CN114703193A

CN114703193A - 多适配子靶标检测

Info

Publication number: CN114703193A
Application number: CN202210264586.7A
Authority: CN
Inventors: U·A·奥克斯纳; L·S·格林; L·戈尔德; N·亚尼奇
Original assignee: Private Placement Protein Body Operation Co ltd
Current assignee: Private Placement Protein Body Operation Co ltd
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2014-09-24
Publication date: 2022-07-05
Also published as: EP3049523A1; AU2014326975A1; CN105555957A; KR20160058777A; BR112016005957A2; MX361451B; IL244284B; KR102348283B1; MX2016003320A; HK1218765A1; US10392621B2; IL244284A0; AU2014326975A2; WO2015048084A1; US20180187197A1; AU2014326975B2; EP3049523A4; SG11201602063UA; US20160237435A1; US9926566B2

Abstract

本申请涉及多适配子靶标检测，描述了包含能够形成三元复合物的第一适配子、第二适配子和靶标的组合物及制备和使用此类组合物的方法，并且其中所述第一适配子和所述第二适配子包含不同的C‑5嘧啶修饰方案。

Description

多适配子靶标检测

本申请是2014年9月24日提交的发明名称为“多适配子靶标检测”的中国专利申请201480051210.1的分案申请。

相关申请案

本申请案依据美国法典第35篇第119条(e)款(35U.S.C.§119(e))要求2013年9月24日提交的美国临时申请案序列号61/881,629的优先权。这些参考文献中的每一篇均通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开总体上涉及核酸配体领域，更具体地，涉及基于适配子对的靶标检测；包含适配子对和靶标的组合物；及制备和使用此类组合物的方法。

2014年9月24日创建的标题为“序列表.txt”，大小为2kb的序列表通过引用整体并入本文。

背景技术

蛋白质诊断法具有广泛的临床应用并且用于测定蛋白质组学标记或疾病特异性生物标志物。这些诊断法通常需要多对分析物特异性试剂以捕获和检测所需靶标(例如，蛋白质)。抗体已经广泛地用作诊断试剂；然而其可能难以以足够的质量和数量获得，并且在试验多种靶标时仅允许有限的复用。进一步地，由于其固有交叉反应性和非通用的测定条件，其在用于复用或高含量蛋白质组学应用的阵列上有限。

与抗体相反，基于核酸的配体具有几个优于抗体的优点，包括低分子量、热和干燥稳定性、可逆性复性、易于生产和成本更低。然而，至今仅存在由两个不同适配子结合的分析物的几个实例。例如，已经描述了用于凝血酶的纤维蛋白原识别和肝素结合外位点(exosite)的分离DNA适配子，并且这两种适配子，TBA1(15聚体)和TBA2(29聚体)，由与凝血酶上离散的正电性表面结合的G-四链体基序组成。已经开发了具有TBA1和TBA2的夹心测定法用于潜在凝血酶监测，包括适配子微阵列和荧光传感平台。另一实例为整联蛋白α_Vβ₃，对其而言已经用α_Vβ₃或α_IIbβ₃经由连续选择生成了α_V或β₃亚基的RNA适配子。还已报道了TATA结合蛋白(TBP)、朊病毒蛋白(PrP)和VEGF-165的适配子对。用于检测蛋白质靶标的适配子对的数量有限很可能是适配子倾向与将最佳配体推动到公共表面的主要为阴离子型的表位结合的结果。因此，总体上一直需要特殊选择方法来促使对非重叠表位的选择。

因此，仍然需要以改进的、有成本效益且有效的方式检测靶蛋白的可选组合物和方法。本公开通过提供包含在其5-位经修饰的脱氧尿苷残基的，用于蛋白质检测的慢解离率(slow off-rate)适配子(SOMAmer)试剂对的新型组合满足了此类需要，与常规适配子相比这既扩大了蛋白质靶标的范围又改善了结合性质。

发明内容

本公开描述了一种包含第一适配子、第二适配子和靶标的组合物，其中所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案不同；并且其中所述第一适配子、第二适配子和所述靶标能够形成三元复合物。

在本公开的另一方面，所述第一适配子对所述靶标而非所述第二适配子具有结合亲和力。

在本公开的另一方面，所述第二适配子对所述靶标而非所述第一适配子具有结合亲和力。

另一方面，所述第二适配子对通过所述第一适配子与所述靶标的缔合而形成的复合物具有结合亲和力。

另一方面，所述靶标的第一适配子结合区域和所述靶标的第二适配子结合区域为不同区域。在一个相关方面，所述第一适配子和所述第二适配子在所述靶标上具有非竞争性结合位点。

另一方面，所述第一适配子和所述第二适配子独立地包含RNA、DNA或其组合。

另一方面，C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-[N-(苯基-3-丙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(PPdU)、5-[N-(2-噻吩-甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(ThdU)(也称为5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-[N-(1-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NEdU)、5-[N-(2-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2NEdU)、5-[N-(4-氟苄基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(FBndU)、5-[N-(4-羟基苯基-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-[N-(3-苯并[b]噻吩-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BTdU)、5-[N-(3-苯并[a]呋喃-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BFdU)、5-[N-(3,4-亚甲基二氧苄基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MBndU)、5-[N-((R)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(RTHdU)、5-[N-((S)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(STHFdU)、5-(N-2-咪唑基乙基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImiddU)、5-[N-(1-吗啉代-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MOEdU)及其组合。

在另一相关方面，所述第一C-5嘧啶修饰方案包括5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

另一方面，所述第一适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷。在一个相关方面，所述第一适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

另一方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-(N-[1-萘甲基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-(N-[2-萘甲基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷及其组合。在一个相关方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。在再一相关方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。

另一方面，所述第二适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷。在一个相关方面，所述第二适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

另一方面，所述第一适配子和第二适配子的GC含量百分比独立地为约37％至约58％(或约37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％或58％)。

另一方面，所述第一适配子包含约9个至约16个(或约9、10、11、12、13、14、15或16个)C-5修饰的嘧啶。

另一方面，所述第二适配子包含约5个至约15个C-修饰的嘧啶(或约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个)。

另一方面，所述第一适配子和所述第二适配子的长度独立地各为约20至100个核苷酸(或长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸)。在一个相关方面，所述第一适配子和所述第二适配子的长度独立地为约40至约100个核苷酸(或长度为40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸)。

另一方面，所述第一适配子和/或所述第二适配子还包含可检测部分。在一个相关方面，所述可检测部分选自染料、量子点、放射性标记、电化学官能团、酶、酶底物、配体和受体。

另一方面，所述靶标包含蛋白质或肽。在一个相关方面，所述靶标为选自以下的蛋白质：ANGPT2、TSP2、CRDL1、MATN2、GPVI、ESAM、C7、PLG、MMP-12、NPS-PLA2和CdtA。

另一方面，所述三元复合物的解离常数(K_d)为至少0.02nM，或约0.01nM至约10nM，或约0.02nM至约6nM(或为约0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6nM)，或约0.02nM至约3nM(或为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.34、0.36、0.38、0.4、0.42、0.44、0.46、0.48、0.5、0.52、0.54、0.56、0.58、0.6、0.62、0.64、0.66、0.68、0.7、0.72、0.74、0.76、0.78、0.8、0.82、0.84、0.86、0.88、0.9、0.92、0.94、0.96、0.98、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3nM)。

本公开还描述了一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：使所述样品与第一适配子接触以形成混合物，其中所述第一适配子能够与所述靶标结合形成第一复合物；在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；使所述混合物与第二适配子接触，其中所述第二适配子能够结合所述第一复合物形成第二复合物；在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；检测所述混合物中所述第一适配子、所述第二适配子、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在或不存在，其中所述第一适配子、所述第二适配子、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在表明所述样品中存在所述靶标；并且其中，所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案不同。

一方面，本公开还提出本文公开的任何方法均可任选地经受或包括动力学激发。另一方面，本文所述的方法还包括添加竞争分子、稀释步骤或一次或多次洗涤以提高所述适配子与所述靶标的结合亲和力。在一个相关方面，所述竞争分子选自寡核苷酸、肝素、鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、硫酸葡聚糖、聚阴离子、无碱基磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸盐。另一方面，动力学激发包括稀释含有本文所述任何复合物的混合物，并且孵育含有所述适配子亲和性复合物的混合物选自大于或等于30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、30分钟和60分钟的时间。另一方面，动力学激发包括稀释含有所述适配子亲和性复合物的混合物并且孵育含有所述适配子亲和性复合物的混合物一段时间，使得测得的适配子亲和性复合物水平与测得的非特异性复合物水平的比例增大。

另一方面，检测样品中的靶标的方法包括使所述样品同时与所述第一和第二适配子接触，在允许形成包含所述靶标及第一和第二适配子的复合物的条件下孵育所述混合物，并且检测所述混合物中所述第一适配子、所述第二适配子、所述靶标或所述复合物的存在或不存在，其中所述第一适配子、所述第二适配子或所述复合物的存在表明所述样品中存在所述靶标。

另一方面，第一和第二适配子两者可独立地与所述靶标形成复合物。具体地，第二适配子可与单独的靶标以及与第一适配子和靶标之间的复合物形成复合物。

另一方面，所述第一适配子对所述靶标而非所述第二适配子具有结合亲和力。

另一方面，所述第二适配子对所述靶标而非所述第一适配子具有结合亲和力。

另一方面，所述第二适配子对第一复合物具有结合亲和力。

另一方面，第一C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷及其组合。在一个相关方面，第一C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。在再一相关方面，第一C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)及其组合。在另一相关方面，第一C-5嘧啶修饰方案包括5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

另一方面，所述第一适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷和5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷。在一个相关方面，所述第一适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

另一方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷及其组合。在一个相关方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。在再一相关方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。

另一方面，所述第一适配子和所述第二适配子的长度独立地各为20至100个核苷酸(或长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸)。在一个相关方面，所述第一适配子和所述第二适配子的长度独立地为约40至约100个核苷酸(或长度为40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸)。

另一方面，所述第二复合物的解离常数(K_d)为至少0.02nM，或约0.01nM至约10nM，或约0.02nM至约6nM(或为约0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6nM)，或约0.02nM至约3nM(或为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.34、0.36、0.38、0.4、0.42、0.44、0.46、0.48、0.5、0.52、0.54、0.56、0.58、0.6、0.62、0.64、0.66、0.68、0.7、0.72、0.74、0.76、0.78、0.8、0.82、0.84、0.86、0.88、0.9、0.92、0.94、0.96、0.98、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3nM)。

另一方面，所述第一复合物的解离常数(K_d)为约0.04nM至约5nM(或为0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5nM)，或约0.04nM至约4.8nM(或约0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7或4.8)。

另一方面，所述第二适配子和所述靶标的解离常数(K_d)为约0.03nM至约14nM(或为0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.2、11.4、11.6、11.8、12、12.2、12.4、12.6、12.8、13、13.2、13.4、13.6、13.8或14nM)。

本公开还描述了一种方法，其包括使靶标与第一适配子接触以形成混合物，其中所述第一适配子能够与所述靶标结合形成第一复合物；在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；使所述混合物与第二适配子接触，其中所述第二适配子能够结合所述靶标形成第二复合物；在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；检测所述混合物中所述第一适配子和所述第二适配子的存在或不存在，其中所述混合物中所述第一适配子和第二适配子两者的存在表明所述第一适配子与所述靶标的结合和所述第二适配子与所述靶标的结合为非竞争性；并且其中，所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案不同。

另一方面，所述第二适配子对所述第一复合物具有结合亲和力。

另一方面，所述第一C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷及其组合。在一个相关方面，所述第一C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。在再一相关方面，所述第一C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)及其组合。在另一相关方面，所述第一C-5嘧啶修饰方案包括5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

另一方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷及其组合。在一个相关方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。在再一相关方面，所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)及其组合。

