JP2002501102A

JP2002501102A - 非対称シアニン色素クエンチャー

Info

Publication number: JP2002501102A
Application number: JP2000528627A
Authority: JP
Inventors: リンダジー．リー，; ロナルドジェイ．グラハム，; カイルザーマンビー．ミュラー，; フランシスティー．ハクゾ，
Original assignee: PE Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1998-01-23
Filing date: 1999-01-19
Publication date: 2002-01-15
Anticipated expiration: 2019-01-19
Also published as: EP1049744B1; JP2004323839A; US6750024B2; US7166715B2; US6348596B1; AU2238399A; WO1999037717A1; US6541618B1; EP1049744A1; US6080868A; CA2318160A1; DE69900813D1; AU740989B2; JP3946443B2; CA2318160C; US20030207305A1; US20050009058A1; ATE212367T1; DE69900813T2; JP4471711B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、構造（１）（その置換形態を含む）を有する非対称シアニン色素化合物を提供し、ここでＲ₁およびＲ₂の少なくとも１個は連結基であり、ＸはＯ、ＳまたはＳｅであり、そしてｎは０〜２の範囲である。本発明は、さらに、非対称シアニン色素を含むレポーター−クエンチャー色素対、非対称シアニン色素を取込む色素−標識化ポリヌクレオチドおよび色素−標識化ポリヌクレオチドを利用するハイブリダイゼーション検出方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、レポーター−クエンチャーエネルギー−移動色素対でクエンチャー
として有用な色素化合物に関する。より詳細には、本発明は、シアニンクエンチ
ャー化合物、このような化合物を取込む試薬、このような化合物および／または
試薬を利用する方法に関する。

【０００２】（背景）核酸ハイブリダイゼーションアッセイは、現代生物学において重要な分類の技
術に含まれる。このようなアッセイは、多様な適用を有し、遺伝病の診断、ヒト
の同定、微生物の同定、親子鑑定、ウイルス学、およびＤＮＡ塩基配列決定（す
なわちハイブリダイゼーションによる塩基配列決定）が挙げられる。

【０００３】核酸ハイブリダイゼーションアッセイの重要な局面は、ハイブリダイゼーショ
ンの検出を容易とするために使用される方法である。核酸ハイブリダイゼーショ
ンアッセイにおいて使用される特に重要な分類の方法は、「レポーター」色素お
よび「クエンチャー」色素を含むレポーター−クエンチャーエネルギー−移動色
素対を利用する。これらの色素は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）過程を
通じて相互作用する。これらの方法において、レポーターは、発光化合物であっ
て、これは、化学反応（化学ルミネセンスを生ずる）によるか、または光の吸収
（蛍光を生ずる）によるかどちらかで励起され得る。このクエンチャーは、レポ
ーターと相互作用することにより光の放射を変え、その結果、通常、レポーター
の発光効率を減少し得る。この現象を、クエンチングと呼ぶ。このクエンチング
効率は、レポーター分子とクエンチャー分子との間の距離の強い関数である。従
って、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、ハイブリダイゼーション
の検出は、エネルギー移動系を設計することによって達成され、この移動系にお
いてレポーターとクエンチャーとの間の間隔が、ハイブリダイゼーションの結果
として調節される。

【０００４】現在、ＦＲＥＴベースの核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用さ
れるクエンチャーは、それ自体が、蛍光性である。すなわちレポーターの蛍光を
クエンチングすることに加えて、このクエンチャーは、蛍光発光を生じる。この
ことは、複数のスペクトル分析レポーターを使用するアッセイにおいて特に問題
である。クエンチャーの蛍光が、１種またはそれ以上のレポーターによって生じ
られる蛍光シグナルと相互作用し得るからである。

【０００５】従って、実質的にそれ自体、非蛍光性であるクエンチャー色素が引き続き必要
である。

【０００６】（要旨）本発明は、レポーター−クエンチャーエネルギー−移動色素対のコンテクスト
において有用である非蛍光性シアニンクエンチャー化合物の１分類における本発
明者らの発見に関する。これらのクエンチャー化合物は、検出方法として蛍光エ
ネルギー移動を利用する核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特定の適
用を見出す。

【０００７】第１の局面において、本発明は、以下の構造を有する非対称性のシアニン色素
化合物（その置換形態を含む）を含み、

【０００８】

【化１１】ここで、すくなくとも１個のＲ₁およびＲ₂は連結基であり、ＸはＯ、Ｓ、または
Ｓｅであり、そしてｎは０〜２の範囲である。

【０００９】第２の局面において、本発明は、レポーター色素およびクエンチャー色素を含
むレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対を含み、ここで、クエンチャ
ー色素は、第１の局面の非対称シアニン色素化合物である。

【００１０】第３の局面において、本発明は、第１の局面に従って、そこに共有結合的に結
合したシアニン色素クエンチャーを有するオリゴヌクレオチドを含む。

【００１１】第４の局面において、本発明は、標的の核酸配列を検出するための方法を提供
し、これは、少なくとも１個の標的核酸配列を含む核酸サンプルを提供し、そし
て標識化オリゴヌクレオチドプローブを標的の核酸配列にハイブリダイズする工
程を含み、この標識化オリゴヌクレオチドプローブが、第１の局面の非対称シア
ニン色素化合物で標識化される。この第４の局面の特定の好ましい実施態様にお
いて、さらなる方法は、レポーター色素およびクエンチャー色素の１個または両
方がオリゴヌクレオチドプローブから取除かれるようなオリゴオリゴヌクレオチ
ドを温浸する工程を含む。

【００１２】上記発明の様々な局面および実施態様は、公知のクエンチャー色素化合物を越
える次の重要な有用性の１またはそれ以上を達成する。本発明の非対称シアニン
クエンチャーは、試薬（例えば、ポリヌクレオチド）と容易に共有結合をし得る
。さらに、オリゴヌクレオチドプローブは、本発明の非対称シアニンクエンチャ
ーで標識化され、従来の標識化プローブに比べて高いハイブリダイゼーション安
定性を示し、これによりハイブリダイゼーションの不一致に対してより敏感であ
る、より短いプローブの使用を可能にする。さらに、本発明の非対称シアニンク
エンチャーは、本質的に非蛍光性であり、これにより１個またはそれ以上のさら
なるレポーターにより占有され得るさらなるスペクトルを提供する。

【００１３】本発明のこれらおよび他の目的、特徴、および有用性は、次の明細書、図面、
および特許請求の範囲を参照することでより良く理解される。

【００１４】（好ましい実施態様の詳細な説明）参考は、本発明の好ましい実施態様、添付する図面で説明される例に詳細に示
される。本発明は、好ましい実施態様を組合せて記載されるが、これらの実施態
様によって本発明を限定しようと意図するものではないことを理解されるべきで
ある。逆に、本発明は、代替の、改変のおよび等価のものを含むことを意図する
ものであり、これらは、添付される特許請求の範囲によって定義される発明の範
囲内に含まれ得る。

【００１５】（Ｉ．定義）他に記述しなければ、次の本明細書において使用する用語および語法は、次の
意味を有することを意図する。

【００１６】「エネルギー移動」および「蛍光クエンチング」とは、エネルギーが、電子的
に励起したルミネセンス「レポーター」分子から、「クエンチャー」分子によっ
て取除かれ、これによりレポーター分子からの光発光なしで、レポーター分子が
その基底状態に戻るプロセスをいう。このレポーター分子は、光吸収および化学
反応を含む多数のプロセスの任意により、より高いエネルギーレベルの１つに励
起され得る。

