ES2605493T3 - Detección de un polipéptido modificado post-traduccionalmente mediante un agente ligante bivalente - Google Patents

Abstract

Agente ligante bivalente aislado de fórmula I: A-a':a-S-b:b'-B (Fórmula I) capaz de unión a un polipéptido diana post-traduccionalmente fosforilado, comprendiendo el agente ligante bivalente exactamente dos ligantes monovalentes A y B de diferente especificidad que se unen entre sí mediante un conector, en el que: a) - representa un enlace covalente, b) a-S-b es el conector, con una longitud de entre 10 nm y 50 nm, en el que S es un espaciador, c) a':a y b:b' son parejas de unión que consisten de secuencias de ácidos nucleicos hibridantes, formando cada una un dúplex estable mediante apareamiento de múltiples bases, en el que las secuencias de la pareja de unión a':a no se unen a la secuencias de la pareja de unión b:b', respectivamente, y viceversa. d) el primer ligante monovalente A es una molécula que interactúa con el polipéptido diana en un único sitio de unión, en el que el primer ligante monovalente se unen a un epítopo de dicho polipéptido diana y en el que el epítopo del polipéptido no es sometido a una modificación post-traduccional, e) el segundo ligante monovalente B se une a una fosforilación post-traduccional, en el que la Kdis del segundo ligante monovalente es por lo menos 20 veces inferior para un polipéptido que porta la fosforilación post-traduccional que en el mismo polipéptido no fosforilado post-traduccionalmente, f) cada ligante monovalente se selecciona de entre el grupo que consiste de un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal y un fragmento Fab' de un anticuerpo monoclonal, g) cada ligante monovalente presenta una Kdis comprendida en el intervalo de entre 5x10-3/s y 10-4/s, determinada mediante espectroscopía de resonancia del plasmón superficial basada en un biosensor, y h) el agente ligante bivalente presenta una Kdis de 3x10-5/s o inferior, determinada mediante espectroscopía de resonancia del plasmón superficial basada en un biosensor.

Description

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En determinadas realizaciones, un ligante monovalente comprendido en el agente ligante bivalente de la presente invención es un anticuerpo de dominio único. Un anticuerpo de dominio único es una única cadena polipeptídica que comprende la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una parte del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de único dominio es un anticuerpo de único dominio humano (Domantis Inc., Waltham M.A.; ver, por ejemplo, la patente US nº 6.248.516 B1). En una realización, un anticuerpo de dominio único consiste de la totalidad o una parte del dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo.

Uno de los dos ligantes monovalentes, el primer ligante monovalente, se une a un epítopo de polipéptido sobre el polipéptido diana.

Un "epítopo de polipéptido" según la presente invención, el sitio de unión en el polipéptido diana unido mediante el ligante monovalente correspondiente, está compuesto de aminoácidos. Dicho ligante se une a un epítopo lineal, es decir, un epítopo que consiste de un tramo de 5 a 12 aminoácidos consecutivos, o el ligante monovalente se une a una estructura terciaria formada mediante la disposición espacial de varios tramos cortos del polipéptido diana. Los epítopos terciarios reconocidos por un ligante, por ejemplo por el sitio de reconocimiento de antígeno o paratopo de un anticuerpo, pueden considerarse características superficiales tridimensionales de una molécula de antígeno; estas características encajan con precisión en el sitio de unión correspondiente del ligante y de esta manera la unión entre el ligante y el polipéptido diana resulta facilitado.

Mientras que en el agente ligante bivalente tal como se da a conocer en la presente memoria el primer ligante monovalente se une a un epítopo de polipéptido, el segundo ligante monovalente se une a una modificación posttraduccional de polipéptido, concretamente a una fosforilación post-traduccional, según la invención.

Una "modificación post-traduccional de polipéptido" es una modificación covalente de un aminoácido dentro de un polipéptido (proteína) o en el extremo del mismo. Las expresiones modificación secundaria y modificación posttraduccional son intercambiables.

Son conocidos muchos tipos de modificaciones de aminoácido co-valentes y han sido el objeto de artículos científicos de revisión. Las modificaciones post-traduccionales descritas en los artículos de revisión de Mann y Jensen, 2003, y de Seo y Lee, 2004, se encuentran incluidas en la presente memoria como referencia (Mann M. y Jensen O.N., Nat. Biotechnol. 21:255-261, 2003; Seo J. y Lee, K.-J., Biochem. Mol. Biol. 37/1:35-44, 2004).

En una realización preferente dada a conocer en la presente memoria, la modificación post-traduccional se selecciona de entre el grupo que consiste de acetilación, fosforilación, acilación, metilación, glucosilación, ubiquitinilación, sumoilación, sulfatación y nitración. Según la invención, la modificación post-traduccional es una fosforilación.

La acetilación (+42 Da) es una modificación secundaria bastante estable. Son ejemplos la acetilación que se encuentra en los extremos N-terminales de muchas proteínas o la acetilación en los residuos de lisina o de serina. Habitualmente la acetilación de un residuo de lisina se encuentra en una o más posiciones bien definidas dentro de una cadena polipeptídica, mientras que otros residuos de lisina se encuentran menos acetilados o no se encuentran acetilados en absoluto.

La fosforilación y la desfosforilación (el equilibrio neto de los cuales pueden denominarse estado de fosforilación) de una proteína es conocido que es uno de los elementos clave en la regulación de la actividad biológica de la proteína. Un porcentaje bajo de residuos aminoácidos fosforilados ya puede resultar suficiente para inducir una determinada actividad biológica. La fosforilación resulta en un incremento de la masa de 80 Da. Los aminoácidos tirosina (Y), serina (S), treonina (T), histidina (H) y ácido aspártico (D) pueden encontrarse fosforilados. Cuanto más compleja sea la función biológica de un polipéptido, más complejo es el patrón correspondiente de los posibles sitios de fosforilación. Lo anterior es especialmente conocido y cierto para receptores unidos a membrana, especialmente las denominadas receptor tirosina quinasas (RTQ). Tal como ya sugiere la nomenclatura, por lo menos parte de la señalización intracelular de las RTQ se encuentra mediada por el estado de fosforilación de determinadas tirosinas del dominio intracelular de dichas RTQ.

Los polipéptidos pueden ser acilados por grupos farnesilo, miristoilo o palmitoilo. La acilación habitualmente se produce en la cadena lateral de un residuo cisteína.

