KR20160058777A

KR20160058777A - 멀티앱타머 표적 검출

Info

Publication number: KR20160058777A
Application number: KR1020167006262A
Authority: KR
Inventors: 우르스 에이. 옥스너; 루이스 에스. 그린; 래리 골드; 네보쟈 야닉
Original assignee: 소마로직, 인크.
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2016-05-25
Also published as: CA2924987C; US10392621B2; US9926566B2; US20160237435A1; KR102348283B1; CN114703193A; MX361451B; EP3049523A1; HK1218765A1; US20180187197A1; CN105555957A; JP2016531593A; AU2014326975A1; EP3049523B1; AU2014326975A2; SG11201602063UA; MX2016003320A; BR112016005957A2; JP6506768B2; EP3049523A4

Abstract

3원 착물을 형성할 수 있는 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 표적을 표함하는 조성물로서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머가 상이한 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하는 조성물, 및 그와 같은 조성물을 제조하는 방법 및 그것을 사용하는 방법이 본원에서 기재되어 있다.

Description

멀티앱타머 표적 검출{Multiaptamer target detection}

관련 출원

본원은 35 U.S.C. §119(e) 하에서 2013년 9월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/881,629호에 대해 우선권을 주장한다. 이들 참고문헌들 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.

기술분야

본 개시내용은 일반적으로 핵산 리간드의 분야, 및 더 구체적으로, 앱타머 쌍 기반의 표적 검출; 앱타머 쌍들 및 표적을 포함하는 조성물; 및 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

"sequence Listing.txt" (2014년 9월 24일에 만들어짐, 2 킬로바이트 크기) 명칭의 서열목록이 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.

단백질 진단은 다양한 임상적 유용성을 가지며 단백체 특징 (proteomic signature) 또는 질환-특이적 바이오마커를 결정하는데 유용하다. 이들 진단은 전형적으로 원하는 표적 (예를 들면, 단백질)의 포착 및 검출을 위한 분석물-특이적 시약의 쌍을 필요로 한다. 항체가 진단 시약으로서 널리 사용되어 왔으나, 이들은 충분한 품질 및 양으로 입수하기 어렵고, 다중 표적을 시험할 때 제한된 멀티플렉싱만을 허용할 수 있다. 게다가, 이들의 고유한 교차-반응성 및 비-보편적인 분석 조건으로 인해, 이들은 멀티플렉스 또는 고-함량 단백체 적용을 위한 어레이에서 제한된다.

항체와 달리, 핵산-기반의 리간드들은, 저분자량, 열 및 건조 안정성, 가역적 복원 (reversible renaturation), 제작 용이성, 및 더 낮은 비용을 포함하여, 항체에 비해 몇 가지 이점을 갖는다. 그러나, 2개의 상이한 앱타머에 의해 결합된 분석물들은 현재까지 단지 몇 가지 예만이 존재한다. 한 가지 예로서, 트롬빈의 피브리노겐-인식 및 헤파린-결합 2차결합부위 (exosite)에 대한 별개의 DNA 앱타머들이 기술되어 왔고, 이들 앱타머 TBA1 (15-량체) 및 TBA2 (29-량체)는 트롬빈 상의 별개의 양전기 표면에 결합하는 G-사중항 (G-quartet) 모티프로 구성된다. TBA1 및 TBA2를 이용한 샌드위치 분석이 잠재적인 트롬빈 모니터링을 위해 개발되어 왔고, 이는 앱타머 마이크로어레이 및 형광 감지 플랫폼을 포함한다. 또 하나의 예는 인테그린 α_Vβ₃으로서, α_V 또는 β₃ 서브유닛에 대한 RNA 앱타머들이 α_Vβ₃ 또는 α_IIbβ₃을 이용한 연속적 선택을 통해 생성되어 왔다. TATA 결합 단백질 (TBP), 프리온 단백질 (PrP), 및 VEGF-165에 대한 앱타머 쌍들이 또한 보고되어 왔다. 단백질 표적을 검출하기 위한 앱타머 쌍들의 제한된 수는 대개 양이온성 에피토프에 결합하는 앱타머의 성향의 결과일 것으로 예상되며, 이는 최상의 리간드들을 공통된 표면으로 유도한다. 따라서, 비-중첩 에피토프에 대한 선택을 강요하기 위해 특별한 선택 방법이 일반적으로 요구되어 왔다.

그러므로, 표적 단백질을 검출하는 개선되고, 비용-효과적이며 효율적인 방식을 위한 대안적인 조성물 및 방법이 계속 요구된다. 본 개시내용은 이들의 5-위치에서 변형된 데옥시우리딘 잔기를 포함하는, 단백질 검출을 위한 느린 오프-레이트 앱타머 (소마머(SOMAmer)) 시약 쌍들의 신규 조합을 제공함으로써 상기 요구를 충족시키며, 이는 종래의 앱타머와 비교하여 단백질 표적의 범위를 확장하고 결합 특성을 개선한다.

요약

본 개시내용은 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 표적을 포함하는 조성물을 기재하고, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 상이하고; 상기 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 상기 표적은 3원 착물을 형성할 수 있다.

본 개시내용의 또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 표적에 대해 결합 친화도를 가지며 상기 제2 앱타머에는 그렇지 않다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 표적에 대해 결합 친화도를 가지며 상기 제1 앱타머에는 그렇지 않다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 상기 제1 앱타머와 상기 표적과의 회합에 의해 형성된 착물에 대한 결합 친화도를 갖는다.

또 하나의 측면에서, 상기 표적의 제1 앱타머 결합 영역 및 상기 표적의 제2 앱타머 결합 영역은 상이한 영역이다. 관련된 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는 표적 상에 비-경쟁적 결합 부위를 갖는다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는, 독립적으로, RNA, DNA 또는 이들의 조합을 포함한다.

또 하나의 측면에서, C-5 변형된 피리미딘은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU) (또한 일명 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU), 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU), 및 이들의 조합.

또 하나의 관련된 측면에서, 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 하기로 이루어진 그룹으로부터 C-5 변형된 피리미딘이다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘 및 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘. 관련된 측면에서, 상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)이다.

또 하나의 측면에서, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-(N-[1-나프틸메틸]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-(N-[2-나프틸메틸]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 및 이들의 조합. 관련된 측면에서, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 및 이들의 조합. In yet 또 하나의 관련된 측면, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 및 이들의 조합.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘이다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘 및 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘. 관련된 측면에서, 제2 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)이다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머의 퍼센트 GC 함량은, 독립적으로, 약 37% 내지 약 58% (또는 약 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57% 또는 58%)이다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 약 9 내지 약 16 (또는 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16)개의 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 약 5 내지 약 15개의 C-변형된 피리미딘 (또는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15)이다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머 각각은, 독립적으로, 약 20 내지 100개의 뉴클레오타이드의 길이 (또는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개의 뉴클레오타이드의 길이)를 갖는다. 관련된 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는, 독립적으로, 약 40 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 길이 (또는 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개의 뉴클레오타이드의 길이)를 갖는다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함한다. 관련된 측면에서, 검출가능한 모이어티는 염료, 양자점, 방사선표지, 전기화학적 작용기, 효소, 효소 기질, 리간드 및 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또 하나의 측면에서, 표적은 단백질 또는 펩타이드를 포함한다. 관련된 측면에서, 표적은 ANGPT2, TSP2, CRDL1, MATN2, GPVI, ESAM, C7, PLG, MMP-12, NPS-PLA2 및 CdtA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질이다.

또 하나의 측면에서, 3원 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 적어도 0.02 nM, 또는 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 0.02 nM 내지 약 6 nM (또는 약 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6 nM) 또는 약 0.02 nM 내지 약 3 nM (또는 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.24, 0.26, 0.28, 0.3, 0.32, 0.34, 0.36, 0.38, 0.4, 0.42, 0.44, 0.46, 0.48, 0.5, 0.52, 0.54, 0.56, 0.58, 0.6, 0.62, 0.64, 0.66, 0.68, 0.7, 0.72, 0.74, 0.76, 0.78, 0.8, 0.82, 0.84, 0.86, 0.88, 0.9, 0.92, 0.94, 0.96, 0.98, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 nM)이다.

본 개시내용은 추가로, 샘플에서 표적을 검출하는 방법을 기재하고, 상기 방법은, 상기 샘플을 제1 앱타머와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 결합하여 제1 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제1 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물을 제2 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 앱타머는 제1 착물에 결합하여 제2 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제2 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머, 상기 표적, 상기 제1 착물 또는 상기 제2 착물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머, 상기 표적, 상기 제1 착물 또는 상기 제2 착물의 존재는, 상기 표적이 샘플 내에 존재하는 것을 나타내는 단계를 포함하고; 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 상이하다.

일 측면에서, 본 개시내용은 추가로, 본원에서 개시된 임의의 방법은 임의로, 동력학적 챌린지에 대해 수행될 수 있거나 그것을 포함할 수 있다는 것을 제공한다. 또 하나의 측면에서, 본원에서 기재된 방법은 추가로, 앱타머와 표적과의 결합 친화도을 개선하기 위해 경쟁자 분자, 희석 단계 또는 하나 이상의 세척제의 부가를 포함한다. 관련된 측면에서, 경쟁자 분자는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 올리고뉴클레오타이드, 헤파린, 청어 정자 DNA, 연어 정자 DNA, 덱스트란 설페이트, 다중음이온, 무염기성 포스포디에스테르 폴리머, dNTP, 및 파이로포스페이트. 또 하나의 측면에서, 동력학적 챌린지는 본원에 기재된 바와 같은 착물의 임의의 것을 함유하는 혼합물을 희석하는 단계, 및 상기 앱타머 친화성 착물을 함유하는 혼합물을 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 30 분, 및 60 분 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 시간 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 또 하나의 측면에서, 동력학적 챌린지는 상기 앱타머 친화성 착물을 함유하는 혼합물을 희석하는 단계 및 상기 앱타머 친화성 착물을 함유하는 혼합물을, 앱타머 친화성 착물의 측정된 수준 대 비-특이적 착물의 측정된 수준의 비가 증가되는 시간 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함한다.

또 하나의 측면에서, 샘플에서 표적을 검출하는 방법은 상기 샘플을 상기 제1 및 제2 앱타머과 동시에 접촉시키는 단계, 상기 혼합물을, 상기 표적 및 제1 및 제2 앱타머를 포함하는 착물의 형성을 허용하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계, 및 혼합물 중 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머, 상기 또는 상기 착물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머 또는 상기 착물의 존재는, 상기 표적이 샘플에 존재하는 지를 나타낸다.

또 하나의 측면에서, 제1 및 제2 앱타머 둘 모두는 착물을 상기 표적으로 독립적으로 형성할 수 있다. 특이적으로, 제2 앱타머는 착물을 상기 표적 단독으로 뿐만 아니라 상기 제1 앱타머와 상기 표적 사이의 착물로 형성할 수 있다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 표적에 대해 결합 친화도를 가지며 상기 제2 앱타머에는 그렇지 않다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 제1 착물에 대한 결합 친화도를 갖는다.

또 하나의 측면에서, 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 및 이들의 조합. 관련된 측면에서, 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 및 이들의 조합. In yet 또 하나의 관련된 측면, 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU) 및 이들의 조합. 또 하나의 관련된 측면에서, 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 하기로 이루어진 그룹으로부터 C-5 변형된 피리미딘이다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘 및 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘. 관련된 측면에서, 상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)이다.

또 하나의 측면에서, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 및 이들의 조합. 관련된 측면에서, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 및 이들의 조합. In yet 또 하나의 관련된 측면, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 및 이들의 조합.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머 각각은, 독립적으로, 20 내지 100개의 뉴클레오타이드의 길이 (또는 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개의 뉴클레오타이드의 길이)를 갖는다. 관련된 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는, 독립적으로, 약 40 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 길이 (또는 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개의 뉴클레오타이드의 길이)를 갖는다.

또 하나의 측면에서, 제2 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 적어도 0.02 nM, 또는 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 0.02 nM 내지 약 6 nM (또는 약 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6 nM) 또는 약 0.02 nM 내지 약 3 nM (또는 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.24, 0.26, 0.28, 0.3, 0.32, 0.34, 0.36, 0.38, 0.4, 0.42, 0.44, 0.46, 0.48, 0.5, 0.52, 0.54, 0.56, 0.58, 0.6, 0.62, 0.64, 0.66, 0.68, 0.7, 0.72, 0.74, 0.76, 0.78, 0.8, 0.82, 0.84, 0.86, 0.88, 0.9, 0.92, 0.94, 0.96, 0.98, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 nM)이다.

또 하나의 측면에서, 제1 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 약 0.04 nM 내지 약 5 nM (또는 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5 nM), 또는 약 0.04 nM 내지 약 4.8 nM (또는 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7 또는 4.8)이다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머 및 표적에 대한 해리 상수 (K _d )는 약 0.03 nM 내지 약 14 nM (또는 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.2, 10.4, 10.6, 10.8, 11, 11.2, 11.4, 11.6, 11.8, 12, 12.2, 12.4, 12.6, 12.8, 13, 13.2, 13.4, 13.6, 13.8 또는 14 nM)이다.

본 개시내용은 추가로, 표적을 제1 앱타머와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 결합하여 제1 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제1 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물을 제2 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 앱타머는 표적에 결합하여 제2 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제2 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머 및 싱기 제2 앱타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 기재하고, 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머 둘 모두의 존재는, 상기 제1 앱타머의 상기 표적에의 결합 및 상기 제2 앱타머의 상기 표적에의 결합은 비-경쟁적이라는 것을 나타내며; 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 상이하다.

또 하나의 측면에서, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 및 이들의 조합. 관련된 측면에서, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 및 이들의 조합. In yet 또 하나의 관련된 측면, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다: 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (NapdU) 및 이들의 조합.

또 하나의 측면에서, 제2 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 적어도 0.02 nM, 또는 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 0.02 nM 내지 약 6 nM(또는 약 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6 nM) 또는 약 0.02 nM 내지 약 3 nM (또는 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.24, 0.26, 0.28, 0.3, 0.32, 0.34, 0.36, 0.38, 0.4, 0.42, 0.44, 0.46, 0.48, 0.5, 0.52, 0.54, 0.56, 0.58, 0.6, 0.62, 0.64, 0.66, 0.68, 0.7, 0.72, 0.74, 0.76, 0.78, 0.8, 0.82, 0.84, 0.86, 0.88, 0.9, 0.92, 0.94, 0.96, 0.98, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 nM)이다.

또 하나의 측면에서, 제1 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 약 0.04 nM 내지 약 5 nM(또는 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9 또는 5 nM), 또는 약 0.04 nM 내지 약 4.8 nM (또는 0.04, 0.06, 0.08, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7 또는 4.8)이다.

본 개시내용은 추가로, 제1 앱타머 및/또는 제2 앱타머 및 표적 단백질, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머를 포함하는 조성물을 제공하고 상기 표적 단백질은 비-공유 상호작용에 의해 결합된다.

개시내용의 전술된 및 다른 목적, 특징, 및 이점은 수반되는 도면에 대한 언급과 함께 진행되는 하기의 상세한 설명으로부터 더 분명해질 것이다.

