JP5019688B2 - 蛍光消光検出試薬及び方法 - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、改善された特性を有するオリゴヌクレオチド−クエンチャ−蛍光−染料接合体と、新規なクエンチャ及び蛍光染料部分をオリゴヌクレオチドに導入するのに適した試薬とに関する。本発明は、更に、オリゴヌクレオチド−クエンチャ−蛍光−染料接合体の核酸標的の検出法における使用にも関する。
【０００２】
２．関連技術の簡単な説明
合成オリゴヌクレオチドが、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ標的用の配列特異的プローブとして長年使用されてきた。これらの方法は、特定の核酸標的の同定と定量化とを可能にするため、法廷科学、分子生物学、及び医学診断において広く利用されている。ＤＮＡプローブの初期の使用法は、標識としての放射性（通常³²Ｐ）に基くものであった。これに対して最近の方法は、化学発光及び蛍光基を含むレポータ分子を使用している。装置の改良によって、これらの分光法的方法の感度が、前記放射標識法の感度に近づく又はそれを凌駕することが可能になった。最近開発された検出法は、プローブハイブリダイゼーションの検出のために、蛍光強度を直接検出する代りに、蛍光共鳴エネルギ転移（ＦＲＥＴ）のプロセスを使用する。このタイプのアッセイにおいて，ＦＲＥＴは、供与フルオロフォア（レポータ）と受容分子（クエンチャ）間において、そのクエンチャ分子の吸収スペクトルが供与フルオロフォアの発光スペクトルとオーバラップし、それら二つの分子が互いに近接している時に、起こる。供与フルオロフォアの励起状態エネルギは、共鳴ダイポール誘導ダイポール相互作用によって隣接する受容体へと転移され、その結果、供与蛍光の消光が起こる。もしも受容分子がフルオロフォアである場合、その蛍光発光は時に増大することがある。供与分子と受容分子との間のエネルギ転移の効率は、これら分子間の距離に大きく依存する。この関係を記載する等式は公知である。フォルスター（Forster)距離（Ｒ₀）は、エネルギ転移が５０％の効率である場合の、供与分子と受容分子との間の距離として記載される。衝突及び電荷転移消光等の、蛍光消光のその他のメカニズムも公知である。
【０００３】
通常、ＦＲＥＴに基く検出法は、その供与蛍光の消光を効率的にするため、供与フルオロフォアと受容分子とが互いに近接する状態になるように構成される。アッセイ中、供与分子と受容分子とは分離され蛍光発光が起こる。ＦＲＥＴに基づく検出アッセイは、核酸ハイブリダイゼーション及び酵素学の分野で開発された。いくつかの形式のＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイがレビューされている(Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, Inc., San Diego 1992, pp.311-352)。
【０００４】
その発見以来、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学を革新してきた。この技術は、特定のＤＮＡ配列の増幅を可能にし、これによって、単一のＤＮＡ標的コピーからＤＮＡプローブアッセイを行うことを可能にする。ＰＣＲ式診断アッセイは、最初は、一般的には使用されなかった。その理由の一つは、サンプルの取り扱いと、非ソースＤＮＡの混入の可能性の問題があるためである。最近、分光蛍光測定サーマルサイクラを使用してＰＣＲの進行をそれの発生している状態で検出する（「リアルタイム」ＰＣＲ検出）ことが可能な、新しい均質な蛍光式ＤＮＡアッセイが記載されている。二つの一般的に使用されているアッセイ方式は、ＤＮＡ増幅が起こる時に蛍光発光性となるＤＮＡプローブを使用する（蛍光発生プローブ）。
【０００５】
「リアルタイム」ＰＣＲのための第１の方式は、「分子ビーコン」として知られているＤＮＡプローブを使用する(チアギ（Tyagi）等、Nat. Biotech.,16:49-53(1998))。分子ビーコンは、クエンチャ染料とレポータ染料とが、そのヘアピンの軸の端部において互いに密に接触しているヘアピン構造を有する。相補的配列とのハイブリダイゼーション時に、前記ヘアピン構造のループが二本鎖となり、クエンチャとレポータ染料とを互いに引き離し、これによって蛍光発光信号を発生する。チアギ（Tyagi）等は、ダブシル(dabcyl)（４−｛［４−（ジメチルアミノ）フェニル］ジアゼニル｝ベンゾイル部分、吸収最大＝４５３ｎｍ）を含む非蛍光発光クエンチャ染料を、広範囲の発光波長（４７５−６１５ｎｍ）の蛍光発光レポータ染料と組み合わせて使用することを報告した。その当時、これは驚くべきことであった。というのは、ＦＲＥＴは、クエンチャの吸収スペクトルが、レポータの発光スペクトルと大幅にオーバラップすることを必要とするからである。ダブシル部分含有（以後、「ダブシル」）クエンチャと或る種の蛍光発光染料の場合、そのスペクトルオーバラップは、極めて低いものであったにも拘わらず、その消光効率は高かった。従って、前記ヘアビン式ビーコンの消光メカニズムはＦＲＥＴではなく、衝突消光（collisional quenching）である、と提案された。事実、前記ヘアビン式ビーコンにおいてクエンチャのＵＶスペクトルが変化し、これは、分子接触、従って、衝突消光の証拠を提供している。関連する検出法は、蛍光発光プローブとしてヘアピンプライマを使用する(ナザレンコ（Nazarenko）等、Nucl. Acid. Res., 25:2516-2521(1997))。
【０００６】
「リアルタイム」ＰＣＲ用の第２の方式は、「５´−ヌクレアーゼプローブ」と称されるＤＮＡプローブを使用する(リー（Lee）等、Nucl. Acid Res., 21:3761-3766(1993))。これらの蛍光発光プローブは、通常、単一ＤＮＡ鎖の３´末端にクエンチャを備え、５´末端にフルオロフォアを備えて作成される。各ＰＣＲサイクル中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５´−ヌクレアーゼ活性によって、前記ＤＮＡ鎖が開裂し、これによって、フルオロフォアをクエンチャから分離し、蛍光発光信号を放出する。前記５´ヌクレアーゼアッセイは、プライマ伸長工程中（６０−６５℃）においてプローブがテンプレート鎖にハイブリダイズすることを必要とする。彼らは、又、一つ以上のフルオロフォア／クエンチャ対を使用して、同じアッセイにおいて一つ以上のポリヌクレオチド配列を同時に「リアルタイム」検出することも開示している。前記５´−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイは、図１に示されている。
【０００７】
当初、５´−ヌクレアーゼプローブは、効率的なＦＲＥＴを得るためには、内部ヌクレオチドの、５´−フルオロフォア（通常は、フルオレセイン（ＦＡＭ）又はテトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ））の間近にクエンチャ（通常は、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））が位置する状態で作られなければならないと信じられていた。後に、これは不要であり、クエンチャとフルオロフォアとは、それぞれ、ＯＤＮの３´末端と５´末端とに位置することが可能であることが判った。溶液中でこれら蛍光発光プローブによって形成されるランダムコイル構造によって、分子が励起状態にある間に、３´−クエンチャ染料が、５´−フルオロフォアのＦｏｒｓｔｅｒ径の中を通過することが許容されると提案されている。
【０００８】
多数の供与／受容対が従来記載されているが、これらの内で本発明にとって重要であるのは、ダブシルであって、これは、例えば、化学センサにおいてダンシルスルホンアミドのクエンチャとして使用される(ロスマン（Rothman）及びスティル（Still）(1999) Med. Chem. Lett.22,509-512)。
【０００９】
驚くべきことに、ダブシルを、５´−ヌクレアーゼプローブや、波長の長いフルオロフォアを使用するその他のＦＲＥＴプローブに使用することについての報告はこれまで公開されていない。上述したように、ダブシルは、ビーコン式プローブに使用されたが、これは、ダブシルとフルオロフォアとが密接接触（衝突消光）状態にある別の消光メカニズムである。ダブシルは、短い（４９０ｎｍ，青色）波長で発光するフルオロフォアＥＤＡＮＳ（５−［（２−アミノエチル）アミノ］ナフタレン−１−スルホン酸）用のクエンチャとして蛍光発光ペプチドに使用された(マトヨシ（Matayoshi）等Science 247:954-958(1990))。ＥＤＡＮＳは、又、ダブシルよりも消光係数が低いので、蛍光消光が効率的であったとしても驚くに値しない。本発明において、初めて、ダブシルをＦＲＥＴ式メカニズムにおいてフルオレセインを消光するのに使用可能であることが判ったのである。
【００１０】
前記５´−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイの他に、ＦＲＥＴメカニズムを使用するその他の方式も開発されている。例えば、一本鎖シグナルプライマが、二つの染料へのリンクによって改変され、その第１染料の蛍光発光が第２染料によって消光されるような、供与／受容染料対が形成された。このシグナルプライマは、標的に対してハイブリダイズした時に、適当な制限酵素が切断する（ｎｉｃｋ）することを許容する制限部位（米国特許第５，８４６，７２６号）を含む。この開裂によって、二つの染料が分離され、消光の減少による蛍光発光の変化が観察される。オリゴヌクレオチドをリガンドに結合させるための非−ヌクレオチド連結試薬も記載さている（米国特許第５，６９６，２５１号）。
【００１１】
ＦＲＥＴシステムは、又、酵素学においても用途を有する。供与／受容染料対が基質に組み込まれたプロテアーゼ開裂可能基質が開発された。酵素による基質の開裂によって供与／需要対が分離され、消光の減少による蛍光発光の変化が観察される。キモトリプシン用（リー（Li）等、Bioconj. Chem., 10:241-245(1999)）,アミノペプチダーゼＰ(ホーソーン（Hawthorne）等, Anal. Biochem., 253:13-17(1997))、ストロメリシン(ビケット（Bickett）等, Ann. N. Y. Acad. Sci., 732: 351-355(1994))及びロイコトリエンＤ₄ヒドラーゼ(ホワイト（White）等, Anal. Biochem., 268: 245-251(1999))用に、開裂可能供与／受容基質が開発されている。リガンドの結合が供与／受容対を分離する化学センサが記載された(ロスマン（Rothman）等. Biorg. Med. Chem.Lett., 9: 509-512 (1999))。
【００１２】
米国特許第５，８０１，１５５号において、共有結合小溝バインダ（ＭＧＢ）を備えたオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）は、非修飾オリゴヌクレオチドよりも、それらの相補的標的に対してより配列特異的であることが開示された。更に、前記ＭＧＢ−ＯＤＮは、非修飾オリゴヌクレオチドと比較した場合、相補的ＤＮＡ標的鎖とのハイブリッド安定性の大幅な増加を示し、より短いオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを可能にする。
【００１３】
上述したＦＲＥＴアッセイを効率的に利用するためには、オリゴヌクレオチドの蛍光発光標識用の試薬が非常に重要である。ＤＮＡマイクロアッセイ等のその他の用途も、蛍光発光標識ＤＮＡプローブ又はプライマを使用するので、蛍光発光ＤＮＡの合成を容易にする改良式試薬が求められている。一般に、ＯＤＮ合成には、ホスホルアミダイト試薬及び固体支持体が広く使用されている。しかし、当該技術の現状においては、蛍光発光基をＯＤＮに導入するためのホスホルアミダイト試薬として市販されているものは多くない。
【００１４】
種々のリガンド基をＯＤＮに付着させるリンカ基は、オリゴヌクレオチド接合体の合成に重要な役割を果す。３´−アミノヘキシル尾オリゴヌクレオチドの合成法(ペトリ（Petrie）等、Bioconj. Chem., 3: 85-87(1992))、三官能基性トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノール基(リード（Reed）等、Bioconj. Chem., 2: 217-225 (1991))、ジグリコール酸（ポン(Pon)等、Nucl.Acids.Res.,25:3629-3635(1997)）、１，３−ジオール試薬（米国特許第５，９４２，６１０号及び第５，４５１，４６３号）そして、非ヌクレオチド三官能基性試薬（米国特許第５，６９６，２５１号）が報告されている。
【００１５】
レゾルフィン及びクマリン誘導体が、チトクロムＰ４５０のイソ酵素を識別するための酵素基質として広く使用されてきた(ホーグランド（Haugland）等, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第６版、Eugene, OR. pp.235-236. 1996)。反応性レゾルフィン類似体が、米国特許第５，３０４，６４５に開示されている。クマリン誘導体の活性化エステルは公知である(ヒルシュバーグ（Hirshberg）等、Biochem., 37: 10391-5 (1998))。プローブに導入されたクマリン−標識化ｄＵＴＰがイン・サイチュ ハイブリダイゼーションに使用された(ウィーガント（Wiegant）等、Cytogenet. Cell Gnet., 63: 73-76 (1993))。オリゴヌクレオチドに標識を導入するためのホスホルアミダイトが米国特許第５，３２８，８２４号及び第５，８２４，７９６号に記載されている。
【００１６】
多くの最近のハイブリダイゼーション用途は、一つ以上のレポータ分子を必要とする。更に、レポータフルオロフォアを、レポータ／クエンチャ対に使用することが可能ではあるが、その大半は、いくつかの望ましくない特性、分離が困難な混合物、正電荷、合成の困難、オリゴヌクレオチド合成中の不安定性、又は、他の望ましいレポータとの発光波長のオーバラップ等の問題を有する。本発明は、これらの望ましくない特性に取り組み、これらの困難のいくつか又は全部を解決する、オリゴヌクレオチドプローブ用の試薬を提供するものである。
【００１７】
発明の要旨
本発明は、４−［４−ニトロフェニル］ジアジニル］フェニルアミン及び／又は４−［４−ニトロフェニル］ジアジニル］−ナフチルアミン構造に基くクエンチャ分子を提供する。これらクエンチャ分子は、一般的に使用されている短い波長域（約４００〜５００ｎｍ）で発光する蛍光発光レポータレポータ基のみならず、中（５２５ｎｍ＝緑色）〜長（６７０＝赤色）の波長に渡る蛍光発光レポータ基に対しても改良されたＵＶスペクトルオーバラップを有する。本発明のクエンチャ発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）は、非蛍光発光で、ＤＮＡ合成試薬に容易に導入され、自動化ＤＮＡ合成、及び保存中に安定しており、ハイブリダイゼーション特性に対する悪影響が無い。更に、より広範囲の波長域に渡って蛍光発光レポータ染料の信号対ノイズ率の改善が観察される。従って、本発明は、従来技術において使用されていたような、消光染料としてのダブシルの使用法(ナザレンコ（Nazerenko）等, Nucl. Acids. res. 25: 2516-21 (1997))に対して大きな利点を提供するものである。
【００１８】
本発明の一態様によれば、４−［４−ニトロフェニル］ジアジニル］フェニルアミン（及び／又は４−［４−ニトロフェニル］ジアジニル）−ナフチルアミン構造）に基く前記クエンチャは、自動化ＤＮＡ合成中におけるそれらの蛍光発光ＤＮＡプローブへの容易な導入を可能にするリンカ構造によって修飾される。本発明は、自動化合成中に前記クエンチャ部分のオリゴヌクレオチドへの導入用の、前記新規なクエンチャ分子から誘導されるホスホルアミダイトの合成、更に、アミノ尾オリゴヌクレオチドへのポスト固相支持体付着用の、前記新規なクエンチャ分子から誘導される試薬の合成も含む。関連態様において、前記新規クエンチャ分子は、それぞれ３´位と５´位とに付着された前記クエンチャを含有する、ピラゾロ−［５，４−ｄ］ピリミジンとピリミジンホスホルアミダイトとを使用してオリゴヌクレオチドに導入される。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、ＤＮＡ合成に適合可能な三種類の蛍光発光試薬タイプが合成又は選択され、ＯＤＮへの導入に適したホスホルアミダイト試薬に変換される。具体的には、１０−フェニル−１，３，５，７，９，１０−ヘキサヒドロビリミジノ［５´，４´−５，６］ピリジノ［２，３−ｄ］ピリミジン−２，４，６，８−テトラオン（ＰＰＴ）構造に基くバイオレット蛍光発光染料と、７−ヒドロキシフェノキサジン−３−オン（レゾルフィン）に基く赤色蛍光発光染料と、クマリンの構造に基く青色蛍光発光染料とが、ホスホルアミダイト試薬に導入される。これらの蛍光発光染料は、他の染料（例えば、フルオレセイン）との組み合わせで、多色蛍光発光分析のための極めて優れた特性を有する。これらの試薬は、蛍光発光の直接検出又はＦＲＥＴ検出方式のいずれかを使用する種々の分析方法に有用である。本発明の関連態様において、前記ＰＰＴ−，クマリン−及びレゾルフィン−ベースのフルオロフォア（蛍光発光染料）は、ＯＤＮの５´末端での「オリゴヌクレオチド−合成後」共有結合付着に適した新規な試薬に変換される。別の態様において、前記新規蛍光発光染料は、それぞれ、３−位置及び５−位置に付着したフルオロフォアを含有する、ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジンとピリミジンホスホルアミダイトを使用したオリゴヌクレオチドに導入される。
【００２０】
本発明の更に別の態様において、共有結合付着された蛍光発光部分と対合する、本発明の前記新規クェンチャ構造と共有結合連結されたＯＤＮが作成される。その結果得られるＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ接合体は、更に、診断アッセイ、特に、対立遺伝子特異的識別が、種々の蛍光発光レポータ分子を備えるプローブのみならず、効率的なクエンチャをも必要とする、一塩基多型（等）のＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイにおける、前記得られたＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢ接合体の結合及び識別特性を改善する、小溝バインダ（ＭＧＢ）も含むことができる。前記ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢ接合体中で本発明によって使用される前記クエンチャは、広い消光波長域を提供し、本発明による或る種の新規なレポータ標識試薬は、改良式多色分析用の異なる発光波長を有する。
【００２１】
上に要約した原理の一用途において、汎用「３´−ヘキサノール」固体支持体（ここに参考文献として合体させるギャンパー（Gamper）等、Nucleic Acids Res., 21: 145-150 (1993)により入手可能）を使用して蛍光発光プローブが作成され、そこでは、本発明のクエンチャホスホルアミダイトが、前記ＯＤＮ配列の第１結合工程（３´−末端）で添加され、フルオロフォア（ＦＬ）が、最終結合工程において付着され、５´−ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ヘキサノール接合体プローブが得られる。
【００２２】
本発明のその他の用途として、前記新規クエンチャの合成方法、及び、前記新規クエンチャを、３´−小溝バインダ（ＭＧＢ）を含む、又は含まない、ＯＤＮ−フルオロフォア接合体へ付着させる方法が開示される。これらの方法は、開裂可能なリンカとともに、自動化オリゴヌクレオチド合成用の合成固体支持体を利用する。
【００２３】
別の用途において、ルクタノフ（Lukhtanov）等Bioconjugate Chem., 7: 564-567 (1996)の操作により、ＭＧＢ修飾固体支持体から、蛍光発光オリゴヌクレオチドプローブが作られ、ここでは、本発明のクエンチャ−ホスホルアミダイトが、第１結合工程において前記ＭＧＢに添加され、フルオロフォア（ＦＬ）が最終結合工程においてＯＤＮに付着されて、５´−ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢ接合体プローブが作られる。
【００２４】
本発明の前記方法及び組成物のその他の用途は、最近、医療科学、法廷科学、農業及び水質制御等の多くの分野において重要になっている、核酸ベースの診断アッセイにおけるマイクロアレイとしてである。本発明の前記方法及び組成物のその他の関連用途は、遺伝子発現のアレイベースの分析等の、オリゴヌクレオチドのアレイを使用する操作である(アイセン（Eisen）, Methods of Enzym., 303: 179-205 (1999))。これらの操作において、多くの生物において遺伝子の全部又は多くの部分に対応するオリゴヌクレオチド又はＤＮＡの秩序配列が、ハイブリダイゼーション用のプラットフォームとして使用される。マイクロアレイベース方法は、発現されたＲＮＡ種の相対的表象を測定するアッセイに使用される。各ＲＮＡ種の豊富性の相違の定量化は、それらを、スペクトル的に異なる蛍光発光染料によって標識化し、同時ハイブリダイゼーション用の二つのプローブを一つのアレイに混合して、直接的に二つのサンプルを比較することによって達成される。
【００２５】
本発明の前記組成物及び方法が核酸の検出に関連する程度において、本発明は、５´−ヌクレアーゼ、汎用エネルギ転移プライマ又はビーコンアッセイ等の、ＦＲＥＴが使用される方法を、非限定的に、含む。これらの方法は、通常、ＰＣＲ−生成核酸配列の検出用であるが、それに限られるものではない。これらの方法の内のいくつかは、同じアッセイ中の一つ以上の核酸配列の同時検出を含む。同様に、本発明は、ＦＲＥＴが、タンパク質濃度又は酵素活性の検出に使用される方法に関する。
【００２６】
本発明のその他の用途は、アミノ、ヒドロキシル、又はスルフィドリル基等の反応基における、薬剤、トキシン、細胞、微生物物質、粒子、ガラス又はポリマ表面等を含む、核酸、タンパク質、及びその他の物質の、発光ＰＰＴ−，クマリン−、レゾルフィン−ベースの染料による標識化に関する。本発明は、一工程及び二工程プロセスに使用することができる。二工程標識プロセスにおいては、オリゴヌクレオチド等の第１成分が、ＯＤＮの反応基（アミン、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒド、又はスルフィドリル基等）との反応によって、前記新規フルオロフォアＰＰＴ−，クマリン−，及びレゾルフィン−ベース染料を導入可能な前記試薬によって標識され、その標識が、オリゴヌクレオチド標的等の第２成分用のプローブとして使用される。
【００２７】
発明の詳細説明
オリゴヌクレオチド合成用のクエンチャ試薬
自動化ＤＮＡ合成機を使用して、オリゴヌクレオチドに、置換４−（フェニルジアゼニル）フェニルアミン・クエンチャ部分を導入するための二つの試薬が、以下の開示において例示される。ここ及び反応スキームにおいて、略称ＭＧＢ，ＦＬ，Ｑ，ＣＰＧ及びＯＤＮは、それぞれ、又、その文脈から明らかなように、「小溝バインダ」、「蛍光剤又はフルオロフォア」、「クエンチャ」、「制御細孔ガラス（controlled pore glass）」、及び「オリゴヌクレオチド」部分又は分子を示す。
【００２８】
ジメトキシトリチル保護クエンチャホスホルアミダイト
ここに開示される第１のタイプの試薬は、クエンチャ分子（Ｑ）と、更に、後続のオリゴヌクレオチド合成中において成長するオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）のための付着ポイントを提供する、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）（メトキシトリチル、トリチル等の酸不安定性ブロッキング基）保護第一級アルコールとを有する、ホスホルアミダイトである。これらの試薬の具体例が式１，２及び３、さらに、反応スキーム１及び２に示されている。
【００２９】
反応スキーム１において、出発化合物は、第１級（ｐｒｉｍａｒｙ）ヒドロキシル基を有する、置換４−（フェニルジアゼニル）フェニルアミン１である。このような出発物質は、市販されており、或いは、実務有機化学者にとって利用可能な一般的技術を適用して、公知の方法で合成することも可能である。例えば、米国特許第２，２６４，３０３の教示内容によれば、４−ニトロベンゼンジアゾニウム塩が２−（２−クロロアニリノ）エタノールと反応して、２−［２−クロロ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）アニリノ］エタノールを得る。２−［２−クロロ−４−（４−ニトロフェニルアゾ）アニリノ］エタノールは、反応スキーム１に示されている化合物１の範囲に含まれる。前記米国特許第２，２６４，３０３の明細書をここに参考文献として合体させる。
【００３０】
市販されている出発物質（又はそれらの前駆物質）のその他の例としては、２−（エチル｛４−［（４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）−エタン−１−オールと２−（エチル｛４−［（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝−アミノ）エタン−１−オールがある。
【００３１】
反応スキーム１に図示されているように、化合物１を、ｐ−ニトロフェニルクロロフォルメートと反応させてカーボネート２を得る。カーボネート２と置換ピロリジンジオールとの反応によって、ジオール中間体３を得る。前記ピロリジンジオールは、アミノ、第１及び第２ヒドロキシル基を有する三官能基性試薬である。ピロリジンジオールの一例、及び、アミノ、第１及び第２ヒドロキシ基を有するその他の三官能基性試薬の具体例が、米国特許第５，５１２，６６７号に記載されており、その明細書をここに参考文献として合体させる。前記ジオール３は、先ず、ジメトキシトリチルクロライド（ＤＭＴｒＣｌ）と反応して、前記三官能基性試薬の第１ヒドロキシル基をブロックし、中間体４を得る。まだ前記三官能基性試薬の自由な第２ヒドロキシル基を含んでいるこの中間体４を、次に、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させて、ジメトキシトリチル保護ホスホルアミダイト試薬５を得る。反応スキーム１に図示されている化合物において、その記号は次のように定義される。Ｒ_O，Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃及びＲ₄は、それぞれ独立的に、−Ｈ、ハロゲン、−Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃，−（ＣＨ₂）_nＣＨ₃であり、ここでｎ＝０〜５、−ＮＯ₂，−ＳＯ₃，−Ｎ［（ＣＨ₂）_{n ´}ＣＨ₃］₂、ここで、ｎ´＝０〜５，−ＣＮ、Ｒ₅＝−Ｈ又は−（ＣＨ₂）_{n ´ ´}ＣＨ₃、ここで、ｎ´´＝０〜５；Ｒ₆＝−（ＣＨ₂）_n*、ここでｎ^*＝１〜５そしてｑ＝１〜２０である。前記ジメトキシトリチル保護ホスホルアミダイト試薬５は、その他の点において標準ＯＤＮ合成において知られている工程においてオリゴヌクレオチドへの付着用に好適である。
【００３２】
【化５５】

