ES2909351T3 - Quencheres estabilizadores de fluorescencia dúplex para sondas de ácidos nucleicos - Google Patents

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Abstract

Un reactivo quencher para el etiquetado de oligonucleótidos que tiene la fórmula: **(Ver fórmula)** en la que Ar1 y Ar2 son moléculas aromáticas o heteroaromáticas; X es hidroxilo, un grupo saliente, un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido, o un enlazador conectado a un soporte sólido de síntesis; y n es de 1 a 3.

Description

DESCRIPCIÓN
Quencheres estabilizadores de fluorescencia dúplex para sondas de ácidos nucleicos
Antecedentes
La presente divulgación se refiere a conjugados de oligonucleótidos-quencher con características de fluorescencia mejoradas, y a reactivos adecuados para incorporar nuevos restos quencher en oligonucleótidos. La divulgación también se refiere a la utilización de conjugados de oligonucleótidos-quencher en procedimientos de detección de dianas de ácidos nucleicos.
La unión al surco menor (MGB) y el apagado de la fluorescencia son dos características clave de las tecnologías de sondas de ADN basadas en la fluorescencia. La primera característica proporciona una mejor estabilización del dúplex y especificidad de hibridación, mientras que la segunda es necesaria para reducir la fluorescencia de fondo de las sondas no hibridadas. Históricamente, se han utilizado dos grupos funcionales independientes para cumplir estas funciones. El MGB y los quenchers se han introducido en las sondas de ADN utilizando dos reactivos como son los soportes sólidos de síntesis de ADN modificados con MGB y los fosforamiditos Quencher. En otro enfoque, se utiliza un soporte sólido MGB-Quencher en el que el MGB y el quencher están unidos a través de un espaciador flexible en el que cada grupo cumple su función única. Las estructuras existentes del MGB-Quencher y los respectivos reactivos de síntesis de ADN, como se divulgan en la patente US n° 6.492.346 son complicadas y costosas de fabricar.
Sumario
La presente divulgación se refiere a ciertos derivados de diaril-azo en los que dichos derivados son eficientes quenchers de fluorescencia así como agentes estabilizadores de dúplex de ácidos nucleicos. La presente divulgación también se refiere a conjugados de oligonucleótidos que llevan dichos derivados de diaril-azo.
De acuerdo con la presente invención se proporciona un reactivo quencher para el etiquetado de oligonucleótidos que tiene la fórmula:
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en la que Ar1 y Ar2 son moléculas aromáticas o heteroaromáticas;
X es hidroxilo, un grupo saliente, un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido, o un enlazador conectado a un soporte sólido de síntesis; y n es de 1 a 3.
Se considera deseable combinar la unión al surco menor (MGB) y el enfriamiento por fluorescencia en una estructura unificada simple. Un enfoque para este problema es convertir parte de la resto MGB en un quencher de fluorescencia como se ilustra en la FIG. 1. Sin embargo, no está claro que dicha unificación funcional pueda lograrse dentro de una estructura sin que se vean afectadas las propiedades de unión al surco menor o de amortiguación de la fluorescencia. Sorprendentemente, ciertas realizaciones preferentes descritas en el presente documento pueden lograr con éxito esta diana.
Los derivados diaril-azo divulgados son especialmente útiles para la modificación de ciertos tipos de agentes MGB conocidos (como los oliogómeros del ácido 3,6,7,8-tetrahidro-benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (CDPI), en los que una parte de la estructura MGB se sustituye por un derivado diaril-azo divulgado. Las dos partes de estas moléculas híbridas están conectadas a través de un enlace amida rígido sin capacidad de plegado interno y con una rotación limitada y, por lo tanto, actúan como una sola entidad. Como se ha demostrado en el presente documento, ciertos tipos de tales moléculas híbridas son tan eficientes o más eficientes como agente estabilizador de dúplex que sus moléculas MGB madre. Los híbridos resultantes son también eficientes quencher de fluorescencia para una variedad de fluoróforos típicos. Esta capacidad de fusionar la estabilización del dúplex y el apagado de la fluorescencia dentro de una estructura es el punto clave de la divulgación.
La disponibilidad de los derivados divulgados elimina la necesidad de dos reactivos separados y simplifica la preparación de conjugados de oligonucleótidos que requieren tanto una hibridación mejorada como un apagado de fluorescencia eficiente. Estos conjugados son de especial interés en las aplicaciones de diagnóstico basadas en la fluorescencia.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 muestra un esquema del concepto de fusión de un aglutinante de surco menor y un quencher de fluorescencia en un único resto de dúplex estabilizador (DSQ).
La FIG. 2 muestra un esquema sintético genérico 1 para la preparación de ésteres de pentafluorofenilo (PFP) g9 y soportes de síntesis g10.
La FIG. 3A muestra una HPLC analítica del conjugado de oligonucleótidos T8-477 preparado según el esquema genérico 1.
La FIG. 3B muestra los espectros UV-VIS de matriz de fotodiodos (PDA) del pico principal del conjugado de oligonucleótidos T8-477 preparado según el esquema genérico 1.
La FIG. 4A muestra las estructuras y los máximos de absorción de los conjugados de oligonucleótidos T8 sintetizados según el esquema de reacción 1.
La FIG. 4B muestra las estructuras y los máximos de absorción de los conjugados de oligonucleótidos T8 sintetizados según el esquema de reacción 1.
La FIG. 4C muestra las estructuras y los máximos de absorción de los conjugados de oligonucleótidos T8 sintetizados según el esquema de reacción 1.
La FIG. 4D muestra las estructuras y los máximos de absorción de los conjugados de oligonucleótidos T8 sintetizados según el esquema de reacción 1.
La FIG. 5A muestra las etapas del esquema de reacción 2, síntesis del soporte de poliestireno ID # 478. La FIG. 5B muestra las etapas del esquema de reacción 2, síntesis del soporte de poliestireno ID # 478. La FIG. 6A muestra una HPLC analítica del conjugado oligonucleótido T8 sintetizado a partir del soporte de poliestireno ID # 478.
La FIG. 6B muestra los espectros PDA UV-VIS del pico principal y la estructura del producto del conjugado T8-oligonucleótido sintetizado a partir del soporte de poliestireno ID # 478.
La FIG. 7A muestra las etapas del esquema de reacción 3, síntesis del soporte de poliestireno ID # 480. La FIG. 7B muestra las etapas del esquema de reacción 3, síntesis del soporte de poliestireno ID # 480. La FIG. 8A muestra una HPLC analítica del conjugado oligonucleótido T8 sintetizado a partir del soporte de poliestireno ID # 480.
La FIG. 8B muestra los espectros PDA UV-VIS del pico principal y la estructura del producto del conjugado T8-oligonucleótido sintetizado a partir del soporte de poliestireno ID # 480.
La FIG. 9A muestra las etapas del esquema de reacción 4, síntesis de la fosforamidita 75.
La FIG. 9B muestra las etapas del esquema de reacción 4, síntesis de la fosforamidita 75.
La FIG. 10A muestra la HPLC analítica del conjugado oligonucleótido T8 sintetizado con el fosforamidito 75.
La FIG. 10B muestra los espectros PDA UV-VIS del pico principal y de la estructura del producto del conjugado T8-oligonucleótido sintetizado utilizando el fosforamidito 75.
La FIG. 11A muestra los espectros de absorción UV-VIS de los conjugados T8-DSQ.
La FIG. 11B muestra los espectros de absorción UV-VIS de los conjugados T8-DSQ.
La FIG. 11C muestra los espectros de absorción UV-VIS de los conjugados T8-DSQ.
La FIG. 12 muestra las temperaturas de fusión de los dúplex (KPC KPC-C) y (IC IC-C) y las secuencias correspondientes.
La FIG. 13 muestra la fluorescencia de fondo (90°C) de las sondas de oligonucleótidos KPC e IC marcadas con derivados 3'-DSQ representativos, donde las sondas también fueron marcadas con 5'-FAM (KPC) o 5'-AP525 (IC).
La FIG. 14A muestra los efectos de varios ligandos DSQ en la estabilidad del dúplex d(T8)/d(A8).
La FIG. 14B muestra los efectos de varios ligandos DSQ en la temperatura de fusión del dúplex d(T8)/d(A8).
La FIG. 15 muestra una comparación de los efectos estabilizadores de dúplex de CDPI2, CDPI3 (ID # 391), MGB- Quencher (ID # 385) y DSQ (ID # 477) en diferentes contextos de secuencia, y las secuencias correspondientes.
La FIG. 16 muestra el rendimiento de la PCR de dos sondas TaqMan marcadas con derivados representativos de DSQ.
La FIG. 17A muestra el perfil de temperatura de fluorescencia dúplex y monocatenario de un conjugado de oligonucleótidos marcado con 5'-Ds Q ID # 473 y 5'-FAM.
La FIG. 17B muestra el perfil de temperatura de fluorescencia dúplex y monocatenario de un conjugado de oligonucleótidos marcado con 5'-Ds Q ID # 473 y 5'-AP525.
La FIG. 18 muestra las estructuras de los colorantes MGB-Quencher (ID # 385), CDPI3 (ID # 391), AP525, AP593 y AP639, con un enlace ondulado que indica el punto de unión a un oligonucleótido.
Descripción detallada
Definiciones
El término compuestos o derivados "diaril-azo" se refiere a los derivados de diazeno (HN=NH) en los que ambos átomos de hidrógeno están sustituidos por dos grupos arilo. A efectos de la presente memoria, el término arilo abarca las definiciones de ambos términos "arilo" y "heteroarilo".
El término "aminoácido aromático" se refiere a un compuesto aromático que comprende un grupo carboxílico aromático y un grupo amino aromático.
Las abreviaturas MGB, FI, Q, CPG y ODN se refieren al "ligante de surco menor", a la "etiqueta fluorescente" o al "fluoróforo", al "quencher", al "vidrio de poro controlado" (como ejemplo de soporte sólido) y a las moléculas o "oligonucleótidos", respectivamente, y de una manera que se desprende del contexto.
El término "aglutinante de surco menor" se refiere a un resto capaz de formar un complejo (típicamente no covalente) con el surco menor del ADN. Los aglutinantes de surco menor de la invención son conjugados de oligonucleótidos (o "sondas") como se describe en patente US n° 5.801.155 y en la patente US n° 6.312.894. Estos conjugados forman dúplex hiperestabilizados con el ADN complementario. En particular, la especificidad de la secuencia de las sondas aglutinantes de surco menor cortas es excelente para aplicaciones de alta temperatura como la PCR. Las sondas/conjugados de la presente divulgación también pueden tener un ligante de surco menor unido covalentemente. En la literatura se ha descrito una variedad de aglutinantes de ranuras menores adecuados (patente US n° 5.801.155; Wemmer, D.E., y Dervan P.B. (1997; Walker et al. (1997), Biopolymers, 44:323-334 (1997); Zimmer, C & Wahnert, U., (1986) y Reddy, et al. (1999), Pharmacol. Therap., 84:1-111 (1999)).
También se han descrito procedimientos adecuados para unir ligantes de surco menor (así como grupos informadores tales como fluoróforos y quenchers) a través de enlazadores a oligonucleótidos (patentes US n°s RE 38.4165,512, 6675,419, 9665,696, 251 5,585,481 5, 942,610 y 5,736,626).
El término "etiqueta fluorescente o fluoróforo" se refiere a un resto orgánica capaz de absorber y reemitir luz. Normalmente, los fluoróforos absorben luz de un determinado rango de longitudes de onda (espectro de excitación) y la reemiten en un rango de longitudes de onda más largo (espectro de emisión) con sus respectivos máximos de excitación y emisión. Los fluoróforos de la invención tienen máximos de excitación y emisión entre 400 y 900 nm. Se pueden encontrar ejemplos de estas clases de colorantes en Haugland, et al., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, SIXTH ED., Molecular Probes, Eugene, Oreg. 1996 Krasovitskii y Bolotin, ORGANIC LUMINESCENT MATERIALS, VCH Publishers, N.Y., 1988 Zolliger, COLOR CHEMISTRY, 2a edición, VCH Publishers, N.Y., 1991. Otros tintes se ofrecen a través de sitios web como zeiss.com. Los colorantes de fosfonato se divulgan en la Pat. US n° 7.671.218, Pat. US n° 7.767.834 y Pat. US n° 8.163.910B2
El término "quencher" se refiere a un resto orgánico que es capaz de reducir la eficiencia de la remisión de luz por un fluoróforo. Los quencheres se han divulgado en la patente US n° 3.996.345 y en las patentes US n°s 6.727.356 y 6,790,945 y por Matayoshi et al., 1990.
El término "oligonucleótido" se refiere a un fragmento de ácido nucleico natural o artificial o a una combinación de los mismos. Entre los ejemplos de ácidos nucleicos artificiales se encuentran los análogos con esqueleto de azúcarfosfato modificado, como el ácido nucleico 2-OMe, el ácido nucleico peptídico (PNA), el ácido nucleico bloqueado (LNA), el ácido nucleico de treosa (TNA), el ácido nucleico glicólico (GNA) ( Pat. US n° 5.539.082, 8.293.684 y 9,464,316) . Ácido nucleico artificial (Pat. US n° 9.169.256) también puede comprender nucleobases modificadas.
El término "nucleobases modificadas o bases modificadas" se refiere a aquellas bases que difieren de las bases naturales (adenina, citosina, guanina, timina y uracilo) por adición o supresión de uno o más grupos funcionales, diferencias en la estructura del anillo heterocíclicofes decir, sustitución del carbono por un heteroátomo, o viceversa), y/o unión de una o más estructuras de brazo enlazador a la base. Las bases modificadas incluyen modificaciones y análogos naturales y sintéticos de las principales bases como, por ejemplo, la hipoxantina, la 2-aminoadenina, el 2-tiouracilo, la 2-tiotina, la inosina, la 5-N4-tenocitosina, la 4-aminopirrazolo[3,4-d]pirimidina y la 6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina. Cualquier nucleótido o análogo de nucleótido modificado compatible con la hibridación de la sonda con un conjugado de ácido nucleico a una secuencia diana es útil, incluso si el propio nucleótido o análogo de nucleótido modificado no participa en el apareamiento de bases, o tiene propiedades de apareamiento de bases alteradas en comparación con los nucleótidos de origen natural. Los ejemplos de bases modificadas se divulgan en Pat. US n°s 7.045.6105, 824,7966, 127,121 5, 912,340 y Publicaciones PCT WO 01/38584 y WO 01/64958. Las bases modificadas preferentes incluyen la 5-hidroxibutil uridina para la uridina; 4-(4,6-diamino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-but-3-in-1-ol, 4-amino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina y 4-amino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina para la adenina; 5-(4-Hidroxi-but-1-inil)-1H-pirimidina-2,4-diona para la timina; y 6-amino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidina-4(5H)-ona para la guanina. Las bases modificadas particularmente preferentes son "Super A®: 4-(4,6-Diamino-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-but-3-in-1-ol," "SuperG®: 4-hidroxi-6-amino-pirazolopirimidina" (elitechgroup.com) y "Super T®: 5-(4-hidroxi-but-1-inil)-1H-pirimidin-2,4-diona". "Super-D™": los análogos de "3-alquil-pirazolopirimidina" como bases universales se divulgan en publicación de solicitud de patente US n° 2012/0244535.
El término "enlazador" y "grupo enlazador" se refiere a un resto que se utiliza para ensamblar varias porciones de la molécula o para unir covalentemente la molécula (o porciones de la misma) a un soporte sólido. Típicamente, un enlazador o grupo enlazador tiene grupos funcionales que se utilizan para interactuar y formar enlaces covalentes con grupos funcionales en los ligandos o componentes (por ejemplo, fluoróforos, oligonucleótidos, aglutinantes de surco menor o quenchers) de las sondas de oligonucleótidos descritas y utilizadas en el presente documento. Además, un enlazador puede incluir porciones lineales o acíclicas, porciones cíclicas, anillos aromáticos o combinaciones de los mismos (patentes US n°s 5.419.9665, 696,251 5, 585,481 5, 942,610 y 5,736,626).
Los términos grupos "funcionales" y "reactivos" en la presente invención se utilizan indistintamente y se refieren a los grupos químicos y a los elementos que son adecuados para la formación de un enlace químico. Se trata, por ejemplo, de aminas, oxiaminas, hidrazinas, hidrazidas, semicarbazidas, semitiocarbazidas, compuestos sustituidos por hidroxilos, compuestos de azufre (como tioles, ditioles, compuestos de tiocarbonilo, fosforotiatos), carboxilatos, fosfatos, fosfonatos, nitrógenos aromáticos (como en la piridina), nitrógenos de amida, azidas, aromáticos ricos en electrones, etc.), ácidos (en presencia de agentes activadores), ésteres, imidoésteres, anhídridos, cloruros ácidos, acilazidas, lactonas, azlactonas, isocianatos, isotiocianatos, o-acilisoureas, amidas ácidas (como las acilimidazolidas o fosforamiditas), compuestos de carbonilo, hidrocarburos halogenados, aromáticos halogenados (como cloruro de triazina, fluoroaromáticos deficientes en electrones), hidrocarburos insaturados, sales de diazonio aromáticas, epóxidos, aziridinas. Otros tipos de grupos funcionales o reactivos son los foto-reactivos (azidas, benzofenonas, diazirinas, etc.), los grupos quelantes de metales (ácido aminodiacético), los sustratos para el acoplamiento catalizado por metales, los ligandos para el reconocimiento molecular (como la biotina), los antígenos y los haptenos. Los grupos funcionales y reactivos de la presente invención también pueden utilizarse junto con reactivos de reticulación bifuncionales o polifuncionales (como bis-aminas, bis-aldehídos, ésteres de maleimido-NHS, etc.). Otros ejemplos de grupos reactivos y de reacción de reticulación pueden encontrarse en la literatura (Hermanson, Bioconjugate Techniques, Elsevier, 1996).
Por "grupo saliente" se entiende un fragmento molecular que parte con un par de electrones en la escisión del enlace heterolítico. Los grupos salientes más comunes son los haluros, como CI-, Br- e I-, los ésteres de sulfonato, como el tosilato (TsO-), los fenolatos, como el 4-nitrofenilato, y el agua (Smith, 2007).
"Grupo protector" o "forma protegida del mismo" o "grupo funcional protegido" o "PFP" o "grupo bloqueador" se refiere a una agrupación de átomos que, cuando se une a un grupo reactivo en una molécula, enmascara, reduce o impide esa reactividad. Se pueden encontrar ejemplos de grupos protectores en T. W. Greene y P. G. Wuts, 2007 y Harrison y Harrison et al 1971 a 1996. Entre los grupos protectores amino representativos se encuentran el formilo, acetilo, trifluoroacetilo, bencilo, benciloxicarbonilo (CBZ), terc-butoxicarbonilo (Boc), trimetilsililo (TMS), 2-trimetilsililetanosulfonilo (SES), tritilo y grupos tritilo sustituidos, aliloxicarbonilo, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC), nitro-veratriloxicarbonilo (NVOC) y similares. Los grupos protectores hidroxi representativos incluyen aquellos en los que el grupo hidroxi está acilado o alquilado, como los éteres de bencilo y de tritilo, así como los éteres de alquilo, los éteres de tetrahidropiranilo, los éteres de trialquilsililo y los éteres de alilo.
El término "soporte sólido" o "soporte sólido de síntesis" se refiere a cualquier soporte que sea compatible con la síntesis de oligonucleótidos, incluyendo, por ejemplo, vidrio, vidrio de poro controlado, materiales poliméricos, poliestireno, perlas, vidrio recubierto y similares.
El término "grupo amino exocíclico" significa un grupo amino situado fuera de un anillo químico, como en la anilina. El término "alquilo" se refiere a un sustituyente hidrocarbonado monovalente lineal, ramificado o cíclico, o a una combinación de sustituyentes monovalentes cíclicos y lineales o ramificados que tienen el número de átomos de carbono indicado en el prefijo. Por ejemplo, el alquilo(C-i-C8) incluye el metilo, el etilo, el n-propilo, el 2-propilo, el terc-butilo, el pentilo, el ciclopentilo, el ciclopropilmetilo y similares. Para cada una de las definiciones del presente documento (por ejemplo, alquilo, alquenilo, alcoxi, aralquiloxi), cuando no se incluya un prefijo para indicar el número de átomos de carbono de la cadena en una porción de alquilo, el sustituyente del mismo tendrá ocho o menos átomos de carbono de la cadena principal.
El término "alquileno" se refiere a un sustituyente hidrocarbonado divalente saturado lineal o a un sustituyente hidrocarbonado divalente saturado ramificado que tiene el número de átomos de carbono indicado en el prefijo. Por ejemplo, se entiende que el alquileno(C-i-C6) incluye el metileno, el etileno, el propileno, el 2-metilpropileno, el pentilo y similares.
El término "aromático" o "arilo" significa un sustituto monocíclico, bicíclico aromático o tricíclico de hidrocarburo de 5 a 14 átomos de anillo, monovalente o bivalente (por ejemplo, arileno), no sustituido o sustituido. Si están sustituidos, los sustituyentes se seleccionan entre los grupos que se indican a continuación. El término "heteromático" o "heteroarilo" se refiere a los arilos en los que uno o más heteroátomos o grupos funcionales heteroatómicos han sustituido a un carbono del anillo, conservando las propiedades aromáticas, por ejemplo, piridilo, quinolinilo, quinazolinilo, tienilo y similares. Más específicamente, los términos arilo y heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, 1 -naftilo, 2-naftilo, tienilo, tiazolilo y benzotiazolilo, y sus formas sustituidas.
Los sustituyentes de los grupos arilo y heteroarilo son variados y se seleccionan entre: -halógeno, -OR', -OC(O)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -NO2, -CO2R', -CONR'R", -C(O)R', -OC(O) NR'R", -NR "C(O)R', -NR "C(O)2R', -NR'-C(O), NR "R'", - NH-C(NH2)=NH, -NR'C(NH2)=NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(O)R', -S(O)2r', -S(O)2NR'R", -N3, -CH(Ph)2, perfluoro(C1-C4)alkoxi, y perfluoro de alquilo(C-i-C4), en un número que va desde cero hasta el número total de valencias abiertas en el sistema de anillos aromáticos; y donde R', R" y R se seleccionan independientemente entre hidrógeno, alquilo(C-i-C8) y heteroalquilo, arilo y heteroarilo no sustituido, (arilo no sustituido)-alquilo(C-i-C4), y (arilo no sustituido)oxi-alquilo(C-i-C4). Los sustituyentes preferidos son -OH, halógeno, OR', -OC(O)R', -NR'R", - SR', -R', -CN y -NO2-, en las que R' y R" son independientemente -H- o -(C1-C4).