도 1은 단백질 표적에 대한 소마머 (변형된 DNA 앱타머) 쌍의 단리 및 확인을 위한 일반적인 전략을 도시한다. 도 1a는 비-경쟁적 클론 쌍에 대해 직접 스크리닝될 수 있는 5' 및 3' 고정된 영역을 갖는, 앱타머의 세트를 분리하기 위해 변형된 랜덤 ssDNA 라이브러리를 이용한 제1 SELEX (또는 1번째 SELEX)에서 사용되는 유리(free) 표적을 나타낸다. 각각의 앱타머의 40개의 뉴클레오타이드 랜덤 영역 내에서 사용될 수 있는 대표적인 화학적 변형이 제공된다 (예를 들면, Bn, Nap, Trp, PE, Try 및 2Nap로 축약됨). 만약 쌍들이 존재하지 않으면, 가장 우수한 결합 특성을 갖는 앱타머가 표적과 착물을 형성하게 되고, 이는 이후에 상이한 변형된 라이브러리를 이용한 제2 SELEX (또는 2번째 SELEX)에서 사용된다. 상기 새로운 앱타머 클론은 이후에 상기 표적에 대한 쌍으로 된 샌드위치 결합에 대해 스크리닝된다. 도 1b는 자유 CdtA 단백질 (풀(pool) 5551)을 이용하여 또는 CdtA-4758-6 착물 (풀 5579)을 이용하여 선택된 서열 패턴 및 다중사본 서열의 묘사를 나타내며; T=2NapdU이다. 제1 CdtA 앱타머인 4758-6과의 비-경쟁적 결합이 명암에 의해 표시된다. 도 1c는 CdtA 단백질과의 앱타머의 평형 결합을 나타낸다. 클론 5551-81 및 5574-49는 유리(free) CdtA를 이용한 SELEX에서 수득되었고, 5579-7 내지 5579-21은 제2 SELEX에서 CdtA-4758-6 착물을 이용하여 수득되었다. 이 분석에서 최대 결합된 분획 (결합 안정기)은 Zorbax 상의 표적-앱타머 착물의 체류 효율 및 결합-능숙한 앱타머의 분획에 의해 영향을 받는다. 도 1d 및 1e는 CdtA에 대해 이전에 생성된 100-배 과잉의 (10 nM) 비표지된 경쟁자 앱타머 4758-6의 부재 또는 존재하에 방사선표지된 5579-12 (도 1D) 또는 5579-11 (도 1E)을 이용한 CdtA 결합 분석을 나타낸다. 결합은 또한 스트렙타비딘 비드 상에 미리 고정된 포착제로서 CdtA 및 바이오티닐화된 4758-6을 이용하여 측정되었다. 도 1f는 LumAvidin 비드에 결합된 포착제로서 4758-6, 및 검출제로서 개별적인 앱타머를 이용한 Luminex 플랫폼 상의 앱타머 쌍들에 대한 스크리닝을 보여준다. 모든 앱타머는 50-량체(mer)로서 합성에 의해 제조되었고, 비드 상에서의 이들의 고정화를 가능하게 하기 위해 (이는 이후 1 mM 바이오틴과의 추가 결합으로부터 차단되었음), 그리고 스트렙타비딘-파이코에리트린 콘주게이트를 이용한 검출을 가능하게 하기 위해, 이들의 5'-말단에 단일 바이오틴을 함유하였다. 도 1g는 포착제로서 4758-6 (25 nM) 및 검출제로서 5579-12 (10 nM)를 이용하거나, 또는 상기 두 시약을 바꾼 CdtA 샌드위치 분석을 보여준다.
도 2a는 스트렙타비딘 비드 상의 바이오티닐화된 포착 앱타머 및 방사선표지된 검출 앱타머를 이용하여, 개별적인 앱타머 샌드위치 쌍을 스크리닝하는 평형 결합 분석을 보여준다. 도 2b는 경쟁적 결합과 비-경쟁적 결합을 구별하는 Luminex 플랫폼 상에서 멀티플렉스 샌드위치 스크리닝 분석을 보여준다. 각각의 앱타머는 상이한 LumAvidin 비드 유형 상에 고정되었고, 개별적인 앱타머를 검출제로서 시험하기 위해 포착 비드를 모았다. 도 2c는 Luminex-기반 멀티플렉스 분석에서 16 CRDL1 앱타머의 쌍별 스크리닝을 보여주며, 성능은 최대 신호의 퍼센트로서 표현되고 열 지도(heat map)로서 표시된다. 도 2d 및 2e는 SELEX 동안 CRDL1과 착물을 형성하는데 사용된 서열이었던 소마머 3362-61 (도 2D) 또는 새로운 서열 중 하나였던 소마머 7575-2 (도 2E)를 이용한 Luminex 샌드위치 선별 분석에서 포착제 또는 검출제로서 16 CRDL1 앱타머의 평가를 보여준다. 대조군은 동일한 소마머가 포착 및 검출을 위해 사용된 분석을 포함하였다(밑줄침). 도 2f는 버퍼 내에 첨가된 단백질 (표 28에 열거된 앱타머)에 대한 Luminex 분석에서 수득된 샌드위치 결합 곡선을 나타낸다. 모든 경우에, 샌드위치 SELEX 동안 표적과 착물을 형성하는 역할을 한 서열이 포착제로서 사용되었고, SELEX의 결과로서 확인된 새로운 클론 중 하나가 검출제로서 사용되었다. 최대 신호 (B_최대에서의 RFU)는 각각 23046 (ANGPT2), 16623 (TSP2), 23349 (CRDL1), 25586 (MATN2), 26000 (C7), 13927 (GPVI), 7103 (PLG), 및 3000 (ESAM)이었다.
도 3은 플레이트-기반 샌드위치 분석에서 사용된 앱타머 쌍들에 대한 K_d 값을 보여준다. 바이오티닐화된 앱타머는 포착 시약으로서 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 상에 고정화되었고, 스트렙타비딘-HRP 콘주게이트로 라벨링하기 위한 검출제로서 사용되었다.

I. 용어 및 방법

달리 지적되지 않으면, 기술 용어들은 종래의 용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반 용어들의 정의는 문헌[Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 확인될 수 있다.

개시내용의 다양한 구현예의 검토를 용이하게 하기 위해, 구체적인 용어들의 하기 설명이 제공된다:

앱타머 : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 앱타머는 표적 분자에 대해 바람직한 작용을 하는 비-천연 발생 핵산을 지칭한다. 바람직한 작용은, 비제한적으로, 표적의 결합, 표적을 촉매적으로 변화시키는 것, 상기 표적 또는 표적의 기능적 활성을 변형시키거나 변화시키는 방식으로 상기 표적과 반응하는 것, 상기 표적에 공유적으로 부착되는 것 (자살 억제제에서와 같음), 및 상기 표적과 또 다른 분자 간의 반응을 용이하게 하는 것을 포함한다.

유사체: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 유사체는 구조적 화학적 유사체 뿐만 아니라 기능적 화학적 유사체를 지칭한다. 구조적 화학적 유사체는 또 하나의 화합물에 유사한 구조를 갖지만 하나 이상의 원자 또는 작용기가 상이한 화합물이다. 이러한 차이는 원자 또는 작용기, 원자 또는 작용기의 대체물 또는 이들의 조합의 부재하에, 원자 또는 작용기의 부가의 결과일 수 있다. 기능적 화학적 유사체는 유사한 화학적, 생화학적 및/또는 약리적 특성을 갖는 화합물이다. 용어 유사체는 또한 화합물의 S 및 R 입체이성질체를 포함할 수 있다.

생물활성: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 생물활성은 생리적 또는 병리생리 과정에 영향을 미칠 수 있는 하나 이상의 세포간, 세포내 또는 세포외 과정 (예를 들면, 세포-세포 결합, 리간드-수용체 결합, 세포 신호전달, 등)을 지칭한다.

C-5 변형된 피리미딘: 본원에서 사용된 바와 같이, C-5 변형된 피리미딘은 C-5 위치에 변형을 갖는 피리미딘을 지칭한다. C-5 변형된 피리미딘의 예는 미국 특허 제5,719,273호, 제5,945,527호, 제7,947,447호뿐만 아니라, 2014년 2월 27일에 출원된 미국 공보 제2014/0058076호에 기재된 것들을 포함한다. 추가의 예가 본원에 제공되어 있다.

경쟁자 분자: 경쟁자 분자 또는 경쟁자는 비-표적 분자와 비-특이적 착물을 형성할 수 있는 임의의 분자를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. "경쟁자 분자" 또는 "경쟁자"는 상이한 유형의 분자들의 집단 또는 하나의 특정한 또는 종의 분자이다. "경쟁자 분자" 또는 "경쟁자"는 하나를 초과하는 상기 유형의 분자를 지칭한다. 경쟁자 분자는 올리고뉴클레오타이드, 다중음이온 (예를 들면, 헤파린, 단일가닥 연어 정자 DNA, 및 폴리덱스트란 (예를 들면, 덱스트란 설페이트)), 무염기성 포스포디에스테르 폴리머, dNTP, 및 파이로포스페이트를 포함한다. 경쟁자를 사용하는 동력학적 챌린지의 경우, 경쟁자는 또한 앱타머와 비-특이적 착물을 형성할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 그와 같은 경쟁자 분자는 다중양이온 (예를 들면, 스페르민, 스페르미딘, 폴리라이신, 및 폴리아르기닌) 및 아미노산 (예를 들면, 아르기닌 및 라이신)을 포함한다.　

공통 서열: 본원에서 사용된 바와 같이, 공통 서열은 서열 정렬된 일련의 핵산 서열의 각각의 위치에서 발견되는 가장 빈번하게 관측된 뉴클레오타이드에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.

공유 결합: 공유 결합 또는 상호작용은 원자 사이에 적어도 한 쌍의 전자의 공유를 포함하는 화학 결합을 지칭한다.

인큐베이팅: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 인큐베이팅 (또는 인큐베이션)은 원하는 결과를 촉진하기 위해 성분들이 합쳐지는 조절된 조건을 지칭한다. 예를 들면,앱타머와 표적과의 결합을 촉진하여 착물을 형성하게 하기 위해 표적 (예를 들면, 단백질) 및 앱타머를 함으로써 표적 및 앱타머는 인큐베이션될 수 있다. 추가 예는 착물을 제2 앱타머와 함께 두어 착물 및 제2 앱타머를 배양시켜 제2 착물 (즉, 앱타머-단백질-제2 앱타머)을 형성하는 것을 포함한다. 인큐베이션을 위한 조절된 조건들은 온도, 시간, pH, 염 농도, 및 혼합물의 유형을 포함하며, 이의 비제한적인 예는 용액, 에멀젼, 겔 및 포말을 포함한다. 온도는 약 21℃ 내지 약 45℃ (또는 약 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 또는 45 섭씨온도)의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 온도는 약 28℃ 내지 약 37℃ (또는 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 섭씨온도), 또는 약 28℃ 또는 약 37℃이다. 인큐베이션 시간은 약 1분 내지 약 240분 (또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235 또는 240분)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 인큐베이션 시간은 약 15분, 30분, 60분, 120분, 180분 또는 약 210분이다. 인큐베이션을 위한 pH 조건은 약 5 내지 약 12 (또는 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5 또는 12)의 범위일 수 있다. 바람직하게는, pH는 약 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 9. 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.1, 10.2, 10.3, 10.4, 10.5, 10.6, 10.7, 10.8, 10.9, 11, 11.1, 11.2, 11.3, 11.4 또는 11.5이다. 상기 특정 조건들의 집합은 대표적이고 비제한적이다. 또한, 인큐베이션을 위한 동일한 특정 조건들이 본원에 개시된 방법 내내 사용될 수 있거나 또는 본원에 개시된 방법의 상이한 단계에서 바뀔 수 있다.

억제하다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 억제하다는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 더 이상 측정가능한 활성 또는 생물활성을 갖지 않는 정도까지 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 발현을 막거나 감소시키거나; 또는 펩타이드 또는 폴리펩타이드가 더 이상 측정가능한 활성 또는 생물활성을 갖지 않는 정도까지 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 안정성을 감소시키고/거나 활성을 감소시키거나 막는 것을 의미한다.

동력학적 챌린지 : 본원에서 사용된 바와 같이, 동력학적 챌린지는 동력학적 압력을 적용하고, 해리 속도를 포함하는, 상기 계열의 착물의 구성요소들의 상이한 친화성 특성을 이용함으로써, 앱타머 친화성 착물 및 비-특이적 착물을 포함하는 착물의 집합으로부터 앱타머 친화성 착물을 농축하는 공정을 지칭한다. 앱타머-비-표적 착물이 앱타머-표적 착물와 비교하여 전형적으로 감소하므로, 동력학적 챌린지는　일반적으로 특이성의 증가를 야기한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동력학적 압력"은 착물의 자연적인 해리를 위한 기회를 제공하고/하거나 자연적으로 착물로부터 해리되는 분자의 재결합을 억제하기 위한 수단을 지칭한다. 동력학적 압력은 착물이 고형 지지체에 결합될 때 경쟁자 분자의 부가에 의해, 또는 샘플 희석에 의해, 또는 광범위한 세척제에 의해, 또는 당해분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 수단에 의해 적용될 수 있다. 동력학적 챌린지가　일반적으로 앱타머 친화성 착물 및 앱타머-비-표적 착물의 상이한 해리 속도에 좌우되기 때문에, 당해분야의 숙련가는 동력학적 챌린지의 지속시간이　 앱타머-비-표적 착물의 수를 실질적으로 감소시키지 않으면서 앱타머 친화성 착물의 높은 비율을 유지하도록 선택된다는 것을 인식할 것이다. 동력학적 챌린지가 효과적이기 위해서, 앱타머 친화성 착물에 대한 해리 속도는 바람직하게는 앱타머-비-표적 착물에 대한 해리 속도보다 유의미하게 더 낮다. 앱타머는 특정한 특성을 포함하도록 설계될 수 있으므로, 앱타머 친화성 착물의 구성요소들은 비교적 낮은 해리 속도, 즉, 낮은 오프 레이트를 갖도록 설계될 수 있다.

변형된: 용어 변형된 (또는 변형하다 또는 변형) 및 이의 어떠한 변형은, 올리고뉴클레오타이드에 관하여 사용될 때, 올리고뉴클레오타이드의 4가지 구성요소 뉴클레오타이드 염기 (즉, A, G, T/U, 및 C) 중 적어도 하나가 천연 발생 뉴클레오타이드의 유사체 또는 에스테르라는 것을 의미한다.

조절하다: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 조절하다는 참조 발현 수준에 비해 그의 발현 수준을 증가시키거나 감소시킴으로써 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현 수준을 변화시키고/거나 참조 안정성 및/또는 활성 수준에 비해 그의 안정성 및/또는 활성 수준을 증가시키거나 감소시킴으로써 펩타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드의 안정성 및/또는 활성을 변화시키는 것을 의미한다.

비-공유 결합: 비-공유 결합 또는 비-공유 상호작용은 원자들 사이에 전자 쌍의 공유를 수반하지 않는 화학 결합 또는 상호작용을 지칭한다. 비-공유 결합 또는 상호작용의 예는 수소 결합, 이온성 결합 (정전 결합), 반데르발스힘 및 소수성 상호작용을 포함한다.

핵산: 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산은 DNA, RNA 및/또는 그것의 유사체를 함유하는 임의의 핵산 서열을 지칭하며, 단일, 이중 및 다중-가닥 형태를 포함할 수 있다. 용어들 "핵산", "올리고", "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

약제학적으로 허용가능한 : 본원에서 사용된 바와 같이, 약제학적으로 허용가능하다는 것은 동물에서, 그리고 더 상세하게는 인간에서 사용하기 위해 연방 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인된 것을 의미하거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식된 약전에 열거된 것을 의미한다.