La metilación como modificación secundaria se produce mediante la cadena lateral de un residuo de lisina. Se ha demostrado que las propiedades de unión de las proteínas reguladoras que son capaces de unirse a un ácido nucleico pueden ser modulados, por ejemplo, mediante metilación.

La glucosilación es una modificación secundaria muy importante. Presenta una influencia grande sobre las interacciones de proteína-proteína, sobre la solubilización de las proteínas y la estabilidad de las mismas. Se conocen dos tipos diferentes de glucosilación: las cadenas laterales unidas mediante N (mediante el N de aminoácido (asparagina)) y las cadenas laterales unidas mediante O (mediante serina (S) o treonina (T)). Se han 7

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En el cálculo de una longitud de espaciador o de conector, se aplican las aproximaciones siguientes: a) para el cálculo de las longitudes de las entidades no nucleosídicas, se utiliza una longitud de enlace promedio de 130 pm con un ángulo de enlace de 180º con independencia de la naturaleza de los átomos unidos, b) un nucleótido en una cadena sencilla se calcula en 500 pm, y c) un nucleótido en una doble cadena se calcula en 330 pm.

El valor de 130 pm se basa en el cálculo de la distancia de los dos átomos de carbono terminales de una cadena C(sp3)-C(sp3)-C(sp3) con un ángulo de enlace de 109º28' y una distancia de 153 pm entre los dos C(sp3), que es de aprox. 250 pm, que se traduce en un ángulo de enlace supuesto de 180ºC y una distancia de enlace entre los dos C(Sp3) de 125 pm. Considerando que algunos heteroátomos como P y S y átomos de carbono sp2 y sp1 también podrían ser parte del espaciador, se adopta el valor de 130 pm. En el caso de que un espaciador comprenda una estructura cíclica como cicloalquilo o arilo, se calcula la distancia de manera análoga mediante el recuento del número de enlaces de dicha estructura cíclica que son parte de la cadena global de átomos que definen la distancia.

Tal como se da a conocer el conector puede unir covalentemente los dos ligantes monovalentes. Según un aspecto de la invención, el conector y los ligantes monovalentes pueden unirse mediante dos parejas de unión específica diferentes, a:a' y b:b'. Por lo tanto, el agente ligante bivalente según la presente invención, ligante de un polipéptido diana modificado post-traduccionalmente, puede ilustrarse mediante la fórmula I, a continuación:

A-a':a-S-b:b'-B,

en la que A es un primer ligante monovalente, de unión a un epítopo de polipéptido de dicho polipéptido diana, en la que B es un segundo ligante monovalente, de unión a la fosforilación post-traduccional, en el que cada ligante monovalente A y B presenta una Kdis comprendida en el intervalo de entre 5x10-3/s y 10-4/s, en la que a':a , así como b:b', son independientemente una pareja de unión o a':a y/o b:b' se encuentran unidos covalentemente, en la que a':a y b:b' son diferentes, en la que S es un espaciador, en la que -representa un enlace covalente, en la que el conector a -S -b presenta una longitud de entre 10 nm y 50 nm y en la que el agente ligante bivalente presenta una Kdis de 3x10-5/s o inferior.

Se da a conocer un conector L que consiste de a -S -b que presenta una longitud de entre 6 y 100 nm. Preferentemente, el conector L que consiste de a -S -b que presenta una longitud de entre 6 y 80 nm. Se da a conocer además que el conector presenta una longitud de entre 6 y 50 nm o de entre 6 y 40 nm. En realizaciones específicas de la invención, el conector presenta una longitud de 10 nm o superior o de 15 nm o superior. Según la presente invención, el conector presenta una longitud de entre 10 nm y 50 nm. En una realización, a y b, respectivamente, son elementos de la pareja de unión y presenta una longitud de por lo menos 2,5 nm cada uno.

El espaciador S puede construirse como se requiera para proporcionar, por ejemplo, la longitud deseada, así como para otras propiedades deseadas. El espaciador puede estar, por ejemplo, compuesto total o parcialmente de aminoácidos naturales o no naturales, de unidades de fosfato-azúcar, por ejemplo un esqueleto similar a ADN sin nucleobases, o estructuras glucopeptídicas, o por lo menos parcialmente unidades sacáridas o por lo menos parcialmente subunidades polimerizables tales como glicoles o acrilamida.

La longitud del espaciador S en un compuesto según la presente invención puede modificarse según se desee. Con el fin de poner a fácil disposición espaciadores de longitud variable, una biblioteca, resulta preferente disponer de un simple acceso sintético a los espaciadores de dicha biblioteca. Resulta preferente una síntesis en fase sólida combinatorial de un espaciador. Debido a que los espaciadores deben sintetizarse hasta una longitud de aproximadamente 100 nm, se selecciona una estrategia de síntesis de manera que se ensamblan bloques constructivos sintéticos monoméricos durante la síntesis en fase sólida con un alta eficiencia. La síntesis de desoxioligonucleótidos basada en el ensamblaje de fosforamidita como bloques constructivos monoméricos cumple perfectamente dichos requisitos. En dicho espaciador se unen unidades monoméricas dentro del espaciador, en cada caso mediante una fracción fosfato o análogo de fosfato.

El espaciador S puede contener grupos libres cargados positiva y/o negativamente de ácidos aminocarboxílicos polifuncionales, por ejemplo amino, carboxilato o fosfato. Por ejemplo, los portadores de carga pueden derivarse de ácidos aminocarboxílicos trifuncionales que contienen: a) un grupo amino y dos grupos carboxilato, o b) dos grupos amino y un grupo carboxilato. Son ejemplos de dichos ácidos aminocarboxílicos trifuncionales, lisina, ornitina, hidroxilisina, ácido α,β-diamino-propiónico, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico, ácido carboxi-glutámico y ácidos carboxílicos trifuncionales simétricos tales como los indicados en los documentos nº EP-A-0 618 192 o nº USA-5.519.142. Alternativamente, uno de los grupos carboxilato en los ácidos aminocarboxílicos trifuncionales a) puede sustituirse con un grupo fosfato, sulfonato o sulfato. Un ejemplo de dicho aminoácido trifuncional es fosfoserina.

