JP6506768B2 - 多重アプタマー標的の検出 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）の下に、２０１３年９月２４日に提出された米国仮出願番号６１／８８１６２９の優先権を主張する。これら参考文献の各々は、その全体を本明細書の一部として本願に援用する。
本開示は、一般的には核酸リガンドの分野に関し、より詳細には、アプタマー対に基づく標的検出、アプタマー対及び標的を含む組成物、及びその製造方法及び使用方法に関する。
２０１４年９月２４日作成されたサイズ２キロバイトの配列表の全体を、本明細書の一部として援用する。
タンパク質診断は、広範な一連の臨床応用を有しており、プロテオミクス的特徴または疾患特異的バイオマーカーを決定するために有用である。これらの診断は、典型的には、所望の標的（例えば、タンパク質）を捕捉及び検出するための、分析物特異的な試薬の対を必要とする。抗体は診断試薬として広く使用されてきた。しかし、それらは十分な質及び量で入手するのが困難であり、複数の標的を試験するときは限定された多重化を可能にするに過ぎない。更に、それらは、固有の交差反応性及び普遍的でないアッセイ条件に起因して、多重化された、または高含量のプロテオミクス用途についてはアレイに限定される。
抗体とは対照的に、核酸ベースのリガンドは、低分子量、熱安定性及び乾燥安定性、可逆的再生、製造の容易さ、及び低コストを含めて、抗体を凌駕する幾つかの利点を有する。しかしながら、二つの異なるアプタマーが結合する検体は、これまでに数例しか存在していない。一例としては、トロンビンのフィブリノーゲン認識性エキソサイト及びヘパリン結合性エキソサイトに対する別々のＤＮＡアプタマーが記載されており、これらアプタマーＴＢＡ１（１５量体）及びＴＢＡ２（２９量体）は両方とも、トロンビン上の離散した電気陽性表面に結合するＧカルテットモチーフからなっている。ＴＢＡ１及びＴＢＡ２を用いたサンドイッチアッセイが、アプタマーマイクロアレイ及び蛍光検知プラットホームを含めて、潜在的なトロンビンのモニタリングのために開発されてきた。別の例はインテグリンαＶβ３であり、そのためのαＶまたはβ３サブユニットに対するＲＮＡアプタマーが、αＶβ３またはαＩＩｂβ３を用いた連続選別を介して生成された。ＴＡＴＡ結合性タンパク質（ＴＢＰ）、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、及びＶＥＧＦ−１６５に対するアプタマー対も報告されている。タンパク質標的を検出するためのアプタマー対の数が限定されるのは、おそらく、アプタマーは優勢なカチオン性エピトープに結合する傾向があり、それによって最良のリガンドが共通の表面に対して駆動されることの結果である。従って、選別を重複しないエピトープに対して強制的に向けるために、特別な選別方法が一般に必要とされている。
従って、標的タンパク質を検出するための改良された、費用効果が高く且つ効率的な代替組成物及び方法に対する必要性が引き続き存在している。本開示は、タンパク質検出のための遅いオフ速度のアプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）試薬対の新規な組み合わせを提供することによって、そのような必要性を満たすものであり、これらは５−位が修飾されたデオキシウリジン残基を含み、これが従来のアプタマーに比較してタンパク質標的の範囲を拡大し、且つ結合特性を改善するものである。
本開示は、第一のアプタマー、第二のアプタマー及び標的を含んでなる組成物であって、前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキーム及び前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは異なり、また前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー及び前記標的は三元複合体を形成できる組成物を開示する。
本開示のもう一つの態様において、前記第一のアプタマーは前記標的についての結合親和性を有し、また前記第二のアプタマーについてはそれを有さない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーが前記標的についての結合親和性を有し、また前記第一のアプタマーについてはそれを有さない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記標的と前記第一のアプタマーの結合により形成される複合体に対して結合親和性を有する。
もう一つの態様において、前記標的の第一のアプタマー結合領域と前記標的の第二のアプタマー結合領域は異なる領域である。関連する側面において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、前記標的上の非競合的結合部位を有している。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組み合わせを含んでいる。
もう一つの態様において、前記Ｃ−５修飾されたピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−［Ｎ−（２−チオフェンメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）（これは５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジンとも言う）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（４−フルオロベンジル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ａ］フラン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−［Ｎ−（３，４−メチレンジオキシベンジル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｒ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＲＴＨｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｓ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＳＴＨＦｄＵ）、５−（Ｎ−２−イミダゾリルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｉｄｄＵ）、５−［Ｎ−（１−モルホリノ−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＯＥｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
もう一つの関連する態様では、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）を含む。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２ −ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシ）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである。関連する態様において、前記第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
もう一つの態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−（Ｎ−［１−ナフチルメチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−［２−ナフチルメチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ −ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。関連する態様では、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。更に別の関連の態様では、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである。関連する態様では、前記第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーのパーセントＧＣ含量は、独立に、約３７％〜約５８％（または約３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％もしくは５８％）である。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーは、約９〜約１６（またはは約９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、もしくは１６）のＣ−５修飾されたピリミジンを含んでいる。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、約５〜約１５のＣ−修飾されたピリミジン（または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５）を含んでいる。
もう一つの態様において、第一のアプタマー及び第二のアプタマーは、独立して、それぞれが約２０〜１００ヌクレオチドの長さ（または長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド）である。関連する態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、それぞれが約４０〜約１００ヌクレオチドの長さ（または長さが４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド）である。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び／または前記第二のアプタマーは、更に検出可能な部分を含む。関連する態様において、該検出可能な部分は、色素、量子ドット、放射性標識、電気化学的官能基、酵素、酵素基質、リガンド及び受容体からなる群から選択される。
もう一つの態様において、前記標的はタンパク質またはペプチドを含む。関連する態様において、前記標的は、ＡＮＧＰＴ２、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬ１、ＭＡＴＮ２、ＧＰＶＩ、ＥＳＡＭ、Ｃ７、ＰＬＧ、ＭＭＰ−１２、ＮＰＳ−ＰＬＡ２及びＣｄｔＡからなる群から選択されるタンパク質である。
もう一つの態様において、前記三元複合体の解離定数（Ｋｄ）は、少なくとも０．０２ｎＭ、または約０．０１ｎＭ〜約１０ｎＭ、または約０．０２ｎＭ〜約６ｎＭ（または約０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９もしくは６ｎＭ）、または約０．０２ｎＭ〜約３ｎＭ（または０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８、０．５、０．５２、０．５４、０．５６、０．５８、０．６、０．６２、０．６４、０．６６、０．６８ 、０．７、０．７２、０．７４、０．７６、０．７８、０．８、０．８２、０．８４、０．８６、０．８８、０．９、０．９２、０．９４、０．９６、０．９８、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９もしくは３ｎＭ）である。
本開示は、試料中の標的を検出するための方法を記載するものであり、該方法は、第一のアプタマーと試料を接触させて混合物を形成し、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的と結合して第一の複合体を形成できることと；前記混合物を、前記第一の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物を第二のアプタマーと接触させ、ここでの該第二のアプタマーは前記第一の複合体と結合して第二の複合体を形成できることと；前記混合物を、前記第二の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物中における前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的、前記第一の複合体または前記第二の複合体の存在または不存在を検出し、ここで前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的、前記第一の複合体または前記第二の複合体の存在が、前記サンプル中の前記標的の存在を示すことを含んでなり、前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、また前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームと前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームが異なっている。
一態様において、本開示は更に、ここに開示された方法の何れかは、任意に動力学的チャレンジを受けるか、または含んでいてよいことを提供する。もう一つの態様において、ここに記載の方法は更に、標的とアプタマーの結合親和性を改善するために、競合分子の添加、希釈工程または１以上の洗浄を含む。関連する態様では、前記競合分子は、オリゴヌクレオチド、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、硫酸デキストラン、ポリアニオン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ及びピロリン酸からなる群から選択される。もう一つの態様において、前記動力学的チャレンジは、ここに記載の複合体の何れかを含む混合物を希釈することと、前記アプタマー親和性複合体を含有する混合物を、３０秒以上、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、３０分、及び６０分からなる群から選択された時間インキュベートすることを含む。もう一つの態様において、前記動力学的チャレンジは、前記アプタマー親和性複合体を含む混合物を希釈することと、前記アプタマーの親和性複合体を含む混合物を、非特異的複合体の測定レベルに対するアプタマー親和性複合体の測定レベルの比率が増大するように、或る時間だけインキュベートすることを含む。
もう一つの態様において、試料中の標的を検出するための前記方法は、前記サンプルを前記第一及び第二のアプタマーに同時に接触させることと、前記混合物を、前記標的並びに前記第一及び第二のアプタマーを含む複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと、前記混合物において前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的、または前記複合体の存在または不存在を検出することを含んでなり、前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、または前記複合体の存在により、前記標的が前記サンプル中に存在することが示される。
もう一つの態様において、前記第一及び第二のアプタマーは両者とも独立に、前記標的と複合体を形成することができる。詳細には、前記第二のアプタマーは、単独の前記標的と複合体を形成できると同様に、前記第一アプタマー及び前記標的間の複合体と複合体を形成することができる。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーは前記標的に対して結合親和性を有し、また前記第二のアプタマーについてはそれを有さない。。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記標的に対して結合親和性を有し、また前記第一のアプタマーについてはそれを有さない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記第一の複合体に対する結合親和性を有する。
もう一つの態様において、前記標的の第一のアプタマー結合領域と、前記標的の第二のアプタマーの結合領域は異なる領域である。関連する態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、前記標的上に非競合性の結合部位を有する。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、RNA、DNAまたはそれらの組み合わせを含む。
もう一つの態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含んでいる。関連する態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。更にもう一つの関連する態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。もう一つの関連する態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）を含む。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジンの（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである。関連する態様において、前記第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
もう一つの態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。関連する態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。更にもう一つの関連した態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジンの（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、塩化５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである。関連する態様において、前記第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、各々が２０〜１００ヌクレオチドの長さ（または長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド）である。関連する態様において、前記第一アプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、約４０〜約１００ヌクレオチドの長さ（または長さが４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０からのものです５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド）である。
もう一つの態様において、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、更に検出可能な部分を含む。関連する態様において、該検出可能な部分は、色素、量子ドット、放射性標識、電気化学的官能基、酵素、酵素基質、リガンド及び受容体からなる群から選択される。
もう一つの態様において、前記標的は、タンパク質またはペプチドを含む。関連する態様において、前記標的は、ＡＮＧＰＴ２、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬ１、ＭＡＴＮ２、ＧＰＶＩ、ＥＳＡＭ、Ｃ７、ＰＬＧ、ＭＭＰ−１２、ＮＰＳ−ＰＬＡ２及びＣｄｔＡからなる群から選択されるタンパク質である。
もう一つの態様において、第二の複合体の解離定数（Ｋｄ）は、少なくとも０．０２ｎＭ、または約０．０１〜約１０ｎＭ、または約０．０２ｎＭ〜約６ｎＭ（または約０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６ｎＭ）、または約０．０２ ｎＭ〜約３ｎＭ（または０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８、０．５、０．５２、０．５４、０．５６、０．５８、０．６、０．６２、０．６４、０．６６、０．６８、０．７、０．７２、０．７４、０．７６、０．７８、０．８、０．８２、０．８４、０．８６、０．８８、０．９、０．９２、０．９４、０．９６、０．９８、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３ｎＭ）である。