El prefijo "halo" y el término "halógeno", cuando se utilizan para describir un sustituyente, se refieren a -F, -Cl, -Br e -I. Algunos compuestos u oligonucleótidos de la presente divulgación pueden existir en forma de sal.
Dichas sales incluyen sales de adición de base como la sal de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o magnesio, o una sal similar. Cuando los compuestos u oligonucleótidos modificados de la presente divulgación contienen funcionalidades relativamente básicas, pueden obtenerse sales de adición de ácido poniendo en contacto la forma neutra de dichos compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, ya sea puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de ácido aceptables incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como el clorhídrico, el bromhídrico, el nítrico, el carbónico, el monohidrógeno-carbónico, el fosfórico, el monohidrógeno-fosfórico, el dihidrógeno-fosfórico, el sulfúrico, el monohidrógeno-sulfúrico, el hidriódico o fosfórico y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos como el acético, el propiónico, el isobutírico, el maleico, el malónico, el láctico, el benzoico, el succínico, el suberico, el fumárico, el mandélico, el ftálico, el bencenosulfónico, el p-tolilsulfónico, el cítrico, el tartárico, el metanosulfónico y similares. También se incluyen sales de aminoácidos como el arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos como los ácidos glucurónico o galactunórico y similares (Berge, S. M., et al. 1977). Algunos compuestos específicos descritos en el presente documento contienen funcionalidades tanto básicas como ácidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adición de base o de ácido. Las formas neutras de los compuestos pueden regenerarse poniendo en contacto la sal con una base o un ácido y aislando el compuesto madre de la manera convencional. La forma madre del compuesto difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades físicas, como la solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás las sales son equivalentes a la forma madre del compuesto a efectos de la presente divulgación.
Ciertos compuestos de la presente divulgación pueden existir en formas no solvatadas así como en formas solvatadas, incluyendo formas hidratadas. En general, las formas solvatadas son equivalentes a las formas no solvatadas y se pretende que queden comprendidas en el ámbito de la presente divulgación. Algunos compuestos de la presente divulgación pueden existir en múltiples formas cristalinas o amorfas. En general, todas las formas físicas son equivalentes para los usos contemplados por la presente divulgación y se pretende que estén dentro del ámbito de la presente divulgación.
Ciertos compuestos de la presente divulgación poseen átomos de carbono asimétricos (centros ópticos) o dobles enlaces; los racematos, los diastereómeros, los isómeros geométricos y los isómeros individuales se pretenden abarcar dentro del alcance de la presente divulgación. Los procedimientos para la determinación de la estereoquímica y la separación de los isómeros son bien conocidos en la técnica (March J. 1992).
Los compuestos de la presente divulgación también pueden contener proporciones no naturales de isótopos atómicos en uno o más de los átomos que constituyen dichos compuestos. Por ejemplo, los compuestos pueden ser radiomarcados con isótopos radiactivos, como por ejemplo tritio(3H), yodo-125(125I) o carbono-14(14C). Todas las variaciones isotópicas de los compuestos de la presente divulgación, ya sean radiactivas o no (por ejemplo, 2H), se pretenden abarcar dentro del alcance de la presente divulgación.
"Opcional" u "opcionalmente" en las definiciones anteriores significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente puede ocurrir pero no necesariamente, y que la descripción incluye casos en los que el evento o circunstancia ocurre y casos en los que no. Por ejemplo, "arilo opcionalmente monosustituido o bisustituido con un grupo alquilo" significa que el grupo alquilo puede estar presente, pero no es necesario, y la descripción incluye situaciones en las que el grupo arilo está monosustituido o bisustituido con un grupo alquilo y situaciones en las que el grupo arilo no está sustituido con el grupo alquilo.
En ciertos casos, la amplificación se lleva a cabo utilizando una polimerasa. La polimerasa puede, aunque no es necesario, tener actividad nucleasa 5'. En otros casos, la extensión de los cebadores se lleva a cabo con una transcriptasa inversa y la amplificación se realiza con una polimerasa (patentes US n°s 6.312.894 y 7,381,818). En otros casos, la amplificación es isotérmica (solicitud de patente US n° 20140255928).
En una realización, las dianas amplificadas se detectan, con sondas dobles FRET DSQ-conjugadas, como se enseña en las patentes US n°s 6.312.894, 7,381,818 y La solicitud de patente US n° 20140255928.
El término "PCR digital" se refiere a un enfoque de detección y cuantificación de ácidos nucleicos, que es un procedimiento de cuantificación absoluta, ya que cuenta directamente el número de moléculas diana en lugar de depender de estándares de referencia o controls endógenos (Sedlak y Jerome 2013).
El término "arrays" se refiere a la hibridación de las sondas de la invención con un oligonucleótido inmovilizado (patente US n° 6.045.996). En algunas matrices, las sondas aquí descritas se inmovilizan en un soporte sólido (patente US n° 6.821.727).
La puesta en práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química orgánica, bioquímica, síntesis y modificación de oligonucleótidos, química de bioconjugados, hibridación de ácidos nucleicos, biología molecular, microbiología, genética, ADN recombinante y campos relacionados, tal y como está dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Maniatis, Fritsch & Sambrook 1982; Sambrook, Fritsch & Maniatis, (1989); Ausubel, et al., 1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996; Gait (ed.), 1984; Eckstein (ed.), 1991.
Descripción
En el presente documento se describen ciertos derivados de diaril-azo, en los que dichos derivados son eficaces quencheres de la fluorescencia, así como agentes estabilizadores de dúplex de ácidos nucleicos. Estos derivados también pueden denominarse compuestos, derivados o agentes de temple dúplex estabilizador (DSQ).
En realizaciones preferentes, los derivados de DSQ comprenden un ácido carboxílico diaril-azo de Fórmula general I:
O
" 1 2
HO— C -A r— N = N — Ar
Formula I
en la que Ar1 y Ar2 son moléculas aromáticas, que comprenden opcionalmente un grupo funcional o un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido.
En ciertas realizaciones preferentes, los ácidos carboxílicos diaril-azo de la Fórmula I se acoplan mediante un enlace carboxamida a un aminoácido aromático de unión al surco menor (o péptido) de la Fórmula II para producir compuestos DSQ de la Fórmula III
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Formula III
en las que Ar1 y Ar2 son moléculas aromáticas o heteroaromáticas, que están opcionalmente sustituidas con un grupo funcional o un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido o un enlazador que se conecta a un soporte sólido de síntesis;
Ar3 es un resto aromático o heteroaromático;
R1 es H, alquilo o alquilo unido covalentemente a Ar3;
X es hidroxilo, un grupo saliente, un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido, o un enlazador que se conecta a un soporte sólido de síntesis; y
n es de 0 a 5. Si n es mayor que 1 cada Ar3 puede ser igual o diferente.
La Tabla 1, dada a continuación, muestra ejemplos de grupos HOOC-Ar1 y Ar2 de acuerdo con las realizaciones preferentes divulgadas en el presente documento, en la que los grupos HoOC-Ar1 y Ar2 están sustituidos con sustituyentes preferidos. El enlace ondulado indica el punto de unión con el grupo azo en la Fórmula III.
Tabla 1
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La Tabla 2, dada a continuación muestra ejemplos de aminoácidos aromáticos de unión al surco menor (HOOC-Ar3-NH(R1)) de Fórmula II de acuerdo con las realizaciones preferentes divulgadas en el presente documento, donde los aminoácidos aromáticos de unión al surco menor están sustituidos con sustituyentes preferidos. El enlace ondulado indica el punto de unión con el grupo azo en la Fórmula II.
Tabla 2
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En realizaciones preferentes, los ácidos diaril-azo caroboxílicos se acoplan a un aminoácido aromático de unión de surco menor que es el ácido 3,6,7,8-tetrahidro-benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (CDPI) dando lugar a derivados DSQ de Fórmula III (a)
en la que Ar1 y Ar2 son moléculas aromáticas o heteroaromáticas, que están opcionalmente sustituidas con un grupo funcional o un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido o un enlazador que se conecta a un soporte sólido de síntesis;
X es hidroxilo, un grupo saliente, un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido, o un enlazador que se conecta a un soporte sólido de síntesis; y
n es de 0 a 5.
En otras realizaciones preferentes de los ácidos carboxílicos diaril-azo, con respecto a la Fórmula III (a), el resto Ar1 es un anillo de indol o de benzotiazol que da lugar a los derivados DSQ de la Fórmula III (b) y de la Fórmula III (c)
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En otras realizaciones preferentes, en las Fórmulas III (b) y III (c), el resto Ar2 es un anillo aromático o heteroaromático con un grupo amino exocíclico, en el que dicho grupo amino exocíclico está opcionalmente sustituido con uno o dos de un alquilo, un enlazador con un grupo funcional o grupo funcional protegido, o un enlazador que conecta con un soporte sólido de síntesis; n está entre 0 y 3; X es -OH, un grupo saliente, un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido, o un enlazador que se conecta a un soporte sólido de síntesis. Otras realizaciones preferentes incluyen los derivados de la Fórmula III representados por la Fórmula III (d) y III (e)
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en las que X es hidroxilo, -OPFP, o un grupo saliente, y n es 0, 1 o 2.
Los compuestos de Fórmula III son particularmente útiles para la preparación de conjugados de oligonucleótidos de Fórmula IV (a) o IV (b)
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en las que ODN es un oligonucleótido; L es un grupo enlazador que tiene de 0 a 100 átomos de cadena principal seleccionados entre C, N, O, S, P y Si y puede ser acíclico, cíclico o aromático o combinaciones de los mismos; R1 es H, alquilo o alquilo conectado covalentemente a Ar3; y R3 es hidroxilo, un grupo enlazador o bloqueador; Ar1 y Ar2 son moléculas aromáticas o heteroaromáticas; y Ar3 es una molécula aromática. Si n es mayor que 1, cada Ar3 puede ser igual o diferente. En realizaciones preferentes, el conjugado de oligonucleótidos puede comprender además un fluoróforo conectado al oligonucleótido, y el fluoróforo puede ser cualquier fluoróforo adecuado, incluyendo FAM, AP525, AP559, AP593 o AP662. El oligonucleótido puede comprender además un aglutinante de surco menor conectado al oligonucleótido. El conjugado de oligonucleótidos también puede incluir una o más nucleobases modificadas o bases modificadas. El enlazador L puede estar conectado al oligonucleótido en su extremo 3' o en su extremo 5', o puede estar conectado al oligonucleótido en una posición distinta al extremo 3' o 5'. En realizaciones preferentes, los conjugados de oligonucleótidos de la Fórmula IV (a) están representados por la Fórmula IV (c):
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en la que n es 1,2 o 3.
En otras realizaciones preferentes, los conjugados de oligonucleótidos de la Fórmula IV (c) están representados por la Fórmula IV (d) o IV (e)
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en las que n es 1, 2 o 3.
Preparación de conjugados de oligonucleótidos
Los conjugados de oligonucleótidos de la divulgación (incluidos los de Fórmula IV (a) y IV (b)) pueden sintetizarse de diversas maneras. Una forma es utilizar los derivados activados de la Fórmula III, en la que X es un grupo saliente. Uno de estos grupos salientes es el grupo pentafluorofeniloxi (-OPFP) ejemplificado en la presente divulgación. Otros ejemplos de grupos salientes adecuados son los grupos N-succinimidiloxi y p-nitrofeniloxi como se pone en la practica porGreg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Elsevier 1996.
Estos derivados pueden hacerse reaccionar convenientemente con oligonucleótidos que lleven grupos amino primarios o secundarios alifáticos para formar enlaces amídicos covalentes entre los oligonucleótidos y los compuestos diaril-azo de la divulgación. La descripción y los ejemplos de procedimientos adecuados para tales reacciones de conjugación pueden encontrarse, por ejemplo, en Kutyavin et al., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2003, 8.4.1-8.4-21 y en Lukhtanov et al., Bioconjugate Chem. 1995, 6, 418-426.
Estos derivados activados también pueden utilizarse para introducir una variedad de grupos funcionales adecuados para otros tipos de reacciones de conjugación, cuyos ejemplos se revisan por Hermanson, en Bioconjugate Techniques, Elsevier, 1996 y Kolb et al., Angewandte Chemie, 2001, 40, (11), 2004-2021.
Un procedimiento genérico para la preparación de derivados de diaril-azo de Fórmula III, en la que X es PFPO, se representa en el esquema de reacción 1 (FIG. 2). El aminoéster (o ácido) aromático de partida g1 se diazotiza utilizando ácido nitroso o nitrosilsulfúrico para dar el diazo intermedio g2, que luego se acopla con un compuesto aromático rico en electrones g3 para dar el éster diaril-azo carboxílico g4 o el ácido g5. Los derivados diarilo-azo obtenidos g4 y g5 son predominantemente isómeros trans en cuanto a la orientación de los grupos arilo alrededor del enlace azo. Otros procedimientos conocidos para la preparación de derivados de diarilo-azo, por ejemplo, revisados en Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 3835-3853 también puede aplicarse para producir los intermedios g5 requeridos. El diaril-ácido g5 se convierte en el éster PFP g6 por reacción con trifluoroacetato de pentafluorofenilo (PFP-TFA). Alternativamente, utilizando reactivos y procedimientos conocidos en la técnica, se puede preparar una variedad de diferentes ésteres activados a partir de los ácidos carboxílicos g5. Los ésteres PFP activados g6 se hacen reaccionar con aminoácidos aromáticos (o péptidos) de unión al surco menor g7 para producir ácidos carboxílicos g8. El aminoácido y el dipéptido ejemplificados en esta memoria son el ácido 3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (c Dp I) y el ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonilo]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (CDPI2), respectivamente. CDPI y CDPI2 son fragmentos del conocido agente de unión a la arboleda menor CDPI3 (Boger et al. J. Org. Chem., 1987, 52, 1521). Otros ejemplos de compuestos g7 adecuados se basan en el N-metilpirrol, el N-metilimidazol, el N-metilhidroxipirrol, los ácidos amino-carboxílicos del tiazol, bloques de construcción de la distamicina y la lexitropsina, conocidos antibióticos de unión al surco menor. El ácido carboxílico g8 se hace reaccionar con PFP-TFA PFP para producir los ésteres activados deseados g9 adecuados para la conjugación con oligonucleótidos modificados con amina para producir conjugados de oligonucleótidos de Fórmula IV (a). Alternativamente, los derivados de ácido g8 no activados pueden conjugarse con oligonucleótidos modificados con aminas en presencia de agentes activadores como la 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Los reactivos para la preparación de oligonucleótidos modificados con aminas, incluidos los soportes sólidos de síntesis de ADN y los fosforamiditos, están disponibles en el mercado.
Los ésteres activados g9 también se utilizan para reaccionar con las moléculas de enlace. Estos enlaces pueden ser mono o polifuncionales y contener varios grupos funcionales como maleimida, biotina, azida, alquino, amina, hidroxilo, hidroxilo protegido por DMT, etc. Un tipo particular de enlazador polifuncional es un 6-aminohexano-1,2-diol y es adecuado para la preparación de soportes sólidos de síntesis como se ilustra en el esquema 1 (FIG. 2). En este enfoque, el enlazador se une al soporte sólido a través de un enlazador de succinato escindible (durante la etapa de escisión y desprotección del oligonucleótido) utilizando el grupo hidroxilo secundario, mientras que los grupos hidroxilo primario y amino están protegidos con los grupos DMT y FMOC, respectivamente. Este soporte se prepara de la manera descrita en la patente US no 6.492.346. El grupo FMOC puede eliminarse selectivamente tratando el soporte sólido de partida con DBU, produciendo un grupo amino libre disponible para la siguiente reacción con los ésteres PFP g9. Los soportes sólidos g10 resultantes son adecuados para la síntesis de oligonucleótidos en línea a partir del grupo hidroxilo primario protegido con DMT. Tras la síntesis y desprotección del oligonucleótido, se obtienen los conjugados de oligonucleótidos de Fórmula IV (a). La conjugación tanto en el extremo 3' como en el extremo 5' puede lograrse dependiendo de si se utilizan fosforamidas de nucleósido 3' o 5' en la síntesis. La FIG. 3A muestra el análisis HPLC y la FIG. 3B muestra los espectros UV de un oligonucleótido sintetizado utilizando un soporte de síntesis del tipo g10. Este ejemplo demuestra que el enfoque general descrito en el esquema 1 proporciona los conjugados de oligonucleótidos deseados en buen rendimiento y los conjugados pueden purificarse fácilmente mediante cromatografía de fase inversa.
Las FIG. 4A - 4D muestran las estructuras y los máximos de absorción de los conjugados de oligonucleótidos T8 sintetizados según el esquema de reacción 1. Las FIG. 4A - 4D muestran la relación entre las estructuras de los DSQ y los máximos de absorción de los conjugados de oligonucleótidos T8 sintetizados según el esquema de reacción 1. En general, los DSQ sustituidos por benzotiazol muestran espectros de absorción más desplazados al rojo que los sustituidos por fenilo o indol. La posición de la banda de absorción está directamente relacionada con la eficiencia del apagado de fluorescencia basado en FRET, como se especifica por Lakowicz, 2007.
Otro ejemplo de un enlazador adecuado para la preparación de los soportes de síntesis de ADN de la divulgación es el hidroxiprolinol, un reactivo trifuncional que tiene un grupo amino, un grupo primario y un grupo secundario hidroxilo. Este enlazador, así como ejemplos de otros reactivos trifuncionales que tienen un grupo amino, primario y un grupo hidroxilo secundario, se describen en la patente US no 5.512.667. El grupo hidroxilo primario en este ejemplo está protegido con un grupo dimetoxitrilo, mientras que los grupos hidroxilo y amino secundarios están disponibles para otras modificaciones.
El soporte de síntesis utilizado en el esquema sintético 1 es un copolímero de estireno-divinilbenceno poroso altamente reticulado y posteriormente aminometilado para permitir la química de superficie (Applied Biosystems, PN 360865C). Otro ejemplo de soporte de síntesis es el vidrio de poros controlados (CPG) (Glen Research, Sterling, VA), que está disponible comercialmente en diferentes tamaños de poros y con extensión de alquilaminas de cadena larga para un acoplamiento de fosforamidas más eficiente.
Los conjugados de oligonucleótidos de Fórmula IV (a) también pueden obtenerse utilizando un soporte de síntesis de poliestireno ID # 480 ejemplificado en el esquema de reacción 3 (FIGS. 7A-7B). Los soportes de síntesis de este tipo pueden prepararse utilizando reactivos de fórmula general III, en los que X es un grupo enlazador con un grupo hidroxilo protegido por DMT y Ar1 o Ar2 contienen un grupo funcional para la unión covalente a un soporte sólido de síntesis mediante un enlazador escindible (durante la desprotección del oligonucleótido).
En el ejemplo particular representado en el esquema de reacción 3, el diaril-azo-tinte 66 se prepara por diazotización del ácido 2-amino-1,3-benzotiazol-6-carboxílico seguido de un acoplamiento con el análogo de anilina N-sustituido 65. El ácido 66 se convierte en el éster PFP activado 67 para la siguiente condensación con el dipéptido CDPI2 dando lugar al intermedio 68. Este intermedio se activa mediante la formación del éster PFP 69 y luego se hace reaccionar con el aminohexanol protegido con O-DMT para obtener el intermedio 70 con dos grupos hidroxilos protegidos ortogonalmente. La protección acetil del intermedio 70 se saponifica selectivamente para dar el intermedio hidroxilo 71. Para introducir el enlazador succinato escindible, el intermedio hidroxilo 71 se hace reaccionar con anhídrido succínico y luego se activa con PFP-TFA. El éster PFP 72 obtenido se hace reaccionar con el soporte aminometilpoliestireno (por ejemplo, el utilizado en el esquema sintético 1) para obtener el soporte de síntesis ID# 480. La HPLC analítica se muestra en la FIG. 8A y los espectros UV-VIS del PDA se muestran en la FIG. 8B para un ejemplo de síntesis de oligonucleótidos utilizando el soporte de síntesis ID# 480. Demuestra que los conjugados de oligonucleótidos modificados con DSQ ID#480 pueden sintetizarse con un rendimiento excelente y purificarse fácilmente mediante cromatografía de fase inversa.
Algunos conjugados de oligonucleótidos de Fórmula IV (b) pueden prepararse utilizando el soporte sólido de síntesis ID # 478 preparado según el esquema de reacción 2 (FIG. 5A-5B). El enfoque representado en este esquema requiere la introducción de un grupo hidroxilo, punto de partida para la síntesis de oligonucleótidos, en la sección diaril-azo de los compuestos de Fórmula I. Esto se consigue en la primera etapa del esquema de reacción utilizando acetato de 6-[metil(fenil)amino]hexilo (documento WO 2008008481), un análogo de la anilina con un enlazador de 6-hidroxihexilo protegido. Esta anilina se acopla con el 2-diazo-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de etilo para producir el colorante diaril-azo 60. A continuación, el biséster 60 se saponifica para dar el ácido hidroxilo 61. A continuación, el grupo hidroxilo se protege con DMT y se activa con PFP-TFA para obtener el éster PFP 62. La condensación del éster con CDPI2 produjo el intermedio 63, que luego se activó con PFP-TFA para obtener el éster PFP 64 deseado, adecuado para la siguiente química de soporte sólido. El soporte inicial de poliestireno N-MMT-5-aminopent ilglycolato (preparado según la patente US no 7.759.126) se desprotegió primero con ácido tricloroacético en diclorometano y luego se hizo reaccionar con el éster PFP 64 para dar el soporte de síntesis de poliestireno ID # 478. En la FIG. se muestra una traza analítica de HPLC C18 de una síntesis de oligonucleótidos T8 utilizando este soporte. 6A, con los espectros PDA UV-VIS del pico principal y la estructura del producto mostrados en la FIG. 6B. Este ejemplo demuestra que los conjugados de oligonucleótidos preparados según el esquema 2 pueden sintetizarse con un rendimiento excelente y purificarse fácilmente mediante cromatografía de fase inversa.