El espaciador S puede contener además grupos hidrofílicos no cargados. Son ejemplos preferentes de grupos hidrofílicos no cargados, grupos de óxido de etileno o de óxido de polietileno con preferentemente por lo menos tres unidades óxido de etileno, sulfóxido, sulfona, amida de ácido carboxílico, éster de ácido carboxílico, amida de ácido fosfónico, éster de ácido fosfónico, amida de ácido fosfórico, éster de ácido fosfórico, amida de ácido sulfónico, éster de ácido sulfónico, amida de ácido sulfúrico y éster de ácido sulfúrico. Los grupos amida preferentemente son grupos de amida primaria, particularmente preferentemente residuos amida de ácido carboxílico en grupos laterales

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aminoácidos, por ejemplo los aminoácidos asparagina y glutamina. Los ésteres se derivan preferentemente de alcoholes hidrofílicos, en particular alcoholes C1-C3 o dioles o trioles.

En una realización, el espaciador S está compuesto de un tipo de monómero. Por ejemplo, el espaciador está compuesto exclusivamente de aminoácidos, de residuos sacáridos, de dioles, de unidades de fosfo-azúcar, o puede ser un ácido nucleico, respectivamente.

En una realización, el espaciador es ADN. En una realización preferente, el espaciador es el L-estereoisómero de ADN también conocido como beta-L-ADN, L-ADN o ADN de imagen especular. El L-ADN presenta ventajas como el comportamiento de hibridación ortogonal, que implica que se forma un dúplex únicamente entre dos cadenas sencillas complementarias del L-ADN pero no se forma dúplex entre una cadena sencilla de L-ADN y la cadena de ADN complementaria, la resistencia a nucleasas y la facilidad de síntesis, incluso de un espaciador largo. Tal como se ha indicado, la facilidad de síntesis y la variabilidad de longitudes de los espaciadores resultan importantes para una biblioteca de espaciadores. Los espaciadores de longitud variable resultan extremadamente útiles para identificar el ligante dual bivalente según la presente invención que presenta un espaciador de longitud óptima, proporcionando de esta manera una distancia óptima entre los dos ligantes monovalentes.

Los bloques constructivos espaciadores, tal como indica el nombre, pueden utilizarse para introducir una fracción espaciadora en el espaciador S o para construir el espaciador S del conector a-S-b.

Se dispone de diferentes números y tipos de bloques constructivos espaciadores no nucleotídicos así como nucleotídicos para introducir fracciones espaciadoras.

Se conocen de la literatura muchos bloques constructivos espaciadores bifuncionales no nucleotídicos diferentes y se encuentra disponible comercialmente una gran diversidad de los mismos. La elección del bloque constructivo bifuncional no nucleotídico influye sobre la carga y flexibilidad de la molécula espaciadora.

En los bloques constructivos espaciadores bifuncionales, un grupo hidroxilo que se encuentra protegido con un grupo protector lábil a ácidos se conecta con un grupo fosforamidita.

Los bloques constructivos espaciadores bifuncionales en una realización son compuestos no nucleosídicos. Por ejemplo, dichos espaciadores son cadenas de carbonos alquilo, alquenilo o alquinilo C2-C18, mientras que dichas cadenas alquilo, alquenilo o alquinilo pueden interrumpirse con fracciones etilenoxi y/o amida adicionales o fracciones de amina catiónica cuaternizada con el fin de incrementar la hidrofilicidad del conector. También pueden utilizarse fracciones cíclicas tales como cicloalquilo C5-C6, heterocicloalquilo C4N, C5N, C4O o C5O, fenilo sustituido opcionalmente con uno o dos grupos alquilo C1-C6, como fracciones espaciadores bifuncionales no nucleosídicas. Los bloques constructivos bifuncionales preferentes comprenden fracciones alquilo C3-C6 y cadenas tri-a hexaetilenglicol. La Tabla I muestra algunos ejemplos de bloques constructivos espaciadores bifuncionales nucleotídicos con diferente hidrofilicidad, diferente rigidez y diferentes cargas. Un átomo de oxígeno se conecta con un grupo protector lábil a ácidos, preferentemente dimetoxitritilo, y el otro es parte de una fosforamidita.

Tabla I: ejemplos de bloques constructivos espaciadores bifuncionales no nucleotídicos

Bloques constructivos espaciadores bifuncionales no nucleotídicos

Referencia

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Seela, F., Nucleic Acids Research 15:3113-3129, 1987

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Lyer, R.P., Nucleic Acids Research 18:2855-2859, 1990

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WO 89/02931 A1

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EP 1 538 221

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US 2004/224372

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Una manera simple de construir el espaciador S o de introducir fracciones espaciadores en el espaciador S es utilizar bloques constructivos de fosforamidita D-o L-nucleósido estándar. En una realización, se utiliza un tramo de cadena sencilla de dT. Lo anterior resulta ventajoso debido a que dT no porta un grupo protector de base.

Puede utilizarse la hibridación con el fin de modificar la longitud del espaciador (distancia entre los elementos de la pareja de unión a y b) y la flexibilidad del espaciador debido a que se reduce la longitud de la doble cadena en comparación con la de la cadena sencilla y una doble cadena es más rígida que una cadena sencilla.

Para la hibridación, en una realización se utilizan oligonucleótidos modificados con una fracción funcional X. El oligonucleótido utilizado para la hibridación puede presentar una o dos extensiones terminales que no se hibridan con el espaciador y/o se encuentra ramificado internamente. Dichas extensiones terminales que no son hibridantes con el espaciador (y que no interfieren con las parejas de unión a:a' y b:b') pueden utilizarse para sucesos de hibridación adicionales. En una realización, un oligonucleótido hibridante con una extensión terminal es un oligonucleótido marcado. Dicho oligonucleótido marcado nuevamente puede comprender extensiones terminales o ser ramificado con el fin de permitir la hibridación adicional; de esta manera puede obtenerse un agregado polinucleótido o dendrímero. Preferentemente se utiliza un dendrímero poli-ácido oligonucleico para producir un polimarcaje o con el fin de obtener una concentración local elevada de X.

Se da a conocer en la presente memoria un espaciador S que presenta una longitud de esqueleto de entre 1 y 100 nm. En otras palabras, los grupos a y b de fórmula I están separados por una distancia de entre 1 y 100 nm. Además se da a conocer en la presente memoria que cada uno de a y b, respectivamente, es un elemento de pareja de unión y el espaciador S presenta una longitud de esqueleto de entre 1 y 95 nm.

"a':a", así como "b:b'", cada uno independientemente, representa una pareja de unión o representa a':a y/o b:b' unido covalentemente, respectivamente.

"a':a" así como "b:b'" son diferentes. El término diferente indica que la unión de a a a' (unión o acoplamiento covalente intra-pareja de unión) no interfiere con la unión o acoplamiento covalente intra-pareja de unión de la otra pareja b a b', y viceversa.