【００１７】一連の色素に関して「スペクトル分解能」とは、色素の蛍光発光バンドが十分
に明瞭（すなわち、十分に重複しないこと）であることを意味し、各色素が結合
する試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、各色素により発生する蛍光シグナル
に基づいて、標準光検出系（例えば、通過帯域フィルター、光電子増倍管、電荷
結合素子、および分光器などの系を使用すること）を使用して識別され得、米国
特許第４，２３０，５５８号、同第４，８１１，２１８号、またはＷｈｅｅｌｅ
ｓｓら、２１〜７６頁、ｉｎＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄＤａｔｅＡｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８５）に記載される系に例示される。

【００１８】「連結基」とは、試薬に付属した「補相的官能基」と反応し得る部分を意味し
、これらの反応により、試薬に色素を結合する「連結」を形成する。この補相的
官能基がアミンである場合、好ましい、連結基は、イソチオシアネート、スルホ
ニルクロリド、４，６−ジクロロトリアジニル、カルボキシレートスクシンイミ
ミジルエステル、または他の活性なカルボキシレートである。あるいは、連結基
は、アミンであり得る。この補相的官能基がスルフヒドリルである場合、好まし
くは、この連結基は、マレイミド、ハロアセチル、またはヨードアセトアミドで
ある。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＨａｎｄｂ
ｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒ
ｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１
９９２）を参照のこと。特定の好ましい実施態様において、この連結基は、Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、そして補相的官能基が
アミンである。ここで、ＮＨＳエステルを形成するために、カルボキシレート連
結基を含む本発明の色素を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドと反応させる。

【００１９】「低級アルキル」とは、１〜８個の炭素原子を含む直鎖および分岐炭化水素の
部分（例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、
イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、など）を意
味する。

【００２０】「ヌクレオシド」とは、ペントースの１’位に連結したプリン、デアザプリン
、またはピリミジンヌクレオシドベース（例えば、アデニン、グアニン、シトシ
ン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン、など）からなる化
合物をいう。ヌクレオシドベースがプリンまたは７−デアザプリンである場合、
この糖部分がプリンまたはデアザプリンの９位に結合され、そしてヌクレオシド
ベースがピリミジンである場合、糖部分がピリミジンの１位に結合される（例え
ば、ＫｏｒｎｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡＲｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２
版（Ｆｒｅｅｍａｎ、ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２））。本明細書中
で使用される用語「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドのリン酸エステル（例え
ば、三リン酸エステル）のことをいう。ここで、最も一般的なエステル化部位は
、ペントースのＣ−５位に結合される水酸基である。本明細書中で使用される用
語「ヌクレオシド／ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両
方を含む一連の化合物をいう。ヌクレオシド／ヌクレオチドに関する「アナログ
」は、改変されたベース部分、改変された糖部分および／または改変されたホス
フェート部分を有する合成アナログを含む（例えば、ＳｃｈｅｉｔによるＮｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅＡｎａｌｏｇｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ、ＮｅｗＹｏｒｋ、
１９８０）に一般的に記載される）。ホスフェートアナログは、リン原子が、⁺ ５酸化状態であり、そして１個またはそれ以上の酸素原子が、非酸素部分で置換
されるホスフェートアナログを含む。典型的なホスフェートアナログは、ホスホ
ロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレ
ノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホアミデー
ト、ホウ素ホスフェート（付随する対イオン（例えば、Ｈ⁺、ＮＨ₄ ⁺、Ｎａ⁺）を
、このような対イオンが存在する場合に含む）が挙げられるが、これらにより限
定されるものではない。典型的なベースアナログは、２，６−ジアミノプリン、
ヒポキサンチン、偽ウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン
、２−チオピリミジンおよび他の同様なアナログが挙げられるが、これらに限定
されない。典型的な糖アナログは、２’−または３’位が水素、ヒドロキシ、ア
ルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブト
キシ、イソブトキシ、およびフェノキシ）、アミノ、またはアルキルアミノ、フ
ルオロ、クロロ、およびブロモである２’−または３’−改変体が挙げられるが
、これらにより限定されるものではない。用語「標識化ヌクレオシド／標識化ヌ
クレオチド」は、標識に共有結合するヌクレオシド／ヌクレオチドのことをいう
。

【００２１】「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、天然のヌクレオチ
ドモノマーまたはそのアナログ（二本鎖または一本鎖のデオキシリボヌクレオチ
ド、リボヌクレオチド、そのα−アノマー形状、などを含む）のポリマーのこと
を意味する。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル連結によっ
て結合されるが、本明細書において使用される場合、用語「ホスホジエステル連
結」は、ホスホジエステル結合またはそのホスフェートアナログを含む結合（付
随する対イオン（例えば、Ｈ⁺、ＮＨ₄ ⁺、Ｎａ⁺）を、このような対イオンが存在
する場合に含む）のことをいう。典型的に、ポリヌクレオチドは、少しのモノマ
ー単位（例えば５〜４０）から幾千のモノマー単位のサイズの範囲である。ポリ
ヌクレオチドが文字の配列によって表される場合（例えば、ＡＴＧＣＣＴＧ）は
、ヌクレオチドは、左から右へ５’から３’の順序であり、そして他に記述がな
ければ、「Ａ」は、デオキシアデノシンを意味し、「Ｃ」は、デオキシシチジン
を意味し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを意味し、そして「Ｔ」は、デオキシ
チミジンを意味することが理解される。

【００２２】本明細書中で使用される「置換」とは、１またはそれ以上の水素原子が、１ま
たはそれ以上の非水素原子、官能基または官能部分で置換される分子のことをい
う。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ₂であり、一方置換窒素は、−ＮＨＣＨ₃であ
る。典型的な置換基は、ハロ（フッ素および塩素）、低級アルキル、低級アルケ
ン、低級アルキン、スルフェート、スルホネート、スルホン、アミノ、アンモニ
ウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多
環式芳香族、電子リッチな複素環、および連結基が挙げられるが、これらに限定
されない。

【００２３】「メチン架橋」または「ポリメチン架橋」とは、２個のベース部分を接続する
シアニン色素化合物の部分、すなわち次の構造を有する架橋のことをいい、 −（ＣＨ＝ＣＨ）_n−ＣＨ− ここで、ｎは、典型的に０〜２の範囲にある。

【００２４】「キサンテン系色素」とは、次の縮合３環構造を含む色素であり、

【００２５】

【化１２】ここで、Ｒは、酸素（フルオレセイン）または−ＮＨ（ローダミン）（その置換
形状を含む）である。典型的な置換フルオレセイン化合物は、次の構造を有する
「ＮＥＤ」色素、

【００２６】

【化１３】次の構造を有する「ＴＥＴ」色素、

【００２７】

【化１４】および、次の構造を有する「ＦＡＭ」色素、

【００２８】

【化１５】を含む。典型的なローダミン色素は、以下の構造を有する「ＴＡＭＲＡ」または
「ＴＭＲ」色素である。

【００２９】

【化１６】「クマリン色素」は、次の縮合２環構造を含む色素であり、

【００３０】

【化１７】ここで、Ｒは、酸素（ヒドロキシクマリン）または−ＮＨ（アミノクマリン）（
それらの置換形状を含む）である。

【００３１】「ＢＯＤＩＰＹ^TM色素」は、次の縮合環構造を含む色素（その置換形状を含む
）である。

【００３２】

【化１８】ｔｈｅＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａ
ｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ、ＳｉｘｔｈＡｄｄｉｔｉｏｎ
、Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９６
）を参照のこと。