약제학적으로 허용가능한 염: 본원에서 사용된 바와 같이, 화합물 (예를 들면, 앱타머)의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 염은 개체에게 투여하기에 적합한, 이온성 결합을 함유하고 화합물을 산 또는 염기 중 하나와 반응시킴으로써 전형적으로 생산되는 생성물을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염은, 비제한적으로, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 포스페이트, 설페이트, 수소 설페이트, 알킬설포네이트, 아릴설포네이트, 아릴알킬설포네이트, 아세테이트, 벤조에이트, 시트레이트, 말레에이트, 푸마레이트, 석시네이트, 락테이트, 및 타르트레이트를 포함하는 산 부가염; 알칼리 금속 양이온, 예컨대 Li, Na, K, 알칼리 토금속 염, 예컨대 Mg 또는 Ca, 또는 유기 아민 염을 포함할 수 있다.

약제학적 조성물: 본원에서 사용된 바와 같이, 약제학적 조성물은 개체에게 투여하는데 적합한 형태의 앱타머를 포함하는 제형을 지칭한다. 약제학적 조성물은 전형적으로 의도된 투여 경로와 양립할 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예는, 비제한적으로, 경구 및 비경구, 예를 들면, 정맥내, 진피내, 피하, 흡입, 국소, 경피, 점막통과, 및 직장 투여를 포함한다.

SELEX : 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 SELEX는 일반적으로 바람직한 방식으로 표적 분자와 상호작용하는, 예를 들면 단백질에 대해 높은 친화성으로 결합하는 핵산의 선별; 상기 선별된 핵산의 증폭을 지칭한다. SELEX는 특이적 표적 분자에 대해 높은 친화성을 갖는 앱타머를 확인하는데 사용될 수 있다. 용어 SELEX 및 "SELEX 공정"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.

서열 동일성: 본원에서 사용된 바와 같이, 2 이상의 핵산 서열의 문맥에서, 서열 동일성은, 갭의 수, 및 2 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 각 갭의 길이를 고려하여, 서열을 공유하는 동일한 뉴클레오타이드 위치의 수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/ 위치의 총 수 × 100). 서열들의 비교 및 2 이상의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘, 예컨대 그것의 디폴트 파라미터에서 BLAST 및 갭핑된 BLAST 프로그램 (예를 들면, Altschul 등, J. Mol . Biol . 215:403, 1990; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 BLASTN을 참조한다)을 이용하여 달성될 수 있다. 서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열을 비교하는 참조 서열로서의 역할을 한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 참조 서열이 컴퓨터로 입력되고, 필요한 경우 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 그리고 나서, 상기 서열 비교 알고리즘은 상기 지정된 프로그램 파라미터에 기초하여, 참조 서열 대비 시험 서열(들)에 대한 퍼센트 서열 동일성을 계산한다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은, 예를 들면, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981의 국소 상동성 알고리즘에 의해, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988의 유사성 방법을 위한 서치에 의해, 이들 알고리즘 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)의 컴퓨터화된 실행에 의해, 또는 육안 검사 (Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. and Wiley- Interscience (1987) 참고)에 의해, 수행될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 서열이 참조 뉴클레오타이드 서열에 적어도, 예를 들어 약 95% 동일한 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 기술할 때, 상기 핵산 서열이 참조 핵산 서열의 각 100개의 뉴클레오타이드 당 최대 5개의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하면, 상기 핵산 서열은 참조 서열과 동일한 것으로 의도된다. 환언하면, 서열이 참조 핵산 서열에 적어도 약 95% 동일한 원하는 핵산 서열을 얻기 위해, 상기 참조 서열 내의 뉴클레오타이드 중 최대 5%가 결실되거나 또 다른 뉴클레오타이드로 치환될 수 있거나, 또는 상기 참조 서열 내의 뉴클레오타이드의 총 수 중 최대 5%까지의 뉴클레오타이드의 일부 수가 참조 서열 내로 삽입될 수 있다 (본원에서 삽입으로서 지칭됨). 원하는 서열을 생성하는 참조 서열의 이러한 돌연변이는 참조 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어나거나 또는 참조 서열에서 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접 그룹에서의 뉴클레오타이드 사이에 개별적으로 산재되어, 상기 말단 위치 사이의 어디에서나 일어날 수 있다.

소마머 ( SOMAmer ): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 소마머는 개선된 오프-레이트 특성을 갖는 앱타머를 지칭한다. 소마머는 대안적으로 느린 오프-레이트 변형된 앱타머 (Slow Off-Rate Modified Aptamer)로 지칭되고, 그 전체가 참조로 편입된 "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates"라는 명칭의 미국 특허 제7,947,447호에 기재된 개선된 SELEX 방법을 통해 선택될 수 있다. 용어들 앱타머 및 소마머는 상호교환적으로 사용될 수 있다.

스페이서 서열: 본원에서 사용된 바와 같이, 스페이서 서열은 앱타머의 핵산 서열의 5'-말단, 3'-말단 또는 5' 및 3' 말단 모두에 공유 결합된 소분자(들)을 포함하는 임의의 서열을 지칭한다. 예시적인 스페이서 서열은, 비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜, 탄화수소 사슬, 및 앱타머 결합 활성을 유지하면서 공통 영역을 연결하는 분자 공유 스캐폴드를 제공하는 다른 폴리머 또는 공중합체를 포함한다. 어떤 측면에서, 스페이서 서열은 표준 연결부, 예컨대 말단 3' 또는 5' 하이드록실, 2' 탄소, 또는 염기 변형, 예컨대 피리미딘의 C5-위치, 또는 퓨린의 C8 위치를 통해 앱타머에 공유결합될 수 있다.

표적 분자: 본원에서 사용된 바와 같이, 표적 분자 (또는 표적)는 핵산이 바람직한 방식 (예를 들면, 표적의 결합, 촉매적으로 표적을 변화시키는 것, 상기 표적 또는 표적의 기능적 활성을 변형시키거나 변화시키는 방식으로 상기 표적과 반응하는 것, 상기 표적에 공유 결합하는 것 (자살 억제제에서와 같음), 및 상기 표적 및 또 하나의 분자 사이의 반응을 용이하게 하는 것)으로 작용할 수 있는 임의의 화합물 또는 분자를 지칭한다. 표적 분자의 비-제한적인 예는 단백질, 펩타이드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원체, 독성 물질, 기질, 대사물, 전이 상태 유사체, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직, 전술된 것 중 어느 것의 임의의 부분 또는 단편 등을 포함한다. 사실상 어떤 화학적 또는 생물학적 효과기가 적합한 표적일 수 있다. 임의의 크기의 분자들이 표적으로서 작용할 수 있다. 표적은 또한 상기 표적 및 핵산 사이의 상호작용의 가능성 또는 강도를 향상시키는 어떤 방식으로 변형될 수 있다. 표적은 또한 특정한 화합물 또는 분자의 임의의 사소한 변이, 예컨대, 단백질의 경우, 예를 들면, 그의 아미노산 서열에서의 변이, 디설파이드 결합 형성, 당화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 분자의 동일성을 실질적으로 변화시키지 않는 라벨링 성분과의 콘주게이션을 포함할 수 있다. "표적 분자" 또는 "표적"은 앱타머에 결합할 수 있는 하나의 유형 또는 종의 분자 또는 다분자 구조의 카피의 집합이다. "표적 분자" 또는 "표적"은 하나를 초과하는 상기 분자의 집합을 지칭한다.

3원 착물 (Ternary complex): 본원에서 사용된 바와 같이, 3원 착물은 적어도 2개의 앱타머 및 표적의 착물을 지칭한다. 어떤 경우, 착물은 공유, 비-공유 또는 공유 및 비-공유 상호작용의 조합을 포함할 수 있다.

달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 이 개시내용이 속하는 당해분야의 숙련가에 의해 통상적으로 인식되는 것과 동일한 의미를 갖는다. "a", "an" 및 "the"와 같은 단수 용어들은 맥락이 달리 명확히 나타내지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. "A 또는 B를 포함하는"은 A 또는 B를 포함하는 것, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 또한, 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 제시된 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

또한, 본원에 제공된 범위는 상기 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들면, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 (뿐만 아니라 상기 맥락이 달리 명확히 지시하지 않는 한 이의 분수)으로 이루어진 군으로부터의 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위범위를 포함하는 것을 이해된다. 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는, 달리 나타내지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수의 값 및, 적절한 경우, 이의 분수 (예컨대 정수의 10분의 1 및 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 폴리머 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징과 관련하여 본원에 언급된 임의의 수 범위는 달리 지적되지 않는 한 상기 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "약" 또는 "본질적으로 이루어지는"은 달리 지적되지 않는 한, 상기 명시된 범위, 값, 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어들 "포함하다(include)" 또는 "포함하다(comprise)"는 개방형이며 동의어로 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어들 부정관사는 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안 (예를 들면, "또는")의 사용은 상기 대안 중 하나, 둘, 또는 이의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 기재된 것과 유사하거나 대등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 적합한 방법 및 물질들이 하기에 기재되어 있다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 다른 참조문헌은 그 전체가 참고로 편입되어 있다. 대립되는 경우, 용어의 설명을 포함하는, 본 명세서에 따를 것이다. 또한, 상기 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하고자 하는 것이 아니다.

II. 개요

개시내용의 또 하나의 측면에서, 본 개시내용의 제1 앱타머 및 제2 앱타머는 하기를 포함할 수 있다: 최대 약 100개의 뉴클레오타이드, 최대 약 95개의 뉴클레오타이드, 최대 약 90개의 뉴클레오타이드, 최대 약 85개의 뉴클레오타이드, 최대 약 80개의 뉴클레오타이드, 최대 약 75개의 뉴클레오타이드, 최대 약 70개의 뉴클레오타이드, 최대 약 65개의 뉴클레오타이드, 최대 약 60개의 뉴클레오타이드, 최대 약 55개의 뉴클레오타이드, 최대 약 50개의 뉴클레오타이드, 최대 약 45개의 뉴클레오타이드, 최대 약 40개의 뉴클레오타이드, 최대 약 35개의 뉴클레오타이드, 최대 약 30개의 뉴클레오타이드, 최대 약 25개의 뉴클레오타이드, 및 최대 약 20개의 뉴클레오타이드.

개시내용의 또 하나의 측면에서, 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 없는 상기 제1 앱타머와 비교하여 제1 앱타머의 오프-레이트 또는 해리율을 개선한다. 또 하나의 측면에서, 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 제2 C-5 피리미딘 변형 도식 없는 제2 앱타머와 비교하여 제2 앱타머의 오프-레이트 또는 해리율을 개선한다.

개시내용의 또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 또하나의 앱타머의 또 하나의 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 또는 적어도 약 75% 동일할 수 있다. 개시내용의 또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 또하나의 앱타머의 또 하나의 핵산 서열과 적어도 약 95% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 80% 동일한, 또는 적어도 약 75% 동일할 수 있다.

또 하나의 측면에서, 상기 표적 또는 표적/앱타머 착물에 대한 제1 또는 제2 앱타머의 K _d 는 약 1 nM 내지 약 100 nM (또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100 nM)이다.

또 하나의 측면에서, K _d 는 약 4 nM 내지 약 10 nM (또는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 nM)이다.

본 개시내용의 또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 10 nM 이하의 상기 표적 또는 표적/앱타머 착물에 대한 해리 상수 (K _d )를 가질 수 있다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 15 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 20 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 25 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 30 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 35 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 40 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 45 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 50 nM 이하의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 3-10 nM (또는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 nM) 범위의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다. 또 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 약 0.02 nM 내지 약 3 nM (또는 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.24, 0.26, 0.28, 0.3, 0.32, 0.34, 0.36, 0.38, 0.4, 0.42, 0.44, 0.46, 0.48, 0.5, 0.52, 0.54, 0.56, 0.58, 0.6, 0.62, 0.64, 0.66, 0.68, 0.7, 0.72, 0.74, 0.76, 0.78, 0.8, 0.82, 0.84, 0.86, 0.88, 0.9, 0.92, 0.94, 0.96, 0.98, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3 nM) 범위의 표적 단백질에 대한 해리 상수 (K _d )를 갖는다.

적합한 해리 상수는 본원에 기재된 바와 같이 다중-점 적정을 사용하고 방정식 y = (최대값 - 최소값)(단백질)/(K _d + 단백질) + 최소값을 핏팅하여 결합 분석으로 결정될 수 있다. 해리 상수의 결정은 측정되는 조건 하에서 크게 의존적이고 따라서 이들 수는 인자 예컨대 평형 시간 등에 대해 유의미하게 변할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

개시내용의 또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 시간 ≥ 약 15 분, ≥ 약 30 분, ≥ 약 60 분, ≥ 약 90 분, ≥ 약 120 분, ≥ 약 150 분, ≥ 약 180 분, ≥ 약 210 분 및 ≥ 약 240 분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 표적으로부터 해리율 (t_1/2)을 포함한다.

본 개시내용은 추가로, 제1 앱타머 및 제2 앱타머를 포함하는 키트를 제공하고, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 상이하고; 상기 제1 앱타머는 표적에 대한 결합 친화도를 가지며, 제2 앱타머는 상기 표적 및/또는 상기 제1 앱타머가 결합된 상기 표적에 대한 결합 친화도를 갖는다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 대한 친화성을 가지며 제2 앱타머에는 그렇지 않다.

본 개시내용은 추가로, 본원에서 개시된 임의의 방법이 동력학적 챌린지가 수행될 수 있거나 그것을 포함할 수 있다는 것을 제공한다. 또 하나의 측면에서, 본원에서 기재된 방법은 추가로, 앱타머와 표적과의 결합 친화도를 개선하기 위해 경쟁자 분자, 희석 단계 또는 하나 이상의 세척제의 부가를 포함한다. 관련된 측면에서, 경쟁자 분자는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 올리고뉴클레오타이드, 헤파린, 청어 정자 DNA, 연어 정자 DNA, 덱스트란 설페이트, 다중음이온, 무염기성 포스포디에스테르 폴리머, dNTP, 및 파이로포스페이트. 또 하나의 측면에서, 동력학적 챌린지는 본원에 기재된 바와 같은 착물의 임의의 것을 함유하는 혼합물을 희석하는 단계, 및 상기 앱타머 친화성 착물을 함유하는 혼합물을 30 초, 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 10 분, 30 분, 및 60 분 이상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 시간 인큐베이팅하는 단계를 포함한다. 또 하나의 측면에서, 동력학적 챌린지는 상기 앱타머 친화성 착물을 함유하는 혼합물을 희석하는 단계 및 상기 앱타머 친화성 착물을 함유하는 혼합물을, 앱타머 친화성 착물의 측정된 수준 대 비-특이적 착물의 측정된 수준의 비가 증가되는 시간 동안 인큐베이팅하는 단계를 포함한다.

본 개시내용은 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 표적을 포함하는 조성물을 기재하고, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 동일하고 상기 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 상기 표적은 3원 착물을 형성할 수 있다.

본 개시내용은 추가로, 샘플에서 표적을 검출하는 방법을 기재하고, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 상기 샘플을 제1 앱타머와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 결합하여 제1 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제1 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물을 제2 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 앱타머는 제1 착물에 결합하여 제2 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제2 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머, 상기 표적, 상기 제1 착물 또는 상기 제2 착물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머, 상기 표적, 상기 제1 착물 또는 상기 제2 착물의 존재는, 상기 표적이 샘플 내에 존재하는 것을 나타내는 단계를 포함하고; 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 동일하다.