もう一つの態様において、前記第一複合体の解離定数（Ｋｄ）は、約０．０４ｎＭ〜約５ｎＭ（または０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９または５ｎＭ）、または約０．０４ｎＭ〜約４．８ｎＭ（または、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７または４．８）である。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマー及び前記標的の解離定数（Ｋｄ）は、約０．０３ｎＭ〜約１４ｎＭ（または０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８または１４ｎＭ）である。
本開示は更に、標的を第一のアプタマーと接触させて混合物を形成し、該第一のアプタマーは前記標的に結合して第一複合体を形成できることと；該混合物を、前記第一の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物を第二のアプタマーと接触させ、該第二のアプタマーは前記標的と結合して第二の複合体を形成できることと；前記混合物を、第二の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物中における前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーの存在または不存在を検出し、前記混合物中に前記第一のアプタマー及び第二のアプタマーの両者の存在によって、前記標的への前記第一のアプタマーの結合及び前記標的への前記第二のアプタマーの結合が非競争的であることが示されることを含んでなり、ここで前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームと第Ｃ−５ピリミジン修飾スキームが異なる方法を記載する。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーは、前記標的に対する結合親和性を有し、且つ前記第二のアプタマーに対する結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記標的に対する結合親和性を有し、且つ前記第一のアプタマーに対する結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記第一複合体に対する結合親和性を有する。
もう一つの態様において、前記標的の前記第一のアプタマー結合領域と、前記標的の前記第二のアプタマー結合領域は異なる領域である。関連する態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、標的上の非競合性の結合部位を有する。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組み合わせを含む。
もう一つの態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。関連する態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。更にもう一つの関連の態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。もう一つの関連する態様では、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）を含む。
もう一つの態様において、第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである。関連する態様において、前記第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）です。
もう一つの態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２ −ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。関連する態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。更にもう一つの関連した態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。
もう一つの態様において、第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシ）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである。関連する態様において、前記第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、２０〜１００ヌクレオチドの長さ（または長さが２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド）である。関連する態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、約４０〜約１００ヌクレオチドの長さ（または長さが４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド）である。
もう一つの態様において、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは更に、検出可能な部分を含む。関連する態様において、該検出可能な部分は色素、量子ドット、放射性標識、電気化学的官能基、酵素、酵素基質、リガンド及び受容体からなる群から選択される。
もう一つの態様において、前記標的はタンパク質またはペプチドを含む。関連する態様において、前記標的は、ＡＮＧＰＴ２、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬ１、ＭＡＴＮ２、ＧＰＶＩ、ＥＳＡＭ、Ｃ７、ＰＬＧ、ＭＭＰ−１２、ＮＰＳ−ＰＬＡ２及びＣｄｔＡからなる群から選択されるタンパク質である。
もう一つの態様において、前記第二の複合体の解離定数（Ｋｄ）は、少なくとも０．０２ｎＭ、または約０．０１〜約１０ｎＭ、または約０．０２ｎＭ〜約６ｎｍ（または約０．０２から、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９または６ｎＭ）、または約０．０２ｎＭ〜３ｎＭ（または０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８、０．５、０．５２、０．５４、０．５６、０．５８、０．６、０．６２、０．６４、０．６６、０．６８、０．７、０．７２、０．７４、０．７６、０．７８、０．８、０．８２、０．８４、０．８６、０．８８、０．９、０．９２、０．９４、０．９６、０．９８、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３ｎＭ）である。
もう一つの態様において、前記第一複合体の解離定数（Ｋｄ）は、約０．０４ｎＭ〜約５ｎｍ（または０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９または５ｎＭ）、または約０．０４ｎＭ〜約４．８ｎＭ（または０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７または４．８）である。
もう一つの態様において、第二のアプタマー及び前記標的の解離定数（Ｋｄ）は、約０．０３ｎＭ〜約１４ｎＭである（または０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８または１４ｎＭ）である。
本開示は、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーと標的タンパク質を含んでなる組成物であって、前記第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーと前記標的タンパク質が非共有相互作用によって結合している組成物を提供する。
本開示の上記及び他の目的、特徴、並びに利点は、添付の図面を参照して述べる以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
図1は、タンパク質標的のためのSOMAmer（修飾DNAアプタマー）対の単離及び検証のための一般的な戦略を描いている。図１Ａは、非競合クローンの対について直接スクリーニングできる５’及び３’固定領域を有するアプタマーの組を単離するように変更されたランダムのｓｓＤＮＡライブラリと、第一のＳＥＬＥＸ（または１ｓｔＳＥＬＥＸ）に使用される遊離標的を示している。各アプタマーの４０ヌクレオチドランダム領域内で使用することができる代表的な化学修飾（例えば、Ｂｎ、Ｎａｐ、Ｔｒｐ、Ｐｅ及び２Ｎａｐと略記する）が設けられている。対が存在しない場合は、最良の結合特性を有するアプタマーが標的との複合体を形成し、これは異なる修飾ライブラリとの第二のＳＥＬＥＸ（または２ｎｄＳＥＬＥＸ）において使用される。次いで、新しいアプタマークローンが、前記標的に結合する対形成されたサンドイッチについてスクリーニングされる。 図１Ｂは、遊離のＣｄｔＡタンパク質（プール５５５１）またはＣｄｔＡ−４７５８−６複合体（プール５５７９）を用いて選択された、配列パターン及びマルチコピー配列の表現を示している；Ｔ＝２ＮａｐｄＵ。第一のＣｄｔＡアプタマー４７５８−６との非競合的結合が陰影により示されている。 図１Ｃは、ＣｄｔＡタンパク質とのアプタマーの平衡結合を示している。クローン５５５１−８１および５５７４−４９が、遊離ＣｄｔＡとのＳＥＬＥＸにおいて得られ、またＣｄｔＡ−４７５８−６複合体を用いた第二のＳＥＬＥＸにおいて、クローン５５７９−７〜５５７９−２１が得られた。このアッセイにおける最大結合画分（結合性プラトー）は、Ｚｏｒｂａｘ上の標的−アプタマー複合体の保持効率および結合能をもつアプタマー画分によって影響される。 図１Ｄは、１００倍過剰（１０ｎＭ）の、以前にＣｄｔＡについて生成された非標識の競合体アプタマー４７５８−６の不存在下または存在下において、放射性標識された５５７９−１２（図１Ｄ）または５５７９−１１（図１Ｅ）を用いたＣｄｔＡ結合アッセイを示している。結合はまた、ＣｄｔＡと、ストレプトアビジンビーズ上に予め固定化された捕捉剤としてのビオチン化４７５８−６を使用して測定された。 図１Ｄは、１００倍過剰（１０ｎＭ）の、以前にＣｄｔＡについて生成された非標識の競合体アプタマー４７５８−６の不存在下または存在下において、放射性標識された５５７９−１２（図１Ｄ）または５５７９−１１（図１Ｅ）を用いたＣｄｔＡ結合アッセイを示している。結合はまた、ＣｄｔＡと、ストレプトアビジンビーズ上に予め固定化された捕捉剤としてのビオチン化４７５８−６を使用して測定された。 図１Ｆは、アプタマーＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズに結合した捕捉剤として４７５８−６を使用し、また個々のアプタマーを検出剤として使用して、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットホーム上でのアプタマー対についてスクリーニングすることを示している。全てのアプタマーは５０量体として合成的に作製され、それらの５’端には、前記ビーズ上での固定化を可能にするために単一のビオチンを含有していた。これらはその後、ストレプトアビジン−フィコエリスリン接合体の検出を可能にするために、１ｍＭビオチンとの更なる結合からブロックされた。 図１Ｇは、捕捉剤として７５８−６（２５ｎＭ）及び検出剤として５５７９−１２（１０ｎＭ）を用い、または二つの試薬のスイッチングを用いたＣｄｔＡサンドイッチアッセイを示している。 図２Ａは、ストレプトアビジンビーズ上のビオチン化された捕捉アプタマー及び放射性標識された検出アプタマーを用いた、個々のアプタマーサンドイッチ対をスクリーニングするための平衡結合アッセイを示している。 図２Ｂは、非競合的結合から競争的結合を識別するための、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットホーム上での多重化されたサンドイッチスクリーニングアッセイを示している。各アプタマーは異なるＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズタイプ上に固定化され、また捕捉ビーズは、検出剤として個々のアプタマーを試験するためにプールされた。 図２Ｃは、ルミネックスに基づく多重化アッセイにおける１６のＣＲＤＬｌアプタマーの対形成スクリーニングを示しており、特性が最大信号のパーセントとして表されており、ヒートマップとして表示されている。 図２Ｄ及び２Ｅは、ＳＥＬＥＸの際にＣＲＤＬｌと複合体を形成するために使用される配列（図２Ｄ）であるＳＯＭＡｍｅｒ・３３６２−６１、または新しい配列の一つであっるＳＯＭＡｍｅｒ・７５７５−２（図２Ｅ）を用いた、ルミネックスサンドイッチスクリーニングアッセイにおける捕捉剤または検出剤としての１６のＣＲＤＬｌアプタマーの評価を示している。捕捉及び検出のために同じＳＯＭＡｍｅｒを使用した対照アッセイ（下線）が含まれている。 図２Ｄ及び２Ｅは、ＳＥＬＥＸの際にＣＲＤＬｌと複合体を形成するために使用される配列（図２Ｄ）であるＳＯＭＡｍｅｒ・３３６２−６１、または新しい配列の一つであっるＳＯＭＡｍｅｒ・７５７５−２（図２Ｅ）を用いた、ルミネックスサンドイッチスクリーニングアッセイにおける捕捉剤または検出剤としての１６のＣＲＤＬｌアプタマーの評価を示している。捕捉及び検出のために同じＳＯＭＡｍｅｒを使用した対照アッセイ（下線）が含まれている。 図２Ｆは、緩衝液中にスパイクされたタンパク質（表２８に記載したアプタマー）について、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで得られたサンドイッチ結合曲線を示している。全ての場合において、サンドイッチＳＥＬＥＸにおいて標的と複合体を形成するのに役立っ他配列が捕捉剤として使用され、またＳＥＬＥＸの結果として特定される新しいクローンの一つが検出剤として使用された。最大信号（ＢｍａｘでのＲＦＵ）は、それぞれ２３０４６（ＡＮＧＰＴ２）、１６６２３（ＴＳＰ２）、２３３４９（ＣＲＤＬｌ）、２５５８６（ＭＡＴＮ２）、２６０００（Ｃ７）、１３９２７（ＧＰＶＩ）、７１０３（ＰＬＧ）、及び３０００（ＥＳＡＭ）であった。 図３は、プレートに基づくサンドイッチアッセイで使用されるアプタマー対のためのＫｄ値を示している。ビオチン化されたアプタマーは、捕捉剤として、ストレプトアビジンでコーティングしたプレート上に固定化され、ストレプトアビジン−ＨＲＰ接合体で標識するための検出剤として使用された。
Ｉ．用語及び方法：
特に断らない限り、技術用語は従来の用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、オックスフォード大学出版によって１９９４に発行されたベンジャミン・レヴィン著の遺伝子Ｖ（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）、ブラックウェルサイエンス社によって１９９４年に発行されたケンドルー等（編）の分子生物学百科事典（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）、及びＶＣＨ出版社によって１９９５年に出版されたロバート・Ａ・マイヤーズ（編）の分子生物学及びバイオテクノロジー：総合デスクリファレンス（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
本開示の様々な実施形態の検討を容易にするために、特定の用語について以下の説明が提供される。
アプタマー： 本明細書で用いる用語のアプタマーは、標的分子に対する望ましい作用を有する非天然の核酸を言う。望ましい作用には、標的を結合すること、該標的を触媒的に変化させること、該標的または該標的の機能的活性を修飾または変化させるように該標的と反応すること、該標的に共有結合的に結合すること（自殺的阻害剤として）、及び該標的ともう一つの分子の間の反応を促進することが含まれるが、これに限定されない。
類似体： 本明細書で使用する類似体の用語は、構造的な化学的類似体、ならびに機能的な化学的類似体を指称する。構造的な化学的類似体は、他の化合物と類似の構造を有するが、1以上の原子または官能基が相違する化合物である。この相違は、原子または官能基の付加、原子または官能基の不存在、原子または官能基の置換、またはそれらの組み合わせであってもよい。機能的な化学的類似体は、類似した化学的、生化学的及び／または薬理学的特性を有する化合物である。類似体の用語はまた、化合物のS及びRの立体異性体を包含することができる。
生物活性：ここで使用される生物活性の用語は、生理学的または病態生理学的プロセスに影響を与えることができる1以上の細胞間、細胞内または細胞外のプロセス（例えば、細胞−細胞結合、リガンド−受容体結合、細胞シグナリング等）を指称する。
Ｃ−５修飾されたピリミジン：本明細書で使用されるＣ−５修飾されたピリミジンとは、Ｃ−５位に修飾を有するピリミジンを言う。Ｃ−５修飾されたピリミジンの例には、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ Ｎｏ．５７１９２７３、Ｎｏ．５９４５５２７、Ｎｏ．７９４７４４７、並びに２０１４年２月２７日に出願されたＵ．Ｓ．公開Ｎｏ．２０１４／００５８０７６に記載されたものが含まれる。追加の例は本明細書中に提供されている。
競合分子：競合分子または競合体は互換的に使用され、非標的分子と共に非特異的複合体を形成できる任意の分子を意味する。「競合分子」または「競合体」は、異なる種類の分子集団、または特定の分子もしくは分子の種である。「競合分子（複数形）」または「競合体（複数形）」は、このようなタイプの２以上の分子を言う。競合分子には、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えば、ヘパリン、一本鎖サケ精子ＤＮＡ、及びポリデキストラン［例えば、デキストラン硫酸ナトリウム］）、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ類、及びピロリン酸が含まれる。競合体を使用する動力学的チャレンジの場合、競合体はまた、アプタマーとの非特異的複合体を形成できる任意の分子であることができる。このような競合分子には、ポリカチオン（例えば、スペルミン、スペルミジン、ポリリジン、ポリアルギニン）及びアミノ酸（例えば、アルギニン及びリジン）が含まれる。
コンセンサス配列：ここで用いるとき、コンセンサス配列とは、配列アラインメントに従う一連の核酸配列の各位置で見られる、最も頻繁に観察されるヌクレオチドを表すヌクレオチド配列を言う。
共有結合：共有結合または相互作用は、原子間において少なくとも一対の電子の共有を含む化学結合を意味する。
インキュベーション： ここで使用するとき、インキュベート（またはインキュベーション）の用語は、所望の結果を促進するために複数の成分が一緒に置かれる制御された条件を言う。例えば、標的（例えば、タンパク質）及びアプタマーは、アプタマーと標的との結合が促進されて複合体を形成するように、それらを一緒にすることによりインキュベートされてよい。更なる例は、該複合体及び第二のアプタマーをインキュベートして第二の複合体（即ち、アプタマー／タンパク質／第二のアプタマー）を形成するために、前記複合体を第二のアプタマーと一緒にすることが含まれる。インキュベーションのための制御された条件には、温度、時間、ｐＨ、塩濃度、及び混合物の種類（その非限定的な例には、溶液、乳液、ゲル及び発泡体である）が含まれる。温度は、約２１℃〜約４５℃（または約２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４または４５℃）に亘ってよい。好ましくは、温度は約２８℃〜約３７℃（または２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７℃）、または約２８℃または約３７℃である。インキュベーションの時間は、約１分〜約２４０分（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５または２４０分）を含んでよい。好ましくは、インキュベーション時間は約１５分、３０分、６０分、１２０分、１８０分、約２１０分である。インキュベーションのためのｐＨ条件は、約５〜約１２（または５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５または１２）の範囲であってよい。好ましくは、ｐＨは約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、１１、１１．１、１１．２、１１．３、１１．４または１１．５である）。上記組の特定の条件は代表的なものであり、且つ非限定的なものである。更に、インキュベーションのために同じ特定の条件が、本明細書に開示される方法全体において使用されてよく、または本明細書に開示する方法の異なるステップにおいて変更されてよい。