【００３３】「シアニン色素」は、メチン、またはポリメチン、架橋によって結合される２
個の窒素複素環式環を含む色素である。このような色素の網羅的な総説は、Ｆｉ
ｃｋｅｎ（Ｆｉｃｋｅｎ、ＴｈｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＳｙｎｔｈｅｔ
ｉｃＤｙｅｓ、第ＩＶ巻、Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ（１９７１））によって
提供される。

【００３４】（Ｉ．非対称シアニン色素化合物）（Ａ．構造）第一の局面において、本発明は、非蛍光クエンチャーとして有用な新規な分類
のシアニン色素化合物を含む。これらの化合物は、すぐ下の式１に示される一般
式（その置換形状を含む）を有し、ここでＲ₁およびＲ₂の少なくとも１個は、連
結基であり、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＳｅであり、そしてｎは、０〜２の範囲であ
る。（本明細書において提供される全分子構造は、示される正確な電子構造だけ
ではなく、全ての共鳴構造、プロトン化状態、およびそれらに付随する対イオン
をも含むことを意図していることに注意すべきである。）

【００３５】

【化１９】好ましくは、この化合物が、非蛍光クエンチャーとして使用される場合、この
化合物は、ニトロＣ−３置換を含む。例えば、化合物５、９、２０、２１および
２３。

【００３６】代わりの好ましい実施態様において、式１の化合物の連結基は、低級アルキル
アミン、または低級アルキルカルボキシ部分であり、ここで、特に好ましい低級
アルキルカルボキシは、−（ＣＨ₂）_nＮ⁺（ＣＨ₃）₂（ＣＨ₂）_nＣＯ₂Ｈ（ここで
、ｎは２〜１２の範囲である）である。例えば、化合物２３。

【００３７】別の好ましい実施態様において、Ｒ₁またはＲ₂のうちの１つは、−（ＣＨ₂）_n Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃であり、ここでｎは、２〜１２の範囲であり、Ｒ₁またはＲ₂のもう一方は、連結基である。

【００３８】さらに別の好ましい実施態様において、本発明のシアニン化合物のＸ基は、硫
黄である。例えば、化合物５、９、２０、２１、２２および２３。

【００３９】別の好ましい実施態様において、式１の化合物は、縮合芳香族、または置換芳
香族、１位および２位、２位および３位；ならびに／または３位および４位で結
合した置換基が挙げられる。さらに好ましくは、この置換芳香族は、１個または
それ以上のニトロ置換基を含む。例えば、化合物２１および２２。

【００４０】本発明のさらに好ましい実施態様において、式１の化合物は、Ｒ₂およびメチン架橋の隣接炭素が一緒になって、５〜７員（より好ましくは６員）を有する環
構造を形成する、架橋基を含む。例えば、化合物２０および２１。

【００４１】（Ｂ．合成）一般に、非蛍光シアニン色素クエンチャーは、以下のように調製され得る。図
２Ａおよび２Ｂを参照のこと。四級化ベンザゾール誘導体（例えば、ベンゾチア
ゾリウム塩１０または１３）をレピジニウム塩、１１と混合し、そして塩基性条
件下で（メタノール中のジイソプロピルエチルアミン、またはピリジン）還流し
た。溶媒をエバポレートし、そして粗製固体を希塩酸（例えば、水中５％）で洗
浄し、そして乾燥した。

【００４２】この色素は、カルボン酸基をスクシンイミジルエステルに変換することによっ
てアミノ反応性が与えられ得る。例えば、色素１２または１４を、スクシンイミ
ジルテトラメチルウロニウム塩およびＤＩＰＥＡと共に、ＤＭＦ中に溶解させる
。この生成物を、希塩酸を添加することで沈殿させ、洗浄し、そして乾燥する。

【００４３】（ＩＩ．非蛍光シアニン色素を含有する色素対）レポーター−クエンチャー色素対は、任意の分子対から構成され得、これらの
分子は、エネルギー転移プロセスに関与し得る。典型的なレポーターは、キサン
テン色素（フルオレセイン、およびローダミン色素を含む）から選択され得る。
これらの化合物の多くの適切な形態は市販されており、様々な置換基をそれぞれ
のキサンテン環に有し、これらの置換基が、オリゴヌクレオチドに対する結合部
位として、または、付着のための結合官能性として使用され得る。蛍光化合物の
別のグループは、ナフチルアミン類であり、これらは、α位またはβ位ににアミ
ノ基を有する。このようなナフチルアミノ化合物には、１−ジメチルアミノナフ
チル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２
−ｐ−トルイジニル（ｔｏｕｉｄｉｎｙｌ）−６−ナフタレンスルホネートが挙
げられる。他の色素には、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：
３−フェニル−７−イソシアナートクマリン、アクリジン（例えば、９−イソチ
オシアナートアクリジンおよびアクリジンオレンジ）、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾ
オキサゾリル）フェニル）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、
ピレンなど。

【００４４】好ましくは、レポーター分子は、フルオレセイン色素およびローダミン色素か
ら選択される。オリゴヌクレオチドに対する付着に関する、これらの色素および
適切な連結方法論は、ほかの場合にも記載されている（Ｋｈａｎｎａら（上記）
；ＭａｒｓｈａｌｌＨｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＪ．，７：２９９−３０３
（１９７５）；Ｍｅｃｈｎｅｎら、米国特許第５，１８８，９３４号；Ｍｅｎｃ
ｈｅｎら、欧州特許出願第８７３１０２５６．０号；およびＢｅｒｇｏｔら、国
際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０５５６５）。特に好ましいレポーター分子には、フ
ルオレセイン色素、ＮＥＤ、ＴＥＴおよびＦＡＭが挙げられる：典型的なレポーター−クエンチャー対には、以下のものが挙げられる。

【００４５】

【表１】（ＩＩＩ．色素標識されたポリヌクレオチド）別の局面において、本発明は、本発明の非蛍光シアニン色素を用いて標識され
たポリヌクレオチドを包含する。このような標識されたポリヌクレオチドは、多
数の重要なコンテクストにおいて有用であり、これらのコンテクストは、オリゴ
ヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブとして、およびオリゴヌクレオチ
ドライゲーションプローブとして含む。

【００４６】一重に、または二重に標識されたポリヌクレオチドは、任意の多数の周知の方
法を使用して調製され得る。３’末端でオリゴヌクレオチドを適切に標識する方
法は、以下の方法が挙げられるが、これらに限定されない：（１）３’末端のリ
ボヌクレオチドの過ヨウ素酸酸化、続く、アミン含有標識との反応（Ｈｅｌｌｅ
ｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、ＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＡｇｅｎｔｓ（Ｄ．Ｔ
．ＫｉｎｇｓｂｕｒｙおよびＳ．Ｆａｌｋｏｗ、編）、頁２４５−２５６、Ａｃ
ａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５）に記載）；（２）デオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを用いる、３’−脂肪族アミン含有ヌクレオチドの酵素的
付加、続く、アミン反応性標識との反応（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、欧州特許出願第２
３２９６７号）；および（３）３’−リボヌクレオチドの過ヨウ素酸酸化、続く
、１，６−ヘキサンジアミンとの反応による、３’末端脂肪族アミンの提供、続
く、アミン反応性標識との反応（Ｃａｒｄｕｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８７９０−８７９４（１９９８））。

【００４７】オリゴヌクレオチドの５’末端の標識化方法には、以下のものが挙げられる：
（１）５’〜５’カップリングリボヌクレオチドの過ヨウ素酸酸化、続く、アミ
ン反応性標識との反応（ＨｅｌｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９８５）；（
２）エチレンジアミンと５’ホスホリル化ポリヌクレオチドとの縮合、続く、ア
ミン反応性標識との反応（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、１９８７）；および（３）固相Ｄ
ＮＡ合成において、アミノヘキシルホスファイト剤を用いる脂肪族アミン置換基
の導入、続く、アミン反応性標識との反応（Ｃａｒｄｕｌｌｏ、１９８８）。