La química de la N,N-diisopropilfosforamidita es otra forma de preparar oligonucleótidos que llevan los compuestos de la divulgación. Un ejemplo de un reactivo de fosforamida adecuado se muestra en el esquema de reacción 4 (FIGS. 9A-9B). En esta aproximación, el intermedio 70 (esquema de reacción 3) se hace reaccionar primero con dietilpirocarbonato para proteger los grupos indol y amida NH dando lugar al intermedio 73. A continuación, se elimina selectivamente el grupo DMT y el alcohol 74 resultante se convierte en la fosforamidita 75 por reacción con 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosfordiamidita. La FIG. 10A muestra una traza analítica de HPLC C18 de una síntesis de oligonucleótidos T8 utilizando este fosforamidito, y la FIG. 10B muestra los espectros PDA UV-VIS del pico principal y de la estructura del producto. Esto demuestra que los conjugados de oligonucleótidos preparados con el fosforamidito 75 pueden sintetizarse en un rendimiento justo y purificarse por cromatografía de fase inversa. Se puede mejorar aún más la pureza en la eficiencia del enfoque de fosforamidita mediante el uso de aminohexanol N-sustituido en el esquema 3 (por ejemplo, N-metil-6-aminohexanol como se describe en la patente US no 9.056.887) eliminando la formación del producto secundario imidazolidina-2,4-diona mostrado en el esquema 4 (FIGS. 9A-9B).
Las FIG. 11A - 11C muestran los espectros de absorción UV-VIS de los conjugados T8-DSQ. Las bandas de absorción de estos compuestos ejemplares cubren el rango de longitudes de onda entre 400 y 700 nm, lo que es adecuado para el apagado FRET eficiente de fluoróforos comunes para aplicaciones de PCR en tiempo real.
Aplicaciones de los conjugados de oligonucleótidos
Los conjugados de oligonucleótidos de Fórmula IV (a) y (b) son útiles para diversas aplicaciones, como se describe a continuación. Las realizaciones preferentes incluyen un procedimiento para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, que comprende la puesta en contacto de la muestra con realizaciones de los conjugados de oligonucleótidos descritos en el presente documento, en el que el conjugado de oligonucleótidos tiene una secuencia de ácido nucleico al menos parcialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, y en el que el conjugado de oligonucleótidos comprende además un fluoróforo, y la detección de una señal fluorescente del conjugado de oligonucleótidos tras la hibridación con la secuencia de ácido nucleico diana. Otras realizaciones preferentes también incluyen la etapa de amplificar la secuencia de ácido nucleico diana. En algunas realizaciones preferentes, el conjugado de oligonucleótidos es un cebador o una sonda.
En una realización de la Fórmula IV, los conjugados DSQ comprenden un 3'-DSQ y un 5'-fluoróforo para producir oligonucleótidos de Fórmula V general:
5'-FI-ODN-DSQ Fórmula V
en la que Fl es un fluoróforo y ODN-DSQ es un conjugado de oligonucleótidos de Fórmula IV (a) o (b).
Los conjugados de Fórmula V son particularmente útiles como sondas de ADN para aplicaciones de PCR en tiempo real y de punto final basadas en la fluorescencia que dependen de la actividad 5'-exonucleasa dependiente de la hibridación de la ADN polimerasa para la escisión del fluoróforo, también conocida como la tecnología TaqMan. En la FIG. se muestran ejemplos de aplicaciones de PCR TaqMan que utilizan conjugados de Fórmula V. 16.
En otras realizaciones preferentes, con referencia a la Fórmula IV, los conjugados de oligonucleótidos comprenden un DSQ 5' y un fluoróforo 3' como se representa en la Fórmula VI:
5'-DSQ-ODN-FI Fórmula VI
en la que Fl es un fluoróforo y DSQ-ODN es un conjugado de oligonucleótidos de Fórmula IV (a) o (b).
Los conjugados de oligonucleótidos de Fórmula VI son útiles como sondas de ADN para sondas fluorogénicas cuya señal de fluorescencia se genera debido a la hibridación con una diana. El resto 5' DSQ impide la degradación de la sonda exonucleasa 5'. Un tipo particular de estas sondas fluorogénicas es la tecnología Molecular Beacon, que se basa en la estructura stem-loop para mejorar la relación señal-fondo y la discriminación de los desajustes.
En otras realizaciones preferentes, con referencia a la Fórmula IV, los conjugados de oligonucleótidos comprenden un 5'-DSQ y un 5'-fluoróforo colocados adyacentes entre sí como se representa en la Fórmula VII:
5'-DSQ-FI-ODN Fórmula VIITales oligonucleótidos son útiles como sondas y cebadores fuorogénicos activados por hibridación, como se ilustra en las FIGS. 14A - 14B y Tabla 14.
En otras realizaciones preferentes, los oligonucleótidos de la Fórmula IV pueden utilizarse en PCR digital y arrays ( Pat US nos 9,328,384 y 7,759,126.
Aunque no se ilustra en las Fórmulas V-VII, en algunas realizaciones preferentes el resto DSQ está unido covalentemente a una posición interna de un oligonucleótido, por ejemplo a una nucleobase de cola amina.
En otras realizaciones preferentes, los oligonucleótidos DSQ se utilizan para diferenciar polimorfismos de un solo nucleótido como se enseña en las Pat nos 6,312,894 y, 7,718,374. En una realización relacionada, se detectan diferentes dianas utilizando el análisis de la curva de fusión como se enseña por Hymas y Hillyard, 2009.
Otras aplicaciones, no descritas específicamente en la presente memoria pero conocidas en la técnica (por ejemplo Didenko, Biotechniques 2001, 31(5): 1106-1121, Kim, Y. et al., Int. J. Clin. Exp. Pathol. (2008) 1, 105-116y Patente US no 7.790.385), son también aplicaciones potenciales de los nuevos derivados y oligonucleótidos de la divulgación.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran el rendimiento funcional de los oligonucleótidos marcados con realizaciones preferentes de los derivados DSQ y no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones.
Ejemplo 1. Preparación de productos intermedios DSQ y ésteres PFP
5-{(E)-[4-(dimetilamino)fenil]diazenil}-1H-indol-2-carboxilato de etilo (1)
Figure imgf000017_0001
A una suspensión de 5-aminoindol-2-carboxilato de etilo (3,0 g, 14,7 mmol) en 80 mL de agua se añadieron 2,5 mL de HCl conc. La suspensión agitada se enfrió en un baño de hielo/agua a 0-4°C y se trató con una solución de NaNO2 (1,1 g, 15,9 mmol) en 20 mL de agua mediante un embudo de adición durante 5 min. La reacción se agitó a 0-4°C durante 20 min y luego se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante otros 10 min para dar una solución oscura y mayormente clara. Se añadió N,N-Dimetilanilina (2,5 mL, 19,7 mmol) en una porción y se continuó agitando durante 1 h. El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se resuspendió en 50 mL de MeOH. La suspensión se calentó a reflujo, se enfrió y se filtró para recoger el sólido precipitado. Secando al vacío se obtuvieron 2,9 g (59% de rendimiento) del colorante deseado 1 como un sólido marrón-anaranjado. 1H NMR (DMSO-d6) 812,17 (s, 1H), 8,14 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,83 (dd, J-,=9 Hz, J2=2,1 Hz, 1H), 7,79 (d, J=9 Hz, 2H), 7,53 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,31 (d, J=0,9 Hz, 1H), 6,84 (d, J=8,7 Hz, 2H), 4,37 (q, J=7,2 Hz, 2H), 3,05 (s, 6H), 1,36 (t, J=7,2 Hz, 3H).
Acido 5-{fE)-[4-(dimetMammo)feml]diazeml}-1H-mdol-2-carboxílico (2)
Figure imgf000018_0001
Una suspensión de 1 (2,9 g, 8,6 mmol) en una mezcla de THF (60 mL), MeOH (40 mL) y NaOH 1N (20 mL) se calentó a 50°C con agitación durante 2,5 h para dar una solución clara de color marrón rojizo. La reacción se enfrió, se neutralizó con 20 mL de HCl 1N y se concentró hasta unos 40 mL. El sólido negro precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 2,6 g (98% de rendimiento) de ácido 2 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 8 12,06 (s, 1H), 8,13 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,83 (dd, Ji=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,78 (d, J=9 Hz, 2H), 7,52 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,26 (d, J=1,5 Hz, 1H), 6,84 (d, J=8,7 Hz, 2H), 3,05 (s, 6H).
5-{fE)-[4-(dimetilammo)feml]diazeml}-1H-mdol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (3)
Figure imgf000018_0002
A una suspensión de 2 (2,6 g, 8,4 mmol) en 30 mL de CH2Ch anhidro se añadió trietilamina (4,2 mL) seguida de trifluoroacetato de pentafluorofenilo (PFP-TFA) en varias porciones hasta que no se observó más ácido de partida 2 por TLC o HPLC. Se añadió un total de 3,5 mL (20,25 mmol) de PFP TFA durante 16 h. La reacción completada se concentró y el residuo obtenido se resuspendió en MeOH frío (50 mL). El material insoluble se recogió por filtración, se lavó con MeOH (2x10 mL) y se secó para obtener 2,7 g (68% de rendimiento) de 3 como un sólido marrónanaranjado. 1H NMR (DMSO-d6) 812,72 (s, 1H), 8,22 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,93 (dd, J-,=8,7 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,80 (d, J=9 Hz, 2H), 7,73 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,61 (d, J=9 Hz, 1H), 6,84 (d, J=9 Hz, 2H), s (3,05, 6H).
Acido 3,6,7,8-Tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(E)-[4-(dimetMammo)feml]d/3zen/7J-íH-/ndo/-2-/7)carbonil] venzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilico (4)
Figure imgf000018_0003
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (documento WO 2004043350) (2,5 mmol) en 10 mL de dimetilformamida (DMF) anhidra se añadió trietilamina (1,5 mL) seguida de 1,2 g (2,5 mmol) de éster 3 de PFP. La reacción se agitó brevemente para dar inicialmente una solución clara, pero la precipitación del producto comenzó en pocos minutos. La reacción se agitó durante 20 h y luego el material precipitado se recogió por filtración, se lavó con una pequeña cantidad de DMF (2 mL), MeOH (10 mL) y éter. Al secar al vacío se obtuvieron 1,6 g (94% de rendimiento) del ácido del título 4 (sal parcial de trietilamonio) como un sólido de color marrón anaranjado. 1H NMR (DMSO-d6) 812,00 (s, 1H), 11,78 (s, 1H), 11,02 (s, 1H), 8,26 (m, 2H), 8,16 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,81 (dd, J-,=8,7 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,80 (d, J=9 Hz, 2H), 7,58 (d, 9 Hz, 1H), 7,39 (d, 9 Hz, 1H), 7,32 (m, 2H), 7,12 (d, J=1,5 Hz, 1H), 6,93 (d, J=1,8 Hz, 1H) 6,85 (d, J=9 Hz, 2H), 4,68 (m, 4H), 3,4 (m, 6H), 3,06 (s, 6H), 2,76 (m, 4H), 1,06 (t, J=7,2 Hz, 6H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(EH4-(dimetilammo)feml]diazeml}-1H-mdol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (5)
Figure imgf000019_0001
A una suspensión de 5 (1,5 g, 2,2 mmol) en 10 mL de DMF anhidra se añadieron 1,2 ml de trietilamina seguidos de varias porciones de PFP-TFA en el transcurso de 24 h hasta que no se encontró más 5 de partida por análisis de HPLC. Se utilizó un total de 0,9 mL (5,2 mmol) de PFP-TFA. Se añadió MeOH (20 mL) para iniciar la precipitación del producto. El sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con metanol (2*10 mL) y éter. Al secar al vacío se obtuvieron 1,73 g (93% de rendimiento) del éster 5 de PFP como sólido marrón. El análisis de RMN indicó una protección parcial (40%) por TFA de los grupos NH del indol. 1H NMR (DMSO-d6) 812,64 (s, 0,4H), 12,55 (s, 0,6H), 12,07 (s, 0,4H), 12,00 (s, 0,6H), 11,81 (s, 0,6H), 8,44 (m, 1H), 8,29 (m, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,8 (m, 3H), 7,7-7,1 (m, 6H), 6,85 (d, J=9 Hz, 2H), 4,72 (m, 4H), 3,5 (m, 4H), 3,06 (s, 6H).
-{fE)-[2,5-dimetoxi-4-(pirrolidm-1-N)feml]diazeml}-1H-mdol-2-carboxNato de etilo (6)
Figure imgf000019_0002
A una suspensión de 5-aminoindol-2-carboxilato de etilo (3,0 g, 14,7 mmol) en 80 mL de agua se añadieron 2,5 mL de HCl conc. La suspensión agitada se enfrió en un baño de hielo/agua a 0-4°C y se trató con una solución de NaNO2 (1,1 g, 15,9 mmol) en 20 mL de agua a través de un embudo de adición durante 5 min. La reacción se agitó a 0-4°C durante 20 minutos y luego se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante otros 10 minutos para dar una solución oscura y mayormente clara. 1-(2,5-dimetoxifenil)pirrolidina (M. Sarma et al. J. Org. Chem. 2012, 77(1), 432-444) (4,08 g, 19,7 mmol) se añadió en una porción y se continuó agitando durante 10 min antes de añadir acetato de sodio sólido trihidratado (5,3 g). La suspensión marrón resultante se agitó durante 2 h. El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua, MeOH y se secó al vacío para obtener 5,3 g (85% de rendimiento) del colorante deseado 6 como un sólido marrón-anaranjado. 1H NMR (DMsO-d6) 812,11 (s, 1H), 8,08 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,78 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,50 (d, J=9 Hz, 2H), 7,33 (s, 1H), 7.29 (d, J=1,2 Hz, 1H), 6,30 (s, 1H), 4,37 (q, J=7,2 Hz, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,51 (m, 4H), 1,90 (m, 4H), 1,36 (t, J=7,2 Hz, 3H).
Acido 5-{(E)-[2,5-Dimetoxi-4-(pirrolidm-1-il)feml]diazeml}-1H-mdol-2-carboxflico (7)
Figure imgf000020_0001
A una solución de 6 (5,0 g, 11,8 mmol) en 90 mL de THF se añadieron 60 mL de MeOH y 30 mL de NaOH 1N. La suspensión inicial se agitó a 50°C durante 1,5 h para obtener una solución oscura. La reacción se enfrió, se neutralizó con HCI 1N (30 mL) y se concentró hasta unos 60 mL. El sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para dar 4,5 g (97% de rendimiento) de ácido 7 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 813,06 (br s, 1H), 12,01 (s, 1H), 8,06 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,76 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,2 Hz, 1H), 7,49 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,35 (s, 1H), 7,23 (s, 1H), 6,29 (s, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,54 (br s, 4H), 1,89 (br s, 4H).
5-{fE)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}-1H-mdol-2-carbox¡lato de pentafluorofenilo (8)
Figure imgf000020_0002
Una solución de 7 (1,18 g, 3,0 mmol) y trietilamina (2,2 mL) en 20 mL de CH2Ch anhidro se añadió PFP-TFA en varias porciones en el transcurso de 2 días hasta una cantidad total de 1,76 mL (10,1 mmol). La reacción (suspensión del producto parcialmente precipitado) se concentró y se resuspendió en 20 mL de MeOH. El material insoluble se recogió por filtración, se lavó con MeOH y se secó al vacío para obtener 1,33 g (79% de rendimiento) de éster PFP 8 como sólido naranja. 1H NMR (DMSO-d6) 8 12,67 (s, 1H), 8,16 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,89 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,73 (d, J=1,2 Hz, 1H), 7,58 (d, J=9 Hz, 2H), 7,35 (s, 1H), 6,30 (s, 1H), 3,95 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,52 (m, 4H), 1,90 (m, 4H).
Ac¡do 3,6,7,8-Tetrah¡dro-6-[[3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[(5-((E)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rroMdm-1-¡l)feml]d/azen//J-íH-/ncfo/-2-//)carboml]benzo[1,2-8:4,3-b']d¡p¡rrol-2-¡l]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']d¡p¡rrol-2-carboxíl¡co (9)
Figure imgf000020_0003
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonilo]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0,8 mmol) en 4 mL de DMF anhidra se añadió trietilamina (0,5 mL) seguida de 0,45 g (0,8 mmol) de éster PFP 8. La suspensión inicial se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se calentó brevemente a unos 45°C para dar una solución roja y clara. La precipitación del producto comenzó poco después. La reacción se dejó transcurrir durante 20 h. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con DMF (2x2 ml), acetona (2x10 mL) y se secó al vacío para dar 0,56 g (96% de rendimiento) de ácido 9 (sal de trietilamonio parcial) como sólido marrón. 1H NMR (DMSO-d6) 511,95 (s, 1H), 11,77 (s, 1H), 11,61 (s, 1H), 8,26 (m, 2H), 8,11 (d, J=1,2 Hz, 1H), 7,76 (dd, J1=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,55 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,38 (d, 9 Hz, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,32 (m, 2H), 7,12 (d, J=1,5 Hz, 1H), 6,92 (s, 1H) 6,32 (s, 1H), 4,68 (m, 4H), 3,95 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,5-3,3 (m, 8H), 2,67 (q, J=7,2 Hz, 4H), 1,91 (m, 4H), 1,06 (t, J=7,2 Hz, 6H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(E)-[2,5-dimetoxi-4-(pirroNdm-1-N)feml]diazeml}-1H-mdol-2-il)carbonil]benzo[1,2-6:4,3-6']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-6:4,3-6']dipirrol-2-carboxMato de pentafluorofenilo (10)
Figure imgf000021_0001
A una suspensión de 9 (0,47 g, 0,62 mmol) en 6 mL de DMF anhidra se añadieron 0,5 mL de trietilamina y 0,2 mL (1,16 mmol) de PFP-TFA. La reacción se agitó durante 8 h y se trató con otra porción de PFP-TFA (0,05 mL) para completar la formación del éster de PFP. Tras agitarse durante 16 h, el material precipitado se recogió por filtración, se lavó con DMF (2x1 mL), acetona (4x5 mL) y se secó al vacío para dar 0,43 (75% de rendimiento) de éster PFP 10 como sólido naranja. 1H NMR (DMSO-d6) 512,55 (s, 1H), 11,95 (s, 1H), 11,80 (s, 1H), 8,42 (d, J=9 Hz, 1H), 8,29 (d, J=8 Hz, 1H), 8,10 (d, J=1,2 Hz, 1H), 7,76 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 7,60 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7,55 (d, J=9 Hz, 2H), 7,43 (d, 9 Hz, 1H), 7,39 (d, 9 Hz, 1H), 7,35 (s, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,16 (s, 1H) 6,32 (s, 1H), 4,71 (m, 4H), 3,95 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,5 (m, 8H), 1,91 (m, 4H).
2-{fE)-[4-(dimetilammo)feml]diazeml}-1,3-benzotiazol-6-carboxMato de etilo (11)
Figure imgf000021_0002
El 2-amino-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de etilo (4,44 g, 20 mmol) se resuspendió en 100 mL de una mezcla 1:1 de ácidos acético y propiónico. La solución parcial se enfrió a 0-4°C y se trató con 6,7 mL de ácido nitrosilsulfúrico al 40% manteniendo la temperatura por debajo de 10°C. La reacción se agitó durante 5 h y luego se dejó calentar brevemente a temperatura ambiente antes de volver a enfriar a 0-4°C. La solución obtenida de la sal de diazonio se añadió mediante un embudo de adición a una mezcla agitada en frío (baño de hielo/agua) preparada combinando una solución de N,N-dimetilanilina (3 mL) en 25 mL de MeOH y una solución de 0,6 g de ácido sulfámico en 200 mL de agua. La agitación continuó durante 3 h antes de neutralizar la reacción añadiendo aproximadamente 200 mL de trimetilamina acuosa al 40% hasta alcanzar un pH de 6-7. El sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se resuspendió en MeOH caliente (50 mL). Después de enfriar el material insoluble se recogió por filtración, se lavó con MeOH (2x10 mL) y se secó al vacío para obtener 4,34 g (61% de rendimiento) de colorante 11 como un sólido de color púrpura oscuro. 1H NMR (CDCh) 58,55 (d, J=1,5 Hz, 1H), 8,14 (dd inactivado, J-i=8,4 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 8,07 (d inactivado, J=8,4 Hz, 1H), 8,02 (d, J=9,6 Hz, 2H), 6,78 (d, J=9,6 Hz, 2H), 4,44 (q, J=7,2 Hz, 2H), 3,19 (s, 6H), 1,43 (t, J=7,2 Hz, 3H).
Acido 2-{fE)-[4-(dimetilammo)feml]diazeml}-1,3-benzotiazol-6-carboxíNco (12)
Figure imgf000022_0001
A una solución de 11 (0,18 g, 0,51 mmol) en 9 mL de THF se añadió MeOH (6 mL) seguido de 3 mL de NaOH 1N. La mezcla se agitó a 50°C durante 70 min, se enfrió, se neutralizó con HCI 1N (3 mL) y se concentró hasta unos 5 mL. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 0,143 g (86% de rendimiento) del ácido 12 deseado como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 813,10 (br s, 1H), 8,60 (s, 1H), 8,02 (s, 2H), 7,87 (d, J=9 Hz, 2H), 6,93 (d, J=9 Hz, 2H), 3,18 (s, 6H).
2-{('£')-[4-(d¡metilammo)feml]d¡azeml}-1,3-benzot¡azol-6-carboxMato de pentafluorofenilo (13)
Figure imgf000022_0002
A una solución de 12 (0,14 g, 0,42 mmol) y trietilamina (0,4 mL) en 2 mL de DMF anhidra se añadieron 0,2 mL (1,16 mmol) de PFP-TFA. Después de agitar durante 30 minutos, la reacción se concentró y se diluyó con acetona (4 mL). El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con acetona (2 mL), 20% de acetato de etilo/hexano (5 mL) y se secó al vacío para dar 0,158 g (76% de rendimiento) de éster 13 de PFP como sólido marrón oscuro. 1H NMR (CDCla) 88,72 (d, J=1,5 Hz, 1H), 8,26 (dd inactivado, J-,=8,4 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 8,16 (d inactivado, J=8,4 Hz, 1H), 8,03 (d, J=9,3 Hz, 2H), 6,79 (d, J=9,6 Hz, 2H), 3,21 (s, 6H).