阻害：ここで用いるとき、阻害するとの用語は、ペプチドまたはポリペプチドがもはや測定可能な活性または生物活性をもたない程度に、ペプチドまたはポリペプチドの発現を防止または低減することを意味する。或いは、ペプチドまたはポリペプチドがもはや測定可能な活性または生物活性をもたない程度に、ペプチドまたはポリペプチドの安定性を減少させる及び／または活性を低減または阻止することを意味する。
動力学的チャレンジ：ここで用いるとき、動力学的チャレンジの用語は、動力学的圧力を適用することにより、また斯かる複合体成分の異なる特徴的親和性（解離速度を含む）を利用することにより、アプタマー親和性複合体及び非特異的複合体を含む一組の複合体からアプタマー親和性複合体を富化するプロセスを言う。動力学的チャレンジにより、アプタマー／非標的複合体は典型的にはアプタマー／標的複合体に比較して低減されるので、一般的に特異性の増大がもたらされる。本明細書で使用する場合、用語「動力学的圧力」とは、複合体の解離のための自然な機会、及び／または天然の複合体から解離した分子の再結合を抑制するための手段を言う。動力学的圧力は、競合分子を添加することによって、または試料希釈によって、または複合体が固体支持体に結合されているときには広範な洗浄によって、または当業者に既知の任意の他の手段によって適用することがでる。当業者が理解するであろうように、動力学的チャレンジは、一般的に、アプタマー親和性複合体とアプタマー非標的複合体の異なる解離速度に依存するため、動力学的チャレンジの持続時間は、アプタマー非標的複合体の数を低減しながら、アプタマー親和性複合体の実質的に高い割合が維持されるように選択される。動力学的チャレンジが有効であるためには、アプタマー親和性複合体の解離速度は、好ましくは、アプタマー非標的複合体よりも著しく低い。アプタマーは、特別な特性を含むように選択できるので、アプタマー親和性複合体の成分は比較的低い解離速度、すなわち、遅いオフ速度を有するように設計することができる。
修飾された：オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、修飾されたの用語（または修飾するもしくは修飾）の用語及びその任意のバリエーションは、オリゴヌクレオチド4つの構成要素ヌクレオチド塩基（即ち、A、G、T / U、及びC）の少なくとも一つが、天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。
調整する：ここで用いる調整するとの用語は、参照発現レベル対して発現レベルを増大もしくは減少させることによって、ペプチド、タンパク質またはポリペプチドの発現レベルを変化させること、及び／または基準の安定性及び／または活性のレベルと比較して、その安定性及び／または活性のレベルを増大または減少させることにより、ペプチド、タンパク質またはポリペプチドの安定性及び／または活性を変更することを意味する。
非共有結合：非共有結合または非共有結合相互作用は、原子間での電子対の共有を伴わない化学結合または相互作用を言う。非共有結合または相互作用の例には、水素結合、イオン結合（静電結合）、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用が挙げられる。
核酸：ここで使用される核酸の用語は、そのDNA、RNA及び／または類似体を含む任意の核酸配列を指称するものであり、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖の形態を含むことができる。「核酸」、「オリゴ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」の用語は、互換的に使用されてよい。
薬学的に許容可能な：ここで使用されるとき、薬学的に許容可能なとは、動物において、特にヒトにおいて使用するために、連邦政府または州政府の規制当局によって承認され、または米国薬局方または他の一般に認められた薬局方に収載されたことを意味する。
薬学的に許容可能な塩：本明細書中で使用するとき、薬学的に許容可能な塩または化合物（例えば、アプタマー）の塩とは、イオン結合を含み、典型的には前記化合物を酸または塩基の何れかと反応させることにより製造される、個体に投与するために適した製品を意味する。薬学的に許容可能な塩には、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び酒石酸塩を含む酸付加塩； Ｌｉ、Ｎａ、Ｋのようなアルカリ陽イオン、ＭｇまたはＣａのようなアルカリ土類金属塩、または有機アミン塩が含まれるが、これらに限定されない。
医薬組成物：ここで使用するとき、医薬組成物とは、個体への投与に適した形態でアプタマーを含む製剤を言う。医薬組成物は、典型的には、その意図される投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、限定されるものではないが、経口経路及び非経口経路、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜、及び直腸投与が含まれる。
ＳＥＬＥＸ：ここで用いるＳＥＬＥＸの用語は、望ましい様式で標的分子と相互作用する核酸、例えばタンパク質に対して高親和性で結合する核酸の選択；及びこれら選択された核酸の増幅を一般に指称する。ＳＥＬＥＸは、特定の標的分子に対して高い親和性を有するアプタマーを同定するために用いることができる。ＳＥＬＥＸの用語と「ＳＥＬＥＸ法」とは互換的に使用できる。
配列同一性：ここで用いる配列同一性とは、２以上の核酸配列の関係において、これら配列によって共有される同一のヌクレオチド位置の数の関数（即ち、％同一性＝同一の位置の数／位置の合計数×１００）であり、ギャップの数、及び２以上の配列のアライメントを最適化するために導入する必要のある各ギャップの長さを考慮する。２以上の配列間での配列の比較及びパーセント同一性の決定は、それらのデフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ・ＢＬＡＳＴプログラムのような数学的アルゴリズムを用いて達成することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。配列比較のためには、典型的には１つの配列が、試験配列が比較されるべき参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合は、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する被験配列（単数または複数）のパーセント配列同一性を計算する。比較のための最適な配列のアラインメントは、文献（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１）に記載の局部的相同性アルゴリズムによって、文献（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０）に記載の相同性アラインメントアルゴリズムによって、文献（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８）に記載の類似性検索法によって、文献（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．．）に記載のこれらアルゴリズムのコンピュータ化による実施によって、または目視検査によって（一般的に下記文献を参照のこと；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７））行うことができる。本明細書で用いるとき、核酸のパーセント同一性を記述する際に、例えば、その配列が参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％同一であるとは、参照核酸配列の各１００ヌクレオチド当たり５％以下の点変異を含み得ることを除いて、当該核酸配列が参照配列と同一であることが意図されている。換言すれば、少なくとも参照核酸配列に対して約９５％同一である所望の核酸配列を得るためには、参照配列中において５％以下のヌクレオチドが欠失または別のヌクレオチドで置換されてよく、または参照配列中のヌクレオチドの総数の５％以下の幾つかの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい（ここでは挿入と称する）。所望の配列を生じさせるための参照配列のこれら変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置において生じてよく、またはこれら末端位置の間の何処かで、参照配列中のヌクレオチド間に個々的にまたは参照配列内の１以上の連続する群で散在するように生じてよい。
ＳＯＭＡｍｅｒ：ここで用いられるＳＯＭＡｍｅｒの用語は、改善されたオフ速度特性を有するアプタマーを言う。ＳＯＭＡｍｅｒは別の呼び方として、遅いオフ速度の修飾アプタマーとも称され、「改善されたオフ速度特性を持ったアプタマーを発生させる方法」と題するＵ．Ｓ．特許番号７９４７４４７に記載の改善されたＳＥＬＥＸ法を介して選択することができ、この特許の全体を本明細書の一部として援用する。アプタマー及びＳＯＭＡｍｅｒの用語は互換的に使用することができる。
スペーサー配列：ここで使用するスペーサー配列とは、アプタマーの核酸配列の５ ’末端、３’末端、または５’及び３’末端の両方に共有結合した小分子（単数または複数）からなる任意の配列を意味する。典型的なスペーサー配列としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、炭化水素鎖、及びアプタマーの結合活性を維持しながらコンセンサス領域を連結する共有結合性分子骨格を提供する他のポリマーまたはコポリマーが含まれる。一定の態様において、スペーサー配列は、末端３’もしくは５’ヒドロキシル基、２’炭素、またはピリミジンのＣ５位もしくはプリンのＣ８位置等の塩基修飾のような、標準的な結合を介してアプタマーに共有結合されてよい。
標的分子：本明細書において使用される標的分子（または標的）とは、何れかの化合物または分子であって、望ましい様式（標的と結合し、該標的を触媒的に変化させ、該標的または該標的の機能を修飾または変更するように該標的と反応し、該標的に共有結合し（自殺阻害剤のように）、また前記標的ともう一つの分子の間の反応を促進する）で、核酸が作用できるをものを言う。標的分子の非限定的な例には、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞、組織、これらの何れかの任意の部分または断片が含まれる。実質的に如何なる化学的または生物学的エフェクターも、適切な標的であり得る。如何なるサイズの分子も標的として働くことができる。標的はまた、標的と核酸の間の相互作用の可能性または強さを高めるために、一定の方法で修飾することができる。標的はまた、特定の化合物または分子の何れかのマイナーなバリエーションを含むことができ、例えばタンパク質の場合は、そのアミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化を含んでよく、または、任意の他の変化たとえば、実質的に分子のアイデンティティを変更しない標識成分との結合などの操作もしくは修飾を含んでよい。「標的分子」または「標的」は、アプタマーに結合可能な一つのタイプまたは種の分子または多分子構造の一組のコピーである。「標的分子（複数形）」または「標的（複数形）」は、１以上のそのような組の分子を言う。
三元複合体：ここで用いる三元複合体とは、少なくとも二つのアプタマーと標的との複合体を言う。特定の例において、該複合体は、共有結合性相互作用、非共有結合性相互作用、または共有結合性相互作用及び非共有結合性相互作用の組み合わせを含んでよい。
特に説明がない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する当業者が理解するのと同じ意味を有する。単数形の「不定冠詞」及び「定冠詞」は、文脈が明らかにそれ以外のことを示さない限り、複数の対象を含む。ＡまたはＢを含むことを意味する「ＡまたはＢを含んでなる」とは、ＡまたはＢを含むこと、或いはＡ及びＢを含むことを意味する。更に、核酸またはポリペプチドについて与えられる全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量値は概算であり、説明のために提供されるものであることが理解されるべきである。
更に、本明細書に提供される範囲は、範囲内の全ての値の省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０（並びに、文脈が明確に他のことを指示しない限りその端数）からなる群から選ばれる何れかの数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むものと理解される。何れかの濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、他に指示しない限り、記載範囲内の任意の整数値、適切な時にはその端数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）を含むものと理解されるべきである。また、何等かの物理的特徴、例えばポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどのに関してここに記載する何れかの数値範囲は、特に明記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。ここ用いる「約」または「実質的になる」は、他に指示しない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。「含む」及び「含んでなる」の用語はオープンエンドであり、同義的に使用される。ここで用いる不定冠詞の「一つの」は、列挙された成分の１以上を言うものと理解されるべきである。選択性の用語（例えば「または」）の使用は、これら選択肢の何れか一方、両方、またはそのを意味するものと理解されるべきである。
ここに記載したものと類似または均等な方法及び材料を、本開示の実施または試験に用いることができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参考として本明細書に援用される。矛盾する場合は、用語の説明を含めて本明細書が支配するものとする。加えて、材料、方法及び実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。
ＩＩ．概説
本開示のもう一つの態様において、本開示の第一のアプタマー及び第二のアプタマーは、約１００ヌクレオチド以下、約９５ヌクレオチド以下、約９０ヌクレオチド以下、約８５ヌクレオチド以下、約８０ヌクレオチド以下、約７５ヌクレオチド以下、約７０ヌクレオチド以下、約６５ヌクレオチド以下、約６０ヌクレオチド以下、約５５ヌクレオチド以下、約５０ヌクレオチド以下、約４５ヌクレオチド以下、約４０ヌクレオチド以下、約３５ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド以下、約２５ヌクレオチド以下、約２０ヌクレオチド以下を含んでよい。
本開示のもう一つの態様において、第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、前記第一のアプタマーのオフ速度または解離速度を、第Ｃ−５ピリミジン修飾スキームなしの第一のアプタマーと比較して向上させる。もう一つの態様において、第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、第二のアプタマーのオフ速度または解離速度を、第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームなしの第二のアプタマーと比較して向上させる。
本開示のもう一つの態様において、第一のアプタマーは、もう一つのアプタマーの他の核酸配列に対して少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約７５％同一であってもよい。本開示のもう一つの態様において、第二のアプタマーは、もう一つのアプタマーの他の核酸配列に対して少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約７５％同一であってよい。
もう一つの態様において、標的または標的／アプタマー複合体に対する第一または第二のアプタマーのＫｄは、約１ｎＭ〜約１００ｎＭ（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１ １、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ｎＭ）である。
もう一つの態様において、Ｋｄは約４ｎＭ〜約１０ｎＭ（または４、５、６、７、８、９、または１０ｎＭ）である。
本開示のもう一つの態様において、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的または標的／アプタマー複合体について約１０ｎｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有してよい。もう一つの例示的な実施形態において、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について、約１５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約２５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有している。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約３０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有している。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約３５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有している。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約４０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有している。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約４５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有している。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約５０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有している。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約３〜１０ｎＭの範囲（または３、４、５、６、７、８、９、または１０ｎＭ）の解離定数（Ｋｄ）を有している。更にもう一つの例示的な実施形態では、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、標的タンパク質について約０．０２ｎＭ〜約３ｎＭの範囲（または０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．０２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．４２、０．４４、０．４６、０．４８、０．５、０．５２、０．５４、０．５６、０．５８、０．６、０．６２、０．６４、０．６６、０．６８、０．７、０．７２、０．７４、０．７６、０．７８、０．８、０．８２、０．８４、０．８６、０．８８、０．９、０．９２、０．９４、０．９６、０．９８、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９または３ｎＭ）の解離定数（Ｋｄ）を有している。
適切な解離定数は、マルチポイント滴定を使用し、方程式ｙ＝（最大−最小）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最小：にフィッティングさせる結合アッセイを用いることによって決定することができる。また、解離定数の決定は、それらが測定される条件に大きく依存し、従って、これらの数字等は平衡化時間などの要因に関して、非常に顕著に異なる可能性があることが理解されるべきである。
本開示のもう一つの態様において、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、≧約１５分、≧約３０分、≧約６０分、≧約９０分、≧約１２０分、≧約１５０分、≧約１８０分、≧約２１０分、及び≧約２４０分からなる群から選択される標的からの解離速度（ｔ１／２）含んでいる。