本公开还提供了一种包含第一适配子和/或第二适配子和靶蛋白的组合物，其中所述第一适配子和/或第二适配子和靶蛋白通过非共价相互作用结合。

从以下根据附图进行的详述看，本公开的前述和其它目的、特征和优点将变得更加明显。

附图说明

图1描绘了为蛋白质靶标分离和验证SOMAmer(经修饰的DNA适配子)对的总体策略。图1A示出了用于第一SELEX(或1st SELEX)中的游离靶标，在第一SELEX中使用经修饰的随机ssDNA文库来分离具有可直接筛选出多对非竞争性克隆的5'和3'固定区域的一组适配子。提供了每个适配子的40个核苷酸随机区域内可使用的代表性化学修饰(例如，缩写为Bn、Nap、Trp、PE、Try和2Nap)。如果不存在配对，则允许具有最佳结合性质的适配子与靶标形成复合物，然后复合物用于使用不同的经修饰的文库的第二SELEX(或2nd SELEX)中。然后筛选与靶标配对夹心结合的新的适配子克隆。图1B示出了用游离CdtA蛋白(库5551)或用CdtA–4758-6复合物(库5579)选择的序列模式和多拷贝序列的示意图；T＝2NapdU。用阴影指出与第一CdtA适配子4758-6的非竞争性结合。图1C示出了适配子与CdtA蛋白的平衡结合。在第二SELEX中用游离CdtA(5579-7至5579-21)与CdtA-4758-6的复合物在SELEX中获得克隆5551-81和5574-49。这项测定中最大结合分数(结合稳定水平)受Zorbax上靶标-适配子复合物的保留效率和有能力结合的适配子部分的影响。图1D和1E示出了在缺乏或存在100倍过量(10nM)的事先为CdtA生成的未标记竞争适配子4758-6时用放射性标记的5579-12(图1D)或5579-11(图1E)进行的CdtA结合测定。还使用CdtA和作为捕获剂已经预先固定在链霉亲和素珠粒上的生物素化4758-6测量了结合。图1F示出了在Luminex平台上使用4758-6作为与LumAvidin珠粒结合的捕获剂和单独适配子作为检测剂来筛选适配子对。所有适配子经合成制备成50-聚体并且在其5'-末端含有单个生物素以允许其固定在珠粒上，然后阻滞其与1mM生物素进一步结合，并且允许用链霉亲和素-藻红蛋白偶联物检测。图1G示出了用4758-6(25nM)作为捕获剂和5579-12(10nM)作为检测剂，或交换所述两种试剂进行的CdtA夹心测定。

图2A示出了使用链霉亲和素珠粒上的生物素化捕获适配子和放射性标记检测适配子，筛选单独适配子夹心对的平衡结合测定。图2B示出了在Luminex平台上区别竞争性与非竞争性结合的复用夹心筛选测定。每个适配子固定在不同LumAvidin珠粒类型上，并且汇合捕获珠粒来试验作为检测剂的单独适配子。图2C示出了在基于Luminex的复用测定中对16个CRDL1适配子的成对筛选，性能表示为最大信号百分比并且显示为热图。图2D和2E示出了在用SOMAmer 3362-61(其为SELEX期间用于与CRDL1形成复合物的序列)(图2D)或用SOMAmer 7575-2(其为新序列之一)(图2E)进行的Luminex夹心筛选测定中对16个CRDL1适配子作为捕获剂或检测剂的评价。对照包括其中用相同SOMAmer进行捕获和检测的测定(加下划线)。图2F示出了在对缓冲液中掺入的蛋白质(表28中列出的适配子)的Luminex测定中获得的夹心结合曲线。在所有情况下，将已经在夹心SELEX期间用于与靶标形成复合物的序列用作捕获剂，作为SELEX的结果而鉴定出的新克隆之一用作检测剂。最大信号(B_max下的RFU)分别为23046(ANGPT2)、16623(TSP2)、23349(CRDL1)、25586(MATN2)、26000(C7)、13927(GPVI)、7103(PLG)和3000(ESAM)。

图3示出了在基于板的夹心测定中所用的适配子对的K_d值。生物素化适配子作为捕获剂固定在链霉亲和素涂层板上，并且用作检测剂以用链霉亲和素-HRP偶联物进行标记。

具体实施方式

I.术语和方法

除非另外指出，否则技术术语根据常规用法使用。可在Benjamin Lewin，Genes V，1994年由Oxford University Press出版(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等(编)，TheEncyclopedia of Molecular Biology，1994年由Blackwell Science Ltd.出版(ISBN 0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers(编),Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference，1995年由VCH Publishers,Inc.出版(ISBN 1-56081-569-8)中找到分子生物学中常用术语的定义。

为了便于回顾本公开的各个实施方案，提供了以下对特定术语的解释：

适配子：术语适配子，如本文中所用，是指非自然存在的对靶分子具有所需作用的核酸分子。所需作用包括但不限于结合靶标，催化改变靶标，以修饰或改变靶标或靶标功能活性的方式与靶标反应，与靶标共价连接(如在自杀性抑制剂中)和促进靶标与另一种分子之间的反应。

类似物：术语类似物，如本文中所用，是指结构化学类似物以及功能化学类似物。结构化学类似物是具有与另一种化学化合物类似的结构，但是有一个或多个原子或官能团不同的化合物。这种不同可能是添加原子或官能团、缺乏原子或官能团、置换原子或官能团或其组合的结果。功能化学类似物是具有类似的化学、生物化学和/或药理学性质的化合物。术语类似物也可涵盖化合物的S和R立体异构体。

生物活性：术语生物活性，如本文中所用，是指可以影响生理或病理生理过程的一种或多种细胞间、细胞内或细胞外过程(例如，细胞间结合、配体-受体结合、细胞信号传导等)。

C-5修饰的嘧啶：C-5修饰的嘧啶，如本文中所用，是指在C-5位具有修饰的嘧啶。C-5修饰的嘧啶的实例包括美国专利第5,719,273、5,945,527、7,947,447号以及2014年2月27日提交的美国公开第2014/0058076号中描述的C-5修饰的嘧啶。本文提供了另外的实例。

竞争分子：竞争分子或竞争剂，可交换地用于指可与非靶分子形成非特异性复合物的任何分子。“竞争分子”或“竞争剂”是一群不同类型的分子或特定分子或一种分子。“多个竞争分子”或“多个竞争剂”是指多于一种这种类型的分子。竞争分子包括寡核苷酸、聚阴离子(例如，肝素、单链鲑鱼精DNA和葡聚糖(例如，硫酸葡聚糖))、无碱基磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸盐。在使用竞争剂的动力学激发情况下，竞争剂也可以是可与适配子形成非特异性复合物的任何分子。此类竞争分子包括聚阳离子(例如，精胺、亚精胺、聚赖氨酸和聚精氨酸)和氨基酸(例如，精氨酸和赖氨酸)。

共有序列：共有序列，如本文中所用，是指代表在经受序列比对的一系列核酸序列的每个位置发现的最经常观察到的核苷酸的核苷酸序列。

共价键：共价键或相互作用是指牵涉原子之间共用至少一对电子的化学键。

孵育：术语孵育(incubating)(或孵育(incubation))，如本文中所用，是指为促进预期结果而将组分放于一起的受控条件。例如，靶标(例如，蛋白质)和适配子可通过将其放在一起而孵育以促进适配子与靶标结合以形成复合物。另外的实例包括将所述复合物与第二适配子放在一起以孵育所述复合物和第二适配子以形成第二复合物(即，适配子-蛋白质-第二适配子)。用于孵育的受控条件包括温度、时间、pH、盐浓度和混合物的类型，其非限制性实例包括溶液、乳液、凝胶和泡沫。温度范围可为约21℃至约45℃(或为约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃)。优选地，温度为约28℃至约37℃(或为28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃)或约28℃或37℃。孵育时间可包括从约1分钟至约240分钟(或为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235或240分钟)。优选地，孵育时间为约15分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟或约210分钟。用于孵育的pH条件范围可为约5至约12(或为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5或12)。优选地，pH为约6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4或11.5)。上述一组特定条件为代表性而非限制性。进一步地，用于孵育的相同特定条件可用于本文公开的所有方法中或可在本文公开的方法的不同步骤变化。

抑制：术语抑制，如本文中所用，意指防止或减少肽或多肽表达到所述肽或多肽不再具有可测量活性或生物活性的程度；或降低肽或多肽的稳定性和/或降低或防止肽或多肽的活性到所述肽或多肽不再具有可测量活性或生物活性的程度。

动力学激发：动力学激发，如本文中所用，是指通过施加动压和利用该组复合物的组成部分的不同亲和力特征，包括解离速率，使适配子亲和性复合物从包括适配子亲和性复合物和非特异性复合物的此类复合物中富集的过程。动力学激发通常引起特异性增加，这是因为适配子-非靶标复合物与适配子-靶标复合物相比通常减少。如本文中所用，术语“动压”是指为复合物自然解离提供机会和/或抑制从复合物自然解离的分子再结合的手段。可通过添加竞争分子，或通过样品稀释，或通过在复合物与固相载体结合时充分洗涤，或通过本领域技术人员已知的任何其它方式施加动压。正如本领域普通技术人员将认识到那样，因为动力学激发通常依赖于适配子亲和性复合物和适配子-非靶标复合物的不同解离速率，所以选择动力学激发的持续时间使得在大幅减少适配子-非靶标复合物的数量的同时保持高比例的适配子亲和性复合物。为了使动力学激发有效，适配子亲和性复合物的解离速率优选地明显低于适配子-非靶标复合物的解离速率。因为可以选择包括特定性质的适配子，所以可将适配子亲和性复合物的组成部分设计为具有相当低的解离速率，即慢解离率。

经修饰的：术语经修饰的(或修饰的)及其任何变型，在关于寡核苷酸使用时，意指寡核苷酸的4种组成核苷酸碱基(即，A、G、T/U和C)的至少一种为自然存在的核苷酸的类似物或酯。

调节：术语调节，如本文中所用，意为通过相对于参考表达水平提高或降低其表达水平而改变肽、蛋白质或多肽的表达水平，和/或通过相对于参考稳定性和/或活性水平提高或降低其稳定性和/或活性水平而改变肽、蛋白质或多肽的稳定性和/或活性。

非共价键：非共价键或非共价相互作用是指不牵涉原子之间共用电子对的化学键或相互作用。非共价键或相互作用的实例包括氢键、离子键(静电键)、范德华力(van derWaals force)和疏水相互作用。

核酸：核酸，如本文中所用，是指含有DNA、RNA和/或其类似物的任何核酸序列并且可包括单链、双链和多链形式。术语“核酸”、“寡聚物”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可交换使用。

药学上可接受：药学上可接受，如本文中所用，意指通过联邦或国家政府的监管机构批准或在美国药典(U.S.Pharmacopoeia)或其它公认药典中列出用于动物中并且更特别是，用于人类中。

药学上可接受的盐：药学上可接受的盐或化合物(例如，适配子)的盐，如本文中所用，是指含有离子键并且通常是通过使所述化合物与酸或碱反应而生成的，适于向个体施用的产品。药学上可接受的盐可包括但不限于酸加成盐，包括盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、芳烷基磺酸盐、醋酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐；碱金属阳离子诸如Li、Na、K，碱土金属盐诸如Mg或Ca，或有机胺盐。

药物组合物：药物组合物，如本文中所用，是指包含适配子的呈适于向个体施用的形式的制剂。药物组合物通常配制为与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括但不限于口腔和肠胃外，例如静脉、皮内、皮下、吸入、局部、经皮、经粘膜和直肠施用。

SELEX：术语SELEX，如本文中所用，通常是指对以所需方式与靶分子相互作用，例如以高亲和力与蛋白质结合的核酸的选择；和那些所选核酸的扩增。SELEX可用于鉴定对特定靶分子具有高亲和力的适配子。术语SELEX和“SELEX过程”可交换使用。

序列同一性：序列同一性，如本文中所用，在两个或更多个核酸序列的情况下，是所述序列共有相同核苷酸位置的数量的函数(即，同一性％＝相同位置的数量/位置总数×100)，考虑到了空位的数量和需要引入以优化两个或更多个序列的比对的每个空位的长度。两个或更多个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可使用数学算法，诸如BLAST和Gapped BLAST程序在其默认参数下实现(例如，Altschul等，J.Mol.Biol.215:403,1990；还请参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST上的BLASTN)。对于序列比较而言，通常一个序列作为将测试序列与之比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如有必要则指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。例如，可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.,2:482,1981的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.,48:443,1970的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444,1988的相似性搜索方法，通过计算机化执行这些算法(Wisconsin遗传学软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)，或通过目测(通常参见，Ausubel,F.M.等，CurrentProtocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience出版(1987))，进行用于比较的序列的最佳比对。如本文中所用，在描述其序列与参考核苷酸序列至少(例如)约95％相同的核酸的同一性百分比时，其意图是除参考核酸序列的每100个核苷酸，所述核酸序列可包括多达5个点突变外，所述核酸序列与参考序列相同。换言之，为获得其序列与参考核酸序列至少约95％相同的所需核酸序列，可删去或用另外的核苷酸取代参考序列中多达5％的核苷酸，或可将参考序列中多达核苷酸总数的5％的一定数量的核苷酸插入参考序列中(本文称为插入)。参考序列为生成所需序列的这些突变可在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或介于那些末端位置之间的任何地方发生，单独散布在参考序列的核苷酸间或参考序列中的一个或多个连续基团中。