Tal como se da a conocer en la presente memoria, a':a o b:b' pueden unirse covalentemente. Según la invención, b:b' y a':a, respectivamente, representan una pareja de unión.

Tal como se da a conocer en la presente memoria tanto a':a como b:b' pueden unirse covalentemente.

Las reacciones de acoplamiento entre a':a y b:b' son diferentes y se seleccionan de entre protocolos estándares. Dependiendo de la naturaleza de la pareja de unión y del espaciador, se seleccionan reacciones de conjugación apropiadas.

La reacción utilizada en el acoplamiento de (a') con (a), es decir, en el acoplamiento A-(a') a un conector que comprende (a), no interfiere con la reacción utilizada en el acoplamiento (b) con (b'), es decir, en el acoplamiento (b')-B con un conector que comprende (b). Tal como apreciará el experto en la materia, los sitios reactivos (a), (a'),

(b) y (b'), respectivamente, que conducen al enlace covalente a':a así como b:b', respectivamente, preferentemente tampoco interfieren con cualquier grupo funcional que podría encontrarse presente en un ligante monovalente (A y/o B de fórmula I).

En el caso de que por lo menos uno de los ligantes monovalentes sea una proteína, un péptido o un mimético de péptido, probablemente porta uno o más grupos OH, COOH, NH2 y/o SH, que podrían reaccionar potencialmente

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Tal como apreciará el experto en la materia, un dúplex de ácidos nucleicos puede estabilizarse adicionalmente mediante el entrecruzamiento entre cadenas. El experto en la materia conocerá varios métodos de entrecruzamiento apropiados, por ejemplo métodos que utilizan psoralén o basados en tionucleósidos.

Las secuencias de ácidos nucleicos que representan los elementos de una pareja de unión preferentemente consisten de entre 12 y 50 nucleótidos. También resulta preferente que dichas secuencias de ácidos nucleicos consistan de entre 15 y 35 nucleótidos.

Las ARNasas son ubicuas y debe tenerse especial cuidado en evitar la digestión no deseada de las parejas de unión y/o secuencias espaciadoras basadas en ARN. Aunque ciertamente resulta posible utilizar, por ejemplo, parejas de unión y/o espaciadores basados en ARN y las parejas de unión y/o espaciadores basados en ADN representan una realización preferente.

Pueden diseñarse fácilmente secuencias de ácidos nucleicos hibridantes apropiadas, proporcionando más de dos parejas de oligonucleótidos complementarios ortogonales, lo que permite la fácil generación y utilización de más de dos parejas de unión. Otra ventaja de utilizar secuencias de ácidos nucleicos hibridantes en un agente ligante dual de la presente invención es que las modificaciones pueden introducirse fácilmente en las secuencias de ácidos nucleicos. Los bloques constructivos modificados se encuentran disponibles comercialmente, permitiendo, por ejemplo, la fácil síntesis de un conector que comprende una fracción funcional. Dicha fracción funcional puede introducirse fácilmente en cualquier posición deseada y en cualquiera de las estructuras a y a', así como b y b' y/o S, con la condición de que representen un oligonucleótido.

En una realización preferente, el espaciador S comprendido en un agente ligante según la fórmula I es un ácido nucleico. En una realización preferente, ambas parejas de unión son secuencias de ácidos nucleicos hibridantes y el espaciador S también es un ácido nucleico. En dicha realización, el conector L consistente de a -S -b es un oligonucleótido.

En el caso de que el espaciador S así como las secuencias a, a', b y b' sean todos secuencias oligonucleótidas, resulta fácilmente posible proporcionar y sintetizar un único oligonucleótido que represente el conector L, comprendiendo S y los elementos a y b de las parejas de unión a':a y b:b', respectivamente. En el caso de los ligantes monovalentes A y B, respectivamente, sean polipéptidos, cada uno de ellos puede acoplarse fácilmente con las secuencias de ácidos nucleicos hibridantes a' y b', respectivamente. La longitud del espaciador S comprendido en dicho constructo puede modificarse fácilmente de cualquier manera deseada. Basándose en los tres constructos a-S-b, A-a' y b'-B, el agente de unión de fórmula I puede obtenerse más fácilmente según procedimientos estándares mediante hibridación entre a':a y b:b', respectivamente. En el caso de que se utilicen espaciadores de longitud diferente, los constructos resultantes permiten agentes de unión dual de otro modo idénticos pero que presentan una distancia diferente entre los ligantes monovalentes A y B. Ello permite una distancia y/o flexibilidad óptima.

En una realización preferente, el espaciador S, así como las secuencias a, a', b y b' son de ADN.

El L-ADN enantiomérico es conocido por su comportamiento de hibridación ortogonal, su resistencia a nucleasas y su facilidad de síntesis de oligonucleótidos de longitud variable. Dicha fácil variabilidad en la longitud de conector mediante el diseño de espaciadores apropiados resulta importante para optimizar la unión de un agente de unión tal como se da a conocer en la presente memoria a su antígeno o antígenos.

En una realización preferente, el conector L (=a-S-b) es L-ADN o L-ARN enantiomérico. En una realización preferente, el conector a-S-b es L-ADN enantiomérico. En una realización preferente, a, a', b y b', así como el espaciador S, son de L-ADN o L-ARN enantiomérico. En una realización preferente, a, a', b y b', así como el espaciador S, son de L-ADN enantiomérico.

En una realización, el espaciador S es un oligonucleótido y se sintetiza en dos partes que comprenden extremos hibridables entre sí. En este caso, el espaciador S puede construirse simplemente mediante la hibridación entre sí de dichos extremos hibridables. El constructo espaciador resultante comprende una parte oligonucleótida dúplex. Tal como resultará evidente, en el caso de que el espaciador se construya de dicha manera, la secuencia de la entidad oligonucleótida hibridable que forma dicho dúplex se selecciona de manera que no pueda producirse hibridación o interferencia con las parejas de unión a:a' y b:b'.

Tal como se da a conocer en la presente memoria, los ligantes específicos monovalentes A y B de fórmula I pueden ser ácidos nucleicos. En una de las realizaciones dadas a conocer, a', a, b, b', A, B y S son todos secuencias oligonucleótidas. En la presente realización, las subunidades A-a', a-S-b y b'-B de fórmula I pueden sintetizarse fácil e independientemente siguiendo procedimientos estándares y combinarse mediante hibridación según procedimientos estándares convenientes.