【００３３】
その他の実施例においては、アミノと二つのヒドロキシル基を含むその他の三官能基性試薬から出発して、反応スキーム１に記載の反応を使用して（或いは、実務有機化学者の技術の範囲内のそのような修飾を使用して）、式１及び式２のホスホルアミダイトが合成され、ここで、ｑ，Ｒ_O，Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄及びＲ₅は上記の定義通りであり、ｒとｓとは、互いに独立的に１〜２０；Ｘは−Ｏ−又は−ＣＨ₂−；ｔ及びｖは、互いに独立的に１〜２０である。
【００３４】
【化５６】

【００３５】
【化５７】

【００３６】
反応スキーム２は、前記置換４−（フェニルジアゼニル）−フェニルアミン・クエンチャ部分を備えるとともに、前記三官能基性ピロリジンジオール部分を含む、別例のホスホルアミダイト試薬１０の合成を開示している。この合成スキームにおいて、出発物質は、自由なカルボキシル基を有する置換４−（フェニルジアゼニル）フェニルアミン化合物６である。この化合物６（市販又は、実務有機化学者の技術範囲無いにおいて化学文献によって製造される）を、ペンタフルオロフェニル トリフルオロアセテートと反応させて活性エステル７を得て、その後、これを反応させて、前記置換４−（フェニルジアゼニル）−フェニルアミン部分を、自由第１ヒドロキシル基と自由第２ヒドロキシル基とを有するピロリジンジオール部分の環窒素に結合させ、化合物８を得る。この化合物８をＤＭＴｒＣｌによって処理した後、２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイトとの反応によって、ジメトキシトリチル保護ホスホルアミダイト試薬１０を得る。反応スキーム２において、記号は、反応スキーム１と同様に定義される。
【００３７】
【化５８】

【００３８】
更に別の例において、反応スキーム２に記載の反応を使用して、置換４−（フェニルジアゼニル）フェニルアミン（化合物６）から出発して、スキーム２に図示したピロリジンジオールの代りに、非環状三官能基性試薬（アミノと、二つのヒドロキシル官能基とを有する）を使用して、式３のジメトキシトリチル保護ホスホルアミダイトを合成する。ここで、ここで、ｑ，Ｒ_O，Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃，Ｒ₄、Ｒ₅及びＲ₆は上記の定義通りであり、ｔとｖは、それぞれ独立的に１〜２０である。
【００３９】
【化５９】

【００４０】
ＯＮＤ合成に適した、保護リンカ（又はその類似手段）によって固体支持体に付着したクエンチャ
ＯＤＮへ前記クエンチャ分子を導入するのに適した第２のクラスの化合物又は試薬は、ＯＤＮ合成に使用されるタイプの固体支持体（例えば、制御細孔ガラス（ＣＰＧ））、と、クエンチャをその固体支持体に付着させるリンカとを有する組成物を構成する。前記リンカは、通常は、合成中、前記第１ヌクレオチドが該リンカへ付着する時に除去されるジメトキシトリチル基によって保護されている、ヒドロキシル官能基を有する。一般に、反応スキーム１において上述したのと同じクエンチャ／リンカ中間体が、反応スキーム３に図示されている構造体例１２を有するこれらの試薬（ＣＰＧビーズ）を作るのにも使用可能である。
【００４１】
【化６０】

【００４２】
このスキームにより、前記中間体４（スキーム１に図示）の第２ヒドロキシル基が、無水コハク酸と反応し、その後、ペンタフルオロフェニル トリフルオロアセテートと反応して、活性エステル１１を得る。この活性エステル１１を、次に、前記固体支持体（ＣＰＧビーズ）に付着した自由アミノ基と反応させて、改変固体支持体１２が提供される。この例示改変固体支持体１２は、ピロリジンジオールから誘導される「三官能基性リンカ」を含んでいるが、当業者には、式１，２及び３に図示されているリンカ等の、その他のリンカ及び関連構造を含む、類似の改変固体支持体も、実質的に反応スキーム３によって製造可能であり、式４及び式５に図示されているもののような、クエンチャ部分を含む改変固体支持体を得ることが可能であることが、容易に理解されるであろう。
【００４３】
構造体１２と式４及び５のクエンチャ部分を含む前記改変固体支持体組成物を、３´−クエンチャ接合体を作成するのに使用して、適当なホスホルアミダイトによる５´−末端へのフルオロフォアの導入、又は、反応基を含むフルオロフォアによる合成後の導入を可能にする。反応スキーム３と式４及び式５とにおいて、記号は上述した通り定義される。その他の固体支持体（ポリスチレン等）や、その他の開裂可能リンカシステム（図示したコハク酸リンカ以外）も、これらの一般的教示内容により、作成することが可能であり、従って、それらも本発明の範囲に含まれる、と理解される。
【００４４】
【化６１】

【００４５】
【化６２】

【００４６】
オリゴヌクレオチド合成用の小溝バインダクエンチャ試薬
一実施例において、小溝バインダ（ＭＧＢ）を、開裂可能リンカを介して制御細孔ガラス（ＣＰＧ）に付着させる。前記４−（フェニルジアゼニル）フェニルアミン構造に基くクエンチャ部分が、リンカ分子を介して前記ＭＧＢに付着される。前記リンカ分子は、更に、ＤＭＴｒ（等）ブロック基によってブロックされたヒドロキシル基も含む。前記ＤＭＴｒ基の除去後、オリゴヌクレオチドを、ヌクレオチド単位の前記ヒドロキシル基への段階的付着によって、自動オリゴヌクレオチド合成機により合成する。フルオロフォアを、適当なホスホルアミダイトによって５´末端に導入するか、若しくは、合成後に、反応基を含むフルオロフォアを導入して、付着蛍光部分（ＦＬ）、クエンチャ（Ｑ）及びＭＧＢ（ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢ）を有するＯＤＮを得る。この点に関して、ＭＧＢの合成と、それらのＯＤＮへの付着は周知であることが銘記される（例えば、米国特許第５，８０１，１５５号、０９／５３９，０９７号及び０９／１４１，７６４号を参照、これらすべてをここに参考文献として合体させる）。
【００４７】
一好適実施例において、前記ＭＧＢは、３−｛［３−（ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イルカルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル］カルボニル｝ピロロ［３，２−ｅ］インドリン−７−カルボキシル酸（ＤＰＩ₃）である。前記共有結合「集合体」ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＤＰＩ₃の合成は、後述するように５つの段階を必要とする。反応スキーム４に図示されているその第１段階は、中間体，２−（４−ニトロフェニル）エチル３−（ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（ＤＰＩ₂−ＮＰＣ）１７、の合成である。その第２段階は、反応スキーム５に図示されているように、Ｑ−ＤＭＴｒ−ＤＰＩ−ＣＯ₂ＰＦＰ２４の合成であり、ここでは、クエンチャが、リンカを介して、ピロロ［３，２−ｅ］インドリン−７−カルボキシル酸単位（ＤＰＩ）に結合されている。ここで、及び、前記反応スキームにおいて、ＰＦＰは、その文脈から、ペンタフルオロフェニル又はペンタフルオロフェニルオキシ基を表わす。その第３段階において、反応スキーム６に図示されているように、ＤＭＴｒ−Ｑ−ＤＰＩ₃−ＰＦＰ２５ａが、１７及び２４から合成される。第４段階において、２５ａがＣＰＧに結合して、ＤＭＴｒ−Ｑ−ＤＰＩ₃−ＣＰＧ２９を得て、第５段階において、自動オリゴヌクレオチド合成機でＤＭＴｒ−Ｑ−ＤＰＩ₃−ＣＰＧ２９を使用して、順次ヌクレオチド単位を付着させ、前記ＣＰＧからの除去後、前記生成物ＦＬ−５´−ＯＤＮ−３´−Ｑ−ＤＰＩ₃３０を得る。
【００４８】
これら合成プロセスの前記第４及び第５段階が反応スキーム７に図示されている。このシーケンス（段階１〜５）のための実験条件を次に示す。
【００４９】
【化６３】

【００５０】
【化６４】

【００５１】
【化６５】

【００５２】
【化６６】

【００５３】
次に、これらの段階又は反応をより詳細に説明すると、Ｑ−ＤＰＩ₃部分２５（段階３）が、反応スキーム６に図示されているように、二つの中間体１７及び２４の反応によって合成される。第１の中間体ＤＰＩ₂−ＮＰＥ １７は、スキーム４に図示されているように作られる。ＤＰＩ−ｔＢｏｃ１３が、ジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）とトリフェニルフォスフィンとの存在下でｐ−ニトロフェニルエタノールと反応して、ジ−エステル１４を得た。この化合物１４を、先ず、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって処理して１５を得、次に、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライドの存在下でＤＰＩ−ｔＢｏｃ１３と結合させて、多量のＤＰＩ₂の４−トリフェニルエステル１６を得た。１６とＴＦＡとの反応によって、ＤＰＩ₂のｐ−ニトロフェンエチル（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｅｔｈｙｌ） エステル１７を得る。前記第２中間体ＤＰＩ−Ｑ２４（段階２）を、反応スキーム５に図示されているように合成する。置換ニトロアニリン１８（市販又は化学文献によって入手可能）を亜硝酸の存在下でジアゾ化し、置換アニリン１９（市販又は化学文献によって入手可能）と結合させ、アゾ中間体クエンチャ分子２０を形成する。前記エチルエステル２０のアルカリ加水分解、その後の、ＤＭＴｒＣｌでの処理によって、ＤＭＴｒ−Ｑ２１を得て、これをその後、ペンタフルオロフェニル トリフルオロアセテートによって活性化して２２を得る。２２とＤＰＩ−メチルエステルとの反応によって、Ｑ−ＤＭＴｒ−ＤＰＩメチルエステル２３を得る。次に、この化合物２３をアルカリによって処理してメチルエステルを加水分解し、次に、ＰＦＰ−ＴＦＡによって活性化してＱ−ＤＭＴｒ−ＤＰＩ ＰＦＰエステル２４得る。反応スキーム５において、Ｒ₀，Ｒ₁〜Ｒ₄、ｖ及びｔは上述したように定義される。
【００５４】
次に、ここでも記号は上述したように定義される反応スキーム６を参照すると、先ず、前記活性化クエンチャ２４（ＤＭＴｒ−Ｑ−ＤＰＩ ＰＦＰ）をＤＰＩ₂−ＮＰＣ１７と反応させることによってｐ−ニトロフェニルエチルエステル２５を得て、これを、先ず、１，８−ジアザバイシクロ［５，４，０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）等の塩基による処理によって、ｐ−ニトロフェニルエチル部分を除去し、次に、２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル トリフルオロアセテート（ＰＦＰ−ＴＦＡ）での処理によって、活性化エステル２５ａに変換し、ＤＭＴｒ−Ｑ−ＤＰＩ₃−ＰＦＰ２５ａ（第３段階）を合成する。
【００５５】
ＤＭＴｒ−Ｑ−ＤＰＩ₃−ＣＰＧ２９（段階４）の合成を反応スキーム７に図示する。この合成シーケンスにおいて、前記改良クエンチャ分子は、開裂可能ジグリコーレート・リンカを介して制御細孔ガラスビーズ（ＣＰＧ）に付着する。具体的には、アミノプロパノール又はその同族体を、モノメトキシトリチル塩化物（ＭＭＴｒ−Ｃｌ）と、次に、ジグリコール酸塩無水物とによって連続に反応させて、ＭＭＴ−ブロック・アミノプロパノール２６（又は同族体）とＭＭＴ−ジグリコレート２７とをそれぞれ得る。記号ｍは、２〜２０の整数値を有するものと定義される。現時点において好適なアミノプロパノール ｍは３である。このスキームの残りの記号は、上述したように定義される。２７を活性化剤（ＨＯＢＴ及びＨＢＴＵ）の存在下で長鎖アミノアルキルＣＰＧとの反応させて、ＭＭＴ−ジグリコレート−ＣＰＧ２８を得て、これを、脱トリチル及び２５ａとの反応後にＤＭＴｒＯ−Ｑ−ＤＰＩ₃−ＣＰＧ２９に変換する。
【００５６】
段階５において、まだ反応スキーム７に図示されているように、自動ＤＮＡ合成機の補助によって、オリゴヌクレオチド合成を行い、フルオロフォア−ホスホルアミダイト又は反応基を含むフルオロフォアのいずれかを使用して、フルオロフォアをＯＤＮの５´末端に付着させて、ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＤＰＩ₃３０接合体を得る。
【００５７】
前記ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＤＰＩ₃３０接合体は、又、これら反応スキームにおいては具体的に図示されない別の合成ルートでも合成することが可能である。この別のルートでは、ＤＰＩ₃−メチルエステル（ボジャー（Boger）等., J. Org. Chem., 52: 1521-(1987)ここに参考文献として合体させる、によって得られる）を、先ず、化合物２２と反応させ、次に、アルカリと反応させて、Ｑ−ＤＰＩ₃−メチルエステルと、Ｑ−ＤＰＩ₃−ＣＯＯＨとをそれぞれ得る。後者の化合物を、次に、ペンタフルオロフェニル トリフルオロアセテートによって活性化し、２５ａを得て、次に、これをスキーム７に図示されている反応に使用して３０を得る。
【００５８】
ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ及びＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢプローブ
ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＤＰＩ₃接合体の好適実施例の一般的構造を式６に図示する。ここで：
ＦＬは、約３００〜約８００ｎｍ、より好ましくは４００〜７００ｎｍの範囲の発光波長を有するフルオロフォアであり、Ｋは、Ｃ，Ｏ，Ｎ，Ｓ，Ｐ及びＨのいずれかを含む、１〜３０原子を含むリンカであり、［Ａ−Ｂ］_nは、ＤＮＡ，ＲＮＡ又はＰＮＡ或いはそれらの組み合わせを表わし、ここで、Ａは糖リン酸骨格鎖（修飾糖及び修飾リン酸を含む）、Ｂは、複素環塩基、そしてｎは、ヌクレオチド単位の数である。Ｂは、独立的に、プリン−とピリミジン−；ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−、７−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−，７−デアザプリン−、７−置換 ７−デアザプリン−、修飾プリン−及びピリミジン−塩基とすることができ、前記オリゴヌクレオチド又は核酸は、これらの塩基の組み合わせを含むことができる。Ｗは、Ｃ，Ｏ，Ｎ，Ｓ，Ｐ及びＨから成るグループから選択される０〜約３０原子の長さのリンカであり、更に，Ｗは、置換分枝脂肪族鎖、又は、置換環構造又は、置換脂肪族及び環構造の組み合わせであり、Ｒ₀，Ｒ₁，Ｒ₂，Ｒ₃及びＲ₄は、前に記載された通りであり、ｍ＝１〜２０である。
【００５９】
【化６７】

【００６０】
ＰＮＡ及びＰＡＮ／ＤＮＡキメラの合成は公知であり、一般的には、ここに参考文献として合体させる刊行物ウールマン（Uhlmann）等, Angew. Chem. Inter. Ed., 37:2796-2823(1998); メイフィールド（Mayfiled）等, Anal. Biochemm., 401-404 (1998)によって行うことができる。
【００６１】
式６の範囲に含まれる更に別の好適実施例は、Ｗが−（ＣＨ₂）₃Ｎ（−）−（ＣＨ₂）₃−；Ｒ₀＝ＮＯ₂；Ｒ₁＝−Ｃｌ；Ｒ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｈ；Ｋが６炭素リンカ、そしてｍ＝３である実施例である。
【００６２】
蛍光発光レポータ−クエンチャ対を含む本発明の接合体プローブは、一般に、多くは、例えば、ここに参考文献として合体させるホランド（Holland）等, Proc. Acad. Sci., 88:7276-7280(1991)及びウィットワー（Wittwer）等, Biotechniques, 22:176-181(1997)に記載されているようなＰＣＲを利用する方法において、標的ポリヌクレオチドの増幅との組み合わせで使用される。前記接合体プローブの結合部位は、前記標的ポリヌクレオチドを増幅するために使用されるＰＣＲプライマ間に位置する。
【００６３】
本発明による前記接合体オリゴヌクレオチドプローブを標的オリゴヌクレオチド配列の検出のために使用することによって、従来技術のレポータクエンチャ基及び組み合わせに対していくつかの利点が提供される。例えば、本発明による４−［４−ニトロフェニル］ジアジニル］フェニルアミン構造を含むクエンチャは、クエンチャとしてのダブシルよりも、レポータとしてのＦＡＭ又はＴＡＭＲＡを有するプローブにおいてより高い信号対ノイズ比を提供した。更に、本発明のクエンチャは、ダブシルよりも広い吸収帯域を示し、広範囲のフルオロフォアの効率的な消光を可能にする。加えて、ＭＧＢオリゴヌクレオチド接合体においては、ハイブリダイゼーション特性の改善を示し、改良式クエンチャは、ダブシルを有する標準プローブ（ＤＰＩ₃無し）と比較して、ＴＡＭＲＡで約３０倍のＳ／Ｎ比の増加を示した。本発明の試薬は、自動オリゴヌクレオチド合成中にクエンチャを導入することを可能にする（ダブシル ホスホルアミダイトは、市販されている（Glen Research, Sterling, VA））。
【００６４】
一般的に、本発明の目的の為に、オリゴヌクレオチドは、複数のヌクレオチド単位と、３´末端と５´末端とを有するものであることが理解されるであろう。前記オリゴヌクレオチドは、通常のプリン及びピリミジン塩基の代りに単数又は複数の修飾塩基と、更に、ワトソン−クリック塩基対合等を通じて標的ポリヌクレオチドに特異的に結合可能な修飾ヌクレオチド間結合とを含むことができる。更に、オリゴヌクレオチドは、ペプチドオリゴヌクレオチド（ＰＮＡ）又はＰＮＡ／ＤＮＡキメラを含むことができ、その合成は、公知であり、例えば、ウールマン（Uhlmann）等, Angew. Chem. Inter. Ed., 37:2796-2823(1998); メイフィールド（Mayfiled）等, Anal. Biochem., 401-404 (1998)によって行うことができる。これらのすべてをここに参考文献として合体させる。
【００６５】
一般的に、本発明の前記オリゴヌクレオチドプローブは、５´−３´エクソヌクレアーゼ活性に、当該プローブ中のクエンチャとフルオロフォア分子との間の効率的な開裂を許容することを可能にさせるために、５´末端に隣接した十分な数のホスホジエステル結合を含む。この点に関する適切な数は、約１〜１００である。
【００６６】
フルオロフォア試薬
クマリン ホスホルアミダイト試薬
緑色染料ＦＡＭより短い発光波長を有する蛍光発光染料も、ＤＮＡベースのアッセイに利用可能である。しかしながら、従来技術においては、これらのプローブは、レーザ光源での消光が、より長い波長によるものよりも実用的でないことから、それほど一般的ではなかった。本発明者等が知る限りにおいて、青色蛍光発光染料を含むＤＮＡ合成試薬は今だ報告されていない。好適なクマリンフルオロフォアを含み、ＤＮＡ合成に適したそのようなホスホルアミダイト試薬の一例が、化合物３４として反応スキーム８に図示されている。このホスホルアミダイト試薬３４において、Ｒ₈及びＲ₉は、独立的に、Ｈ，ハロゲン、−ＮＯ₂，−ＳＯ₃，−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ₂，又は−ＣＨ；−ＯＲ_nn，−ＳＲ_nn，−ＯＲ_nn，−ＮＨＲ_nn，−Ｎ［Ｒ_nn］₂であり、ここで、Ｒ_nnは、独立的にＨ，酸性又はアルカリ性条件下で除去可能でオリゴマ合成に使用可能なブロック基であり、又は１〜１０炭素原子を含む基であり、ｊ及びｋは、独立的に１〜１０である。図示されているように、前記試薬３４は、４５８ｎｍで光を放出する共役結合クマリン発色団を含む。このクマリン発色団を含むＤＮＡプローブを作成したところ所望の蛍光発光特性が得られた。
【００６７】
【化６８】