SOMAmer：术语SOMAmer，如本文中所用，是指具有改善的解离率特征的适配子。SOMAmer可替代地称为慢解离率修饰的适配子，并且可经由通过引用整体并入的标题为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利第7,947,447号中描述的改进SELEX方法选择。术语适配子和SOMAmer可交换使用。

间隔区序列：间隔区序列，如本文中所用，是指由与适配子核酸序列的5'-末端、3'-末端或5'-末端和3'-末端两处共价结合的小分子组成的任何序列。示例性间隔区序列包括但不限于聚乙二醇、烃链和提供连接共有区域，同时保持适配子结合活性的分子共价支架的其它聚合物或共聚物。在某些方面，间隔区序列可通过标准连键诸如末端3'或5'羟基、2'碳或碱基修饰诸如嘧啶的C5-位或嘌呤的C8位与适配子共价连接。

靶分子：靶分子(或靶标)，如本文中所用，是指核酸可按所需方式(例如，结合靶标，催化改变靶标，以修饰或改变靶标或靶标功能活性的方式与靶标反应，与靶标共价连接(如同在自杀性抑制剂中)和促进靶标与另一种分子之间的反应而对其起作用的任何化合物或分子。靶分子的非限制性实例包括蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、有毒物质、底物、代谢产物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养素、生长因子、细胞、组织、任何前述物质的任何部分或片段等。实际上任何化学或生物效应子均可为适合靶标。任何大小的分子均可用作靶标。也可按某种方式修饰靶标以增强靶标和核酸之间相互作用的可能性或强度。靶标也可包括特定化合物或分子的任何微小变化，诸如，在蛋白质的情况下，例如，其氨基酸序列上的变化、二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，诸如与并不实质上改变分子同一性的标记组分偶联。“靶分子”或“靶标”是能够与适配子结合的一类或一种分子或多分子结构的一组拷贝。“靶分子”或“靶标”是指一种以上此类分子组。

三元复合物：三元复合物，如本文中所用，是指至少两个适配子和靶标的复合物。在某些情况下，所述复合物可包含共价、非共价相互作用或共价和非共价相互作用的组合。

除非另有解释，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本公开所属领域中普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另外明确指出，否则单数术语“一”、“一种(个)”和“所述”包括复数指示物。“包含A或B”意为包括A或B，或包括A和B。应进一步理解，对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小及所有分子量或分子质量值均为近似值，并且是为了描述而提供的。

进一步地，将本文提供的范围理解为是该范围内所有值的简写。例如，将1至50的范围理解为包括来自于由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(除非上下文另外明确指出，否则还包括含其分数)组成的组的任何数字、数字组合或子范围。除非另有说明，否则将任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围理解为包括所述范围内任何整数的值并且，在适当的时候，包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。同样，除非另有说明，否则将本文关于任何物理特征，诸如聚合物亚基、大小或厚度叙述的任何数量范围理解为包括所述范围内的任何整数。如本文中所用，除非另有说明，否则“约”或“基本上由……组成”意为指示范围、值或结构的±20％。如本文中所用，术语“包括”和“包含”为开放性并且作为同义词使用。应理解术语一”和“一种(个)”如本文中所用，是指“一种或多种”所列举的组分。可选方案(例如，“或”)的使用应理解为意指可选方案的一种、两种或其任何组合。

虽然在本公开的实践或试验中可使用与本文所述类似或等效的方法和材料，但是下面描述的是合适的方法和材料。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入。如有冲突，以专利说明书，包括术语的定义为准。另外，所述材料、方法和实例仅为说明性而非旨在为限制性。

II.综述

在本公开的另一方面，本公开的第一适配子和第二适配子可包括多达约100个核苷酸、多达约95个核苷酸，多达约90个核苷酸、多达约85个核苷酸、多达约80个核苷酸、多达约75个核苷酸、多达约70个核苷酸、多达约65个核苷酸、多达约60个核苷酸、多达约55个核苷酸、多达约50个核苷酸、多达约45个核苷酸、多达约40个核苷酸、多达约35个核苷酸、多达约30个核苷酸、多达约25个核苷酸和多达约20个核苷酸。

在本公开的另一方面，与无第一C-5嘧啶修饰方案的第一适配子相比，第一C-5嘧啶修饰方案改善了第一适配子的解离率或解离速率。另一方面，与无第二C-5嘧啶修饰方案的第二适配子相比，第二C-5嘧啶修饰方案改善了第二适配子的解离率或解离速率。

在本公开的另一方面，第一适配子可与另一适配子的另一核酸序列至少约95％相同、至少约90％相同、至少约85％相同、至少约80％相同或至少约75％相同。在本公开的另一方面，第二适配子可与另一适配子的另一核酸序列至少约95％相同、至少约90％相同、至少约85％相同、至少约80％相同或至少约75％相同。

另一方面，第一或第二适配子与靶标或靶标/适配子复合物的K_d为约1nM至约100nM(或为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100nM)。

另一方面，K_d为约4nM至约10nM(或为4、5、6、7、8、9或10nM)。

在本公开的另一方面，第一适配子和/或第二适配子对靶标或靶标/适配子复合物具有为约10nM或更小的解离常数(K_d)。在另一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约15nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约20nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约25nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约30nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约35nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约40nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约45nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有为约50nM或更小的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有在约3-10nM范围内(或为3、4、5、6、7、8、9或10nM)的解离常数(K_d)。再一示例性实施方案中，第一适配子和/或第二适配子对靶蛋白具有在约0.02nM至约3nM范围内(或为0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2、0.22、0.24、0.26、0.28、0.3、0.32、0.34、0.36、0.38、0.4、0.42、0.44、0.46、0.48、0.5、0.52、0.54、0.56、0.58、0.6、0.62、0.64、0.66、0.68、0.7、0.72、0.74、0.76、0.78、0.8、0.82、0.84、0.86、0.88、0.9、0.92、0.94、0.96、0.98、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3nM)的解离常数(K_d)。

可用结合测定，使用多点滴定并且如本文所述拟合方程式y＝(最大值-最小值)(蛋白质)/(K_d+蛋白质)测定合适的解离常数。应理解解离常数的测定高度取决于其测量条件并且因此这些数字可相对于诸如平衡时间等因子显著变化。

在本公开的另一方面，第一适配子和/或第二适配子包含选自以下时间的从靶标解离的速率(t_1/2)：≥约15分钟、≥约30分钟、≥约60分钟、≥约90分钟、≥约120分钟、≥约150分钟、≥约180分钟、≥约210分钟和≥约240分钟。

本公开还提供了包含第一适配子和第二适配子的试剂盒，其中所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案不同；并且其中所述第一适配子对靶标具有结合亲和力，而第二适配子对靶标和/或与靶标结合的第一适配子具有结合亲和力。

另一方面，第一适配子对靶标而非第二适配子具有结合亲和力。

另一方面，第二适配子对靶标而非第一适配子具有结合亲和力。

另一方面，第二适配子对通过第一适配子与靶标的缔合而形成的复合物具有结合亲和力。

另一方面，第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷及其组合。在一个相关方面，第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。在再一相关方面，第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。

本公开还提出本文公开的任何方法均可任选地经受或包括动力学激发。另一方面，本文所述的方法还包括添加竞争分子、稀释步骤或一次或多次洗涤以提高所述适配子与所述靶标的结合亲和力。在一个相关方面，所述竞争分子选自寡核苷酸、肝素、鲱鱼精DNA、鲑鱼精DNA、硫酸葡聚糖、聚阴离子、无碱基磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸盐。另一方面，动力学激发包括稀释含有本文所述任何复合物的混合物，并且孵育含有所述适配子亲和性复合物的混合物选自大于或等于30秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、30分钟和60分钟的时间。另一方面，动力学激发包括稀释含有所述适配子亲和性复合物的混合物并且孵育含有所述适配子亲和性复合物的混合物一段时间，使得测得的适配子亲和性复合物水平与测得的非特异性复合物水平的比例增大。

本公开描述了一种包含第一适配子、第二适配子和靶标的组合物，其中所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案相同并且其中所述第一适配子、第二适配子和所述靶标能够形成三元复合物。

本公开还描述了一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：使所述样品与第一适配子接触以形成混合物，其中所述第一适配子能够与所述靶标结合形成第一复合物；在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；使所述混合物与第二适配子接触，其中所述第二适配子能够结合所述第一复合物形成第二复合物；在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；检测所述混合物中所述第一适配子、所述第二适配子、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在或不存在，其中所述第一适配子、所述第二适配子、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在表明所述样品中存在所述靶标；并且其中，所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案相同。

本公开还描述了一种方法，其包括使靶标与第一适配子接触以形成混合物，其中所述第一适配子能够与所述靶标结合形成第一复合物；在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；使所述混合物与第二适配子接触，其中所述第二适配子能够结合所述靶标形成第二复合物；在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；检测所述混合物中所述第一适配子和所述第二适配子的存在或不存在，其中所述混合物中所述第一适配子和第二适配子两者的存在表明所述第一适配子与所述靶标的结合和所述第二适配子与所述靶标的结合为非竞争性；并且其中，所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案相同。

另一方面，第一适配子能够结合选自ANGPT2、TSP2、CRDL1、MATN2、GPVI、ESAM、C7、PLG、MMP-12、NPS-PLA2和CdtA的蛋白质。

另一方面，第二适配子能够结合选自ANGPT2、TSP2、CRDL1、MATN2、GPVI、ESAM、C7、PLG、MMP-12、NPS-PLA2和CdtA的蛋白质。

另一方面，第一适配子、第二适配子和靶标形成三元复合物，其中所述第一适配子在靶标的第一区域中结合靶标，而第二适配子在靶标的第二区域中结合靶标，其中所述靶标的第一区域和第二区域为重叠或非重叠区域。

另一方面，所述组合物包含第一适配子、第二适配子和靶标，其中所述第一适配子、第二适配子和所述靶标能够形成三元复合物，并且其中所述第一适配子和第二适配子的长度独立地为约40至约50个核苷酸，并且第一适配子包含C-5修饰的嘧啶且第二适配子包含C-5修饰的嘧啶，其中所述C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-[N-(苯基-3-丙基)羧酰胺]-2’-脱氧尿苷(PPdU)、5-[N-(2-噻吩-甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(ThdU)(也称为5-(N-硫苯甲基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-[N-(1-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NEdU)、5-[N-(2-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2NEdU)、5-[N-(4-氟苄基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(FBndU)、5-[N-(4-羟基苯基-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-[N-(3-苯并[b]噻吩-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BTdU)、5-[N-(3-苯并[a]呋喃-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BFdU)、5-[N-(3,4-亚甲基二氧苄基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MBndU)、5-[N-((R)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(RTHdU)、5-[N-((S)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(STHFdU)、5-(N-2-咪唑基乙基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImiddU)、5-[N-(1-吗啉代-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MOEdU)，并且其中所述第一适配子的C-5修饰的嘧啶和所述第二适配子的C-5修饰的嘧啶是不同的C-5修饰的嘧啶。

另一方面，所述组合物包含第一适配子、第二适配子和靶标，其中所述第一适配子、第二适配子和所述靶标能够形成三元复合物，并且其中所述第一适配子和第二适配子的长度独立地为约40至约50个核苷酸，并且第一适配子包含C-5修饰的嘧啶且第二适配子包含C-5修饰的嘧啶，其中所述C-5修饰的嘧啶选自5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)、5-[N-(苯基-3-丙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(PPdU)、5-[N-(2-噻吩-甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-[N-(1-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NEdU)、5-[N-(2-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2NEdU)、5-[N-(4-氟苄基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(FBndU)、5-[N-(4-羟基苯基-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(TyrdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-[N-(3-苯并[b]噻吩-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BTdU)、5-[N-(3-苯并[a]呋喃-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BFdU)、5-[N-(3,4-亚甲基二氧苄基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MBndU)、5-[N-((R)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(RTHdU)、5-[N-((S)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(STHFdU)、5-(N-2-咪唑基乙基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImiddU)、5-[N-(1-吗啉代-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MOEdU)，并且其中所述第一适配子的C-5修饰的嘧啶和所述第二适配子的C-5修饰的嘧啶是相同的C-5修饰的嘧啶。