Tal como se ha comentado en detalle anteriormente, el acoplamiento puede ser covalente o puede ser mediante parejas de unión específicas.

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Tal como apreciará fácilmente el experto en la materia, el agente ligante bivalente según la presente invención puede modificarse adicionalmente para portar una o más fracciones funcionales. Dicha fracción funcional X preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste de un grupo ligante, un grupo de marcaje, un grupo efector y un grupo reactivo. En el caso de que se encuentre presente más de una fracción funcional X, cada una de dichas fracciones funcionales puede en cada caso ser independientemente un grupo ligante, un grupo de marcaje, un grupo efector o un grupo reactivo.

En una realización, la fracción funcional X preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste de un grupo ligante, un grupo de marcaje y un grupo efector.

En una realización, el grupo X es un grupo ligante. Tal como resultará evidente para el experto en la materia, el grupo ligante X se selecciona para que no presente interferencia con las parejas a':a y b:b'.

Son ejemplos de grupos ligantes las parejas de una pareja de unión bioafín que pueden interactuar específicamente con la otra pareja de la pareja de unión bioafín. Dichas parejas de unión bioafines adecuadas son hapteno o antígeno/anticuerpo, biotina o análogos de biotina, tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina y avidina o estreptavidina; azúcar y lectina, oligonucleótido y oligonucleótido complementario, receptor y ligando, por ejemplo receptor de hormona esteroidea y hormona esteroidea. En una realización, X es un grupo ligante y se encuentra unido covalentemente a por lo menos uno de entre a', a, b, b' o S del compuesto de fórmula I. Preferentemente, la pareja más pequeña de una pareja de unión bioafín, por ejemplo la biotina o un análogo de la misma, un ligando de receptor, un hapteno o un oligonucleótido se une covalentemente a por lo menos uno de entre a', a, L, b o b' tal como se han definido anteriormente.

En una realización, la fracción funcional X es un grupo ligante seleccionando de entre hapteno, biotina o análogos de biotina, tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina, oligonucleótido y hormona esteroidea.

En una realización, la fracción funcional X es un grupo reactivo. El grupo reactivo puede seleccionarse de entre cualquier grupo reactivo conocido, tal como amino, sulfhidrilo, carboxilato, hidroxilo, azido, alquinilo o alquenilo. En una realización, el grupo reactivo se selecciona de entre maleimido, succinimidilo, ditiopiridilo, éster de nitrofenilo y éster de hexafluorofenilo.

En una realización, la fracción funcional X es un grupo de marcaje. El grupo de marcaje puede seleccionarse de entre cualquier grupo detectable conocido. El experto en la materia seleccionará el número de marcajes apropiado para una sensibilidad óptima con una extinción mínima.

El grupo de marcaje puede seleccionarse de entre cualquier grupo detectable conocido. En una realización, el grupo de marcaje puede seleccionarse de entre pigmentos tales como grupos de marcaje luminiscente, tales como grupos quimioluminiscentes, por ejemplo ésteres de acridinio o dioxetanos, o pigmentos fluorescentes, por ejemplo fluoresceína, coumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina y derivados de los mismos, complejos de metal luminiscente, tales como complejos de rutenio o de europio, enzimas tales como los utilizados para el CEDIA (por sus siglas en inglés, inmunoensayo de donante enzimático clonado, por ejemplo la patente EP nº 0 061 888), micropartículas o nanopartículas, por ejemplo partículas de látex o soluciones metálicas, e isótopos radioactivos.

En una realización, el grupo de marcaje es un complejo de metal luminiscente y el compuesto presenta una estructura de fórmula general (II):

[M(L1L2)L3)]n -Y -XmA (II)

en la que M es un catión metálico divalente o trivalente seleccionado de entre iones tierras raras o metales de transición, L1, L2 y L3 son iguales o diferentes y representan ligandos con por lo menos dos heterocíclicos que contienen nitrógeno, en los que L1, L2 y L3 se encuentran unidos al catión metálico mediante átomos de nitrógeno, X es un grupo funcional reactivo que se encuentra unido covalentemente a por lo menos uno de los ligandos L1, L2 y L3 mediante un conector Y, n es un número entero entre 1 y 10, preferentemente entre 1 y 4, m es 1 o 2 y preferentemente 1, y A se refiere al contraión que puede resultar necesario para ecualizar la carga.

El complejo metálico preferentemente es un complejo de metal luminiscente, es decir, un complejo metálico que experimenta una reacción de luminiscencia detectable tras una excitación apropiada. La reacción de luminiscencia puede detectarse, por ejemplo, mediante medición de la fluorescencia o electroquimioluminiscencia. El catión metálico en dicho complejo es, por ejemplo, un metal de transición o un metal tierra rara. El metal preferentemente es rutenio, osmio, renio, iridio, rodio, platino, indio, paladio, molibdeno, tecnecio, cobre, cromo o tungsteno. Resultan particularmente preferentes, rutenio, iridio, renio, cromo y osmio. El más preferente es el rutenio.

Los ligandos L1, L2 y L3 son ligandos con por lo menos dos heterociclos que contienen nitrógeno. Resultan preferentes los heterociclos aromáticos, tales como bipiridilo, bipirazilo, terpiridilo y fenantrolilo. Los ligandos L1, L2 y L3 se seleccionan particularmente preferentemente de entre los sistemas de anillos bipiridina y fenantrolina.

16

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utilizan para la introducción de una fracción funcional. Preferentemente, dichas entidades no nucleotídicas se encuentran situadas dentro del espaciador S, es decir, entre los dos elementos de la pareja de unión, a y b.

Se conocen de la literatura muchos bloques constructivos espaciadores modificadores no nucleotídicos diferentes y

5 se encuentra disponible comercialmente una gran diversidad de los mismos. Para la introducción de una fracción funcional se utilizan bloques constructivos modificadores bifuncionales no nucleosídicos o bloques constructivos modificados trifuncionales no nucleosídicos como VPC para el marcaje terminal o como fosforamidita para el marcaje interno (ver Wojczewski C. et al., Synlett 10:1667-1678, 1999).

10 Bloques constructivos modificadores bifuncionales

Los bloques constructivos modificadores bifuncionales conectan una fracción funcional o, en caso necesario, una fracción funcional protegida con un grupo fosforamidita para la unión del bloque constructivo en el extremo 5' (síntesis normal) o en el extremo 3' (síntesis invertida) al grupo hidroxilo terminal de una cadena oligonucleótida en

15 crecimiento.