Acido 3,6,7,8-Tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(2-{(E)-[4-(dimethNammo)feml]diazeml}-1,3-benzotiazol-6-M)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b,]dipirrol-2-il]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b,]dipirrol-2-carboxiNco (14)
Figure imgf000022_0003
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0.33 mmol) en 5 mL de DMF anhidra se añadió trietilamina (0,2 mL) seguida de 0,156 g (0,32 mmol) de éster PFP 13. La reacción se agitó a 50°C durante 5 h y luego se enfrió a temperatura ambiente. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con DMF (2x1 ml), acetona (2x5 mL) y se secó al vacío para dar 0,167 g (75 % de rendimiento) de ácido 14 (sal de trietilamonio parcial) como sólido marrón. 1H NMR (DMSO-d6) 8 11,75 (s, 1H), 11,66 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,1-8,3 (m, 2H), 8,05 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,88 (d, J=9,6 Hz, 2H), 7,72 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,35 (br s, 1H), 7,29 (d, J=9 Hz, 1H), 7,07 (s, 1H), 6,94 (d, J=9 Hz, 2H), 6,93 (s, 1H), 4,62 (t, J=8,7 Hz, 2H), 4,20 (t, J=8,4 Hz, 2H), 3,3 (m, 8H), 3,18 (s, 6H), 2,68 (m, 3H), 1,02 (t, J=7 Hz, 4H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(2-{(E)-[4-(dimetilammo)feml]diazeml}-1,3-benzotiazol-6-i^carbom^benzo^^-b^^-b^dipirrol^-i^carbom^benzo^^-b^^-b^dipirrol^-carboxilato de pentafluorofenilo (15)
Figure imgf000023_0001
A una suspensión de 14 (0,163 g, 0,23 mmol) en 2 mL de DMF anhidra se añadieron 0,1 mL de trietilamina y 0,1 mL (0,58 mmol) de PFP-TFA. Tras agitar durante 16 h, la reacción se concentró y el material resultante se resuspendió en acetona (2-3 mL). La filtración, el lavado con acetona y el secado al vacío permitieron obtener 0,175 g (88% de rendimiento) de éster PFP 15 como sólido marrón. El análisis de RMN indicó una protección parcial (25%) por TFA de los grupos NH del indol.1H NMR (DMSO-d6) 8 12,62 (s, 0,25H), 12,52 (s, 0,75H), 11,78 (s, 0,75H), 8,5-8,1 (m, 3H), 8,06 (d, J=8,7 Hz, 0,25H), 8,05 (d, J=8,7 Hz, 0,75H), 7,87 (d, J=9 Hz, 2H), 7,73 (m, 1H), 7,61 (d, J=1,2 Hz, 0,25H), 7,57 (d, J=1,5 Hz, 0,75H), 7,5-7,3 (m, 2H), 7,09 (s, 1H), 6,94 (d, J=9 Hz, 2H), 4,66 (m, 2H), 4,20 (m, 2H), 3,46 (m, 2H), 3,29 (m, 2H), 3,17 (s, 6H).
2-{fE)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}-1,3-benzot¡azol-6-carbox¡lato de etilo (16)
Figure imgf000023_0002
A una suspensión de 2-amino-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de etilo (0,64 g, 2,86 mmol) en ácido acético (8 mL) se añadió 1 mL de ácido nitrosilsulfúrico al 40% con agitación durante 1 min para dar una solución parcial de color amarillo claro. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de utilizarla en la siguente etapa. Una solución de 1-(2,5-dimetoxifenil)pirrolidina (0,88 g, 4,2 mmol) en 20 mL de THF se combinó con una solución de acetato de sodio trihidratado (2,4 g) en 12 mL de agua para dar una mezcla bifásica. La mezcla se enfrió a 0-4°C y se trató con la solución de sal de diazonio de la etapa 1. La suspensión azul resultante se agitó durante 1 h y luego se vertió en NaHCO3 saturado. El colorante crudo se extrajo con acetato de etilo y se purificó sobre sílice eluyendo con un gradiente de acetato de etilo en hexano. La concentración de las fracciones del producto puro permitió obtener 0,17 g (13% de rendimiento) del colorante 16 como un sólido púrpura oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 8 8,54 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,99 (dd inactivado, J-,=8,7 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,89 (d inactivado, J=8,4 Hz, 1H), 7,31 (s, 1H), 6,20 (s, 1H), 4,35 (q, J=7,2 Hz, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,81 (s, 3H), 3,79 (m, 4H), 1,95 (m, 4H), 1,36 (t, J=7,2 Hz, 3H).
Ac¡do 2-{(E)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}-1,3-benzot¡azol-6-carboxíl¡co (17)
Figure imgf000023_0003
A una solución de 11 (0,17 g, 0,39 mmol) en 9 mL de THF se añadió MeOH (6 mL) seguido de 3 mL de NaOH 1N. La mezcla se agitó a 50°C durante 70 min, se enfrió, se neutralizó con HCl 1N (3 mL) y se concentró hasta unos 5 mL. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 0,16 g (99% de rendimiento) del ácido 17 deseado como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 8 8,51 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,98 (dd inactivado, Ji=8,4 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 7,82 (d inactivado, J=8.4 Hz, 1H), 7,28 (s, 1H), 6,21 (s, 1H), 4,01 (s, 3H), 3,85 (m, 4H), 3,83 (s, 3H), 1,96 (m, 4H).
2-{fE)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}-1,3-benzot¡azol-6-carbox¡lato de pentafluorofenilo (18)
Figure imgf000024_0001
Una solución de 17 (0,16 g, 0,39 mmol) y trietilamina (0,4 mL) en 2 mL de DMF anhidra se trató con varias porciones (0,05 mL cada una) de PFP-TFA hasta que no se encontró más 17 de partida por análisis de HPLC. Se utilizó un total de 0,35 mL (2 mmol) de PFP-TFA. La reacción se concentró y se cromatografió sobre sílice eluyendo con un gradiente de acetato de etilo (50-100%) en hexano. La concentración de las fracciones del producto puro permitió obtener 0,14 g (62% de rendimiento) del éster PFP 18 como sólido negro. 1H NMR (CDCh) 88,51 (m, J=0,9 Hz, 1H), 8,21 (d de m, J-,=8,4 Hz, J2=0,9 Hz, 1H), 8,03 (d de m, J=8.4 Hz, 1H), 7,55 (s, 1H), 6,01 (s, 1H), 4,05 (s, 3H), 3,82 (s, 3H), 3,77 (m, 4H), 2,01 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[[3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[(2-{(E)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}-1,3-benzot¡azol-6-¡l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']d¡p¡rrol-2-¡l]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dip¡rrol-2-carboxíl¡co (19)
Figure imgf000024_0002
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0,245 mmol) en 5 mL de DMF anhidra se añadió trietilamina (0,2 mL) seguida de 0,14 g (0,24 mmol) de éster PFP 18. La reacción se agitó a 50°C durante 3 h y luego se enfrió a temperatura ambiente. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con acetona (3x5 mL) y se secó al vacío para dar 0,117 g (62 % de rendimiento) de ácido 19 (sal de trietilamonio parcial) como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 8 11,78 (s, 1H), 11,71 (s, 1H), 8,4-8,0 (m, 3H), 7,93 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,68 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,4-7,2 (m, 2H), 7,10 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 6.21 (s, 1H), 4,66 (t, J=8,1 Hz, 2H), 4,23 (t, J=8,1 Hz, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,82 (s, (3H), 3,78 (m, 4H), 3,45 (m, 2H), 2,71 (m, 2H), 1,96 (m, 4H), 1,04 (t, J=8,4 Hz, 3H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(2-{(E)-[ 2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrolidm-1-¡l)feml]d¡azeml}-1,3-benzot¡azol-6-il)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b,]dipirrol-2-il]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b,]dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (20)
Figure imgf000025_0001
A una suspensión de 19 (0,117 g, 0,15 mmol) en 2 mL de DMF anhidra se añadió trietilamina (0,1 mL) seguida de PFP-TFA (0,1 mL, 0,58 mmol). La reacción se agitó durante 1 h y luego se concentró. El material resultante se resuspendió en acetona (3 mL) y se filtró. El sólido recogido se lavó con acetona y se secó al vacío para obtener 0,125 g (88% de rendimiento) del compuesto 20 como un sólido púrpura oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 8 12,57 (s, 1H), 11,82 (s, 1H), 8,44 (d, J=7,8 Hz, 1H), 8,4-8,0 (m, 2H), 7,92 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,8-7,6 (m, 3H), 7,5-7,2 (m, 3H), 7.12 (s, 1H), 6,19 (s, 1H), 4,70 (t, J=8,1 Hz, 2H), 4,23 (t, J=8,1 Hz, 2H), 4,00 (s, 3H), 3,82 (s, (3H), 3,78 (m, 4H), 3,5­ 3,3 (m, 4H), 1,96 (m, 4H).
3-cloro-4-{(E)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}benzoato de metilo (21)
Figure imgf000025_0002
A una suspensión de 4-amino-3-clorobenzoato de metilo (1,1 g, 5,9 mmol) en 32 mL de agua se añadió 1 mL de HCl conc. La suspensión agitada se enfrió en un baño de hielo/agua a 0-4°C y se trató con una solución de NaNO2 (0,44 g, 6,3 mmol) en 8 mL de agua a través de un embudo de adición durante 5 min. La reacción se agitó a 0-4°C durante 30 minutos y luego se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante otros 10 minutos para dar una solución casi completa. se añadió 1-(2,5-dimetoxifenil)pirrolidina (1,9 g, 9,1 mmol) en una porción y se continuó agitando durante 10 min antes de añadir acetato de sodio sólido trihidratado (5,0 g). La reacción se dejó calentar a temperatura ambiente, se agitó durante 3 h y luego se neutralizó cuidadosamente con NaHCO3 saturado. El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó al vacío. El producto crudo se cristalizó a partir de MeOH caliente para obtener 1,8 g (67% de rendimiento) de colorante 21 como un sólido cristalino negro. 1H NMR (CDCla) 88,14 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,92 (dd, J-f 8,7 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,71 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7.50 (s, 1H), 6,14 (s, 1H), 4,01 (s, 3H), 3,93 (s, 3H), 3,82 (s, 3H), 3,63 (m, 4H), 1,98 (m, 4H).
Ac¡do 3-cloro-4-{(E)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}benzo¡co (22)
Figure imgf000025_0003
Una solución de 21 (1,6 g, 3,96 mmol) en una mezcla de THF (90 mL) y MeOH (60 mL) se trató con NaOH 1N (30 mL). La reacción se calentó a 50°C con agitación durante 2,5 h para dar una solución roja clara. La reacción se enfrió, se neutralizó con 30 mL de HCI 1N y se concentró hasta unos 60 mL. El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó al vacío para obtener 1,7 g (98% de rendimiento) de ácido 22 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,15 (br s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,93 (d, J=7,5 Hz, 1H), 7,65 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 6,22 (s, 1H), 3,97 (s, 3H), 3,77 (s, 3H), 3,68 (m, 4H), 1,93 (m, 4H).
3-cloro-4-{fE)-[2,5-d¡metox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml}benzoato de pentafluorofenilo (23)
Figure imgf000026_0001
El ácido 22 (1,7 g, 4,3 mmol) se secó por coevaporación con 25 mL de DMF anhidra y 1 mL de trietilamina. El material seco se redisolvió en otra porción (25 mL) de DMF con 1 mL de trietilamina y se trató con 0,75 mL (4,3 mmol) de PFP-TFA. La reacción se agitó durante 60 minutos para dar una suspensión espesa debido a la precipitación del producto. El DMF se eliminó al vacío y el sólido resultante se resuspendió en agua. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con MeOH y se secó al vacío sobre P2O5. El éster PFP 23 crudo se recristalizó a partir de acetato de etilo para obtener 1,94 g (81% de rendimiento) de éster PFP 23 como sólido cristalino negro. 1H NMR (CDCla) 88,29 (d, J=1,8 Hz, 1H), 8,06 (dd, J-f 8,7 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,82 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,52 (s, 1H), 6,11 (s, 1H), 4,02 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 3,67 (m, 4H), 1,99 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-Tetrah¡dro-6-[[3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[3-chloro-4-{(E)-[2,5-dimetox¡-4-(p¡rrol¡dm-1-¡l)feml]d¡azeml} benzo il]benzo[1,2-6:4,3-6']dip¡rrol-2-il]carboml]benzo[1,2-6:4,3-6']d¡p¡rrol-2-carboxil¡co (24)
Figure imgf000026_0002
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0.8 mmol) en 4 mL de DMF anhidra se añadió trietilamina (0,5 mL) seguida de 0,44 g (0,8 mmol) de éster PFP 23. La reacción se agitó a 50°C durante 5 h y luego se enfrió a temperatura ambiente. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con DMF (3x2 ml), acetona (2x5 mL) y se secó al vacío para dar 0,46 g (75% de rendimiento) de ácido 24 (sal de trietilamonio parcial) como sólido marrón. 1H NMR (DMSO-d6) 8 11,79 (s, 1H), 11,69 (s, 1H), 8,3-8,1 (m, 2H), 7,84 (s, 1H), 7,66 (br s aparente, 2H), 7,4-7,2 (m, 3H), 7,10 (s, 1H), 6,97 (s, 1H), 6,27 (s, 1H), 4,65 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,22 (t, J=7,8 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,62 (m, 4H), 3,5-3,3 (m, 4H), 2,73 (m, 3H), 1,93 (m, 4H), 1,05 (t, J=7,2 Hz, 4H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[3-chloro-4-{(E)-[2,5-dimetoxi-4-(pirroMdm-1 -il)fenil]d¡azen¡l}benzo il]benzo[1,2-6:4,3-6']dipirrol-2-il]carboml]benzo[1,2-6:4,3-6']dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (25) A una suspensión de 24 (0,46 g, 0,61 mmol) en 6 mL de DMF anhidra se añadieron 0,3 ml de trietilamina seguidos de varias porciones de PFP-TFA en el transcurso de 24 h hasta que no se encontró más 24 de partida por análisis de HPLC. Se utilizó un total de 0,36 mL (2,1 mmol) de PFP-TFA. La reacción se concentró y el residuo se resuspendió en acetona. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con acetona y se secó al vacío para dar 0,44 g (78% de rendimiento) de éster PFP 25 como sólido marrón oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,56 (s, 1h ), 11,82 (s, 1H), 8,44 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,3-8,1 (m, 2H), 7,84 (s, 1H), 7,66 (aparente br s, 2H), 7,6 (s, 1H), 7,4 (m, 3H), 7,12 (s, 1H), 6,22 (s, 1H), 4,69 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,22 (t, J=7,8 Hz, 2H), 3,97 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,63 (m, 4H), 3,6-3,3 (m, 4H), 1,93 (m, 4H), 3,49 (t, 2H), 3,30 (m, 2H), 1,93 (m, 4H).
Acido 4-[fE)-(4-Ammo-2,5-dimetoxifeml)diazeml]benzoico (26)
Figure imgf000027_0001
Se añadió una solución de NaNO2 (2,5 g, 36,5 mmol) en 25 mL de agua a través de un embudo de adición en el transcurso de 40 min a una solución fría (0-4°C) agitada de ácido 4-aminobenzoico en una mezcla de agua (200 mL) y HCI conc. (6,2 mL). La solución amarilla clara resultante se agitó a 0-4°C durante 30 minutos antes de utilizarla en la siguente etapa. La 2,5-dimetoxianilina sólida (5,59 g, 36,5 mmol) se añadió en una porción a la solución agitada de la sal de diazonio de la etapa 1. La reacción se agitó a 0-4°C durante 1,5 h y luego a temperatura ambiente durante 1 h para dar una suspensión debido a la precipitación del producto. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó. El colorante crudo se cromatografió sobre sílice eluyendo con un gradiente de MeOH en CH2Cl2 (0-20%). Las fracciones de colorante puro se concentraron para obtener 3,7 g (33%) del compuesto 26 como un sólido rojo oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,9 (br s, 1H), 8,01 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,72 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,25 (s, 1H), 6,41 (s, 1H), 6,24 (s, 2H), 3,83 (s, 3H), 3,76 (s, 3H),
Acido 4-[fE)-(2,5-Dimetoxi-4-{fE)-[4-(dimetilammo)feml]diazeml}feml]benzoico (27)
Figure imgf000027_0002
Se añadió una solución de NaNO2 (0,85 g, 12,3 mmol) en 8 mL de agua a través de un embudo de adición en el transcurso de 5 min a una suspensión fría (0-4°C) agitada del compuesto 26 (3,7 g, 12,3 mmol) en una mezcla de agua (67 mL) y HCI conc. (2,0 mL). La reacción se agitó a 0-4°C durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante 2 h antes de utilizarla en la siguente etapa. Se añadió una solución de N,N-dimetilanilina (2,4 mL) en 10 mL de MeOH en una porción a la sal de diazonio de la etapa 1, seguida de 5,0 g de acetato de sodio trihidratado. La suspensión oscura resultante se agitó a temperatura ambiente durante 16 h y luego se filtró para recoger el sólido precipitado. El colorante crudo se purificó por trituración en MeOH caliente (20 mL) seguido de enfriamiento y filtración para obtener 2,2 g (41%) de colorante 27 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 813,17 (br s, 1H), 8,11 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,93 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,80 (d, J=8.7 Hz, 2H), 7,39 (s, 1H), 7,35 (s, 1H), 6,83 (d, J=9 Hz, 2H), 3,96 (s, 3H), 3,92 (s, 3H), 3,06 (s, 6H).
4-[(E)-(2,5-dimetoxi-4-{(E)-[4-(dimetilammo)feml]diazeml}feml]diazeml]benzoato de pentafluorofenilo (28)
Figure imgf000028_0001
Se añadió PFP-TFA (1,2 mL, 6,9 mmol) en dos porciones a una solución de 27 (2,2 g, 5,07 mmol) y trietilamina (2 mL) en 50 mL de CH2Ch anhidro. Tras agitar durante 2 h, la reacción se concentró y el residuo semisólido obtenido se resuspendió en 2-propanol (25 mL). El sólido resultante se recogió por filtración y se secó al vacío para obtener el éster crudo 28, que se purificó de nuevo por trituración en una mezcla caliente 4:1 de hexano y acetato de etilo (20 mL), seguida de enfriamiento y filtración. Al secar al vacío se obtuvieron 2,2 g (72%) de éster PFP 28. 1H NMR (CDCla) 88,34 (d, J=8,4 Hz, 2H), 8,05 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,96 (d, J=9 Hz, 2H), 7,53 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 6, 77 (d, J=9 Hz, 2H), 4,10 (s, 3H), 4,07 (s, 3H), 3,13 (s, 6H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[4-[(E)-(2,5-dimetoxi-4-{(£H4-(dimethilammo)feml]diazeml} fenil)diazenil]benzo il]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (29)
Figure imgf000028_0002
Una mezcla de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonilo]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (1 mmol), 28 (0,6 g, 1 mmol), DMF (5mL) y trietilamina se agitó a 50°C durante 20 h y luego se enfrió a temperatura ambiente. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con DMF (2 mL), CH2Ch (2x3 mL) y se secó para obtener 0,76 g (84%) del compuesto 29 como sólido negro (sal parcial de trietilamonio según el análisis de RMN). 1H NMR (DMSO-d6) 811,80 (br s, 1H), 11,55 (br s, 1H), 8,22 (m, 2H), 7,98 (m, 2H), 7,85 (m, 3H), 7,46 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,30 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,10 (s, 1H), 6,89 (m, 3H), 4,65 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,21 (t, J=7,2 Hz, 2H), 4,02 (s, 3H), 3,99 (s, 3H), 3,39 (m, 4H), 3,11 (s, 6H), 2,76 (m, 6H), 1,08 (t, J=7,2 Hz, 8H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[4-[(E)-(2,5-dimetoxi-4-{(E)-[4-(dimetilammo)feml]diazeml}feml] diazenil]benzoil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b,]dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (30)
Figure imgf000028_0003
A una suspensión de 29 (0,76 g, 0,84 mmol) en 10 mL de DMF anhidra se añadieron 0,5 mL de trietilamina y 0,2 mL (1,16 mmol) de PFP-TFA. La reacción se agitó durante 8 h y se trató con otra porción de PFP-TFA (0,15 mL) para completar la formación del éster de PFP. Tras agitarse durante 48 h, el material precipitado se recogió por filtración, se lavó con DMF (2x0,5 mL), acetona (4x5 mL) y se secó al vacío para dar 0,44 (54% de rendimiento) de éster PFP 30 como sólido marrón. 1H NMR (DMSO-d6) 5 12,57 (br s, 1H), 11,84 (br s, 1H), 8,44 (d, J=8,4 Hz, 1H), 8,22 (m, 1H), 8,00 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,86 (m, 4H), 7,62 (s, 1H), 7,45 (m, 4H), 7,16 (s, 1H), 6,89 (d, J=9Hz, 2H), 4,71 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,23 (t, J=7,2 Hz, 2H), 4,03 (s, 3H), 4,00 (s, 3H), 3,55 (t, J=8,4 Hz, 2H), 3,35 (m, 2H), 3,13 (s, 6H).
5-{(E)-[2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazenil}-1H-indole-2-carboxilato de etilo (31)
Figure imgf000029_0001
A una suspensión de 5-aminoindol-2-carboxilato de etilo (1,5 g, 7,34 mmol) en 40 mL de agua se añadieron 1,25 mL de HCl conc. La suspensión agitada se enfrió en un baño de hielo/agua a 0-4°C y se trató con una solución de NaNO2 (0,55 g, 8 mmol) en 10 mL de agua a través de un embudo de adición durante 5 min. La reacción se agitó a 0-4°C durante 20 minutos y luego se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante otros 30 minutos para dar una solución oscura y mayormente clara. 2-(Pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol (C. Boga et al., Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 7061-7068.) (1,5 mL, 9,7 mmol) se añadió en una porción seguido de 2,7 g de acetato de sodio trihidratado y 7 mL de MeOH y se continuó agitando durante 3 h. El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se resuspendió en 100 mL de MeOH. La suspensión se calentó a reflujo, se enfrió y se filtró para recoger el sólido precipitado. Al secar al vacío se obtuvieron 2,35 g (86%) del colorante deseado 31 como un sólido naranja. 1H NMR (DMSO-d6) 512,14 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,97 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,68 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 7,49 (d, J=9 Hz, 1H), 7,25 (s, 1H), 4,35 (q, J=7,9 Hz, 2H), 3,51 (br s aparente, 4H), 2,00 (m, 4H), 1,34 (t, J=7,2 Hz, 3H).