另一方面，在允许形成第一复合物的条件下孵育第一适配子和靶标的混合物。这些条件包括为约10:1的靶标(例如，蛋白质)与第一适配子比例。靶标与第一适配子的可选比例包括约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1:10。所述条件还包括约37℃的温度。可选温度包括室温(或约21℃)或约21℃至约37℃(或为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃)。所述条件还包括在前面提到的比例和温度条件下的孵育时间，包括约30秒至约72小时(或为约30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3,小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、44小时、48小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时或72小时)。

另一方面，在允许形成第二复合物的条件下孵育第二适配子和靶标或第二适配子和第一复合物的混合物。这些条件包括为约10:1的靶标(例如，蛋白质)或第一复合物与第二适配子比例。靶标或第一复合物与第二适配子的可选比例包括约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1:10。所述条件还包括约37℃的温度。可选温度包括室温(或约21℃)或约21℃至约37℃(或为21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃)。所述条件还包括在前面提到的比例和温度条件下的孵育时间，包括约30秒至约72小时(或为约30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、3,小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、15小时、20小时、24小时、30小时、36小时、40小时、44小时、48小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时或72小时)。

另一方面，通过选自放射性标记过滤结合测定和基于荧光珠粒的Luminex测定的方法测定结合亲和力(或K_d)。

本公开还描述了一种方法，其包括：使第一适配子与固相载体接触，其中所述第一适配子包含接头和标签，其中所述标签能够与固相载体结合；使靶标与第一适配子接触，其中所述第一适配子对靶标具有结合亲和力，并且所述第一适配子结合靶标形成第一复合物；使第一复合物与多种适配子接触，其中所述多种适配子中的至少一种适配子结合第一复合物形成第二复合物；将第二复合物与剩余的多个适配子分隔开；解离第二复合物；扩增所述至少一种适配子；并且鉴定能够结合第一复合物的所述至少一种适配子。

本公开还描述了一种方法，其包括：使第一适配子与固相载体接触，其中所述第一适配子包含接头和标签，其中所述标签能够与固相载体结合；使靶标与第一适配子接触，其中所述第一适配子对靶标具有结合亲和力，并且所述第一适配子结合靶标形成第一复合物；使第一复合物与多种适配子接触，其中所述多种适配子中的一种或多种适配子结合第一复合物形成第二复合物；将第二复合物与剩余的多种适配子分隔开；解离第二复合物；扩增所述一种或多种适配子并且鉴定能够结合第一复合物的所述一种或多种适配子。

本公开还描述了一种方法，其包括：使第一适配子与固相载体接触，其中所述第一适配子包含接头和标签，其中所述标签能够与固相载体结合；使靶标与第一适配子接触，其中所述第一适配子对靶标具有结合亲和力，并且所述第一适配子结合靶标形成第一复合物；使第一复合物与多种适配子接触以形成第二复合物，其中所述第二复合物包含第一适配子、靶标和第二适配子；将第二复合物与剩余的多种适配子分隔开；解离第二复合物；扩增第二适配子并且鉴定能够结合第一复合物的第二适配子。

另一方面，第一适配子包含C-5修饰的嘧啶。

另一方面，所述至少一种适配子包含C-5修饰的嘧啶。

另一方面，多种适配子中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的适配子包含C-5修饰的嘧啶。

另一方面，所述标签结合固相载体。

另一方面，剩余的多个适配子对第一复合物具有比所述至少一种适配子低的结合亲和力。

另一方面，所述标签在第一适配子的5'-末端或3'-末端。

另一方面，所述接头为光可裂解接头。

另一方面，所述靶标选自蛋白质、肽、碳水化合物、糖蛋白、细胞和组织。

另一方面，第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述至少一种适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案相同或不同。

另一方面，第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述一种或多种适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案相同或不同。

另一方面，第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案相同或不同。

另一方面，所述至少一种适配子对靶标而非第一适配子具有结合亲和力。

另一方面，所述至少一种适配子结合第一复合物的靶标而非第一复合物的第一适配子。

另一方面，所述至少一种适配子结合第一复合物的靶标和第一适配子。

另一方面，所述一种或多种适配子对靶标而非第一适配子具有结合亲和力。

另一方面，所述一种或多种适配子结合第一复合物的靶标而非第一复合物的第一适配子。

另一方面，所述一种或多种适配子结合第一复合物的靶标和第一适配子。

另一方面，第二适配子结合第一复合物的靶标而非第一复合物的第一适配子。

另一方面，第二适配子结合第一复合物的靶标和第一适配子。

另一方面，所述固相载体选自显微镜载玻片、环烯烃共聚物基体、膜、塑料基体、顺磁珠、带电纸、尼龙(nylon)、朗缪尔-布洛杰特膜(Langmuir-Bodgett film)、玻璃、锗基体、硅基体、硅晶圆芯片、导流芯片、微珠、聚四氟乙烯基体、聚苯乙烯基体、砷化镓基体、金基体和银基体。

另一方面，所述固相载体为链霉亲和素珠粒。

另一方面，所述扩增步骤引起适配子的候选混合物形成。

另一方面，所述方法还包括使第一复合物与适配子的候选混合物接触以进一步选择对第一复合物具有结合亲和力的适配子。

本公开还提供了一种方法，其包括：a)使第一适配子与固相载体接触，其中所述第一适配子包含接头和标签，其中所述标签能够与固相载体结合；b)使靶标与第一适配子接触，其中所述第一适配子对靶标具有结合亲和力，并且所述第一适配子结合靶标形成第一复合物；c)使第一复合物与多种适配子接触以形成多种第二复合物，其中所述多种第二复合物中的每一种均包含第一适配子、靶标和第二适配子，并且其中所述多种第二复合物包含多种第二适配子；d)将所述多种第二复合物与所述多种适配子中的所述适配子分隔开，其中所述多种适配子中的至少一种适配子对第一复合物具有比所述多种第二复合物的至少一种第二适配子低的结合亲和力；e)解离所述多种第二复合物；f)扩增所述多种第二适配子以形成适配子的第一候选混合物；g)用适配子的第一候选混合物重复步骤a)至f)至少一次以形成适配子的第二候选混合物，或重复步骤a)至f)至少两次以形成适配子的第三候选混合物，或重复步骤a)至f)至少三次以形成适配子的第四候选混合物，或重复步骤a)至f)至少四次以形成适配子的第五候选混合物，或重复步骤a)至f)至少五次以形成适配子的第六候选混合物，或重复步骤a)至f)至少六次以形成适配子的第七候选混合物，或重复步骤a)至f)至少七次以形成适配子的第八候选混合物，或重复步骤a)至f)至少八次以形成适配子的第九候选混合物，或重复步骤a)至f)至少九次以形成适配子的第十候选混合物，或重复步骤a)至f)至少十次以形成适配子的第十一候选混合物，或重复步骤a)至f)至少十一次以形成适配子的第十二候选混合物，或重复步骤a)至f)至少十二次以形成适配子的第十三候选混合物，或重复步骤a)至f)至少十三次以形成适配子的第十四候选混合物，或重复步骤a)至f)至少十四次以形成适配子的第十五候选混合物，或重复步骤a)至f)至少十五次以形成适配子的第十六候选混合物及h)鉴定所述多种第二适配子中能够结合第一复合物的适配子的至少一种。

本公开还提供了一种方法，其包括：a)使第一适配子与固相载体接触，其中所述第一适配子包含接头和标签，其中所述标签能够与固相载体结合；b)使靶标与第一适配子接触，其中所述第一适配子对靶标具有结合亲和力，并且所述第一适配子结合靶标形成第一复合物；c)使第一复合物与多种适配子接触以形成多种第二复合物，其中所述多种第二复合物中的每一种均包含第一适配子、靶标和第二适配子，并且其中所述多种第二复合物包含多种第二适配子；d)将所述多种第二复合物与所述多种适配子中的所述适配子分隔开，其中所述多种适配子中的至少一种适配子对第一复合物具有比所述多种第二复合物的至少一种第二适配子低的结合亲和力；e)解离所述多种第二复合物；f)量化所述多种第二适配子以获得定量值；g)重复步骤a)至f)直至定量值与参考值之比保持不变或相对于先前重复步骤a)至f)的定量值与参考值之比降低，其中所述参考值基于量化暴露于步骤a)至f)的方法而无靶标的多种对照适配子；h)鉴定所述多种第二适配子中能够结合第一复合物的适配子的至少一种。

另一方面，所述标签为生物素。

A.SELEX

SELEX通常包括制备核酸的候选混合物，使候选混合物与所需靶分子结合以形成亲和性复合物，将亲和性复合物与未结合的候选核酸分开，将核酸从亲和性复合物分开并分离，纯化所述核酸，并鉴定特定适配子序列。该过程可包括多轮以进一步提高所选适配子的亲和力。该过程可包括在该过程中的一个或多个时刻的扩增步骤。参见，例如，标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利第5,475,096号。SELEX过程可用于生成共价结合其靶标的适配子以及非共价结合其靶标的适配子。参见，例如，标题为“Systematic Evolutionof Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX”的美国专利第5,705,337号。

SELEX过程可用于鉴定含有赋予适配子改善特征，诸如，改善的体内稳定性或改善的递送特征的经修饰的核苷酸的高亲和力适配子。此类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸和/或碱基位置上的化学取代。在标题为“High Affinity Nucleic Acid LigandsContaining Modified Nucleotides”的美国专利第5,660,985号中描述了经SELEX过程鉴定的含有经修饰的核苷酸的适配子，该专利中描述了含有在嘧啶的5'-和2'-位经化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。参见上文，美国专利第5,580,737号描述了含有一个或多个经2'-氨基(2'-NH₂)、2'-氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸的高度特异性适配子。还请参见，标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利第8,409,795号，其描述了具有扩展的物理化学性质的核酸文库及其在SELEX和photoSELEX中的用途。

SELEX也可用于鉴定具有所需解离率特征的适配子。参见，例如，标题为“Methodfor Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利第7,947,447号，其描述了生成可与靶分子结合的改进SELEX方法。如以上所提及，这些慢解离率适配子称为“SOMAmer”。描述了生成与其各自的靶分子解离的速率较慢的适配子或SOMAmer和光适配子或SOMAmer的方法。所述方法包括使候选混合物与靶分子结合，使得核酸-靶标复合物的形成发生，并且进行慢解离率富集过程，其中解离速率快的核酸-靶标复合物将解离并且不会重新形成，而解离速率慢的复合物将保持完好。另外，所述方法包括将经修饰的核苷酸用于生成候选核酸混合物以生成解离率性能改善的适配子或SOMAmer。

这种测定的变型采用含有使适配子能够共价结合或“光交联”其靶分子的光反应性官能团的适配子。参见，例如，标题为“Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”的美国专利第6,544,776号。这些光反应性适配子也称为光适配子。参见，例如，美国专利第5,763,177号、国专利第6,001,577号和美国专利第6,291,184号，其各自标题为“SystematicEvolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Photoselection ofNucleic Acid Ligands and Solution SELEX”，还请参见，例如，标题为“Photoselectionof Nucleic Acid Ligands”的美国专利第6,458,539号。在微阵列与样品接触并且光适配子已经有机会与其靶分子结合后，光活化光适配子，并且洗涤固相载体以去除任何非特异性结合的分子。因为与光适配子结合的靶分子，由于光适配子上的光活化官能团产生的共价键而通常未被去除，所以可使用苛刻的洗涤条件。

