TWI708845B - 用於結合生長分化因數8之核酸化合物 - Google Patents

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Abstract

本文描述了能夠結合生長分化因數8(GDF8)蛋白質之適體；包含GDF8結合適體之組合物；及製備及使用該等適體及該等組合物之方法。

Description

用於結合生長分化因數8之核酸化合物
本申請案主張2015年2月9日申請之美國臨時申請案第62/113,866號之優先權益，該申請案出於任何目的以全文引用之方式併入本文。
本揭示案總體上係關於核酸領域，且更特定言之係關於能夠結合生長分化因數8(GDF8)蛋白之適體；包含GDF8結合適體之組合物；及製備及使用該等適體及該等組合物之方法。
生長分化因數8(GDF8)或肌抑素屬於藉由調控Hox基因之表現控制發育期間之前-後圖案化的轉型生長因數β超家族。GDF8為肌肉生長之負調控因數，且已顯示在調控心肌細胞增殖中起作用。
GDF8與GDF11密切相關，GDF11為肌肉生長之負調控因數。如同GDF8，GDF11參與調控心肌細胞增殖。肌抑素與GDF11之間之相似性暗示相同調控機制用於控制肌肉及神經發育期間之組織大小的可能性。在機理上，肌抑素的作用可能由WFIKKN2調控，WFIKKN2為由卵泡抑素、免疫球蛋白、蛋白酶抑制劑及NTR域組成之大細胞外多域蛋白質。據發現WFIKKN2抑制肌抑素之生物活性且對GDF11具有高親和力。
GDF8(肌抑素)及GDF11在發育過程中及在調控成體組織中之細 胞生長及分化中起重要作用。定位及/或量測此兩種蛋白質之能力對於進一步理解且區分其在發育及成體組織(例如，心肌及骨骼肌)中之貢獻而言為重要的。然而，由於其同源性，難以用現有蛋白質結合試劑(例如，抗體)區分此等蛋白質之存在及/或水準。因此，對於能夠區分GDF8及GDF11之蛋白質結合試劑存在需要。本揭示案藉由提供對GDF8蛋白具有結合特異性之適體而滿足此類需求。
本揭示案描述能夠結合生長分化因數8(GDF8；肌抑素)蛋白之適體。在一些實施例中，提供適體，其結合GDF8之平衡結合常數(K d )小於100nM。在另一態樣中，K d 為約0.1nM至約100nM(或約0.1nM至約50nM、或約0.1nM至約10nM、或約0.5nM至約10nM、或約0.5nM至約5nM)。
在一些實施例中，提供一種適體，其結合GDF8之親和力小於10nM。在一些實施例中，該適體結合GDF8之親和力小於10nM，且在相同條件下，該適體結合GDF11之親和力比對GDF8之親和力弱至少10倍。在一些實施例中，該適體不結合GDF11。在一些實施例中，該適體結合GDF11之親和力比對GDF8之親和力弱至少20倍，或弱至少30倍，或弱至少50倍。在一些實施例中，該適體結合GDF11之親和力大於50nM、或大於100nM、或大於150nM、或大於200nM、或大於250nM、或大於300nM。在一些實施例中，該適體結合GDF8之親和力小於8nM、或小於7nM、或小於6nM、或小於5nM、或小於4nM、或小於3nM、或小於2nM、或小於1nM。在一些實施例中，使用包括聚陰離子抑制劑之結合分析測定親和力。在一些實施例中，該聚陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z-阻斷劑、聚dI/dC、經超音波處理或經剪切之鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA及dNTP。
在一些實施例中，該適體包含序列5’ GWWR1CnR2ZGnGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KWnAGX2 nWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：1)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
在一些實施例中，該適體包含序列5’-WGWWAGZGWX2CWWX1AWGAGWCWAD-3’(SEQ ID NO：3)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；Z係選自A及W；及D係選自G、A及W。
在一些實施例中，該適體包含序列5’-GWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAG-3’(SEQ ID NO：4)，其中各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶。
在一些實施例中，提供結合GDF8之適體，其中該適體包含序列5’-GWWR1CnR2ZGnGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KWnAGX2 nWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：1)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W； K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1在一些實施例中，提供結合GDF8之適體，其中該適體包含序列5’-GWWR1R2ZGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KAGWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：49)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