Acido 5-{(E)-[2-(Pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-if]diazenil}-1H-indole-2-carboxilico (32)
Figure imgf000029_0002
Una suspensión de 31 (2,35 g, 6,3 mmol) en una mezcla de THF (135 mL), MeOH (90 mL) y NaOH 1N (45 mL) se calentó a 50°C con agitación durante 2,5 h. La reacción se enfrió, se neutralizó con 45 mL de HCI 1N y se concentró hasta unos 80 mL. El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 2,17 g (100% de rendimiento) de ácido 32 como sólido marrón. 1H NMR (DMSO-d6) 513,08 (br s, 1H), 12,03 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,97 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,68 (dd, J-,=9 Hz, J2=18 Hz, 1H), 7,47 (d, J=9 Hz, 1H), 7,20 (d, J=1,2 Hz, 1H), 3,52 (br s aparente, 4H), 2,01 (m, 4H).
5-{(E)-[2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazenil}-1H-indol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (33)
Figure imgf000029_0003
A una solución de 32 (1,0 g, 2,92 mmol) y trietilamina (2 mL) en 30 mL de CH2Ch anhidro se añadió PFP-TFA en varias porciones de 0,5 mL en el transcurso de 2 días hasta que no se encontró más material de partida por análisis de HPLC. Se añadió un total de 1,5 mL (8,7 mmol) de PFP-TFA. El producto precipitado se recogió por filtración, se lavó con una pequeña cantidad (aprox. 2 mL) de CH2Cl2, hexano-acetato de etilo 4:1 y hexano. Secando al vacío se obtuvieron 0,865 g (58%) de éster PFP 33 como sólido amarillo. 1H NMR (DMSO-d6) 512,71 (d, J=1,2 Hz, 1H), 8,11 (s, 1H), 8,07 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,80 (dd, J-,=9 Hz, J2=18 Hz, 1H), 7,71 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,58 (d, J=9 Hz, 1H), 3,54 (br s aparente, 4H), 2,03 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-Tetrahidro-6-[(5-{(E)-[2-(pirroNdm-1-M)-1,3-tiazol-5 N]d/azen/7}-1H-/ndol-2-/l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilico (34)
Figure imgf000030_0001
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico, (0,79 mmol) y 0,5 mL de trietilamina en 5 mL de DMF se añadieron 0,4 g (0,79 mmol) de éster PFP 33 y la reacción se agitó durante 18 h. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con MeOH (2*5 ml) y se secó al vacío para dar 0,414 g (99%) del compuesto 34 (sal parcial de trietilamonio) como un sólido amarillo. 1H NMR (DMSO-d6) 811,98 (s, 1H), 11,73 (s, 1H), 8,26 (d, J=8,1 Hz, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,99 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,68 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,53 (d, J=9 Hz, 1H), 7,32 (d, J=9 Hz, 1H), 7,26 (s, 1H), 7,00 (s, 1H), 4,65 (t, J=8,1 Hz, 2H), 3,54 (br s aparente, 4H), 3,43 (t, J=8,1 Hz, 2H), 2,79 (q, J=7,2 Hz, 2H), 2,03 (m, 4H), 1,08 (t, J=7,2 Hz, 3H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(E)-[2-(pirroNdm-1 -M)-1,3-tiazol-5-M]d/azen/7}-1H-/ndol-2-/l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilato (3 de pentafluorofenilo 5)
Figure imgf000030_0002
A una suspensión de 34 (0,40 g, 0,76 mmol) en 9 mL de DMF anhidra se añadieron 0,5 mL de trietilamina y 0,2 mL (1,16 mmol) de PFP-TFA. La reacción se agitó durante 1 h y se trató con otra porción de PFP-TFA (0,2 mL) para completar la formación del éster de PFP. Tras agitarse durante 2 h, la reacción se concentró y el material precipitado se recogió por filtración. El sólido se resuspendió en 2-propanol (5 mL), se lavó con más 2-propanol (2*5 mL) y se secó para obtener 0,57 g (100%) de éster PFP 35. Según el análisis de RMN, el producto estaba parcialmente (aprox. 40%) bloqueado por TFA en uno de los grupos NH del indol. 1H NMR (DMSO-d6) 812,64 (s, 0,4H), 12,55 (s, 0,6H), 12,00 (s, 1H), 8,5-7,2 (protones aromáticos, 8H), 4,69 (m, 2H), 3,52 (m, 6H), 2,03 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(E)-[2-(pirroMdm-1-il)-1,3-tiazol-5-N]d/azen/7}-1H-/ndof-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (36)
Figure imgf000030_0003
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0.79 mmol) en 5 mL de DMF anhidra se añadieron 0,5 mL de trietilamina seguidos de 0,4 g (0,79 mmol) de éster PFP 33. La mezcla se agitó brevemente para dar inicialmente una solución clara que rápidamente se convirtió en una suspensión debido a la precipitación del producto. La reacción se agitó durante 18 h y el material precipitado se recogió por filtración. El sólido recogido se lavó con MeOH (3x5 mL), CH2Ch (10 mL) y se secó al vacío para obtener 0,59 g (100%, como sal de trietilamonio) del compuesto 36 como un sólido naranja. 1H NMR (DMSO-d6) 812,00 (s, 1H), 11,78 (d, J=1,2 Hz, 1H), 11,63 (s, 1H), 8,27 (m, 2H), 8,07 (s, 1H), 7,99 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,69 (dd, J1=9 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 7,54 (d, J=9 Hz, 1H), 77.39 (d, J=9 Hz, 1H), 7,31 (d, J=9 Hz, 1H), 7,27 (s, 1H), 7,13 (s, 1H), 6,94 (s, 1H), 4,67 (m, 4H), 3,53 (m, 4H), 3,42 (m, 4H), 2,72 (q, J=7,2 Hz, 4H), 2,03 (m, 4H), 1,05 (t, J=7,2 Hz, 6H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[p,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(EH2-(pirrolidm-1-il)-1,3-tiazol-5-il]d/3zen//}-1H-/ndo/-2-//)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (37)
Figure imgf000031_0001
A una suspensión de 36 (0,58 g, 0,8 mmol) en DMF (9 mL) se añadió trietilamina (0,5 mL) seguida de PFP-TFA (0,2 mL). La suspensión se agitó durante 2 h y se trató con otra porción de 0,2 mL de PFP-TFA y se continuó agitando durante 3 días más. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con 2-propanol (2*5 mL) y se secó al vacío para obtener 0,40 g (57%) de éster PFP 37 como sólido amarillo. 1H NMR (DMSO-d6) 812,56 (s, 1H), 11,99 (s, 1H), 11,82 (s, 1H), 8,42 (d. br, J=8,7 Hz, 1H), 8,29 (d. br, J=7,5 Hz, 1H), 8,07 (s, 1H), 8,00 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,68 (dd, J-i=9 Hz, J2=18 Hz, 1H), 7,61 (d, J=1,2 Hz, 1H), 7,54 (d, J=9 Hz, 1H), 7,44 (d, J=9 Hz, 1H), 7,39 (d, J=9 Hz, 1H), 7,27 (s, 1H), 7,17 (s, 1H), 4,69 (m, 4H), 3,53 (m, 8H), 2,03 (m, 4H).
Acido 4-{(E)-[2,5-dimetoxi-4-(pirrolidin-1-il)fenil]diazenil}-1-metil-1H-pirrol-2-carboxílico (38)
Figure imgf000031_0002
El ácido 4-[(1,1-dimetiletil)carbonil]amino]-1-metil-1H-pirrol-2-carboxílico 90,49 g (2,04 mmol) se trató con 11 mL de HCI conc. durante 30 min. La solución resultante se enfrió a 0-4°C y mientras se agitaba se trató con una solución de nitrito de sodio (0,15 g) en 3 mL de agua manteniendo la temperatura por debajo de 5° C. La reacción fría se agitó a 0-4°C durante 2 h antes de utilizarse en la siguiente etapa. Se añadió con agitación una solución de 1-(2,5-dimetoxifenil)pirrolidina (0,66 g, 3,2 mmol) en 50 mL de MeOH a la solución de sal de diazonio de la etapa 1 seguida de 100 mL de 1 NaOH y se dejó que la reacción se calentara hasta la temperatura ambiente. Tras agitarse durante 10 h, la reacción se concentró hasta unos 100 mL y el sólido resultante se recogió por filtración. El sólido se lavó con agua y se secó al vacío para obtener 0,275 g (37%) de colorante 38 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 87,65 (s, 1H), 7,29 (s, 1H), 6,99 (d, J=1,8 Hz, 1H), 6,29 (s, 1H), 3,91 (s, 6H), 3,74 (s, 3H), 3,36 (br s aparente, 4H), 1,90 (m, 4H).
4-{(E)-[2,5-dimetoxi-4-(pirrolidin-1-il)fenil]diazenil}-1-metil-1H-pirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (39) A una solución de 38 (0,27 g, 0,75 mmol) y trietilamina (0,5 mL) en 7,5 mL de CH2CI2 anhidro se añadió PFP-TFA en varias porciones de 0,1 mL en el transcurso de 2 días hasta que no se encontró más material de partida por análisis de HPLC. Se añadió un total de 0,3 mL (1,7 mmol) de PFP-TFa . La reacción se concentró y el residuo se trituró con 2-propanol (5 mL). El material vendido se recogió por filtración, se lavó con una pequeña cantidad (aprox. 2 mL) de MeOH y se secó para obtener 0,17 g (43%) de éster 39 de PFP como un sólido marrón anaranjado. 1H NMR (DMSO-d6) 87,99 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,40 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,21 (s, 1H), 6,26 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,49 (m, 4H), 1,88 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-Tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6[(4-{(E)-[2,5-dimetoxi-4-(pirroMdm-1-N)feml]d/3zen/7J-1-meth/7-1H-p/rro/-2-//)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-N]carbonM]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxflico (40)
Figure imgf000032_0001
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0.33 mmol) en 2 mL de DMF anhidra se añadieron 0,3 mL de trietilamina seguidos de 0,17 g (0,32 mmol) de éster 39 de PFP. La reacción se agitó a 50°C durante 24 h y luego se concentró. El residuo oscuro obtenido se trituró con acetato de etilo (10 mL), el material precipitado se recogió por filtración, se lavó con MeOH (2x5 mL) y se secó para obtener 0,203 g (84%) del compuesto 40 como un sólido marrón oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 813,00 (br s, 1H), 11,84 (s, 1H), 11,76 (s, 1H), 8,28 (br d, J=7,5 Hz, 1H), 7,98 (br s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,34 (d, J=9H, 2H), 7,20 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 7,05 (s, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,28 (s, 1H), 4,65 (t, J=8,1 Hz, 2H), 4,44 (t, J=8,1 Hz, 2H), 3,88 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,5-3,4 (m, 8H), 1,88 (m, 4H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6-[(4-{(EH2,5-dimetoxi-4-(pirroNdm-1-N)feml]d/3zen/7J-1-meth/7-1H-p/rro/-2-//)carbonil]benzo[1,2-6:4,3-b']dipirrol-2-M]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (41)
Figure imgf000032_0002
A una suspensión de 40 (0,197 g, 0,27 mmol) en DMF (3 mL) se añadió trietilamina (0,2 mL) seguida de PFP-TFA (0,1 mL). La suspensión se agitó durante 20 h y se trató con otra porción de 0,05 mL de PFP-TFA y se continuó agitando durante 1 hora más. Se eliminó la DMF y el residuo se trituró con 2-propanol (5 mL). El material resultante se recogió por filtración, se lavó con 2-propanol (2x5 mL) y se secó al vacío para obtener 0,218 g (90%) de éster PFP 41 como sólido marrón. 1H NMR (DMSO-d6) 812,54 (s, 1H), 11,78 (s, 1H), 8,40 (br d, J=7,8 Hz, 1H), 7,99 (br s, 1H), 7,64 (s, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,42 (d, J=9 Hz, 1H), 7,32 (d, J=9 Hz, 1H), 7.20 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,28 (s, 1H), 4,66 (t, J=8,1 Hz, 2H), 4,44 (t, J=8,1 Hz, 2H), 3,88 (s, 3H), 3,83 (s, 3H), 3,71 (s, 3H), 3,5-3,4 (m, 8H), 1,88 (m, 4H).
2-[(E)-2,3,6,7-tetr3h/dro-1H,5H-p/r/do[3,2,1-//]qumoMn-9-Ndiazeml]-1,3-benzotiazol-6-carboxMato de etilo (42)
Figure imgf000033_0001
Una solución de 2-amino-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de etilo (2,22 g, 10 mmol) en una mezcla 1:1 de ácidos acético y propiónico (50 mL) se enfrió a 0-4°C y luego se trató con 3,1 mL de ácido nitrosilsulfúrico al 40% durante 5 min. La suspensión resultante se agitó a 0-4°C durante 5 minutos y luego a temperatura ambiente durante otros 5 minutos para dar una solución clara y luego se volvió a enfriar a 0-4°C antes de utilizarla en la siguente etapa. Una solución de julolidina (2,1 g, 12 mmol) en MeOH (15 mL) se combinó con una solución de ácido sulfámico (0,3 g) en agua (100 mL) y luego se enfrió a 0-4°C. A esta mezcla se añadió la sal de diazonio preparada anteriormente en el transcurso de 5 min. La reacción se agitó durante 1 h y luego se diluyó con agua (400 mL) y se neutralizó con 90 mL de titilamina. El sólido precipitado se extrajo con acetato de etilo, se lavó con NaHCO3 saturado, se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo obtenido se trituró con hexano-acetato de etilo 1:1 caliente (30 mL) y el sólido resultante se recogió por filtración. Al secar a presión reducida se obtuvieron 0,8 g (48%) de colorante 42 suficientemente puro como sólido púrpura oscuro. 1H NMR (CDCh) 88,51 (d, J=1,5 Hz, 1H), 8,11 (dd inactivado, J-i=8,7 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 8,01 (d inactivado, J=8,7 Hz, 1H), 7,61 (s, 2H), 4,42 (q, J=7,2 Hz, 2H), 3,39 (t, J=6 Hz, 4H), 2,80 (t, J=6 Hz, 4H), 2,00 (m, 4H), 1,43 (t, J=7,2 Hz, 3H).
Acido 2-[(E)-2,3,6,7-Tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quino\ in-9-Mdiazenil]-1,3-benzotiazol-6-carboxMico (43)
Figure imgf000033_0002
A una solución de 42 (0,35 g, 0,86 mmol) en una mezcla de THF (18 mL) y MeOH (12 mL) se añadieron 6 mL de NaOH 1N. La reacción se agitó a 50°C durante 1,5 h y luego se enfrió, se neutralizó con HCI 1N (6 mL) y se concentró a presión reducida hasta unos 10 mL. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 0,32 g (98%) del compuesto 43 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 813,0 (br s, 1H), 8,54 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,99 (dd inactivado, J-,=8,7 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 7,93 (dd inactivado, J=8,7 Hz, 1H), 7,47 (s, 2H), 3,43 (t, J=6 Hz, 4H), 2,77 (t, J=6 Hz, 4H), 1,90 (m, 4H).
2-[(E)-2,3,6,7-tetrahidro-1H,5H-pirido[3,2,1-ij]quino\in-9-yidiazeni\]-1,3-benzotiazo\-6-carboxi\ato de pentafluorofenilo (44)
Figure imgf000033_0003
A una solución de 43 (0,32 g, 0,84 mmol) y trietilamina (0,5 mL) en 10 mL de DMF anhidra se añadió PFP-TFA en varias porciones en el transcurso de 3 horas hasta que no se encontró más material de partida por análisis de HPLC. Se añadió un total de 0,5 mL (2,9 mmol) de PFP-TFA. La reacción se concentró a presión reducida y el residuo se cromatografió sobre sílice eluyendo con un gradiente de acetato de etilo en hexano. La concentración de las fracciones del producto puro proporcionó 0,13 g (28%) de éster PFP 44 como un sólido púrpura oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 88,86 (d, J=1,8 Hz, 1H), 8,18 (dd inactivado, Ji=8,4 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 8,05 (d inactivado, J=8,4 Hz, 1H), 7,52 (s, 2H), 3,47 (t, J=6 Hz, 4H), 2,79 (t, J=6 Hz, 4H), 1,92 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6[(2-[(E)-2,3,6,7-tetrah/dro-1H,5H-p/r/do[3,2,1-//]qumoMn-9-ildiazenil]-1,3-benzotiazol-6-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (45)
Figure imgf000034_0001
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0,24 mmol) en 2 mL de DMF anhidra se añadieron 0,2 mL de trietilamina seguidos de 0,13 g (0,24 mmol) de éster 44 de PFP. Tras agitarse a 50°C durante 6 h, la reacción se concentró a presión reducida para obtener un residuo de color púrpura oscuro. Para aislar el producto, el residuo se resuspendió en MeOH (10 mL), el material precipitado se recogió por filtración, se lavó con MeOH (2x5 mL) y se secó para obtener 0,181 g (100%) del compuesto 45 como un sólido morado oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,9 (br s, 1H), 11,84 (s, 1H), 11,76 (s, 1H), 8,4-8,1 (m, 3H), 7,98 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,68 (br d, J=7,8 Hz, 1H), 7,48 (s, 2H), 7,3 (m, 2H), 7,07 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,05 (d, J=1,5 Hz, 1H), 4,63 (t, J=7,8 Hz, 2H), 4,20 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,4 (m, 6H), 3,27 (m, 2H), 2,78 (t, J=6 Hz, 4H), 1,91 (m, 4H).
Acido pentafluorofenil 3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6[(2-[(E)-2,3,6,7-tetrah/dro-1H,5H-p/r/do[3,2,1-///jqumoNn-9-Mdiazeml]-1,3-benzotiazol-6-M)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-N]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b'jdipirrol-2-carboxílico (46)
Figure imgf000034_0002
A una suspensión de 45 (0,175 g, 0,23 mmol) en DMF (2,5 mL) se añadió trietilamina (0,2 mL) seguida de dos porciones de 0,1 mL de PFP-TFA en el transcurso de 3 horas. La DMF se eliminó a presión reducida y el residuo se trituró con 2-propanol (5 mL). El material insoluble resultante se recogió por filtración, se lavó con 2-propanol (2x5 mL) y se secó a presión reducida para obtener 0,20 g (95%) de éster 46 de PFP como un sólido púrpura oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,53 (s, 1H), 11,78 (s, 1H), 8,6-7,0 (protones aromáticos, 11H), 4,66 (t, J=7,8 Hz, 2H), 4,20 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,9-3,0 (m, 8H), 3,27 (m, 2H), 2,77 (m, 4H), 1,90 (m, 4H).
6-{(E)-[2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazenil}-1,3-benzotiazol-2-carboxilato de etilo (47)
Figure imgf000035_0001
A una suspensión de 5-amino-1,3-benzotiazol-2-carboxilato de etilo (preparada por reducción de Fe/NH4Cl/agua/EtOH de 5-nitro-1,3-benzotiazol-2-carboxilato de etilo (Patente US no 8.586.759)) (0,9 g, 3,57 mmol) en agua (20 mL) se añadió HCI conc. (0,625 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se enfrió a 0-4°C. Se añadió una solución de NaNO2 (0,246 g) en agua (5 mL) con agitación durante 5 min. La reacción se agitó durante 10 min y después se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante otros 10 min. A la solución resultante de la sal de diazonio se añadió una solución de 2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol (0,66 g, 4,28 mmol) en 10 mL de metanol, seguida de acetato de sodio sólido, trihidrato (1,35 g). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h para dar una suspensión espesa de color naranja. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para dar el producto bruto, que se recristalizó a partir de acetato de etilo para obtener 0,91 g (66%) de colorante 47 como sólido naranja. 1H NMR (DMSO-d6) 68,45 (d, J=1,8 Hz, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,24 (d, J=9 Hz, 1H), 7,92 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 4,44 (q, J=6,9 Hz, 2H), 3,56 (br s, 4H), 2,14 (m, 4H), 1,34 (t, J=6,9 Hz, 3H).
Acido 6-{fE)-[2-(pirrolidm-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazeml}-1,3-benzotiazol-2-carboxilico (48)
Figure imgf000035_0002
A una solución de 47 (0,90 g, 2,32 mmol) en una mezcla de THF (48 mL) y MeOH (32 mL) se añadieron 16 mL de NaOH 1N. La reacción se agitó a 50°C durante 1,5 h y luego se enfrió, se neutralizó con HCI 1N (16 mL) y se concentró a presión reducida hasta unos 30 mL. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 0,81 g (97%) del compuesto 48 como un sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 68,40 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,19 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,88 (d, J=8,4 Hz, 1H), 3,55 (br s, 4H), 2,01 (br s, 4H).