본 개시내용은 추가로, 표적을 제1 앱타머와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 결합하여 제1 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제1 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물을 제2 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제2 앱타머는 표적에 결합하여 제2 착물을 형성할 수 있는 단계; 상기 혼합물을, 상기 제2 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이팅하는 단계; 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머 및 싱기 제2 앱타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는 방법을 기재하고, 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머 둘 모두의 존재는, 상기 제1 앱타머의 상기 표적에의 결합 및 상기 제2 앱타머의 상기 표적에의 결합은 비-경쟁적이라는 것을 나타내며; 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 동일하다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 ANGPT2, TSP2, CRDL1, MATN2, GPVI, ESAM, C7, PLG, MMP-12, NPS-PLA2 및 CdtA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 결합할 수 있다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 ANGPT2, TSP2, CRDL1, MATN2, GPVI, ESAM, C7, PLG, MMP-12, NPS-PLA2 및 CdtA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질을 결합할 수 있다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 상기 표적은 3원 착물을 형성하고, 상기 제1 앱타머는 표적의 제1 영역에서 상기 표적에 결합하고, 그리고 제2 앱타머는 표적의 제2 영역에서 상기 표적에 결합하고, 상기 표적의 제1 영역 및 제2 영역은 중첩 또는 비-중첩 영역이다.

또 하나의 측면에서, 본 조성물은 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 표적을 포함하고, 상기 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 상기 표적은 3원 착물을 형성할 수 있고, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는, 독립적으로, 그 길이가 약 40 내지 약 50개의 뉴클레오타이드이고, 상기 제1 앱타머는 C-5 변형된 피리미딘을 포함하고 제2 앱타머는 C-5 변형된 피리미딘을 포함하고, 상기 C-5 변형된 피리미딘은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU) (또한 일명 5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU), 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 제1 앱타머의 C-5 변형된 피리미딘 및 제2 앱타머의 C-5 변형된 피리미딘은 상이한 C-5 변형된 피리미딘이다.

또 하나의 측면에서, 본 조성물은 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 표적을 포함하고, 상기 제1 앱타머, 제2 앱타머 및 상기 표적은 3원 착물을 형성할 수 있고, 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는, 독립적으로, 그 길이가 약 40 내지 약 50개의 뉴클레오타이드이고, 상기 제1 앱타머는 C-5 변형된 피리미딘을 포함하고 제2 앱타머는 C-5 변형된 피리미딘을 포함하고, 상기 C-5 변형된 피리미딘은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU), 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 제1 앱타머의 C-5 변형된 피리미딘 및 제2 앱타머의 C-5 변형된 피리미딘은 동일한 C-5 변형된 피리미딘이다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머 및 표적의 혼합물은, 제1 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이션된다. 이들 조건은 약 10:1의 표적 (예를 들면, 단백질) 대 제1 앱타머 비를 포함한다. 표적 대 제1 앱타머의 대안적인 비는 약 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 및 1:10을 포함한다. 조건은 추가로, 약 37 ℃의 온도를 포함한다. 대안적인 온도는 실온 (또는 약 21 ℃) 또는 약 21 ℃ 내지 약 37 ℃ (또는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 ℃)를 포함한다. 조건은 또한, 상기 언급된 비 및 온도 조건에서 인큐베이션의 시간을 포함하고, 그 시간은 약 30 초 내지 약 72 시간 (또는 약 30 초, 1 분, 2, 분, 5 분, 10, 분, 15, 분, 20 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3, 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 12 시간, 15 시간, 20 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간, 44 시간, 48 시간, 50 시간, 55 시간, 60 시간, 65 시간, 70 시간 또는 72 시간)을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머 및 표적 또는 제2 앱타머 및 제1 착물의 혼합물은 제2 착물이 형성되도록 하는 조건 하에서 인큐베이션된다. 이들 조건은 약 10:1의 표적 (예를 들면, 단백질) 또는 제1 착물 대 제2 앱타머 비를 포함한다. 표적 또는 제1 착물 대 제2 앱타머의 대안적인 비는 약 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 및 1:10을 포함한다. 조건은 추가로, 약 37 ℃의 온도를 포함한다. 대안적인 온도는 실온 (또는 약 21 ℃) 또는 약 21 ℃ 내지 약 37 ℃ (또는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 또는 37 ℃)을 포함한다. 조건은 또한, 상기 언급된 비 및 온도 조건에서 인큐베이션의 시간을 포함하고, 그 시간은 약 30 초 내지 약 72 시간 (또는 약 30 초, 1 분, 2, 분, 5 분, 10, 분, 15, 분, 20 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3, 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 12 시간, 15 시간, 20 시간, 24 시간, 30 시간, 36 시간, 40 시간, 44 시간, 48 시간, 50 시간, 55 시간, 60 시간, 65 시간, 70 시간 또는 72 시간)을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 결합 친화도 (또는 K _d )는 방사선표지 필터-결합 분석 및 형광 비드-기반 Luminex 분석으로부터 선택된 방법에 의해 결정된다.

본 개시내용은 추가로, 제1 앱타머를 고형 지지체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 링커 및 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 고형 지지체에 결합할 수 있는 단계; 표적을 상기 제1 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 대한 결합 친화도를 가지며, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제1 착물을 형성하는 단계; 상기 제1 착물을 복수의 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 복수의 앱타머 중 적어도 하나의 앱타머는 상기 제1 착물에 결합하여 제2 착물을 형성하는 단계; 상기 제2 착물을 잔여 복수의 앱타머로부터 분할하는 단계; 상기 제2 착물을 분리하는 단계; 상기 적어도 하나의 앱타머를 증폭시키는 단계; 및 상기 제1 착물에 결합할 수 있는 상기 적어도 하나의 앱타머를 확인하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다.

본 개시내용은 추가로, 제1 앱타머를 고형 지지체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 링커 및 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 고형 지지체에 결합할 수 있는 단계; 표적을 상기 제1 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 대한 결합 친화도를 가지며, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제1 착물을 형성하는 단계; 상기 제1 착물을 복수의 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 복수의 앱타머 중 하나 이상의 앱타머는 상기 제1 착물에 결합하여 제2 착물을 형성하는 단계; 상기 제2 착물을 잔여 복수의 앱타머로부터 분할하는 단계; 상기 제2 착물을 분리하는 단계; 상기 하나 이상의 앱타머를 증폭시키는 단계 및 상기 제1 착물에 결합할 수 있는 하나 이상의 앱타머를 확인하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다.

본 개시내용은 추가로, 제1 앱타머를 고형 지지체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 링커 및 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 고형 지지체에 결합할 수 있는 단계; 표적을 상기 제1 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 대한 결합 친화도를 가지며, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제1 착물을 형성하는 단계; 상기 제1 착물을 복수의 앱타머와 접촉시켜 제2 착물을 형성하는 단계로서, 상기 제2 착물은 상기 제1 앱타머, 상기 표적 및 상기 제2 앱타머를 포함하는 단계; 상기 제2 착물을 잔여 복수의 앱타머로부터 분할하는 단계; 상기 제2 착물을 분리하는 단계; 상기 제2 앱타머를 증폭시키는 단계 및 상기 제1 착물에 결합할 수 있는 상기 제2 앱타머를 확인하는 단계를 포함하는 방법을 기재한다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 적어도 하나의 앱타머는 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 복수의 앱타머 중 앱타머의 적어도 10%, 20%, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%는은 C-5 변형된 피리미딘을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 태그는 고형 지지체에 결합한다.

또 하나의 측면에서, 잔여 복수의 앱타머는 적어도 하나의 앱타머보다 제1 착물에 대한 결합 친화도가 더 낮다.

또 하나의 측면에서, 태그는 상기 제1 앱타머의 5'-말단 또는 3'-말단에 있다.

또 하나의 측면에서, 링커는 광-절단가능 링커이다.

또 하나의 측면에서, 표적은 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 당단백질, 세포 및 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 적어도 하나의 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 동일 또는 상이하다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 하나 이상의 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 동일 또는 상이하다.

또 하나의 측면에서, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 동일 또는 상이하다.

또 하나의 측면에서, 적어도 하나의 앱타머는 표적에 대해 결합 친화도를 가지며 상기 제1 앱타머에는 그렇지 않다.

또 하나의 측면에서, 적어도 하나의 앱타머는 상기 제1 착물의 표적에 결합하고 상기 제1 착물의 제1 앱타머에는 결합하지 않는다.

또 하나의 측면에서, 적어도 하나의 앱타머는 상기 제1 착물의 상기 표적 및 상기 제1 앱타머에 결합한다.

또 하나의 측면에서, 하나 이상의 앱타머는 상기 표적에 대한 결합 친화도를 가지며 상기 제1 앱타머에는 그렇지 않다.

또 하나의 측면에서, 하나 이상의 앱타머 상기 제1 착물의 표적에 결합하고 상기 제1 착물의 제1 앱타머에는 결합하지 않는다.

또 하나의 측면에서, 하나 이상의 앱타머 상기 제1 착물의 상기 표적 및 상기 제1 앱타머에 결합한다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 표적에 대해 결합 친화도를 가지며 상기 제1 앱타머는 그렇지 않다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 상기 제1 착물의 표적에 결합하고 상기 제1 착물의 제1 앱타머에는 결합하지 않는다.

또 하나의 측면에서, 제2 앱타머는 상기 제1 착물의 상기 표적 및 상기 제1 앱타머에 결합한다.

또 하나의 측면에서, 고형 지지체는 현미경 슬라이드, 사이클로-올레핀 공중합체 기판, 막, 플라스틱 기판, 상자성 비드, 대전된 종이, 나일론, Langmuir-Bodgett 필름, 유리, 게르마늄 기판, 실리콘 기판, 실리콘 웨이퍼 칩, 통과액 칩, 마이크로비드, 폴리테트라플루오로에틸렌 기판, 폴리스티렌 기판, 갈륨 아르세나이드 기판, 금 기판 및 은 기판으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

또 하나의 측면에서, 고형 지지체는 스트렙타비딘 비드이다.

또 하나의 측면에서, 증폭 단계는 앱타머의 후보 혼합물의 형성을 야기한다.

또 하나의 측면에서, 방법은 추가로, 제1 착물에 대한 결합 친화도를 갖는 앱타머를 추가로 선택하기 위해 제1 착물을 앱타머의 후보 혼합물과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 개시내용은 추가로, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다: a) 제1 앱타머를 고형 지지체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 링커 및 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 고형 지지체에 결합할 수 있는 단계; b) 표적을 상기 제1 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 대한 결합 친화도를 가지며, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제1 착물을 형성하는 단계; c) 상기 제1 착물을 복수의 앱타머와 접촉시켜 복수의 제2 착물을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 제2 착물 각각은 상기 제1 앱타머, 상기 표적 및 상기 제2 앱타머를 포함하고, 상기 복수의 제2 착물은 복수의 제2 앱타머를 포함하는 단계; d) 복수의 제2 착물을 복수의 앱타머 중 앱타머로부터 분할하는 단계로서, 복수의 앱타머 중 적어도 하나의 앱타머는 복수의 제2 착물의 제2 앱타머 중 적어도 하나보다 제1 착물에 대한 결합 친화도가 더 작은 단계; e) 복수의 제2 착물을 분리하는 단계; f) 복수의 제2 앱타머를 증폭하여 제1 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계; g) 적어도 한 번, 제1 앱타머의 후보 혼합물로 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제2 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 2회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제3 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 3회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제4 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 4회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제 5 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 5회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제6 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 6회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제7 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 7회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제8 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 8회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제9 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 9회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제10 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 10회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제11 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 11회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 a 제12 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 12회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제13 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 13회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제14 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 14회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제15 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계, 또는 마지막 15회에, 단계 a) 내지 f)를 반복하여 제16 앱타머의 후보 혼합물을 형성하는 단계 및 h) 상기 제1 착물에 결합할 수 있는 복수의 제2 앱타머의 앱타머 중 적어도 하나를 확인하는 단계.

본 개시내용은 추가로, 하기 단계들을 포함하는 방법을 제공한다: a) 제1 앱타머를 고형 지지체와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 링커 및 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 고형 지지체에 결합할 수 있는 단계; b) 표적을 상기 제1 앱타머와 접촉시키는 단계로서, 상기 제1 앱타머는 표적에 대한 결합 친화도를 가지며, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제1 착물을 형성하는 단계; c) 상기 제1 착물을 복수의 앱타머와 접촉시켜 복수의 제2 착물을 형성하는 단계로서, 여기서 복수의 제2 착물 각각은 상기 제1 앱타머, 상기 표적 및 상기 제2 앱타머를 포함하고, 상기 복수의 제2 착물은 복수의 제2 앱타머를 포함하는 단계; d) 복수의 제2 착물을 복수의 앱타머 중 앱타머로부터 분할하는 단계로서, 복수의 앱타머 중 적어도 하나의 앱타머는 복수의 제2 착물의 제2 앱타머 중 적어도 하나보다 제1 착물에 대한 결합 친화도가 더 작은 단계; e) 복수의 제2 착물을 분리하는 단계; f) 복수의 제2 앱타머를 정량화하여 정량적 값을 얻는 단계; g) 상기 정량적 값 대 참조 값의 비가 변화지 않은 채로 있거나 정량적 값 대 단계 a) 내지 f)의 이전의 반복의 참조 값의 비에 대해 감소할 때까지 단계 a) 내지 f)를 반복하는 단계로서, 상기 참조 값은 상기 표적 없이 단계 a) 내지 f)의 방법에 노출된 복수의 대조군 앱타머를 정량화하는 것을 기준으로 하는 단계; h) 상기 제1 착물에 결합할 수 있는 복수의 제2 앱타머의 앱타머 중 적어도 하나를 확인하는 단계.

또 하나의 측면에서, 태그는 바이오틴이다.

A. SELEX

SELEX는 일반적으로 핵산의 후보 혼합물을 제조하는 것, 상기 후보 혼합물을 원하는 표적 분자에 결합시켜 친화성 착물을 형성하는 것, 상기 친화성 착물을 미결합된 후보 핵산으로부터 분리하는 것, 상기 친화성 착물로부터 핵산을 분리 및 단리하는 것, 핵산을 정제하는 것, 및 특이적 앱타머 서열을 확인하는 것을 포함한다. 상기 공정은 선택된 앱타머의 친화성을 더 개선하기 위해 다수의 라운드를 포함할 수 있다. 상기 공정은 상기 공정 내의 하나 이상의 지점에서 증폭 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, "Nucleic Acid Ligands"라는 명칭의 미국 특허 제5,475,096호를 참조한다. 상기 SELEX 공정은 그의 표적에 비-공유적으로 결합하는 앱타머뿐만 아니라 그 표적에 공유적으로 결합하는 앱타머를 생성하는데 사용될 수 있다. "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX"라는 명칭의 미국 특허 제5,705,337호를 참조한다.

상기 SELEX 공정은 앱타머에 개선된 특성, 예를 들면, 개선된 생체내 안정성 또는 개선된 전달 특성을 부여하는 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 고-친화성 앱타머를 확인하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 변형의 예는 리보오스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 SELEX 공정-확인된 앱타머는 "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides"라는 명칭의 미국 특허 제5,660,985호에 기재되어 있으며, 이는 피리미딘의 5'- 및 2'-위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 유도체를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 기술한다. 전술한 미국 특허 제5,580,737호는 2'-아미노 (2'-NH₂), 2'-플루오로 (2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 고 특이성 앱타머를 기술한다. "SELEX and PHOTOSELEX"라는 명칭의 미국 특허 제8,409,795호를 참조하며, 이는 확장된 물리적 및 화학적 특성을 갖는 핵산 라이브러리 및 SELEX 및 광SELEX에서 이들의 용도를 기술한다.