在一些實施例中，提供結合GDF8之適體，其中該適體包含序列5’-WGWWAGZGWX2CWWX1AWGAGWCWAD-3’(SEQ ID NO：3)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；Z係選自A及W；及D係選自G、A及W。
在上述序列之一些實施例中，至少一個R1為A。在上述序列之一些實施例中，各R1為A。在上述序列之一些實施例中，至少一個R2為G。在上述序列之一些實施例中，各R2為G。在上述序列之一些實施例中，K為G。在上述序列之一些實施例中，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個、至少7個或8個n為0。在上述序列之一些實施例中，各n為0。在上述序列之一些實施例中，1、2或3 個n為1，且其餘n為0。
在上述序列之一些實施例中，至少一個X1為W。在上述序列之一些實施例中，各X1為W。在上述序列之一些實施例中，至少一個X2為C。在上述序列之一些實施例中，各X2為C。
在一些實施例中，提供結合GDF8之適體，其中該適體包含序列5’-GWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAG-3’(SEQ ID NO：4)，其中各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶。
在上述序列之一些實施例中，各W獨立地且在每次出現時係選自：5-(N-苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)，5-(N-苄基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-苄基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-苯乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(PEdU)，5-(N-苯硫基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(ThdU)，5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)，5-(N-酪胺醯基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TyrdU)，5-(N-3,4-亞甲基二氧基苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(MBndU)，5-(N-4-氟苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(FBndU)，5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(PPdU)，5-(N-咪唑基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(ImdU)，5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)，5-(N-R-酥胺醯基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(ThrdU)，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷， 5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]甲醯胺)-2'-去氧尿苷氯化物，5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]甲醯胺)-2'-去氧尿苷)，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，各W獨立地且在每次出現時係選自：5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷， 5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個W各自獨立地選自5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷及5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷。在一些實施例中，各W獨立地選自5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷及5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，該適體包含選自SEQ ID NO：5至48之序列。在一些實施例中，該適體包含選自SEQ ID NO：5至19、26至28、30至32及34至48之序列。
在本文所述之任何實施例中，該適體可由18至200個核苷酸、或 18至150個核苷酸、或18至100個核苷酸、或18至75個核苷酸、或18至50個核苷酸、或20至150個核苷酸、或20至100個核苷酸、或20至75個核苷酸、或20至50個核苷酸、或23至200個核苷酸、或23至150個核苷酸、或23至100個核苷酸、或23至75個核苷酸、或23至50個核苷酸組成，其中各核苷酸可獨立地為經修飾或未經修飾之核苷酸。在本文所述之任何實施例中，該適體可包含可偵測標記。