本開示は更に、第一のアプタマー及び第アプタマーを含んでなるキットであって、前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキーム及び前記第二のＣ−５ピリミジン修飾は異なり、前記第一のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有し、また前記第二のアプタマーは前記標的及び／または該標的に結合した前記第一のアプタマーに対する結合親和性を有するキットを提供する。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有し、前記第二のアプタマーに対しては結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有し、前記第一のアプタマーに対しては結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記第一のアプタマーの前記標的との結合によって形成された複合体に対する結合親和性を有する。
もう一つの態様において、前記標的の前記第一のアプタマー結合領域と、前記標的の前記第二のアプタマー結合領域は異なる領域である。関連の態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、前記標的上の非競合的結合部位を有する。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは独立に、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組み合わせを含む。
もう一つの態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。関連する態様において、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。更にもう一つの関連する態様では、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含みます。別の関連する態様では、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）を含む。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏメチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシ）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである。関連する態様では、前記第一のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
もう一つの態様において、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。関連する態様では、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５− ［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。更にもう一つの関連する態様では、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジンの（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’− Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、及び５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシ）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンからなる群から選択されるＣ−５修飾されるピリミジンである。関連する態様において、前記第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）である。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二アプタマーは、独立に、それぞれ長さが約２０〜１００ヌクレオチド（または２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチドの長さ）である。関連する態様において、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、約４０〜約１００ヌクレオチドの長さ（または長さが４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００ヌクレオチド）である。
もう一つの態様において、第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーは、更に検出可能な部分を含む。関連する態様では、この検出可能な部分は、色素、量子ドット、放射性標識、電気化学的官能基、酵素、酵素基質、リガンド及び受容体からなる群から選択される。
もう一つの態様において、前記標的はタンパク質またはペプチドを含む。関連する態様において、前記標的は、ＡＮＧＰＴ２、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬ１、ＭＡＴＮ２、ＧＰＶＩ、ＥＳＡＭ、Ｃ７、ＰＬＧ、ＭＭＰ−１２、ＮＰＳ−ＰＬＡ２及びＣｄｔＡからなる群から選択されるタンパク質である。
本開示は更に、ここに開示された方法の何れかが、動力学的チャレンジを受けることを含んでよいことを提供する。もう一つの態様において、ここに記載の方法は更に、標的とアプタマーの結合親和性を改善するために、競合分子の添加、希釈工程または１回以上の洗浄を含む。関連する態様において、前記競合分子は、オリゴヌクレオチド、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、硫酸デキストラン、ポリアニオン、無塩基性ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰを、及びピロリン酸からなる群から選択される。もう一つの態様において、前記動力学的チャレンジは、ここに記載の複合体の何れかを含む混合物を希釈することと、該アプタマー親和性複合体を含有する混合物を３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、３０分、６０分以上からなる群から選択される時間に亘ってインキュベートすることを含む。もう一つの態様において、前記動力学的チャレンジは、前記アプタマー親和性複合体を含有する混合物を希釈することと、該アプタマー親和性複合体を含む混合物を、非特異的複合体の測定レベルに対するアプタマー親和性複合体の測定レベルの比率が増大するような時間に亘ってインキュベートすることを含む。
本開示は、第一のアプタマー、第二のアプタマー及び標的を含有する組成物であって、前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームと前記第二の第Ｃ−５ピリミジン修飾スキームは同じであり、前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー及び前記標的は三元複合体を形成することができる組成物を記載する。
本開示は更に、試料中の標的を検出するための方法であって：該方法は、前記サンプルを第一のアプタマーと接触させて混合物を形成し、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的に結合して第一の複合体を形成できることと；前記混合物を、前記第一の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物を第二のアプタマーと接触させ、ここでの該第二のアプタマーは前記第一の複合体と結合して第二の複合体を形成できることと；前記混合物を、前記第二の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物中における前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的、前記第一の複合体または前記第二の複合体の存在または不存在を検出し、ここで前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的、前記第一の複合体または前記第二の複合体の存在が、前記サンプル中の前記標的の存在を示すことを含んでなり、前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、また前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームと第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームが同じである方法を記載する。
もう一つの態様において、試料中の標的を検出するための前記方法は、前記資料を前記第一及び第二のアプタマーと同時に接触させることと、前記混合物を、前記標的と前記第一及び第二のアプタマーを含む複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと、前記混合物中における前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的または前記複合体の存在または不存在を検出することを含んでなり、前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマーまたは前記複合体の存在が、前記試料中に前記標的が存在することを示す。
もう一つの態様において、第一及び第二のアプタマーは、両者が独立に、前記標的と複合体を形成することができる。詳細に言えば、前記第二のアプタマーは、単独の前記標的と複合体を形成できると共に、前記第一のアプタマー及び前記標的との間で複合体を形成できる。
本開示は更に、標的を第一のアプタマーと接触させて混合物を形成し、該第一のアプタマーは前記標的に結合して第一複合体を形成できることと；該混合物を、前記第一の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物を第二のアプタマーと接触させ、該第二のアプタマーは前記標的と結合して第二の複合体を形成できることと；前記混合物を、第二の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；前記混合物中における前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーの存在または不存在を検出し、前記混合物中における前記第一のアプタマー及び第二のアプタマーの両者の存在によって、前記標的への前記第一のアプタマーの結合及び前記標的への前記第二のアプタマーの結合が非競争的であることが示されることを含んでなり、ここで前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームと第Ｃ−５ピリミジン修飾スキームが同じである方法を記載する。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーはＡＮＧＰＴ２、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬ１、ＭＡＴＮ２、ＧＰＶＩ、ＥＳＡＭ、Ｃ７、ＰＬＧ、ＭＭＰ−１２、ＮＰＳ−ＰＬＡ２及びＣｄｔＡからなる群から選択されるタンパク質に結合することができる。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーはＡＮＧＰＴ２、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬ１、ＭＡＴＮ２、ＧＰＶＩ、ＥＳＡＭ、Ｃ７、ＰＬＧ、ＭＭＰ−１２、ＮＰＳ−ＰＬＡ２及びＣｄｔＡからなる群から選択されるタンパク質に結合することができる。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー及び前記標的は三元複合体を形成し、ここで前記第一のアプタマーは、前記標的の第一の領域において前記標的に結合し、前記第二のアプタマーは、前記標的の第二の領域において前記標的に結合し、また前記標的の第一の領域と第二の領域は、重複する領域または重複しない領域である。
もう一つの態様において、前記組成物は第一のアプタマー、第二のアプタマー及び標的を含んでなり、第二の標的は三元複合体を形成することが可能であり、前記第一のアプタマー及び第二のアプタマーは、独立に、長さが約４０〜約５０ヌクレオチドであり、前記第一のアプタマーはＣ−５修飾されたピリミジンを含み、第二のアプタマーはＣ−５修飾されたピリミジンを含み、ここでの前記Ｃ−５修飾されたピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−［Ｎ−（２−チオフェンメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）（これは５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキサミドとも言う）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（４−フルオロベンジル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ａ］フラン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−［Ｎ−（３，４−メチレンジオキシベンジル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｒ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＲＴＨｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｓ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＳＴＨＦｄＵ）、５−（Ｎ−２−イミダゾリルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｉｄｄＵ）、５−［Ｎ−（１−モルホリノ２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＯＥｄＵ）からなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含み、ここでの前記第一のアプタマーのＣ−５修飾されたピリミジン及び前記第二のアプタマーのＣ−５変更されたピリミジンは、異なるＣ−５修飾されたピリミジンである。
もう一つの態様において、前記組成物は、第一のアプタマー、第二のアプタマー及び標的を含んでなり、ここでの前記第一のアプタマー、第二のアプタマー及び標的は三元複合体を形成することができ、また前記第一のアプタマー及び第二のアプタマーは、独立に、長さが約４０〜約５０ヌクレオチドであり、前記第一のアプタマーはＣ−５修飾されたピリミジンを含み、前記第二のアプタマーはＣ−５修飾されたピリミジンを含み、また前記Ｃ−５修飾されたピリミジンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−［Ｎ−（２−チオフェンメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（４−フルオロベンジル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ａ］フラン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−［Ｎ−（３，４−メチレンジオキシベンジル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｒ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＲＴＨｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｓ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＳＴＨＦｄＵ）、５−（Ｎ−２−イミダゾリルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｉｄｄＵ）、５−［Ｎ−（１−モルホリノ−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＯＥｄＵ）からなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含み、ここで前記第一アプタマーのＣ−５変更されたピリミジン及び前記第二のアプタマーのＣ−５変更されたピリミジンは同じＣ−５修飾ピリミジンである。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーと前記標的との混合物は、前記第一の複合体を形成することを可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件には、前記第一のアプタマーに対する前記標的の約１０：１の比率が含まれる。前記第一のアプタマーに対する前記標的の代替の比率には、約９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、及び１：１０が含まれる。前記条件には、更に約３７℃の温度が含まれる。代替の温度には、室温（約２１℃）、または約２１℃〜約３７℃（または２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７℃）が含まれる。前記条件にはまた、上記の比率及び温度条件の下でのインキュベーション時間が含まれ、これには約３０秒〜約７２時間（または約３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４４時間、４８時間、５０時間、５５時間、６０時間、６５時間、７０時間または７２時間）が含まれる。
もう一つの態様においては、第二のアプタマー及び標的、または第二のアプタマーと第一の複合体の混合物が、第二の複合体を形成することを可能にする条件下でインキュベートされる。これらの条件には、第２のアプタマーに対する標的（例えばタンパク質）または第一の複合体の約１０：１の比率が含まれる。第二アプタマーに対する標的または第一の複合体の代替比率には、約９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、 １：９、１：１０が含まれる。前記条件には更に、約３７℃の温度が含まれる。代替の温度には、室温（約２１℃）、または約２１℃〜約３７℃（または２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７℃）が含まれる。前記条件にはまた、上記の比率及び温度条件の下でのインキュベーション時間が含まれ、これには約３０秒〜約７２時間（または約３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４４時間、４８時間、５０時間、５５時間、６０時間、６５時間、７０時間または７２時間）が含まれる。
もう一つの態様において、結合親和性（またはＫｄ）が、放射性標識フィルター結合アッセイ及び蛍光ビーズに基づくルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイから選択される方法により決定される。
本開示は更に、第一のアプタマーを固体支持体と接触させ、ここでの第一のアプタマーはリンカー及びタグを含んでおり、前記タグは前記固体支持体に結合できることと；標的を前記第一のアプタマーと接触させ、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有しており、前記第一のアプタマーは前記標的に結合して第一の複合体を形成することと；前記第一の複合体を複数のアプタマーと接触させ、ここでは該複数のアプタマーのうち少なくとも一つのアプタマーが前記第一の複合体と結合して、第二の複合体を形成することと；前記第二の複合体を残りの複数のアプタマーから分割することと；前記第二の複合体を解離させることと；前記少なくとも一つのアプタマーを増幅することと；前記第一の複合体に結合できる前記少なくとも一つのアプタマーを同定することを含んでなる方法を記載する。