Los bloques constructivos modificadores bifuncionales preferentemente son compuestos no nucleosídicos. Por ejemplo, dichos bloques constructivos modificados son cadenas de carbonos alquilo, alquenilo o alquinilo C2-C18, mientras que dichas cadenas alquilo, alquenilo o alquinilo pueden interrumpirse con fracciones etilenoxi y/o amida 20 adicionales con el fin de incrementar la hidrofilicidad del espaciador y de esta manera la estructura completa del conector. También pueden utilizarse fracciones cíclicas tales como cicloalquilo C5-C6, heterocicloalquilo C4N, C5N, C4O o C5O-, fenilo sustituido opcionalmente con uno o dos grupos alquilo C1-C6, como bloques constructivos modificados bifuncionales no nucleosídicos. Los bloques constructivos bifuncionales modificados preferentes comprenden fracciones alquilo C3-C6 y cadenas tri-a hexa-etilenglicol. Se proporcionan ejemplos no limitativos

25 aunque preferentes de bloques constructivos modificadores bifuncionales en la Tabla III, a continuación.

Tabla III:

Bloque constructivo modificador bifuncional no nucleosídico

Introducción de Referencia

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imagen18 Pon, R.T., Tetrahedron Letters 32:17151718, 1991 Theisen, P. et al., Nucleic Acids Symposium Series (1992), 27 (Nineteenth Symposium on Nucleic Acids Chemistry, 99100, 1992) EP 0 292 128

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imagen19 EP 0 523 978

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Meyer, A. et al., Journal of Organic Chemistry 75:3927-3930, 2010

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imagen22 Morocho, A.M. et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 22:1439-1441, 2003

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30

35

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Cocuzza, A.J., Tetrahedron Letters 30:62876290, 1989

Bloques constructivos modificadores trifuncionales

Los bloques constructivos trifuncionales conectan (i) una fracción funcional o, en caso necesario, una fracción funcional protegida, (ii) un grupo fosforamidita para el acoplamiento del informador o la fracción funcional o, en caso necesario, una fracción funcional protegida, durante la síntesis de oligonucleótidos a un grupo hidroxilo de la cadena oligonucleótida en crecimiento, e (iii) un grupo hidroxilo que está protegido con un grupo protector lábil frente a ácidos preferentemente con un grupo protector dimetoxitritilo. Tras la eliminación de dicho grupo protector lábil a ácidos se libera un grupo hidroxilo que puede reaccionar con fosforamiditas adicionales. Por lo tanto, los bloques constructivos trifuncionales permiten el posicionamiento de una fracción funcional en cualquier localización dentro de un oligonucleótido. Los bloques constructivos trifuncionales también son un requisito previo para la síntesis utilizando soportes sólidos, por ejemplo el vidrio de poro controlado (VPC), que se utilizan para el marcaje 3'-terminal de oligonucleótidos. En este caso, se conecta el bloque constructivo trifuncional con una fracción funcional o, en caso necesario, una fracción funcional protegida mediante cadenas de carbono alquilo, alquenilo o alquinilo C2-C18, mientras que dichas cadenas alquilo, alquenilo o alquinilo pueden encontrarse interrumpidas por fracciones etilenoxi y/o amida adicionales con el fin de incrementar la hidrofilicidad del espaciador y de esta manera de la estructura del conector completo y comprende un grupo hidroxilo que se encuentra unido mediante un espaciador cortable a una fase sólida y un grupo hidroxilo que se encuentra protegido con un grupo protector lábil a ácidos. Tras la eliminación de dicho grupo protector se libera un grupo hidroxilo que seguidamente puede reaccionar con una fosforamidita.

Los bloques constructivos trifuncionales pueden ser no nucleosídicos o nucleosídicos.

Los bloques constructivos trifuncionales no nucleosídicos son cadenas de carbonos alquilo, alquenilo o alquinilo C2-C18, mientras que dichas cadenas alquilo, alquenilo o alquinilo pueden interrumpirse opcionalmente con fracciones etilenoxi y/o amida adicionales con el fin de incrementar la hidrofilicidad del espaciador y de esta manera la estructura completa del conector. Otros bloques constructivos trifuncionales son grupos cíclicos como cicloalquilo C5-C6, C4N, C5N, C4O, C5O heterocicloalquilo, fenilo que se encuentran sustituidos opcionalmente con uno o más grupos alquilo C1-C6. Los grupos cíclicos y acíclicos pueden sustituirse con un grupo -alquilo C1-C18-O-PG, mientras que dicho alquilo C1-C18 comprende fracciones (etilenoxi)n, (amida)m, en donde n y m, independientemente, son iguales a 0 a 6 y PG es un grupo protector lábil a ácidos. Los bloques constructivos trifuncionales preferentes son alquilo C3-C6, cicloalquilo, fracciones heterocicloalquilo C5O que comprenden opcionalmente un enlace amida y sustituidos con un grupo alquilo C1-C6-O-PG, en el que PG es un grupo protector lábil a ácidos, preferentemente monometoxitritilo, dimetoxitritilo, pixilo, xantilo, más preferentemente dimetoxitritilo. Se resumen, por ejemplo, en la Tabla IV ejemplos no limitativos aunque preferentes de bloques constructivos trifuncionales no nucleosídicos.

Tabla IV: ejemplos de bloques constructivos modificadores trifuncionales no nucleosídicos

Trifuncional

Introducción de Referencia

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imagen26 Nelson, P.S. et al., Nucleic Acids Research 20:62536259, 1992. EP 0 313 219; US 5,585,481; US 5,451,463; EP 0 786 468; WO 92/11388; WO 89/02439

imagen27

imagen28 Su, S.-H. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 7:1639-1644, 1997 WO 97/43451

19

imagen29

imagen30 Putnam, W.C. et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids 24:1309-1323, 2005 US 2005/214833; EP 1 186 613

imagen31

imagen32 EP 1 431 298

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imagen34 WO 94/04550 Huynh, V. et al., Nucleic Acids Symposium Series 29 (Second International Symposium on Nucleic Acids Chemistry):19-20, 1993.