【００４８】これらの末端標識化方法に加え、標識は、アミン含有ヌクレオチドホスホルア
ミダイト剤（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｒｅａｇｅｎｔ）（例えば、５
’−ジメトキシトリチル−５−［Ｎ−（トリフルオロアセチルアミノヘキシ）−
３−アクリルイミド］−２−デオキシウリジン）、３’−［（２−シアノエチル
）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ
ｍｉｄｉｔｅ）（例えば、アミノモディファイヤーＣ６ｄＴホスホルアミ
ダイト（ＬｉｎｋｅｒＡｒｍＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＧｌｅｎＲｅａｓｅ
ａｒｃｈ，Ｉｎｃ．））を使用して、合成ポリヌクレオチドの特定の位置に配置
され得る（Ｍａｔｈｉｅｓら、米国特許第５，６８８，６４８号）。

【００４９】オリゴヌクレオチドの標識化手順の全体的な総説に関しては、以下を参照のこ
と：Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄの、ＥｘｃｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＢｉｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ、Ｓｔｅｉｎｅｒ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（１９８３）、
ＦｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃＰｒｏｂｅＤｅｓｉｇｎａｎｄＳｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ：ＡＴｅｃｈｎｉｃａｌＧｕｉｄｅ、ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ（１９９６）、およびＧ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９６）に
おける記載。

【００５０】一般に、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブの設計は、本発
明の非蛍光シアニン色素クエンチャーを含み、従来技術に従う。従って、標識さ
れたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを設計する場合、以下
の一般のガイドラインに従うべきである：（１）標的核酸の配列がＰＣＲ単位複
製配列内に配置される場合、プローブ配列は、プローブが、ＰＣＲプライマー間
の配列上の位置でハイブリダイゼーションするようにあるべきである；（２）プ
ローブは、約２０〜３０個のヌクレオチド長を有するべきであり、その結果、良
好なハイブリダイゼーション動態および結合特異性を保証する；（３）プローブ
および標的の核酸配列における２次構造の阻止；（４）このプローブが１対のＰ
ＣＲプライマーと組み合わせて使用される場合、このプローブは、正方向プライ
マーおよび逆方向プライマーのいずれともハイブリダイゼーションすべきではな
い；そして（５）単一ヌクレオチドの長伸縮（すなわち、４より大きい）を有す
るプローブを阻止する；および（６）プローブ配列とその相補体との間で選択す
る場合、ＧヌクレオチドよりもＣヌクレオチドを多く有するストランドを取り出
す。

【００５１】（ＩＶ．非蛍光シアニン色素を利用するハイブリダイゼーション方法）ハイブリダイゼーションの検出方法としてエネルギー転移を利用する、幾つか
のハイブリダイゼーションアッセイフォーマットが記載されており、これらのう
ち５つを以下に記載し、そして、概略的に図５Ａ〜Ｅに示す。

【００５２】第１アッセイフォーマットにおいて、図５Ａに示されるように、２つのオリゴ
ヌクレオチドプローブの配列を、それらが標的の核酸５の近接した領域とハイブ
リダイゼーションするように選択される。第１プローブ１０（標的核酸の５’末
端方向へハイブリダイゼーションする）は、その５’末端付近で、レポーター標
識で標識され、ここで、第２プローブ１５がその３’末端付近で、クエンチャー
ラベルで標識される。従って、３方向ハイブリッド２０が、標的核酸５および第
１プローブ１０および第２プローブ１５との間で形成され、レポーターおよびク
エンチャーを、かなり接近させ、そして、エネルギー転移が進行し得る。従って
、このフォーマットにおいて、２つのプローブの標的のハイブリダイゼーション
の際、レポーターの発光がクエンチされる（Ｈｅｌｌｅｒら、欧州特許出願第０
７０６８５号（１９８３））。

【００５３】第２のアッセイフォーマットにおいて、図５Ｂに示されるように、２つのオリ
ゴヌクレオチドプローブ２５および３０は、互いに相補的であり、そして、これ
らの各々は、レポーター標識またはクエンチャー標識を備え、使用される。プロ
ーブが互いとハイブリダイゼーションし、プローブ−プローブハイブリッド３５
を形成する場合、クエンチング相互作用が好まれるようにラベルの位置が選択さ
れ、ここでプローブが分離される場合、わずかな量のクエンチングが起こる。標
的核酸の検出は、標的核酸５およびプローブ２５および３０の両方の変性によっ
て達成され、次いで、ストランドの再アニールが可能となる。従って、プローブ
−プローブハイブリダイゼーションとプローブ−標的ハイブリダイゼーションの
間に競合が存在する。標的核酸が多く存在すればするほど、より多くのプローブ
が標的とハイブリダイゼーションし、プローブ−標的ハイブリッド４０を形成す
る。標的ＤＮＡが存在は、レセプターＲからの発光の増加によって示され、これ
は、プローブ−プローブハイブリッド数の減少によって引き起こされる、クエン
チャーＱによるクエンチングの減少による（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、欧州特許出願第
２３２９６７号（１９８７））。

【００５４】第３のアッセイフォーマット（図５Ｃに記載する）は、唯一の標識プローブ４
５および二重鎖核酸５０と優先的に結合する色素を使用する。この色素５０は、
二重鎖種の塩基対間でインターカレートし得るか、または、ヘリックスの外部と
結合し得、そしてクエンチャーとして作用する。従って、ハイブリダイゼーショ
ンが存在しない場合、クエンチャーＱは、一重鎖プローブ４５と結合せず、そし
てレポーターＲは、Ｑによる影響を受けない。しかし、標的の核酸５が存在する
場合、プローブ４５は標的の核酸とハイブリダイゼーションし、そしてＱは、得
られた二重鎖領域と結合し、標的−プローブ−色素複合体５５を形成する。この
複合体において、ＱおよびＲはかなり接近して配置され、そして、エネルギー転
移または蛍光のクエンチングが起こり得る。従って、このフォーマットにおいて
、レポーターの発光は、プローブが標的とハイブリダイゼーションする際にクエ
ンチされる（ＨｅｌｌｅｒおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、ＲａｐｉｄＤｅｔｅｃｔ
ｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ａｇｅｎｔｓ（Ｄ．Ｔ．ＫｉｎｇｓｂｕｒｙａｎｄＳ．Ｆａｌｋｏｗ、編
）、２４５−２５６頁、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９８５）））。

【００５５】第４のアッセイフォーマット（図５Ｄに示す）において、レポーターおよびク
エンチャーの両方を用いて標識される単一プローブ６０が使用される。プローブ
が一本鎖状態である場合、すなわち、標的の核酸とハイブリダイゼーションして
いない場合、一本鎖構造のプローブは、レポーター標識およびクエンチャー標識
が非常に接近し、それによってエネルギー転移が進行し得るような状態となるよ
うに、レポーター標識およびクエンチャー標識の位置が選択される。この一本鎖
構造を達成する１つの代替方法において、レポーターおよびクエンチャーは、プ
ローブ配列を設計することによってかなりの近接化がもたらされ、その結果、プ
ローブの末端でヘアピン形状を形成し、それによってレポーターおよびクエンチ
ャーを一緒にねじ伏せる（Ｂａｇｗｅｌｌ、欧州特許出願第６０１８８９号（１
９９４）；ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、１４：３０３−３０８（１９９６））。この一本鎖構造を達成する別
の代替方法において、クエンチャーおよびレポーターを十分かなり接近してさせ
るために、一本鎖プローブのランダムコイル形状が役立つように、レポーターお
よびクエンチャーがプローブ上で十分に間隔を開けて配置される（Ｍａｙｒａｎ
ｄ、米国特許第５，６９１，１４６号）。しかし、二重標識されたプローブ６０
が、標的の核酸５とハイブリダイゼーションし、プローブ−標的ハイブリッド６
５を形成する場合、レポーターおよびクエンチャーは互いに分離され、そしてク
エンチング相互作用が妨げられる。従って、このフォーマットでは、プローブの
標的へのハイブリダイゼーションの際、レポーターの発光はクエンチされなくな
る。