SELEX는 또한 바람직한 오프-레이트 특성을 갖는 앱타머를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates"라는 명칭의 미국 특허 제7,947,447호를 참조하며, 이는 표적 분자에 결합할 수 있는 앱타머를 생성하는 개선된 SELEX 방법을 기술한다. 상기에서 언급된 바와 같이, 이들 느린 오프-레이트 앱타머는 "소마머(SOMAmer)"로서 공지되어 있다. 앱타머 또는 소마머를 생산하는 방법 및 이들의 각 표적 분자로부터 더 느린 속도의 해리를 갖는 광앱타머 (photoaptamer) 또는 소마머가 기재되어 있다. 상기 방법은 후보 혼합물을 상기 표적 분자와 접촉시키는 것, 핵산-표적 착물을 형성시키는 것, 및 느린 오프-레이트 농축 공정을 수행하는 것을 포함하며, 여기서 빠른 해리 속도를 갖는 핵산-표적 착물은 해리되어 재형성되지 않는 반면, 느린 해리 속도를 갖는 착물은 온전하게 유지될 것이다. 추가로, 본 방법은 개선된 오프-레이트 성능을 갖는 앱타머 또는 소마머를 생성하기 위해 후보 핵산 혼합물의 생산에 변형된 뉴클레오타이드를 사용하는 것을 포함한다.

이 분석의 변형은 앱타머를 그들의 표적 분자에 공유결합시키거나 "광가교(photocrosslink)"시킬 수 있는 광반응성 작용기를 포함하는 앱타머를 이용한다. 예를 들면, "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"이라는 명칭의 미국 특허 제6,544,776호를 참조한다. 이들 광반응성 앱타머는 광앱타머로도 지칭된다. 예를 들면, "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"라는 명칭의 미국 특허 제5,763,177호, 미국 특허 제6,001,577호 및 미국 특허 제6,291,184호를 참조하며, 또한 "Photoselection of Nucleic Acid Ligands"라는 명칭의 미국 특허 제6,458,539호를 참조한다. 마이크로어레이가 샘플과 접촉되고 광앱타머가 그의 표적 분자에 결합할 기회를 가진 후, 상기 광앱타머는 광활성화되고, 고형 지지체는 임의의 비-특이적으로 결합된 분자를 제거하기 위해 세정된다. 상기 광앱타머에 결합된 표적 분자는 상기 광앱타머 상의 광활성화된 작용기(들)에 만들어진 공유 결합으로 인해 일반적으로 제거되지 않으므로, 가혹한 세정 조건이 사용될 수 있다.

이들 분석 포맷 모두에서, 앱타머 또는 소마머는 샘플과 접촉하기 전에 고형 지지체에 고정된다. 그러나, 어떤 상황 하에서는, 샘플과 접촉하기 전 앱타머 또는 소마머의 고정화가 최적의 분석을 제공하지 않을 수 있다. 예를 들면, 앱타머 또는 소마머의 전-고정화가 앱타머 또는 소마머의 고형 지지체 표면 상의 표적 분자와의 비효율적인 혼합을 야기하여, 아마도 너무 긴 반응 시간과 이에 따른 앱타머 또는 소마머가 그것의 표적 분자에의 효율적인 결합을 허용하는 확장된 인큐베이션 시간을 초래할 수 있다. 게다가, 광앱타머 또는 광소마머가 상기 분석에서 이용될 때 그리고 고형 지지체로서 이용되는 물질에 따라, 고형 지지체는 광앱타머 또는 광소마머 및 그것의 표적 분자 사이의 공유 결합을 형성시키기 위해 사용된 빛을 분산시키거나 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 게다가, 상기 고형 지지체의 표면이 또한 사용된 임의의 라벨링 제제에 노출되거나 이에 의해 영향을 받을 수 있으므로, 이용된 방법에 따라, 이들의 앱타머 또는 광소마머에 결합된 표적 분자의 검출은 부정확할 수 있다. 마지막으로, 앱타머 또는 소마머의 고형 지지체 상으로의 고정화는 일반적으로 앱타머 또는 소마머를 샘플에 노출하기 전 앱타머 또는 소마머-제조 단계 (즉, 고정화)를 포함하고, 이 제조 단계는 상기 앱타머 또는 소마머의 활성 또는 작용성에 영향을 미칠 수 있다.

소마머가 용액에서 그 표적을 포착하게 한 다음 검출 이전에 소마머-표적 혼합물의 특정 성분을 제거하기 위해 설계된 분리 단계를 이용하는 소마머 분석이 또한 기재되어 왔다 ("Multiplexed Analyses of Test Samples"라는 명칭의 미국 특허 제7,855,054호 참고). 상기 기재된 소마머 분석 방법은 핵산 (즉, 소마머)을 검출하고 정량함으로써 시험 샘플 내의 비-핵산 표적 (예를 들면, 단백질 표적)의 검출 및 정량을 가능하게 한다. 상기 기재된 방법은 비-핵산 표적을 검출하고 정량하기 위한 핵산 대용품 (surrogate)(즉, 소마머)를 만듦으로써, 증폭을 포함하는 광범위한 핵산 기술들이 단백질 표적을 포함하는 더 넓은 범위의 원하는 표적에 적용되게 한다.

표적이 펩타이드인 SELEX 공정의 구현예가 "Modified SELEX Processes Without Purified Protein"이라는 명칭의 미국 특허 제6,376,190호에 기재되어 있다.

B. 느린 오프-레이트 앱타머 (소마머)

느린 오프-레이트 앱타머 (소마머 시약)는 프로테오믹스, 바이오마커 발견, 및 의료 진단의 분야를 변화시켜 왔다. 이제 >1000 단백질을 동시에 그리고 혈청, 혈장, CSF, 또는 조직 용해물의 작은 샘플 (0.1 mL)에서 높은 정확도로 측정할 수 있다. 이러한 고 멀티플렉스 분석 (SOMAscan)의 적용은 감염 질환, 폐 질환, 종양 질환, 심혈관 질환, 신장 및 신경 질환에서 바이오마커의 발견으로 이어졌다. 소마머는 아미노산 측쇄를 모방하는 소수성 방향족 작용기로 그의 5-위치가 변형된 데옥시우리딘 잔기를 함유하기 때문에, 종래의 앱타머에 비해 확장된 범위의 단백질 표적 및 개선된 결합 특성을 갖는다. 소마머는 동력학적 챌린지, 분배, 및 증폭을 갖는 다수의 라운드의 선별로 이루어진 SELEX 공정 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)에 의해 시험관내에서 생성된다.

C. 앱타머에 대한 화학적 변형

앱타머는 개선이 특성 및 특징인 변형된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 그러한 개선의 비-제한적인 예는 생체내 안정성, 분해에 대한 안정성, 그의 표적에 대한 결합 친화도, 및/또는 개선된 전달 특성을 포함한다.

그러한 변형의 예는 뉴클레오타이드의 리보오스 및/또는 포스페이트 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 SELEX 공정-확인된 앱타머가 "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides"라는 명칭의 미국 특허 제5,660,985호에 기재되어 있으며, 이는 피리미딘의 5'- 및 2'-위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 유도체를 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 기술한다. 전술한 미국 특허 제5,580,737호는 2'-아미노 (2'-NH₂), 2'-플루오로 (2'-F), 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe)로 변형된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 함유하는 고 특이성 앱타머를 기술한다. 또한 "SELEX and PHOTOSELEX"라는 명칭의 미국 특허 제8,409,795호를 참조하며, 이는 확장된 물리적 및 화학적 특성을 갖는 핵산 라이브러리 및 SELEX 및 광SELEX에서 이들의 용도를 기술한다.

C-5 변형의 구체적인 예는 하기로부터 독립적으로 선택되는 치환체로의 C-5 위치에서의 데옥시우리딘의 치환을 포함한다: 하기에 바로 예시된 바와 같은 벤질카복시아미드 (대안적으로 벤질아미노카보닐) (Bn), 나프틸메틸카복시아미드 (대안적으로 나프틸메틸아미노카보닐) (Nap), 트립트아미노카복시아미드 (대안적으로 트립트아미노카보닐) (Trp), 및 이소부틸카복시아미드 (대안적으로 이소부틸아미노카보닐) (iBu).

또한, C-5 변형된 피리미딘의 화학적 변형들은 조합되거나, 단독이거나, 또는 2'-위치 당 변형, 고리외 아민에서의 변형, 및 4-티오우리딘의 치환 등과 임의로 조합될 수 있다.

대표적인 C-5 변형된 피리미딘은 하기를 포함한다: 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3 -트리메틸암모늄)프로필] 카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘 또는 5-(N-[l-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘.

존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조의 변형은 폴리뉴클레오타이드의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는, 예컨대 라벨링 성분과의 콘주게이션에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다.

본 개시내용의 핵산 서열 내로 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드 (예를 들면, C-5 변형된 피리미딘)의 추가의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다:

염기 = 우리딘 (U) 또는 시티딘 (C)임 (5-위치에 부착)

K= R'기 플러스 (CH₂)_n 연결기, 여기서 n= 0-3

R'는 하기와 같이 정의된다:

그리고, R'', R''' 및 R''''는 하기와 같이 정의된다:

여기서

R''''는 분지형 또는 선형 저급 알킬 (C1-C20); 하이드록실 (OH), 할로겐 (F, Cl, Br, I); 니트릴 (CN); 보론산 (BO₂H₂); 카복실산 (COOH); 카복실산 에스테르 (COOR''); 일차 아미드 (CONH₂); 2차 아미드 (CONHR''); 3차 아미드 (CONR''R'''); 설폰아미드 (SO₂NH₂); N-알킬설폰아미드 (SONHR'')로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서

R'', R'''는 분지형 또는 선형 저급 알킬 (C1-C2)); 페닐 (C₆H₅); R'''' 치환된 페닐 고리 (R''''C₆H₄); (여기서 R'''' 은 상기에서 정의되어 있음); 카복실산 (COOH); 카복실산 에스테르 (COOR'''''); (여기서 R'''''은 분지형 또는 선형 저급 알킬 (C1-C20)임); 및 사이클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 R'' = R''' = (CH₂)n이고;

여기서 n=2-10이다.

또한, C-5 변형된 피리미딘 뉴클레오타이드는 하기를 포함한다:

여기서 R은 하기 모이어티 중 하나로부터 선택된다:

명명법 목적을 위해 그리고 예로써, 상기 R 그룹이 상기 6a (또는 Bn)로서 정의되는 경우, 상기 뉴클레오타이드는 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)로 명명되고; 상기 R 그룹이 상기 6f (또는 Nap)로 정의되는 경우, 상기 뉴클레오타이드는 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU)으로 명명되고, 상기 R 그룹이 상기 6h (또는 2Nap)로 정의되는 경우, 상기 뉴클레오타이드는 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU)으로 명명된다.

일부 구현예에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 상기 올리고뉴클레오타이드에 뉴클레아제 내성을 부여한다. 일부 구현예에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 화학식 6a 내지 6v로 이루어진 군으로부터 선택된다. C-5 위치에 치환을 갖는 피리미딘은 변형된 뉴클레오타이드의 예이다. 변형은 골격 변형, 메틸화, 아이소베이스 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 흔치않은 염기 짝짓기 조합 등을 포함할 수 있다. 변형은 또한 캡핑과 같은 3' 및 5' 변형을 포함할 수 있다. 다른 변형은 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오타이드의 유사체로의 치환, 뉴클레오타이드간 변형 예컨대, 예를 들면, 전하를 띠지 않는 연결부를 갖는 것 (예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트, 등) 및 전하를 띠는 연결부를 갖는 것 (예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 등), 삽입제를 갖는 것 (예를 들면, 아크리딘, 소랄렌, 등), 킬레이터를 함유하는 것 (예를 들면, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화적 금속, 등), 알킬화제를 함유하는 것, 및 변형된 연결부를 갖는 것 (예를 들면, 알파 아노머 핵산, 등)을 포함할 수 있다. 또한, 뉴클레오타이드의 당에 일반적으로 존재하는 어느 하이드록실 그룹은 포스포네이트 그룹 또는 포스페이트 그룹에 의해 치환되거나; 표준 보호 그룹에 의해 보호되거나; 또는 추가의 뉴클레오타이드에 또는 고형 지지체에 추가의 연결부를 제조하기 위해 활성화될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH 그룹은 인산화되거나 또는 아민, 약 1 내지 약 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 그룹 모이어티, 일 구현예에서 약 10 내지 약 80 kDa 범위의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 폴리머, 또 하나의 구현예에서 약 20 내지 약 60 kDa의 PEG 폴리머, 또는 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 폴리머로 치환될 수 있다. 일 구현예에서, 변형은 피리미딘의 C-5 위치이다. 이들 변형은 C-5 위치에서 직접 아미드 연결부를 통해 또는 다른 유형의 연결부를 통해 생산될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드는 또한 당해 기술에 일반적으로 공지된 리보오스 또는 데옥시리보스 당류의 유사한 형태를 함유할 수 있으며, 이는 2'-O-메틸-, 2'- O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보오스, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당류, 예컨대 아라비노오스, 자일로스 또는 릭소스, 파이라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 무염기성 뉴클레오사이드 유사체, 예컨대 메틸 리보사이드를 포함한다. 전술한 바와 같이, 하나 이상의 포스포디에스테르 연결부는 대안적인 연결 그룹에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결 그룹은 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈")에 의해 대체된 구현예를 포함하고, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결부를 함유하는 치환된 또는 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아랄딜이다. 폴리뉴클레오타이드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 당, 퓨린, 및 피리미딘의 유사한 형태의 치환은, 예를 들면 폴리아미드 골격과 같은 대안적인 골격 구조와 마찬가지로, 최종 생성물에서 유리할 수 있다.

D. 조성물을 포함하는 키트

본 개시내용은 본원에 기재된 제1 앱타머 및/또는 제2 앱타머를 포함하는 키트를 제공한다. 그러한 키트는, 예를 들면, (1) 제1 앱타머 (예를 들면, 표적 포착 앱타머) 및/또는 제2 앱타머 (예를 들면, 표적 검출 앱타머); 및 (2) 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 예컨대 용매 또는 용액을 포함할 수 있다. 부가적인 키트 구성요소는 예를 들면 하기를 임의로 포함할 수 있다: (1) 본원에서 확인된 약제학적으로 허용가능한 부형제 중 어느 것, 예컨대 안정제, 버퍼, 등, (2) 키트 구성요소를 보유하고/거나 혼합하기 위한 적어도 하나의 용기, 바이알 또는 유사한 장치; 및 (3) 전달 장치.

하기 실시예는 어떤 특정한 특징 및/또는 구현예를 예시하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 개시내용을 기재된 특정한 특징 또는 구현예로 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1: 물질 및 방법

본 실시예는 표적 검출 (예를 들면, 단백질 표적)을 위한 DNA 앱타머 쌍을 선별하고 확인하는데 사용되는 일반적인 물질 및 방법의 요약을 제공한다.

SELEX를 위해 사용되는 단백질. C. 디피실리에 2원 독소 (CdtA)를 기재된 바와 같이 재조합, His₁₀-태그된 형태로 생산하였다. 재조합, 태그된 형태로 이용가능한 인간 단백질 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)은 안지오포이에틴-2 (Cat. No. 623-AN/CF), TSP2 (Cat. No. 1635-T2), CRDL1 (Cat. No. 1808-NR), MATN2 (Cat. No. 3044-MN/CF), GPVI (Cat. No. 3627-GP) (이들은 His-태그됨), 및 Fc-융합으로서 ESAM (Cat. No. 2688-EC)을 포함하였다. 혈장으로부터 정제된 원상태 인간 단백질은 C7 (Quidel, San Diego, CA, USA, Cat. No. A405) 및 플라스미노겐 (Athens Research & Technology, Athens, GA, USA, Cat. No. 16-16-161200)을 포함하였고; 이 둘은 기재된 바와 같이 EZ-Link NHS-PEG4-바이오틴 (Thermo, Rockford, IL, USA, Cat. No 21329)을 이용하여 바이오티닐화되었다.