本開示は更に、第一のアプタマーを固体支持体と接触させ、ここでの第一のアプタマーはリンカー及びタグを含んでおり、前記タグは前記固体支持体に結合できることと；標的を前記第一のアプタマーと接触させ、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有しており、前記第一のアプタマーは前記標的に結合して第一の複合体を形成することと；前記第一の複合体を複数のアプタマーと接触させ、ここでは該複数のアプタマーのうち少なくとも一つのアプタマーが前記第一の複合体と結合して、第二の複合体を形成することと；前記第二の複合体を残りの複数のアプタマーから分割することと；前記第二の複合体を解離させることと；前記少なくとも一つのアプタマーを増幅し、前記第一の複合体に結合できる前記１以上のアプタマーを同定することを含んでなる方法を記載する。
本開示は更に、第一のアプタマーを固体支持体と接触させ、ここでの第一のアプタマーはリンカー及びタグを含んでおり、前記タグは前記固体支持体に結合できることと；標的を前記第一のアプタマーと接触させ、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有しており、前記第一のアプタマーは前記標的に結合して第一の複合体を形成することと；前記第一の複合体を複数のアプタマーと接触させて第二の複合体を形成し、該第二の複合体は前記第一のアプタマー、前記標的及び第二のアプタマーを含むことと；前記第二の複合体を残りの複数のアプタマーから分割することと；前記第二の複合体を解離させることと；該第二のアプタマーを増幅し、前記第一の複合体に結合できる前記第二のアプタマーを同定することを含んでなる方法を記載する。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーはＣ−５修飾されたピリミジンを含む。
もう一つの態様において、前記少なくとも一つのアプタマーＣ−５修飾されたピリミジンを含む。
もう一つの態様において、前記複数のアプタマーの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のアプタマーは、Ｃ−５修飾されたピリミジンを含む。
もう一つの態様において、前記タグは前記固体支持体に結合する。
もう一つの態様において、残りの前記複数のアプタマーは、前記少なくとも一つのアプタマーよりも前記第一の複合体に対して低い結合親和性を有する。
もう一つの態様において、前記タグは、前記第一のアプタマーの５’末端または３’末端にある。
もう一つの態様おいて、前記リンカーは光切断可能なリンカーである。
もう一つの態様において、前記標的は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖タンパク質、細胞及び組織からなる群から選択される。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーは、第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記少なくとも一つのアプタマーは、第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキーム及び前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは同じであるか、または異なっている。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーは、第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記１以上のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキーム及び前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは同じであるか、または異なっている。
もう一つの態様において、前記第一のアプタマーは、第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキーム及び前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは同じであるか、または異なっている。
もう一つの態様において、前記少なくとも一つのアプタマーは、標的に対する結合親和性を有し、前記第一のアプタマーに対しては結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記少なくとも一つのアプタマーは、前記第一の複合体の前記標的に結合し、前記第一の複合体の前記第一のアプタマーに対しては結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記少なくとも一つのアプタマーは、前記標的及び前記第一の複合体の前記第一のアプタマーに結合する。
もう一つの態様において、前記１以上のアプタマーは、前記標的に対する結合親和性を有し、前記第一のアプタマーに対しては結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記１以上のアプタマーは、前記第一複合体の標的に結合し、前記第一複合体の前記第一のアプタマーには結合しない。
もう一つの態様において、前記１以上のアプタマーは、前記標的と、前記第一の複合体の前記第一のアプタマーに結合する。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記標的に対する結合親和性を有し、前記第一のアプタマーに対しては結合親和性を持たない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記第一の複合体の前記標的に結合し、前記第一の複合体の前記第一のアプタマーには結合しない。
もう一つの態様において、前記第二のアプタマーは、前記標的と、前記第一の複合体の前記第一のアプタマーに結合する。
もう一つの態様において、前記固体支持体は、顕微鏡スライド、シクロオレフィン共重合体基板、膜、プラスチック基板、常磁性ビーズ、帯電紙、ナイロン、ラングミュア−ブロジェット膜、ガラス、ゲルマニウム基板、シリコン基板、シリコンウェハーチップ、フロースルーチップ、マイクロビーズ、ポリテトラフルオロエチレン基板、ポリスチレン基板、ガリウム砒素基板、金基板、及び銀基板からなる群から選択される。
もう一つの態様において、前記固体支持体はストレプトアビジンビーズである。
もう一つの態様において、前記増幅工程は、アプタマーの候補混合物の形成をもたらす。
もう一つの態様において、前記方法は更に、前記第一の複合体を前記アプタマーの候補混合物と接触させて、前記第一の複合体に対する結合親和性を有するアプタマーを更に選択することを含んでいる。
本開示は更に、ａ）第一のアプタマーを固体支持体と接触させ、ここでの第一のアプタマーはリンカー及びタグを含んでおり、前記タグは前記固体支持体に結合できることと；ｂ）標的を前記第一のアプタマーと接触させ、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有しており、前記第一のアプタマーは前記標的に結合して第一の複合体を形成することと；ｃ）前記第一の複合体を複数のアプタマーと接触させて複数の第二の複合体を形成し、ここでは該複数の第二の複合体の各々が前記第一のアプタマー、前記標的及び第二のアプタマーを含み、また前記複数の第二の複合体は複数の第二のアプタマーを含むことと；ｄ）前記複数の第二の複合体を、前記複数のアプタマーのうちの前記アプタマーから分割し、前記複数のアプタマーのうちの少なくとも一つのアプタマーは前記複数の第二の複合体の少なくとも一つの前記第二のアプタマーよりも前記第一の複合体に対する低い結合親和性を有することと；ｅ）前記複数の第二の複合体を解離させることと；ｆ）前記複数の第二のアプタマーを増幅させて、アプタマーの第一の候補混合物を形成することと；ｇ）少なくとも１回、前記アプタマーの第一の候補混合物を用いて工程ａ）からｆ）を反復させて、アプタマーの第二の候補混合物を形成し、または少なくとも２回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第三の候補混合物を形成し、または少なくとも３回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第四の候補混合物を形成し、または少なくとも４回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第五の候補混合物を形成し、または少なくとも５回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第六の候補混合物を形成し、または少なくとも６回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第七の候補混合物を形成し、または少なくとも７回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第八の候補混合物を形成し、または少なくとも８回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第九の候補混合物を形成し、または少なくとも９回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第十の候補混合物を形成し、または少なくとも１０回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第十一の候補混合物を形成し、または少なくとも１１回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第十二の候補混合物を形成し、または少なくとも１２回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第十三の候補混合物を形成し、または少なくとも１３回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第十四の候補混合物を形成し、または少なくとも１４回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第十五の候補混合物を形成し、または少なくとも１５回、工程ａ）からｆ）を反復させてアプタマーの第十六の候補混合物を形成することと；ｈ）前記第一の複合体に結合できる、前記複数の第二のアプタマーのうちの少なくとも一つのアプタマーを同定することを含んでなる方法を提供する。
本開示は更に、ａ）第一のアプタマーを固体支持体と接触させ、ここでの第一のアプタマーはリンカー及びタグを含んでおり、前記タグは前記固体支持体に結合できることと；ｂ）標的を前記第一のアプタマーと接触させ、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的に対する結合親和性を有しており、前記第一のアプタマーは前記標的に結合して第一の複合体を形成することと；ｃ）前記第一の複合体を複数のアプタマーと接触させて複数の第二の複合体を形成し、ここでは該複数の第二の複合体の各々が前記第一のアプタマー、前記標的及び第二のアプタマーを含み、また前記複数の第二の複合体は複数の第二のアプタマーを含むことと；ｄ）前記複数の第二の複合体を、前記複数のアプタマーのうちの前記アプタマーから分割し、前記複数のアプタマーのうちの少なくとも一つのアプタマーは前記複数の第二の複合体の少なくとも一つの前記第二のアプタマーよりも前記第一の複合体に対する低い結合親和性を有することと；ｅ）前記複数の第二の複合体を解離させることと；ｆ）前記複数の第二のアプタマーを定量して、定量値を得ることと；ｇ）参照値に対する前記定量値の比率が変化せず残るまで工程ａ）〜ｆ）を反復するか、または工程ａ）〜ｆ）の先の反復の参照値に対する前記定量値の比率に対して減少するまで工程ａ）〜ｆ）を反復し、ここでの前記参照値は、前記標的なしで工程ａ）〜ｆ）の方法に露出された複数の対照アプタマーを定量することに基づくことと；ｈ）前記第一の複合体に結合できる、前記複数の第二のアプタマーのうちの少なくとも一つのアプタマーを同定することを含んでなる方法を提供する。
もう一つの態様において、前記タグはビオチンである。
Ａ．ＳＥＬＥＸ
ＳＥＬＥＸは一般的に、核酸の候補混合物を調製することと、該候補混合物を所望の標的分子に結合させて親和性複合体を形成することと、該親和性複合体を未結合の候補核酸から分離することと、前記核酸を前記親和性複合体から分離及び単離することと、前記核酸を精製することと、特定のアプタマー配列を同定することを含んでいる。該方法は、前記選択されたアプタマーの親和性を更に洗練するために、複数のラウンドを含んでもよい。該方法は、プロセス内の１以上のポイントにおいて増幅工程を含むことができる。例えば、「核酸リガンド」の名称のＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，４７５，０９６を参照されたい。ＳＥＬＥＸプロセスは、共有結合的にその標的に結合するアプタマー、並びに非共有結合的にその標的に結合するアプタマーを生成するために使用することができる。例えば、「指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統的進化：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸを」の名称のＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，７０５，３３７を参照されたい。
ＳＥＬＥＸ法は、例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性のような改善された特性をアプタマーに与える、修飾された核酸を含有する高親和性アプタマーを同定するために使用することができる。このような修飾の例には、リボース及び／またはリン酸及び／または塩基の位置における化学的置換が含まれる。修飾されたヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ法で同定されたアプタマーは、「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，６６０，９８５に記載されており、ピリミジンの５’−位及び２’−位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している。前出のＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，５８０，７３７は、２’−アミノ（２’−ＮＨ ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１以上のヌクレオチドを含有する、高度に特異性のアプタマーを記載している。また、拡大された物理的及び化学的特性を有する核酸ライブラリ、並びにＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用を記載した、「ＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸ」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．８，４０９，７９５も参照されたい。
ＳＥＬＥＸはまた、望ましいオフ速度特性を有するアプタマーを同定することができる。例えば、標的分子に結合できるアプタマーを生成するための改善されたＳＥＬＥＸ法を記載した、「改善されたオフ速度を有するアプタマーを生成する方法」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．７，９４７，４４７を参照されたい。上記で述べたように、これらの遅いオフ速度のアプタマーは、「ＳＯＭＡｍｅｒｓ」として知られている。より遅い解離速度を有するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓ及び光アプタマーまたはまたはＳＯＭＡｍｅｒｓを、それらのそれぞれの標的分子から製造するための方法が記載される。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させることと、核酸−標的複合体の形成を生じさせることと、遅い解離速度の富化工程を実施し、ここでは速い解離速度を有する核酸−標的複合体は解離して再形成されないのに対して、遅い解離速度をもった複合体はそのまま残ることをを含んでいる。加えて、前記方法は、改善されたオフ速度性能を有するアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓを生成するための候補核酸混合物の製造における修飾ヌクレオチドの使用を含む。
このアッセイのバリエーションは、アプタマーをその標的分子に共有結合または「光架橋」することを可能にする光反応性官能基を含んだアプタマーを用いる。例えば、「核酸リガンド診断バイオチップ」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，５４４，７７６を参照されたい。これらの光反応性アプタマーはまた、光アプタマーとも呼ばれている。例えば、それぞれ「指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統的進化；核酸リガンドの光選択及び溶液ＳＥＬＥＸ」と題する、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，７６３，１７７、Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，００１，５７７、及びＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，２９１，１８４を参照されたい。また、例えば「核酸リガンドの光選択」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，４５８，５３９も参照のこと。マイクロアレイが試料と接触され、光アプタマーがその標的分子に結合する機会を持った後に、光アプタマーは光活性化され、そして固体支持体は洗浄されて、非特異的に結合した如何なる分子も除去される。光アプタマーに結合される標的分子は、光活性化された官能基により形成された共有結合に起因して一般に除去されないので、過酷な洗浄条件が使用されてよい。
これらアッセイフォーマットの何れにおいても、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓは、サンプルと接触させる前に固体支持体上に固定化される。しかし、特定の状況下では、アプタマーまたはサンプルと接触させる前にＳＯＭＡｍｅｒｓを固定化することは、最適なアッセイを提供することはできない。例えば、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓを予備固定化することは、おそらく長い反応時間をもたらし、従って、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓをそれらの標的分子に効率的に結合させるためには、インキュベーション期間の延長を導くことになる。更に、該アッセイに光アプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒｓが用いられ、且つ前記固体支持体として利用される材料に依存しているときに、前記固体支持体は、光アプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒｓとその標的分子間に共有結合を形成するために使用される光を散乱または吸収する傾向がある。固体支持体の表面もまた、使用される任意の標識物質に露出されて影響を受け得るので、用いる方法に依存して、それらのアプタマーまたは光ＳＯＭＡｍｅｒｓに結合した標的分子の検出は不正確になる可能性がある。最後に、固体支持体上のアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓの固定化は、一般的に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓをサンプルに暴露する前に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを調製する工程（即ち、固定化）を含み、この調製工程はアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒｓの活性または機能に影響を与える可能性がある。
ＳＯＭＡｍｅｒが溶液中の標的を捕捉することを可能にし、次いで、検出に先立ってＳＯＭＡｍｅｒ−標的混合物の特定の成分を除去するように設計される工程を用いるＳＯＭＡｍｅｒアッセイもまた記載されている（「試験サンプルの多重化分析」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．７，８５５，０５４を参照されたい）。ここに記載されるＳＯＭＡｍｅｒアッセイ法は、非核酸標的を検出及び定量化して、広範囲な核酸技術するために代理核酸（即ち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を作製し、増幅を含む広範な核酸技術を、タンパク質標的を含むより広範な所望の標的に適用することを可能にする。