【００６８】
次に、一般的条件及び、具体的なホスホルアミダイト試薬３４ａを提供する例におけるスキーム８を参照すると、ヒドロキシル置換（２−オキソ−２Ｈ−クロメン−４−イル）−アルキルカルボキシルメチルエステル（３１）を、ここに参考文献として合体させる刊行物ベーカー（Baker）等(J. Chem. Soc.; 170, 173 (1950))によって得る。この化合物３１を、アミノアルカノールとの８０℃での反応によってアルカノール誘導体３２（具体的には、Ｒ₈が−ＯＨでＲ₉が−Ｈである３２ａ）に変換する。この３２を先ずＤＭＴｒＣｌと、次に、トリメチルアセテート無水物と反応させ、その後、ＤＭＴｒブロック基を除去することによって、ピバロエート誘導体３３、具体例３３ａでは、Ｒ₈が−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ₃）₂でＲ₉が−Ｈである、を得る。この３３を２−シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させて試薬３４（具体的には、Ｒ₈が−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＣＨ₃）₂，Ｒ₉が−Ｈである３４ａ）を得る。この試薬３４を使用して、前記クマリンフルオロフォアをＤＮＡプローブの５´末端に導入する。尚、自動化オリゴヌクレオチド合成中の前記保護基の除去は良好に行われ、高収率で得られることが銘記される。スキーム８中の記号ｊ及びｋは、それぞれ、０〜２０及び１〜２０と定義される。
【００６９】
レゾルフィン ホスホルアミダイト
別の新規なクラスのＤＮＡ合成試薬は、親化合物（レゾルフィン）中に存在する７−ヒドロキシ−３Ｈ−フェノキサジン−３−オン発光団に基き、ＦＡＭ発光から容易に区別される発光波長（５９５ｎｍ）を有する。本発明によれば、前記発光団は、更なる官能化の為に、所望のホスホルアミダイト試薬にリンカ構造を導入するように合成される。ＤＮＡ合成に適したこれら試薬３７の好適例の作成が反応スキーム９に図示されている。一般的に、試薬３７において、Ｒ₁₀及びＲ₁₁は、独立的に、Ｈ，−ＯＲ₁₂，−ＮＨＲ₁₃，ハロゲン，−Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃，−（ＣＨ₂）_nＣＨ₃，−ＮＯ₂，−ＳＯ₃，−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ₂，−Ｎ［（ＣＨ₂）_nＣＨ₃］₂，Ｏ−アルキル又はＯ−アルカノイルであり、ここで、前記アルキル又は前記アルカノイル基は１〜１０炭素、又は−ＣＮであり、ここでｎ＝０〜５；ｈ＝１〜２０、そして、Ｒ₁₂及びＲ₁₃は、ＯＤＮ合成に使用可能なブロック基である。スキーム中のＲ₁₄は、Ｈ又はＤＭＴｒである。
【００７０】
【化６９】

【００７１】
一般条件及び具体例のスキーム９の例に図示されているように、ニトロソレコルシノール誘導体（市販もしくは、当該技術で入手可能）と、４−（３−ヒドロキシプロピル）ベンゼン−１，３−ジオール（フォルチャシン（Forchiassin）等J. Heterocyc. Chem. 20, 1983, 493-494によって得られる）とＭｎＯ₂との反応によって、いくらかのレゾルフィン誘導体が混入したリザスリン誘導体が得られる。この混合物を、ＮＨ₄ＯＨとＺｎダストとによって処理して、主要不純物として２，３，４−トリヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，２−ｂ］フェノキサジン−９−オンが混入したレゾルフィン誘導体３５（具体的には、Ｒ₁₀がＯＨでＲ₁₁がＨである３５ａ）を得る。後者の混合物を、ＤＭＴｒＣｌとピリミジンとで処理し、次に、トリメチル酢酸無水物によって処理する。その生成物３６を、次に、シリカゲル上でのクロマトグラフィによって精製し、３６ａ（Ｒ₁₀は−ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ₃）₃，Ｒ₁₁はＨそしてＲ₁₄はＤＭＴｒ）のＤＭＴｒ保護誘導体を得た。前記純粋ＤＭＴｒ誘導体を、ＴＦＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂で処理して、シリカゲルクロマトグラフィ後に単一生成物３６ｂを得た。３６（Ｒ１０は−ＯＣ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ₃）₃，Ｒ₁₁及びＲ₁₄はＨ）の２−シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトでの処理によって、所望のＯＤＮへのフルオロフォアの導入に使用される所望のホスホルアミダイト試薬３７（具体的には３７ａ）を得た。
【００７２】
【化７０】

【００７３】
ＰＰＴホスホルアミダイト
それぞれ３８４ｎｍと４００ｎｍとに励起及び発光波長を有する紫色蛍光発光染料ＰＰＴ４４を導入したホスホルアミダイト試薬の合成を、反応スキーム１０と例Ｘとに示す。このスキームによると、６−クロロ−３−ｎ−ブチルウラシル３８と２−（４−アミノフェニル）エタノール３９とを反応させて、フェニル置換ウラシル誘導体４０を得る。前記化合物３８及び３９は、当該技術及び化学文献によって得ることが可能である。室温でのＤＭＦ中での４０と５−フォルミル−４，６−ジクロロピリミジンとの反応によって、三環性複素環式化合物４１が得られる。ＮＨ₃／Ｎａ₂Ｓ₂Ｏ₄中での４１の還元によって４２を得て、これをその後、トルオイル誘導体４３としてブロックする。最後の段階で４３を２−シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させて、ＯＤＮへのＰＰＴフルオロフォアの導入に使用される試薬ＰＰＴシアノエチルホスホルアミダイト４４を得る。
【００７４】
更に別の実施例においては、フルオロフォアである、アルキルカルボキシル基によって置換された、クマリン、レゾルフィン及びＰＰＴは、対応のホスホルアミダイト試薬の合成用の出発物質として作用する。フルオロフォアである、アルキルカルボキシル基によって置換された、クマリン、レゾルフィン及びＰＰＴは、市販、又は、当該技術によって合成可能である。これらの化合物は、ペンタフルオロフェニルエステルとしてアルキルカルボキシル基上で活性化される。これらの活性化されたエステルを使用して、これらの染料をアミン修飾オリゴヌクレオチドに付着させる。
【００７５】
同様に、更に別の実施例において、ｄＵＴＰ標識クエンチャ又はフルオロフォアが、例えば、米国特許第５，３２８，８２４号）の教示に基いて得られる。更に、７−標識ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン標識クエンチャ又はフルオロフォアは、５，８２４，７９６（ここに参考文献として合体させる）によって合成され、オリゴヌクレオチドの標識に使用することができる。
【００７６】
オリゴヌクレオチド合成用の、ＰＰＧレッドダイ（ｒｅｄ ｄｙｅ）ベース及びその他のホスホルアミダイト試薬
別の実施例において、レッドダイ１３クエンチャを、ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン（ＰＰ）の３位置、又は、ピリミジンの５位置に付着する。次にスキーム１１自身を参照すると、出発物質は、５−（４−アミノ−３−ヨードピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジニル）−２−（ヒドロキシメチル）オキソラン−３−オール４５であり、これはここに参考文献として合体させる刊行物シーラ（Seela）等. J. Chem. Soc., Perkin, Trans., 1 (1999, 479-488)によって入手可能である。化合物４５を、先ず、Ｎ−プロピニル−２，２，２−トリフルオロアセテート（又は、前記スキームにおいてｎが１〜１０である場合のその同族体）と反応させ、次に、Ｐｄ（ＰＰｈ₃）₄−ＣｕＩと反応させてアルキン誘導体４６を得る。４６のＰｄ／Ｈ₂還元と、その後の水酸化アンモニウム処理とによって、アミノアルキル誘導体４７（ＰＰＡ´）が得られる。ＰＰＡ´と化合物２（反応スキーム１との関連において開示したように入手可能）との反応によってＰＰＡ´−レッド１３ ４８が得られた。この４８と（１，１−ジメトキシエチル）ジメチルアミンとの反応によって、ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジンのアミノ基をブロックし、４９を得る。この４９を先ず、ＤＭＴｒＣｌと反応させ、次に、２−シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトと反応させて、ＤＭＴｒＣｌブロックＰＰＡ´−レッド１３ホスホルアミダイト５０を得る。
【００７７】
【化７１】

【００７８】
６−アミノ−５−ヒドロキシ−３−ヨード−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４−オン（３−Ｉｏｄｏ−ＰＰＧ）のデオキシリボシドから出発する更に別の実施例において、３−Ｉｏｄｏ−ＰＰＧ部分に共有結合されたレッド１３染料を含有するホスホルアミダイト試薬が、反応スキーム１１に図示されているものに類似の反応によって合成される。同様に、５−アミノプロピルデオキシウリジンから出発して、５−アミノプロピル−デオキシウリジンに共有結合されたレッド１３染料を含有するホスホルアミダイト試薬が合成される。
【００７９】
当業者においては、上記開示から、本発明の範囲内の、前記ピラゾロピリミジン−レッド１３−又はウリジン−レッド１３−ベースのホスホルアミダイトには、そのようなリンカが当該技術及び本開示内容から利用可能な限りにおいて、ピラゾロピリミジンとウラシル塩基とレッド１３クエンチャとの間に種々のリンカを含むことが可能であることが明白であろう。
【００８０】
例
本発明の方法及び組成物は、オリゴヌクレオチドの別の核酸へのハイブリダイゼーションが使用される、現在使用されているものと今後開発されるものとの両方の種々の技術に使用可能である。これらの技術は、非限定的に、オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが最終目的である技術；単数又は複数のオリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションが、そのオリゴヌクレオチドをプライマとして使用し、標的核酸をテンプレートとして使用する単数又は複数のポリメラーゼ仲介伸長工程に先立って行われる技術；オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションを、別のプライマの伸長を阻止するために使用する技術；オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイズ後に、そのオリゴヌクレオチドを加水分解して付着標識を解放する技術；及び、二つ以上のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズして、これら複数のオリゴヌクレオチド間の相互作用を測定する技術、を含む。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの条件、及び、温度、イオン強度、溶媒組成等のハイブリダイゼーションの度合い及び特異性に影響を与える要因は、当該技術において周知である。例えば、サムブルック（Sambrook）等、前出、オースベル（Ausubel）等、前出、イニス（Innis）等、前出（ｅｄｓ）PCR Protocols, Academic Press, San iego, 1990; ヘイムス（Hames）等 (edss)Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985;及びバン・ネス（van Ness）等(1991) Nucleic Acids Res. 19: 5143-5151を参照。
【００８１】
ハイブリダイゼーションプローブ
本発明の一用途において、単数又は複数のＦＬ−オリゴヌクレオチド接合体を、プローブ（単数又は複数）と標的核酸との間のハイブリダイゼーションを評価することによって、標的核酸を同定するプローブ（単数又は複数）として使用する。プローブは、本発明の検出可能な標識によって標識化することができ、或いは、標識との会合が可能な、又は、標的へのハイブリダイゼーション前又は後において第２の標識プローブにハイブリダイズすることが可能な、反応基を含ませることによって、ハイブリダイゼーション前又はハイブリダイゼーション後に標識化する能力を持たせることができる。この技術の基礎として、核酸プローブのハイブリダイゼーションの条件は当該技術において周知である。例えば、サムブルック（Sambrook）等, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); オースベル（Ausubel）等, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ジョン・ウィリ及びサンズ（John Wiley & Sons） (1987, 1988, 1989, 1990, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996); ヘイムス（Hames）等 (eds) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1985及びバン・ネス（van Ness）等, Nucleic Acids Res. 19: 5143-5151 (1991)を参照。
【００８２】
ハイブリダイゼーションは、当業者に周知のいくつかの方法の一つによって、ハイブリダイズしたプローブを遊離プローブから識別することによって、アッセイすることができる（即ち、ハイブリダイズした核酸を同定することができる）。これらの方法としては、非限定的に、直接的又は間接的な標的核酸の固体支持体への付着（第２の支持体結合プローブへのハイブリダイゼーション、又は、表面結合したリガンドと、プローブ接合したリガンドとの間の相互作用によって）、その後の、プローブとの直接的又は間接的なハイブリダイゼーション、そして、ハイブリダイズしなかったプローブを除去するための洗浄；ヌクレアーゼ抵抗性の測定；浮遊密度測定；核酸二体鎖に対して特異的なアフィニティ法（例えば、ヒドロキシアパタイト クロマトグラフィ）；同じ標的核酸にハイブリダイズした複数のプローブ間の相互作用；その他公知の方法が含まれる。例えば、ファルコウ（Falkow）等、米国特許第４，３５８，５３５号、ウルダー（Urdea）等, 米国特許第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号、フリーフェルダー（Freifelder）, Physical Biochemistry, 第２版、Freeman & Co., San Francisco, 1982; サムブルック（Sambrook）等,前出、オースベル（Ausubel）等,前出、及びヘイムス（Hames）等、前出、を参照。
【００８３】
標識化プローブ、加水分解可能プローブ及び標識化プライマを利用するアッセイ フルオロフォアとクエンチャとを含むオリゴヌクレオチド接合体のその他の用途としては、標識プローブが標的及び／又は標的の伸長生成物にハイブリダイズし、ハイブリダイゼーションの結果としてその標識の物理的状態の変化が起こる、アッセイがある。プローブは、第２の核酸分子中の標的配列にハイブリダイズ可能な核酸分子である。例えば、このタイプのアッセイの一つである、加水分解可能プローブアッセイは、ＤＮＡポリメラーゼ等の多くの重合化酵素は、５´−３´エキソヌクレアーゼ活性を本来的に有していることを利用する。従って、もしも、プローブが、重合化のためのテンプレートとして作用することが可能な配列にハイブリダイズするならば（例えば、もしもプローブが、増幅反応中において、二つの増幅プライマ間に位置するＤＮＡの領域にハイブリダイズするならば）、上流側の増幅プライマで重合化を開始した重合化酵素は、そのプローブをエキソヌクレアーゼ的に消化可能である。もしもそのプローブがその標的にハイブリダイズして、もしも増幅がそのプローブがハイブリダイズした領域を横切って発生しているならば、そのようなプローブに付着したいかなる標識も解放される。解放された標識は標識化プローブから分離され、その標識の性質に応じて、当業者に周知の方法によって検出される。例えば、放射性標識されたフラグメントは薄層クロマトグラフィによって分離され、オートラジオグラフィによって検出可能であり；蛍光標識フラグメントは、適当な励起波長での放射と適当な発光波長での観察によって、検出することができる。この基本的技術は、例えば、ここに参考文献として合体させる米国特許第５，２１０，０１５号に記載されている。
【００８４】
この技術のバリエーションにおいて、プローブは、蛍光発光標識とこの蛍光発光標識の蛍光発光を消光するクエンチャ剤との両方を含有する。この場合、前記蛍光発光標識は、前記クエンチャ剤に対するその空間的関係が変化するまで、例えば、蛍光発光標識がプローブからエキソヌクレアーゼ的に解放されるまで、検出不能である。従って、標的配列へのハイブリダイゼーションの前は、前記デュアル フルオロフォア／クエンチャ標識プローブは、蛍光発光しない。前記フルオロフォア／クエンチャ標識プローブのその標的へのハイブリダイゼーション後、それは、上流側プライマにおいて重合化を開始した重合化酵素のエキソヌクレアーゼ活性のための基質となる。プローブのエキソヌクレアーゼ的分解によって、蛍光発光標識がプローブから、従って、クエンチャ剤の近傍から放出され、適当な励起波長における放射時における蛍光発光信号の検出を可能にする。この方法は、放出された標識を、インタクトなプローブから分離する必要がないという利点を有する。多重法は、複数のプローブを利用し、これらプローブのそれぞれは、異なる標的配列に対して相補的であって識別可能な標識を有し、これによって複数の標的配列の同時アッセイを可能にする。
【００８５】
この方法及びこれに関連する方法におけるＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＤＰＩ₃接合体の使用によって、これらのアッセイをより速度、感度及び識別力が高いものとすることができる。特に、ＭＧＢ−オリゴヌクレオチド接合体の、完全なハイブリッドと、単一塩基ミスマッチを含むハイブリッドとの間の識別を可能にする増大した能力によって、ここに参考文献として合体させる刊行物ＷＯ９９５１６２Ａ２に記載されているような、一塩基多型等の同定において加水分解可能プローブアッセイを使用することが容易になる。例１３及び１４は、このタイプのアッセイにおけるＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＤＰＩ₃接合体の有用性を例示している。当業者にとっては、単一ヌクレオチドミスマッチを識別可能な、本発明のもののような、組成物及び方法は、複数のミスマッチを含む配列間をそれぞれ識別することも可能であるということが理解されるであろう。
【００８６】
別の用途実施例は、内在性の尾を備えた自己プローブプライマを使用し、ここで、クエンチャ／フルオロフォアはヘアピンに存在し、これは、プライマの伸長生成物をプローブすることができ、増幅後に蛍光発光する状態でアンプリコンにハイブリダイズする。これによって、標的配列のプロービングを、一分子事象に変換することができる(フィットコンベ D.（Whitcombe, D.） 等, Nat. Biotech., 17: 804-807 (1999))。
【００８７】
蛍光発光エネルギ転移
本発明の前記新規組成物の更に別の用途において、フルオロフォア／クエンチャ対（ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ）を含むオリゴヌクレオチド接合体は、複数の蛍光発光標識プローブを使用する種々の技術に使用される。これらのアッセイの内のいくつかにおいて、蛍光発光標識の特性の変化を使用してハイブリダイゼーションをモニタする。例えば、蛍光発光共鳴エネルギ転移（ＦＲＥＴ）が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションのインジケータとして使用されている。この技術の一実施例において、それぞれが、蛍光発光標識とクエンチャ分子とをそれぞれ含む、二つのプローブが使用される。前記蛍光発光標識は供与体であり、前記クエンチャは受容体であり、ここで、前記供与体の発光波長は、受容体の吸収波長とオーバラップする。これらプローブの配列は、それらが標的核酸の隣接する領域に対してハイブリダイズし、これによって、もしも標的が存在しているならば、蛍光発光供与体と受容体とを互いに近接させるように選択される。標的核酸の存在時には、前記蛍光発光供与体の吸収波長に対応する波長の放射によって、蛍光発光受容体からの放出が起こる。これらのタイプのアッセイは、それらは均質アッセイであって、未反応プローブを除去する必要のない、明確な信号を提供するという利点を有する。それら自身公知である、これらのアッセイの更なる詳細及びその他の具体例については、例えば、共にここに参考文献として合体させるヨーロッパ特許公報０７０６８５；及び刊行物カルデゥロ（Cardullo）等, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794を参照。本発明の前記新規組成物のその他の用途は、共に同じ標的核酸にハイブリダイズした二つの異なるオリゴヌクレオチド間の相互作用を測定する技術、及びそれらに関連の技術にある。適当な蛍光発光供与体／蛍光発光受容体対の選択は、所与の対について、蛍光発光供与体の発光波長が受容体の吸収波長にオーバラップするという原則に基いて、当業者には明らかであろう。ＤＰＩ₃−オリゴヌクレオチド接合体の、完全なハイブリッドと、単一塩基ミスマッチを含むハイブリッドとの間の識別を可能にする増大した能力によって、一塩基多型等の同定においてＦＲＥＴ−ベースの技術を使用することが容易になる。
【００８８】
本発明の前記新規組成物の別の用途において、ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ接合体の蛍光発光は、そのネイティブな状態で消光される。しかし、意図される標的とのハイブリダイゼーション後は、フルオロフォアとクエンチャ部分との空間配置が変化して蛍光発光が起こる。この基本的技術については、例えば、共にここに参考文献として合体させる、チアギ（Tyagi）等, Nat. Biotech., 16: 49-53 (1998)及び米国特第５，８７６，９３０号を参照。
【００８９】
尚、本発明において、本発明のクエンチャと使用されるのに特に有用とされ、本発明によってＯＤＮに導入される前記フルオロフォアの他に、当業者は、参考文献、ホーグランド（Haugland） Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,第６版, Eugne, OR. pp.235-236. 1996; ベールマン（Berlman）, Handbook of Fluorescence Spectraof Aromatic Molecules, 2^nd, Academic Press, New York, 1971; デゥ（Du）等, Photochem CAD. A Computer-Aided Design and Research Tool in Photochemistry, Photochem. Photobiol. 68: 141-142 (1998)等の文献に記載されている光学特性に基き、本発明のクエンチャと組み合わせて使用されるその他のフルオロフォアを選択することができると理解される。従って、これらの公知のフルオロフォアとの組み合わせでの、前記新規ＯＤＮクエンチャ接合体の使用は本発明の範囲内に含まれると見なされる。
【００９０】
別の用途において、前記小溝バインダ，ＤＰＩ₃は、ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＣＤＰＩ₃接合体においてクエンチャと結合されて、信号対ノイズ比を改良する（表２を参照）。好適なクエンチャは、式６のクエンチャであり、より好適なクエンチャは、８−１１，１２−１６及び３０である。
【００９１】
本発明の前記新規なフルオロフォア（３４，３７及び４４）と組み合わせて使用されるその他のクエンチャとしては、ダブシルニトロチアゾール，ＴＡＭＲＡ，６−（Ｎ−［７−ニトロベンズ−２−オクサ−１，３−ジアゾル−４−イル］アミノ）ヘキサン酸，６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）及びＱＳＹ−７がある。
【００９２】
本発明の前記新規なフルオロフォア／クエンチャ対のその他の用途は、前記対を酵素基質に導入することであり、ここで、蛍光発光は、そのフルオロフォアとクエンチャとの近接性によって消光される。しかしながら、酵素が基質を開裂した後は、フルオロフォアとクエンチャとが分離され、蛍光発光が観察される。この技術の一例を、以下、ホスホジエステラーゼ酵素を使用して説明する。当業者には、前記新規なクエンチャとフルオロフォアとの両方を含む適当な基質を、その基質を開裂する酵素のために構築することが可能であることが明白であろう。
【００９３】
オリゴヌクレオチドアレイ
別の用途において、本発明のＦＬ−ＯＤＮは、オリゴヌクレオチドのアレイを使用する操作に利用される。それ自身公知であるこの技術の具体例には、ハイブリダイゼーションによる配列決定と、遺伝子発現のアレイベースの分析が含まれる。これらの操作において、異なる既知の配列のオリゴヌクレオチドの秩序配列が、単数又は複数のテストポリヌクレオチド、核酸又は核酸集団（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）へのハイブリダイゼーションのためのプラットフォームとして使用される。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの測定とそれらの既知の配列とのアラインメントとによって、テストポリヌクレオチドを再構築することが可能である。これらの技術の説明については、米国特許第５，４９２，８０６号、第５，５２５，４６４号、第５，５５６，７５２号及びＰＣＴ公報ＷＯ９２／１０５８８及びＷＯ９６／１７９５７を参照。これのすべてをここに参考文献として合体させる。アレイの構築のための材料としては、非限定的に、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウエハ、及び光ファイバがある。
【００９４】
構造的考慮事項
オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド及び核酸という用語は、修飾又は非自然発生ヌクレオチドを含有する、ＤＮＡ又はＲＮＡ（或いはそれらの両方）の一本鎖又は二本鎖のポリマ、或いは、非限定的に、ニールセン（Nielsen）等(1991) Science 254: 1497-1500に開示されているペプチド核酸、バイシクロＤＮＡオリゴマ(ボリ（Bolli）等(1996) Nucleic Acids res. 24: 4660-4667)及びそれらに関連する構造を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡと安定な塩基対合を形成可能な如何なる他のタイプのポリマを、相互交換可能に意味する。単数又は複数のＭＧＢ部分及び／又は単数又は複数の蛍光発光標識、及びクエンチャ剤を、前記オリゴマの５´末端、３´末端又はその内部に付着させることができる。本発明において好適なＭＧＢは、ＤＰＩ₃であり、好適なクエンチャはレッド１３アミドである。
【００９５】
本発明のおいて好適であるのは、一本鎖で、１００ヌクレオチド以下、好ましくは５０ヌクレオチド以下、より好ましくは３０ヌクレオチド以下、最も好ましくは、約５ヌクレオチドを下限として２０ヌクレオチド以下の長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
【００９６】
フルオロフォア／クエンチャ対を含み、ＭＧＢ有り又は無しのオリゴヌクレオチド接合体は、自然発生塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミン、及びウラシルに加えて、単数又は複数の修飾塩基を含むことができる。修飾塩基は、単数又は複数の官能基の追加又は欠失、複素環構造の相違（即ち、炭素の複素原子による置換、あるいはその逆）、及び／又は塩基に対する単数又は複数のリンカアーム構造の付着によって、自然発生塩基とは異なるものと考えられる。本発明の前記ＯＤＮ接合体に含ませることが可能な修飾ヌクレオチドとしては、７−デアザブリン及びそれらの誘導体、及び、ピラゾロピリミジン（ここに参考文献として合体させるＰＣＴ ＷＯ９０／１４３５３）、及び共有及び同時係属出願第０９／０５４，６３０に記載がある。
【００９７】
このタイプの好適な塩基類似体は、グアニン類似体である６−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−オン（ｐｐＧ又はＰＰＧ）、及び、アデニン類似体である４−アミノ１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（ｐｐＡ又はＰＰＡ）を含む。更に、キサンチン類似体である１Ｈ−ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−４（５Ｈ）−６（７Ｈ）−ジオン（ｐｐＸ）も使用される。これらの塩基類似体は、オリゴヌクレオチド中に含まれる時、ハイブリダイゼーションを強化し、ミスマッチ識別を改善する。自然発生塩基、修飾塩基、及び塩基類似体のすべての互変体形状のものを本発明のオリゴヌクレオチド接合体に含ませることができる。
【００９８】
同様に、本発明において、修飾糖又は糖類似体を、オリゴヌクレオチド接合体の単数又は複数のヌクレオチドサブユニット中に存在させることができる。糖修飾としては、非限定的に、糖の２´，３´及び／又は４´炭素原子への置換物の付着、異なるエピマー形状の糖、グリコシド結合のα又はβ配置の違い、及びその他のアノマー的相違が挙げられる。糖部分は、非限定的に、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、リボース、デオキシリボース、グルコース、アラビノース、ペンタフラノース、キシロース、リキソース、及びシクロペンチルを含む。
【００９９】
修飾ヌクレオチド間結合も、本発明のオリゴヌクレオチド接合体中に含ませることができる。そのような修飾結合は、非限定的に、ペプチド、ホスフェート、ホスフォジエステル、ホスフォトリエステル、アルキルホスフェート、アルカンホスホネート、チオホスフェート、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホルアミダイト、置換ホスホルアミダイト等を含む。オリゴヌクレオチド中においてプローブ及び／又はプライマとして作用するべく適用可能な、その他いくつかの塩基、糖、及び／又はヌクレオチド間結合の修飾は、当業者にとって明白であろう。
【０１００】
本発明のいくつかの好適実施例は、反応スキーム３に図示されているように、種々のクエンチャ発光団及びリンカを伴う種々のホスホルアミダイトの合成、及び、蛍光発光ＭＧＢ ＯＤＮの３´末端におけるそれらの導入に関する。種々の蛍光発光レポータ基（反応スキーム７に図示）も、前記オリゴヌクレオチドプローブに導入された。これらは、実験の部に記載されている。これらＯＮＤ接合体の蛍光発光特性は、表２に記載されている。他の実験において、ＭＧＢ分子は、それらの望ましい改良されたハイブリダイゼーション特性により、ハイブリダイゼーション特異性、蛍光消光及び蛍光発光信号の損失無く、フルオロフォアとクエンチャとの両方を有するオリゴヌクレオチドに導入された。隣接する芳香性ＤＰＩ₃残基に結合されたフラットな芳香性クエンチャは、厳格な幾何学的要件を有する。なぜなら、オリゴヌクレオチドとＤＰＩ₃残基との間のリンカは、ＤＮＡ二本鎖形成後における小溝中のＤＰＩ₃の配置を可能にするのに十分にフレキシブルなものでなければならないからである。
【０１０１】
本発明の試薬の特性
本発明の試薬及び方法によって合成された様々なＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＤＰＩ₃接合体が式７〜１６に図示されており、ここで、ｎは、オリゴヌクレオチド中の塩基を数を表わし、Ｒ₂はＦＡＭ又はＴＡＭＲＡである。“Ｂ”は、デオキシリボース糖部分に付着した複素環塩基を示す。
【０１０２】
【化７２】