在这两种测定形式下，适配子或SOMAmer在与样品接触之前固定在固相载体上。然而，在某些情况下，适配子或SOMAmer在与样品接触之前固定可能未提供最佳测定。例如，适配子或SOMAmer的预先固定可引起适配子或SOMAmer与固相载体表面上的靶分子无效混合，可能导致超长的反应时间，并因此导致孵育期延长而容许适配子或SOMAmer与其靶分子有效结合。进一步地，当光适配子或photoSOMAmer用于测定中并且依赖于用作固相载体的材料时，固相载体可倾向于散射或吸收用于实现光适配子或photoSOMAmer与其靶分子之间共价键形成的光。而且，根据采用的方法，对与其适配子或photoSOMAmer结合的靶分子的检测可遭受不精确性，这是因为固相载体的表面也可暴露于使用的任何标记剂并受其影响。最后，适配子或SOMAmer固定在固相载体上通常牵涉在适配子或SOMAmer暴露于样品之前的适配子或SOMAmer制备步骤(即，固定)，并且这个制备步骤可影响适配子或SOMAmer的活性或功能性。

还已描述了容许SOMAmer在溶液中捕获其靶标，然后采用为在检测之前去除SOMAmer-靶标混合物的特定组分而设计的分离步骤的SOMAmer测定(参见标题为“Multiplexed Analyses of Test Samples”的美国专利第7,855,054号)。所述SOMAmer测定法使得能够通过检测和量化核酸(即，SOMAmer)而检测和量化试样中的非核酸靶标(例如，蛋白质靶标)。所述方法产生了用于检测和量化非核酸靶标的核酸替代物(即，SOMAmer)，从而允许各种各样的核酸技术，包括扩增，应用于更广泛的所需靶标，包括蛋白质靶标。

在标题为“Modified SELEX Processes Without Purified Protein”的美国专利第6,376,190号中描述了其中靶标为肽的SELEX过程的实施方案。

B.慢解离率适配子(SOMAmer)

慢解离率适配子(SOMAmer)已经改变了蛋白质组学、生物标志物发现和医疗诊断学领域。现在可以同时高精度测量一小份血清、血浆、CSF或组织裂解液样品(0.1mL)中>1000种蛋白质。这种高度复用测定(SOMAscan)的应用已导致发现了传染病、肺病、肿瘤疾病、心血管疾病、肾病和神经病中的生物标志物。SOMAmer与常规适配子相比，蛋白质靶标范围扩大并且结合性质改善，这是因为它们含有在其5-位经模拟氨基酸侧链的疏水性芳香族官能团修饰的脱氧尿苷残基。通过由多轮经动力学激发选择、分隔和扩增组成的SELEX过程(指数富集配体系统进化)在体外生成SOMAmer。

C.对适配子的化学修饰

适配子可含有改善性质和特征的经修饰的核苷酸。此类改善的非限制性实例包括体内稳定性、降解稳定性、对其靶标的结合亲和力和/或改善的递送特征。

此类修饰的实例包括在核苷酸的核糖和/或磷酸和/或碱基位置上的化学取代。在标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”的美国专利第5,660,985号中描述了经SELEX过程鉴定的含有经修饰的核苷酸的适配子，其描述了含有在嘧啶的5'-和2'-位经化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。参见上文，美国专利第5,580,737号描述了含有一个或多个经2'-氨基(2'-NH₂)、2'-氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸的高度特异性适配子。还请参见，标题为“SELEX andPHOTOSELEX”的美国专利第8,409,795号，其描述了具有扩展的物理化学性质的核酸文库及其在SELEX和photoSELEX中的用途。

C-5修饰的具体实例包括用独立地选自以下的取代基取代C-5位上的脱氧尿苷：苄基羧基酰胺(可选地，苄基氨基羰基)(Bn)、萘甲基羧基酰胺(可选地，萘甲基氨基羰基)(Nap)、色氨基羧基酰胺(可选地，色氨基羰基)(Trp)和异丁基羧基酰胺(可选地，异丁基氨基羰基)(iBu)，如下面立即所述。

C-5修饰的嘧啶的化学修饰也可单独地或以任何组合与2'-位糖修饰、环外胺上的修饰和4-硫尿核苷的取代组合。

代表性C-5修饰的嘧啶包括：5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷或5-(N-[l-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷。

若存在，可在多核苷酸组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分间断。可在聚合之后，诸如通过与标记组分偶联而进一步修饰多核苷酸。

可并入本公开的核酸序列中的经修饰的核苷酸(例如，C-5修饰的嘧啶)另外的非限制性实例包括以下：

R'定义如下：

并且，R”、R”'和R””定义如下：

其中

R””选自支链或直链低级烷基(C1-C20)；羟基(OH)、卤素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO₂H₂)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR”)；伯胺(CONH₂)；仲胺(CONHR”)；叔胺(CONR”R”')；磺胺(SO₂NH₂)；N-烷基磺胺(SONHR”)；

其中

R”、R”'独立地选自支链或直链低级烷基(C1-C20)；苯基(C₆H₅)；R””取代的苯环(R””C₆H₄)；其中R””定义如上；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR””')；其中R””'为支链或直链低级烷基(C1-C20)；和环烷基；其中R”＝R”'＝(CH₂)n；

其中n＝2-10。

进一步地，C-5修饰的嘧啶核苷酸包括以下：

X＝三磷酸

其中R选自以下部分之一：

为了命名的目的和举例，R基团定义为以上6a(或Bn)时，核苷酸命名为5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)；R基团定义为以上6f(或Nap)时，核苷酸命名为5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)和R基团定义为以上6h(或2Nap)时，核苷酸命名为5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)。

在一些实施方案中，经修饰的核苷酸赋予寡核苷酸以核酸酶抗性。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸选自化学式6a至6v。在C-5位有取代的嘧啶是经修饰的核苷酸的实例。修饰可包括骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合(诸如异碱基异胞苷和异胍)等。修饰还可包括3'和5'修饰，诸如帽化。其它修饰可包括经类似物取代一个或多个自然存在的核苷酸、核苷酸间修饰诸如经不带电的连键(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、亚磷酰胺、氨基甲酸酯等)的修饰和经带电连键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修饰、经插层剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的修饰、含插层剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的修饰、含烷化剂的修饰和经修饰的连键(例如，α异头核酸等)的修饰。进一步地，核苷酸的糖上通常存在的任何羟基均可被膦酸基团或磷酸基团置换；受标准保护基保护；或经活化以制备与附加核苷酸或固相载体的附加连键。5'和3'末端OH基团可经磷酸化或经胺、约1至约20个碳原子的有机帽化基团部分、聚乙二醇(在一个实施方案中范围为约10至约80kDa)、PEG聚合物(在另一个实施方案中范围为约20至约60kDa)或其它亲水性或疏水性生物或合成聚合物取代。在一个实施方案中，修饰为嘧啶的C-5位。这些修饰可通过直接在C-5位的酰胺连键或通过其它类型的连键产生。

多核苷酸也可含有本领域通常所知类似形式的核糖或脱氧核糖，包括2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-氟或2'-叠氮-核糖、碳环糖类似物、α-异头糖、差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物和无碱基核苷类似物(诸如甲基核糖苷)。如上所述，一个或多个磷酸二酯连键可被替代性连接基团置换。这些替代性连接基团包括其中磷酸经P(O)S(“硫代化物”)、

P(S)S(“二硫代化物”)、(O)NR₂(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中每个R或R'独立地为H或任选含有醚(-O-)连键的经取代或未经取代的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有连键均需要相同。取代类似形式的糖、嘌呤和嘧啶可有利于设计最终产物，例如，可选骨架结构如聚酰胺骨架也可以。

D.包含组合物的试剂盒

本公开提供了包含如本文所述的第一适配子和/或第二适配子的试剂盒。此类试剂盒可包含，例如，(1)第一适配子(例如，靶标捕获适配子)和/或第二适配子(例如，靶标检测适配子)；和(2)至少一种药学上可接受的载体，诸如溶剂或溶液。另外的试剂盒组分可任选地包括，例如：(1)本文鉴定的任何药学上可接受的赋形剂，诸如稳定剂、缓冲液等，(2)用于容纳和/或混合试剂盒组分的至少一个容器、小瓶或类似装置；和(3)递送装置。

提供以下实施例是为了说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限于所述特定特征或实施方案。

实施例

实施例1：材料和方法

该实施例提供了对用于选择并鉴定用于靶标(例如，蛋白质靶标)检测的DNA适配子对的一般材料和方法的概述。

用于SELEX的蛋白质。如所述，产生以重组、His₁₀标记形式的艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)二元毒素(CdtA)。以重组、标记形式可获得的人蛋白(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)包括血管生成素-2(产品目录号623-AN/CF)、TSP2(产品目录号1635-T2)、CRDL1(产品目录号1808-NR)、MATN2(产品目录号3044-MN/CF)、经His标记的GPVI(产品目录号3627-GP)和作为Fc-融合物的ESAM(产品目录号2688-EC)。从血浆中纯化的天然人蛋白包括C7(Quidel,San Diego,CA,USA，产品目录号A405)和纤溶酶原(Athens Research&Technology,Athens,GA,USA，产品目录号16-16-161200)；两者均如所述使用EZ-Link NHS-PEG4-生物素(Thermo,Rockford,IL,USA，产品目录号21329)生物素化。

适配子合成。使用经修饰的核苷酸，经由标准亚磷酰胺化学法制备在每个末端含有40-核苷酸靶标结合区域和5个核苷酸的截短合成适配子。AB-H 50聚体含有5'-生物素-dA六乙二醇间隔区以易于和链霉亲和素(SA)耦合和3'反向dT核苷酸(idT)以提高外切核酸酶稳定性。

菜单适配子(Menu Aptamer,SOMAmer)和夹心SELEX。已经经由SELEX分离作为所有蛋白质靶标的主要结合剂的菜单适配子并且如上所述制备AB-H 50-聚体。作为AB-H适配子的替代物，PBDC(具生物素和荧光团的光可裂解接头)用于经改进的SELEX过程中。通过在SB18T中加热3分钟至95℃并缓慢冷却至37℃而“加热-冷却”适配子以确保其正确复性。在平衡结合和拉下测定中确认活性。对于夹心SELEX而言，公开的选择方案经如下改进。在每轮SELEX之前立即使蛋白质与AB-H形式的同源菜单适配子复合。对于R1而言，将100μl的500nM蛋白质(50pmol)与5μl的5μM(25pmol)经加热-冷却的适配子混合并且在37℃下孵育30分钟以允许复合物形成。对于后续几轮而言，使用10μl的500nM蛋白质(5pmol)和2μl的5μM(10pmol)适配子(2倍过量)。在每轮SELEX中新鲜制备用于降低由于非特异性适配子间相互作用而产生的本底的特异性反向选择珠粒。简言之，向SB18T中40μl的2.5mg/ml SA珠粒中添加2μl的5μM(10pmol)经加热-冷却的AB-H适配子并振荡15分钟以允许固定。然后洗涤珠粒以去除残留的游离适配子，重新悬浮在50μl SB18T中并连同10μl Hexa-His(AnaSpec,Fremont,CA,USA，产品目录号24420)涂层珠粒或50μl SA珠粒或蛋白G珠粒一起根据下游分隔方法添加到反向选择板中。缓冲液SB18T(40mM HEPES pH 7.5、0.1M NaCl、5mM KCl、5mMMgCl₂、0.05％吐温-20(Tween-20))用于SELEX并用于所有后续结合测定。起始文库由1nmol(10¹⁴-10¹⁵个)含有40个连续随机位，两侧为用于PCR扩增的固定序列的经修饰DNA序列的序列组成。使用具有不同的经修饰的核苷酸的单独文库，包括5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-[2-萘甲基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(2NapdU)和5-(N-苯乙基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)。从第2轮SELEX开始继续进行用5mM硫酸葡聚糖动力学激发以利于慢解离率。用顺磁性

(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)，分别对于His标记蛋白使用His-标签2(产品目录号101-04D)，对于Fc-融合蛋白使用蛋白G(产品目录号100-04D)并且对于生物素化靶标使用MyOne链霉亲和素C1(产品目录号350-02D)珠粒实现靶标-适配子复合物的分隔。用高氯酸钠洗脱缓冲液(1.8M NaClO₄、40mM PIPES、1mM EDTA、0.05％Triton X-100，pH 6.8)从珠粒上洗脱所选DNA 5分钟，然后捕获在引物珠粒上并且经加工用于PCR和引入延伸以使用KOD XL DNA聚合酶获得具有经修饰的核苷酸的有义链。