【００５６】第５アッセイフォーマット、本明細書中では、「Ｔａｑｍａｎ」アッセイとし
て言及され、図５Ｅに示され、レポーター標識およびクエンチャー標識の両方を
備える二重標識されたプローブは、標的の核酸とのハイブリダイゼーションの際
に消化され、それによって、プローブからの一方または両方の標識を遊離する（
Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７
２７６−７２８０（１９９１）；Ｌｉｖａｋ、米国特許第５，５３８，８４８号
）。この方法において、二重に標識されたプローブ７５は、標的の核酸５とハイ
ブリダイゼーションされる。さらに、オリゴヌクレオチドプライマー７０は、プ
ローブの上流の位置で標的の核酸とハイブリダイゼーションされる（すなわち、
標的の核酸の３’末端と接近する）。次いで、プライマー７０は、ポリメラーゼ
酵素を用いて伸長され、それによって伸長されたプライマー８０を形成する（例
えば、ＤＮＡポリメラーゼを使用して）。プライマー伸長反応の間、ポリメラー
ゼの５’−３’ヌクレアーゼ活性は、プローブ７５を切断するのに役立ち、その
結果、レポーター標識を備える第１プローブフラグメント８５およびクエンチャ
ー標識を備える第２プローブフラグメント９０を形成する。従って、レポーター
標識およびクエンチャー標識は分離され、それによって、これら２つの間のエネ
ルギー転移を阻止する。従って、このフォーマットにおいて、レポーターの発光
は、プローブの標的へのハイブリダイゼーションおよび次のプローブの分解の際
に、クエンチされなくなる。

【００５７】上記および図５Ａ〜Ｅの各５つのアッセイフォーマットにおいて、別に説明し
ない限り、レポーターおよびクエンチャーの位置は任意であることに注目された
い。従って、レポーターが一方のプローブ上に、そしてクエンチャーが他方のプ
ローブ上に示されるが、それらの位置は逆転され得る。

【００５８】上記のアッセイフォーマットは、単一のレポーター標識のみを使用するシステ
ムに関して示されるが、マルチレポーターシステムがまた、実施され得る。この
ようなマルチレポーターシステムは、単一反応用量におけるマ複数のハイブリダ
イゼーションの分析を必要とする用途に有益である。このようなシステムにおい
て、各レポーター分子は発光を生じ、この発光は、任意の他のレポーターからの
発光によるスペクトル解析が可能である。各レポーターと共に使用される特定の
クエンチャーは、同一であるか、または異なり得、これは、クエンチャーおよび
レポーターのスペクトル特性に依存する。

【００５９】上記のアッセイの各々は、核酸増幅工程（例えば、ＰＣＲ）と組み合わせて実
施され得る。従って、ハイブリダイゼーションアッセイを実施する前に、全部ま
たは一部の核酸サンプルが増幅され得る。増幅工程と組み合わせて実施する場合
、このハイブリダイゼーションアッセイは、エンドポイントモードまたはリアル
タイムモードで実施され得る。エンドポイントモードにおいて、ハイブリダイゼ
ーションアッセイは、増幅反応が完了した後（例えば、全部、または実質的に全
部のＰＣＲ反応の増幅サイクルが完了した後）に実施される。リアルタイムモー
ドにおいて、ハイブリダイゼーションアッセイは、増幅反応の間の複数の時点（
例えば、ＰＣＲプロセスの各熱サイクル後）で実施される（Ｈｉｇｕｃｈｉ、欧
州特許出願第５１２３３４号）。リアルタイムモードが好ましいのは、標的の核
酸の初期量の定量測定が必要である場合である（例えば、血液サンプル中に存在
する病原核酸の複製数）。

【００６０】（Ｖ．実施例）本発明は、以下の実施例を考慮することによってさらに明らかにされ、これら
の実施例は、本発明の単なる例示を意図し、いかなる点においても本発明の範囲
を制限することは意図されない。

【００６１】（実施例１）ニトロチアゾールブルー５およびニトロチアゾールオレンジ９の合成ニトロチアゾールブルー５およびニトロチアゾールオレンジ９の合成を、図３
および４に概説する。

【００６２】（６−ニトロベンゾチアゾール１の調製）図３Ａを参照のこと。２−メチルベンゾチアゾールのニトロ化を以下の方法に
従って実施した：Ｍｉｚｕｎｏ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｏｃ．Ｊａｐａｎ、７２、
７４５（１９５２）。発煙硝酸（１．６ｍＬ）および濃硫酸（１．２ｍＬ）の混
合物を、２−メチルベンゾチアゾール（２ｇ）の氷冷硫酸（８ｍＬ）溶液に添加
した。この溶液を１時間室温に加温し、次いで、１００ｍＬの氷に注いだ。固体
を濾過し、水で洗浄し、そしてエタノール（８０ｍＬ）から再結晶し、２．５ｇ
の黄みを帯びた針状物を得た。

【００６３】（３−メチル−６−ニトロベンゾチアゾリウムｐ−トルエンスルホネート２
の調製）図３Ａを参照のこと。６−ニトロベンゾチアゾール（１ｇ）およびメチル−ｐ
−トルエンスルホネート（１．２ｇ）の混合物を１４０℃で２０分間加熱した。
この固体をアセトンで洗浄し、濾過して、青みを帯びた固体を得た（１．１ｇ）
。

【００６４】（２−（２’−アセトアニリドビニル）−３−メチルベンゾチアゾリウムｐ
−トルエンスルホネート３の調製）図３Ａを参照のこと。３−メチル−６−ニトロベンゾチアゾリウムｐ−トル
エンスルホネート２（２００ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）、ジフェニルホルムアミ
ジン（１６０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）および無水酢酸（２ｍＬ）の混合物を２０
分間還流した。溶液を冷却し、エーテルで粉砕し、茶褐色の固体を得た（２００
ｍｇ）。

【００６５】（１−（５’−カルボキシフェニル）−レピジニウムブロミド４の調製）図３Ｂを参照のこと。レピジン（５ｇ）および６−ブロモヘキサン酸（１０ｇ
）の混合物を１３０℃で６時間加熱した。この固体をアセトンで洗浄し、濾過し
、オフホワイトの固体を得た（１０．５ｇ）。

【００６６】（ニトロチアゾールブルー５の調製）図３Ｃを参照のこと。上記のアセトアニリド３（６５ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ
）および上記のレピジニウムブロミド４（６６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）およびピ
リジン（１ｍＬ）の混合物を併せ、そして３０分間還流した。この青色溶液を乾
固するまで濃縮し、そして１ｍＬの５％ＨＣｌで洗浄した（５×）。残渣を乾
燥し、青色固体を得た（６７ｍｇ）。