【０１０３】
式７〜１６によって表わされる化合物に導入されたクエンチャは、本発明において、それぞれ、レッド１（Ｒｅｄ１），レッド１３（Ｒｅｄ１３）及びダブシルとして示す、市販の２−［４−（４−ニトロフェニルアゾ）−Ｎ−エチルフェニルアミノ］エタノール(ディスパース レッド１（Disperse Red 1）)，２−［４−（２−クロロ−４−ニトロフェニルアゾ）−Ｎ−エチルフェニルアミノ］エタノール(ディスパース レッド１３（Disperse Red 13）)及び２−［４−（ジメチルアミノ）フェニルアゾ］安息香酸、である。
【０１０４】
レッド１３及びダブシルオリゴヌクレオチド接合体のＵＶ特性
図２は、ダブシル（式７、その他の点では非修飾のＤＮＡプローブの３´末端に導入された場合はＤＰＩ₃無し）との比較で、レッド１３発光団（式８、ＤＰＩ₃無し）の吸収特性を図示している。レッド１３発光団のより広範囲の吸収（特に、長波長における）は、明らかな利点である。レッド１３の８_maxが５２２ｎｍであるのに対してダブシルの８_maxが４７９ｎｍであることに注目。レッド１３の吸収は、フルオレセイン（発光最大＝５２５ｎｍ）の消光に理想的であるだけではなく、同時に、その他の一般的なレーザ染料の蛍光発光放射にオーバラップしている。
【０１０５】
種々のクエンチャ及びリンカを有するＤＰＩ₃プローブの消光特性
式７〜１６の１０の蛍光発光プローブについて、各プローブの標準溶液の蛍光発光を、実験の部に記載されているように、ヘビ毒液ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）での消化の前と後とに、測定した。このＰＤＥアッセイは、各プローブの消光特性を比較することを可能にする。消化されたプローブの蛍光発光（信号）を初期蛍光発光（ノイズ）で割ることによって、表１に示されている信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が得られた。Ｓ／Ｎの大きな数字は、インタクトプローブのより効果的な蛍光消光（低い蛍光発光バックグランド）を表わす。
【０１０６】
【表１】

【０１０７】
表１のデータから、レッド１３発光団と、それに密接に関連したレッド１発光団が、ダブシルよりも、種々のリンカを伴うＦＡＭ及びＴＡＭＲＡの両方に対して良好なクエンチャであることが明らかである。リンカは、レッド１３発光団による消光に影響を与えうる。例えば、式１４及び式１５は、ＦＡＭとは良好に作用したが、ＴＡＭＲＡでは消光効果が悪かった。ダブシルが、特にＴＡＭＲＡプローブに関して、非常に良好に作用したことは幾分意外である。後述するように、ダブシルによる効果的なＦＲＥＴ消光は、ＭＧＢプローブの特定のケースである。
【０１０８】
【化７３】

【０１０９】
ＤＰＩ₃プローブとＤＰＩ₃無しのプローブとの消光特性の比較
レッド１３クエンチャ発光団の利点を更に示すために、３´−ヘキサノルブロック基（ＭＧＢ無し）を備える蛍光発光プローブと比較した。同じ配列を有する１３の蛍光発光プローブの構造と蛍光発光特性とを前記ＰＥＤアッセイを使用して比較した。この研究（表２）においては赤色感知検出器を使用し、表１に図示した研究においては青色感知検出器を使用した（検出器の違いによって、同じフルオロフォアに対する感度が異なる為、同じＯＤＮに対するＳ／Ｎは異なる）。次の構造上の変更を表２に要約する。プローブタイプ（ＭＧＢ無し対ＭＢＧ）、クエンチャ（ダブシル対レッド１３対レッド１３アミド）、そしてレポータ染料（ＦＡＭ対ＴＡＭＲＡ）。
【０１１０】
【表２】

^１ 信号対ノイズ（Ｓ／Ｎ）は、上述したホスホジエステラーゼアッセイを使用して測定された。ＯＤＮ配列は、５´−ｇａｇｇｇａｔｇｔａａａａａｔ（配列識別番号１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１））であった。ダブシル又はレッド１３クエンチャ（Ｑ）のリンカ構造は、それぞれ式７及び８に図示されている。レッド１３アミドのリンカ構造は、反応スキーム７の３０に図 示され、ここでＲ₀はＮＯ₂，Ｒ₁＝２−Ｃｌ，Ｒ₂＝Ｒ₃＝Ｒ₄＝Ｈ；ｔ＝ｖ＝３である。
【０１１１】
表２のデータから、ＤＰＩ₃を含まないプローブにおいて、染料レッド１３クエンチャは、ＦＡＭとＴＡＭＲＡとの両方においてダブシルよりも良好に作用することが明白である。ＤＰＩ₃含有プローブでは、染料レッド１３は、ＴＡＭＲＡとの組み合わせにおいてよりも、ＦＡＭとの組み合わせで遥かに良好に作用する。８と３０とは共に、両方のフルオロフォアを含有するＤＰＩ₃含有プローブにおいてより良好に作用し、ＦＡＭの場合に最良のＳ／Ｎ比を示す。従って、レッド１３発光団は、長い波長の蛍光発光レポータ基に対してダブシルよりもより効果的なクエンチャであるということが判った。大半の一般に使用されていフルオロフォア（ＦＡＭ）に関して、Ｓ／Ｎの２．５倍の増大が標準の（ＤＰＩ₃無し）プローブで観察された。レッド１３によるこの消光の改善は、図２に示すスペクトルのオーバラップの増加と標準ＦＲＥＴメカニズムとに一致している。ＤＰＩ₃プローブに導入された時の、８と３０との両方のＳ／Ｎの増大は、劇的であり驚異的である。レッド１３クエンチャとＤＰＩ₃との組み合わせによって、とＦＡＭ消光において１０倍のＳ／Ｎの増大と、ＴＡＭＲＡ消光において２８倍のＳ／Ｎの増大が得られた。
【０１１２】
ＤＰＩ₃残基がダブシル及びレッド１３発光団による蛍光消光を改善することは驚くべきことである。理論によって限定されることは望むものではないが、現時点においては、溶液中の蛍光発光プローブのランダムコイル形状が、ＤＰＩ₃プローブ中において、フルオロフォアとクエンチャとの間の平均距離がＭＧＢ無しのプローブにおいてよりも近くなるようにより構造化されるものと推定されている。このＤＰＩ₃プローブ中における平均距離の短縮（よりタイトなコイル）によって、ＦＲＥＴがより効率的になるのであろう。この相互作用の性質は正確には判っていないが、クエンチャと染料発光団のＵＶスペクトルはＤＰＩ₃によって影響されない。これは、ＵＶスペクトルが規制形状（衝突消光）によって変化する蛍光発光ヘアピンプローブと対照的である。
【０１１３】
「リアルタイム」ＰＣＲアッセイにおける蛍光発光ＤＰＩ₃プローブの性能
５´−フルオレセインとレッド１３アミドリンカとを備えて作成されたＤＰＩ₃プローブを、そのハイブリダイゼーション特性がリンカシステムと適合可能であるか否かを調べるために５´−ヌクレアーゼアッセイにおいてテストした。図３に図示されているように、ダブシルとレッド１３との両方が、ＭＧＢプローブに使用された時に、５´−ヌクレアーゼアッセイにおいてフルオレセインに対するクエンチャとして作用した。レッド１３は、初期蛍光発光（バックグランド）が低いこととＰＣＲ後のプラトーが高いことによって示されているように、ダブシルよりも性能がよかった。現在市販されているサーマル−サイクル螢光計では、リアルタイムＰＣＲにおいてより長い波長は読み取ることはできないが、レッド１３は、ＰＣＲ後のエンドポイントでのＴＡＭＲＡ含有プローブと良好なＳ／Ｎ比を提供することが示された。
【０１１４】
別の一般方法によれば、本発明の５´−フルオロフォア−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢ接合体は、直接的ハイブリダイゼーションによってＤＮＡ標的を検出するように構成されたアッセイにおいて性能を改善した。この方法の基本的説明は、ここに参考文献として合体させる米国特許第５，８７６，９３０号に見られる。このアッセイ方式において、非ハイブリダイズプローブ（ＦＲＥＴによって消光）が、リジッドな二本鎖構造を形成することによって蛍光発光性となり、これによって、クエンチャとフルオロフォアとを分離させる。
【０１１５】
【表３】

蛍光発光プローブの構造は、ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＣＤＰＩ₃であり、ここで、Ｑはレッド１３アミド、そしてＯＤＮ配列は５´−ＧＴＣ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＴＡ Ｃ（配列識別番号２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２））であった。フルオロフォアであるＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ，ｃｙ３及びｃｙ５は、市販のホスホルアミダイト試薬を使用して導入された。クマリンとレゾルフィン フルオロフォアは、後述するように作成されたホスホルアミダイト３４及び３７を使用して導入された。
【０１１６】
【表３】