在一些實施例中，GDF8為人類、小鼠或大鼠GDF8且GDF11為人類、小鼠或大鼠GDF11。在一些實施例中，GDF8為包含SEQ ID NO：63之序列的成熟人類GDF8且GDF11為包含SEQ ID NO：50之序列的成熟人類GDF11。
在一些實施例中，提供一種偵測樣品中之GDF8的方法，該方法包括使來自該樣品之蛋白質與本文所述之適體相接觸。在一些實施例中，該適體結合GDF11之親和力比對GDF8之親和力弱至少10倍。在一些實施例中，該適體不結合GDF11。
在一些實施例中，提供一種測定樣品是否包含GDF8之方法，該方法包括使來自該樣品之蛋白質與本文所述之適體相接觸。在一些實施例中，該樣品包含GDF11。在一些實施例中，該方法包括使該樣品與該適體在嚴格條件下相接觸。在一些實施例中，該嚴格條件包括聚陰離子抑制劑。在一些實施例中，該聚陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z-阻斷劑、聚dI/dC、經超音波處理或經剪切之鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA及dNTP。
在一些實施例中，該樣品為來自人類之樣品。在一些實施例中，該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。在一些實施例中，該組織樣品係選自心肌組織、骨骼肌組織、胰腺組織、軟骨組織及神經組織。
在一些實施例中，該等蛋白質已與該樣品之至少一種其他組分 分離。在一些實施例中，該等蛋白質尚未與該樣品之其他組分分離。
在一些實施例中，提供包含本文所述之適體及來自樣品之蛋白質的組合物。在一些實施例中，該樣品包含GDF11。在一些實施例中，該組合物包含聚陰離子抑制劑。在一些實施例中，該聚陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z-阻斷劑、聚dI/dC、經超音波處理或經剪切之鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA及dNTP。在一些實施例中，該樣品為來自人類之樣品。在一些實施例中，該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。在一些實施例中，該組織樣品係選自心肌組織、骨骼肌組織、胰腺組織、軟骨組織及神經組織。在一些實施例中，該等蛋白質已與該樣品之至少一種其他組分分離。在一些實施例中，該等蛋白質尚未與該樣品之其他組分分離。
在另一態樣中，該適體為至少25個核苷酸長。在另一態樣中，該適體為至少30個核苷酸長。在另一態樣中，該適體為至少40個核苷酸長。在另一態樣中，該適體為約40至約100個核苷酸長(或40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100個核苷酸長)。
本揭示案進一步提供一種包含適體及GDF8蛋白之組合物，其中該適體及該GDF8蛋白藉由非共價相互作用結合。
本發明之前述及其他目標、特徵及優點將自以下詳細描述變得更清楚，該詳細描述參考附圖進行。
圖1顯示在聚陰離子抑制劑(Z-阻斷劑)存在或不存在下適體純系14583-49_3對人類GDF8蛋白及人類GDF11蛋白之結合親和力的比 較。x軸顯示各別蛋白質之濃度且y軸顯示結合至蛋白質之適體之百分比(1.0為100%)。
圖2顯示在聚陰離子抑制劑(Z-阻斷劑)存在下適體14583-19_3對人類GDF11蛋白及人類肌抑素(GDF8)蛋白之結合親和力的比較。x軸顯示各別蛋白質之濃度且y軸顯示結合至蛋白質之適體純系之百分比(1.0為100%)。
圖3顯示適體純系14583-49_3(50-聚體序列)之截短分析及在聚陰離子抑制劑(Z-阻斷劑)存在下各序列對GDF8之結合親和力。
圖4顯示在聚陰離子抑制劑(Z-阻斷劑)存在下適體純系14583-49_29及14583-49_3對人類GDF8蛋白及人類GDF11蛋白之結合親和力的比較。x軸顯示各別蛋白質之濃度且y軸顯示結合至蛋白質之適體之百分比(1.0為100%)。
I.術語及方法
雖然本發明將結合某些代表性實施例進行描述，但應瞭解本發明由申請專利範圍定義且不限於彼等實施例。
熟習此項技術者將認識到與本文所述之彼等方法及材料類似或等效之許多方法及材料可用於實踐本發明。本發明絕不限於所描述之方法及材料。
除非另外定義，否則本文所使用之技術及科學術語皆具有與本發明所屬技術之一般技藝人士通常所理解相同的含義。分子生物學中一般術語之定義可見於Benjamin Lewin,Genes V，由Oxford University Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(編),The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(編),Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)。雖然與本文所述之方法、裝置及材料相似或等效之任何方法、裝置及材料可用於實踐本發明，但本文描述某些方法、裝置及材料。
本文引用之所有公開案、公開專利檔及專利申請案均特此以引用之方式併入，達到如同明確且個別地指示將各個別公開案、公開專利檔或專利申請案以引用之方式併入的相同程度。
如本申請案(包括隨附申請專利範圍)中所使用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數，且可與「至少一個」及「一或多個/種」互換使用。因此，提及「適體」包括適體之混合物，提及「探針」包括探針之混合物等。