对于改进的夹心SELEX而言，用结合主要PBDC适配子上的生物素-标签的链霉亲和素(SA)珠粒实现靶标-适配子复合物的分隔。这与基于AB-H适配子的SELEX相反，其中所述生物素-标签在靶标上。这种改进方法允许在夹心SELEX中使用未标记的靶标。经由从SA珠粒上光裂解(在不可见光下振荡7分钟，2次)三部分组成的复合物，而不是用高氯酸钠洗脱，收获选自所述文库的DNA适配子，并且经加工用于PCR和eDNA制备。

DNA测序和比较序列分析。使用PCR-Script Amp克隆试剂盒(Agilent,SantaClara,CA,USA，产品目录号211189)克隆在SELEX中获得的适配子库并且在ABI Prism3730(SeqWright,Houston,TX)上测定单个克隆的序列。使用定制、灵活比对算法，用模式同一性阈值＝0.5-0.9，家族集群截止值＝0.5-0.9，序列匹配阈值＝0.8和等效错配＝5，比较在用复合与游离蛋白质的SELEX中获得的适配子以鉴定常见模式。

平衡结合测定和竞争测定。首先评价在SELEX中分离的全长适配子及其合成、截短对应物与游离蛋白质的结合，再评价与预先形成的蛋白质-菜单适配子复合物(化学计量比1:1)的结合以在过滤结合测定中确定并比较平衡结合常数K_d。用Zorbax PSM-300A(Agilent,Santa Clara,CA,USA)实现复合物向尼龙膜上的有效分隔，除与GPVI的复合物外，其中改为使用

His-标签2(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA，产品目录号101-04D)。在竞争结合测定中进一步试验了夹心适配子候选物，其中在作为竞争剂的100倍过量(10nM)未标记菜单适配子的存在下，在一定浓度范围内(0.001nM至100nM)用靶蛋白孵育放射性标记适配子(～0.01nM)。

夹心过滤结合测定。进行过滤结合夹心测定的两种变型以获得12-pt结合曲线。第一种方法牵涉蛋白质和放射性标记、全长检测适配子的平衡结合，接着是用通过将AB-H菜单适配子固定在SA珠粒上制备的特异性捕获珠粒进行分隔(间歇性振荡30分钟)。第二种方法基于在蛋白质、放射性标记检测适配子(全长、非生物素化)和过量(10nM)未标记、AB-H菜单适配子平衡结合期间形成三部分组成的复合物，接着用SA珠粒分隔(间歇性振荡5分钟)。两种方法产生同等结果。作为对照，在忽略了捕获剂的单独测定中试验了所有序列，以鉴定由于SA珠粒结合产生的非特异性本底。从进一步分析中去除了这些克隆和由于捕获和检测适配子的直接相互作用而产生不可滴定的信号的序列。

复用夹心筛选测定。Luminex平台用于呈夹心结合形式的适配子(AB-H 50聚体)的复用、成对筛选。捕获珠粒制备和结合测定在经缓冲液SB17T(补充了1mM EDTA的SB18T)预湿的MSBVN12滤板(EMD Millipore Corp.,Billerica,MA,USA)中进行。将不同类型的

微球体(Luminex Corporation,Austin,TX，产品目录号L100-L101-01至L100-L116-01)分配到单独孔中(100,000个珠粒/孔)并且通过真空过滤用180μl SB17T洗涤3×1分钟。适配子经加热-冷却，向不同珠粒类型添加80μl的50nM指定蛋白质靶标的每种捕获适配子原液，并且振荡所述板(在室温下20分钟，1100rpm)以允许固定。然后各用100μl于SB17T中的50nM链霉亲和素和10mM生物素洗涤珠粒5分钟，然后用180μl SB17T洗涤4×1分钟。汇合每种蛋白质的所有捕获珠粒并且用SB17T使体积达到1.7ml。对于结合测定而言，将50μl汇合的捕获珠粒分配到预湿MSBVN12滤板的孔中，每种待测适配子使用两个孔作为检测剂，并且与50μl于SB17T+1％BSA中的20nM蛋白质或50μl缓冲液混合用于非蛋白质对照。在1100rpm下振荡至少30分钟后，用180μl SB17T+1％BSA真空洗涤所述板2×1分钟并且使珠粒重新悬浮在50μl SB17T+BSA中。使用50μl的12.5nM原液，向单独孔中添加经加热-冷却的检测适配子，并且继续振荡孵育30分钟，然后如以上洗涤并重新悬浮所述珠粒。添加50μl于SB17T+BSA中的10μg/ml链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)偶联物(Moss,Pasadena,MD,USA，产品目录号SAPE-001)作为报告因子，如以上洗涤并重新悬浮。在Luminex 100分析仪上读板(超时：启用120秒，DD门控：7500-8000，报告因子增益：高PMT)。

夹心测定靶标滴定。为基于珠粒和基于板的夹心测定生成AB-H适配子对的结合曲线。对于珠粒测定而言，使用携带一种特异性捕获适配子的单一LumAvidin微球珠粒类型，并且除从100nM开始按半对数连续稀释添加靶蛋白以获得12点结合曲线外，基本上如同以上对筛选测定所述而进行测定。对于板测定而言，使2pmol(100μl的20nM)经加热-冷却的适配子固定在Reacti-Bind链霉亲和素涂层板(Pierce Biotechnology-Thermo Scientific,Rockford,IL,USA，产品目录号15500)上过夜。各用100μl于SB17T中的50nM链霉亲和素和10mM生物素洗涤所述孔5分钟，然后用200μl SB17T+1％BSA封闭10分钟。添加靶蛋白并振荡孵育45分钟，并且用150μl SB17T+1％BSA洗涤所述板2×1分钟。添加检测适配子(100μl于SB17T+1％BSA中的20nM原液)，继续孵育35分钟，并且如以上洗涤所述孔。添加100μl的0.4μg/ml SA-HRP偶联物(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA，产品目录号S-911)作为报告因子，振荡35分钟，接着用SB17(无吐温-20)洗涤三次。添加TMB底物(FisherScientific,Pittsburg,PA,USA，产品目录号PI34028)(100μl)20–30分钟，然后用50μl 10％的硫酸终止反应，并且记录450nm下的吸光度。

实施例2：对艰难梭状芽胞杆菌二元毒素A链(CdtA)的适配子对的选择和鉴定

该实施例提供了选择和生成艰难梭状芽胞杆菌二元毒素A链(CdtA)蛋白质的DNA适配子对的代表性方法。在图1中概述了这种代表性方法并且可用于鉴定其它目标靶标(例如，蛋白质)的适配子对。

用纯化重组CdtA蛋白质和TrpdU修饰文库的SELEX产生K_d为0.86nM的克隆4758-6。克隆4758-6的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是TrpdU的适配子，并且能够与CdtA蛋白质结合。核苷酸序列如下：5'-GAAGACTTTAATTCTGACATGGTGTCCAATGGCGCGCGAG-3'(SEQ ID NO:1)，用T表示TrpdU。试图鉴定非竞争适配子，与不可扩增形式的克隆4758-6的复合物(CdtA-4758-6适配子复合物)中的CdtA在第二SELEX(库5579-2NapdU修饰适配子文库)中用作靶标，第二SELEX采用2NapdU修饰文库代替用于生成4758-6克隆的TrpdU文库。下面表1提供了在SELEX中使用与CdtA蛋白质复合的4758-6适配子克隆鉴定的适配子(或克隆)的序列分析总结，鉴定的序列模式的相应编号(“#”)、K_d数据和是否与CdtA-4758-6适配子复合物形成适配子夹心(“夹心”)。缩写：游离蛋白质(F.P.)和竞争剂(Comp.)。

表1

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

用游离CdtA(库5551)的SELEX与针对CdtA-4758-6适配子复合物的SELEX中使用的相同2NapdU文库，并且也与不同PEdU修饰的文库(库5574)平行进行。8轮选择后，所有SELEX实验均成功生成与起始随机文库相比至少100倍亲和力富集的序列库。下面表2提供了在SELEX中使用游离CdtA蛋白质(库5551-2NapdU修饰适配子文库)鉴定的适配子(或克隆)的序列分析总结，鉴定的序列模式的相应编号(“#”)、K_d数据和是否形成适配子夹心(“夹心”)。

表2

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

下表3提供了在SELEX中使用游离CdtA蛋白质(库5574-PEdU修饰的适配子文库)鉴定的适配子(或克隆)的序列分析总结，鉴定的序列模式的相应编号(“#”)、K_d数据和是否形成适配子夹心(“夹心”)。

表3

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

对来自于亲和力富集库5579(CdtA-4758-6；表1)和5551(游离CdtA；表2)的2NapdU克隆的比较序列分析显示在模式和丰度上的差异，但是也存在一些共有序列基序(图1B)。主导模式出现在库5579的20个(44％)序列中，但仅出现在库5551的5个(12％)序列中。具有这种模式的序列(例如，5579-7、5579-12、5579-21)在与原始配体4758-6的夹心形式下一直表现良好。只在库5579(CdtA-4758-6)中发现另一种模式和呈多个拷贝存在的两个序列，并且这些序列也不与4758-6竞争。在来自两个库的序列中存在另一种模式，并且这个家族含有最具活性的适配子(例如5579-11)，但是它们在夹心测定中失败。很有可能，这些序列在SELEX期间成功地与4758-6竞争，以更高的亲和力或优良的结合动力学性质占据相同表位。仅在库5551(游离CdtA SELEX)中发现两种不同模式和三个多拷贝序列并且在夹心测定中失败。最后，使用PEdU文库在游离CdtA SELEX中生成的序列都不结合复合物，虽然其中几个对游离CdtA具有亚纳摩尔级亲和力。因此，虽然游离CdtA SELEX也生成了几个与不同表位结合的新适配子，但是用CdtA-4758-6复合物的SELEX明显导致更高分数的用于夹心测定的序列与4758-6结合。

新适配子以范围为0.05nM-14nM的亲和力结合游离蛋白(图1C)，并且也在竞争测定和夹心形式中与现有4758-6TrpdU适配子一起试验(图1D和1E)。正如对具有比得上4758-6的亲和力(K_d＝0.67nM与0.86nM)的克隆5579-12所示，与CdtA的结合不受～100倍过量(10nM)4758-6竞争剂的存在所影响，或当4758-6用作捕获剂时，表明两个序列结合不同的CdtA表位。相反，与4758-6相比具有优良亲和力(K_d＝0.05nM与0.86nM)的适配子5579-11的结合被作为竞争剂或捕获剂的4758-6所减少。还在Luminex平台上筛选了来自每次SELEX的代表性序列，其中第一适配子4758-6用作珠粒上的捕获剂。来自于复合物SELEX的大多数克隆(5579-7、5579-10、5579-12、5579-21)以及来自于游离CdtA SELEX的一个克隆(5551-81)在用作检测剂时加强了其结合(图1F)。捕获剂和检测剂对于4758-6和5579-12而言可交换，在Luminex夹心测定中产生类似结合曲线(图1G)。

实施例3：对8种不同蛋白质靶标的适配子对的选择

该实施例提供了选择和生成以下蛋白质靶标的DNA适配子对的代表性方法：血管生成素-2(ANGPT2)、凝血酶敏感蛋白-2(TSP2)、腱蛋白样蛋白1(CRDL1)、软骨基质蛋白2(MATN2)、糖蛋白VI(GPVI)、内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)、补体7(C7)和纤溶酶原(PLG)。

采用双层策略以获得靶蛋白的适配子对。对于第一种策略而言，经由SELEX获得的展示出良好亲和力(K_d<10nM)的适配子为8种靶标中的3种(C7、MATN2、PLG)产生功能性适配子对，全部具有BndU作为经修饰的核苷酸。对于第二种策略而言，SELEX用靶标-SOMAmer复合物进行，采用两个新的经修饰的核苷酸文库(TrpdU和2NapdU)，并且与使用TrpdU或2NapdU文库的游离蛋白质SELEX同时进行。7轮SELEX后，24个库全部在DNA重新缔合(C₀t)动力学的基础上显示出会聚并且展示出低纳摩尔或亚纳摩尔级K_d值。对每个库至少48个SOMAmer的克隆和常规测序允许比较分析在用蛋白质-SOMAmer复合物和游离蛋白质靶标的SELEX中获得的序列。在所有情况下，获得了结合蛋白质-SOMAmer复合物的活性克隆，然而，当使用游离靶标进行SELEX时，较大分数的受试克隆不结合复合物。因此，在SELEX期间使用蛋白质-SOMAmer复合物明显增加了找到夹心候选物的可能性。然而，例外的是来自于用ESAM-2981-9复合物选择的库7565TrpdU的克隆，其全部共有公共序列模式并且显示出ESAM-2981-9复合物而非游离ESAM蛋白质的结合。稍后显示这些序列与SOMAmer 2981-9相互作用而不结合靶蛋白。