蛍光発光プローブの構造は、ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＣＤＰＩ₃であり、ここで、Ｑはレッド１３アミド、そしてＯＤＮ配列は５´−ＧＴＣ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＴＡ Ｃ（配列識別番号２(SEQUENCE Id. No. 2)）であった。フルオロフォアであるＦＡＭ，ＴＡＭＲＡ，ｃｙ３及びｃｙ５は、市販のホスホルアミダイト試薬を使用して導入された。クマリンとレゾルフィン フルオロフォアは、後述するように作成されたホスホルアミダイト３４及び３７を使用して導入された。
【０１１７】
蛍光発光放出は、図４のオーバーレイスペクトルに図示されているように、ＦＡＭから十分に分離されている。表３に図示されているように、レゾルフィン蛍光発光も、レッド１３発光団によって消光される。このように、レゾルフィンホスホルアミダイトは、ＦＲＥＴプローブでの使用、及び、多色分析用のＦＡＭとの組み合わせの使用において非常に優れた特性を有している。
【０１１８】
表３に図示されているように、クマリン蛍光発光は、レッド１３発光団によっても消光される。従って、クマリンホスホルアミダイト試薬をＦＲＥＴプローブに、特に、多色分析用にＦＡＭと組み合わせて、導入することができる。
【０１１９】
ＦＲＥＴ式酵素基質
前記改良式クエンチャ分子は、その他のＦＲＥＴ式アッセイシステムに使用することができる。本発明の別の一般的用途によれば、クエンチャ分子と、フルオロフォアとが、酵素基質に付着され、この基質は、このＱ−基質−フルオロフォア接合体に対するその触媒作用によって、前記Ｑとフルオロフォア分子を開裂し分離する。例えば、反応スキーム３に図示されているペンタフルオロフェニル活性化エステル１１は、タンパク質分解酵素の研究のために、ペプチドのリジン残基の標識化に使用することができる。
【０１２０】
実験手順
一般的実験
すべての空気及び水感応性反応は、僅かに正圧のアルゴン下で行われた。無水溶剤は、Aldrich (Milwaukee, WI)から入手した。フラッシュクロマトグラフィを２３０−４００メッシュのシリカゲル上で行った。融点は、開放細管中でＭｅｌ−Ｔｅｍｐ融点装置で測定し、補正しなかった。元素分析を、Quantitative Technologies Inc. (Boundbrook, NJ)によって行った。ＵＶ可視吸収スペクトルを、２００−４００ｎｍの帯域で、ＵＶ−２１００(Shimadzu)又はLambda 2(Perkin Elmer)分光計によって記録した。¹Ｈ ＮＭＲスペクトルを、Bruker WP-200又はVarian XL-200分光計上で２０ＥＣで実行した。化学シフトは、Ｍｅ₄Ｓｉからダウンフィールドへｐｐｍで報告する。薄層クロマトグラフィを、シリカゲル６０Ｆ−２５４（EM Regents）アルミニウムバックのプレート上で実行した。
【０１２１】
例１
２−（｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝エチルアミノ）エチル（２Ｓ，４Ｒ）−２−｛［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル｝−４−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］（２−シアノ−エトキシ）ホスフィノオキシ｝ピロリジンカルボキシレート（５）。
２−（｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝エチルアミノ）エチル（５Ｓ，３Ｒ）−３−ヒドロキシ−５−（ヒドロキシメチル）ピロリジンカルボキシレート（３）。
９０ｍｌの無水ピリミジン中の、２−［４−（２−クロロ−４−ニトロフェニルアゾ）−Ｎ−エチルフェニルアミノ］エタノール(Disperse Red 13, Aldrich Chemical Co., 9.0 g, 28.80mmol)の溶液と４−ニトロフェニル クロロフォルメート(Aldrich Chemical Co., 9.4 g, 46.61 mmol)を、７０℃で４０分間攪拌し、中間体２を得た。前記反応溶液に対してエタノール（５．０ｍｌ）を添加し、その後、トランス−ヒドロキシプロリノール(リード（Reed）等,Bioog. Chem. 2: 217-225(1991)（エタノール中の０．５Ｍ溶液４２ｍｌ）とトリエチルアミン（３．２ｍｌ）とを添加した。その結果得られた溶液を３０分間７０℃で攪拌した。その溶液を乾燥状態まで蒸発させ、その残渣を１リットルの水中に懸濁させ、エチルアセテート（３ｘ５００ｍｌ）によって抽出した。プールされた抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。その残渣を、エチルアセテート中における０〜１０％メタノールのグラジエント溶出によるシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。その精製生成物フラクションを、蒸発させ、エチルアセテートエーテルから析出させた：９．２ｇ（５９％）；ＴＬＣ（エチルアセテート），Ｒ_f＝０．２５。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ８．４３（１Ｈ，ｄ，ｊ＝２．５Ｈｚ），８．２５（１Ｈ，ｄｄ，ｊ＝９．０及び２．４Ｈｚ），７．８６（２Ｈ，ｄ，ｊ＝９．１Ｈｚ），７．７８（１Ｈ，ｄ，ｊ＝９．０Ｈｚ），６．９６（２Ｈ，ｄ，ｊ＝９．３Ｈｚ），４．８８（１Ｈ，ｍ），４．６７（１Ｈ，ｔ，ｊ＝５．７Ｈｚ），４．１９（３Ｈ，ｍ），３．８０（１Ｈ，ｍ），３．７３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４ＨＺ），３．５６（２Ｈ，ｑ），３．４６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），３．２７（１Ｈ，ｍ），１．９４（１Ｈ，ｍ），１．７９（１Ｈ，ｍ），１．１７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８ＨＺ）。分析、計算Ｃ₂₂Ｈ₂₆ＣｌＮ₅Ｏ₆＋０．２Ｈ₂Ｏ：Ｃ，５３．３２；Ｈ，５．３７；Ｎ，１４．１３。結果：Ｃ，５３．２４，Ｈ，５．２５；Ｎ，１３．９９。
【０１２２】
２−（｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル］ジアゼニル｝フェニル｝エチルアミノ）エチル（５Ｓ，３Ｒ）−５−｛［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル｝−３−ヒドロキシピロリジンカルボキシレート（４）。
１３０ｍｌの無水ピリミジン中の３（９．１ｇ，１８．５３ｍｍｏｌ）の溶液に対して、６．２６ｇの塩化ジメトキシトリチルを添加した。この溶液を室温で３時間攪拌し、次に、３００ｍｌの５％重炭酸ナトリウム溶液に注いだ。この混合物を、エチルアセテート（２ｘ３００ｍｌ）で抽出し、その組み合わされた抽出物を、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、蒸発させた。その残渣を、エチルアセテート中の２０〜０％ヘキサン・グラジエント、その後、０〜２％のメタノール・グラジエント溶出でシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。このクロマトグラフィ溶離液も、１％のトリエチルアミンを含有していた。前記精製生成物フラクションを組み合わせて、アモルファス固体（ａｍｏｒｐｈｏｕｓ ｓｏｌｉｄ）を得た：１２．６６ｇ（８６％）；ＴＬＣ（エチルアセテート），Ｒ_f＝０．４４。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ８．４５（１Ｈ，ｓ），８．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ），７．８２（３Ｈ，ｍ），７．２７（４Ｈ，ｍ），７．１６（５Ｈ，ｍ），６．９５−６．７９（６Ｈ，ｍ），４．９５（１Ｈ，ｍ），４．３２（１Ｈ，ｍ），４．１４（１Ｈ，ｍ），３．９９（２Ｈ，ｍ），３．７３（１Ｈ，ｍ），３．６９（６Ｈ，ｍ），３．５６（１Ｈ，ｍ），３．４０−３．３０（２Ｈ，ｍ），３．１４（１Ｈ，ｍ），２．１０−１．８２（２Ｈ，ｍ），１．１６（３Ｈ，ｍ），１．０６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）。分析、計算Ｃ₄₃Ｈ₄₄ＣｌＮ₅Ｏ₈＋０．２Ｈ₂Ｏ：Ｃ，６４．７３；Ｈ，５．６１；Ｎ，８．７８。結果：Ｃ，６５．０８，Ｈ，５．７０；Ｎ，８．３１。
【０１２３】
２−（｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝エチルアミノ）エチル（２Ｓ，４Ｒ）−２−｛［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル｝−４−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］（２−シアノ−エトキシ）ホスフィノオキシ｝ピロリジンカルボキシレート（５）。
【０１２４】
【化７４】

【０１２５】
８．０ｍｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを含有した４４０ｍｌの無水塩化メチレン中に溶解した４（１２．６３ｇ，１５．１９ｍｍｏｌ）の溶液に、５．９４ｍｌの２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダイトを添加した。この溶液をアルゴン下で室温で３０分間攪拌した。その反応混合物を１０ｍｌのメタノールで処理し、４００ｍｌの５％重炭酸ナトリウム溶液に注入した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。その残渣を、エチルアセテート（２％ トリエチルアミン）中の４０−２０％ヘキサン・グラジエント溶出でシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。精製生成物フラクションを、蒸発させてアモルファス固体を得た：１４．７５ｇ（９３％収量）。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１４６．９３（一重項）。分析。計算Ｃ₅₂Ｈ₆₁ＣｌＮ₇Ｏ₉＋１．０Ｈ₂Ｏ：Ｃ，６１．６８；Ｈ，６．２７；Ｎ，９．６８。結果：Ｃ，６１．４４，Ｈ，６．４７；Ｎ，９．３５。
【０１２６】
例２
レッド１３−ピロリジン−ＤＭＴｒ−ＣＰＧ １２
ペンタフルオロフェニルエステル（１１）とレッド１３ ピロリジン ＤＭＴｒ ＣＰＧ（１２）の合成 反応スキーム３。
【０１２７】
【化７５】

【０１２８】
ペンタフルオロフェニルエステル（１１）を、例４と反応スキーム５に記載した、化合物２２の合成に使用したものと同じ方法によって合成する。
【０１２９】
レッド１３−ピロリジン−ＤＭＴｒ−ＣＰＧ（１２）
１０ｇのＬＣＡＡ ＣＰＧを、５ｍｌのＤＭＦ中の１１の０．３Ｍ溶液と合せて、緩やかに一晩撹伴し、その時、それを濾過し、２ｘ１００ｍＬのＤＭＦ，２ｘ１００ｍＬのアセトニトリル、及び２ｘ１００ｍＬのエーテルで洗浄した。微少量のエーテルを真空除去した（オイルポンプ）。未反応アミノ基を、前記ＣＰＧを４０ｍＬの乾燥ピリミジンと５ｍＬの無水酢酸とによって処理することによってアセチル化した。１．５時間の渦流（ｓｗｉｒｌｉｎｇ）後、ＣＰＧを濾過し、２ｘ１００ｍＬのＤＭＦ，２ｘ１００ｍＬのアセトニトリル、及び２ｘ１００ｍＬのエーテルで洗浄した。微少量のエーテルを真空除去した（オイルポンプ）。２５ｍＬの１：１／７０％過塩素酸：メタノール中で３ ５ｍｇのＣＰＧを処理することによって、前記ＣＰＧのＭＭＴローディングを、分析した。放出されたＭＭＴ陽イオンの吸収を４７２ｎｍで記録し、ローディングレベルを、下記の等式を使用して３０ ４０ｍｍｏｌ／ｇのＣＰＧに調節した。
ＭＭＴローディング（ｍｍｏｌ／ｇ）＝Ａ４７２ｘ体積（ｍＬ）ｘ１４．３，ＣＰＧ（ｍｇ）のｗｔ
【０１３０】
例３
２−（４−ニトロフェニル）エチル３−（ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イルカルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（１７）。（反応スキーム４）
２−（４−ニトロフェニル）エチル３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）オキシカルボニル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（１４）。
１０グラム（３３．１ｍｍｏｌ）の十分乾燥した３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）オキシカルボニル］ピロロ［３，２−ｅ］インドリン−７−カルボキシル酸(ボジャー（Boger）, D. L., コールマン（Coleman）, R.S. インベルゴ（Invergo）, B. J. (1987) J. Org. Chem. 52, 1521)をアルゴンを充填したフラスコに入れ、８４ｍＬのＴＨＦと１０．４ｍＬ（６６．２ｍｍｏｌ）のジエチルアゾカルボキシレート（ＤＥＡＤ）を添加する。次に、滴下漏斗をフラスコ（アルゴンでフラッシング）の上に載せ、ウォーターバス（フラスコを冷却するため）をその下に置く。１６０ｍＬのエチルエーテル中の、１７．３ｇ（６６ｍｍｏｌ）のトリフェニルホスフィンと６．６４ｇ（３９．７ｍｍｏｌ）の２−（ｐ−ニトロフェニル）エタノールの溶液を作る。この溶液を前記滴下漏斗に加え、その後、攪拌しながら、前記反応フラスコに滴下によって加える。反応を１時間進行させ、その時、反応が完全であるか否かを調べるためにＵＶ（２５４ｎｍ）によって調べるＴＬＣ分析（２：１ヘキサン／酢酸エチル）を行う。もしも反応が完全であれば、その場合、ベースラインスポット（帯青）が消え、０．５５のＲ_fで、生成物が暗色スポットとして現れる。多くの場合、特に反応物が完全に乾燥していない場合には、トリフェニルホスフィンとＤＥＡＤとの追加ポーションが必要である。その場合には、通常、元の量の１／１０、即ち、１．７３ｇのトリフェニルホスフィンと１．０４ｍＬのＤＥＡＤで十分である。これらは、攪拌溶液に対してニート（ｎｅａｔ）に添加することができる。更に１時間反応させ、その後、もう一回のＴＬＣ分析によって通常、完全な反応が示される。生成物は、通常、一部が沈殿し、これを濾過によって収集し、メタノールで洗浄し、次に、最小量（通常は８０−１００ｍｌ）の温アセトン中に溶解させ、その４倍の量の温メタノールを添加することによって再結晶化させる。数時間、恐らく一晩で４℃まで冷却させる。もとの沈殿物の上澄みを取り、シロップ状態又は乾燥状態まで蒸発させる。これも、最小量の温アセトン、通常は約１００−１２０ｍＬの温アセトン、中で溶解させる。これら二回の再結晶化に使用されるアセトンの総量は、通常約２００ｍＬである。前と同様に、アセトンの量の４倍に等しい量の温メタノールを添加する。溶液を冷却すると、ほとんど即座に結晶化が始まるが、これを数時間乃至一晩継続させる。再結晶化は極めて効率的であるが、前記反応上澄みからの生成物は、通常、十分に精製されていないので、再結晶化によって精製する。その収率は、約８５％である。（ｍｐ１９１−１９３℃）¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．８３（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８４（ｂｒ ｓ，１Ｈ），７．６４（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．９６（ｓ，１Ｈ），４．５６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），４．００（ｔ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｍ，４Ｈ），１．５１（ｓ，９Ｈ）。燃焼分析：結果：Ｃ，６３．１６％；Ｈ，５．５６％；Ｎ，９．４５％。計算０．４モル添加水：Ｃ，６２．８％；Ｈ，５．７％；Ｎ，９．１６％。
【０１３１】
２−（４−ニトロフェニル）エチル ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（１５）。
２グラム（４．４３ｍｍｏｌ）の１４を、丸底フラスコ中に量って入れる。次に、換気フード内で、２５ｍＬ（３２５ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸を添加し、フラスコをキャップし、攪拌する。固体は約１分間で溶解する。この混合物を１時間攪拌し、その時、脱保護が行われる（ＨＰＬＣをチェックとして使用することができる）。前記酸を、ロータリ・エバポレータ（トラップを使用）で蒸発させ、その生成物を、１００ｍＬの塩化メチレン中に溶解させる。これを、１００ｍＬの１／２乃至２／３飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回抽出する。水性相を、〜５０ｍＬの塩化メチレンで一度逆抽出し、これを残りと合せる。有機層を硫酸ナトリウム上で二回乾燥させ、蒸発させて茶色の固体を得る。所望の場合は、この物質を、塩化エチレン中に非常に濃縮された溶液として希釈し、メタノールによと冷却とによって再結晶化することができる。１００％に近い収率が通常得られる。ｍｐ １９２−１９４℃。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１１．５１（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝８．５１Ｈ），６．８０（ｓ，１Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），５．０３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．５４（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），３．１９（ｍ，２Ｈ），３．０４（ｔ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ）。燃焼分析：計算Ｃ₁₉Ｈ₁₇Ｎ₃Ｏ₄；Ｃ，６４．９４％；Ｈ，４．８８％；Ｎ，１１．９６％。結果：Ｃ，６５．５０％；Ｈ，４．７０％；Ｎ，１１．６４％。
【０１３２】
２−（４−ニトロフェニル）エチル ３−（｛３−［（ｔｅｒｔ−ブチル）オキシカルボニル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル｝カルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（１６）。
３．０９グラム（８．８ｍｍｏｌ）の１５を、２．６６グラム（８．８ｍｍｏｌ）の１３(ボジャー（Boger）, D. L. Coleman（コールマン）, R. S. （インベルゴ）Invergo,B. J. (1987) J. Org. Chem. 52, 1521)と混合し、４６ｍＬのＤＭＦを添加する。次に、３，８５グラム（８．７７ｍｍｏｌ）の１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を添加する。この混合物を約３時間攪拌する。混合物は最初は均質であるが、攪拌が進むにつれて、生成物の沈殿物が形成される。前記溶媒ＤＭＦを高真空下で蒸発させ、約１００ｍＬのメタノールを添加する。混合物を渦流し、焼結ガラス漏斗で濾過し、次に、３Ｘ５０ｍＬポーションのメタノールで完全に洗浄する。次に、それを真空乾燥させる。１００％に近い収率が通常得られる。ｍｐ １３２Ｅ−１３４℃。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）＊：１１．９３（ｓ，ＮＨ，１Ｈ），１１．６２（ｓ，ＮＨ，１Ｈ），８．３０（ｂｒ ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），８．２７（ｂｒ ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），８．１９（ｄ，芳香族陽子，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｄ，芳香族陽子，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），７．２９（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），７．０７（ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），６．９８（ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），４．６０（ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ），４．０２（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．２４（ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ），１．５２（ｓ，３ｘＣＨ₃，９Ｈ）。燃焼分析：計算：Ｃ，６６．１３％；Ｈ，５．２３％；Ｎ，１１．０２％。結果：Ｃ，６５．９４％，Ｈ，５．１９％；Ｎ，１１．０７％。
【０１３３】
２−（４−ニトロフェニル）エチル ３−（ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イルカルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（１７）
【０１３４】
【化７６】

【０１３５】
５グラムの１６をフラスコに入れる。１００ｍＬのトリフルオロ酢酸を添加し、混合物を攪拌する。１時間後、酸をロータリ・エバポレータで蒸発させ、１００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム溶液と１００ｍＬの水を添加する。この混合物を〜１／２時間、攪拌又は超音波処理し、次に濾過し、水と、その後エタノールとで洗浄し、真空乾燥させる。この物質は再結晶化することができる。それを、最小量の温ＤＭＦ中に溶解させ、次に、約３倍のポーションのエタノールを添加し、その溶液を２−３分間超音波処理する。クリーム色〜茶色の物質が結晶析出される。これを、メタノールで洗浄し、真空乾燥させる。その収率は理論値に近づく。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ１１．９６（ｓ，ＮＨ，１Ｈ），１１．７１（ｓ，ＮＨ，１Ｈ），８．３０（ｂｒ ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），８．２７（ｂｒ ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），８．１９（ｄ，芳香族陽子，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．６６（ｄ，芳香族陽子，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３４（ｍ，芳香族陽子，２Ｈ），７．０８（ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），７．０３（ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），４．６０（ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ），３．６８（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．２４（ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ）。燃焼分析：結果：Ｃ，６３．５５％，Ｈ，４．４２％；Ｎ，１１．９５％。計算，１／２モルの重炭酸ナトリウム混入：Ｃ，６３．４３％；Ｈ，４．４５％；Ｎ，１２．１３％。
【０１３６】
例４
２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル ３−［４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）ブタノイル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（２４）（反応スキーム５）
エチル ４−［（３−ヒドロキシプロピル）フェニルアミノ］ブタノエート（１９）
３−（フェニルアミノ）プロパン−１−オール(フアン・ヤンデ（Huang, Yande）;アリフ・アッタ M.（Arif, Atta M.）; ベントルード・ウェスレイ G．(Bentrude, Weseley G.); J. Org. Chem.; 58 (23) 1993; 6235-6246) （６５．６ｇ，０．４３ｍｏｌ）、エチル４−ブロモブチレート（１０４．５ｇ，０．５４ｍｏｌ）と１００ｍＬのエチルジイソプロピルアミンとの混合物を、１００℃で１時間攪拌する。反応物を室温まで冷却し、水４００ｍＬとエチルアセテート（５００ｍＬ）との間で分ける。有機層を、飽和ＮａＨＣＯ₃、塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させる。濃縮後に得られるオイルを、シリカ上でクロマトグラフィにかけ、１０％ＥｔＯＨ／ＣＨＣｌ₃によって溶出する。適当なフラクションの濃縮によって、無色、粘性オイルとして１１５ｇ（１００％）の所望の生成物が得られる。¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ７．２３（ｍ，２Ｈ），６．７２（ｍ，３Ｈ），４．１４（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ），３．４３（ｔ，７Ｈｚ，２Ｈ），３．３４（ｔ，７Ｈｚ，２Ｈ），２．３５（ｔ，７Ｈｚ），１．８８（ｍ，４Ｈ），１．２６（ｔ，７Ｈｚ，３Ｈ）。
【０１３７】
エチル４−（｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタノエート（２０）
２−クロロ−４−ニトロアニリン２．５ｇ（１０ｍｍｏｌ）を、１２５ｍＬのフラスコに入れ、６ｍＬの水を添加する。攪拌と超音波処理とによって、黄色のクロロニトロアミンの一部が溶解する。次に、この攪拌溶液を換気フード内で氷によって冷却し、１５．８ｍＬの濃縮（〜１２Ｍ）ＨＣｌを添加する。前記黄色物質の大半がこの時点で溶解する。前記フラスコに、滴下漏斗を取り付け、３−４ｍＬの水中の１．５１ｇ（２１．９ｍｍｏｌ）の亜硝酸ナトリウムの溶液を前記滴下漏斗に添加し、約２０分間に亘って攪拌しながら、フラスコ内の溶液にゆっくりと添加する。これが完了すると、０．６ｇ（〜２１ｍｍｏｌ）の尿素、その後、８．２ｍＬ酢酸中の溶液としての２．７３ｇのエチル ４−[（３−ヒドロキシプロピル）フェニルアミノ]ブタノエートを添加する。１分後、〜５０ｍＬの水中の酢酸ナトリウムを添加する。この混合物を室温で１時間攪拌させる。生成物の大半は、エマルジョンとして分離する。この混合物を、酢酸エチルと水との間に分ける。有機層をＮａＨＣＯ₃（３ｘ５０ｍｌ）、塩水（ｂｒｉｎｅ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。次に、有機溶媒を、シロップ状態まで蒸発させる。粗生成物を、シリカゲル（１．５ｘ２０インチ）上でクロマトグラフィにかけ、５０％酢酸エチル／ヘキサンで溶出する。適当なフラクションを収集し、組み合わせ、蒸発させ（３０−４０度）、そして真空乾燥させる。その生成物は暗色のオイルである。収率は約６８−７０％である。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．２４（ｄｄ，Ｊ₁＝９Ｈｚ，Ｊ₂＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，２Ｈ），４．６７（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＯＨ，１Ｈ），４．０７（ｑ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ₂Ｏ、２Ｈ），３．５（ｍ，脂肪族陽子，６Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），１．８４（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ），１．７２（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ），１．１８（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，ＣＨ₃，３Ｈ）。
【０１３８】
４−（｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル］ジアゼニル｝フェニル｝（３−ヒドロキシプロピル）アミノ）ブタン酸。
４０ｍＬのＴＨＦ中の２０（４．４８ｇ，１０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４０ｍＬのエタノールを添加し、その後、２０ｍＬの水中のＫＯＨ（０．８４ｇ，１５ｍｍｏｌ）と２０ｍＬのエタノールの溶液を添加する。その混合物を一晩攪拌し、濃縮する。その残渣を、１２５ｍＬの水中に懸濁させ、２．６ｍＬ（〜３ｅｑｖ．）の酢酸で処理し、４℃まで冷却する。その結果得られる固体を濾過し、水で洗い、乾燥させる。収率は定量である。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４２（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．２３（ｄｄ，Ｊ₁＝９Ｈｚ，Ｊ₂＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），７．８２（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，２Ｈ），７．９０（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），４．８（ｂｒ ｓ，ＯＨ，１Ｈ），３．５（ｍ，脂肪族陽子，６Ｈ），１．８６（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），１．７２（ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ）。
【０１３９】
４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）ブタン酸（２１）
前の工程からの４．２１ｇ（１０ｍｍｏｌ）の酸を、２５０ｍＬの丸底フラスコに入れる。乾燥ピリジン（５０−１００ｍｌ）を添加し、ロータリ・エバポレータで蒸発させる（３０−４０度）。このプロセスを１回〜２回繰返して、全ての水を除去する。前記フラスコの中身に乾燥ピリジン（８０ｍｌ）を添加する。次に、４．０７ｇ（１２ｍｍｏｌ）の塩化ジメトキシトリチルを添加する。１時間攪拌後、ピリジンを蒸発させ、その結果得られるシロップを数ミリリットルの１８：１：１塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミン中で溶解させる。１８：１：１塩化メチレン／メタノール／トリエチルアミンの溶出液でシリカゲルカラム（〜１．５”ｘ２０”）を準備し、生成物をカラムに通し、適切なフラクションを収集して合せる。溶媒が蒸発によって除去された後、その結果得られるアモルファス固体は、所望の生成物の他に、いくらかのトリエチルアンモニウム塩を含んでいる。不純度は、次の工程に干渉しないので、その生成物を追加の精製無しで使用する。
【０１４０】
２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル ４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］−プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）ブタノエート（２２）。
２１（１０ｍｍｏｌ）を含むフラスコに、７ｍＬのトリエチルアミンを添加し、その後、１００ｍＬの塩化メチレンを添加し、その後、２．０５ｍＬのペンタフルオロフェニルトリフルオロアセテート（ＰＦＰ−ＴＦＡ）を添加する。この溶液を半時間攪拌する。この時の最後に、反応は通常完了している（ＴＬＣ： ２：１ ヘキサン／酢酸エチル）。溶媒をロータリ・エバポレータで除去し、シロップを得て、これをシリカ上でクロマトグラフィにかけて１：３ 酢酸エチル／ヘキサンで溶出する。適当なフラクションを収集し、合せ、蒸発させ、真空乾燥させる。収率は４１％である。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ８．４３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．２４（ｄｄ，Ｊ₁＝９Ｈｚ，Ｊ₂＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子、１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子、１Ｈ），７．７８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ）， ７．４２−７．１５（ｍ，芳香族陽子，１０Ｈ），７．０７（ｍ，芳香族陽子，２Ｈ），７．００−６．８０（ｍ，芳香族陽子，４Ｈ），３．７２（ｓ，２ｘＣＨ₃，６Ｈ），３．５６（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．４８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），２．８９（ｔ，Ｊ＝７ＨＺ，脂肪族陽子，２Ｈ），１．９５（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ），１．８６（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ）。
【０１４１】
メチル ３−［４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）ブタノイル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（２３）。
１５ｍＬの無水ＤＭＦ中の２２（３．０ｇ，３．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．７５ｍＬ）を添加し、その後、メチル ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート(ボジャー（Boger）, D. L., コールマン（Coleman）, R. S. , インベルゴ（Invergo）, B. J. (1987) J. Org. Chem. 52, 1521)（０．８ｇ，３．７ｍｍｏｌ）を添加する。その結果得られた溶液を室温で２０時間保存する。その完了を確認するために、反応をＨＰＬＣによって分析する。ＤＭＦを、オイルポンプを備えたロータリ・エバポレータによって除去する。残渣である暗色シロップを、５０％酢酸エチル／ヘキサン（〜２５ｍＬ）中に懸濁させる。この混合物を超音波処理して結晶化を開始させる。結晶を１５分間攪拌し、焼結ガラス漏斗上での濾過によって収集し、メタノール（２ｘ３０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥させる。所望生成物の収量は、深紫色の固体として２．７ｇ（８７％）である。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９３（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，インドールＮＨ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．３−８．２（ｍ，芳香族陽子，２Ｈ），７．８５−７．７５（ｍ，芳香族陽子，３Ｈ），７．４５−７．１８（ｍ，芳香族陽子，１０Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，２Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，４Ｈ），４．１２（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．８７（ｓ，エステルＣＨ₃，３Ｈ），３．７１（ｓ，ＣＨ₃，６Ｈ），３．６０（ｂｒ ｔ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．４５（ｂｒ ｔ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．２９（ｂｒ ｔ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），２．５（ｂｒ ｔ，ＤＭＳＯ信号によって不明瞭化，脂肪族陽子，２Ｈ），１．８８（ｂｒ ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ）。
【０１４２】
２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル ３−［４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］−プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）ブタノイル］−ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（２４）
【０１４３】
【化７７】