【００６７】（ニトロチアゾールブルースクシンイミジルエステルの調製）ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０
．０５ｍＬ）中のニトロチアゾールブルー５（３１ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）
溶液に、Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウ
ロニウムテトラフルオロボレート（３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。
この混合物を１０分間、７０℃に加温した。反応の進行を、シリカゲルのＴＬＣ
（溶出液として、６００：６０：１６ジクロロメタン：メタノール：酢酸を使
用する）によってモニターした。この均一溶液に５％のＨＣＬ（２ｍＬ）を添加
した。沈殿物を、さらにＨＣｌで洗浄し、そして乾燥させ、暗色の固体を得た（
３０ｍｇ）。

【００６８】（２−（メチルチオ）−６−ニトロベンゾチアゾール７の調製）図４Ａを参照のこと。発煙硝酸（１．９３ｇ）を、２−（メチルチオ）ベンゾ
チアゾール（５ｇ）の氷浴で冷却した濃硫酸（１６．８ｇ）溶液に滴下した。５
℃で３時間攪拌後、この溶液を氷に注ぎ、そして濾過し、黄色固体を得た（５．
７ｇ、２５ｍｍｏｌ、９１％）。

【００６９】（３−メチル−２−（メチルチオ）−ベンゾチアゾリウムｐ−トルエンスル
ホネート８の調製）６−ニトロ−２−（メチルチオ）ベンゾチアゾール７（０．５ｇ、２．２ｍｍ
ｏｌ）およびメチル−ｐ−トルエンスルホネート（３．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）の
混合物を、１時間にわたって１２０℃〜１４５℃に加熱した。この溶液を冷却し
、３０ｍＬのエーテルを添加した。得られた非結晶固体をアセトンで粉砕し、淡
紫色の固体を得た（０．５７ｇ、１．４ｍｍｏｌ、６３％）。

【００７０】（ニトロチアゾールオレンジ９の調製）図４Ｂを参照のこと。３−メチル−２−（メチルチオ）−ベンゾチアゾリウム
ｐ−トルエンスルホネート８（５０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）および１−（５
’−カルボキシペンチル）−レピジニウムブロミド４（４１ｍｇ、０．１２ｍｍ
ｏｌ）のメタノール（５ｍＬ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ
）を添加した。この溶液を１５分間還流した。この溶媒をエバポレートし、そし
て反応残渣を５％のＨＣｌ（２ｍＬ）で粉砕した。この固体を、さらなる５％の
ＨＣｌで洗浄し、そして乾燥させ、オレンジ色の固体（８ｍｇ）を得た。

【００７１】（ニトロチアゾールオレンジスクシンイミジルエステル１０の調製）ジメチルホルムアミド（０．１ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０
．０１ｍＬ）中のニトロチアゾールオレンジ９（８ｍｇ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−
スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフル
オロボレート（１０ｍｇ）を添加した。この混合物を１０分間、７０℃に加温し
た。反応の進行をシリカゲルのＴＬＣ（溶出液として、６００：６０：１６ジ
クロロメタン：メタノール：酢酸を使用する）によってモニターした。この均一
溶液に５％のＨＣｌ（１ｍＬ）を添加した。沈殿物をさらなるＨＣｌで洗浄し、
そして乾燥させ、オレンジ色の固体を得た（８ｍｇ）。

【００７２】（実施例２）Ｔａｑｍａｎアッセイのための二重標識プローブの調製ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３９４ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ合成機（ＴｈｅＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＰＥ
ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＢＤ））を使
用し、操作手引きに記載の一般的な手順に従って、オリゴヌクレオチドプローブ
の自動合成を実施した。色素標識ＣＰＧ固体支持体（ＭｕｌｌａｈおよびＡｎｄ
ｒｕｓ、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ、３８（３３）：５７５１−
５７５４（１９９７））、ＤＮＡＦａｓｔＰｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（
ＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ番号８５、１９９４、ＡＢＤ）ならびに、色素標識
ホスホルアミダイト、ＦＡＭおよびＴＥＴ（ＵｓｅｒＢｕｌｌｅｔｉｎ番号７
５、１９９４、ＡＢＤ）を使用し、オリゴヌクレオチドを０．２μｍｏｌスケー
ルで合成した。標準的な０．２μｍｏｌの合成サイクルを、ＦＡＭアミダイトの
カップリング時間をさらに１２０秒延長することで若干変更した（ＵｓｅｒＢ
ｕｌｌｅｔｉｎ番号７８、１９９４、ＡＢＤ）。各プローブは、このプローブの
５’末端に付着したレポーター色素および３’末端に配置されたクエンチャー色
素を備える。

【００７３】合成の完了後、ＭｅＯＨ：ｔ−ＢｕＮＨ₂：Ｈ₂Ｏ（１：１：２）（Ｗｏｏら、
米国特許第５，２３１，１９１号）の混合物での処理によって、ＤＮＡ合成機の
支持体からオリゴヌクレオチドを自動切断し、ここで、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機に関する操作手引
きに記載される、１時間自動切断手順（「ＥＮＤＣＥ」手順）を使用した。こ
の混合物を８５℃で１時間または６５℃で３時間加熱することで、塩基の保護基
を除去した。

【００７４】粗製オリゴヌクレオチドを、純度および完全性に関し、以下の装備および条件
を使用する逆相ＨＰＬＣによって分析した：ＡＢＩ７８３Ａプログラム可能検
出器を装備したＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒシリーズ２００溶媒送達システム；
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＩＳＳ２００オートサンプラー；およびＰＥＮｅ
ｌｓｏｎ９００シリーズデータシステム；ＲＰ−１８逆相クロマトグラフィ
ーカラム（２２０×４．６ｍｍ、ＡＢＤ）；溶媒Ａ：０．１Ｍのトリエチルアン
モニウムアセテート；溶媒Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ；勾配４〜２８％Ｂ（３５分において）；流速：１ｍＬ／分；および検出器：２６０ｎｍ。

【００７５】（実施例３）ヒトβアクチン遺伝子のためのＴａｑｍａｎアッセイヒト遺伝子ＤＮＡを従来の方法を使用して調製した。アッセイ試薬の組成は以
下である（全体の用量、５０μｌ）：

【００７６】

【表２】試薬を９６−ウェルマイクロタイタートレイ中で混合し、以下のプロトコルを
使用して熱的に循環させた：５０℃で２分間；９５℃で１０分間；９５℃で１５
秒間、続いて６０℃で１分間を４０サイクル。ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓＭｏｄｅｌ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙ
ｓｔｅｍ（ＡＢＤ）を使用し、増幅プロセス間の蛍光をモニターした。

【００７７】Ｔａｑｍａｎ実験の結果は、２つのパラメータ；Ｒｎ値およびＣｔ値を使用し
て分析され得る。Ｒｎ値は、ＰＣＲ実験の終了時のレポーター色素の蛍光および
受動的参照の蛍光との比率である。Ｃｔ値、または閾値サイクル数は、蛍光比が
バックグラウンドとの識別が可能な時点における、ＰＣＲサイクル数である。所
定のレポーター色素および固定の標的濃度に対し、Ｒｎ値およびＣｔ値の両方は
、クエンチャーの効率を反映する。

【００７８】ＮＢＴ５の効率を、レポーターＦＡＭおよびＴＥＴをクエンチングする際のＴ
ＭＲの効率と比較した。ＮＴＢおよびＴＭＲに対するＲｎ値およびＣｔ値は、両
方のレポーター色素に対して識別不可能であった。クエンチャーＮＴＯ９をＦＡ
Ｍと共に使用し、そしてＮＴＢおよびＴＭＲの両方と等しいことが見出された。
ＮＴＢをレポーターＮＥＤと対にすることで他のレポーターと同様の結果を得た
。ＴＭＲは、レポーター色素ＮＥＤと共にクエンチャーとして使用され得なかっ
た。なぜなら、ＴＭＲおよびＮＥＤの蛍光発光は、同一の波長であったためであ
る。