標的がペプチドであるＳＥＬＥＸプロセスの実施形態が、「精製されたタンパク質がない改変ＳＥＬＥＸ法」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．６，３７６，１９０に記載されている。
Ｂ．遅いオフ速度アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒｓ）
遅いオフ速度アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ試薬）は、プロテオミクス、バイオマーカーの発見、及び医療診断の分野を変革しました。それは、＞１０００のタンパク質を同時に、且つ少量（０．１ｍＬ）のサンプルを用いて高精度で、血清、血漿、ＣＳＦ、または組織溶解物を測定することが可能です。この高多重検定（ＳＯＭＡｓｃａｎ）の適用は、感染、肺、腫瘍学、心臓血管、腎臓及び神経疾患におけるバイオマーカーの発見導いている。ＳＯＭＡｍｅｒｓは、アミノ酸側鎖を模倣する疎水性の芳香族官能基で５位を修飾されたデオキシウリジン残基を含むため、従来に比較してタンパク質標的の範囲を拡大し、且つアプタマーの結合特性を改善した。ＳＯＭＡｍｅｒｓは、動力学的チャレンジ、分割、及び増幅を用いた多数回選択からなるＳＥＬＥＸ法（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）により、インビトロで生成される。
Ｃ．アプタマーに対する化学修飾
アプタマーは、性質及び特性を改善する修飾ヌクレオチドを含んでよい。そのような改善の非限定的な例には、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／または改善された送達特性が含まれる。
そのような修飾の例には、ヌクレオチドのリボース位置及び／またはリン酸位置及び／または塩基位置での化学的置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含むＳＥＬＥＸ法で同定されたアプタマーは、「修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンド」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，６６０，９８５に記載されており、ピリミジンの５’−位及び２’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している。Ｕ．Ｓ．特許Ｎｏ．５，５８０，７３７（前出を参照のこと）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１以上のヌクレオチドを含む高度に特異的なアプタマーを記載している。また、拡大された物理的及び化学的性質を有する核酸ライブラリ、並びにＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸにおけるその使用を記載した、「ＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸ」と題するＵ．Ｓ．特許Ｎｏ．８，４０９，７９５も参照されたい。
Ｃ−５修飾の特定の例には、Ｃ−５位に下記から独立に選択された置換基を備えたデオキシウリジンの置換が含まれる：即ち、下記に示すように、ベンジルカルボキサミド（或いはベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキサミド（或いはナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキサミド（トリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、及びイソブチルカルボキサミド（或いはイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）である。
Ｃ−５修飾されたピリミジンの化学修飾はまた、単独または任意の組み合わせにおいて、２’−位での糖修飾、環外アミンでの修飾、４−チオウリジンの置換などと組み合わせることができる。
代表的なＣ−５修飾されたピリミジンには下記のものが含まれる：５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、または５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシ）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン。
存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドの組み立ての前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され可能性がある。ポリヌクレオチドは、重合の後に、標識成分との結合等によって更に修飾することができる。
本開示の核酸配列に組み込むことができる修飾ヌクレオチド（例えば、Ｃ−５修飾されたピリミジン）の、追加の非限定的な例には以下が含まれる：
Ｒ’は次のように定義される：
そして、Ｒ’’、Ｒ’’’およびR’’’’は次のように定義される：
ここで
Ｒ’’’’は、分枝または直鎖状の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；ヒドロキシル（ＯＨ）、ハロゲン（Ｆ、ＣＩ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２ Ｈ ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’）；一級アミド（ＣＯＮＨ ２）；二級アミド（ＣＯＮＨＲ’’）；三級アミド（ＣＯＮＲ’’Ｒ’’’ ）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲ’’）からなる群から選択され；
ここで
Ｒ’’、Ｒ’’’は独立に、分枝状または直鎖状の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２）、フェニル（Ｃ ６ Ｈ ５）；R’’’’置換されたフェニル環（R’’’’Ｃ ６ Ｈ ４）からなる群から選択され；ここでのR’’’’は上記で定義され；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯR’’’’’）；ここでのR’’’’’は、分枝状または直鎖状の低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；及びシクロアルキルであり； ここで、Ｒ’’＝R’’’＝（ＣＨ ２）ｎ
ここで、ｎ＝２〜１０。である。
更に、Ｃ−５修飾されたピリミジンヌクレオチドには次のものが含まれる：
Ｒは、下記の部分の１つから選択される：
命名法の目的および例として、Ｒ基が上記の６ａ（またはＢｎ）として定義される場合、該ヌクレオチドは５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）と命名され；Ｒ基が上記６ｆ（またはＮａｐ）として定義される場合、該ヌクレオチドは、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）と命名され；Ｒ基が６ｈ（または２Ｎａｐ）として定義される場合、該ヌクレオチドは５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）と命名される。
幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに対してヌクレアーゼ耐性を付与する。幾つかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、化学式６ａ〜６ｖからなる群から選択される。Ｃ−５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの例である。修飾は、骨格修飾、メチル化、並びにイソ塩基類、イソシチジン及びイソグアニジン等のような異常塩基対合の組合せを含むことができる。修飾はまた、キャッピングなどの３’及び５’修飾を含むことができる。他の修飾には、天然に存在する１以上のヌクレオチドの類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非帯電結合を持つもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、カルバメート等）、帯電結合を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）を有するもの、キレート化剤（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、及び修飾された結合（例えば、αアノマー核酸など）を有するものを含むことができる。更に、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基の何れかは、ホスホン酸基またはリン酸基で置換されてよく；標準的な保護基で保護されてよく；または更なるヌクレオチドまたは固体支持体に対する追加の結合を調製するように活性化されてもよい。５’及び３’末端のＯＨ基は、リン酸化でき、またはアミン類、約１〜約２０の炭素原子の有機キャッピング基部分、一つの実施形態では約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、もう一つの実施形態では約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、または他の親水性または疎水性の生物学的または合成のポリマーで置換することができる。一つの実施形態において、修飾はピリミジンのＣ−５位でのものである。これらの修飾は、直接Ｃ−５位での直接のアミド結合または他の種類の結合を介して生成することができる。
ポリヌクレオチドは、当技術分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似形態を含むことができ、これには２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ、または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース（ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅｓ）、非環式類似体及びメチルリボシドのような脱塩基ヌクレオシド類似体が含まれる。上述のように、１以上のホスホジエステル結合は代替連結基で置換されてよい。これらの代替連結基には、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換される実施形態が含まれ、ここでの各ＲまたはＲ’は独立にＨまたは置換もしくは非置換のアルキル（１−２０Ｃ）であり、任意にエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルキルを含む。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。例えば、糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、ポリアミド骨格のような代替の骨格構造がそうであるように、最終製品の設計に有利であることができる。
Ｄ．組成物を含むキット
本開示は、ここに記載の第一のアプタマー及び／または第二のアプタマーを含むキットを提供する。このようなキットは、例えば、（１）最初のアプタマー（例えば、標的捕捉アプタマー）、及び／または第二のアプタマー（例えば、標的検出アプタマー）；及び（２）少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、たとえば溶媒または溶液を含むことができる。追加のキット成分は、必要に応じて、例えば（１）安定化剤、緩衝剤のような本明細書中で同定した医薬的に許容可能な何れかの賦形剤、（２）キット成分を保持及び／または混合するための少なくとも１つの容器、バイアルまたは類似の装置；および（３）送達装置を含むことができる。
以下の実施例は、ある特定の特徴及び／または実施形態を説明するために提供されるものである。これらの実施例は、本開示を、記載された特定の特徴または実施例に限定するものと解釈されるべきではない。
実施例１：材料及び方法
この実施例では、標的（例えば、タンパク質標的）を検出するためのＤＮＡアプタマー対を選択および同定するために使用される、一般的な材料および方法の概要を提供する。
＜ＳＥＬＥＸのために使用されるタンパク質＞： Ｃ．ディフィシル（ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）バイナリ毒素（ＣｄｔＡ）が、記載されたように組換えのＨｉｓ１０タグ付き形態で製造された。組換えのタグ付き形態で利用可能なヒトタンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州ミネアポリス、米国）には、何れもＨｉｓタグ付けされたアンジオポエチン２（カタログ番号６２３−ＡＮ／ＣＦ）、ＴＳＰ２（カタログ番号１６３５−Ｔ２）、ＣＲＤＬｌ（カタログ番号１８０８−ＮＲ）、ＭＡＴＮ２（カタログ番号３０４４−ＭＮ／ＣＦ）、ＧＰＶＩ（カタログ番号３６２７−ＧＰ）、並びにＦｃ融合としてのＥＳＡＭ（カタログ番号２６８８−ＥＣ）が含まれる。血漿から精製された天然のヒトタンパク質には、Ｃ７（Ｑｕｉｄｅｌ社、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ、カタログ番号Ａ４０５）及びプラスミノーゲン（アテネリサーチ＆テクノロジー、アテネ、ＧＡ、ＵＳＡ、カタログ番号１６−１６−１６１２００）が含まれる。記載されているように、これら両者は、ＥＺ−ＬｉｎｋのＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（サーモ、ロックフォード、イリノイ州、ＵＳＡ、カタログ番号２１３２９）を使用してビオチン化された。
＜アプタマー合成＞： ４０−ヌクレオチドの標的結合領域及び両端に５個のヌクレオチドを含んた短縮型の合成アプタマーが、修飾されたヌクレオチドを使用して、標準的なホスホラミダイト化学により調製された。ＡＢ−Ｈ５０量体は、ストレプトアビジン（ＳＡ）への容易なカップリングのための５’−ビオチン−ｄＡヘキサエチレングリコールスペーサー、及び改善されたエキソヌクレアーゼ安定性のための、３’逆ｄＴヌクレオチド（ｉｄＴ）を含有していた。
＜メニューアプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒｓ）及びサンドイッチＳＥＬＥＸ＞： 全てのタンパク質標的への一次結合剤としてのメニューアプタマーがＳＥＬＥＸを介して単離され、またＡＢ−Ｈ５０量体が上記のようにして調製された。ＡＢ−Ｈアプタマーの代替としての、ＰＢＤＣ（ビオチンおよびフルオロフォアを備えた光切断可能なリンカー）アプタマーが、改変ＳＥＬＥＸ法において使用された。該アプタマーは、その適切な再生を保証するために、ＳＢ１８Ｔ中において３分間９５℃に加熱し、３７℃まで徐々に冷却することによって「加熱−冷却」された。活性は、平衡結合において、またプルダウンアッセイにおいて確認された。サンドイッチＳＥＬＥＸのために、公表された選択プロトコルが次のように変更された。タンパク質は、ＳＥＬＥＸの各ラウンドの直前に、同族メニューアプタマーのＡＢ−Ｈバージョンと複合体形成された。Ｒ１については、１００μＬの５００ｎＭタンパク質（５０ピコモル）を加熱−冷却された５μＬの５μＭ（２５ピコモル）アプタマーと混合し、３７℃で３０分間インキュベートして複合体を形成させた。その後のラウンドについては、１０μＬの５００ｎＭタンパク質（５ピコモル）と、２μＬの５μΜ（１０ピコモル）アプタマー（２倍過剰）を使用した。非特異的アプタマーアプタマー相互作用によるバックグラウンドを低減するために、特異的なカウンター選別ビーズをＳＥＬＥＸの各ラウンドで新たに調製した。簡単に言えば、２μＬの５μΜ（１０ピコモル）加熱−熱冷却したＡＢ−Ｈアプタマーを、ＳＢ１８Ｔ中における２．５ｍｇ／ｍＬのＳＡビーズ４０μＬに添加し、１５分間振盪して固定化させた。次いで、該ビーズを戦場して残留する遊離アプタマーを除去し、５０μＬのＳＢ１８Ｔ中に再懸濁させ、１０μＬのＨｅｘａ−Ｈｉｓ（アナスペック（ＡｎａＳｐｅｃ）、フリーモント、ＣＡ、ＵＳＡ、カタログ番号２４４２０）をコーティングしたビーズ、または５０μＬのＳＡビーズ、またはプロテインＧビーズと共に、ダウンストリーム分割法に従って、カウンター選別プレートに加えた。緩衝液ＳＢ１８Ｔ（４０ｍＭのＨＥＰＥＳ・ｐＨ７．５、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０）が、ＳＥＬＥＸおよび全てのその後の結合アッセイに使用された。出発ライブラリは、１ナノモル（１０１４ 〜１０ １５）の修飾ＤＮＡ配列の配列からなっており、該配列はＰＣＲ増幅のために固定された配列に挟まれた４０の連続する無作為化位置を含んでいた。５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−［２−ナフチルメチル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、及び５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）を含む、異なる修飾ヌクレオチドの別のライブラリが使用された。遅いオフ速度が選ばれるように、ＳＥＬＥＸラウンド２から先において、５ｍＭの硫酸デキストランを用いた動力学的チャレンジが行われた。標的・アプタマー複合体の分割は、Ｈｉｓタグタンパク質についてはＨｉｓタグ２（カタログ番号１０１−０４Ｄ）、Ｆｃ融合タンパク質についてはプロテインＧ（カタログ番号１００−０４Ｄ）、およびビオチン化された標的についてはＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１（カタログ番号３５０−０２Ｄ）ビーズを使用した常磁性ダイナビーズ（登録商標；ライフテクノロジー社、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて達成された。選択されたＤＮＡを、過塩素酸溶出緩衝液（１．８ＭのＮａＣｌＯ４、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％トリトンＸ−１００、ｐＨ６．８）で５分間ビーズから溶出させ、次いでプライマービーズ上に捕捉し、ＫＯＤ・ＸＬ・ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ及びプライマー伸長のために処理し、修飾されたヌクレオチドを有するセンス鎖を得た。
改変サンドイッチＳＥＬＥＸのために、標的−アプタマー複合体の分割は、一次ＰＢＤＣアプタマー上のビオチンタグに結合するストレプトアビジン（ＳＡ）ビーズを用いて達成された。これは、ビオチンタグが標的上にあるＡＢ−Ｈアプタマーに基づくＳＥＬＥＸとは対照的である。この改変法は、サンドイッチＳＥＬＥＸにおいてタグ付けされていない標的の使用を可能にする。ライブラリから選択されたＤＮＡアプタマーは、過塩素酸ナトリウムでの溶出の代わりに、ＳＡビーズからの三元複合体の光開裂（ブラックライト下での振盪を７分で２回）を介して回収され、ＰＣＲ及びｃＤＮＡ調製のために処理された。
＜ＤＮＡ配列決定及び比較配列分析＞： ＳＥＬＥＸで得られるアプタマープールは、ＰＣＲ−スクリプトアンプクローニングキット（アジレント、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ、カタログ番号２１１１８９）を使用してクローニングし、個々のクローンの配列をＡＢＩプリズム３７３０（ＳｅｑＷｒｉｇｈｔ、ヒューストン、テキサス州）で決定した。錯体化されたＳＥＬＥＸで得たアプタマーｖｓ遊離タンパク質が、共通パターンを識別するために、パターン識別閾値＝０．５〜０．９、ファミリー・クラスター・カットオフ＝０．５〜０．９、配列一致閾値＝０．８、および均等ミスマッチ＝５のでカスタマイズされた柔軟なアラインメントアルゴリズムを使用して比較された。
＜平衡結合アッセイ及び競合アッセイ＞： ＳＥＬＥＸにおいて単離された完全長アプタマー及びそれらの合成の短縮型カウンターパートは、まず遊離タンパク質への結合について評価され、その後、予め形成されたタンパク質−メニューアプタマー複合体（化学量論比１：１）と比較して、フィルター結合アッセイにおいて平衡結合定数（Ｋｄ）が決定された。ナイロン膜上での複合体の効率的な分割は、ダイナビーズ（登録商標）Ｈｉｓ−タグ２（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ、カタログ番号１０１−０４Ｄ）を用いたＧＰＶＩを除き、ゾルバックスＰＳＭ−３００Ａ（アジレント、サンタクララ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて達成された。サンドイッチアプタマー候補は更に競合結合アッセイで試験され、ここでは放射性標識されたアプタマー（〜０．０１ｎＭ）が、競争相手としての１００倍過剰（１０ｎＭ）の非標識メニューの存在下に、或る濃度範囲（０．００１ｎＭ〜１００ｎＭ）の標的タンパク質と共にインキュベートされた。