【０１４４】
１．メチルエステルの加水分解
２５ｍＬのＴＨＦ中の２３（２．６７ｇ，２．９ｍｍｏｌ）の溶液に、メタノール（２５ｍＬ）とＨ₂Ｏ（１０ｍＬ）中の５％ＬｉＯＨ一水化物とを添加する。その結果得られる懸濁液を５０℃（浴温度）で９０分間攪拌すると、その時までに、透明な溶液が得られる。ＴＬＣ分析は出発物質を示さない。溶媒を真空下で除去し、生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂と冷１０％クエン酸との間に分ける。有機相をトリエチルアミンによって中和し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮する。その結果得られる生成物（アモルファス固体）を、高真空下で少なくとも３時間乾燥させ、追加の精製無しで次の工程に使用する。
【０１４５】
２．ＰＦＰエステルの作成
前の工程で得た生成物を１０ｍＬの無水ＤＭＦ中に溶解させる。トリエチルアミン（２ｍＬ）を添加し、その後、ＰＦＰ−ＴＦＡ（２ｍＬ，４．４ｍｍｏｌ）を添加する。その反応物を３０分間攪拌し、ＨＰＬＣによって分析する。出発物質、遊離酸は観察されないはずである。ＤＭＦを蒸発させ、その残渣である深紫色のシロップを１００ｍＬのＭｅＯＨ中に懸濁させる。３０分間の攪拌後、暗色の析出物が形成され、これを焼結ガラス漏斗上での濾過によって収集し、メタノール（２ｘ２０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥させる（１５−３０時間）。この操作によって、紫色の固体として所望の生成物が２．７ｇ（９４％）得られる。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．４５（ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，インドールＮＨ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．３８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．２４（ｄｄ，Ｊ₁＝９Ｈｚ，Ｊ₂＝２．５Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），７．８５−７．７５（ｍ，芳香族陽子，３Ｈ），７．５２−７．１８（ｍ，芳香族陽子，１１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，２Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，４Ｈ），４．１６（ｔ，Ｊ＝８．５ＨＺ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．７１（ｓ，ＣＨ₃，６Ｈ），３．６１（ｂｒ ｔ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．４７（ｂｒ ｔ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．３２（ｂｒ ｔ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），２．５（ｂｒ ｔ，ＤＭＳＯ信号によって不明瞭化，脂肪族陽子，２Ｈ），１．８８（ｂｒ ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ）。
【０１４６】
例５
２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル ３−｛［３−［４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）−フェニルメトキシ］プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝−アミノ）ブタノイル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル］カルボニル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル｝カルボニル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（２５ａ）、ここでＲ１＝２−Ｃｌそしてｔ＝ｖ＝３（反応スキーム６）
２−（４−ニトロフェニル）エチル ３−｛［３−（｛３−［４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）ブタノイル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル｝カルボニル）ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル］カルボニル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（２５）。
１００ｍＬの丸底フラスコに、１．３１ｇ（１．２２ｍｍｏｌ）の２４を量って入れる。これを２５ｍＬのジメチルホルムアミド中に溶解させる。次に０．８１ｍＬのトリエチルアミンを添加し、最後に０．６２３ｇ（１．１６２ｍｍｏｌ）の１７を添加する。その反応混合物を、一晩放置し、次に、溶液を〜１０ｍＬに濃縮し、その結果得られた沈殿物を、焼結ガラス漏斗を使用して濾過する。その固体を、十分な量のメタノール（真空に晒す前に、フィルタ中のスラッジをメタノールと攪拌する）で数回洗浄し、エーテルで洗浄する。溶出液が透明で実質的に無色になったところで深紫色の沈殿物を真空乾燥して１．５ｇ（９０％）の所望生成物を得る。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９６（ｓ，インドールＮＨ，１Ｈ），１１．７６（ｓ，インドールＮＨ，１Ｈ），１１．６９（ｓ，インドールＮＨ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ−２．４Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．３５−８．２０（ｍ，芳香族陽子，４Ｈ），８．１９（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，２Ｈ），７．８５−７．７５（ｍ，芳香族陽子，３Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，２Ｈ），７．４５−７．１８（ｍ，芳香族陽子，１２Ｈ），７．１０（ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），７．０１（ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），６．９９（ｍ，芳香族陽子，３Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，４Ｈ），４．６１（ｍ，脂肪族陽子 ，６Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．７１（ｓ，２ｘＣＨ₃Ｏ，６Ｈ），３．５９（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．４３（ｍ，脂肪族陽子，６Ｈ），３．３４（ｍ，水信号によって不明瞭化，脂肪族陽子，２Ｈ），３．２２（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），２．５（ｔ，ＤＭＳＯ信号によって不明瞭化，ＣＯＣＨ₂−，２Ｈ），１．８９（ｂｒ ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ）。分析：計算：Ｃ，６８．２７％；Ｈ，４．９５％；Ｎ，１０．８１％。結果：Ｃ，６８．０８％；Ｈ，４．９８％；Ｎ，１０．６３％。
【０１４７】
２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル ３−｛［３−（｛３−［４−（｛３−［ビス（４−メトキシフェニル）−フェニルメトキシ］プロピル｝｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝アミノ）ブタノイル］ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル］カルボニル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−イル｝カルボニル｝ピロロ［４，５−ｅ］インドリン−７−カルボキシレート（２５ａ）。
【０１４８】
【化７８】

【０１４９】
フラスコに、１．０ｇ（０．７３ｍｍｏｌ）の前工程からの生成物と、４０ｍＬのＴＨＦと、２．４６ｇのＤＢＵとを入れる。この混合物を５０度で４時間攪拌し、熱から離し、１５〜２０ｍｌに蒸発させる。前記生成物に約４０ｍＬのエタノールを添加し、この混合物を攪拌し超音波処理する。次に、沈殿物を、焼結ガラス漏斗で濾過し、４０−６０ｍＬの追加のエタノールで洗浄し、その後、類似量のエチルエーテルで洗浄し、それぞれの洗浄時に、溶出液がすぐに透明になるように、真空に晒す前にフィルタ内の物質を攪拌する。その生成物を、次の工程に使用する前に、１〜２時間真空乾燥させる。その物質を、１００ｍＬのフラスコ中で２０ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、溶解するように攪拌する。次に、０．６ｍＬ（４．３ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加し、その後、０．６ｍＬのＰＦＰ−ＴＦＡを添加する。この反応混合物をアルゴン下で一晩攪拌し、次に、ガム状態まで蒸発させ、〜１０ｍＬのＤＭＦを添加し、その後、〜８０ｍＬのメタノールを添加する。この混合物を渦流し、超音波処理し、次に、析出した生成物を濾過し、真空乾燥する。収率は８５−９０％である。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１２．０１（ｓ，インドールＮＨ，１Ｈ），１１．７６（ｓ，インドールＮＨ，１Ｈ），１１．６９（ｓ，インドールＮＨ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ−２．４Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），８．４０（ｂｒ ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），８．３５−８．２０（ｍ，芳香族陽子，３Ｈ），７．８５−７．７５（ｍ，芳香族陽子，３Ｈ），７．５９（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，芳香族陽子，１Ｈ），７．４５−７．１８（ｍ，芳香族陽子，１２Ｈ），７．１３（ｓ，芳香族陽子，１Ｈ），６．９９（ｍ，芳香族陽子，３Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ，芳香族陽子，４Ｈ），４．６６（ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．７１（ｓ，２ｘＣＨ₃Ｏ，６Ｈ），３．５９（ｍ，脂肪族陽子，２Ｈ），３．４３（ｍ，脂肪族陽子，６Ｈ），３．３４（ｍ，水信号によって不明瞭化，脂肪族陽子，２Ｈ），３．０８（ｔ，Ｊ＝５Ｈｚ，脂肪族陽子，２Ｈ），２．５（ｔ，ＤＭＳＯ信号によって不明瞭化，ＣＯＣＨ₂−，２Ｈ），１．８９（ｂｒ ｍ，脂肪族陽子，４Ｈ）。分析：結果：Ｃ，６３．５８％；Ｈ，４．１３％；Ｎ，９．５３％。計算：２．３モルの水；Ｃ，６３．９７；Ｈ，４．２１％；Ｎ，９．４４％。
【０１５０】
例６
ＤＭＴｒＯ−レッド１３−アミド−ＣＤＰＩ₃−ＣＰＧ（２９）
（反応スキーム７）
３−［（４−メトキシフェニル）ジフェニルアミノ］プロパン−１−オール（２６）。
オーブン乾燥させた２５０ｍＬの丸底フラスコ中で、攪拌によって、４ｇ（５３ｍｍｏｌ）の３−アミノプロパノールを、５０ｍＬの塩化メチレン中に溶解させた。この溶液を栓止めし、放置した。７．７ｇ（２４．９ｍｍｏｌ）の塩化モノメトキシトリチル（ＭＭＴ−Ｃｌ, Aldrich試薬グレード）を、別の５０ｍｌの塩化メチレン中に溶解させた。オーブン乾燥させた滴下漏斗を前記フラスコに取り付け、前記ＭＭＴ−Ｃｌ溶液を漏斗に添加した。次に、フラスコ中の前記溶液に、前記ＭＭＴ−Ｃｌ溶液を、〜１０分間に渡って添加した（いくらか熱が発生）。１時間後、反応をＴＬＣ（１：１ｖ／ｖ ヘキサン／酢酸エチル，Ｒ_f０．４）によって分析したところ、完了していることが判った。ニンヒドリンスプレー／熱によるＴＬＣスポットの可視化によって、微小量（高速移動）のビス−ＭＭＴ副産物を示した。前記反応混合物を分液漏斗中の２００ｍＬの塩化メチレン上に静置された２００ｍＬの水に添加した。この混合物を振とうし、層に分離した。水層は捨て、有機層を別の２００ｍＬの水で洗浄した。この有機層を１０−２０ｇの硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させて薄黄色のシロップとしての〜７ｇのトリチル化アミンを得た。この化合物は、更なる精製を必要とせず、一晩乾燥された。数日間後、前記シロップは固化した。生成物を、エーテル−ヘキサンから再結晶化し、白色固体（ｍｐ＝８９．５−９０．５ＥＣ）としての４．６ｇ（５３％収率）の２６を得た。分析、計算Ｃ₂₃Ｈ₂₅ＮＯ₂：Ｃ，７９．５１；Ｈ，７．２５；Ｎ，４．０３。結果：Ｃ，７９．４８；Ｈ．７．１８；Ｎ，３．９８。
【０１５１】
２−［（｛３−［４−メトキシフェニル］ジフェニルアミノ｝プロピル｝オキシカルボニル）メトキシ］−酢酸，トリエチルアンモニウム塩（２７）。
２．７２ｇ（７．８３ｍｍｏｌ）のアルコール（２６）を、１．３ｍＬ（９．４ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンと１．１ｇ（９．５ｇｍｍｏｌ）のグリコール酸無水物（ｇｌｙｃｏｌｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）とを含む２０ｍＬの塩化メチレン中に溶解させた。この混合物を、２時間攪拌した（均質になった）。ＴＬＣは、明白な反応（９：１／塩化メチレン：エタノール中のＲｆ＝０．３５）を示した。溶媒を蒸発によって除去し、９３％塩化メチレン、５％メタノール、及び２％トリメチルアミンで充填した１．５ｘ１８インチのシリカゲルカラムで、残渣をクロマトグラフィにかけた。生成物を含むフラクションを合せ、溶媒を蒸発によって除去した。乾燥ＤＭＦによる同時蒸発によって、少量の水及び残渣の揮発性溶媒の除去を確実にした。無色シロップ（２７）の収量は、１００％であると見做された。このシロップを、乾燥ＤＭＦ中に溶解させて、２３．４ｍＬ（〜０．３３Ｍ溶液）の最終量を得た。
【０１５２】
Ｎ−ＭＭＴジグリコレートＣＰＧ（２８）の合成
１０ｇのＬＣＡＡ−ＣＰＧを、１００ｍＬの丸底フラスコ中で、ＤＭＦ（１．６６ｍｍｏｌ）中の２７の０．３３Ｍ溶液の５ｍＬと合せた。２．５ｍＬのジイソプロピルエチルアミン、０．１１ｇ（０．８ｍｍｏｌ）のＨＯＢＴ及び０．６３ｇ（１．６６ｍｍｏｌ）のＨＢＴＵの溶液を準備し、これを前記ＣＰＧに添加した。この混合物を栓止めし、オービタルシェーカ（１５０ｒｐｍ）で１６時間渦流した。前記ＣＰＧを、中度空孔率（ｍｅｄｉｕｍ ｐｏｒｏｓｉｔｙ）焼結ガラス漏斗で濾過し、２ｘ１００ｍＬのＤＭＦ，２ｘ１００ｍＬのアセトニトリル、及び２ｘ１００ｍＬのエーテルで洗浄した。微小量のエーテルを真空（オイルポンプ）除去した。４０ｍＬの乾燥ピリジン及び５ｍＬの無水酢酸とでＣＰＧを処理することによって、未反応アミノ基をアセチル化した。１．５時間の渦流後、ＣＰＧを濾過し、２ｘ１００ｍＬのＤＭＦ，２ｘ１００ｍＬのアセトニトリル、及び２ｘ１００ｍＬのエーテルで洗浄した。微小量のエーテルを真空（オイルポンプ）除去した。前記ＣＰＧのＭＭＴローディングを、３−５ｍｇのＣＰＧを２５ｍＬの１：１／７０％過塩素酸：メタノール中で処理することによって分析した。放出されたＭＭＴ陽イオンの吸光度を４７２ｎｍで記録し、ローディング・レベルは、下記の等式を使用して９５．７：ｍｏｌ／ｇのＣＰＧとして計算した。
ＭＭＴローディング（：ｍｍｏｌ／ｇ）
＝Ａ₄₇₂ｘ体積（ｍＬ）ｘ１４．３÷ＣＰＧのｗｔ（ｍｇ）
【０１５３】
ＣＰＧ２９の合成
【０１５４】
【化７９】

【０１５５】
４ｇのＮ−ＭＭＴジグリコレートＣＰＧ（２８）を、中度空孔率焼結ガラス漏斗に計量した。ＣＰＧを、２５ｍＬの３％ＴＣＡ／ＤＣＭで処理することによって脱トリチル化した。薬匙による短時間の攪拌後、混合物を、濾過の前に５分間反応させた（黄色になった）。このプロセスを、濾液が無色になるまで４回繰返した。前記ＣＰＧを、４ｘ４０ｍＬの塩化メチレンで洗浄した。濾液を有機廃棄物として捨て、ＣＰＧを、４０ｍＬのアセトニトリル中の２０％トリエチルアミンでの処理によって中和した。薬匙による短時間の攪拌後、混合物を濾過し、２ｘ４０ｍＬのアセトニトリル、及び２ｘ４０ｍＬのエーテルで洗浄した。微小量のエーテルを真空（オイルポンプ）除去した。前記脱トリチル化ＣＰＧをすぐに次の固定反応に使用した。
【０１５６】
０．２５９ｇ（１８０：ｍｏｌ）の２５ａを、１５ｍＬのポリプロピレン試験管中で１２ｍＬの乾燥ＤＭＳＯと共に振とうした。１５分間後、その暗紫色の溶液を４ｇの脱トリチル化ジグリコーレートＣＰＧ（５０ｍＬの丸底フラスコ中）に添加した。これは、ＣＰＧ一グラム当たり、４５：ｍｏｌＰＦＰエステルの提供比に対応する。追加の５ｍＬのＤＭＳＯを前記ポリプロピレン試験管に追加して、残りのＰＦＰエステルを溶解させ、この溶液を前記ＣＰＧに添加した。２ｍＬのトリエチルアミンを前記混合物に添加し、この混合物を栓止めし、オービタルミキサで１４時間渦流した。ＣＰＧを濾過し、２ｘ５０ｍＬのＤＭＳＯ，２ｘ５０ｍＬのアセトニトリル、及び２ｘ５０ｍＬのエーテルで洗浄した。微小量のエーテルを真空（オイルポンプ）除去した。未反応アミノ基を、ＣＰＧを１０ｍＬの乾燥ピリジン、及び３ｍＬの無水酢酸とで処理することによってアセチル化した。６時間の渦流後、ＣＰＧを濾過し、２ｘ５０ｍＬのＤＭＦ，２ｘ５０ｍＬのアセトニトリル、及び２ｘ５０ｍＬのエーテルで洗浄した。微小量のエーテルを真空（オイルポンプ）除去した。前記ＣＰＧのＭＭＴローディングを、３−５ｍｇのＣＰＧを２５ｍＬの１：１ ／ ７０％過塩素酸：メタノール中で処理することによって分析した。放出されたＭＭＴ陽イオンの吸光度を４９８ｎｍで記録し、装填レベルは、下記の等式を使用して４５：ｍｏｌ／ｇのＣＰＧと計算された。
ＭＭＴローディング（：ｍｍｏｌ／ｇ）
＝Ａ₄₉₈ｘ体積（ｍＬ）ｘ１４．３÷ＣＰＧ（ｍｇ）のｗｔ
【０１５７】
例７
ＦＬ−ＯＤＮ−レッド１３−アミド−ＣＤＰＩ₃（３０）の合成
【０１５８】
【化８０】