【００７９】各個々の出願または特許出願を、特異的、かつ、個々に示し、参考として援用
する場合、全ての出願および特許出願は、本明細書中で参考として同程度に援用
される。

【００８０】極少数の実施態様を以上で詳細に説明したが、これらを含む分子生物学の当業
者は、多くの改変が好ましい実施態様において本発明の技術から逸脱することな
く可能であることを明らかに理解する。全てのこのような改変は、添付の特許請
求の範囲内に包含される。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】図１Ａは、本発明の様々な好ましいシアニン色素化合物を示す。

【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の様々な好ましいシアニン色素化合物を示す。

【図２Ａ】図２Ａは、本発明のシアニン色素クエンチャーの合成のための一般的な合成ス
キームを示す。

【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明のシアニン色素クエンチャーの合成のための一般的な合成ス
キームを示す。

【図３Ａ】図３Ａは、本発明の第１番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のた
めの合成スキームを示す。

【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の第１番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のた
めの合成スキームを示す。

【図３Ｃ】図３Ｃは、本発明の第１番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のた
めの合成スキームを示す。

【図４Ａ】図４Ａは、本発明の第２番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のた
めの合成スキームを示す。

【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の第２番目の好ましいシアニン色素クエンチャーの合成のた
めの合成スキームを示す。

【図５Ａ】図５Ａは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示
す。

【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示
す。

【図５Ｃ】図５Ｃは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示
す。

【図５Ｄ】図５Ｄは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示
す。

【図５Ｅ】図５Ｅは、本発明に従う様々なハイブリダイゼーション検出方法の概略図を示
す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月２６日（２０００．１．２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００９

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００９】第２の局面において、本発明は、レポーター色素およびクエンチャー色素を含
むレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対を含み、ここで、クエンチャ
ー色素は、第１の局面の非対称シアニン色素化合物である。ＥＰ−Ａ−０７１０６６８は、非ニトロ置換シアン色素およびオリゴヌク
レオチドの結合体を開示する。これらの結合体が、標的にハイブリダイズまたは
結合する場合、蛍光強度の検出可能な増加または蛍光偏光の変化が観測される。
従って、ＥＰ−Ａ−０７１０６６８の結合体色素は、蛍光共鳴エネルギー移
動によって予想外のクエンチングおよびニトロ置換シアニン色素の非蛍光特性に
よって本発明と区別される。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３６】代わりの好ましい実施態様において、式１の化合物の連結基は、低級アルキル
アミン、または低級アルキルカルボキシ部分であり、ここで、特に好ましい低級
アルキルカルボキシは、−（ＣＨ₂）_qＮ⁺（ＣＨ₃）₂（ＣＨ₂）_qＣＯ₂Ｈ（ここで
、ｑは２〜１２の範囲である）である。例えば、化合物２３。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３７

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３７】別の好ましい実施態様において、Ｒ₁またはＲ₂のうちの１つは、−（ＣＨ₂）_q Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃であり、ここでｑは、２〜１２の範囲であり、Ｒ₁またはＲ₂のもう一方は、連結基である。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４０】本発明のさらに好ましい実施態様において、式１の化合物は、Ｒ₁およびメチン架橋の隣接炭素が一緒になって、５〜７員（より好ましくは６員）を有する環
構造を形成する、架橋基を含む。例えば、化合物２０および２１。

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４３】（ＩＩ．非蛍光シアニン色素を含有する色素対）レポーター−クエンチャー色素対は、任意の分子対から構成され得、これらの
分子は、エネルギー転移プロセスに関与し得る。典型的なレポーターは、キサン
テン色素（フルオレセイン、およびローダミン色素を含む）から選択され得る。
これらの化合物の多くの適切な形態は市販されており、様々な置換基をそれぞれ
のキサンテン環に有し、これらの置換基が、オリゴヌクレオチドに対する結合部
位として、または、付着のための結合官能性として使用され得る。蛍光化合物の
別のグループは、ナフチルアミン類であり、これらは、α位またはβ位ににアミ
ノ基を有する。このようなナフチルアミノ化合物には、１−ジメチルアミノナフ
チル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネートおよび２
−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートが挙げられる。他の色素には
、以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：３−フェニル−７−イソ
シアナートクマリン、アクリジン（例えば、９−イソチオシアナートアクリジン
およびアクリジンオレンジ）、Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル
）マレイミド、ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなど。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４５】

【表１】

【手続補正７】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７１】（ニトロチアゾールオレンジスクシンイミジルエステルの調製）ジメチルホルムアミド（０．１ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（０
．０１ｍＬ）中のニトロチアゾールオレンジ９（８ｍｇ）の溶液に、Ｏ−（Ｎ−
スクシンイミジル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフル
オロボレート（１０ｍｇ）を添加した。この混合物を１０分間、７０℃に加温し
た。反応の進行をシリカゲルのＴＬＣ（溶出液として、６００：６０：１６ジ
クロロメタン：メタノール：酢酸を使用する）によってモニターした。この均一
溶液に５％のＨＣｌ（１ｍＬ）を添加した。沈殿物をさらなるＨＣｌで洗浄し、
そして乾燥させ、オレンジ色の固体を得た（８ｍｇ）。

【手続補正８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１Ａ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１Ａ】

【手続補正９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１Ｂ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１Ｂ】

【手続補正１０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２Ａ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２Ａ】

【手続補正１１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２Ｂ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２Ｂ】

【手続補正１２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３Ａ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３Ａ】

【手続補正１３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３Ｂ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３Ｂ】

【手続補正１４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３Ｃ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３Ｃ】

【手続補正１５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４Ａ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４Ａ】

【手続補正１６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４Ｂ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４Ｂ】

【手続補正１７】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５Ａ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５Ａ】

【手続補正１８】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５Ｂ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５Ｂ】

【手続補正１９】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５Ｃ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５Ｃ】

【手続補正２０】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５Ｄ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５Ｄ】

【手続補正２１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５Ｅ

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５Ｅ】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｄ 513/04 ３４５Ｃ０７Ｄ 513/04 ３４５４Ｃ０７２Ｃ０７Ｈ 19/04 Ｃ０７Ｈ 19/04 ４Ｈ０５６ 21/00 21/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/58 ＡＧ０１Ｎ 33/58 (Ｃ０７Ｄ 421/06 //(Ｃ０７Ｄ 421/06 215:06 215:06 293:12） 293:12） (Ｃ０７Ｄ 513/04 (Ｃ０７Ｄ 513/04 211:80 211:80 277:62） 277:62）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者グラハム，ロナルドジェイ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94588，プリーザントン，アンドリューズドライブナンバー315 3610 (72)発明者ミュラー，カイルザーマンビー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94404，ユニオンシティ，リージェンツブールバード 32804 (72)発明者ハクゾ，フランシスティー．アメリカ合衆国カリフォルニア 94117，サンフランシスコ，ページストリート 946 Ｆターム(参考） 2G045 BA20 DA12 DA13 DA80 FB02 FB07 FB12 FB13 GC15 4B024 AA11 CA01 CA09 HA08 HA13 HA14 4B063 QA01 QQ42 QR32 QR56 QR62 QR66 QS25 QS34 QX02 4C057 BB02 DD01 LL03 MM05 4C063 AA01 BB03 CC62 DD14 EE10 4C072 AA01 AA06 BB02 BB06 CC01 CC16 EE13 FF07 GG06 HH07 UU04 4H056 CA01 CC02 CC08 CE03 CE06 DD04 DD19 DD23 FA08