6-{fE)-[2-(pirrolidm-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazeml}-1,3-benzotiazol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (49)
Figure imgf000035_0003
Antes de la reacción, el ácido inicial 48 (0,8 g, 2,22 mmol) se secó por coevaporación con DMF anhidra (10 mL) complementada con 0,5 mL de trietilamina y luego se volvió a disolver en una porción fresca de DMF (10 mL). A esta solución se añadió trietilamina (0,5 mL) seguida de PFP-TFA (0,4 mL, 2,3 mmol). En pocos minutos se obtuvo una suspensión espesa. La reacción se agitó en un agitador orbital durante 1 h, luego se concentró a presión reducida y el residuo resultante se cromatografió sobre sílice eluyendo con acetato de etilo. La concentración de las fracciones que contenían el producto y la recristalización a partir de acetato de etilo permitieron obtener 0,803 g (69%) del éster 49 de PFP como sólido rojo. 1H NMR (CDCla) 68,34 (d, J=1,8 Hz, 1H), 8,32 (d, J=9 Hz, 1H), 8,14 (s, 1H), 8,07 (dd, J-i=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 3,67 (br s, 4H), 2,03 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(6-{(E)-[2-(pirrolidm-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazeml}-1,3-benzotiazol-2-il)carboml] venzo [1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilico (50)
Figure imgf000036_0001
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (0,69 mmol) y 0,45 mL de trietilamina en 4,5 mL de DMF se añadieron 0,35 g (0,67 mmol) de éster 49 de PFP. La reacción se agitó durante 2 horas a 50°C y se enfrió a temperatura ambiente. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con DMF (2 mL), acetona (3x15 mL), metanol (2*10 ml) y se secó para dar 0,375 g (100%) del compuesto 50 como un sólido de color rojo ladrillo. 1H NMR (DMSO-d6) 811,70 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 8,28 (d, J=9,3 Hz, 1H), 8,22 (s, 1H), 8,17 (d, J=9 Hz, 1H), 7,87 (d, J=9 Hz, 1H), 7,32 (d, J=9,3 Hz, 1H), 6,93 (s, 1H), 4,89 (m, 2H), 3,7-3,3 (m, 6H), 2,01 (br s, 4H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[(6-{(E)-[2-(pirroNdm-1 -il)-1,3-tiazol-5-il]diazenil}-1,3-benzotiazol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (51)
Figure imgf000036_0002
Se añadió PFP-TFA (un total de 0,35 mL, 1,63 mmol) en varias porciones en el transcurso de 20 h a una suspensión de 50 (0,36 g, 0,66 mmol) y trietilamina (0,4 mL) en 5 mL de DMF anhidra hasta que no se encontró más material de partida por análisis de HpLC. La reacción se concentró a presión reducida y el residuo semisólido obtenido se resuspendió en metanol (25 mL). El sólido resultante se recogió por centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos, se decantó el metanol y se repitió el procedimiento dos veces más. Al secar a presión reducida se obtuvieron 0,340 g (72%) de éster PFP 51 como sólido de color rojo ladrillo. 1H NMR (DMSO-d6) 812,62 (s, 1H), 8,48 (8,46 (d, J=9 Hz, 1H), 8,44 (d, J=1,5 Hz, 1H), 8,25 (s, 1H), 8,21 (d, J=9 Hz, 1H), 7,90 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H), 7,46 (d, J=9 Hz, 1H), 4,95 (t, J=8,1 Hz, 2H), 3,55 (br s, 4H), 3,50 (t, J=8,4 Hz, 2H), 2,03 (m, 4H).
4-fenil-2-(pirrolidin-1-yi)-1,3-tiazol (52)
Figure imgf000036_0003
Una mezcla de 2-bromo-4-fenil-1,3-tiazol (5,4 g, 22,5 mmol) y pirrolidin (5 mL, 60 mmol) se calentó a 80°C durante 2,5 h, después se enfrió y se concentró. El semisólido resultante se resuspendió en acetato de etilo-hexano 1:2 y el bromuro de pirrolidinio precipitado se eliminó por filtración. El filtrado se concentró y el residuo se cromatografió sobre sílice eluyendo con acetato de etilo-hexano 1:2 para obtener 5,15 g del compuesto 52 como un sólido cristalino incoloro. 1H NMR (CDCla) 8 7,86 (m, 1H), 7,83 (m, 1H), 7,36 (dt, J-,=6 Hz, J2=1,5 Hz, 2H), 7,26 (dt inactivado, J-,=6 Hz, J2=1,5 Hz, 1H), 6,66 (s, 1H), 3,51 (m, 4H), 2,04 (m, 4H).
5-{(E)-[4-feml-2-(pirroNdm-1-N)-1,3-tiazol-5-N]d/azen//}-1H-/ndo/e-2-carbox//ato de etilo(53)
Figure imgf000037_0001
A una suspensión de 5-aminoindol-2-carboxilato de etilo (0,75 g, 3,67 mmol) en 20 mL de agua se añadieron 0,625 mL de HCI conc. La suspensión agitada se enfrió en un baño de hielo/agua hasta 0-4°C y se trató con una solución de NaNO2 (0,275 g, 3,98 mmol) en 5 mL de agua durante 5 min. La reacción se agitó a 0-4°C durante 30 minutos y luego se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante otros 30 minutos. A esta solución se añadió una solución de 52 (1,1 g, 4,85 mmol) en 16 mL de metanol seguida de acetato sódico, trihidrato (1,35 g) y se continuó agitando durante 5 h. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con agua, se resuspendió en 20 mL de MeOH y se secó. El colorante crudo se recristalizó del metanol para obtener 1,42 g (87%) de colorante 53 como un sólido rojo anaranjado. 1H NMR (CDCh) 88,96 (br s, 1H), 8,34 (dd, J-,=8,1 Hz, J2=1,5 Hz, 2H), 8,07 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,85 (dd, J-i=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,55-7,35 (m, 4H), 7,30 (s, 1H), 4,42 (q, J=6,9 Hz, 2H), 3,66 (br s, 4H), 2,10 (m, 4H), 1,43 (t, J=6,9 Hz, 3H).
Acido 5-{(E)-[4-Feml-2-(pirroNdm-1-M)-1,3-tiazol-5-M]d/azen//}-1H-/ndo/e-2-carbox///co (54)
Figure imgf000037_0002
Una suspensión de 53 (1,3 g, 2,92 mmol) en una mezcla de THF (60 mL) y metanol (40 mL) se añadió NaOH 1N (20 mL). La reacción se agitó a 50°C durante 1,5 h, luego se enfrió, se neutralizó con HCI 1N (20 mL) y se concentró hasta aproximadamente 40 mL. El material precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 1,22 g (100%) de ácido 54 como sólido marrón oscuro. 1H Nm R (DMSO-d6) 812,03 (s, 1H), 8,29 (d, J=8,7 Hz, 2H), 7,98 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,69 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,6-7,4 (m, 4H), 7,20 (d, J=1,5 Hz, 1H), 3,59 (br s, 4H), 2,04 (br s, 4H).
-{(E)-[4-fenil-2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazenil}-1H-indol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (55)
Figure imgf000037_0003
El ácido 54 (1,22 g, 2,92 mmol) se secó primero por coevaporación con DMF anhidra (15 mL) y luego se volvió a disolver en una porción fresca de DMF (15 mL) y se trató con trietilamina (1 mL) y PFP-TFA (0,57 mL, 3,3 mmol). Tras agitarse a temperatura ambiente durante 3 h, la reacción se concentró a presión reducida y el producto resultante se resuspendió en metanol (15 mL). El material insoluble se recogió por filtración, se lavó con metanol (2x5 mL) y se secó para obtener 1,71 g (87% como aducto de DMF) del éster 55 de PFP como un sólido naranja. 1H NMR (CDCla) 89,09 (br s, 1H), 8,34 (m, 2H), 8,11 (d, J=1,8 Hz, 1H), 8,02 (br s, 1H, DMF), 7,94 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,62 (d, J=1,8 Hz, 1H), 7,55-7,35 (m, 4H), 3,67 (br s, 4H), 2,96 (s, 3H, DMF), 2,89 (s, 3H, DMF), 2,12 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(E)-[4-fenil-2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-il]d/azen//}-1H-/ndo/-2-//)carbonil] venzo [1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilico (56)
Figure imgf000038_0001
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (0,79 mmol) en 5 mL de DMF se añadieron 0,5 mL de trietilamina seguidos de 0,53 g (0,79 mmol) de éster PFP 55. La mezcla se agitó durante unos minutos para obtener una solución casi completa antes de que comenzara la precipitación del producto. La suspensión se calentó a 50°C durante 2h y luego se diluyó con metanol (10 mL). El precipitado se recogió por filtración, se lavó con metanol (3*10 mL) y se secó para obtener 0,545 g (100% como sal de trietilamonio) del compuesto 56 como un sólido rojo anaranjado. 1H NMR (DMSO-d6) 811,95 (s, 1H), 11,56 (s, 1H), 8,31 (m, 2H), 8,22 (br d, J=8,4 Hz, 1H), 7,99 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,69 (dd, J-,=9 Hz, J2=1,8 Hz, 1H), 7,6-7,4 (m, 4H), 7.29 (dd, J=9 Hz, 1H), 7,26 (s, 1H), 6,89 (s, 1H), 4,65 (t, J=8,1 Hz, 2H), 3,60 (br s, 4H), 3,41 (t, J=8,4 Hz, 2H), 2,67 (q, J=6,9 Hz, 6H), 2,04 (m, 4H), 1,03 (t, J=7,2 Hz, 9H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[(5-{(EH4-feml-2-(pirroMdm-1-M)-1,3-tiazol-5-M]d/azen/7J-íH-/ndo/-2-/7)carbonil]benzo[1,2-6:4,3-6']dip¡rrol-2-carbox¡lato de pentafluorofenilo (57)
Figure imgf000038_0002
Antes de comenzar la reacción, el ácido 56 (0,545 g, 0,79 mmol) se secó por coevaporación con DMF anhidra (20 mL), luego se redisolvió en una porción fresca de DMF (6 mL) y se trató con trietilamina (0,5 mL). Se añadió PFP-TFA en varias porciones de 0,1 mL durante un periodo de 9 h hasta que no se encontró más ácido de partida 56 por análisis de HPLC. Se añadió un total de 0,8 mL (4,66 mmol) de PFP-TFA. La suspensión resultante se concentró y el residuo se trituró en metanol (10 mL). El sólido se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó para obtener 0,6 g (99%) de éster PFP 57 como sólido rojo-anaranjado. Este producto estaba parcialmente bloqueado por TFA en los grupos NH del indol. 1H NMR (DMSO-d6) 812,55 (s, 0,4H), 11,98 (s, 1H), 8,33 (m, 2H), 8,00 (s, 1H), 7,8­ 7,2 (protones aromáticos, aprox. 9H), 4,70 (t, J=8,4 Hz, 2H), 3,60 (br s, 4H), 5,52 (m oscurecido por señal de agua, 2H), 2,05 (br s, 4H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[[6-acetN-3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-6:4,3-6']dipirrol-2-M]carboml]benzo[1,2-6:4,3-¿^dipirrol-2-carboxiNco (58)
Figure imgf000038_0003
Se añadió anhídrido acético (0,12 mL, 1,27 mmol) a una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (1,0 mmol) y 0,4 mL de trietilamina en 10 mL de d Mf . La precipitación del producto se inició pocos minutos después de la adición. Se dejó que la reacción continuara durante 15 h, el material precipitado se recogió por filtración, se lavó con acetona (3x15 mL) y se secó para obtener 0,36 g (84%) de 58 como un sólido blanquecino. 1H NMR (DMSO-d6) 813,0 (br s, 1H), 11,85 (d, J=1,8 Hz, 1H), 11,70 (d, J=1,8 Hz), 8,28 (br d, J=8,7 Hz, 1H), 8,17 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,33 (d, J=9,3 Hz, 1H), 7,29 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,07 (d, J=1,2 Hz, 1H), 7,05 (d, J=1,5 Hz, 1H), 4,65 (t, J=8,1 Hz, 2H), 4,22 (t, J=8,4 Hz, 2h ), 3,43 (t, 8,1 Hz, 2H), 3,39 (m parcialmente oscurecido por la señal de agua, 2 H), 2,18 (s, 3H).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[[6-acetil-3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (59)
Figure imgf000039_0001
Se añadió PFP-TFA en varias porciones (0,04 -0,12 mL cada una) con agitación durante 20 h a una solución de 58 (0,35 g, 0,82 mmol) y trietilamina (0,4 mL) en 10 mL de DMF anhidra hasta que no se encontró más material de partida por análisis de HPLC. La DMF se eliminó a presión reducida y el residuo se resuspendió en acetona (10 mL). El material insoluble se recogió por filtración, se lavó con acetona y se secó para obtener 0,46 g (94%) de 59 como un sólido blanquecino. 1H NMR (DMSO-d6) 812,56 (d, J=1,8 Hz, 1H), 11,73 (d, J=1,5 Hz), 8,44 (br d, J=9,3 Hz, 1H), 8,19 (d, J=9 Hz, 1H), 7,97 (s, 1H), 7,61 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,45 (d, J=9 Hz, 1H), 7,31 (d, 9 Hz, 1H), 7,08 (d, J=1,5 Hz, 1H), 4,69 (t, J=8,4 Hz, 2H), 4,22 (t, J=8,4 Hz, 2H), 3,49 (t, 8,4 Hz, 2H), 3,39 (m parcialmente oscurecido por la señal de agua, 2H), 2,19 (s, 3H).
Ejemplo 2. Preparación de soportes sólidos de síntesis de 6-aminohexano-1,2-diol modificados con DSQ (6-N-(Fluorenilmetoxicarbonil)amino-1-(4,4'-dimetoxitrifilmetoxi)hex-2-il)oxi-4-oxobutanoil Soporte de poliestireno (ID# 349 PS)
Figure imgf000039_0002
El (6-N-(Fluorenilmetoxicarbonil)amino-1-(4,4'-dimetoxitrifilmetoxi)hex-2-il)oxi-4-oxobutanoil soporte de poliestireno (ID #349 PS) (carga de DMT 20 pmol/g) se preparó de la misma manera que el soporte CPG descrito en Patente US no 6.492.346 ,partiendo de un soporte de aminometilpoliestireno (33 mmol/g, Applied Biosystems PN 360865C). Ejemplo 3. Preparación de los soportes de poliestireno
Procedimiento general para la preparación de soportes de poliestireno ID# 473, 474-477, 479,481-488 Etapa 1. Desprotección de FMOC
El soporte de poliestireno (ID# 349 PS) (2,0 g) se resuspendió en 15 mL de solución 0,2 M de 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) en DMF y se agitó en un agitador orbital durante 10 min. El DMF se eliminó por filtración y el procedimiento se repitió dos veces más. A continuación, el soporte de poliestireno se lavó con DMF o N-metil-2-pirrolidona (NMP) (3x50 mL), dependiendo de la elección del disolvente en la siguiente etapa, y se hizo reaccionar inmediatamente con un éster de PFP como se describe a continuación.
Etapa 2. Acoplamiento de ésteres PFP
Se combinó una solución de uno de los ésteres de PFP (50 pmol) sintetizados como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1 (la lista completa de ésteres de PFP utilizados en esta reacción se muestra en la Tabla 3) y trietilamina (0,2 mL) en 8,5 mL de un disolvente indicado en la Tabla 3 con el soporte de poliestireno de la etapa 1. La suspensión se agitó durante el periodo de tiempo indicado en la Tabla 3 y luego se filtró, se lavó con el mismo disolvente (3x50 mL) y se llevó inmediatamente a la siguiente etapa.
Tabla 3
Figure imgf000040_0002
Etapa 3. Bloqueo de los grupos amino no reactivos
El soporte de la etapa 2 se resuspendió en 18 mL de piridina y se trató con 2 mL de anhídrido acético. La suspensión se agitó durante 30 minutos, luego se filtró, se lavó con DMF (3x50 mL) y acetona (3x50 mL) y se secó a presión reducida.
Ejemplo 4. Preparación del soporte de poliestireno ID # 478
2-[(E)-(4-[(6-acetilhexil)(metil)ammo]feml}diazeml]-1,3-benzotiazol-6-carboxMato de etilo (60)
Figure imgf000040_0001
A una suspensión fría (0-4°C) de 2-amino-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de etilo (0,444 g, 2,0 mmol) en una mezcla de ácidos acético (5 mL) y propiónico (5 mL) se añadieron gota a gota 0,62 mL de ácido nitrosilsulfúrico al 40% con agitación. Tras agitarse durante 3 h, se obtuvo una solución amarilla-naranja casi clara que se utilizó inmediatamente en la siguiente etapa. La solución de sal de diazonio se añadió en varias porciones a una mezcla fría (0-4°C) preparada combinando una solución de acetato de 6-[metil(fenil)amino]hexilo (documento WO 2008008481) (0,6 g, 2,4 mmol) en 2,5 mL de MeOH y una solución de ácido sulfámico (0,060 g) en 20 mL de agua.
La reacción se agitó a 0-4°C durante 2 horas, se neutralizó añadiendo NaHCO3 saturado en varias porciones y el material precipitado se extrajo con acetato de etilo. El extracto se concentró a presión reducida y el residuo obtenido se trituró con hexano-acetato de etilo 4:1 (30 mL). El sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con MeOH (15 mL) y se secó para obtener 0,415 g (42%) de azocolorante 60 como sólido negro. 1H NMR (CDCh) 88,55 (s, 1H), 8,13 (dd inactivado, J-,=8,4 Hz, J2=1,2 Hz, 1H), 8,07 (d inactivado, J=8,4 Hz, 1H), 8,00 (d, J=9,3 Hz, 2H), 6,76 (d, J=9,3 Hz, 2H), 4,43 (q, J=7,2 Hz, 2H), 4,07 (t, J=6,6 Hz, 2H), 3,49 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,14 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 1,66 (m, 4H), 1,44 (m, 7H).
Acido 2-[(E)-{4-[(6-hidroxihexil)(metil)ammo]feml}diazeml]-1,3-benzotiazol-6-carboxnico (61)
Figure imgf000041_0001
Se añadió NaOH 1N (6 mL) a una solución de colorante azoico 60 (0,415 g, 0,86 mmol) en una mezcla de THF (18 mL) y MeOH (12 mL). La reacción se calentó a 50°C con agitación durante 1,5 h, después se enfrió a temperatura ambiente, se neutralizó con HCI 1 N (6 mL) y se concentró a presión reducida hasta unos 10 mL. El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó para obtener 0,356 g (100%) del compuesto 61 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 813,08 (s, 1H), 8,58 (s, 1H), 7,99 (s, 2H), 7,83 (d, J=9,3 Hz, 2H), 6,92 (d, J=9,3 Hz, 2H), 4,32 (br s, 1H), 3,51 (t, J=6,9 Hz, 2H), 3,35 (m, 2H), 3,12 (s, 3H), 1,56 (m, 2H), 1,36 (m, 2H), 1,29 (m, 4H).
2-[('£'H4-[(6-(b¡s-(4-metox¡feml))(feml)metox¡hex¡l)(met¡l)ammo]feml} diazenil]-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de pentafluorofenilo (62)
Figure imgf000041_0002
El compuesto 61 (0,355 g, 0,86 mmol) se secó por coevaporación con piridina anhidra (25 mL) y luego se volvió a disolver en una porción fresca de piridina (10 mL). Se añadió cloruro de dimetoxitrilo (0,336 g, 1,0 mmol), se agitó la reacción durante 3 h y se trató con PFP-TFA (0,4 mL, 2,3 mmol) y se dejó reaccionar durante otras 3 h. Se eliminó la piridina a presión reducida y el residuo se repartió entre acetato de etilo y ácido cítrico al 10%. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4, se concentró y el material resultante se cromatografió sobre sílice eluyendo con un gradiente de acetato de etilo en hexano (30 a 50%). Las fracciones que contenían el producto deseado se concentraron para dar 0,45 g (59%) de éster PFP 62 como un sólido amorfo de color púrpura oscuro. Este material era lo suficientemente puro para su uso posterior.
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6[(2-[(E)-(4-[(6-(bis-(4-metoxifeml))(feml)metoxifexil) (metil) amino]fenilldiazenil]-1,3-benzotiazol-6-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (63)
Figure imgf000041_0003
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (0.45 mmol) en 8 mL de DMF anhidra se añadieron 0,5 mL de trietilamina seguidos de 0,4 g (0,45 mmol) de éster PFP 62. Tras agitarse a temperatura ambiente durante 20 h, la reacción se concentró a presión reducida. El residuo obtenido se resuspendió en acetona (10 mL), el material precipitado se recogió por filtración, se lavó con más acetona (2x5 mL) y se secó para obtener 0,41 g (84%) del compuesto 63 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 811,85 (s, 1H), 11,78 (s, 1H), 8,5-6,9 (protones aromáticos, 26H), 4,64 (m, 2H), 4,21 (m, 2H), 3,74 (s, 6H), 3,6-3,2 (m, 8H), 3,13 (s, 3H), 1,58 (m, 4H), 1,36 (m, 2H), 1,28 (m, 2H).
,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6[(2-[(E)-{4-[(6-(bis-(4-metoxifeml))(feml)metoxifexN)(metM) ammo]feml}d¡azeml]-1,3-benzot¡azol-6-il)carboml]benzo[1,2-b:4,3-6']d¡p¡rrol-2-M]carboml]benzo[1,2-6:4,3-b']dipirrol-2-carboxilato de pentafluorofenilo (64)
Figure imgf000042_0001
A una suspensión de 63 (0,285 g, 0,26 mmol) en DMF (4 mL) se añadió trietilamina (0,2 mL) seguida de PFP-TFA (0,1 mL). Tras agitar durante 1 h, la reacción se concentró y el residuo resultante se resuspendió en acetona (10 mL). El material sólido se recogió por filtración, se lavó con acetona (2x5 mL) y se secó a presión reducida para obtener 0,25 g (77%) de éster PFP 64 como un sólido de color marrón oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,54 (s, 1H), 11,80 (s, 1H), 8,5-6,9 (protones aromáticos, 26H), 4,68 (m, 2H), 4,22 (m, 2H), 3,74 (s, 6H), 3,6-3,2 (m, 8H), 3,13 (s, 3H), 1,58 (m, 4H), 1,36 (m, 2H), 1,28 (m, 2H).
Preparación del soporte de poliestireno ID #478
Figure imgf000042_0002
Soporte de poliestireno (N-MMT-5-aminopent il)glycolato (Patente US no 7.381.818) (5,0 g, 20 umol/g de carga de MMT) se desprotegió suspendiendo en 30 mL de ácido tricloacético al 3% en CH2Ch y filtrando. El procedimiento se repitió unas 10 veces hasta que no se observó más color amarillo. A continuación, el soporte se lavó con CH2Ch, trietilamina al 10%/CH2Ch y N-metilpirrolidinona (NMP) antes de resuspenderlo en una solución de 64 (0,156 g, 0,12 mmol, 25 umol/g de oferta) y trietilamina (0,2 mL) en 25 mL de NMP. La suspensión se agitó en un agitador orbital durante 18 h y luego se filtró y se lavó con NMP. Para bloquear los aminogrupos sin reaccionar, el soporte se suspendió en piridina (22,5 mL), se trató con anhídrido acético (2,5 mL) y se agitó durante 30 minutos. Los reactivos de bloqueo se eliminaron por filtración y el soporte se lavó con varias porciones de 50 mL de NMP y acetona, seguido de un secado a presión reducida para obtener el soporte de poliestireno ID #478 como un sólido púrpura claro. La carga de DMT fue de 19,0 pmol/g según una prueba colorimétrica de escisión del ácido.