【０１５９】
ＭＧＢ部分のヨウ素化を避ける為に、標準０．１Ｉ₂酸化溶液が０．０１−０．０１５に希釈された以外は、標準ホスホルアミダイト結合化学反応を使用してＣＰＧ２９上でオリゴヌクレオチドを合成した。ＦＡＭとＴＥＴとを、Glen Research社から入手可能な対応のホスホルアミダイトを使用して５´末端に導入した。
【０１６０】
例８
４−｛［Ｎ−（６−｛[ビス（メチルエチル）アミノ]（２−シアノエトキシ）ホスフィノオキシ｝ヘキシル）カルバモイル］メチル｝−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル２，２−ジメチルプロパノエート（３４ａ）。
Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）−２−（７−ヒドロキシ−２−オキソ（２Ｈ−クロメン−４−イル））アセトアミド（３２ａ）。
（７−ヒドロキシ−２−オキソ（２Ｈ−クロメン−４−イル）酢酸メチルエステル（１）をベーカー（Baker）等(J. Chem. Soc.; 1950;170,173)に従って合成した。
１５ｍＬのＤＭＦ中の３１（２．０ｇ，８．５ｍｍｏｌ）と６−アミノヘキサノール（４．０ｇ，３４．１ｍｍｏｌ）との溶液を、８０℃で２４時間加熱した。ＤＭＦを真空下で蒸発させ、生成物と過剰６−アミノヘキサノールとの混合物を粘性シロップとして得た。１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂での溶出によるシリカ上のクロマトグラフィと精製生成物フラクションの蒸発とによって、白色固体を得て、これをエーテルで洗浄し、真空乾燥させた。収量は２．０５ｇ（７５％）であった。
【０１６１】
４−｛［Ｎ−（６−ヒドロキシヘキシル）カルバモイル］メチル｝−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル ２，２−ジメチルプロパノエート（３３ａ）。
２０ｍＬの乾燥ピリミジン中の３２ａ（２．０ｇ，６．３ｍｍｏｌ）の溶液に、４，４´−塩化ジメトキシトリフェニルメチル（３．０ｇ，８．９ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を、室温で１時間保存し、ＴＬＣ分析したところ（酢酸エチル，Ｒ_f〜０．７）、完全な反応（第１ヒドロキシ基の保護）が示された。この溶液に、トリメチル無水酢酸（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（２．０ｍＬ，９．９ｍｍｏｌ）を添加し、その後、トリエチルアミン（５ｍＬ）と４−（ジメチルアミノ）ピリジン（０．３ｇ）を添加した。この混合物を５時間攪拌し、ＴＬＣ分析によって、フェノール基の完全な保護（Ｒ_f〜０．９，酢酸エチル）が示された。過剰の無水物をクエンチングするためにメタノールを添加した。真空下での蒸発とキシレンとの同時蒸発とによって、ピリジンを除去した。得られた生成物を、酢酸エチルと２％ＮａＨＣＯ₃との間で分け、有機相を真空下で濃縮して粗ＤＭＴ保護３３ａを得た。
【０１６２】
前記ＤＭＴ基を除去するために、ＤＭＴ誘導体をＣＨ₂Ｃｌ₂中の１００ｍＬの１０％ＭｅＯＨ中に溶解させ、０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸で処理した。１時間の攪拌後、反応混合物をトリエチルアミン（０．７ｍＬ）で中和し、濃縮した。その結果得られた粘性オイルを、酢酸エチルと水との間で分けた。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮した。得られた固体をエーテル（５０ｍＬ）中で懸濁させ３０分間攪拌した。所望の生成物は、不溶性物質であり、これは濾過によって収集し、エーテルで洗浄し乾燥させた。表記生成物３３の収量は１．６ｇ（６４％）であった。
【０１６３】
４−｛［Ｎ−（６−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］（２−シアノエトキシ）ホスフィノオキシ｝ヘキシル）カルバモイル］メチル｝−２−オキソ−２Ｈ−クロメン−７−イル ２，２−ジメチルプロパノエート（３４）。
【０１６４】
【化８１】

【０１６５】
１０ｍＬの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中の３３ａ（０．６ｇ，１．５ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（０．４ｍＬ）と、その後、２−シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３５ｍＬ，１．６ｍｍｏｌ）を添加した。この溶液を室温で１時間保存し、０．１ｍＬのＭｅＯＨによって処理した。溶媒を蒸発させ、残渣を、酢酸エチルと飽和ＮａＨＣＯ₃との間で分けた。有機相を飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮した。粗生成物を、シリカ上でクロマトグラフィにかけて、酢酸エチル中の５％トリエチルアミンで溶出した。精製生成物フラクションの濃縮と真空下での乾燥とによって、無色粘性オイルとして０．５９ｇ（６５％）の３４を得た。
【０１６６】
例９
８−（３−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］（２−シアノエトキシ）ホスフィノオキシ｝プロピル）−７−オキソフェノキサジン−３−イル ２，２−ジメチルプロパノエート（３７ａ）。（反応スキーム９）
７−ヒドロキシ−２−（３−ヒドロキシプロピル）フェノキサジン−３−オン（３５ａ）。
５０ｍＬのＭｅＯＨ中の、４−ニトロソレコルシノール（４−ｎｉｔｒｏｓｏｒｅｃｏｒｃｉｎｏｌ）（４．５ｇ，３２．４ｍｍｏｌ），４−（３−ヒドロキシプロピル）ベンゼン−１，３−ジオール(フォルチャシン（Forchiassin）, M.; ロッソ（Russo）, C., J. Heterocyc. Chem. 20, 1983, 493-494)（４．０ｇ，２３．８ｍｍｏｌ）とＭｎＯ₂（２．５ｇ，１７．６ｍｍｏｌ）との懸濁液を、〜０℃（氷浴）まで冷却した。この懸濁液に、２．５ｍＬの濃Ｈ₂ＳＯ₄を滴下添加し、この反応物を室温で５時間攪拌した。沈殿した赤色リザズリン化合物を濾過によって収集し、メタノールで洗浄し、乾燥させた。収量は５．５ｇであった。この生成物は均質ではなく、それには、レゾルフィン化合物とマンガン塩とが混入していた。
【０１６７】
前記粗リザズリン化合物を、２００ｍＬの水と５０ｍＬの濃ＮＨ₄ＯＨとの混合物中に懸濁させた。亜鉛末（ｚｉｎｃ ｄｕｓｔ）（２．０ｇ）を添加し、懸濁液を２０分間攪拌した。得られた紫色混合物を濾過し、その濾液を、部分過剰還元の生成物であるロイコレゾルフィンを酸化させるために空気を含ませて激しく攪拌した。その反応物を酢酸によって酸性化し、形成された茶色の固体を濾過によって収集し、水によって洗浄し、乾燥させた。収量は２．１ｇであった。その物質は、前記第１工程から行われていた分子内環形成の生成物である、〜５０％の２，３，４−トリヒドロ−２Ｈ−ピラノ［３，２−ｂ］フェノキサジン−９−オンを含有していた。その物質の残りが前記所望表記化合物３５であった。
【０１６８】
８−（３−ヒドロキシプロピル）−７−オキソフェノキサジン−３−イル ２，２−ジメトキシプロパノエート（３６ｂ）。
５０ｍＬのピリジン中の３５ａ（２．０ｇ）の懸濁液を、４，４´−塩化ジメトキシトリフェニルメチル（５．０ｇ，１４．８ｍｍｏｌ）で処理し、５時間攪拌した。いくらかの不溶性物質を除去するために、その混合物を濾過し、濾液をトリメチル酢酸無水物（２ｍＬ）で処理した。その溶液を１５時間攪拌し、過剰無水物をクエンチングするためにＭｅＯＨ（２ｍＬ）を添加した。３時間の攪拌後、その反応混合物を真空下で濃縮した。残渣ピリジンを、トリエチルアミンとキシレンとの同時蒸発によって除去した。得られた粗生成物３６ａを、シリカ上でクロマトグラフィにかけ、５０％酢酸エチル／ヘキサンでの溶出でした。
【０１６９】
ＤＭＴ誘導体を１００ｍＬの１０％ ＭｅＯＨ／ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させ、０．５ｍＬのトリフルオロ酢酸によって処理した。１時間後、トリエチルアミン（２ｍＬ）を添加し、その溶液を濃縮した。シリカ（酢酸エチル）上でのクロマトグラフィと乾燥とによって、オレンジ色の固体として所望の所望の生成物０．３８ｇを得た。
【０１７０】
８−（３−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］（２−シアノエトキシ）ホスフィノオキシ｝プロピル）−７−オキソフェノキサジン−３−イル ２，２−ジメトキシプロパノエート（３７ａ）。
【０１７１】
【化８２】

【０１７２】
３６ｂ（０．３８ｇ，１．１ｍｍｏｌ）を６ｍＬの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶解させた。トリエチルアミン（１．５ｍＬ）を添加し、次に、２−シアノエチル ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．２９ｍＬ，１．３ｍｍｏｌ）を添加した。その溶液を室温で３０分間保存し、ＭｅＯＨ（０．１ｍＬ）を添加し、その反応物を真空濃縮した。得られた残渣を酢酸エチルとＮａＨＣＯ₃との間で分けた。有機相を飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮して粗アミダイトを得た。これを２ｍＬのエーテル中に溶解させ、〜５０ｍＬのヘキサンに滴下添加した。得られたオレンジ色の固体を濾過によって収集し、ヘキサンで洗浄し、乾燥させた。収量は０．４ｇであった。
【０１７３】
例１０
３−｛［（ｔｅｒｔ−ブチル）（メチルエチル）アミノ］［２−（４−｛３−ブチル−７−［（４−メチルフェニル）−カルボニル］−２，４，６，８−テトラオキソ−１−（フェニルカルボニル）（１，３，５，７，９，１０−ヘキサヒドロ−ピリミジノ［５´，４´−５，６］ピリジノ［２，３−ｄ］ピリミジン−１０−イル）｝フェニル）エトキシ］−ホスフィノオキシ］プロパンニトリル（ＰＰＴ） ４４（反応スキーム１０）
３−ｎ−ブチル−６−［４−（２−ヒドロキシエチル）アミノフェニル］ウラシル ４０。
６−クロロ−３−ｎ−ブチルウラシル（１０．４ｇ，５１．３ｍｍｏｌ），２−（４−アミノフェニル）エタノール（１０．０ｇ，７２．９ｍｍｏｌ）及びエチルジイソプロピルアミン（１８ｍｌ，０．１ｍｏｌ）との混合物とを、１５０°オイル浴で１時間２０分、アルゴン下で攪拌しながら加熱した。この混合物を室温まで冷却し、５０ｍｌの水で希釈し、１０ｍｌの酢酸で処理し、一晩結晶化のための攪拌した。沈殿した固体を濾過し、２％酢酸で洗浄し、フィルタ上で乾燥させ、１００ｍｌの高温９６％エタノール中に溶解させた。この溶液に１００ｍｌの熱水を添加し、その後１．０ｇのチャコールを添加した。この混合物を高温濾過し、氷上で結晶化させた。黄色の固体を濾過によって収集し、真空乾燥させて１０．７ｇの４０を得た。ｍｐ２０７−２０８℃。₁Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ₃），１．２５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂），１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂），２．７０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＣＨ₂），３．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝１１．８，６．８Ｈｚ，ＣＨ₂），３．６８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ₂），４．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，ＯＨ），４．７３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，５−Ｈ），７．１０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ），７．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ），７．１０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１０．３７（Ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。
【０１７４】
３−ｎ−ブチル−１０−［（２−ヒドロキシエチル）フェニル］ピリド［２，３−ｄ；６，５−ｄ´］ジピリミジン−２，４，６，８−（３Ｈ，７Ｈ，９Ｈ，１０Ｈ）−テトロン ４１。
８０ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の４０（６．６ｇ，２０ｍｍｏｌ）と５−フォルミル−２，４−６−トリクロロピリミジン（５．８５ｇ，２７．７ｍｍｏｌ）の溶液を、室温で８時間攪拌し、８０ｍＬの水でゆっくりと希釈した。その溶液は、２日間の冷蔵で固体を生成した。この生成物を濾過によって分離し、冷５０％エタノール（５０ｍｌ）と２５％エタノール（５０ｍｌ）とで洗浄し、真空乾燥させて、無色固体として８．１６ｇ（９６％）の４１を得た，ｍｐ２０５−２１５℃（分解（ｄｅｃｏｍｐ））。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，ＣＨ₃），１．２７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂），１．４８（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂），２．８１−２．９０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂），３．７１−３．８５（ｍ，４Ｈ，ＣＨ₂），４．５０（ｂｒ．ｓ，５Ｈ，ＯＨ，ＮＨ，Ｈ₂Ｏ），７．２６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ），７．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，ＡｒＨ），８．６２（ｓ，１Ｈ，５−Ｈ）。
【０１７５】
３−ｎ−ブチル−５，１０−ジヒドロ−１０−［（２−ヒドロキシエチル）フェニル］ピリド［２，３−ｄ；６，５−ｄ´］ジピリミジン−２，４，６，８−（１Ｈ，３Ｈ，７Ｈ，９Ｈ，１０Ｈ）−テトロン。４２
３００ｍｌの２５％ＮＨ₃水溶液中の４１（７．９１ｇ，１８．７ｍｍｏｌ）の懸濁液に、Ｎａ₂Ｓ₂０₄（１３．８ｇ，８５％，６７ｍｍｏｌ）を添加し、攪拌しながら６０°までゆっくりと加熱した。この混合物を６０°で４０分間攪拌し、水（１００ｍｌ）で希釈し、更に１時間同じ温度で攪拌した。透明な溶液が形成された。この溶液をその元の量の半分まで一部蒸発させ、氷で冷却し、５０ｍｌの酢酸でｐＨ５まで中和させて、沈殿物を形成させた。混合物を完全な結晶化のため冷蔵庫で保存し、濾過し、冷水で洗浄した。その固体を真空乾燥させて白色固体として７．３２ｇ（９２％）の４２を得た。ｍｐ１８２−２１０℃（分解（ｄｅｃｏｍｐ））。¹Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）δ０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ₃），１．２３（ｍ、２Ｈ，ＣＨ₂）,１．４２（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂），２．８０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，ＣＨ₂），３．１４（ｓ，２Ｈ，５−ＣＨ₂），３．６８（ｍ，４Ｈ，ＡｒＣＨ₂ＣＨ₂），４．６４（ｔ，１Ｈ，ＯＨ），７．２５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＡｒＨ），７．３３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，ＡｒＨ），７．７３（ｂｒ．ｓ，３Ｈ，ＮＨ）。
【０１７６】
ＰＰＴ ４４
【０１７７】
【化８３】

【０１７８】
固体４２（１．２ｇ，２．８２ｍｍｏｌ）を、ピリジン（１０ｍｌ）と蒸発させ、ピリジン（１３ｍｌ）中で懸濁させ、Ｍｅ₃ＳｉＣｌ（２．２ｍｌ，１７．３ｍｍｏｌ）で処理し、アルゴン下、室温で３０分間攪拌した。その反応混合物を氷で冷却し、塩化トルオイル（５ｍｌ，２８．８ｍｍｏｌ）でゆっくりと処理した。攪拌を室温で２時間継続し、溶媒を蒸発させた。残渣を酢酸（１０ｍｌ）で処理し、その後、水（１０ｍｌ）を添加した。沈殿したオイルをヘキサン（３ｘ５０ｍｌ）で抽出し、ヘキサン中で不溶性の残渣を水と蒸発させた。残渣を９６％エタノール（１０ｍｌ）中に懸濁させ、濾過して０．３ｇの出発物質を回収した。母液を水で希釈して、オイルとしてビス−トルオイル誘導体を沈殿させた。このオイルを真空乾燥させて固体泡まつとして０．９６ｇ（５２％）の４３を得た。追加の精製無しでこの化合物を、以下の手順によってホスホルアミダイトに変換した。前記固体をアセトニトリルと蒸発させ、２５ｍｌのジクロロメタン中に溶解させ、ジイソプロピルアンモニウム テトラゾリド（０．５４ｇ，３．１３ｍｍｏｌ）で処理し、その後、２−シアノエチル テトライソプロピルホスホルアミダイト（０．８８ｇ，２．９ｍｍｏｌ）で処理した。その反応混合物をアルゴン下で１時間攪拌し、メタノール（１ｍｌ）で処理し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）に入れ、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させた。この溶液を蒸発させ、勾配システム０−５０％Ｂ；ＣＨ₂Ｃｌ₂−ヘキサン−ＮＥｔ₃（１５：３０：１）（Ａ）；ＥｔＯＡｃ（Ｂ）；３２０ｎｍで検出、を使用してシリカゲルカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。主要フラクションを蒸発させて、無色泡まつとして、０．７９ｇ（３３％）のＡＧｌホスホルアミダイト４４を得た。
¹Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ０．９２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ＣＨ₃），１．０７−１．４２（ｍ，１４Ｈ，４ｘＣＨ₃（ｉ−Ｐｒ），ＣＨ₂（Ｂｕ）），１．５０−１．６５（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂（Ｂｕ）），２．３５−２．６０（ｍ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＮ），２．４０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ₃Ａｒ），２．４６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ₃Ａｒ），２．９５−３．１３（ｍ，４Ｈ，２ｘＣＨ（ｉ−Ｐｒ），ＣＨ₂（Ｂｕ）），３．４５−３．６０（ｍ，２Ｈ，ＯＣＨ₂），３．８０−４．０２（ｍ，４Ｈ，ＡｒＣＨ₂ＣＨ₂），３．８２（ｓ，２Ｈ，５−ＣＨ₂），７．１５−７．３５（ｍ，８Ｈ，ＡｒＨ（Ｔｏｌ）），７．４５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７３（ｂｒ．ｓ，３Ｈ，ＮＨ），７．９５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＡｒＨ），８．０５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，ＡｒＨ）。³¹Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ（ｐｐｍ，Ｈ₃ＰＯ₄）１４３．２（ｓ）。
【０１７９】
例１１
Ｎ−｛３［４−［（１Ｚ）−１−アザ−２−（ジメチルアミノ）プロプ−１−エニル］−１−（５−｛［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメトキシ］メチル｝−４−｛［ビス（メチルエチル）アミノ］（２−シアノエチル）ホスフィノオキシ｝オキソラン−２−イル）ピラゾロ［５，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）プロピル）［２−（｛４−［（２−クロロ−４−ニトロフェニル）ジアゼニル］フェニル｝エチルアミノ）−エトキシ］カルボキシアミド（５０）（反応スキーム１１）
４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−３−（３−トリフルオロアセチミド−プロピン−１−イル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４６；ｎ＝１）。
１０ｍｌの無水ＤＭＦ中の４５（１．９６ｇ，５．２０ｍｍｏｌ）と、ＣｕＩ（１０３ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）とテトラキス［トリフェニルホスフィン］パラジウム［０］（３１７ｍｇ，０．２７６ｍｍｏｌ）の混合物に、無水トリエチルアミン（１．１ｍｌ）を添加し、その後、プロパルギル トリフルオロアセチイミド（１．５０ｇ，９．８８ｍｍｏｌ）を添加した。この反応混合物をアルゴン下で４時間攪拌した。溶媒ＤＭＦを蒸発によって除去し、残渣オイルを、シリカゲルクロマトグラフィによって、酢酸エチル中の７％メタノールで溶出して精製した。生成物フラクションをプールし蒸発させて、泡沫：２．１６ｇ（９９％）収量を得た。
【０１８０】
４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル）−３−（３−アミノプロピル）ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４７；ｎ＝１）。
カーボン（ギ酸によって事前に活性化）上の０．３００ｍｇの５％パラジウムを含有する、５０ｍｌのエタノール中の４６（２．１０ｇ，５．２５ｍｍｏｌ）の溶液に、１．０ｍｌの４Ｍ トリエチルアンモニウム フォルメート緩衝液（ｐＨ６．５）を添加した。この混合物を４０ｐｓｉの水素ガス下で１８時間振とうした。この混合物をセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）で濾過し、その濾液を蒸発させて、固体を得た。１．８ｇ（８５％）収量。
【０１８１】
前記固体を、１５ｍｌの濃縮水酸化アンモニウム中（封止フラスコ）で１２時間攪拌し、次に乾燥状態まで蒸発させた。前記固体（４７）を、乾燥アセトニトリルから蒸発させ、真空保存した：１．７４ｇ収量。
【０１８２】
４８（ｎ＝１，ｑ＝２，Ｒ₅＝ＣＨ₃ＣＨ₂−，Ｒ₅，Ｒ₅＝Ｈ，Ｒ₁＝２−Ｃｌ，Ｒ₅＝４−ＮＯ₂）の合成
４７（０．９０ｇ，２．９２ｍｍｏｌ）と７（１．５９ｇ，２．９２ｍｍｏｌ）との溶液を、１．０ｍｌのトリエチルアミンを含有する５．０ｍｌの無水ジメチルホルムアミド中に、５０℃で１．０時間攪拌した。この溶液を、乾燥状態まで蒸発させ、その残渣を、シリカゲルクロマトグラフィによって、酢酸エチル中の０−２０％メタノール・グラジエントで溶出して精製した。生成物フラクションを、蒸発させて、アモルファス固体：０．７４ｇ（３７％）収量を得た。
【０１８３】
４９（ｎ＝１，ｑ＝２，Ｒ₅＝ＣＨ₃ＣＨ₂−，Ｒ₅，Ｒ₅＝Ｈ，Ｒ₁＝２−Ｃｌ，Ｒ₅＝４−ＮＯ₂）の合成
５．０ｍｌのジメチルアセタミド中の４８（０．７１ｇ，１．０３ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルアセタミド ジメチルアセタール（１．９ｍｌ）の溶液に、２．０ｍｌのトリエチルアミンを添加した。この溶液を１８時間攪拌し、次に、乾燥状態まで蒸発させてオイルを得た：０．７５ｇ（１００％）収量。
【０１８４】
５０（ｎ＝１，ｑ＝２，Ｒ₅＝ＣＨ₃ＣＨ₂−，Ｒ₅，Ｒ₅＝Ｈ，Ｒ₁＝２−Ｃｌ，Ｒ₅＝４−ＮＯ₂）の合成
【０１８５】
【化８４】