앱타머 합성. 각각의 말단에 40-뉴클레오타이드 표적-결합 영역 및 5개의 뉴클레오타이드를 함유한 끝이 잘린 합성 앱타머를 변형된 뉴클레오타이드를 이용한 표준 포스포르아미다이트 화학을 통해 제조하였다. AB-H 50머는 스트렙타비딘 (SA)에의 커플링을 용이하게 하기 위한 5'-바이오틴-dA 헥사에틸렌글리콜 스페이서, 및 개선된 엑소뉴클레아제 안정성을 위한 3' 역전된 dT 뉴클레오타이드 (idT)를 함유하였다.

Menu 앱타머 (소마머) 및 샌드위치 SELEX. 모든 단백질 표적에 대한 일차 결합제로서 메뉴 앱타머는 SELEX를 통해 단리되어 왔고 AB-H 50-량체는 상기에서 기재된 바와 같이 제조되었다. AB-H 앱타머에 대한 대안으로서, PBDC (바이오틴 및 형광단을 갖는 광절단가능 링커) 앱타머를 변형된 SELEX 공정에서 사용하였다. 상기 앱타머는 SB18T에서 3분간 95℃로 가열하고 37℃로 서서히 냉각함으로써 이들의 적절한 복원 (renaturation)을 보장하기 위해 "열-냉각(heat-cooled)"하였다. 활성은 평형 결합에서 그리고 풀-다운(pull-down) 분석에서 확인하였다. 샌드위치 SELEX를 위해, 공개된 선별 프로토콜을 하기와 같이 변형하였다. 상기 단백질을 SELEX의 각 라운드 이전에 즉시 동족 메뉴 앱타머의 AB-H 버전과 착물화하였다. R1의 경우, 100 μl의 500 nM 단백질 (50 pmol)을 5 μl의 5 μM (25 pmol) 열-냉각된 앱타머와 혼합하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하여 착물을 형성시켰다. 차후의 라운드의 경우, 10 μl의 500 nM 단백질 (5 pmol) 및 2 μl의 5 μM (10 pmol) 앱타머 (2배 과잉)를 사용하였다. 비-특이적 앱타머-앱타머 상호작용으로 인한 백그라운드를 감소시키는 특이적 반대-선별 (counter-selection) 비드를 SELEX의 각 라운드에서 새롭게 제조하였다. 요약하면, 2 μl의 5 μM (10 pmol) 열-냉각된 AB-H 앱타머를 SB18T 중의 40 μl의 2.5 mg/ml SA 비드에 부가하고 15분 동안 진탕시켜 고정화시켰다. 그리고 나서, 상기 비드를 세정하여 잔류 유리 앱타머를 제거하고, 50 μl SB18T에 재현탁시키고 10 μl 헥사-His (AnaSpec, Fremont, CA, USA, Cat. No 24420) 코팅된 비드와 함께, 또는 다운스트림 분배 방법에 따라 50 μl SA 비드 또는 단백질 G 비드와 함께, 반대-선별 플레이트에 부가하였다. 버퍼 SB18T (40 mM HEPES pH 7.5, 0.1 M NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 0.05% Tween-20)을 SELEX 및 이후의 모든 결합 분석을 위해 사용하였다. 개시 라이브러리는 PCR 증폭을 위한 고정된 서열의 옆에 있는 40개의 연속적인 무작위 위치를 함유하는 변형된 DNA 서열의 1 nmol (10¹⁴-10¹⁵) 서열로 구성되었다. 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-[2-나프틸메틸]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (2NapdU), 및 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU)을 포함하는, 상이한 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 개별적인 라이브러리를 사용하였다. 5 mM 덱스트란 설페이트를 이용한 동력학적 챌린지를 SELEX 라운드 2부터 수행하여 느린 오프-레이트를 촉진하였다. His-태그된 단백질에 대한 His-태그 2 (Cat. No. 101-04D), Fc-융합 단백질에 대한 단백질 G (Cat. No. 100-04D), 및 바이오티닐화된 표적에 대한 MyOne 스트렙타비딘 C1 (Cat. No. 350-02D) 비드를 각각 이용하여, 상기 표적-앱타머 착물의 분배를 상자성 Dynabeads^® (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 달성하였다. 선별된 DNA를 나트륨 퍼클로레이트 용출 버퍼 (1.8 M NaClO₄, 40 mM PIPES, 1 mM EDTA, 0.05% 트리톤 X-100, pH 6.8)를 이용하여 5분간 상기 비드로부터 용출시킨 다음, 프라이머 비드 상에 포착시키고 KOD XL DNA 폴리머라제를 이용하여 PCR 및 프라이머 연장을 수행하여 변형된 뉴클레오타이드를 갖는 센스-가닥을 수득하였다.

변형된 샌드위치 SELEX를 위해, 상기 표적-앱타머 착물의 분배를 일차 PBDC 앱타머 상의 바이오틴-태그에 결합하는 스트렙타비딘 (SA) 비드로 달성하였다. 이것은 바이오틴-태그가 상기 표적 상에 있는, AB-H 앱타머 기반 SELEX와 상이하다. 이 변형된 방법은 샌드위치 SELEX에서 태그되지 않은 표적을 사용할 수 있게 하였다. 상기 라이브러리로부터 선별된 DNA 앱타머를 나트륨 퍼클로레이트를 이용한 용출 대신에 SA 비드로부터 3분체 착물의 광절단 (불가시광선(blacklight) 하에 교반하면서 7분에서 2회)을 통해 수확하고, PCR 및 eDNA 준비를 위해 처리하였다.

DNA 시퀀싱 및 비교 서열 분석. SELEX에서 수득된 앱타머 풀(pool)을 PCR-Script Amp 클로닝 키트 (Agilent, Santa Clara, CA, USA, Cat. No. 211189)를 이용하여 클로닝하고, 각 클론의 서열을 ABI Prism 3730 (SeqWright, Houston, TX) 상에서 결정하였다. 복합된 단백질 대 유리 단백질을 이용하여 SELEX에서 수득된 앱타머들을 비교하여, 패턴 동일성 역치 = 0.5-0.9, 패밀리 클러스터 컷오프 = 0.5-0.9, 서열 매치 역치 = 0.8, 및 등가 미스매치 = 5를 갖는 맞춤형, 플렉서블 정렬 알고리즘을 이용하여, 공통의 패턴을 확인하였다.

평형 결합 분석 및 경쟁 분석. SELEX에서 단리된 전장 앱타머 및 이들의 합성, 끝이 잘린 대응물을 대상으로 유리 단백질 및 그 다음 미리-형성된 단백질-메뉴 앱타머 착물 (화학양론 비율 1:1)에 대한 결합을 먼저 평가하여 필터-결합 분석에서 평형 결합 상수 K_d's를 결정하고 비교하였다. 상기 착물의 나일론 막 상으로의 효율적인 분배를 GPVI를 갖는 착물을 제외한(Dynabeads^® His-태그 2 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, Cat. No. 101-04D)가 대신 사용됨), Zorbax PSM-300A (Agilent, Santa Clara, CA, USA)로 달성하였다. 샌드위치 앱타머 후보를 경쟁 결합 분석에서 추가 시험하였고, 여기서 방사선표지된 앱타머 (~0.01 nM)를 경쟁자로서 100-배 과잉의 (10 nM) 비표지된 메뉴 앱타머의 존재하에 다양한 농도 (0.001 nM 내지 100 nM)의 표적 단백질과 함께 인큐베이션하였다.

샌드위치 필터-결합 분석. 필터-결합 샌드위치 분석의 두 가지 변형을 수행하여 12-pt 결합 곡선을 수득하였다. 제1 방법은 단백질 및 방사선표지된 전장 검출 앱타머의 평형 결합 후, AB-H menu 앱타머를 SA 비드 상에 고정화함으로써 제조된 특이적 포착 비드를 이용한 분배 (간헐적 교반하면서 30분)를 포함하였다. 제2 방법은 단백질, 방사선표지된 검출 앱타머 (전장, 비-바이오티닐화됨) 및 과잉의 (10 nM) 비표지된 AB-H menu 앱타머의 평형 결합 동안 3분체 착물의 형성 후, SA 비드를 이용한 분배 (간헐적 교반하면서 5분)에 기반하였다. 두 가지 방법은 비슷한 결과를 낳았다. SA 비드 결합으로 인한 비-특이적 백그라운드를 확인하기 위해, 대조군으로서, 모든 서열을 포착제가 생략된 별개의 분석에서 시험하였다. 포착 및 검출 앱타머의 직접적인 상호작용으로 인해 비-적정가능한 신호를 야기하는 서열과 함께, 이들 클론들은 추가 분석에서 제거되었다.

멀티플렉스 샌드위치 선별 분석. 샌드위치 결합 포맷에서 앱타머 (AB-H 50mers)의 멀티플렉스, 쌍별 스크리닝을 위해 Luminex 플랫폼을 사용하였다. 버퍼 SB17T (1 mM EDTA가 보충된 SB18T)로 미리 적신 MSBVN12 필터 플레이트 (EMD Millipore Corp., Billerica, MA, USA)에서 포착 비드 제조 및 결합 분석을 수행하였다. 상이한 유형의 LumAvidin^® 마이크로구형체 (Luminex Corporation, Austin, TX, Cat. No. L100-L101-01 내지 L100-L116-01)를 개별적인 웰들 (100,000 비드 / 웰) 내로 디스펜싱하고 진공 여과에 의해 180 μl SB17T로 3x1분 세정하였다. 앱타머를 열-냉각하고, 주어진 단백질 표적에 대한 각각의 포착 앱타머의 50 nM 스톡 80 μl를 상이한 비드 유형에 부가하고, 상기 플레이트를 진탕시켜 (실온에서 20분, 1100 rpm) 고정화시켰다. 그리고 나서, 상기 비드를 100 μl 50 nM 스트렙타비딘 및 SB17T 중의 10 mM 바이오틴으로 각각 5분간, 그리고 나서 180 μl SB17T로 4x 1분간 세정하였다. 각각의 단백질에 대한 모든 포착 비드를 풀링(pooled)하고 부피를 SB17T를 이용하여 1.7 ml로 조정하였다. 결합 분석을 위해, 검출제로서 시험될 각 앱타머에 대한 2개의 웰들을 이용하여, 50 μl의 풀링(pooled)된 포착 비드를 미리 적신 MSBVN12 필터 플레이트의 웰들 내로 디스펜싱하고, 비-단백질 대조군을 위하여 SB17T+1%BSA 또는 50 μl 버퍼 중의 20 nM 단백질 50 μl와 혼합하였다. 1100 rpm에서 교반하면서 적어도 30분 후, 플레이트를 180 μl SB17T+1%BSA로 2x1분 진공-세정하고 비드를 50 μl SB17T+BSA에 재현탁시켰다. 열-냉각된 검출 앱타머를 50 μl의 12.5 nM 스톡을 이용하여 개별적인 웰들에 부가하고, 교반하면서 인큐베이션을 30분 동안 계속한 다음, 비드를 세정하고 상기와 같이 재현탁시켰다. 리포터로서, SB17T+BSA 중의 50 μl의 10 μg/ml 스트렙타비딘-파이코에리트린 (SA-PE) 콘주게이트 (Moss, Pasadena, MD, USA, Cat. No. SAPE-001)를 부가하고, 상기 비드를 다시 진탕시키고, 세정하고 상기와 같이 재현탁시켰다. 상기 플레이트를 Luminex 100 분석기 (time out: enabled 120 s, DD gating: 7500-8000, reporter gan: high PMT) 상에서 판독하였다.

샌드위치 분석 표적 적정. AB-H 앱타머 쌍들에 대한 결합 곡선을 비드-기반 및 플레이트-기반 샌드위치 분석 모두에 대해 생성하였다. 비드-분석의 경우, 하나의 특이적 포착 앱타머를 갖는 단일 LumAvidin 마이크로구형체 비드 유형을 사용하였고, 12-점 결합 곡선을 얻기 위해 표적 단백질을 100 nM로부터 시작하여 하프-로그 연속 희석으로 부가하는 것을 제외하고, 상기 선별 분석에 대해 기재된 바와 같이 상기 분석을 본질적으로 수행하였다. 플레이트-분석의 경우, 2 pmol (100 μl의 20 nM) 열-냉각된 앱타머를 Reacti-Bind 스트렙타비딘 코팅된 플레이트 (Pierce Biotechnology-Thermo Scientific, Rockford, IL, USA, Cat. No. 15500) 상에 밤새 고정시켰다. 상기 웰들을 100 μl 50 nM 스트렙타비딘으로 그리고 SB17T 중의 10 mM 바이오틴으로 각각 5분 동안 세정한 다음, 200 μl SB17T+1%BSA으로 10분 동안 차단시켰다. 표적 단백질을 부가하고 교반하면서 45분 동안 인큐베이션하고, 상기 플레이트를 150 μl SB17T+1%BSA로 2x 1분 세정하였다. 검출 앱타머를 부가하고 (SB17T+1%BSA 중의 20 nM 스톡 100 μl), 인큐베이션을 35분 동안 계속하고, 웰들을 상기와 같이 세정하였다. 리포터로서, 100 μl의 0.4 μg/ml SA-HRP 콘주게이트 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, Cat. No. S-911)를 교반하면서 35분간 부가한 다음, SB17 (Tween-20 없음)로 3회 세정하였다. TMB 기질 (FisherScientific, Pittsburg, PA, USA, Cat. No. PI34028)을 20-30분간 부가한 다음 (100 μl), 상기 반응을 50 μl의 10% 황산으로 중지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 기록하였다.

실시예 2: 클로스트리듐 디피실리에 의 2원 독소 A 사슬 ( CdtA )에 대한 앱타머 쌍들의 선택 및 확인

본 실시예는 C. 디피실리에의 2원 독소 A 사슬 (CdtA) 단백질에 대한 DNA 앱타머 쌍들의 선택 및 생산을 위한 대표적인 방법을 제공한다. 이 대표적인 방법은 도 1에 개괄되어 있고 관심있는 다른 표적 (예를 들면, 단백질)을 위한 앱타머 쌍들을 확인하는데 사용될 수 있다.

정제된 재조합 CdtA 단백질 및 TrpdU-변형된 라이브러리를 이용한 SELEX는 0.86 nM의 K_d를 갖는 클론 4758-6을 생성하였다. 클론 4758-6의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 TrpdU를 포함하는 40 뉴클레오타이드의 길이의 앱타머이며, CdtA 단백질에 결합할 수 있다. 상기 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같고: 5'- GAAGACTTTAATTCTGACATGGTGTCCAATGGCGCGCGAG - 3' (서열번호: 1), T는 TrpdU를 나타낸다. 비-경쟁적 앱타머를 확인하기 위한 시도로, 클론 4758-6 (CdtA-4758-6 앱타머 착물)의 비-증폭가능한 형태와의 착물의 내의 CdtA가 제2 SELEX (풀 5579 - 2NapdU 변형된 앱타머 라이브러리)에서 표적으로서 사용되었고, 이는 4758-6 클론을 생성하기 위해 사용된 TrpdU 라이브러리 대신에 2NapdU-변형된 라이브러리를 이용하였다. 하기 표 1은 CdtA 단백질과 착물화된 4758-6 앱타머 클론을 이용한 SELEX에서 확인된 앱타머 (또는 클론)의 서열 분석, 확인된 서열 패턴의 상응하는 수 ("#"), K _d 데이타 및 앱타머-샌드위치가 CdtA-4758-6 앱타머 착물 ("샌드위치")와 함께 형성되었는지 여부의 요약을 제공한다. 약어: 유리 단백질 (F.P.) 및 경쟁자 (Comp.).