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の構造を有し、そして任意の付随する対イオンを含む非対
称シアニン色素化合物であって：【化１】ここで：ｎは、０〜２の範囲内であり；Ｘは、Ｏ、ＳまたはＳｅであり；Ｒ₁は、メチルおよび連結基からなる群から選択されるか、またはメチン架橋の隣接炭素と一緒になる場合、５〜７員を有する環構造を形成し；Ｒ₂は、連結基であり；Ｒ₃は、水素であるか、またはＲ₄と一緒になる場合、１個またはそれ以上のニ
トロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；Ｒ₄は、水素であるか、またはＲ₃もしくはＲ₅のどちらかと一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；Ｒ₅は、ニトロであるか、またはＲ₄もしくはＲ₆のどちらかと一緒になる場合、１個またはそれ以上のニトロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成し；Ｒ₆は、水素であるか、またはＲ₅と一緒になる場合、１個またはそれ以上のニ
トロ基で置換される縮合芳香族架橋を形成する、化合物。
【請求項２】請求項１に記載の化合物であって、Ｒ₅がニトロであり、そしてＲ₃、Ｒ₄およびＲ₆が、それぞれ水素である、化合物。
【請求項３】請求項１に記載の化合物であって、前記連結基が、低級アル
キルアミンまたは低級アルキルカルボキシである、化合物。
【請求項４】請求項１に記載の化合物であって、Ｒ₁またはＲ₂の一方が−
（ＣＨ₂）_q−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₃であり、ここでｑは、２〜１２の範囲であり、そしてもう一方は、連結基である、化合物。
【請求項５】請求項３に記載の化合物であって、ここで、前記低級アルキ
ルカルボキシが−（ＣＨ₂）_q−Ｎ⁺（ＣＨ₃）₂−（ＣＨ₂）_q−ＣＯ₂Ｈであり、こ
こでｑは、２〜１２の範囲である、化合物。
【請求項６】請求項１に記載の化合物であって、ここでＸが、硫黄である
、化合物。
【請求項７】請求項１に記載の化合物であって、ここでｎが、０または１
である、化合物。
【請求項８】請求項１に記載の化合物であって、ここでＲ₃およびＲ₄がそ
れぞれ水素であり、そしてＲ₅およびＲ₆が一緒になって、１個またはそれ以上の
ニトロ基で置換される縮合芳香族環となる、化合物。
【請求項９】以下の式の化合物【化２】
【請求項１０】以下の式の化合物【化３】
【請求項１１】以下の式の化合物【化４】
【請求項１２】以下の式の化合物【化５】
【請求項１３】以下の式の化合物【化６】
【請求項１４】以下の式の化合物【化７】
【請求項１５】レポーター色素およびクエンチャー色素を含むレポーター
−クエンチャーエネルギー移動色素対であって、該クエンチャー色素が、請求項
１に記載の非対称シアニン色素化合物である、レポーター−クエンチャーエネル
ギー移動色素対。
【請求項１６】前記レポーター色素が、キサンテン、クマリン、ナフチル
アミン、シアニンおよびボディピー（ｂｏｄｉｐｙ）色素からなる群から選択さ
れる、請求項１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対。
【請求項１７】前記レポーター色素がキサンテン色素である、請求項１５
に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対。
【請求項１８】前記キサンテン色素が、フルオレセイン色素またはローダ
ミン色素である、請求項１５に記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動
色素対。
【請求項１９】前記レポーター色素が、カルボキシ−フルオレセイン（Ｆ
ＡＭ）であり、前記クエンチャー色素が、以下の式である、請求項１５に記載の
レポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対【化８】
【請求項２０】前記レポーター色素が、カルボキシ−フルオレセイン（Ｆ
ＡＭ）、２’，４’，１，４−テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、および
２’−クロロ−５’−フルオロ−７’，８’−縮合フェニル−１，４−ジクロロ
−カルボキシフルオレセイン（ＮＥＤ）からなる群から選択され、そして前記ク
エンチャー色素が、以下の式である、請求項１５に記載のレポーター−クエンチ
ャーエネルギー移動色素対【化９】
【請求項２１】前記クエンチャー色素が、以下の式である、請求項１５に
記載のレポーター−クエンチャーエネルギー移動色素対【化１０】
【請求項２２】標識化オリゴヌクレオチドであって、オリゴヌクレオチド；および該オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合した請求項１に記載の非蛍光シアニン
色素クエンチャーを含む、標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項２３】前記オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合したレポータ
ー色素をさらに含む、請求項２２に記載の標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項２４】請求項２３に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、
ここで、前記レポーター色素および前記クエンチャー色素の前記位置において、
該標識化オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズされる場合、該
レポーター色素が該クエンチャー色素によって効果的にクエンチされず、そして
該標識化オリゴヌクレオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズされない場合、
該レポーター色素が該クエンチャー色素によって効果的にクエンチされるような
、標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】請求項２４に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、
前記レポーター色素が、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にク
エンチされない場合の蛍光に比べて、少なくとも２の因子で減少する、標識化オ
リゴヌクレオチド。
【請求項２６】請求項２５に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、
前記レポーター色素が、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にク
エンチされない場合の蛍光に比べて、少なくとも６の因子で減少する、標識化オ
リゴヌクレオチド。
【請求項２７】請求項２３に記載の標識化オリゴヌクレオチドであって、
前記レポーター色素および前記クエンチャー色素の一方が、前記オリゴヌクレオ
チドの３’末端で結合し、そしてもう一方が、該オリゴヌクレオチドの５’−末
端で結合する、標識化オリゴヌクレオチド。
【請求項２８】標的核酸配列を検出する方法であって、少なくとも１つの
標的核酸配列を含む核酸サンプルを提供する工程；および標識化オリゴヌクレオ
チドプローブを、該標的核酸配列にハイブリダイズする工程を包含し、該標識化
オリゴヌクレオチドプローブは、請求項１に記載の非対称シアニン色素化合物で
標識化される、方法。
【請求項２９】請求項２８に記載の方法であって、前記標識化オリゴヌク
レオチドは、前記オリゴヌクレオチドに共有結合的に結合したレポーター色素を
含む、方法。
【請求項３０】請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記レポータ
ー色素および前記クエンチャー色素の前記位置において、前記標識化オリゴヌク
レオチドが、標的核酸配列にハイブリダイズされる場合、該レポーター色素が、
該クエンチャー色素によって効果的にクエンチされず、そして該標識化ヌクレオ
チドが、標的核酸配列にハイブリダイズされない場合、該レポーター色素が該ク
エンチャー色素によって効果的にクエンチされるような、方法。
【請求項３１】請求項３０に記載の方法であって、前記レポーター色素が
、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にクエンチされない場合の
蛍光に比べて、少なくとも２の因子で減少する、方法。
【請求項３２】請求項３１に記載の方法であって、前記レポーター色素が
、効果的にクエンチされる場合、この蛍光が、効果的にクエンチされない場合の
蛍光に比べて、少なくとも６の因子で減少する、方法。
【請求項３３】請求項２９に記載の方法であって、前記レポーター色素お
よび前記クエンチャー色素の一方が、前記オリゴヌクレオチドの３’末端で結合
し、そしてもう一方が、該オリゴヌクレオチドの５’−末端で結合する、方法。
【請求項３４】請求項２９に記載の方法であって、前記レポーター色素お
よび前記クエンチャー色素の一方または両方が、前記オリゴヌクレオチドプロー
ブから除去されるように該オリゴヌクレオチドプローブを温浸する工程をさらに
含む、方法。
【請求項３５】請求項３４に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチ
ドプローブが、ポリメラーゼ酵素の５’→３’ヌクレアーゼ活性によって生じる
ように温浸される工程を含む、方法。