【０１８６】
塩化ジメトキシトリチル（０．４２ｇ）を、１０ｍｌの乾燥ピリジン中の４９（０．７５ｇ，１．０３ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。この溶液をアルゴン下で４．０時間攪拌して、次に、２００ｍｌの５％重炭酸ナトリウム溶液に注入した。その生成物を、３００ｍｌの酢酸エチルで抽出した。この抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィによって、酢酸エチル（１％トリエチルアミン）中の１０％メタノールで溶出して精製した。生成物フラクションを、蒸発させて、泡沫：５５６ｇ（５７％）収量を得た。
【０１８７】
０．３０ｍｌのジイソプロピルエチルアミンを含有した、１５ｍｌの無水塩化メチレン中の５´−ジメトキシトリチル誘導体（５４０ｍｇ，０．５６７ｍｍｏｌ）の溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．２５ｍｌ）を添加した。アルゴン下で２５℃での３０分間の攪拌後、前記溶液を、１．０ｍｌのメタノールで処理し、２００ｍｌの酢酸エチルで希釈した。この溶液を、２００ｍｌの５％重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィによって、酢酸エチル（２％トリエチルアミン）中の５％メタノールで溶出して精製した。生成物フラクションを、蒸発させて、泡沫：４５３−ｍｇ（７６％）収量を得た。
【０１８８】
例１２
蛍光発光オリゴデオキシヌクレオチドプローブの合成
３´−ＤＰＩ₃プローブを、前に記載した(ルクタノフ（Lukhtanov）等, Biorg. Chem., 7:564-567(1996))方法を使用して、ＤＰＩ₃−修飾ガラス支持体から自動ＤＮＡ合成によって作成した。オリゴヌクレオチド合成を、ＣＤＰＩ₃部分のヨウ素化を避けるために酸化工程において０．０１５Ｍ（標準の０．１Ｍの代りに）のヨウ素溶液を利用した以外は、製造業者によって供給されたプロトコルに従って、ＡＢＩ３９４合成機で行った。ＰＣＲ中の伸長を防止するために、３´−ＣＤＰＩ₃無しのプローブを、前述したように(ギャンパー（Gamper）等, Biochem. 36:14816-14826(1997))、３´−ヒドロキシヘキシル ホスフェートを用いて作成した。前記クエンチャホスホルアミダイトを、ＣＰＧに添加し、標準β−シアノエチルホスホルアミダイトと試薬(Glen Research, Sterling, VA)をオリゴヌクレオチド合成に使用した。６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）ホスホルアミダイト(Glen Research)を使用して、５´−レポータ染料を導入した。或いは、ＴＡＭＲＡ−ｄＵ ホスホルアミダイト(Glen Research)，ｃｙ３又はｃｙ５ ホスホルアミダイト(Glen Research)，レゾルフィン ホスホルアミダイト、クマリン ホスホルアミダイト、又はＡＧ ホスホルアミダイトを使用して、５´−フルオロフォアを導入した。５´−ヘキシルアミン ホスホルアミダイト (Glen Research)を、３´−クエンチャ染料テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）の合成後接合のために、いくつかのＯＤＮに導入した。脱保護後、すべてのオリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ精製し、ブタノール濃縮／過塩素酸ナトリウム沈殿(ミレシ（Milesi）等, Methods Enzym. 313: 164-173(1999))によってナトリウム塩として分離した。
【０１８９】
例１３
ＴＡＭＲＡとのＯＤＮ合成後の接合
ＴＡＭＲＡ ＮＨＳエステル(Glen Research)を、製造業者によって提供されたプロトコルに従って、或る種のＯＤＮ中のヘキシルアミン リンカをアシル化するために使用した。その結果得られた二つの接合された染料を備えたＣＤＰＩ₃−プローブを、８％ポリアクリルアミドを使用した変性ゲル電気泳動によって精製した。所望のバンドを切除し、ゲルスライスを、１０ｍＬの１００ｍＭトリス−ＨＣｌ，１０ｍＭ塩化トリエチルアンモニウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．８）中で、３７℃で、一晩、インキュベートした。生成物を逆相ＨＰＬＣ，ブタノール濃縮、及び過塩素酸ナトリウム沈殿によって、前記抽出物から分離した。ペレットを水中で溶解させ、その濃度を、分光測光法によって測定した。最も近いモデル(カンター（Cantor）等, Biopolymers 9:1059-1077(1970)を使用して、ＯＮＤの消光係数（ε₂₆₀）を計算した。前記接合体及びプローブについて、消光係数は、ＯＤＮ及び取り込まれた残基であるＤＰＩ₃（６８，０００Ｍ^-1，ｃｍ^-1），６−ＦＡＭ（２２，８００Ｍ^-1，ｃｍ^-1），ＴＡＭＲＡ（３４，０００Ｍ^-1，ｃｍ^-1）及びクエンチャ（１１，３００Ｍ^-1，ｃｍ^-1）のε₂₆₀の合計として計算された。
【０１９０】
例１４
ヘビ毒液ホスホジエステラーゼによるオリゴヌクレオチドの消化
種々のクエンチャの蛍光消光能力を調べるために、オリゴヌクレオチドを、ヘビ毒液ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって消化した。２００ｎＭのオリゴヌクレオチドを、４０ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．９），５ｍＭのＭｇＣｌ₂及び０．０２５％のＢＳＡを含む緩衝液に入れた。ホスホジエステラーゼ(Pharmacia,Piscataway, NJ)５４単位の酵素を反応混合物に添加して３７℃で１６時間インキュベートする前に、初期蛍光発光を、ＬＳ５０Ｂ螢光計(Perkin-Elmer Corporation, Foster City CA)で読み取った。次に、最終蛍光発光を、前記ＬＳ５０Ｂを使用して測定した。初期蛍光発光に対する最終蛍光発光の比率が、クエンチャの信号対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比を表わす。それとは別に、オリゴヌクレオチドの完全な消化に必要な時間を測定するために、消化反応の反応速度（キネティクス）を前記ＬＢ５０Ｂを使用してモニタした。
【０１９１】
例１５
５´ヌクレアーゼＰＣＲアッセイ
ＣＤＰＩ₃−結合オリゴヌクレオチドは、５´末端にフルオロフォアであるＦＡＭを結合させ、上述した方法によって３´末端にリンカを介して種々のクエンチャを結合させた。調査中の種々のクエンチャの消光能力を調べるために、上記オリゴヌクレオチドで５´ヌクレアーゼアッセイを行った。蛍光発光モニタを、Idaho Technologies LC-24Light Cyclerによって行った。各反応物は、ＰＣＲ緩衝液（４０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ トリス ＨＣｌ，ｐＨ８．９，５ｍＭ ＭｇＳＯ₄，０．０５％ウシ血清アルブミン），１２５ｍＭの各ｄＮＴＰ，０．５ｍＭの各プライマ、０．１ｍＭ蛍光発光ＣＤＰＩ₃プローブ、０．５Ｕ／１０ｍＬのＴａｑポリメラーゼ及びテンプレートとしての０．１ｎｇ／１０ｍＬの合成ＤＮＡを含んでいた。サイクリング プログラムは、９５ＥＣで２秒間、次に、伸長温度（５５−７０Ｅ）で３０秒間を、５０サイクル（又は前述）であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、リアルタイム５´−ヌクレアーゼＰＣＲアッセイの略図である
【図２】図２は、ダブシル−及びレッド１３染料修飾ＤＮＡプローブのＵＶスペクトルを示すグラフである
【図３】図３は、「リアルタイム」ＰＣＲアッセイにおける蛍光発光ＭＧＢプローブの性能を示すグラフである
【図４】図４は、ＤＮＡプローブを含有する、バイオレット、ＦＡＭ及びレゾルフィン染料の蛍光発光スペクトルを示すグラフである

Claims (32)

1. 式ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑを有するオリゴヌクレオチド接合体。
   〔ここで、ＯＤＮは、オリゴヌクレオチド又は核酸、
   ＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮに共有結合付着されたフルオロフォア部分、そして
   Ｑは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮに共有結合付着されたクエンチャ部分であり、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する、
   

   

   〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ、n^＊＝１〜２０であり、Ｘ_２はＨ、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル、酸不安定性ブロッキング基である−（ＣＨ₂）_n＊−ＯＸ_２、又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃、そして、前記クエンチャ部分は、ａによって表わされる原子価結合を介して前記リンカに付着している。〕〕
2. Ｒ ₅ はエチルである請求項１に記載のオリゴヌクレオチド接合体。
3. 前記クエンチャ部分と、それを前記ＯＤＮに付着する前記リンカとは、下記の式Ｑ−１、Ｑ−２、Ｑ−３及び、Ｑ３ａに図示された部分から選択される構造を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド接合体。
   

   

   

   

   

   〔ここで、Ｒ_６はｎ^*が１〜２０である−（ＣＨ₂）_n＊であり、ｑは１〜２０、Ｘは−Ｏ−、−ＯＣＨ₂−又は−ＣＨ₂−であり、ｔとｖとは、独立的に、１〜２０、ｒとｓは、独立的に１〜２０、そして前記接合クエンチャとリンカ部分は、ａ又はｂによって示される原子価結合の一つを介して前記ＯＤＮに付着されている。〕
4. 更に、ａ又はｂによって示される原子価結合の一つを介して前記クエンチャ−リンカ接合体に付着する小溝バインダ部分を有する請求項３に記載のオリゴヌクレオチド接合体。
5. 前記クエンチャ部分と、それを前記ＯＤＮに付着するリンカとは、下記の式Ｑ−４及びＱ−５に図示された部分から選択される構造を有する請求項１に記載のオリゴヌクレオチド接合体。
   

   

   

   〔ここで、Ｒ₆はｎ^*は１〜２０である−（ＣＨ₂）_n*であり、ｑ、ｒ、ｔおよびｖは、独立的に、１〜２０、そして前記クエンチャ部分は、ａによって示される原子価結合を介して前記ＯＤＮに付着されている。〕
6. 下記の部分を有するオリゴヌクレオチド−フルオロフォア−クエンチャ接合体を作成するためのホスホルアミダイト試薬。
   

   

   〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃、そして、それに共有結合されたビス（メチルエチル）アミノ］（２−シアノエトキシ）ホスフィノオキシ部分である。〕
7. ＰＡ−１、ＰＡ−２及びＰＡ−３として示された式から成るグループから選択される式を有する請求項６に記載のホスホルアミダイト試薬。
   

   

   

   

   〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃、Ｒ₆はｎ^*が１〜２０である−（ＣＨ₂）_n*であり、ｑは１〜２０、Ｘは−Ｏ−又は−ＣＨ₂−、ｔ、ｖ、ｒ及びｓは、独立的に、１〜２０であり、そして、Ｘ₂は−Ｈ又はジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル又は酸不安定ブロック基である。〕
8. ＰＡ−１として示された式を有する請求項７に記載のホスホルアミダイト試薬。
9. ＰＡ−２として示された式を有する請求項７に記載のホスホルアミダイト試薬。
10. ＰＡ−３として示された式を有する請求項７に記載のホスホルアミダイト試薬。
11. Ｒ ₅ はエチルである請求項７に記載のホスホルアミダイト試薬。
12. 下記の構造を有するオリゴヌクレオチド合成に適した、共有結合した固体支持体とクエンチャとの接合体。
    

    

    〔ここで、ＣＰＧは、ポリマ固体支持体を示し、
    リンカは、１〜３０原子の長さを有し、ジフェニルアゾ部分を前記ＣＰＧに結合する部分、
    Ｘ₂は、−ＯＨ又はジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル又は酸不安定ブロック基、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、Ｒ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃である。〕
13. 下記の構造から選択される構造を有する請求項１２に記載の共有結合した固体支持体とクエンチャとの接合体。
    

    

    

    

    〔ここで、Ｒ₆はｎ^*が１〜２０である−（ＣＨ₂）_n*であり、そしてｑ、ｒ、ｔ
    及びｖは、独立的に、１〜２０である。〕
14. Ｒ ₅ はエチルである請求項１３に記載の共有結合した固体支持体とクエンチャとの接合体。
15. 式ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢを有するオリゴヌクレオチド接合体。
    〔ここで、ＯＤＮはオリゴヌクレオチド又は核酸、
    ＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮに共有結合付着されたフルオロフォア、そして、
    Ｑは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮに共有結合付着されたクエンチャ部分であり、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する、
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、Ｒ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃である〕、そして、
    ＭＧＢは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して、前記ＯＤＮ部分又は前記クエンチャ部分に共有結合付着された小溝バインダ部分である。〕
16. 前記ＭＧＢ部分は前記クエンチャ部分に付着し、前記共有結合ＭＧＢ−Ｑ部分は以下の構造を有する請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド接合体。
    

    

    〔ここで、ｔとｖとは、独立的に１〜２０であって、ａによって示される原子価結合が前記ＭＧＢ−Ｑ部分を前記ＯＤＮ部分に付着させている。〕
17. 以下の構造を有するオリゴヌクレオチド合成用の共有結合した小溝バインダ・クエンチャ試薬。
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、そしてｔとｖとは、独立的に１〜２０である、
    Ｘ₂は−Ｈ又はジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル又は酸不安定ブロック基、そして
    Ｘ₃は、ペンタフルオロフェニルオキシ、又はＮＨ−ＬＩＮＫＥＲ−ＣＰＧ又はＯ−ＬＩＮＫＥＲ−ＣＰＧであり、ここで、ＣＰＧはポリマ固体支持体であり、リンカは０〜３０原子の長さを有し前記三環性部分を前記ＣＰＧに結合する結合部分である。〕
18. Ｘ₃は、ペンタフルオロフェニルオキシである請求項１７に記載の共有結合した小溝バインダ・クエンチャ試薬。
19. Ｘ₃は、ＮＨ−ＬＩＮＫＥＲ−ＣＰＧ又はＯ−ＬＩＮＫＥＲ−ＣＰＧである請求項１７に記載の共有結合した小溝バインダ・クエンチャ試薬。
20. ｖ＝ｔ＝３である請求項１７の共有結合した小溝バインダ・クエンチャ試薬。
21. 下記の式のオリゴヌクレオチド接合体。
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、
    ＦＬは、３００〜８００ｎｍの帯域の発光波長を有するフルオロフォア部分、
    Ｋは、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＨから成るグループから選択される１〜３０原子を含むリンカ、
    ［Ａ−Ｂ］_nは、ＯＤＮ、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡ或いはそれらの組み合わせを示し、ここで、Ａは、糖とリン酸とが独立的に修飾され得る糖リン酸骨格鎖、Ｂは、複素環塩基、ここで、Ｂは、独立的に、プリン、ピリミジン、ピラゾロ［３、４−ｄ］ピリミジン、７−置換ピラゾロ［３、４−ｄ］ピリミジン−、７−デアザプリン、７−置換 ７−デアザプリン、及び修飾プリン−及びピリミジン−塩基であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＯＤＮは、これらの塩基のすべての組み合わせを含むことができる、そして、ｎは、前記ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はＯＤＮのヌクレオチド単位の数、Ｗは、Ｃ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、Ｐ及びＨから成るグループから選択される０〜３０原子の長さのリンカ、そして、ｍは、１〜２０の値を有する整数である。〕
22. 前記フルオロフォア部分は３００〜８００ｎｍの発光波長を有する請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド接合体。
23. 下記の式を有するオリゴヌクレオチド−フルオロフォア−クエンチャ接合体を作成するためのホスホルアミダイト試薬。
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、そして、Ｒ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃であり、
    ｎは１〜１０、
    ｑは１〜２０、そして、
    Ｘ₂は−Ｈ又はジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル又は酸不安定ブロック基である。〕
24. Ｒ ₅ はエチル、ｎは１、そしてｑは２である請求項２３に記載のホスホルアミダイト試薬。
25. 以下の工程を有する核酸をハイブリダイズする方法。
    （ａ）第１核酸と第２核酸を提供する
    （ｂ）前記両核酸をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする
    （ｃ）ハイブリダイズした核酸を同定する、ここで、前記核酸の少なくとも一つは、ＦＬ−核酸−Ｑ接合体を有し、ここでＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたフルオロフォア部分、そして、Ｑは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたクエンチャ部分であり、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、そしてＲ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃であり、そして、前記クエンチャ部分は、ａによって表わされる原子価結合を介して前記リンカに付着されている。〕
26. 前記クエンチャ部分の式Ｑにおいて、Ｒ ₅ はエチルである請求項２５に記載の方法。
27. 下記の工程を有する単一のヌクレオチドが異なるポリヌクレオチド間を識別する方法。
    （ａ）標的配列を有するポリヌクレオチドを提供する
    （ｂ）少なくとも二つのＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ接合体を提供する、ここで、ＯＤＮはオリゴヌクレオチド部分を示す、前記少なくとも二つのＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ接合体の一方は、前記標的配列に対して完全に相補的な配列を有し、前記少なくとも二つのＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ接合体の他方は、前記標的配列に対して単一のヌクレオチドミスマッチを有する
    （ｃ）ハイブリダイゼーション条件下で、前記ＦＬ−ＯＮＤ−Ｑ接合体のそれぞれを、別々に、前記ポリヌクレオチドとインキュベートする
    （ｄ）前記ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑのそれぞれと前記ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション強度を測定する、ここでＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたフルオロフォア部分であり、そしてＱは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたクエンチャ部分であり、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃であり、そして、前記クエンチャ部分は、ａによって表わされる原子価結合を介して前記リンカに付着されている。〕
28. 前記クエンチャ部分の式Ｑにおいて、Ｒ ₅ はエチルである請求項２７に記載の方法。
29. 以下の工程を有する核酸をハイブリダイズする方法。
    （ａ）第１核酸と第２核酸を提供する
    （ｂ）前記両核酸をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする
    （ｃ）ハイブリダイズした核酸を同定する、ここで、前記核酸の少なくとも一つは、ＦＬ−核酸−Ｑ−ＭＧＢ接合体を有する
    〔ここで、ＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたフルオロフォアであり、ＭＧＢは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮ部分又はクエンチャ部分に共有結合付着された小溝バインダ部分であり、そして、Ｑは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたクエンチャ部分であり、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する、
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃であり、そして、前記クエンチャ部分は、ａによって表わされる原子価結合を介して前記リンカに付着されている。〕〕
30. 核酸をハイブリダイズする方法であって、以下の工程を有する、
    （ａ）第１核酸と第２核酸を提供する、
    （ｂ）前記両核酸をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする、そして
    （ｃ）ハイブリダイズした核酸を同定する、
    ここで、前記核酸の少なくとも一つは、ＦＬ−核酸−Ｑ−ＭＧＢ接合体を有する
    〔ここで、ＭＧＢは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮ部分又は前記クエンチャ部分に共有結合付着された小溝バインダ部分、Ｑは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたクエンチャ部分であり、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する、
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ、n^＊＝１〜２０であり、Ｘ_２は−Ｈ、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル、酸不安定性ブロッキング基である−（ＣＨ₂）_n＊−ＯＸ_２、又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃であり、そして、前記クエンチャ部分は、ａによって表わされる原子価結合を介して前記リンカに付着している。〕、
    そしてＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたフルオロフォアであり、当該フルオロフォア部分は３００〜８００ｎｍの発光波長を有する。〕
31. 以下の工程を有する核酸をハイブリダイズする方法。
    （ａ）第１核酸と第２核酸を提供する
    （ｂ）前記両核酸をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする
    （ｃ）ハイブリダイズした核酸を同定する、ここで、前記核酸の少なくとも一つは、ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ−ＭＧＢ接合体を有する
    〔ここで、ＯＤＮは核酸又は修飾核酸であり、ＭＧＢは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮ部分又はクエンチャ部分に共有結合付着された小溝バインダ部分、Ｑは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮに共有結合付着されたクエンチャ部分、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する、
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ、n^＊＝１〜２０であり、Ｘ_２は−Ｈ、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル、酸不安定性ブロッキング基である−（ＣＨ₂）_n＊−ＯＸ_２、又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃であり、そして、前記クエンチャ部分は、ａによって表わされる原子価結合を介して前記リンカに付着している。〕、
    そして、ＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたフルオロフォアであり、当該フルオロフォア部分は３００〜８００ｎｍの発光波長を有する。〕
32. 以下の工程を有する核酸をハイブリダイズする方法。
    （ａ）第１核酸と第２核酸を提供する
    （ｂ）前記両核酸をハイブリダイゼーション条件下でインキュベートする
    （ｃ）ハイブリダイズした核酸を同定する、ここで、前記核酸の少なくとも一つは、ＦＬ−ＯＤＮ−Ｑ接合体を有する
    〔ここで、ＯＤＮは核酸又は修飾核酸であり、Ｑは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記ＯＤＮに共有結合付着されたクエンチャ部分、当該クエンチャ部分は下記の構造を有する、
    

    

    〔ここで、Ｒ ₀ は−Ｈ、Ｒ ₁ はベンゼン核の４位の−ＮＯ ₂ 、Ｒ ₂ はベンゼン核の２位の−Ｈ又は−Ｃｌ、そしてＲ ₃ 及びＲ ₄ は−Ｈであり、及びＲ₅＝−Ｈ、n^＊＝１〜２０であり、Ｘ_２は−Ｈ、ジメトキシトリチル、メトキシトリチル、トリチル、酸不安定性ブロッキング基である−（ＣＨ₂）_n＊−ＯＸ_２、又はｎ_´´＝０〜５である−（ＣＨ₂）_n´´ＣＨ₃であり、そして、前記クエンチャ部分は、ａによって表わされる原子価結合を介して前記リンカに付着している。〕
    そして、ＦＬは、０〜３０原子の長さを有するリンカを介して前記核酸に共有結合付着されたフルオロフォア部分であり、当該フルオロフォア部分は３００〜８００ｎｍの発光波長を有する。〕

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