표 1

유리 CdtA (풀 5551)를 이용한 SELEX를 CdtA-4758-6 앱타머 착물에 대한 SELEX에서 사용된 동일한 2NapdU 라이브러리와 병행하여, 그리고 또한 상이한 PEdU 변형된 라이브러리 (풀 5574)와 병행하여 수행하였다. 8 라운드의 선택 후, 모든 SELEX 실험은 시작하는 랜덤 라이브러리와 비교하여 적어도 100-배 친화성 농축을 갖는 서열 풀을 생성하는데 성공적이었다. 하기 표 2는 유리 CdtA 단백질 (풀 5551 - 2NapdU 변형된 앱타머 라이브러리)을 이용하여 SELEX에서 확인된 앱타머 (또는 클론)의 서열 분석, 확인된 서열 패턴의 상응하는 수 ("#"), K _d 데이타 및 앱타머-샌드위치가 형성되었는지 여부 ("샌드위치")의 요약을 제공한다.

표 2

하기 표 3은 유리 CdtA 단백질 (풀 5574 - PEdU 변형된 앱타머 라이브러리)을 이용하여 SELEX에서 확인된 앱타머 (또는 클론)의 서열 분석, 확인된 서열 패턴의 상응하는 수 ("#"), K _d 데이타 및 앱타머-샌드위치가 형성되었는지 여부 ("샌드위치")의 요약을 제공한다.

표 3

친화성-농축된 풀 5579 (CdtA-4758-6; 표 1) 및 5551 (유리 CdtA; 표 2)로부터 2NapdU 클론의 비교 서열 분석은 패턴 및 존재도의 차이를 밝혀내었지만, 일부 공유된 서열 모티프도 있었다 (도 1b). 지배적인 패턴은 풀 5579에서 서열의 20 (44%)에서 발생하였지만, 풀 5551에서는 서열의 5 (12%)에서만 발생하였다. 이 패턴을 갖는 서열들 (예를 들면, 5579-7, 5579-12, 5579-21)은 최초 리간드 4758-6를 갖는 샌드위치 포맷에서 일관되게 잘 수행하였다. 다중 카피로 발견된 또 하나의 패턴 및 2개의 서열들은 풀 5579 (CdtA-4758-6)에서 배타적으로 발견되었고, 또한 이들 서열은 4758-6과 비-경쟁적이었다. 또 하나의 패턴은 두 풀 유래의 서열 내에 존재하였고, 이 패밀리는 가장 활성 앱타머 (예를 들면 5579-11)를 함유하였지만, 이들은 샌드위치 분석에서 실패하였다. 아마도, 이들 서열은 SELEX 동안 4758-6과 성공적으로 경쟁하였고, 이는 더 높은 친화성 또는 우수한 결합 동력학으로 동일한 에피토프를 차지한다. 2개의 상이한 패턴 및 3개의 다중사본 서열들이 풀 5551 (유리 CdtA SELEX)에서만 발견되었고 샌드위치 분석은 실패하였다. 마지막으로, 이들 중 몇 가지가 유리 CdtA에 대해 나노몰 이하의 친화성을 가졌음에도 불구하고, PEdU 라이브러리를 이용하여 유리 CdtA SELEX에서 생성된 서열들 중 어느 것도 착물에 결합하지 않았다. 따라서, 유리 CdtA SELEX가 상이한 에피토프에 결합한 몇 가지 새로운 앱타머를 생산하였음에도 불구하고, CdtA-4758-6 착물을 이용한 SELEX는 4758-6과 함께 샌드위치 분석에 대해 유용한 더 큰 부분의 서열들을 명확히 야기하였다.

상기 새로운 앱타머는 0.05 nM-14 nM 범위의 친화성으로 유리 단백질에 결합하였고 (도 1c), 또한 기존 4758-6 TrpdU 앱타머와 함께 경쟁 분석에서 그리고 샌드위치 포맷에서 시험되었다 (도 1d 및 1e). 4758-6 (K_d=0.67 nM vs 0.86 nM)에 비교할만한 친화성을 가진 클론 5579-12에 대해 나타난 바와 같이, CdtA에 대한 결합은 ~100-배 과잉의 (10 nM) 4758-6 경쟁자의 존재에 의해, 또는 4758-6이 포착제로서 사용될 때 영향을 받지 않았는데, 이는 상기 두 서열이 뚜렷이 다른 CdtA 에피토프에 결합한다는 것을 가리킨다. 그에 반해서, 4758-6 (K_d=0.05 nM vs 0.86 nM)과 비교하여 우수한 친화성을 가진 앱타머 5579-11의 결합은 경쟁자 또는 포착제로서 4758-6을 이용하여 감소되었다. 각각의 SELEX로부터의 대표적인 서열들은 또한 Luminex 플랫폼 상에서 스크리닝되었고, 여기서 상기 제1 앱타머 4758-6은 비드 상에서 포착제로서 작용하였다. 착물 SELEX (5579-7, 5579-10, 5579-12, 5579-21)로부터의 대부분의 클론 뿐만 아니라 유리 CdtA SELEX (5551-81)로부터의 하나의 클론은 검출제로서 사용될 때 이들의 결합을 확인하였다 (도 1f). 포착 및 검출 제제는 4758-6 및 5579-12에 대해 상호교환가능하였고, Luminex 샌드위치 분석에서 유사한 결합 곡선을 생산하였다 (도 1g).

실시예 3: 8개의 상이한 단백질 표적에 대한 앱타머 쌍들의 선택

본 실시예는 하기 단백질 표적에 대한 DNA 앱타머 쌍들의 선택 및 생산을 위한 대표적인 방법을 제공한다: 안지오포이에틴-2 (ANGPT2), 트롬보스폰딘-2 (TSP2), 코르딘-유사 1 (CRDL1), 매트릴린-2 (MATN2), 당단백질 VI (GPVI), 내피 세포-선택적 접합 부착 (ESAM), 보체 7 (C7), 및 플라스미노겐 (PLG).

표적 단백질에 대한 앱타머 쌍들을 수득하기 위해 2단계 전략이 이용되었다. 제1 전략의 경우, 우수한 친화성 (K_d<10 nM)을 입증한 SELEX를 통해 수득된 앱타머들은 8개의 표적 중 3개(C7, MATN2, PLG)에 대한 기능적 앱타머 쌍들을 생성하였고, 모두 변형된 뉴클레오타이드로서 BndU를 가지고 있었다. 제2 전략의 경우, SELEX는 2개의 새로운 변형된 뉴클레오타이드 라이브러리 (TrpdU 및 2NapdU)를 이용하는, 표적-소마머 착물을 이용하여, 그리고 TrpdU 또는 2NapdU 라이브러리 중 하나를 이용하는 유리 단백질 SELEX를 이용하여 수행되었다. 7 라운드의 SELEX 후, 모든 24 풀은 DNA 재해리 (C₀t) 동력학에 기초한 수렴(convergence)을 나타내었고 저-나노몰 또는 나노몰 이하의 K _d 값을 입증하였다. 풀 당 적어도 48 소마머의 클로닝 및 일상적인 서열분석은 단백질-소마머 착물 및 유리 단백질 표적을 이용한 SELEX에서 수득된 서열의 비교 분석을 허용하였다. 모든 경우에, 단백질-소마머 착물에 결합한 활성 클론들이 수득되었으나, 큰 비율의 시험된 클론들은 유리 표적이 SELEX를 위해 사용된 착물에 결합하지 않았다. 따라서, SELEX 동안 단백질-소마머 착물 표적을 이용하는 것은 샌드위치 후보를 찾는 가능성을 명확히 증가시켰다. 하지만, 예외는 ESAM-2981-9 착물을 이용하여 선택된 풀 7565 TrpdU로부터의 클론들이었고, 이들 모두는 공통된 서열 패턴을 가지고 있었고, ESAM-2981-9 착물의 결합을 나타내었지만 유리 ESAM 단백질의 결합을 나타내지 않았다. 훗날, 이 서열들은 표적 단백질에 결합하기보다는 소마머 2981-9와 상호작용하는 것으로 나타났다.

단백질-menu 소마머 착물에 대한 새로운 클론들의 관측된 결합은 진짜 샌드위치의 존재를 입증하지 않았는데, 상기 클론들이 menu 소마머를 간단히 대체하고 동일한 에피토프에 결합할 수 있기 때문이다. 이를 구분하기 위해, 새로운 클론을 10 nM (~100-배) 과잉의 비표지된 경쟁자 menu 소마머의 존재하에 결합 분석 및 포착 제제로서 메뉴 소마머를 이용한 샌드위치 분석하였다. 도 2a에 묘사된 샌드위치 분석은 샌드위치가 형성되는 경우에만 신호를 야기하였고, 제1 소마머의 치환이 일어나는 경우에는 신호를 야기하지 않았다. 착물 단백질 또는 유리 단백질을 이용한 SELEX에서 수득된 모든 소마머 (합성 5'AB-H 50mer)에 대한 상세한 서열 분석 및 결합 특성이 표 4-27에 하기에 나타나 있다.

표 4-6은 안지오포이에틴-2 (ANGPT2) 단백질에 대한 앱타머에 대한 요약을 제공한다. 클론 2602-2의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, ANGPT2 단백질에 결합할 수 있다.

표 4

표 5

표 6

표 7-9는 트롬보스폰딘-2 (TSP2) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 3339-33의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, TSP2 단백질에 결합할 수 있다.

표 7

표 8

표 9

표 10-12는 코르딘-유사 1 (CRDL1) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 3362-61의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, CRDL1 단백질에 결합할 수 있다.

표 10

표 11

표 12

표 13-15는 매트릴린-2 (MATN2) 단백질에 대한 앱타머에 대한 요약을 제공한다. 클론 3325-2의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, MATN2 단백질에 결합할 수 있다.

표 13

표 14

표 15

표 16-18은 당단백질 VI (GPVI) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 3194-36의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, GPVI 단백질에 결합할 수 있다.

표 16

표 17

표 18

표 19-21은 내피 세포-선택적 부착 (ESAM) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 2981-9의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, ESAM 단백질에 결합할 수 있다.

표 19

표 20

표 21

표 22-24는 보체 7 (C7) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 2888-49의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, C7 단백질에 결합할 수 있다.

표 22

표 23

표 24

표 25-27은 플라스미노겐 (PLG) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 4151-6의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이고, PLG 단백질에 결합할 수 있다.

표 25

표 26

표 27

이 결합 분석이 샌드위치 포맷에서 수행하는 앱타머를 확인하는데 유용하지만, 그것은 쌍별 시험에 제한된다. 따라서, 우리는 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같이, Luminex 플랫폼을 이용한 고 멀티플렉스 샌드위치 선별 분석 방법을 수립하였다 (도 2b).

실시예 4: 변형된 샌드위치 SELEX 방법에 의한 표적 단백질에 대한 앱타머 쌍들의 선택

본 실시예는 하기 단백질 표적에 대한 DNA 앱타머 쌍들의 선택 및 생산을 위한 대표적인 방법을 제공한다: 매트릭스 메탈로프로테이나제-12 (MMP-12) 및 분비된 포스포리파제 A2 (NPS-PLA2).

표적-앱타머 착물의 분배를 위해 비드 상에 부착된 포착 제제로서 PBDC 앱타머를 이용한 변형된 샌드위치 SELEX 프로토콜에 따라 표적 단백질에 대한 앱타머 쌍들을 수득한 다음, 3분체 착물을 광절단하였다. MMP-12의 경우, PBDC 앱타머 4496-60 BndU를 NapdU 라이브러리를 이용한 SELEX에 대한 표적과 착물을 형성하는데 사용하였다. NPS-PLA2의 경우, PBDC 앱타머 2692-74 BndU를 TrpdU 라이브러리를 이용한 SELEX에서 착물 형성을 위해 사용하였다. 9 라운드의 SELEX 후, 상기 풀을 시퀀싱하고 개별적인 클론들을 합성에 의해 제조하고 (AB-H 50mer) 결합에 대해 시험하였다.

표 28은 메탈로프로테이나제-12 (MMP-12) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 4496-60의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, MMP-12 단백질에 결합할 수 있다.

표 28

표 29는 포스포리파제 A2 (NPS-PLA2) 단백질에 대한 앱타머의 요약을 제공한다. 클론 2692-74의 핵산 분자는 C-5 변형된 피리미딘, 구체적으로 BndU를 포함하는 앱타머로서 40 뉴클레오타이드의 길이이며, NPS-PLA2 단백질에 결합할 수 있다.

표 29

실시예 5: 앱타머 쌍들의 평형 결합 상수

본 실시예는 DNA 앱타머 쌍들에 대한 평형 결합 상수 (K_d 값)를 측정하기 위한 대표적인 방법을 제공한다.

요약하면, 주어진 표적에 대한 각각의 클론을 특이적 LumAvidin 비드 유형 상에 개별적으로 고정시켰다. 그리고 나서, 상기 비드를 풀링(pooled)하여 표적의 포착을 위해 사용하였고, 각각의 샌드위치 후보 클론을 검출을 위해 개별적으로 사용하였다. 8개의 패널 단백질 (ANGPT2, TSP2, CRDL1, MATN2, GPVI, ESAM, C7 및 PLG)에 대한 앱타머 샌드위치 후보의 수 (표적당 7-16 범위)와 관련하여, 이 접근법은 1116 분석 (15²+14²+16²+14²+9²+7²+8²+7²)으로부터 90 분석 (15+14+16+14+9+7+8+7)으로, 기능적 앱타머 샌드위치에 대한 쌍별 스크리닝의 2차원 매트릭스를 1차원으로 감소시켰다. 상기 멀티플렉스 Luminex 샌드위치 선별 분석은, 예를 들면, 열 지도(heat map)으로서 총 신호를 플롯팅함으로써 기능적 앱타머 쌍들을 신속히 확인할 수 있게 해주었다. 도 2c에서 예로서 나타난 CRDL1의 경우, 16 앱타머들을 포착 및 검출 시약으로 쌍별 매트릭스에서 시험하였고, 이는 TrpdU를 함유하는 11개의 서열, 2NapdU를 갖는 4개, 및 BndU를 갖는 앱타머를 포함한다. CRDL1에 대한 menu 앱타머 3362-61은 새로운 클론 중 어느 것과 함께 포착제로서 또는 검출제로서 사용될 때 잘 수행하였다. 그에 반해서, 클론 7575-6 및 7575-19는 검출 제제로서 더 잘 기능하였다 (도 2d). 비교하면, 새로운 클론 중 하나 (7575-2)를 어떤 다른 새로운 클론과 함께 사용하는 샌드위치 분석은 더 낮은 신호를 생산하였고, 어떤 쌍도 menu 소마머 3362-61과의 쌍만큼 우수하지 않았다 (도 2e). 포착 및 검출을 위해 사용된 동일한 소마머를 이용하여 어떤 신호도 수득되지 않았다.