Ejemplo 5. Preparación del soporte de poliestireno ID # 480
Figure imgf000043_0001
Una mezcla de N-metilanilina (23,6 mL, 0,218 mol), 3-cloropropilacetato (32,4 ml, 0,266 mol), diisopropiletilamina (46,4 mL, 0,267 mol) y yoduro de sodio (2,2 g, 14,7 mmol) se calentó a 120°C con agitación durante 7 h antes de enfriarse y repartirse entre agua (500 mL) y acetato de etilo (200 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El producto crudo resultante se purificó por destilación al vacío a 1 mmHg con el producto deseado destilando a aproximadamente 110°C dando 35,8 g (80%) de acetato de 3-[metil(fenil)amino]propilo (65) como un líquido amarillo pálido. 1H NMR (CDCh) 87,7 (m, 2H), 6,7 (m, 3H), 4,11 (t, J=6,3 Hz, 2H), 3,42 (t, J=6,9 Hz, 2H), 2,93 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 1,91 (p, J=6,6 Hz, 2H).
Acido 2-[(E)-(4-{[3-(acetil)propil](metil)amino}fenil)diazenil]-1,3-benzotiazol-6-carboxílico (66)
Figure imgf000043_0002
A una suspensión fría (0-4°C) de ácido 2-amino-1,3-benzotiazol-6-carboxílico (1,25 g, 6,25 mmol) en una mezcla de ácidos acético (16 mL) y propiónico (16 mL) se añadió gota a gota ácido nitrosilsulfúrico al 40% (2,0 mL) en el transcurso de 5 min. La reacción se agitó a 0-4°C durante 2 h y luego a temperatura ambiente durante 2 h para dar una suspensión de color amarillo claro. Esta suspensión se añadió lentamente (aprox. 5 min) a una mezcla fría (0-4°C) preparada combinando una solución de acetato de 3-[metil(fenil)amino]propilo (65) (1,6 g, 7,7 mmol) en metanol (8mL) y una solución de ácido sulfámico (0,2 g) en agua (65 mL). Tras agitar durante 1 h, la reacción se neutralizó añadiendo 65 mL de trietilamina y se diluyó con agua (500 mL). El sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y se secó. El colorante crudo se trituró con hexano-acetato de etilo 4:1 (20 mL) y el sólido se recogió por filtración. El secado a presión reducida permitió obtener 1,66 g (64%) de azocolorante 66 suficientemente puro como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 88,62 (s, 1H), 8,04 (s, 2H), 7,89 (d, J=9 HZ, 2H), 6,98 (d, J=9 Hz, 2H), 4,07 (t, J=6 Hz, 2H), 3,66 (t, J=6,6 Hz, 2H), 3,16 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,93 (p, J=6,3 Hz, 2H).
2-[(E)-(4-{[3-(acetil)propil](metil)amino}fenil]diazenil]-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de pentafluorofenilo (67)
Figure imgf000043_0003
A una solución de 66 (1,66 g, 4,0 mmol) y trietilamina (0,5 mL) en 10 mL de CH2Ch anhidro se añadió PFP-TFA en dos porciones en el transcurso de 3 horas hasta que no se encontró más material de partida por análisis de HPLC. Se añadió un total de 1,1 mL (6,4 mmol) de PFP-TFA. La reacción se concentró a presión reducida y el residuo se resuspendió en 20 mL de metanol. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con metanol y se secó para obtener 1,88 g (81%) de éster PFP 67 como sólido púrpura oscuro. 1H NMR (CDCh) 8 8,72 (s, 1H), 8,27 (dd inactivado, J-,=8,4 Hz, J2=1,2 Hz, 1H), 8,16 (d, J=8,7 Hz, 1H), 8,03 (d, J=9 Hz, 2H), 6,79 (d, J=9 Hz, 2H), 4,16 (t, J=6 Hz, 2H), 3,63 (t, J=7,2 Hz, 2H), 3,18 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 2,03 (m, 2H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3,6,7,8-tetrahidro-6[(2-[(E)-(4-([3-(acetM)propil](metM)ammo}feml)diazeml]-1,3-benzotiazol-6-il)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (68)
Figure imgf000044_0001
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(3,6,7,8-tetrahidrobenzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il)carbonil]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol]-2-carboxílico (3.05 mmol) en 20 mL de DMF anhidra se añadieron 2 mL de trietilamina seguidos de 1,8 g (3,11 mmol) de éster PFP 67. La reacción se agitó a 50°C durante 3 h y luego se concentró. El residuo oscuro obtenido se trituró con acetona (30 mL), el sólido resultante se recogió por filtración, se lavó con acetona (2x10 mL) y se secó para obtener 2,55 g (107% debido a una forma parcial de sal de trietilamonio) del compuesto 68 como un sólido marrón-púrpura oscuro. 1H NMR (DMSO-d6) 811,77 (s, 1H), 11,62 (s, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,2 (m, 2H), 8,07 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,89 (d, J=9 Hz, 2H), 7,74 (br d, J=8,1 Hz, 1H), 7,35 (br s, 1H), 7,29 (d, J=9 Hz, 1H), 7,08 (s, 1H), 6,98 (d, J=9,3 Hz, 2H), 6.92 (s, 1H), 4,63 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,21 (t, 2H), 4,07 (t, J=6 Hz, 2H), 3,66 (t, J=6,3 Hz, 2H), 3,40 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,31 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,16 (s, 3H), 2,73 (m, 5H, Et3NH+), 2,04 (s, 3H), 1,95 (m, 2H), 1,05 (t, J=7,2 Hz, 8H, Et3NH+).
3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[[3,6,7,8-tetrah¡dro-6[(2-[(E)-(4-{[3-(acet¡l)prop¡l](met¡l)ammo}feml)d¡azeml]-1,3-benzot¡azol-6-¡l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-6,]dip¡rrol-2-¡l]carboml]benzo[1,2-6:4,3-6']d¡p¡rrol-2-carbox¡lato de pentafluorofenilo (69)
Figure imgf000044_0002
A una suspensión de 68 (2,55 g, 2,67 mmol) en 25 mL de DMF anhidra se añadió trietilamina (1 mL) seguida de PFP-TFA en varias porciones en el transcurso de 4 horas hasta que no se encontró más material de partida por análisis de HPLC. Se añadió un total de 0,91 mL (5,3 mmol) de PFP-TFA. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con acetona (3x20 mL) y se secó para obtener 2,40 g (95%) de éster PFP 69 como sólido rojo-púrpura. 1H NMR (DMSO-d6) 8 12,54 (s, 1H), 11,80 (s, 1H), 8,5-8,2 (m, 3H), 8,07 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,89 (d, J=9 Hz, 2H), 7,74 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,43 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,37 (s, 1H), 7,11 (s, 1H), 6.98 (d, J=9,3 Hz, 2H), 4,68 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,22 (t, J=6,3 Hz, 2H), 4,07 (t, J=6,3 Hz, 2H), 3,66 (t, J=6,2 Hz, 2H), 3,48 (t, J=7,2 Hz, 2H), 3,31 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,16 (s, 3H), 2,04 (s, 3H), 1,93 (m, 2H).
W-(6-(b¡s-(4-metox¡feml))(feml)metox¡hex-1-¡l)-3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[[3,6,7,8-tetrah¡dro-6[(2-[(E)-(4-{[3-(acet¡l)prop¡l](metil)ammo}feml)d¡azeml]-1,3-benzot¡azol-6-¡l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-6']d¡p¡rrol-2-il]carbonil]benzo[1,2-6:4,3-6']dipirrol-2-carboxam¡da (70)
Figure imgf000045_0001
Una solución de 6-aminohexan-1-ol protegido con O-DMT-, N-Fmoc (S. Mahajan (2006)) (0,55 g, 0,86 mmol) en una mezcla de DMF (6 mL) y trietilamina (6 mL) se calentó a 80°C durante 1 h, después se concentró y se volvió a disolver en una nueva porción de DMF (30 mL) complementada con trietilamina (0,45 mL). A esta solución se añadieron 0,74 g (0,78 mmol) de 69 y la reacción se agitó a 50°C durante 5 h y luego a temperatura ambiente durante 18 h. La DMF se eliminó a presión reducida y el residuo resultante se trituró con metanol. La filtración del sólido obtenido, seguida de un lavado con metanol y un secado, permitió obtener 0,885 g (87%) del compuesto 70 como un sólido púrpura. 1H NMR (DMSO-d6) 811,78 (s, 1H), 11,64 (s, 1H), 8,45 (br t, 1H), 8,33 (s, 1H), 8,20 (m, 2H), 8,08 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,90 (d, J=9,3 Hz, 2H), 7,75 (br d, J=6,9 Hz, 1H), 7,4-7,25 (m, 11H), 7,08 (s, 2H), 6,98 (d, J=9,3 Hz, 2H), 6,89 (d, J=9 Hz, 4H), 4,65 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,22 (t, J=6,3 Hz, 2H), 4,07 (t, J=6 Hz, 2H), 3,73 (s, 6H), 3,66 (t, J=6,2 Hz, 2H), 3,43 (t, J=7.2 Hz, 2H), 3,28 (m, 4H), 3,16 (s, 3H), 2,96 (t, J=6 Hz, 2H), 2,04 (s, 3H), 1,94 (m, 2H), 1,55 (m, 4H), 1,32 (m, 4H).
W-(6-(b¡s-(4-metox¡feml))(feml)metox¡hex-1-¡l)-3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[[3,6,7,8-tetrah¡dro-6[(2-[(E)-(4-{[3-h¡drox¡prop¡l](met¡l)ammo}feml)d¡azeml]-1,3-benzot¡azol-6-¡l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-6']d¡p¡rrol-2-¡l]carbon¡l]benzo[1,2-6:4,3-6']d¡p¡rrol-2-carboxam¡da (71)
Figure imgf000045_0002
A una solución de 70 (0,61 g, 0,52 mmol) en 20 mL de DMF se añadieron 10 mL de etanol seguidos de 5 mL de NaOH 1 N. La reacción se calentó a 50°C con agitación durante 30 min, luego se concentró y el residuo resultante se resuspendió en metanol (30 mL). El sólido obtenido se recogió por filtración, se lavó con metanol (2x30 mL) y se secó para obtener 0,562 g (95% ) de 71 como sólido púrpura. 1H NMR (DMSO-d6) 811,77 (s, 1H), 11,64 (s, 1H), 8,45 (br t, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,20 (m, 2H), 8,08 (d, J=8.4 Hz, 1H), 7,88 (d, J=9 Hz, 2H), 7,72 (br d, J=6,9 Hz, 1H), 7,4­ 7,25 (m, 11H), 7,07 (s, 2H), 6,97 (d, J=9,3 Hz, 2H), 6,87 (d, J=8,7 Hz, 4H), 4,65 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,21 (t, J=6,3 Hz, 2H), 3,71 (s, 6H), 3,62 (t, J=6,3 Hz, 2H), 3,49 (m, 2H), 3.39 (t, J=7,2 Hz, 2H), 3,27 (m, 4H), 3,16 (s, 3H), 2,92 (t, J=6 Hz, 2H), 1,76 (m, 2H), 1,54 (m, 4H), 1,31 (m, 4H).
W-(6-(b¡s-(4-metox¡feml))(feml)metox¡hex-1-¡l)-3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[[3,6,7,8-tetrah¡dro-6[(2-[(E)-(4-{[3-{[4-oxo-4-(pentafluorofenox¡)butano¡l]ox¡} prop¡l](met¡l)ammo}feml)d¡azeml]-1,3-benzot¡azol-6-¡l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-6,]d¡p¡rrol-2-¡l]carboml]benzo[1,2-6:4,3-6']d¡p¡rrol-2-carboxam¡da (72)
Figure imgf000046_0001
El compuesto 71 (0,56 g, 0,49 mmol) se secó por coevaporación con DMF anhidra y luego se volvió a disolver en una porción fresca (10 mL) de DMF. Se añadieron trietilamina (0,3 mL), N-metilimidazol (0,1 mL) y anhídrido succínico (0,10 g, 1,0 mmol) y la reacción se agitó a 50°C durante 7 h hasta que no se encontró material de partida por análisis de HPLC. La reacción se enfrió y se trató con trietilamina (0,2 mL) y PFP-TFA (0,21 mL, 1,22 mmol). Tras agitar durante 2 h, la reacción se concentró a presión reducida y el semisólido resultante se resuspendió en metanol frío (50 mL). El material insoluble se recogió por filtración, se lavó con metanol (3*10 mL) y se secó para obtener 0,642 g (93%) de éster PFP 72 como sólido rojo-púrpura. 1H NMR (DMSO-d6) 811,78 (s, 1H), 11,64 (s, 1H), 8,45 (br t, 1H), 8,32 (s, 1H), 8,20 (m, 2H), 8,08 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,86 (d, J=9 Hz, 2H), 7,76 (br d, J=6,9 Hz, 1H), 7,4­ 7,25 (m, 11H), 7,08 (s, 2H), 6,97 (d, J=9,3 Hz, 2H), 6,88 (d, J=8,4 Hz, 4H), 4,65 (t, J=7,5 Hz, 2H), 4,22 (t, J=6,3 Hz, 2H), 4,14 (t, J=5,4 Hz, 2H), 3,72 (s, 6H), 3,67 (m, 2H), 3,40 (m, 2H), 3,28 (m, 4H), 3,15 (s, 3H), 3,07 (t, J=6 Hz, 2H), 2,96 (t, J=6 Hz, 2H), 2,79 (t, J=6 Hz, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,54 (m, 4H), 1,33 (m, 4H).
Preparación del soporte de poliestireno ID #480
Figure imgf000046_0002
A una solución de 72 (0,12 g, 0,14 mmol, 17 umol/g de oferta) y trietilamina (0,5 mL) en 25 ml de DMF se añadió un soporte de aminometilpoliestireno (33 umol/g de capacidad amínica, Applied Biosystems, PN 360865C) (5,0 g). La suspensión se agitó en un agitador orbital durante 22 h y luego se filtró y se lavó con DMF. Para bloquear los aminogrupos sin reaccionar, el soporte se suspendió en piridina (22,5 mL), se trató con anhídrido acético (2,5 mL) y se agitó durante 30 minutos. Los reactivos de bloqueo se eliminaron por filtración y el soporte se lavó con varias porciones de 50 mL de DMF y acetona, seguido de un secado a presión reducida para obtener el soporte de poliestireno ID #480 como un sólido de color púrpura claro. La carga de DMT fue de 16,1 pmol/g según una prueba colorimétrica de escisión del ácido.
Ejemplo 6. Preparación de una fosforamida DSQ
W-efox/c3rbon/7-W-(6-(bis-(4-metoxifeml))(feml)metoxihex-1-il)-3-(etoxicarboml)-3,6,7,8-tetrahidro-6-[[3-(etoxicarboml)-3,6,7,8-tetrahidro-6[(2-[fE)-(4-{[3-(acetil)propil](metil)ammo}feml)diazeml]-1,3-benzotiazol-6-il)carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-il]carboml]benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxamida (73)
Figure imgf000047_0001
A una suspensión del compuesto 70 (0,88 g, 0,74 mmol) en una solución de trietilamina (1 mL) y N,N-dimetilaminopiridina (0,054 g) en 13 mL de DMF anhidra se añadió con agitación a 50°C 1 mL de dietilpirocarbonato. Se añadieron cinco porciones más de dietilpirocarbonato por un total de 6 mL en el transcurso de 6 h. Se dejó que la reacción continuara a temperatura ambiente durante 2 días más y luego se concentró y se dividió entre CH2Cl2 y agua. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró. El residuo obtenido se cromatografió sobre sílice eluyendo con acetona en acetato de etilo (0 - 5%). La concentración de las principales fracciones del producto permitió obtener 0,7 g de un sólido amorfo de color púrpura. el análisis de 1HRMNindicó la presencia de dos compuestos, uno de los cuales probablemente sea el compuesto 73 protegido con trietoxicabonil deseado (aprox.
66%) y el otro el producto de ciclización dioxoimidazo (aprox. 33%), como se muestra en la Figura 9. Esta mezcla se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
W-efox/car6on/7-W-(6-h¡drox¡hex-1-¡l)-3-(etox¡carboml)-3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[[3-(etox¡carboml))-3,6,7,8-tetrah¡dro-6[(2-[(E)-(4-{[3-(acet¡l)prop¡l](met¡l)ammo}feml)d¡azeml]-1,3-benzot¡azol-6-¡l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-6']d¡p¡rrol-2-¡l]carboml]benzo[1,2-6:4,3-6']d¡p¡rrol-2-carboxam¡da (74)
Figure imgf000047_0002
Se añadió metanol (3 mL) y agua (0,06 mL) a una solución de 73 (0,7 g, 0,52 mmol) en CH2Ch (12 mL), seguida de ácido trifluoroacético (0,12 mL). Tras mantenerla a temperatura ambiente durante 10 minutos, la reacción se apagó añadiendo 0,24 mL de trietilamina y se concentró. El residuo obtenido se cromatografió sobre sílice eluyendo con acetona-acetato de etilo 3:4. La concentración de las principales fracciones del producto permitió obtener 0,52 g de un sólido amorfo de color púrpura oscuro. el espectro de 1H RMN era consistente con que el producto era una mezcla del 74 deseado y el análogo del dioxoimidazo (FIG. 9). Esta mezcla se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
W-efox/car6on/7-W-(6-{(c¡anometox¡)[d¡(propan-2-¡l)ammo]fosfaml}ox¡hex-1-¡l)-3-(etox¡carboml)-3,6,7,8-tetrah¡dro-6-[[3-(etox¡carboml)-3,6,7,8-tetrah¡dro-6[(2-[(E)-(4-([3-(acet¡l)prop¡l](met¡l)ammo}feml)d¡azeml]-1,3-benzot¡azol-6-¡l)carboml]benzo[1,2-b:4,3-6']d¡p¡rrol-2-¡l]carboml]benzo[1,2-6:4,3-6']d¡p¡rrol-2-carboxam¡da (75)
Figure imgf000048_0001
A una solución de 74 (0,51 g, 0,5 mmol) en 10 mL de CH2CI2 anhidro se añadió tetrazolida de diisopropilamonio (0,077 g) seguida de 0,21 g (0,66 mmol) de 2-cianoetil N,N,N',N'-tetraisopropilfosforodiamidita. La reacción se agitó durante 3 h y luego se diluyó con CH2Ch (100 mL) y se extrajo con 50 mL de NaHCO3 saturado. La fase orgánica se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4. La concentración del extracto dio una espuma sólida amorfa que se volvió a disolver en una pequeña cantidad (aprox. 6 mL) de acetato de etilo y luego se diluyó con hexano (100 mL). El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con hexano y se secó para obtener 0,56 g de fosforamidita 75 como mezcla con el análogo de dioxoimidazo que se muestra en la Figura 9. 31P NMR (DMSO-d6) 8 145,90, 145,87.
Ejemplo 7. Preparación de conjugados de oligonucleótidos por modificación postsintética de oligonucleótidos con cola de amina
Acido 2-{fE)-[4-fenil-2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazenil}-1,3-benzotiazol-6-carboxilico (76)
Figure imgf000048_0002
Se añadió ácido nitrosilsulfúrico al 40% (0,8 mL) en el transcurso de 1 min a una suspensión agitada de ácido 2­ amino-1,3-benzotiazol-6-carboxílico (0,625 g, 3,22 mmol) en una mezcla de ácidos acético (8 mL) y propiónico (8 mL) a aproximadamente 5°C. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h antes de utilizarla en la siguente etapa. Una solución de ácido sulfámico (0,1 g) en agua (30 mL) se combinó con una solución de 52 (0,89 g, 3,87 mmol) en metanol (30 mL). La emulsión resultante se enfrió a unos 5°C y luego se añadió lentamente (unos 2 minutos) a la sal de diazonio de la primera etapa. La mezcla púrpura obtenida se agitó a 0-4°C durante 2 h, a temperatura ambiente durante 1 h, luego se diluyó con agua (300 mL) y se filtró para recoger el producto precipitado. El precipitado se lavó con agua y se secó para obtener 0,69 g (49%) de colorante crudo 76 como sólido negro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,25 (br s, 1H), 8,54 (s, 1H), 8,32 (m, 2H), 7,98 (d inactivado, J=8,7 Hz, 1H), 7,87 (d inactivado, J=8,7 Hz, 1H), 7,63 (m, 3H), 3,95(m, 2H), 3,63 (m, 2H), 2,09 (m, 4H).
2-{fE)-[4-fenil-2-(pirrolidin-1-il)-1,3-tiazol-5-il]diazenil}-1,3-benzotiazol-6-carboxilato de pentafluorofenilo (77)
Figure imgf000049_0001
El ácido 76 (0,69 g, 1,58 mmol) se secó primero por coevaporación con DMF (20 mL) complementado con trietilamina (0,5 mL) y luego se volvió a disolver en una mezcla de CH2Ch (20 mL) y trietilamina (0,5 mL). Se añadió PFP-TFA (0,4 mL, 2,33 mmol) en una porción. La reacción se agitó durante 1 h y luego se concentró y el sólido obtenido se resuspendió en metanol frío (20 mL). El precipitado resultante se recogió por filtración, se lavó con metanol (2x5 mL) y se secó a presión reducida para obtener 0,76 g (80%) de éster PFP 77 como sólido negro. 1H NMR (CDCla) 88,65 (s, 1H), 8,40 (m, 2H), 8,21 (d inactivado, J=8,4 Hz, 1H), 8,03 (d inactivado, J=8,4 Hz, 1H), 7,55 (m, 3H), 4,00 (m, 2H), 3,57 (m, 2H), 2,18 (m, 4H).
Acido 3,6,7,8-tetrahidro-6-[(2-{(E)-[4-feml-2-(pirroNdm-1-N)-1,3-tiazol-5-N]diazeml}-1,3-benzotiazol-6-M)carboml] benzo[1,2-6:4,3-6']dipirrol-2-carbox¡Mco (78)
Figure imgf000049_0002
A una solución de ácido 3,6,7,8-tetrahidro-benzo[1,2-b:4,3-b']dipirrol-2-carboxílico (0,25 mmol) en 2 mL de DMF se añadieron 0,5 mL de trietilamina seguidos de 0,15 g (0,25 mmol) de éster PFP 77. La mezcla se agitó durante unos minutos para obtener una solución casi completa antes de que comenzara la precipitación del producto. La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3h, después se concentró en un rotavapor y el residuo negro resultante se resuspendió en metanol (7 mL). El precipitado obtenido se recogió por filtración, se lavó con metanol (2x2 mL) y se secó a presión reducida para obtener 0,158 g (100%) del compuesto 78 (sal de trietilamonio parcial) como un sólido negro. 1H NMR(DMSO-d6) 811,69 (br s, 1H), 8,32 (m, 2H), 8,23 (s, 1H), 7,92 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,61 (m, 4H), 7,27 (br s, 1H), 6,93 (s, 1H), 4.17 (t, J=7,8 Hz, 2H), 3,92 (m, 2H), 3,61 (m, 2H), 3,25 (t, J=8,1 Hz, 2H), 2,76 (m, 2,5H, Et3NH+), 2,08 (m, 4H), 1,06 (t, J=7,2 Hz, 4,1H, Et3NH+).