＜サンドイッチフィルター結合アッセイ＞： フィルター結合サンドイッチアッセイの２つのバリエーションを行って、１２−ＰＴ結合曲線を得た。第一の方法は、タンパク質と放射性標識された完全超の検出アプタマーの平衡結合と、それに続く、ＳＡビーズ上にＡＢ−Ｈメニューアプタマーを固定化することにより調製した特異的捕捉ビーズを用いた分割（間欠的に震盪しながら３０分）を含んでいた。第二の方法は、タンパク質、放射性標識された検出アプタマー（全長、非ビオチン化）及び過剰（１０ｎＭ）な非標識のＡＢ−Ｈメニューアプタマーの結合平衡時の三元複合体の形成と、それに続くＳＡビーズを用いた分割（間欠的に振盪しながら５分）に基づいていた。両者の方法は同等の結果を生じた。対照として、ＳＡビーズ結合による非特異的バックグラウンドを識別するために、捕捉剤を省略した別個のアッセイにおいて全配列を試験した。これらのクローンは、捕捉及び検出アプタマーの直接的相互作用による非滴定信号を生じる配列と一緒に、更なる分析から除外した。
＜多重化されたサンドイッチスクリーニングアッセイ＞： サンドイッチ結合フォーマットでのアプタマーの多重化された対形成でのスクリーニング（ＡＢ−Ｈの５０ｍｅｒｓ）のために、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）プラットホームを使用した。捕捉ビーズの調製及び結合アッセイは、緩衝液ＳＢ１７Ｔ（１ｍＭのＥＤＴＡを補充したＳＢ１８Ｔ）で予め湿潤化されたＭＳＢＶＮ１２濾過プレート（ＥＭＤミリポア社、ビレリカ、ＭＡ、ＵＳＡ）上で行った。異なる種類のＬｕｍＡｖｉｄｉｎ（登録商標）マイクロスフェア（ルミネックス・コーポレーション社、オースチン、テキサス州、カタログ番号Ｌｌ００−Ｌｌ０ｌ−０１からＬ１００−Ｌ１１６−０１）を、別々のウェルに分配し（ウェル当たり１００，０００ビーズ）、真空濾過により１８０μＬのＳＢ１７Ｔで３×１分間洗浄した。アプタマーを加熱―冷却し、所定のタンパク質標的に対する各補足アプタマーの５０ｎＭストック液８０μＬを異なるビーズタイプに追加し、固定化させるためにプレートを振盪した（ＲＴ、１１００ｒｐｍで２０分間）。次いで、ビーズをＳＢ１７Ｔ中における１００μＬの５０ｎＭストレプトアビジンおよび１０ｍＭビオチンで各々５分間洗浄し、その後１８０μＬのＳＢ１７Ｔで４×１分洗浄した。各タンパク質について全ての捕捉ビーズをプールし、ＳＢ１７Ｔで容量を１．７ｍＬにした。結合アッセイのために、プールされた捕捉ビーズの５０μＬを予め湿潤化されたＭＳＢＶＮ１２濾過プレートのウェルに分注し、検出剤として試験すべき各アプタマーについて二重複ウェルを使用し、そしてＳＢ１７Ｔ＋１％ＢＳＡ中の２０ｎＭタンパク質５０μＬ、またはタンパク質なしの対照のための５０μＬの緩衝液と混合した。１１００ｒｐｍで振盪しながら少なくとも３０分後、プレートを１８０μＬのＳＢ１７Ｔ＋１％ＢＳＡで２×１分間真空洗浄し、ビーズを５０μＬのＳＢ１７Ｔ＋ＢＳＡ中に再懸濁させた。加熱―冷却された検出アプタマーを、５０μＬの１２．５ｎＭストック液を使用して個々のウェルに添加し、冷却し、振盪しながら３０分間インキュベーションを継続し、その後ビーズを洗浄して上記のように再懸濁させた。レポーターとして、ＳＢ１７Ｔ＋ＢＳＡ中の１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＳＡ−ＰＥ）複合体（モス、パサデナ、ＭＤ、ＵＳＡ、カタログ番号ＳＡＰＥ−００１）５０μＬを添加し、ビーズを再び振盪し、洗浄し、上記のように再懸濁した。該プレートをルミネックス１００アナライザーで読み取った（タイムアウト：１２０秒可能、ＤＤゲーティング：７５００〜８０００、レポーターゲイン：高ＰＭＴ）。
＜サンドイッチアッセイ標的滴定＞： ＡＢ−Ｈアプタマーペアの結合曲線を、ビーズベースおよびプレートベースの両方のサンドイッチアッセイのために作成した。ビーズアッセイについては、一つの特定の捕捉アプタマーを担持した単一のＬｕｍＡｖｉｄｉｎ微小球ビーズタイプを使用して行い、また標的タンパク質を１００ｎＭで始まる半対数連続希釈で添加して１２ポイントの結合曲線を得たことを除き、本質的には上記のスクリーニングアッセイについて記載したようにして行った。プレートアッセイについては、アプタマーを冷却熱２ピコモル（２０ｎＭの１００μＬ）の加熱−冷却されたアプタマーを、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジン被覆プレート（ピアース・バイオテクノロジー・サーモサイエンティフィック、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ、カタログ番号１５５００）上で一晩固定化した。ウェルを１００μＬの５０ｎＭのストレプトアビジンおよびＳＢ１７Ｔ中の１０ｍＭビオチンで各５分間洗浄し、その後２００μＬのＳＢ１７Ｔ＋１％ＢＳＡで１０分間ブロックした。標的タンパク質を加え、振盪しながら４５分間インキュベートし、プレートを１５０μＬのＳＢ１７Ｔ＋１％ＢＳＡで２×１分間洗浄した。検出アプタマー（ＳＢ１７Ｔ＋１％ＢＳＡ中の２０ｎＭストック液１００μＬ）を添加し、インキュベーションを３５分間続け、ウェルを上記のように洗浄した。レポーターとして、１００μＬの０．４μｇ／ｍＬ・ＳＡ−ＨＲＰ複合体（ライフテクノロジー社、カールスバッド、ＣＡ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｓ−９１１）を３５分間振盪しながら添加し、続いてＳＢ１７で３回洗浄した（Ｔｗｅｅｎ−２０なし）。ＴＭＢ基質（フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ、ＵＳＡ、カタログ番号ＰＩ３４０２８）を２０〜３０分間（１００μＬ）添加し、次いで５０μＬの１０％硫酸で反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を記録した
実施例２：クロストリジウム・ディフィシルのバイナリ毒素A鎖（ＣｄｔＡ）のためのアプタマー対の選択及び同定
この実施例では、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ・Ｄｆｆｉｃｉｌｅ）のバイナリ毒素A鎖（ＣｄｔＡ）タンパク質のためのDNAアプタマー対を選択及び製造するための代表的な方法を提供する。この代表的な方法は、図1に概説されており、興味のある他の標的（例えば、タンパク質）に対するアプタマー対を識別するために使用することができる。
精製された組換えＣｄｔＡタンパク質およびＴｒｐｄＵで修飾されたライブラリを用いたＳＥＬＥＸによって、０．８６ｎＭのＫｄを有するクローン４７５８−６が得られた。クローン４７５８−６の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＴｒｐｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＣｄｔＡタンパク質に結合することができる。該ヌクレオチド配列は次の通りであり、ここでのＴはＴｒｐｄＵを表わす：５’−ＧＡＡＧＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＧ−３’（配列番号１）。非競合性アプタマーを同定する試みにおいて、クローン４７５８−６の非増幅性バージョンとの複合体におけるＣｄｔＡ（ＣｄｔＡ−４７５８−６アプタマー複合体）が第二のＳＥＬＥＸにおける標的として用いられ（プール５５７９−２ＮａｐｄＵ修飾されたアプタマーライブラリ）、これは４７５８−６クローンを生成するためにＴｒｐｄＵライブラリの代わりに２ＮａｐｄＵ修飾されたライブラリを使用した。以下の表１は、ＣｄｔＡタンパク質と複合体化された４７５８−６アプタマークローンを使用するＳＥＬＥＸにおいて同定された配列解析の要約、同定された配列パターンの対応する数（「＃」）、Ｋｄデータ、およびＣｄｔＡ−４７５８−６アプタマーとの複合体が形成されたかどうか（「サンドイッチ」）を提供する。略語：遊離タンパク質（Ｆ．Ｐ．）及び競合体（Ｃｏｍｐ．）。
遊離ＣｄｔＡ（プール５５５１）を用いたＳＥＬＥＸは、ＣｄｔＡ−４７５８−６アプタマー複合体に対するＳＥＬＥＸで使用された同じ２ＮａｐｄＵライブラリ、および異なるＰＥｄＵ修飾ライブラリ（プール５５７４）と並行して行われた。８ラウンドの選択の後、全てのＳＥＬＥＸ実験は、出発ランダムライブラリと比較して少なくとも１００倍の親和性富化を伴った配列のプールを生成することに成功した。下記の表２は、遊離ＣｄｔＡタンパク質を使用したＳＥＬＥＸにおいて同定されたアプタマー（クローン）の配列解析の要約であって（プール５５５１−２ＮａｐｄＵ修飾されたアプタマーライブラリ）、同定された配列パターンの対応する数（「＃」）、Ｋｄデータ、およびアプタマーサンドイッチが形成されたかどうか（「サンドイッチ」）を提供する。
下記の表３は、遊離ＣｄｔＡタンパク質を使用して（プール５５７４−ＰＥｄＵ修飾されたはアプタマーライブラリー）、ＳＥＬＥＸで同定されたアプタマー（またはクローン）の配列分析の要約であって、同定された配列パターンの対応する数（「＃」）、Ｋｄデータ、およびアプタマーサンドイッチを形成するかどうか（「サンドイッチ」）を提供する。
親和性富化プール５５７９（ＣｄｔＡ−４７５８−６、表１）および５５５１（遊離ＣｄｔＡ；表２）からの２ＮａｐｄＵクローンの比較比較可能な配列解析によって、パターン及び量における違いが明らかになったが、同様に幾つかの共通配列モチーフが存在した（図１Ｂ）。支配的なパターンは、プール５５５１における配列の２０個（４４％）で発生したが、プール５５７９では５個（１２％）の配列だけであった。このパターンを保有する配列（例えば、５５７９−７、５５７９−１２、５５７９−２１）は、元のリガンド４７５８−６とのサンドイッチ形式でも一貫して首尾よく働いた。複数のコピーで見つかった別のパターンおよび２つの配列は、プール５５７９（ＣｄｔＡ−４７５８−６）でのみ発見され、また、これらの配列は４７５８−６と非競合的であった。もう一つのパターンは両方のプールからの配列に存在し、このファミリーが最も活発なアプタマー（例えば５５７９−１１）を含んでいたが、それらはサンドイッチアッセイでは働かなかった。殆どの場合、これらの配列はＳＥＬＥＸの際に４７５８−６と首尾よく競合し、より高い親和性またはより優れた結合キネティクスで同じエピトープを占めた。二つの異なるパターン及び三つのマルチコピー配列がプール５５５１（遊離ＣｄｔＡ ＳＥＬＥＸ）だけに見られ、サンドイッチアッセイに失敗した。最後に、それらの幾つかは遊離ＣｄｔＡに対してナノモル未満の親和性を有していたが、ＰＥｄＵライブラリを用いた遊離ＣｄｔＡ・ＳＥＬＥＸで生成した何れの配列も前記複合体に結合しなかった。従って、遊離ＣｄｔＡ・ＳＥＬＥＸは異なるエピトープに結合する幾つかの新たなアプタマーも生じたが、ＣｄｔＡ−４７５８−６複合体を用いたＳＥＬＥＸは明らかに、４７５８−６と共同して、より高い比率でサンドイッチアッセイのために有用な配列をもたらした。
前記新たなアプタマーは、０．０５ｎＭ〜４ｎＭの範囲の親和性で前記遊離タンパク質に結合し（図１Ｃ）、また、既存の４７５８−６・ＴｒｐｄＵアプタマーと一緒に、競合アッセイ及びサンドイッチフォーマットで試験された（図１Ｄ及び１Ｅ）。４７５８−６に匹敵する親和性（Ｋｄ ＝０．６７ｎＭ対０．８６ｎＭ）を持ったクローン５５７９−１２について示されているように、〜１００倍過剰（１０ｎＭ）の４７５８−６の存在によっては、または４７５８−６が補足剤として使用されたときには、ＣｄｔＡへの結合は影響されず、二つの配列が異なるＣｄｔＡエピトープに結合することが示された。これとは対照的に、４７５８−６に比較して優れた親和性を持つアプタマー５５７９−１１の結合（Ｋｄ ＝０．０５ｎＭ対０．８６ｎＭ）は、競合体または捕捉剤としての４７５８−６で低下した。各ＳＥＬＥＸからの代表的な配列はまたＬｕｍｉｎｅｘプラットホーム上でスクリーニングされ、ここでは最初のアプタマー４７５８−６がビーズ上の捕捉剤として働いた。遊離ＣｄｔＡ・ＳＥＬＥＸ（５５７９−７、５５７９−１０、５５７９−１２、５５７９−２１）からの殆どのクローン、並びに遊離ＣｄｔＡ・ＳＥＬＥＸ（５５５１−８１）からの１つのクローンは、検出剤として使用した場合にそれらの結合を確認した（図１Ｆ）。捕捉剤及び検出剤は、４７５８−６から及び５５７９−１２ついて交換可能であり、ルミネックスサンドイッチアッセイにおいて同様の結合曲線を生じた（図１Ｇ）。
実施例３： ８つの異なるタンパク質標的に対するアプタマー対の選択
この実施例は、下記のタンパク質標的のためのＤＮＡアプタマー対のための第二要諦な方法を提供する：アンジオポエチン２（ＡＮＧＰＴ２）、トロンボスポンジン２（ＴＳＰ２）、コーディン様１（ＣＲＤＬｌ）、マトリリン−２（ＭＡＴＮ２）、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）、内皮細胞選択的接着分子（ＥＳＡＭ）、補体７（Ｃ７）、およびプラスミノーゲン（ＰＬＧ）。
標的タンパク質に対するアプタマー対を取得するために二段階戦略が用いられた。第一の戦略については、良好な親和性（Ｋｄ＜１０ｎＭ）を実証したＳＥＬＥＸを介して得られたアプタマーは、全て修飾ヌクレオチドとしてＢｕｎｄＵを用いて、８標的のうちの三つ（Ｃ７、ＭＡＴＮ２、ＰＬＧ）のための機能的プタマー対を生じた。第二の戦略では、ＳＥＬＥＸは、二つの新しい修飾ヌクレオチドライブラリ（ＴｒｐｄＵ及び２ＮａｐｄＵ）を用いて標的・ＳＯＭＡｍｅｒ複合体で実施され行われ、並行して、ＴｒｐｄＵまたは２ＮａｐｄＵライブラリの何れかを使用した遊離タンパク質ＳＥＬＥＸが行われた。７ラウンドのＳＥＬＥＸの後、全ての２４のプールは、ＤＮＡ再会合（Ｃ０ｔ）動力学に基づく収束を示し、低ナノモルまたはナノモル未満のＫｄ値が実証された。プールあたり少なくとも４８のＳＯＭＡｍｅｒｓのクローニング及び配列決定が、タンパク質ＳＯＭＡｍｅｒ複合体及び遊離タンパク質標的を用いてＳＥＬＥＸで得られた配列の比較分析を可能にした。全ての場合において、タンパク質ＳＯＭＡｍｅｒ複合体に結合する活性クローンが得られたが、遊離標的がＳＥＬＥＸに使用された場合には、試験されたクローンの大部分が前記複合体に結合しなかった。従って、ＳＥＬＥＸの際にタンパク質−ＳＯＭＡｍｅｒ複合体標的を使用することは、サンドイッチ候補を見つける可能性を明らかに増加させた。しかし、例外は、しかし、共通の配列パターンを共有し、ＥＳＡＭ−２９８１−９複合体を用いて選択されたプール７５６５ＴｒｐｄＵ由来のクローンは例外であり、そのすべてが共通の配列パターンを共有し、ＥＳＡＭ−２９８１−９複合体の結合を示したが、遊離ＥＳＡＭタンパク質の結合は示さなかった。後になって、これらの配列は標的タンパク質と結合するよりも、むしろＳＯＭＡｍｅｒ２９８１−９と相互作用することが示された。
それらは単にメニューＳＯＭＡｍｅｒを置換して同じエピトープに結合する可能性があるため、タンパク質−メニューＳＯＭＡｍｅｒ複合体に対する新たなクローンの観察された結合は、真のサンドイッチの存在を実証しなかった。この識別を行うために、この新しいクローンを、１０ｎＭ（〜１００倍）過剰の非標識競合メニューＳＯＭＡｍｅｒの存在下での結合アッセイと、捕捉剤としてのメニューＳＯＭＡｍｅｒｓを用いたサンドイッチアッセイに供した。図２Ａに示されたサンドイッチアッセイは、サンドイッチが形成されている場合にのみ信号を発生し、第一のＳＯＭＡｍｅｒの置換が生じない場合には信号は発生しない。遊離タンパク質とのＳＥＬＥＸで得られた全てのＳＯＭＡｍｅｒｓ（合成５’ＡＢ−Ｈ・５０ｍｅｒｓ）についての詳細な配列解析及び結合特性は、以下の表４〜２７に示されている。
表４〜６は、アンジオポエチン２（ＡＮＧＰＴ２）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン２６０２−２の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＡＮＧＰＴ２タンパク質に結合することができる。
表７〜９は、トロンボスポンジン−２（ＴＳＰ２）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン３３３９−３３の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＴＳＰ２のタンパク質に結合することができる。
表１０〜１２は、コーディン様１（ＣＲＤＬ１）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン３３６２−６１の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＣＲＤＬ１タンパク質に結合することができる。
表１３〜１５は、マトリリン−２（ＭＡＴＮ２）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン３３２５−２の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＭＡＴＮ２タンパク質に結合することができる。
表１６〜１８は、糖タンパク質ＶＩ（ＧＰＶＩ）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン３１９４−３６の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＧＰＶＩタンパク質に結合することができる。
表１９〜２１は、内皮細胞選択的接着分子（ＥＳＡＭ）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン２９８１−９の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＥＳＡＭタンパク質に結合することができる。
表２２〜２４は、補体７（Ｃ７）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン２８８８−４９の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、Ｃ７タンパク質に結合することができる。
表２５〜２７は、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン４１５１−６の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さ４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＰＬＧタンパク質に結合することができる。
この結合アッセイは、サンドイッチフォーマットで働くアプタマーを同定するために有用であったが、それは対での試験に限定される。従って、我々は実施例１で詳細に説明したルミネックスプラットホームを使用して、高度に多重化されたサンドイッチスクリーニングアッセイ法を樹立した。
実施例４：改変されたサンドイッチＳＥＬＥＸ法による、標的タンパク質のためのアプタマー対の選択
この実施例は、下記のタンパク質標的のためのＤＮＡアプタマー対を選択および製造スルタンネオ代表的な方法を提供する：即ち、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＭＭＰ−１２）、分泌ホスホリパーゼＡ２（ＮＰＳ−ＰＬＡ２）である。
標的タンパク質に対するアプタマー対は、標的−アプタマー複合体の分割のために、ビーズに結合された捕捉剤としてＰＢＤＣアプタマーを用い、続いて三元複合体の光開裂を用いる改変サンドイッチＳＥＬＥＸプロトコルに従って得られた。ＭＭＰ−１２については、ＰＢＤＣアプタマーは、４４９６−６０・ＢｎｄＵを用いて、ＮａｐｄＵライブラリを使用するＳＥＬＥＸのための標的と複合体を形成した。ＮＰＳ−ＰＬＡ２については、ＴｒｐｄＵライブラリでのＳＥＬＥＸにおける複合体形成のために、ＰＢＤＣアプタマー２６９２−７４ＢｎｄＵが使用された。９ラウンドのＳＥＬＥＸの後にプールを配列決定し、個々のクローンを合成で調製し（ＡＢ−Ｈ・５０ｍｅｒｓ）を調製し、結合について試験した。
表２８は、メタロ−１２（ＭＭＰ−１２）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン４４９６−６０の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含むアプタマーとしての長さ４０のヌクレオチドのであり、ＭＭＰ−１２タンパク質に結合することができる。