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imagen36 WO 2003/019145

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imagen38 Behrens, C. and Dahl, O., Nucleosides & Nucleotides 18 (1999) 291-305 WO 97/05156

imagen39

imagen40 Prokhorenko, I.A. et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 5 (1995) 2081-2084 WO 2003/104249

20

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Bloques constructivos modificadores nucleosídicos:

Se utilizan bloques constructivos modificadores nucleosídicos para el marcaje interno siempre que resulte necesario

5 no influir sobre las propiedades de hibridación de los oligonucleótidos en comparación con un oligonucleótido no modificado. Por lo tanto, los bloques constructivos nucleosídicos comprenden una base o un análogo de base que todavía es capaz de hibridarse con una base complementaria. La fórmula general de un compuesto de marcaje para el marcaje de una secuencia de ácidos nucleicos de uno o más de entre a, a', b, b' o S comprendido en un agente ligante según la fórmula I de la presente invención se proporciona en la fórmula II.

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en la que PG es un grupo protector lábil a los ácidos, preferentemente monometoxitritilo, dimetoxitritilo, pixilo, xantilo, más preferentemente dimetoxitritilo, en el que Y es alquilo, alquenilo o alquinilo C2-C18, en el que dicho alquilo,

15 alquenilo o alquinilo puede comprender fracciones etilenoxi y/o amida, en las que Y preferentemente es alquilo, alquenilo o alquinilo C4-C18 y contiene una fracción amida y en la que X es una fracción funcional a la que puede unirse un marcaje.

Las posiciones específicas de la base pueden seleccionarse para dicha sustitución con el fin de minimizar la

20 influencia sobre las propiedades de hibridación. Por lo tanto, las posiciones siguientes resultan preferentes para la sustitución: a) con bases naturales: uracilo sustituido en C5; citosina sustituida en C5 o en N4; adenina sustituida en C8 o en N6 y guanina sustituida en C8 o en N2, y b) con análogos de base: 7-deaza-A y 7-deaza-G sustituido en C7; 7-deaza-8-aza-A y 7-deaza-8-aza-G sustituido en C7; 7-deaza-aza-2-amino A sustituido en C7; pseudouridina sustituida en N1 y formicina sustituida en N2.

25 Se proporcionan en la Tabla V ejemplos no limitativos aunque preferentes de bloques constructivos trifuncionales nucleosídicos.

Tabla V:

Nucleósido trifuncional

A Referencia

imagen43

imagen44 Roget, A. et al., Nucleic Acids Research 17:7643-7651, 1989 WO 89/12642; WO 90/08156; WO 93/05060

21

imagen45

imagen46 Silva, J.A. et al., Biotecnologia Aplicada 15:154-158, 1998

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imagen48 US 6.531.581 EP 0 423 839

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imagen50 US 4.948.882, US 5.541.313, US 5.817.786

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imagen52 WO 2001/042505

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imagen54 McKeen,C.M.e t al., Organic & Biomolecular Chemistry 1:2267-2275, 2003

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imagen56 Ramzaeva N. et al., Helvetica Chimica Acta 83:1108-1126, 2000

En las Tablas III, IV y V, uno de los átomos de oxígeno terminales de una fracción bifuncional o uno de los átomos de oxígeno terminales de una fracción trifuncional es parte de una fosforamidita que no se muestra en detalle completo aunque resultará evidente para el experto en la materia. El segundo oxígeno de oxígeno terminal del

5 bloque constructivo trifuncional se encuentra protegido con un grupo protector lábil a ácidos PG, tal como se ha definido para la fórmula II, anteriormente.

La modificación post-sintética es otra estrategia para introducir una fracción funcional unida covalentemente en un conector o en una molécula espaciadora. En este enfoque, se introduce un grupo amino mediante la utilización de 10 un bloque constructivo bifuncional o trifuncional durante la síntesis en fase sólida. Tras la escisión del soporte y la purificación del oligonucleótido modificado amino, se hace reaccionar con un éster activado de una fracción funcional

o con un reactivo bifuncional en el que un grupo funcional es un éster activo. Los ésteres activos preferentes son ésteres de NHS o fenil-ésteres de pentaflúor.

15 La modificación post-sintética resulta especialmente útil para introducir una fracción funcional que no sea estable durante la síntesis en fase sólida y la desprotección. Son ejemplos la modificación con éster de trifenilfosfinocarboximetilo para la ligación de Staudinger (Wang C.C. et al., Bioconjugate Chemistry 14:697-701, 2003), la modificación con digoxigenina o para introducir un grupo maleinimido utilizando sulfo SMCC disponible comercialmente.

20 La fracción funcional X en una realización se encuentra unida a por lo menos uno de entre a', a, b, b' o S mediante una pareja de unión adicional.

La pareja de unión adicional a la que puede encontrarse unida una fracción funcional X preferentemente es un

25 dominio de cremallera de leucinas o un ácido nucleico hibridante. En el caso de que la fracción funcional X se encuentra unida a por lo menos uno de entre a', a, b, b' o S mediante un elemento adicional de pareja de unión, el elemento de pareja de unión al que se encuentra unido X y las parejas de unión a':a y b:b', respectivamente, se seleccionan todos para que presenten diferente especificidad. Las parejas de unión a:a' y b:b' y la pareja de unión a la que se encuentra unida X se unen (por ejemplo se hibridan), cada una, a su pareja respectiva sin interferir con la

30 unión de cualquiera de las otras parejas de unión.

23 5

15

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35

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65

Acoplamiento covalente de un elemento de una pareja de unión con un ligante monovalente

Dependiendo de la naturaleza bioquímica del ligante, se dispone de diferentes estrategias de conjugación.

En el caso de que el ligante sea una proteína natural o un polipéptido recombinante de entre 50 y 500 aminoácidos, existen procedimientos estándares en los libros de texto que describen las reacciones de síntesis de conjugados de proteínas que pueden ser fácilmente seguidas por el experto en la materia (Hackenberger C.P. y Schwarzer D., Angew Chem., Int. Ed., 47:10030-10074, 2008).

En una realización, se utiliza la reacción de una fracción maleinimido con un residuo de cisteína dentro de la proteína. Ésta es una reacción de acoplamiento preferente, en el caso de que se utilice, por ejemplo, un fragmento Fab o Fab' de un anticuerpo, un ligante monovalente. Alternativamente, en una realización se lleva a cabo el acoplamiento de un elemento de una pareja de unión (a' o b', respectivamente, de la fórmula I) con el extremo Cterminal del polipéptido ligante. La modificación C-terminal de una proteína, por ejemplo de un fragmento Fab, puede llevarse a cabo, por ejemplo, tal como indican Sunbul M. et al., Organic & Biomolecular Chemistry 7:3361-3371, 2009).