3,6,7,8-tetrahidro-6-[(2-{(E)-[4-feml-2-(pirroMdm-1-M)-1,3-tiazol-5-M]diazeml}-1,3-benzotiazol-6-il)carbonil]benzo[1,2-6:4,3-b']d¡p¡rrol-2-carbox¡lato de pentafluorofenilo (79)
Figure imgf000049_0003
Se añadió PFP-TFA en dos porciones de 0,05 mL durante 2 h a una solución de 78 (0,154 g, 0,25 mmol) y trietilamina (0,1 mL) en 5 mL de DMF anhidra. La solución inicial se convirtió en una suspensión al final de este tiempo. La suspensión se enfrió en hielo, el material insoluble se enfrió por filtración, se lavó con metanol y se secó para obtener 0,15 (76%) de éster PFP 79 como un sólido metálico negro. 1H NMR (DMSO-d6) 812,52 (s, 1H), 8,32 (m, 2H), 8,26 (s, 1H), 7,94 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,68 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,61 (m, 3H), 7,55 (s, 1H), 7,38 (br s, 1H), 4,22 (t, J=7,8 Hz, 2H), 3,93 (m, 2H), 3,62 (m, 2H), 3,25 (t oscurecido por la señal de agua, J=8,1 Hz, 2H), 2,08 (m, 4H).
Conjugación postsintética de los grupos DSQ por reacción del octadeoxitimidilato modificado con 6-amino-2-hidroxihexilo con los ésteres PFP 44, 77, 79 y Dabcyl
A una solución de 3'-(6-amino-2-hidroxihexil)-octadeoxitimidilato (aprox. 60 nmol), que se había preparado mediante síntesis de oligonudeótidos a partir del soporte PS ID # 394 (Ejemplo 2) seguido de purificación por HPLC C18 utilizando tampón de bicarbonato de trietilamonio, en 20 pL de DMSO se añadieron 0,7 mg (1,1 nmol) de ésteres de PFP 44, 77 o 79 y 0,5 pL de trietilamina. Tras mantenerse a temperatura ambiente (55°C en el caso del éster PFP 79) durante 20 h, la reacción se diluyó con tampón 1*HPLC, se centrifugó para centrar el éster PFP no reaccionado y se cromatografió en una columna C18 HPLC eluyendo con un gradiente de CH3CN en tampón de bicarbonato de trietilamonio 0,1 M (pH ~9). El pico de producto se recogió y se secó en un concentrador de vacío SpeedVac a presión reducida. La conjugación con dabcil utilizando el éster Quencher-470 PFP (ELITechGroup Inc., producto # M830572) se realizó de forma análoga. Las identidades y la pureza de los productos se confirmaron mediante espectrometría de masas ESI.
Ejemplo 8. Espectros de absorción de conjugados de octadeoxitimidilato ejemplares de la divulgación Los espectros de absorción de varios compuestos de acuerdo con realizaciones preferentes de la presente divulgación conjugados con octadeoxitimidilato, como se muestra en la Figura 11, se obtuvieron utilizando la instrumentación y las condiciones de medición descritas en la Tabla 4 a continuación.
Tabla 4
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Las FIG. 11A - 11C muestran los espectros de absorción UV-VIS de conjugados de oligonucleótidos representativos de acuerdo con las realizaciones preferentes.
Ejemplo 9. Síntesis de oligonucleótidos
Todos los oligonucleótidos y conjugados de oligonucleótidos utilizados en los Ejemplos 10-14 se sintetizaron utilizando la instrumentación, la síntesis y las condiciones de purificación descritas en la Tabla 5, dada a continuación.
Tabla 5
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La espectrometría de masas para los conjugados d(T8)-3'-DSQ se enumeran en la Tabla 6, dada a continuación.
Tabla 6. Resumen de la espectroscopia de masas ESI de los conjugados d(T8)-3'-DSQ
Figure imgf000051_0002
Ejemplo 10. Desnaturalización térmica de las sondas TaqMan marcadas con DSQ
Para evaluar las propiedades estabilizadoras de dúplex y de apagado de fluorescencia de los nuevos derivados de DSQ, se investigaron dos sondas TaqMan marcadas con FAM o AP525. Las sondas (200 nM) FAM-5'-G*CAGGTTCCGTTTG-DSQ (SEQ ID NO:1) o AP525-5'-G*ACCACGTACCGCATTG-DSQ (SEQ ID NO:2) se hibridaron en un tampón de PCR con 1 pM del complemento respectivo (complemento FAM: 5'-TCAAAACCGGAACCTGCT (SEQ ID NO:3); complemento AP525: TCAATGCGGTACGTGGTCT (SEQ ID NO:4) calentando brevemente la solución a 80°C, enfriando a 20°C, y luego aumentando a 90°C mientras se monitorea la fluorescencia. La fluorescencia de fondo se midió a 90°C, temperatura a la que todos los dúplex se han desnaturalizado completamente. La instrumentación y las condiciones de medición fueron las indicadas en la Tabla 7. Los resultados se resumen en las FIG. 12 y 13.
Tabla 7. Instrumentación y condiciones experimentales
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La FIG. 12 muestra una comparación de la temperatura de fusión para los dúplex formados entre dos sondas de ADN y sus respectivas dianas complementarias. Las sondas están marcadas con varios derivados ejemplares de DSQ en el extremo 3' y uno de los fluoróforos, FAM o AP 525, en el extremo 5'. Como referencia, las sondas (ID # 385), que tienen la estructura tradicional del MGB y del quencher (CDPI3 quencher Eclipse, FIG. 18), también se incluyen en la comparación. Es evidente que las sondas con ciertos derivados de DSQ (por ejemplo, modificación ID # 473, 477, 480, 485) tienen temperaturas de fusión que son iguales o superan los valores de las sondas de referencia. Esto confirma que el MGB truncado (CDpI2 en este caso) puede recuperar toda su capacidad estabilizadora de dúplex cuando se amplía con ciertos tipos de derivados diaril-azo de Fórmula I. En particular, las sondas etiquetadas con DSQ ID # 485 superan a las sondas de referencia (ID # 385) indicando que, al menos en este contexto de secuencia particular, los grupos diaril-azo aportan más a la estabilidad del dúplex que la unidad CDPI desplazada. Los derivados DSQ estabilizadores de dúplex menos eficientes (ID # 479, 481, 483) contenían un anillo de fenilo 1,4-sustituido o un anillo de N-metilpirrol 2,4-sustituido como grupo Ar1 de la fórmula III. Este último resultado es inesperado a la vista del informe de Ong et al. (2012) sobre las propiedades 4-(1 -metilpirrol-2- il)azo-1 -metilpirrol-2-carboxilatos.
La FIG. 13 aborda las propiedades de extinción de la fluorescencia de las realizaciones preferentes de los derivados DSQ. En este ensayo, la fluorescencia de fondo de las sondas no hibridadas es la medida de la eficacia del quenching. Como se esperaba, los derivados con el mejor solapamiento espectral entre la emisión del fluoróforo (máximo de emisión FAM - 515 nm, máximo de emisión AP525 - 549 nm) y la absorción del quencher (FIG. 11) demuestran la menor fluorescencia de fondo, confirmando así que el principal apagado se produce a través del mecanismo FRET (Didenko (2001)). Algunos análogos de DSQ (por ejemplo, SDQ ID # 476, 477, 478 y 480) tienen la fluorescencia de fondo tan baja o más baja que el quencher Eclipse de referencia (parte de la modificación ID # 385). Estos resultados confirman que las propiedades generales de extinción de los compuestos aril-azo no se ven afectadas por la incorporación a la estructura DSQ según las declaraciones de la presente memoria.
Ejemplo 11. Análisis de fusión por fluorescencia de los dúplex d(T8)-DSQ/FAM-d(A8CC)
Para evaluar el efecto estabilizador del dúplex de los derivados representativos de DSQ en un contexto de secuencia rica en A/T, se investigó un dúplex corto d(T8)/d(A8CC) mediante un análisis de fusión por fluorescencia. los conjugados 3-DSQ-TTTTTTTT (d(T8)-DSQ) se combinaron con el complemento (5-FAM-AAAAAAAACC (SEQ ID NO:5)) en el tampón especificado en la Tabla 8 y la solución se equilibró a 10°C, y las curvas de disociación se adquirieron monitorizando la fluorescencia de 10-70°C a una rampa de 1°C/min. La desnaturalización del dúplex se monitorizó detectando el cambio de fluorescencia a lo largo de una rampa térmica. La temperatura de fusión (Tm) se calculó encontrando el máximo de la segunda derivada de la curva de fusión en bruto. La instrumentación y las condiciones de medición fueron las indicadas en la Tabla 8. Los resultados se resumen en la Tabla 9 y la Figura 14.
Tabla 8. Instrumentación y condiciones experimentales
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Tabla 9
Figure imgf000053_0001
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La FIG. 14A muestra los efectos de varios ligandos DSQ en la estabilidad del dúplex d(T8)/d(A8) y FIG. 14B muestra los efectos de varios ligandos DSQ en la temperatura de fusión del dúplex d(T8)/d(A8), otra demostración de las propiedades estabilizadoras del dúplex de los nuevos derivados DSQ. En este ejemplo, se utiliza un dúplex corto d(T8)/d(A8CC) para realzar las diferencias entre los derivados. Como control, también se incluye un oligonucleótido d(T8) marcado con CDPh. El complemento d(A8CC) está marcado con un grupo de fluoresceína en el extremo 5', que se apaga en la forma dúplex y no se apaga tras la desnaturalización del dúplex, lo que permite la detección de la fusión por fluorescencia. Se puede observar que los análogos de DSQ, compuestos por ciertos restos aril-azo y dos unidades CDPI (por ejemplo, DSQ ID # 473, 475, 477, 478, 479, 480, 483, 485 y 486), superan al conjugado CDPh de control, confirmando así que el resto aril-azo contribuye efectivamente a la estabilización del dúplex según las declaraciones de la presente memoria. En un ejemplo, el conjugado DSQ ID # 484, que tiene un resto de diarilazo acoplado a una sola unidad de CDPI, supera a los conjugados CDPh de control, mostrando que esta estructura particular tiene una afinidad especialmente alta por el dúplex de ADN.
Ejemplo 12. Evaluación del efecto de la secuencia en la estabilización del dúplex por DSQ ID # 477
Para establecer la contribución estabilizadora de la resto DSQ (ID # 477) al dúplex, se evaluaron secuencias (Tabla 11) con contenido variable de G/C en la región de unión inferida de la resto DSQ. A modo de comparación, también se ensayaron oligonucleótidos marcados con CDPh (ID # 482), CDPh (ID # 391), MGB-Quencher (ID # 385) y no modificados. Los dúplex se calentaron brevemente hasta los 80 °C, se equilibraron a 20 °C y luego se incrementaron hasta los 70 o 90 °C mientras se monitorizaba la absorbancia UV. La instrumentación y las condiciones de medición fueron las indicadas en la Tabla 10. Los resultados se resumen en la Tabla 11 y en la FIG. 15.
Tabla 10. Instrumentación y condiciones experimentales
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Tabla 11
Figure imgf000055_0002
Para demostrar que las nuevas moléculas DSQ pueden estabilizar dúplex de ADN con un contexto de secuencia diferente, la prueba mostrada en la FIG. 15 y la tabla 10. Se preparó un conjunto de conjugados de oligonucleótidos de DSQ (ID # 477) con diferente contenido de G/C en la región putativa de unión a DSQ. A modo de comparación, también se ensayaron oligonucleótidos marcados con CDPh (ID # 482), CDPh (ID # 391), MGB-Quencher (Id # 385) y no modificados. En todos los casos, excepto en dos, el ligando DSQ superó al resto COPh de control hasta en 10 °C, confirmando así los resultados anteriores con los conjugados T8 (Ejemplo 11). Las dos secuencias (SEQ ID NO:9 y SEQ ID NO:12) con temperaturas de fusión del CDPh inferiores a las del control tenían una estructura secundaria interna significativa, sobreestabilizada por la presencia del resto DSQ, como se muestra en la FIG. 15 Este tipo de estructura secundaria estabilizada por el MGB es esperable y debe evitarse mediante un análisis exhaustivo de la secuencia. Aparte de los dos valores atípicos, los resultados obtenidos confirman que los nuevos derivados de DSQ son adecuados para la estabilización de dúplex de ADN de varias secuencias y contenido G/C.
Ejemplo 13. PCR en tiempo real con sondas TaqMan marcadas con DSQ
Para evaluar el rendimiento de la PCR de los nuevos derivados de DSQ, se realizó la PCR utilizando dos sondas TaqMan marcadas con DSQ (ensayo TaqMan). La formulación del monorreactivo de PCR y las condiciones de PCR se muestran en la Tabla 12. Los resultados se resumen en la Tabla 13 y en la FIG. 16.
Tabla 12
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Tabla 13. Resumen de los datos de la PCR
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La FIG. 16 muestra el rendimiento de la PCR de conjugados representativos de la divulgación. Dos sondas TaqMan, una (KPC) marcada con FAM y la otra (IC2) con AP525 en el extremo 5' (FIG. 12), se sintetizaron utilizando los soportes de síntesis de ADN descritos en esta memoria. Como control, también se sintetizaron las mismas dos sondas utilizando el reactivo tradicional MGB-Quencher (modificación ID # 385). La amplificación del ADN diana se realizó en presencia de las sondas, los cebadores específicos de la diana y la Taq polimerasa. Para evaluar el rendimiento, se compararon el ciclo umbral (Ct), la fluorescencia de referencia (fondo), la señal de fluorescencia (fluorescencia en el ciclo 45) y la relación señal/fondo, como se resume en la Tabla 12 y la FIG. 16. Basándose en los valores Ct, las nuevas sondas proporcionaron una eficacia de amplificación y una sensibilidad general de la prueba similares a las de la sonda de control, con valores Ct que generalmente varían dentro de un ciclo de amplificación. La fluorescencia de fondo, a excepción de las DSQ ID 473 y 475, fue igual o inferior al fondo de la sonda de control. Como consecuencia del bajo fondo, algunas de las nuevas sondas DSQ demostraron una mejor relación señal/fondo (por ejemplo, DSQ ID # 476, 477, 478 y 480). Estos resultados demuestran que los nuevos derivados de la DSQ son adecuados para las aplicaciones de la PCR, con un rendimiento comparable o mejor que el de la tecnología tradicional.
La amplificación y detección simultánea de múltiples dianas es un requisito esencial para las aplicaciones de PCR multiplex. Esto sólo se puede habilitar si se combinan múltiples fluoróforos con una amplia gama de espectros de emisión en una reacción de PCR. Para demostrar que los nuevos derivados de DSQ también son adecuados para aplicaciones de PCR con fluoróforos desplazados al rojo, se realizó un experimento en el que se marcó la sonda KPC con el colorante AP593 (emisión máxima de 613 nm) o AP639 (emisión máxima de 655 nm) en el extremo 5' y el DSQ ID # 477 en el extremo 3'. Los resultados obtenidos (resumidos en la Tabla 12) confirmaron que la diana KPC se amplificó con éxito y se detectó eficazmente con valores Ct, fluorescencia de fondo y relaciones señal/fondo similares o mejores a los de la sonda marcada con FAM.
Ejemplo 14. Evaluación de la fluorescencia desencadenada por la hibridación de las sondas marcadas con DSQ
Para evaluar las propiedades fluorogénicas de los oligonucleótidos de Fórmula VII, se evaluó la fluorescencia dúplex a 50°C (Señal), la fluorescencia de una sola hebra a 50°C (Fondo) y la relación señal/fondo (S/B) de dos oligonucleótidos marcados en el extremo 5' con DSQ ID # 473 y fAm -HEG (ELITechGroup Inc, producto #M830100) o AP525-HEG (ELITechGroup Inc., producto # M100104) fueron sintetizados y probados. Para generar una señal fluorescente se hibridaron los DSQ-Fa M (o AP525) -5'-TAAAAGGTGTAC (SeQ ID NO:24) (200 nM) en un tampón de PCR con 1 pM del complemento (TTGTACACCTTTTATT (SEQ ID NO:25)) calentando brevemente la solución a 80 °C, enfriando a 20 °C, y luego subiendo a 90 °C mientras se monitoriza la fluorescencia. El fondo se midió en ausencia de complemento. La instrumentación y las condiciones de medición fueron las indicadas en la Tabla 14. Los resultados se resumen en la Tabla 15 y en la FIG. 17A -17B.
Tabla 14
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Tabla 15
Figure imgf000058_0002
Los nuevos derivados de la DSQ también pueden utilizarse para la preparación de sondas y cebadores de hibridación, que dependen de la separación espacial entre las moléculas de enfriamiento y fluorescentes durante la hibridación con la diana para generar una señal fluorescente. En una configuración particular, las moléculas DSQ y fluoróforo se colocan en el mismo extremo de un oligonucleótido. En esta configuración, la separación espacial entre el quencher y el fluoróforo se consigue a través de la unión del DSQ dentro del surco menor del dúplex. Dichos conjugados pueden sintetizarse partiendo de un soporte de síntesis DSQ, seguido de un fosforamidito fluoróforo adecuado para la incorporación interna (por ejemplo, los fosforamiditos FAM-HEG y AP525-HEG disponibles en ELITechGroup Inc.), y luego una secuencia de oligonucleótidos. FIG. 17A y 17B muestran los resultados de un experimento de fusión térmica con dicho oligonucleótido fluorogénico etiquetado con el DSQ ID # 473 en combinación con el fluoróforo FAM o AP525. Debido a su espectro de absorción desplazado hacia el azul (FIG. 11), esta DSQ se basa principalmente en el enfriamiento por contacto ((Patente US no 6.150.097) en su estado monocatenario. El enfriamiento se elimina al confinar el DSQ en la ranura menor. Como resultado, tales oligonucleótidos demuestran una buena señal de fluorescencia y una buena relación señal/fondo (Tabla 14) y son útiles como cebadores o sondas fluorogénicas dependiendo de si el 3'-hidroxilo está presente' o bloqueado.
REFERENCIAS CITADAS
Documentos de patentes estadounidenses y extranjeras
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20130030166F
Patente US no
RE 38,416
3.996.345
5,419,966
5,512,667
5,585,481
5,696,251
5,736,626
5,801,155
5,942,610
6,150,097
6,312,894
6,323,337
6,399,392
6.492.346
6,699,661
6,699,975
6,727,356
6,790,945
6,821,727
6,972,339
7,019,129
7,166,715
7,205, 105
7,262,007
7,381,818
7,439,341
7, 564-567
7,582,739
7,767,834
7, 759, 470
7,803,536
7,879,986
7,790,385
8,163,910
8,586,759
8,637,658
9,056,887
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un reactivo quencher para el etiquetado de oligonucleótidos que tiene la fórmula:
Figure imgf000066_0001
en la que Ar1 y Ar2 son moléculas aromáticas o heteroaromáticas;
X es hidroxilo, un grupo saliente, un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido, o un enlazador conectado a un soporte sólido de síntesis; y
n es de 1 a 3.
2. El reactivo quencher de la reivindicación 1, en el que uno o ambos de Ar1 y Ar2 están sustituidos con un grupo reactivo, un enlazador con un grupo funcional o un grupo funcional protegido, o un enlazador conectado a un soporte sólido de síntesis.
3. El reactivo quencher de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:
Figure imgf000066_0003
en las que Ar2 es un anillo aromático o hetero-aromático con un grupo amino exocíclico.
4. El reactivo quencher de la reivindicación 1, en el que el grupo amino exocíclico está sustituido con uno o dos de entre un alquilo, un enlazador con un grupo funcional o grupo funcional protegido, o un enlazador conectado a un soporte sólido de síntesis.
5. El reactivo quencher de la reivindicación 4, que tiene la fórmula:
Figure imgf000066_0002
O
Figure imgf000067_0001
en las que X es hidroxilo, -OPFP, o un grupo saliente, y n es 1 o 2.
6. Un procedimiento de preparación de un conjugado de oligonudeótidos marcado con un quencher, que comprende: hacer reaccionar un oligonucleótido con el reactivo quencher de las reivindicaciones 1-5 para producir un conjugado de oligonucleótidos marcado con un quencher.
7. Un conjugado de oligonucleótidos que comprende un compuesto que apaga la fluorescencia y que tiene la fórmula
Figure imgf000067_0002
en las que ODN es un oligonucleótido;
L es un grupo enlazador que tiene de 0 a 100 átomos de cadena principal seleccionados entre C, N, O, S, P y Si, en el que L puede incluir grupos acíclicos, cíclicos o aromáticos, o combinaciones de los mismos; Ar1 y Ar2 son restos aromáticos o heteroaromáticos;
R7 es hidroxilo, un grupo enlazador o un grupo bloqueador; y
n es de 1 a 3.
8. El conjugado de oligonucleótidos de la reivindicación 7, en el que el oligonucleótido comprende además un fluoróforo conectado al oligonucleótido, o en el que el oligonucleótido comprende además un ligante de surco menor conectado al oligonucleótido, o en el que el oligonucleótido comprende una o más nucleobases modificadas o bases modificadas.
9. El conjugado de oligonucleótidos de la reivindicación 7, en el que L está conectado al oligonucleótido en un extremo 3' o en un extremo 5', o en el que L está conectado al oligonucleótido en una posición distinta de un extremo 3' o 5'.
10. Un procedimiento de detección de una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra, que comprende: poner en contacto la muestra con el conjugado de oligonucleótidos de la reivindicación 8, en el que el conjugado de oligonucleótidos tiene una secuencia de ácido nucleico al menos parcialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, y en el que el conjugado de oligonucleótidos comprende además un fluoróforo; y
detectar una señal fluorescente resultante de la hibridación del oligonucleótido conjugado con la secuencia de ácido nucleico diana.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la señal fluorescente se genera por acción de una polimerasa que tiene actividad de 5'-nucleasa.
12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el conjugado de oligonucleótidos es un cebador o una sonda.
13. El procedimiento de la reivindicación 10, comprende además la etapa de amplificar la secuencia de ácido nucleico diana.
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