观察到的新克隆与蛋白质-菜单SOMAmer复合物的结合并未证明真正夹心的存在，因为它们可能仅仅置换菜单SOMAmer并且与相同表位结合。为了对此进行区分，使新克隆在10nM(～100倍)过量未标记竞争菜单SOMAmer的存在下进行结合测定并且用菜单SOMAmer作为捕获剂进行夹心测定。图2A中描绘的夹心测定只有在夹心形成时，而不是在发生第一SOMAmer置换时产生信号。下面在表4-27中示出了在用复合或游离蛋白质的SELEX中获得的所有SOMAmer(合成5'AB-H 50聚体)的详细序列分析和结合特征。

表4-6提供了对血管生成素-2(ANGPT2)蛋白的适配子的总结。克隆2602-2的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与ANGPT2蛋白结合。

表4

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表5

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表6

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表7-9提供了对凝血酶敏感蛋白-2(TSP2)蛋白的适配子的总结。克隆3339-33的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与TSP2蛋白结合。

表7

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表8

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表9

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表10-12提供了对腱蛋白样蛋白1(CRDL1)蛋白的适配子的总结。克隆3362-61的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与CRDL1蛋白结合。

表10

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表11

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表12

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表13-15提供了对软骨基质蛋白-2(MATN2)蛋白的适配子的总结。克隆3325-2的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与MATN2蛋白结合。

表13

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表14

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表15

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表16-18提供了对糖蛋白VI(GPVI)蛋白的适配子的总结。克隆3194-36的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与GPVI蛋白结合。

表16

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表17

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表18

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表19-21提供了对内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)蛋白的适配子的总结。克隆2981-9的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与ESAM蛋白结合。

表19

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表20

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表21

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表22-24提供了对补体7(C7)蛋白的适配子的总结。克隆2888-49的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与C7蛋白结合。

表22

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表23

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表24

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表25-27提供了对纤溶酶原(PLG)蛋白的适配子的总结。克隆4151-6的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与PLG蛋白结合。

表25

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表26

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

表27

²NT，未试验

*eDNA全长SOMAmer试验数据(未产生合成的SOMAmer)

虽然这种结合测定用于鉴定呈夹心形式的适配子，但是限于成对试验。因此，如实施例1中所详细描述，我们提出了使用Luminex平台的高度复用夹心筛选测定法(图2B)。

实施例4：通过改进的夹心SELEX方法对靶蛋白的适配子对的选择

该实施例提供了选择和生成以下蛋白质靶标的DNA适配子对的代表性方法：基质金属蛋白酶-12(MMP-12)和分泌型磷脂酶A2(NPS-PLA2)。

按照采用PBDC适配子作为附着于珠粒上的捕获剂分隔靶标-适配子复合物的改进夹心SELEX方案，接着光裂解三部分组成的复合物获得靶蛋白的适配子对。对于MMP-12而言，使用PBDC适配子4496-60BndU与靶标形成复合物，以使用NapdU文库进行SELEX。对于NPS-PLA2而言，使用PBDC适配子2692-74BndU在用TrpdU文库进行的SELEX中形成复合物。9轮SELEX后，为所述库测序并合成制备单独的克隆(AB-H 50聚体)并试验其结合。

表28提供了对金属蛋白酶-12(MMP-12)蛋白的适配子的总结。克隆4496-60的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与MMP-12蛋白结合。

表28

NT，未试验

表29提供了对磷脂酶A2(NPS-PLA2)蛋白的适配子的总结。克隆2692-74的核酸分子如同长度为四十(40)个核苷酸，包含C-5修饰的嘧啶，特别是BndU的适配子，并且能够与NPS-PLA2蛋白结合。

表29

NT，未试验

实施例5：适配子对的平衡结合常数

该实施例提供了测量DNA适配子对的平衡结合常数(K_d值)的代表性方法。

简言之，使指定靶标的每个克隆单独固定在特异性LumAvidin珠粒类型上。然后汇合珠粒并用于捕获靶标，并且单独使用每个夹心候选克隆进行检测。至于8组蛋白质(ANGPT2、TSP2、CRDL1、MATN2、GPVI、ESAM、C7和PLG)的适配子夹心候选物的数量(范围为每个靶标7-16个)，这种方法将对功能适配子夹心的成对筛选的二维矩阵减少为一维，从1116次测定(15²+14²+16²+14²+9²+7²+8²+7²)减少为90次测定(15+14+16+14+9+7+8+7)。复用Luminex夹心筛选测定允许快速鉴定功能适配子对，例如，通过将净信号绘制为热图。对于图2C作为实例示出的CRDL1而言，16个适配子在成对矩阵中作为捕获和检测剂而试验，包括11个含TrpdU的序列，4个具有2NapdU，并且适配子具有BndU。CRDL1的菜单适配子3362-61在连同任何新克隆一起用作捕获剂或用作检测剂时表现良好。相反，克隆7575-6和7575-19用作检测剂更好(图2D)。为了比较，使用新克隆之一(7575-2)与任何其它新克隆的夹心测定产生较低信号，并且没有一对像与菜单SOMAmer 3362-61的这一对那样好(图2E)。相同SOMAmer用于捕获和检测未获得信号。

为8种蛋白质中的7种生成在Luminex平台上的夹心结合曲线：ANGPT2(血管生成素-2)、TSP2、CRDL1、MATN2、C7、PLG(纤溶酶原)和GPVI以及MMP-12和NPS-PLA2(图2F)。对于与同源适配子的蛋白质复合物而言新适配子的表观平衡结合常数(K_d值)范围为0.02-2.7nM(参见表30)。值得注意的是，对于MATN2和C7夹心测定而言，当适配子1(捕获)和适配子2(检测)的C-5修饰的嘧啶不同时“夹心”K_d值提高。具体地，对于MATN2而言，夹心K_d值提高约2.5倍(比较BndU捕获适配子和BndU检测适配子(2.19nM K_d)与BndU捕获适配子和TrpdU检测适配子(0.88nM K_d)；参见表30)；并且对于C7而言，夹心K_d值提高约6.3倍(BndU捕获适配子和BndU检测适配子(8.56nM K_d)与BndU捕获适配子和2NapdU检测适配子(1.35nM K_d)；参见表30)。

表30中蛋白质的Swiss Prot编号如下：ESAM(SwissProt#Q96AP7)和CdtA-二元毒素(SwissProt#Q9KH42)、ANGPT2(SwissProt#O15123)、TSP2(SwissProt#P35442)、CRDL1(SwissProt#Q9BU40)、MATN2(SwissProt#O00339)、C7(SwissProt#P10643)、PLG(SwissProt#P00747)、GPVI(SwissProt#Q9HCN6)、MMP-12(SwissProt#39900)、NPS-PLA2(SwissProt#14555)。

表30

¹人蛋白；²艰难梭状芽胞杆菌蛋白

^a在放射性标记测定中测定。括号内的值是对于靶标与适配子1的复合物而言

^b在基于Luminex珠粒的夹心测定中测定

^c来自于存档序列的适配子(未进行夹心SELEX)

除基于LumAvidin珠粒的测定外，我们还在基于板的夹心测定中评价了一些适配子对。用生物素化适配子作为固定在链霉亲和素涂层板上的捕获剂并且连同链霉亲和素-HRP偶联物一起作为检测剂，靶标滴定与基于珠粒的试验相比在测定表现上显示出差异。虽然C7适配子对的表观K_d值在两种测定类型中基本上相同，但是TSP2对在Luminex测定中表现更佳，而纤溶酶原对在板测定中表现更佳(参见图3)。

表31和32提供了对表30中总结的用于制备三元复合物(即，“适配子夹心”)及靶标的捕获和检测的适配子的物理和功能特征的总结。

表31中提供了对用作“捕获适配子”(或第一适配子)的十一(11)种适配子的描述。

表31

“nts.”为核苷酸

“Mod.”为修饰

“C.R.”为适配子的中心区域

¹人蛋白；²艰难梭状芽胞杆菌蛋白

通常，起到“捕获适配子”(或第一适配子)作用的适配子长度为与48个至约58个核苷酸(或长度为约48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58个核苷酸)。每个适配子包含一40-聚体(长度为40个核苷酸)中心区域(适配子的其余核苷酸在40-聚体中心区域两侧)。40-聚体中心区域包含约9个至约16个(或9、10、11、12、13、14、15或16个)BndU或TrpdU C-5修饰的嘧啶。可选地，40-聚体中心区域包含约22％至约40％(或22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40％)BndU或TrpdU C-5修饰的嘧啶。进一步地，“捕获适配子”的40-聚体中心区域包含约37％至约58％GC含量(或37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58％GC含量)。“捕获适配子”(或第一适配子)对其靶蛋白的结合亲和力为约0.07nM至约4.9nM(或为约0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8或4.9nM)。

表30中提供了对用作“检测适配子”(或第二适配子)的十四(14)种适配子的描述。

表32

“nts.”为核苷酸

“Mod.”为修饰

“C.R.”为适配子的中心区域

¹人蛋白；²艰难梭状芽胞杆菌蛋白

通常，起到“检测适配子”(或第二适配子)作用的适配子长度为与50个至约58个核苷酸(或长度为约50、51、52、53、54、55、56、57或58个核苷酸)。每个适配子包含一40-聚体(长度为40个核苷酸)中心区域(适配子的其余核苷酸在40-聚体中心区域两侧)。40-聚体中心区域包含约5个至约15个(或5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15)BndU、TrpdU、NapdU或2NapdU C-5修饰的嘧啶。可选地，40-聚体中心区域包含约12％至约38％(或12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37或38％)BndU、TrpdU、NapdU或2NapdU C-5修饰的嘧啶。进一步地，“检测适配子”(或第二适配子)的40-聚体中心区域包含约37％至约58％GC含量(或37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58％GC含量)。“检测适配子”(或第二适配子)对其靶蛋白的结合亲和力为约0.03nM至约13.1nM(或为约0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.2、10.4、10.6、10.8、11、11.2、11.4、11.6、11.8、12、12.2、12.4、12.6、12.8、13、13.2、13.4、13.6、13.8或14nM)。

总的来说，鉴定了适于蛋白质分析物的夹心测定的功能适配子对。从存档SELEX库挖掘现有适配子，同应用以靶标-适配子复合物进行的第二SELEX的方法相结合，支持使用不同类型的经修饰的核苷酸使得能够鉴定能够结合靶标的适配子对的观点。在适配子夹心测定中，作为特异性和非特异性适配子之间差示解离率的结果，降低了由于非特异性结合而产生的本底。这种特征，同双试剂夹心型测量中固有的新增特异性相结合，为开发具有更高特异性和更高复用能力的测定提供了基础。适配子对为在大型仪器安装基地已经到位的各个医学诊断领域中开发特定平台带来希望。

参考文献

Zichi,D.,Eaton,B.,Singer,B.&Gold,L.Proteomics and diagnostics:Let'sGet Specific,again.Curr Opin Chem Biol 12,78-85(2008).

Gold,L.et al.Aptamer-based multiplexed proteomic technology forbiomarker discovery.PLoS One 5,e15004(2010).

Gupta,S.et al.Rapid histochemistry using slow off-rate modifiedaptamers with anionic competition.Appl Immunohistochem Mol Morphol 19,273-8(2011).

Ochsner,U.A.,Katilius,E.&Janjic,N.Detection of Clostridium difficiletoxins A,B and binary toxin with slow off-rate modified aptamers.DiagnMicrobiol Infect Dis(2013).

Pultar,J.,Sauer,U.,Domnanich,P.&Preininger,C.Aptamer-antibody on-chipsandwich immunoassay for detection of CRP in spiked serum.Biosens Bioelectron24,1456-61(2009).

Ferreira,C.S.et al.DNA aptamers against the MUC1 tumour marker:designof aptamer-antibody sandwich ELISA for the early diagnosis of epithelialtumours.Anal Bioanal Chem 390,1039-50(2008).

Tasset,D.M.,Kubik,M.F.&Steiner,W.Oligonucleotide inhibitors of humanthrombin that bind distinct epitopes.J Mol Biol 272,688-98(1997).