En general, la reacción específica de sitio y el acoplamiento covalente de un elemento de una pareja de unión con un ligante polipeptídico monovalente se basa en transformar un aminoácido natural en un aminoácido con una reactividad que es ortogonal respecto a la reactividad de los otros grupos funcionales presentes en una proteína. Por ejemplo, una cisteína específica dentro de un contexto de secuencia raro puede convertirse enzimáticamente en un aldehído (ver Formylglycine aldehyde tag -protein engineering through a novel post-translational modification (Frese, M.-A. et al., ChemBioChem 10:425-427, 2009). También resulta posible obtener una modificación de aminoácido deseada mediante la utilización de la reactividad enzimática específica de determinados enzimas con un aminoácido natural en un contexto de secuencia dado (ver, por ejemplo, Taki M. et al., Protein Engineering, Design & Selection 17:119-126, 2004; Gautier A. et al., Chemistry & Biology 15:128-136, 2008; la formación de enlaces C-N catalizada por proteasas es utilizada por Bordusa, F., Highlights in Bioorganic Chemistry 389-403, 2004) y la ligación de proteínas mediada por sortasa es utilizada por Mao H. et al., J. Am Chem Soc. 126:2670-2671, 2004 y revisada por Proft T., Biotechnol. Lett 32:1-10, 2010).

La reacción específica de sitio y el acoplamiento covalente de un elemento de pareja de unión a un ligante polipeptídico monovalente también puede llevarse a cabo mediante la reacción selectiva de aminoácidos terminales con reactivos modificados apropiados.

Puede utilizarse la reactividad de una cisteína N-terminal con benzonitrilos (Ren, Hongjun Xiao et al., Angewandte Chemie, International Edition 48:9658-9662, 2009) para conseguir un acoplamiento covalente específico de sitio.

La ligación química nativa también puede basarse en residuos de cisteína C-terminales (Taylor E. et al., Nucleic Acids and Molecular Biology 22:65-96, 2009).

La patente EP nº 1 074 563 describe un método de conjugación que se basa en la reacción más rápida de una cisteína dentro de un tramo de aminoácidos cargados negativamente con una cisteína situada en un tramo de aminoácidos cargados positivamente.

El ligante monovalente también puede ser un péptido sintético o mimético de péptido. En el caso de que se sintetice un péptido químicamente, pueden incorporarse aminoácidos con reactividad química ortogonal durante dicha síntesis (de Graaf A.J. et al., Bioconjugate Chemistry 20:1281-1295, 2009). Debido a que se encuentra incluida una gran diversidad de grupos funcionales ortogonales que pueden ser introducidos en un péptido sintético, la conjugación de dicho péptido con un conector es una reacción estándar.

Con el fin de obtener una proteína con un solo marcaje, el conjugado con estequiometría 1:1 puede separarse mediante cromatografía de otros productos de conjugación. Dicho procedimiento resulta facilitado por la utilización de un elemento de pareja de unión marcado con pigmento y un espaciador con carga. Mediante la utilización de este tipo de elemento de pareja de unión marcado y con elevada carga negativa, se separan con facilidad proteínas mono-conjugados de las proteínas no marcadas y de las proteínas que portan más de un conector, ya que puede utilizarse para la separación las diferencias de carga y peso molecular. El pigmento fluorescente resulta valioso para purificar el agente ligante bivalente de los componentes no unidos, tales como un ligante monovalente marcado.

Por lo tanto, en una realización resulta preferente utilizar un elemento de pareja de unión (a' y/o b', respectivamente, de fórmula I) que se encuentra marcado con un pigmento fluorescente (por ejemplo sintetizado utilizando un bloque constructivo modificador bifuncional o trifuncional en combinación con bloques constructivos espaciadores bifuncionales durante la síntesis) para formar el agente ligante bivalente de la presente invención. En una realización preferente, el espaciador S, así como las secuencias a, a', b y b' son de ADN y por lo menos una de entre a' y b', respectivamente, se marca con un pigmento fluorescente. En una realización preferente, el espaciador S, así como las secuencias a, a', b y b' son de ADN y tanto a' como b', respectivamente, se encuentran marcadas, cada una, con un pigmento fluorescente diferente.

24

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SEC ID nº 22 VL (mAb 7.2.32):

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SEC ID nº 23 VH (mAb 4.1.15):

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SEC ID nº 24 VL (mAb 4.1.15):

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2. Secuencias de ADNss 15 a) ADNss 19-mero (unido covalentemente en el extremo 3' con Fab' del mAb b anti-troponina-T o Fab' 8.1.2 con IGF-1R fosforilado, respectivamente)

5'-A GTC TAT TAA TGC TTC TGC-3' (SEC ID nº 5) 20 b) ADNss 17-mero (unido covalentemente en el extremo 5' con Fab' del mAb a anti-troponina-T o Fab'

1.4.168 con IGF-1R, respectivamente) 5'-AGT TCT ATC GTC GTC CA-3' (SEC ID nº 6) 25 c) ADNss 19-mero complementario (utilizado como parte de un conector) 5'-G CAG AAG CAT TAA TAG ACT-3' (SEC ID nº 7) d) ADNss 17-mero complementario (utilizado como parte de un conector)

30 5'-TGG ACG ACG ATA GAA CT-3' (SEC ID nº 8)

3. Secuencias de epítopos de troponina T:

35 SEC ID nº 9 = ERAEQQRIRAEREKEUUSLKDRIEKRRRAERAEamida, en la que U representa β-Alanina. (el epítopo "A" para el anticuerpo anti-troponina a.)

SEC ID nº 10 = SLKDRIERRRAERAEOOERAEQQRIRAEREKEamida, en el que O representa ácido aminotrioxa-octanoico. (el epítopo "B" para el anticuerpo anti-troponina b.) 40

4. Secuencias de los epítopos de IGF-1R/1R

SEC ID nº 11 = FDERQPYAHMNGGRKNERALPLPQSST; IGF-1R (1340-1366) 45 SEC ID nº 12 = YEEHIPYTHMNGGKKNGRILTLPRSNPS; hIR(1355-1382)

5. Conector proteico y secuencias de etiqueta: SEC ID nº 13 = motivo GGGGS (=G4S) (por ejemplo como parte de un polipéptido conector)

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SEC ID nº 14 = YPYDVPDYA (etiqueta HA)

SEC ID nº 15 = GLNDIFEAQKIEWHE (etiqueta Avi)

55 SEC ID nº 16 = LPETGGGSGS (etiqueta de corte de sortasa)

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Claims (1)

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