蛍光標識からの蛍光シグナルを、該ポリヌクレオチドに結合する非蛍光消光剤で消光するステップと；
    （ｅ）該検出ゾーン内の該蛍光標識からの蛍光シグナルを検出するステップと；
    （ｆ）該検出された蛍光シグナルから該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定するステップと
    を含む方法。
  11. 前記固相膜が、前記励起ビームの伝送を実質的に遮蔽する不透明層を含み、前記照射するステップおよび前記検出するステップが落射照明システムを含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記非蛍光消光剤が、臭素基、ヨウ素基、ニトロ基、アゾ基によって共有結合で修飾された一本鎖ＤＮＡ結合性色素である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記一本鎖ＤＮＡ結合性色素が非対称シアニン色素である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記非蛍光消光剤が結合部分および消光部分を含む、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記結合部分がオリゴヌクレオチドまたはその類似体である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記消光部分が、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）化合物、シアニン消光化合物、キサンテン消光剤、またはアントラキノン消光化合物である、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記検出ゾーンが、前記第２のチャンバー内の前記ポリヌクレオチドの移動速度および前記非蛍光消光剤の濃度によって決定される、請求項１０に記載の方法。
  18. 前記第１のチャンバーがシスチャンバーであり、前記第２のチャンバーがトランスチャンバーである、請求項１０に記載の方法。
  19. 前記固相膜が不透明層を含み、前記照射するステップが、落射照明システムで実施される、請求項１０に記載の方法。
  20. 前記ナノポアアレイの前記ナノポアが、それぞれ、前記固相膜のアパーチャー内に固定化されたタンパク質ナノポアを含む、請求項１０に記載の方法。
  21. 前記異なる種類のヌクレオチドの少なくとも２つが、少なくとも２つの前記異なる蛍光標識で標識される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記検出するステップおよび決定するステップが、（ｉ）ポリヌクレオチドが検出ゾーンを通過すると、前記蛍光標識からの時系列の前記蛍光シグナルを検出するステップ；（ｉｉ）異なる種類のヌクレオチドからの蛍光シグナルを分離するステップ；および（ｉｉｉ）ポリヌクレオチドからの時系列の分離された蛍光シグナルからヌクレオチドの配列を決定するステップを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
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