Gong,Q.et al.Selection strategy to generate aptamer pairs that bindto distinct sites on protein targets.Anal Chem 84,5365-71(2012).

Shi,H.,Fan,X.,Sevilimedu,A.&Lis,J.T.RNA aptamers directed to discretefunctional sites on a single protein structural domain.Proc Natl Acad Sci U SA 104,3742-6(2007).

Xiao,S.J.et al.Sensitive discrimination and detection of priondisease-associated isoform with a dual-aptamer strategy by developing asandwich structure of magnetic microparticles and quantum dots.Anal Chem 82,9736-42(2010).

Nonaka,Y.,Sode,K.&Ikebukuro,K.Screening and improvement of an anti-VEGF DNA aptamer.Molecules 15,215-25(2010).

Sosic,A.,Meneghello,A.,Cretaio,E.&Gatto,B.Human thrombin detectionthrough a sandwich aptamer microarray:interaction analysis in solution and insolid phase.Sensors(Basel)11,9426-41(2011).

Huang,D.W.,Niu,C.G.,Qin,P.Z.,Ruan,M.&Zeng,G.M.Time-resolvedfluorescence aptamer-based sandwich assay for thrombin detection.Talanta 83,185-9(2010).

Tennico,Y.H.,Hutanu,D.,Koesdjojo,M.T.,Bartel,C.M.&Remcho,V.T.On-chipaptamer-based sandwich assay for thrombin detection employing magnetic beadsand quantum dots.Anal Chem 82,5591-7(2010).

Gold,L.,Walker,J.J.,Wilcox,S.K.&Williams,S.Advances in humanproteomics at high scale with the SOMAscan proteomics platform.N Biotechnol29,543-9(2012).

Baird,G.S.et al.Age-dependent changes in the cerebrospinal fluidproteome by slow off-rate modified aptamer array.Am J Pathol 180,446-56(2012).

De Groote,M.A.et al.Elucidating novel serum biomarkers associatedwith pulmonary tuberculosis treatment.PLoS One 8,e61002(2013).

Ostroff,R.M.et al.Unlocking biomarker discovery:large scaleapplication of aptamer proteomic technology for early detection of lungcancer.PLoS One 5,e15003(2010).

Ostroff,R.M.et al.Early detection of malignant pleural mesotheliomain asbestos-exposed individuals with a noninvasive proteomics-basedsurveillance tool.PLoS One 7,e46091(2012).

Mehan,M.R.et al.Protein signature of lung cancer tissues.PLoS One 7,e35157(2012).

Mehan,M.R.et al.Highly multiplexed proteomic platform for biomarkerdiscovery,diagnostics,and therapeutics.Adv Exp Med Biol 734,283-300(2013).

Vaught,J.D.et al.Expanding the chemistry of DNA for in vitroselection.J Am Chem Soc 132,4141-51(2010).

Brody,E.N.&Gold,L.Aptamers as therapeutic and diagnostic agents.JBiotechnol 74,5-13(2000).

Gold,L.Oligonucleotides as research,diagnostic,and therapeuticagents.J Biol Chem 270,13581-4(1995).

Kraemer,S.et al.From SOMAmer-based biomarker discovery to diagnosticand clinical applications:a SOMAmer-based,streamlined multiplex proteomicassay.PLoS One 6,e26332(2011).

Perlee,L.et al.Development and standardization of multiplexedantibody microarrays for use in quantitative proteomics.Proteome Sci 2,9(2004).

Brody,E.N.,Gold,L.,Lawn,R.M.,Walker,J.J.&Zichi,D.High-contentaffinity-based proteomics:unlocking protein biomarker discovery.Expert RevMol Diagn 10,1013-22(2010).

Davies,D.R.et al.Unique motifs and hydrophobic interactions shape thebinding of modified DNA ligands to protein targets.Proc Natl Acad Sci U S A109,19971-6(2012).

Gill,R.D.et al.Cardiovascular risk event prediction and usesthereof.PCT/US2012/058060(SomaLogic,Inc.,USA,2012).

序列表

<110> 私募蛋白质体运营有限公司

<120> 多适配子靶标检测

<130> RIC/FP7187438

<140> EP 14847780.5

<141> 2014-09-24

<150> US 61/881,629

<151> 2013-09-24

<160> 4

<170> PatentIn 3.3 & 3.5版

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(9)

<223> 5-[N-(3-吲哚-2-乙基)-羧酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> 5-[N-(3-吲哚-2-乙基)-羧酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> 5-[N-(3-吲哚-2-乙基)-羧酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(20)

<223> 5-[N-(3-吲哚-2-乙基)-羧酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> 5-[N-(3-吲哚-2-乙基)-羧酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> 5-[N-(3-吲哚-2-乙基)-羧酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> 5-[N-(3-吲哚-2-乙基)-羧酰胺]-2'-脱氧尿苷

<400> 1

gaagacnnna anncngacan ggngnccaan ggcgcgcgag 40

<210> 2

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> 5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> 5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷

<400> 2

gaanngnncc g 11

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> 5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(12)

<223> 5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷

<400> 3

gganngcagg nnccc 15

<210> 4

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> 5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> 5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> 5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷

<400> 4

gaancnanac 10

Claims

1.一种组合物，其包含第一适配子、第二适配子和靶标，

其中所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，并且其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案不同；

其中所述第一C-5嘧啶修饰方案包括5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)并且其中所述第一适配子包含9个至16个C-5修饰的嘧啶；

其中所述第二适配子包含5个至15个C-5修饰的嘧啶；

其中所述第一适配子和所述第二适配子的长度独立地各为20至100个核苷酸；并且

其中所述第一适配子、第二适配子和所述靶标能够形成三元复合物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一适配子对所述靶标而非所述第二适配子具有结合亲和力。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二适配子对所述靶标而非所述第一适配子具有结合亲和力。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二适配子对通过所述第一适配子与所述靶标的缔合而形成的复合物具有结合亲和力。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶标的第一适配子结合区域和所述靶标的第二适配子结合区域为不同区域。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一适配子和所述第二适配子独立地包含RNA、DNA或其组合。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一适配子和第二适配子的GC含量百分比独立地为约37％至约58％。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-[N-(2-噻吩-甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-[N-(1-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NEdU)、5-[N-(2-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-[N-(3-苯并[b]噻吩-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BTdU)、5-[N-(3-苯并[a]呋喃-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BFdU)、5-[N-(3,4-亚甲基二氧苄基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MBndU)、5-[N-((R)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(RTHdU)、5-[N-((S)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(STHFdU)、5-(N-2-咪唑基乙基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImiddU)、5-[N-(1-吗啉代-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MOEdU)及其组合。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第二适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-[N-(2-噻吩-甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-[N-(1-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NEdU)、5-[N-(2-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-[N-(3-苯并[b]噻吩-2-乙基)羧酰胺]-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-[N-(3-苯并[a]呋喃-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BFdU)、5-[N-(3,4-亚甲基二氧苄基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MBndU)、5-[N-((R)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(RTHdU)、5-[N-((S)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(STHFdU)、5-(N-2-咪唑基乙基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImiddU)和5-[N-(1-吗啉代-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MOEdU)。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一适配子和/或所述第二适配子还包含可检测部分。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述可检测部分选自染料、量子点、放射性标记、电化学官能团、酶、酶底物、配体和受体。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述靶标包含蛋白质或肽。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述靶标为选自以下的蛋白质：ANGPT2、TSP2、CRDL1、MATN2、GPVI、ESAM、C7、PLG、MMP-12、NPS-PLA2和CdtA。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述三元复合物的解离常数(K_d)为至少0.02nM，或约0.01nM至约10nM，或约0.02nM至约6nM，或约0.02nM至约3nM。

17.一种检测样品中的靶标的方法，所述方法包括：

a)使所述样品与第一适配子接触以形成混合物，其中所述第一适配子能够与所述靶标结合形成第一复合物；

b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；

c)使所述混合物与第二适配子接触，其中所述第二适配子能够结合所述第一复合物形成第二复合物；

d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；

e)去除残留的游离适配子；

f)检测所述混合物中所述第一适配子、所述第二适配子、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在或不存在，其中所述第一适配子、所述第二适配子、所述靶标、所述第一复合物或所述第二复合物的存在表明所述样品中存在所述靶标；并且

其中所述第一适配子包含第一C-5嘧啶修饰方案，所述第二适配子包含第二C-5嘧啶修饰方案，

其中所述第二适配子包含5个至15个C-5修饰的嘧啶；

其中所述第一C-5嘧啶修饰方案和所述第二C-5嘧啶修饰方案不同。

18.一种方法，其包括：

a)使靶标与第一适配子接触以形成混合物，其中所述第一适配子能够与所述靶标结合形成第一复合物；

b)在允许所述第一复合物形成的条件下孵育所述混合物；

c)使所述混合物与第二适配子接触，其中所述第二适配子能够结合所述靶标形成第二复合物；

d)在允许所述第二复合物形成的条件下孵育所述混合物；

e)去除残留的游离适配子；

f)检测所述混合物中所述第一适配子和所述第二适配子的存在或不存在，其中所述混合物中所述第一适配子和第二适配子两者的存在表明所述第一适配子与所述靶标的结合和所述第二适配子与所述靶标的结合为非竞争性；并且

其中所述第二适配子包含5个至15个C-5修饰的嘧啶；

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第一适配子对所述靶标而非所述第二适配子具有结合亲和力。

20.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二适配子对所述靶标而非所述第一适配子具有结合亲和力。

21.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二适配子对所述第一复合物具有结合亲和力。

22.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述靶标的第一适配子结合区域和所述靶标的第二适配子结合区域为不同区域。

23.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第一适配子和所述第二适配子独立地包含RNA、DNA或其组合。

24.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第一适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为5-(N-苄基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)。

25.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-[N-(2-噻吩-甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-[N-(1-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NEdU)、5-[N-(2-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-[N-(3-苯并[b]噻吩-2-乙基)羧酰胺]-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-[N-(3-苯并[a]呋喃-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BFdU)、5-[N-(3,4-亚甲基二氧苄基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MBndU)、5-[N-((R)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(RTHdU)、5-[N-((S)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(STHFdU)、5-(N-2-咪唑基乙基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImiddU)、5-[N-(1-吗啉代-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MOEdU)及其组合。

26.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。

27.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二C-5嘧啶修饰方案包括选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)及其组合。

28.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二适配子的每个尿嘧啶或胸腺嘧啶均为选自以下的C-5修饰的嘧啶：5-[N-(2-噻吩-甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(ThdU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-异丁基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色氨基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲铵)丙基]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物、5-[N-(1-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NapdU)、5-[N-(2-萘甲基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2-NapdU)、5-[N-(1-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(NEdU)、5-[N-(2-萘乙基)羧基酰胺]-2'-脱氧尿苷(2NEdU)、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘甲基羧基酰胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(2,3-二羟丙基)]羧基酰胺)-2'-脱氧尿苷、5-[N-(3-苯并[b]噻吩-2-乙基)羧酰胺]-2’-脱氧尿苷(BTdU)、5-[N-(3-苯并[a]呋喃-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(BFdU)、5-[N-(3,4-亚甲基二氧苄基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MBndU)、5-[N-((R)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(RTHdU)、5-[N-((S)-2-四氢呋喃甲基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(STHFdU)、5-(N-2-咪唑基乙基羧酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImiddU)和5-[N-(1-吗啉代-2-乙基)羧酰胺]-2'-脱氧尿苷(MOEdU)。

29.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第一适配子和/或所述第二适配子还包含可检测部分。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述可检测部分选自染料、量子点、放射性标记、电化学官能团、酶、酶底物、配体和受体。

31.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述靶标包含蛋白质或肽。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述靶标为选自以下的蛋白质：ANGPT2、TSP2、CRDL1、MATN2、GPVI、ESAM、C7、PLG、MMP-12、NPS-PLA2和CdtA。

33.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二复合物的解离常数(K_d)为至少0.02nM，或约0.01nM至约10nM，或约0.02nM至约6nM，或约0.02nM至约3nM。

34.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第一复合物的解离常数(K_d)为约0.04nM至约5nM，或约0.04nM至约4.8nM。

35.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述第二适配子和所述靶标的解离常数(K_d)为约0.03nM至约14nM。