Luminex 플랫폼 상의 샌드위치 결합 곡선이 8개의 단백질 중 7개 단백질에 대해 생성되었다: ANGPT2 (안지오포이에틴-2), TSP2, CRDL1, MATN2, C7, PLG (플라스미노겐), 및 GPVI뿐만 아니라, MMP-12 및 NPS-PLA2 (도 2f). 동족 앱타머와의 단백질 착물에 대한 새로운 앱타머의 겉보기 평형 결합 상수 (K_d 값)는 0.02-2.7 nM 범위였다 (참고 표 30). 주목할만하게도, MATN2 및 C7 샌드위치 분석의 경우, 앱타머 1 (포착) 및 앱타머 2 (검출)에 대한 C-5 변형된 피리미딘이 상이할 때 "샌드위치" K_d 값이 개선되었다. 특이적으로, MATN2의 경우, 샌드위치 K_d 값은 약 2.5 배 개선되었고 (BndU 포착 앱타머 및 BndU 검출 앱타머 (2.19 nM K_d)를 BndU 포착 앱타머 및 TrpdU 검출 앱타머 (0.88 nM K_d)와 비교; 표 30 참조), C7의 경우, 샌드위치 K_d 값은 약 6.3배 개선되었다 (BndU 포착 앱타머 및 BndU 검출 앱타머 (8.56 nM K_d)를 BndU 포착 앱타머 및 2NapdU 검출 앱타머 (1.35 nM K_d)와 비교; 표 30 참고).

표 30에서의 단백질에 대한 Swiss Prot 번호는 하기와 같다: ESAM (SwissProt # Q96AP7) 및 CdtA - 2원 독소 (SwissProt # Q9KH42), ANGPT2 (SwissProt # O15123), TSP2 (SwissProt # P35442), CRDL1 (SwissProt # Q9BU40), MATN2 (SwissProt # O00339), C7 (SwissProt # P10643), PLG (SwissProt # P00747), GPVI (SwissProt # Q9HCN6 ), MMP-12 (SwissProt # 39900), NPS-PLA2 (SwissProt # 14555).

표 30

¹인간 단백질; ² C. 디피실리에 단백질

^a 방사선표지 분석에서 결정됨. 괄호 안의 값은 표적과 앱타머 1과의 착물에 대한 것임

^b Luminex 비드-기반 샌드위치 분석에서 결정됨

^c 보관된 서열로부터의 앱타머 (샌드위치 SELEX 없이)

LumAvidin 비드-기반 분석 외에, 본 발명자들은 또한 플레이트-기반 샌드위치 분석에서 앱타머 쌍들 중 일부를 평가하였다. 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 상에 고정된 포착 제제로서, 그리고 스트렙타비딘-HRP 콘주게이트와 함께 검출 제제로서 바이오티닐화된 앱타머를 이용하여, 표적 적정은 비드-기반 시험과 비교하여 분석 성능에서 차이를 나타내었다. C7 앱타머 쌍에 대한 겉보기 K_d 값은 두 분석 유형에서 본질적으로 동일하였지만, TSP2 쌍은 Luminex 분석에서 더 우수하게 수행하였고, 플라스미노겐 쌍은 플레이트 분석에서 약간 더 우수하였다 (참고 도 3).

표 31 및 32는 3원 착물 (즉, "앱타머 샌드위치")를 만들기 위해, 그리고 표적의 포착 및 검출을 위해 사용된 표 30에 요약된 앱타머의 물리적 및 기능적 특성의 요약을 제공한다.

"포착 앱타머" (또는 제1 앱타머)로서 사용된 11개의 앱타머의 설명이 표 31에 제공된다.

표 31

일반적으로, "포착 앱타머" (또는 제1 앱타머)로서 기능한 앱타머들은 약 48 내지 약 58 뉴클레오타이드의 길이 (또는 약 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 또는 58 뉴클레오타이드의 길이)였다. 각각의 앱타머는 40-량체 (40개의 뉴클레오타이드의 길이) 중앙 영역을 포함하였다 (앱타머의 나머지 뉴클레오타이드들이 40-량체 중앙 영역의 측면에 있음). 상기 40-량체 중앙 영역은 약 9 내지 약 16 (또는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16) BndU 또는 TrpdU C-5 변형된 피리미딘을 포함한다. 대안적으로, 40-량체 중앙 영역은 약 22% 내지 약 40% (또는 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40%) BndU 또는 TrpdU C-5 변형된 피리미딘을 포함한다. 게다가, "포착 앱타머"의 40-량체 중앙 영역은 약 37% 내지 약 58% GC 함량 (또는 약 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58% GC 함량)을 포함한다. 상기 "포착 앱타머" (또는 제1 앱타머)는 약 0.07 nM 내지 약 4.9 nM (또는 약 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8 또는 4.9 nM)의 그의 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 포함한다.

"검출 앱타머" (또는 제2 앱타머)로서 사용된 14개의 앱타머의 설명이 표 30에 제공된다.

표 32

일반적으로, "검출 앱타머" (또는 제2 앱타머)로서 기능한 앱타머는 약 50 내지 약 58 뉴클레오타이드의 길이 (또는 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58 뉴클레오타이드의 길이)였다. 각각의 앱타머는 40-량체 (40개의 뉴클레오타이드의 길이) 중앙 영역을 포함하였다 (앱타머의 나머지 뉴클레오타이드는 40-량체 중앙 영역의 측면에 있음). 상기 40-량체 중앙 영역은 약 5 내지 약 15 (또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15) BndU, TrpdU, NapdU 또는 2NapdU C-5 변형된 피리미딘을 포함한다. 대안적으로, 40-량체 중앙 영역은 약 12% 내지 약 38% (또는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 또는 38%) BndU, TrpdU, NapdU 또는 2NapdU C-5 변형된 피리미딘을 포함한다. 게다가, "검출 앱타머" (또는 제2 앱타머)의 40-량체 중앙 영역은 약 37% 내지 약 58% GC 함량 (또는 약 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 또는 58% GC 함량)을 포함한다. "검출 앱타머" (또는 제2 앱타머)는 약 0.03 nM 내지 약 13.1 nM (또는 약 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10, 10.2, 10.4, 10.6, 10.8, 11, 11.2, 11.4, 11.6, 11.8, 12, 12.2, 12.4, 12.6, 12.8, 13, 13.2, 13.4, 13.6, 13.8 또는 14 nM)의 그의 표적 단백질에 대한 결합 친화도를 포함한다.

요약하면, 단백질 분석물의 샌드위치 분석에 적합한 기능적 앱타머 쌍들이 확인되었다. 표적-앱타머 착물을 이용한 제2 SELEX를 적용하는 접근법과 조합된, 보관된 SELEX 풀로부터 기존 앱타머를 찾는 것은 상이한 유형의 변형된 뉴클레오타이드를 사용하는 것이 표적에 결합할 수 있는 앱타머 쌍을 확인할 수 있게 해준다는 개념을 뒷받침한다. 앱타머 샌드위치 분석에서, 비-특이적 결합으로 인한 백그라운드는 특이적 및 비-특이적 앱타머 간의 차별적인 오프-레이트의 결과로서 줄어든다. 2-시약 샌드위치-유형 측정에서 내재하는 부가된 특이성과 조합된, 이 특징은 더 큰 특이성 및 더 높은 멀티플렉스 능력을 갖는 분석의 개발을 위한 토대를 제공한다. 앱타머 쌍들은 기기의 큰 설치 기반이 이미 시행되고 있는 의료 진단의 다양한 분야에서 특이적 패널의 개발을 위한 가망성을 가지고 있다.

<110> SOMALOGIC, INC. <120> Multiaptamer Target Detection <130> I16O10C0009P/US <150> US 61/881,629 <151> 2013-09-24 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (7)..(9) <223> 5-[N-(3-indole-2-ethyl)-carboxyamide]-2'-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> 5-[N-(3-indole-2-ethyl)-carboxyamide]-2'-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> 5-[N-(3-indole-2-ethyl)-carboxyamide]-2'-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> 5-[N-(3-indole-2-ethyl)-carboxyamide]-2'-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> 5-[N-(3-indole-2-ethyl)-carboxyamide]-2'-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> 5-[N-(3-indole-2-ethyl)-carboxyamide]-2'-deoxyuridine <220> <221> misc_feature <222> (30) <223> 5-[N-(3-indole-2-ethyl)-carboxyamide]-2'-deoxyuridine <400> 1 gaagacnnna anncngacan ggngnccaan ggcgcgcgag 40

Claims

제1 앱타머, 제2 앱타머 및 표적을 포함하고,
여기서, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하며, 및
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 상이하고; 및
상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머 및 상기 표적은 3원 착물을 형성할 수 있는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머는 상기 표적에 대해 결합 친화도를 가지나, 상기 제2 앱타머에 대해서는 그렇지 않은, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2 앱타머는 상기 표적에 대해 결합 친화도를 가지나, 상기 제1 앱타머에 대해서는 그렇지 않은, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2 앱타머는 상기 제1 앱타머와 상기 표적과의 회합에 의해 형성된 착물에 대해 결합 친화도를 갖는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표적의 제1 앱타머 결합 영역 및 상기 표적의 제2 앱타머 결합 영역은 상이한 영역인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는, 독립적으로, RNA, DNA 또는 이들의 조합을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU), 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머의 퍼센트 GC 함량은, 독립적으로, 약 37% 내지 약 58%인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머는 약 9 내지 약 16개의 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU) 및, 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU)으로 이루어진 그룹으로부터 C-5 변형된 피리미딘인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU), 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2 앱타머는 약 5 내지 약 15개의 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU) 및 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제2 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머 각각은, 독립적으로, 그 길이가 20 내지 100의 뉴클레오타이드인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함하는, 조성물.
제19항에 있어서,
상기 검출가능한 모이어티는 염료, 양자점, 방사선표지, 전기화학적 작용기, 효소, 효소 기질, 리간드 및 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 표적은 단백질 또는 펩타이드를 포함하는, 조성물.
제21항에 있어서,
상기 표적은 ANGPT2, TSP2, CRDL1, MATN2, GPVI, ESAM, C7, PLG, MMP-12, NPS-PLA2 및 CdtA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질인, 조성물.
제1항에 있어서,
상기 3원 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 적어도 0.02 nM, 또는 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 0.02 nM 내지 약 6 nM, 또는 약 0.02 nM 내지 약 3 nM인, 조성물.
a) 상기 샘플을 제1 앱타머와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계로, 여기서, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제1 착물을 형성할 수 있고;
b) 상기 혼합물을, 상기 제1 착물이 형성되도록 하는 조건하에서 인큐베이팅하는 단계;
c) 상기 혼합물을 제2 앱타머와 접촉시키고, 상기 제2 앱타머는 상기 제1 착물에 결합하여 제2 착물을 형성할 수 있는 단계;
d) 상기 혼합물을 상기 제2 착물이 형성되도록 하는 조건하에서 인큐베이팅하는 단계;
e) 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머, 상기 표적, 상기 제1 착물 또는 상기 제2 착물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로, 여기서, 상기 제1 앱타머, 상기 제2 앱타머, 상기 표적, 상기 제1 착물 또는 상기 제2 착물의 존재는 상기 표적이 상기 샘플 내 존재한다는 것을 나타내고; 및
여기서, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하며, 및
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 상이한 것을 포함하는, 샘플에서 표적을 검출하는 방법.
a) 표적을 제1 앱타머와 접촉시켜 혼합물을 형성하는 단계로, 여기서, 상기 제1 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제1 착물을 형성할 수 있고;
b) 상기 혼합물을, 상기 제1 착물이 형성되도록 하는 조건하에서 인큐베이팅하는 단계;
c) 상기 혼합물을 제2 앱타머와 접촉시키고, 상기 제2 앱타머는 상기 표적에 결합하여 제2 착물을 형성할 수 있는 단계;
d) 상기 혼합물을 상기 제2 착물이 형성되도록 하는 조건하에서 인큐베이팅하는 단계;
e) 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로, 여기서, 상기 혼합물 중 상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머 둘 모두의 존재는 상기 제1 앱타머의 상기 표적에의 결합 및 상기 제2 앱타머의 상기 표적에의 결합이 비-경쟁적이라는 것을 나타내고; 및
여기서, 상기 제1 앱타머는 제1 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하고, 상기 제2 앱타머는 제2 C-5 피리미딘 변형 도식을 포함하며, 및
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식 및 상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 상이한 것을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 앱타머는 표적에 대해 결합 친화도를 가지며 상기 제2 앱타머에 대해서는 그렇지 않은, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 앱타머는 표적에 대해 결합 친화도를 가지며 상기 제1 앱타머에 대해서는 그렇지 않은, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 앱타머는 상기 제1 착물에 대한 결합 친화도를 갖는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 표적의 제1 앱타머 결합 영역 및 상기 표적의 제2 앱타머 결합 영역은 상이한 영역인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머는, 독립적으로, RNA, DNA 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU), 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU) 및 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU), 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 C-5 피리미딘 변형 도식은 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘을 포함하는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU), 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (PEdU), 5-[N-(페닐-3-프로필)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (PPdU), 5-[N-(2-티오펜-메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (ThdU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (iBudU), 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (TrpdU), 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄) 프로필]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 클로라이드, 5-[N-(1-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NapdU), 5-[N-(2-나프틸메틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (2-NapdU), 5-[N-(1-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 (NEdU), 5-[N-(2-나프틸에틸)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 2NEdU), 5-[N-(4-플루오로벤질)카복시아미드]-2'-데옥시우리딘 FBndU), 5-[N-(4-하이드록시페닐-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (TyrdU), 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸우리딘, 5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로우리딘, 5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시우리딘, 5-[N-(3-벤조[b]티오펜-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BTdU), 5-[N-(3-벤조[a]푸란-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (BFdU), 5-[N-(3,4-메틸렌디옥시벤질)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MBndU), 5-[N-((R)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (RTHdU), 5-[N-((S)-2-테트라하이드로푸릴메틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (STHFdU), 5-(N-2-이미다졸릴에틸카복사마이드)-2'-데옥시우리딘 (ImiddU) 및 5-[N-(1-모폴리노-2-에틸)카복사마이드]-2'-데옥시우리딘 (MOEdU)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 C-5 변형된 피리미딘인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 앱타머의 각각의 우라실 또는 티민은 5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시우리딘 (BndU)인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 앱타머 및 상기 제2 앱타머 각각은, 독립적으로, 그 길이가 20 내지 100의 뉴클레오타이드인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 앱타머 및/또는 상기 제2 앱타머는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함하는, 방법.
제43항에 있어서,
상기 검출가능한 모이어티는 염료, 양자점, 방사선표지, 전기화학적 작용기, 효소, 효소 기질, 리간드 및 수용체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 표적은 단백질 또는 펩타이드를 포함하는, 방법.
제45항에 있어서,
상기 표적은 ANGPT2, TSP2, CRDL1, MATN2, GPVI, ESAM, C7, PLG, MMP-12, NPS-PLA2 및 CdtA로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 적어도 0.02 nM, 또는 약 0.01 nM 내지 약 10 nM, 또는 약 0.02 nM 내지 약 6 nM, 또는 약 0.02 nM 내지 약 3 nM인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제1 착물에 대한 해리 상수 (K _d )는 약 0.04 nM 내지 약 5 nM, 또는 약 0.04 nM 내지 약 4.8 nM인, 방법.
제24항 또는 제25항에 있어서,
상기 제2 앱타머 및 상기 표적에 대한 해리 상수 (K _d )는 약 0.03 nM 내지 약 14 nM인, 방법.