表２９は、ホスホリパーゼＡ２（ＮＰＳ−ＰＬＡ２ ）タンパク質に対するアプタマーの概要を提供する。クローン２６９２−７４の核酸分子は、Ｃ−５修飾されたピリミジン、特にＢｎｄＵを含む長さが４０ヌクレオチドのアプタマーであり、ＮＰＳ−ＰＬＡ２タンパク質に結合することができる。
実施例５： アプタマー対の平衡結合定数
この実施例では、 ＤＮＡアプタマー対の平衡結合定数（Ｋｄ値）を測定するための代表的な方法を提供する。
簡単に言うと、所与の標的に対するクローンの各々を別々に、特定のＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズ型に固定化した。次いで、ビーズをプールし、標的の捕捉のために使用し、サンドイッチ候補クローンの各々を、検出のために別々に使用した。八つのパネルタンパク質（ＡＮＧＰＴ２、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬｌ、ＭＡＴＮ２、ＧＰＶＩ、ＥＳＡＭ、Ｃ７及びＰＬＧ）のためのアプタマーサンドイッチ候補の数（標的当たり７〜１６に亘る）に関して、このアプローチは、機能的アプタマーサンドイッチ対でのスクリーニングの２次元マトリックスを一次元に、即ち、１１１６アッセイ（１５２＋１４２＋１６２＋１４２＋９２＋７２＋８２＋７２）から９０アッセイ（１５＋１４＋１６＋１４＋９＋７＋８＋７）へと減少した。多重化されたルミネックス・サンドイッチスクリーニングアッセイは、例えば、ネット信号をヒートマップとしてプロットすることにより、機能的アプタマー対の迅速な同定を可能にした。図２Ｃに一例として示したＣＲＤＬｌについて、ＴｒｐｄＵを含む１１配列、２ＮａｐｄＵを含む四つ、及びＢｎｄＵを含む一つのアプタマー配列を含む、１６のアプタマーを捕捉剤及び検出剤として対式マトリックスで比較した。ＣＲＤＬｌのメニューアプタマー３３６２―６１は、或いは新しいクローンの何れかと組み合わせて捕捉剤または検出剤として使用したときに、良好に働いた。これとは対照的に、クローン７５７５−６及び７５７５−１９は、検出剤として更に良好に働いた（図２Ｄ）。比較のために、他の新しいクローンと共に一つの新しいクローン（７５７５−２）を使用したサンドイッチアッセイは低い信号を生じ、メニューＳＯＭＡｍｅｒの３３６２−６１との対と同様に良好な対はなかった（図２Ｅ）。捕捉及び検出のために同じＳＯＭＡｍｅｒを使用すると、全く信号は得られなかった。
八つのタンパク質のうちの七つについて、ルミネックス・プラットホームでサンドイッチ結合曲線が生成された：ＡＮＧＰＴ２（アンジオポエチン−２）、ＴＳＰ２、ＣＲＤＬｌ、ＭＡＴＮ２、Ｃ７、ＰＬＧ（プラスミノーゲン）及びＧＰＶＩ、並びにＭＭＰ−１２及びＮＰＳ−ＰＬＡ２（図２Ｆ）。同族アプタマーとのタンパク質複合体のための新たなアプタマーの見かけの平衡結合定数（Ｋｄ値）は、０．０２〜２．７ｎＭに亘る（表３０参照）。ＭＡＴＮ２及びＣ７サンドイッチアッセイについて注目すべきことは、アプタマー１（捕捉）及びアプタマー２（検出）のためのＣ−５修飾されたピリミジンが異なるときに、「サンドイッチ」Ｋｄ値が改善ししたことである。詳細に言えば、ＭＡＴＮ２については、サンドイッチＫｄ値は約６．３倍改善され（ＢｎｄＵ捕捉アプタマーおよびＢｎｄＵ検出アプタマー（２．１９ｎＭのＫｄ）を、ＢｎｄＵ捕捉アプタマーおよびＴｒｐｄＵ検出アプタマー（０．８８ｎＭのＫｄ）と比較して）、またＣ７については、サンドイッチＫｄ値は約２．５倍改善された（ＢｎｄＵ捕捉アプタマーおよびＢｎｄＵ検出アプタマー（８．５６ｎＭのＫｄ）を、ＢｎｄＵ捕捉アプタマーおよび２ＮａｐｄＵ検出アプタマー（１．３５ｎＭのＫｄ）と比較して；表３０参照）。
表３０におけるタンパク質のためのスイスプロット番号は次の通りである：ＥＳＡＭ（スイスプロット＃Ｑ９６ＡＰ７）およびＣｄｔＡ−バイナリ毒素（スイスプロット＃Ｑ９ＫＨ４２）、ＡＮＧＰＴ２（スイスプロット＃Ｏ１５１２３）、ＴＳＰ２（スイスプロット＃Ｐ３５４４２）、ＣＲＤＬ１（スイスプロット＃Ｑ９ＢＵ４０）、ＭＡＴＮ２（スイスプロット＃Ｏ００３３９）、Ｃ７（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＃Ｐ１０６４３）、ＰＬＧ（スイスプロット＃Ｐ００７４７）、ＧＰＶＩ（スイスプロット＃Ｑ９ＨＣＮ６）、ＭＭＰ−１２（スイスプロット＃３９９００）、ＮＰＳ−ＰＬＡ２（スイスプロット＃１４５５５）。
ＬｕｍＡｖｉｄｉｎビーズに基づくアッセイに加えて、我々は、プレートに基づくサンドイッチアッセイにおいてもアプタマー対の幾つかを評価した。ビオチン化ストレプトアビジンでコーティングしたプレート上に固定化されたアプタマーを捕捉剤として、またストレプトアビジン−ＨＲＰ接合体を検出剤とした標的滴定によって、ビーズに基づく試験と比較して、アッセイ特性における相違が示された。Ｃ７アプタマー対の見かけのＫｄ値は２つのアッセイの種類において本質的に同一であったが、ルミネックスアッセイではＴＳＰ２対が優れた性能を発揮し、またプレートアッセイにおいてはプラスミノーゲン対が幾分良好なであった（図３参照）。
表３１及び表３２は、三元複合体（即ち、「アプタマーサンドイッチ」）を作製するために使用した表３０に要約されたアプタマーの物理的及び機能的特徴、及び標的の捕捉及び検出のための要約を提供する。
「捕捉アプタマー」（または第一のアプタマー）としてし応される１１のアプタマーの説明が、表３１に提供される。
一般に、「捕捉アプタマー」（または第一のアプタマー）として機能するアプタマーは、約４８〜約５８ヌクレオチド長（または長さが約４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、もしくは５８ヌクレオチド）であった。各アプタマーは、４０量体（長さ４０ヌクレオチド）の中央領域を含んでいる（アプタマーの残りのヌクレオチドは該４０量体の中央領域に隣接する）。４０量体の中央領域は、約９〜約１６（または９、１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６）のＢｎｄＵまたはＴｒｐｄＵ・Ｃ−５修飾されたピリミジンを含む。或いは、前記４０量体の中心領域は、約２２％〜約４０％（または２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０％）のＢｎｄＵまたはＴｒｐｄＵ・Ｃ−５修飾されたピリミジンを含む。更に、「捕捉アプタマー」の４０量体の中央領域は、約３７％〜約５８％のＧＣ含量（約３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８％のＧＣ含量）を含んでいる。「捕捉アプタマー」（または第一のアプタマー）は、約０．０７ｎＭ〜約４．９ｎＭ（または０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８もしくは４．９ｎＭ）の、その標的タンパク質についての結合親和性を有している。
「検出アプタマー」（または第二アプタマー）として使用される１４個のアプタマーの説明が表３２に提供される。
一般に、「検出アプタマー」（または第二アプタマー）として機能するアプタマーは、約５０〜約５８ヌクレオチド長（または長さが約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、もしくは５８ヌクレオチド）であった。各アプタマーは、４０量体（長さ４０ヌクレオチド）の中央領域（アプタマーの残りのヌクレオチドは該４０量体中央領域に隣接する）を含んでいた。該４０量体の中央領域は、約５〜約１５（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５）のＢｎｄＵ、ＴｒｐｄＵ、ＮａｐｄＵまたは２ＮａｐｄＵ・Ｃ−５修飾ピリミジンを含んでいる。或いは、４０−ｍｅｒの中心領域は、約１２％〜約３８％（または１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７もしくは３８％）のＢｎｄＵ、ＴｒｐｄＵ、ＮａｐｄＵまたは２ＮａｐｄＵ・Ｃ−５修飾されたピリミジンを含んでいる。更に、「検出アプタマー」（または第二のアプタマー）の４０量体の中心領域は、約３７％〜約５８％のＧＣ含量（または約３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７または５８％のＧＣ含量）を含んでいる。「検出アプタマー」（または第二のアプタマー）は、その評定タンパク質に対して約０．３ｎＭ〜約１３．１ｎＭ（０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．２、１０．４、１０．６、１０．８、１１、１１．２、１１．４、１１．６、１１．８、１２、１２．２、１２．４、１２．６、１２．８、１３、１３．２、１３．４、１３．６、１３．８または１４ｎＭ）の結合親和性を有している。
要約すると、タンパク質分析物のサンドイッチアッセイに適した機能的アプタマー対が同定された。記録されたＳＥＬＥＸプールから既存のアプタマーを選定することは、標的・アプタマー複合体を用いる第二のＳＥＬＥＸを適用する手法と組み合わせることは、修飾ヌクレオチドの異なる種類を使用すると、異なる種類の修飾ヌクレオチドの使用が標的を結合できるアプタマー対の同定を可能にするとの考えを支持している。アプタマーサンドイッチアッセイにおいて、非特異的結合のバックグラウンドは、特異的及び非特異的なアプタマーとの間のオフ速度差の結果として減少する。この特徴は、２試薬サンドイッチ型測定に固有の追加された特異性と組み合わされることにより、高い特異性と高い多重化能力を備えたアッセイの開発のための基礎を提供する。アプタマー対は、機器の大規模な設置ベースが所定の位置に既にある医療診断の様々な分野において、具体的なパネルの開発に向けた有望性を有している。
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Claims (14)

  1. 第一のアプタマー、第二のアプタマー及び標的を含んでなる組成物であって、
    前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含んでおり、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含んでおり、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキーム及び前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは異なり、
    前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）を含み、
    また前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー及び前記標的は三元複合体を形成できる、前記組成物。
  2. 試料中の標的を検出するための方法であって：該方法は、
    ａ）第一のアプタマーと試料を接触させて混合物を形成すること、ここでの前記第一のアプタマーは前記標的と結合して第一の複合体を形成できる；
    ｂ）前記混合物を、前記第一の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること；
    ｃ）前記混合物を第二のアプタマーと接触させること、ここでの該第二のアプタマーは前記第一の複合体と結合して第二の複合体を形成できる；
    ｄ）前記混合物を、前記第二の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること；
    ｅ）前記混合物中における前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的、前記第一の複合体または前記第二の複合体の存在または不存在を検出すること、ここで前記第一のアプタマー、前記第二のアプタマー、前記標的、前記第一の複合体または前記第二の複合体の存在が、前記サンプル中の前記標的の存在を示すこと
    を含んでなり、
    前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）を含み、また前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームと前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームが異なっている、前記方法。
  3. ａ）標的を第一のアプタマーと接触させて混合物を形成すること、ここでの該第一のアプタマーは前記標的に結合して第一の複合体を形成できる；
    ｂ）前記混合物を、前記第一の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることと；
    ｃ）前記混合物を第二のアプタマーと接触させること、ここでの該第二のアプタマーは前記標的と結合して第二の複合体を形成できる；
    ｄ）前記混合物を、第二の複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすること；
    ｅ）前記混合物中における前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーの存在または不存在を検出すること、ここで前記混合物中における前記第一のアプタマー及び第二のアプタマーの両者の存在によって、前記標的への前記第一のアプタマーの結合及び前記標的への前記第二のアプタマーの結合が非競争的であることが示されること
    を含んでなり、
    ここで前記第一のアプタマーは第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第二のアプタマーは第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームを含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）を含み、前記第一のＣ−５ピリミジン修飾スキームと第Ｃ−５ピリミジン修飾スキームが異なる、方法。
  4. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第一のアプタマーは前記標的についての結合親和性を有し、且つ前記第二のアプタマーについては親和性を有さない、前記組成物または方法。
  5. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第二のアプタマーは前記標的についての結合親和性を有し、且つ前記第一のアプタマーについては親和性を有さない、前記組成物または方法。
  6. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第二のアプタマーは、前記第一のアプタマーと前記標的との結合により形成された複合体に対して結合親和性を有する、前記組成物または方法。
  7. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記標的の前記第一のアプタマー結合領域と前記標的の前記第二のアプタマー結合領域は異なる領域である、前記組成物または方法。
  8. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーは、独立に、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組み合わせを含んでなる、前記組成物または方法。
  9. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第一のアプタマー及び前記第二のアプタマーのパーセントＧＣ含量は、独立に、約３７％〜約５８％である、前記組成物または方法。
  10. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第一のアプタマーは、約９〜約１６のＣ−５修飾されたピリミジンを含む、前記組成物または方法。
  11. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第二のＣ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−［Ｎ−（２−チオフェン−メチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（４−フルオロベンジル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ａ］フラン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−［Ｎ−（３，４−メチレンジオキシベンジル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｒ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＲＴＨｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｓ）−２−テトラヒドロフリル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＳＴＨＦｄＵ）、５−（Ｎ−２−イミダゾリルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｉｄｄＵ）、５−［Ｎ−（１−モルホリノ−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＯＥｄＵ）及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンを含む、前記組成物または方法。
  12. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、前記第二のアプタマーは約５〜約１５のＣ−５修飾されたピリミジンを含んでなる、前記組成物または方法。
  13. 請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法であって、第二のアプタマーの各ウラシルまたはチミンは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−フェネチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５−［Ｎ−（フェニル−３−プロピル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５−［Ｎ−（２−チオフェンメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、塩化５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（２−ナフチルエチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン ２ＮＥｄＵ）、５−［Ｎ−（４−フルオロベンジル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５−［Ｎ−（３−ベンゾ［ａ］フラン−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５−［Ｎ−（３，４−メチレンジオキシベンジル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｒ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＲＴＨｄＵ）、５−［Ｎ−（（Ｓ）−２−テトラヒドロフリルメチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＳＴＨＦｄＵ）、５−（Ｎ−２−イミダゾリルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｉｄｄＵ）、５−［Ｎ−（１−モルホリノ−２−エチル）カルボキサミド］−２’−デオキシウリジン（ＭＯＥｄＵ）からなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジンである、前記組成物または方法。
  14. 前記第二の第Ｃ−５ピリミジン修飾スキームは、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキサミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−［Ｎ−（１−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）および５−［Ｎ−（２−ナフチルメチル）カルボキシアミド］−２’−デオキシウリジン（２−ＮａｐｄＵ）からなる群から選択されるＣ−５修飾されたピリミジン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物、または請求項２もしくは３に記載の方法。
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