如本文所用，術語「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「包括(includes)」、「包括(including)」、「含有(contains)」、「含有(containing)」及其任何變化形式意欲涵蓋非排它性包括，以使得包含、包括或含有要素或一系列要素之過程、方法、方法限定產品或物質組合物可包括未明確列出之其他要素。
應進一步瞭解，針對核酸或多肽給出之所有鹼基大小或胺基酸大小及所有分子量或分子品質值均為近似值，且提供用於描述。
為了有助於綜述本揭示案之各種實施例，提供特定術語之以下闡述：適體：如本文所用，「適體」係指對標靶分子具有特異性結合親和力之核酸。應認識到，親和力相互作用為程度問題；然而，在此上下文中，適體對其標靶之「特異性結合親和力」意謂適體結合其標靶之親和力程度通常比其結合測試樣品中之其他組分高得多。「適體」為具有特定核苷酸序列之一種類型或物種之核酸分子的一組複本。適體可包括任何適合數目之核苷酸，包括任何數目之經化學修飾之核苷酸。「適體」係指一個以上此組分子。不同適體可具有相同或不同數 目之核苷酸。適體可為DNA或RNA或經化學修飾之核酸且可為單鏈、雙鏈的，或包含雙鏈區，且可包括高級有序結構。適體還可為光適體，其中光反應性或化學反應性官能基包括於適體中以允許其共價連接至其相應標靶。本文揭示之任何適體方法可包括使用特異性結合同一標靶分子之兩種或兩種以上適體。如下文進一步描述，適體可包括標籤。若適體包括標籤，則該適體之所有複本無需具有相同標籤。此外，若不同適體各自包括標籤，則此等不同適體可具有相同或不同標籤。
可使用任何已知方法，包括SELEX方法來鑑別適體。一旦鑑別，即可根據任何已知方法，包括化學合成方法及酶合成方法來製備或合成適體。
GDF8適體：如本文所用，GDF8適體係指能夠結合成熟GDF8蛋白之適體。以下示出非限制性例示性成熟人類GDF8蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot：O14793之胺基酸267至375)：DFGL DCDEHSTESR CCRYPLTVDF EAFGWDWIIA PKRYKANYCS GECEFVFLQK YPHTHLVHQA NPRGSAGPCC TPTKMSPINM LYFNGKEQII YGKIPAMVVD RCGCS(SEQ ID NO：63)。
在一些實施例中，GDF8適體結合GDF11之親和力比對GDF8之親和力弱至少10倍。在一些實施例中，GDF8適體不結合GDF11。以下示出非限制性例示性成熟人類GDF11蛋白(UniProtKB/Swiss-Prot：O95390之胺基酸299至407)：NL GLDCDEHSSE SRCCRYPLTV DFEAFGWDWI IAPKRYKANY CSGQCEYMFM QKYPHTHLVQ QANPRGSAGP CCTPTKMSPI NMLYFNDKQQ IIYGKIPGMV VDRCGCS(SEQ ID NO：50)。
抑制：如本文所用，術語抑制意謂防止或降低肽或多肽之表現 至該肽或多肽不再具有可量測之活性或生物活性的程度；或降低肽或多肽之穩定性及/或降低或防止肽或多肽之活性至該肽或多肽不再具有可量測之活性或生物活性之程度。如本文所述，可經抑制之蛋白質為GDF8。
核酸：如本文所用，「核酸」、「寡核苷酸」及「多核苷酸」可互換用於指核苷酸之聚合物，且包括DNA，RNA，此等種類之核酸、寡核苷酸及多核苷酸之DNA/RNA雜種及修飾，其中包括不同實體或部分與核苷酸單元在任何位置處之連接。術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」包括雙鏈或單鏈分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸及多核苷酸為比術語適體更廣泛之術語且因此術語核酸、寡核苷酸及多核苷酸包括為適體之核苷酸之聚合物，但術語核酸、寡核苷酸及多核苷酸不限於適體。
經修飾：如本文所用，術語「修飾(modify)」、「經修飾」、「修飾(modification)」及其任何變化形式當參考寡核苷酸使用時意謂寡核苷酸之四種組成核苷酸鹼基(亦即，A、G、T/U及C)中之至少一者為天然存在之核苷酸的類似物或酯。在一些實施例中，經修飾核苷酸賦予對寡核苷酸之核酸酶抗性。在一些實施例中，經修飾核苷酸導致適體與蛋白質標靶之主要疏水性相互作用，從而產生高結合效率及穩定共晶複合物。具有在C-5位置之取代的嘧啶為經修飾核苷酸之實例。修飾可包括主鏈修飾、甲基化、不尋常鹼基配對組合諸如異鹼基、異胞苷及異胍等。修飾亦可包括3'及5'修飾，諸如封端。其他修飾可包括用類似物取代一或多種天然存在之核苷酸，核苷酸間修飾諸如具有不帶電鍵聯之彼等核苷酸間修飾(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電荷鍵聯之彼等核苷酸間修飾(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、具有嵌入劑之彼等核苷酸間修飾(例如，吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑之彼等核苷酸間修飾(例 如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、含有烷化劑之彼等核苷酸間修飾及具有經修飾鍵聯之彼等核苷酸間修飾(例如，α端基異構核酸等)。此外，通常存在於核苷酸之糖上之任何羥基可經膦酸酯基或磷酸酯基替代；經標準保護基保護；或經活化以製備與額外核苷酸或固體支撐物之額外鍵聯。5'和3'端OH基團可經磷酸化或經胺、約1至約20個碳原子之有機封端基團部分、聚乙二醇(PEG)聚合物(在一些實施例中，約10至約80kDa之範圍內)、PEG聚合物(在一些實施例中，約20至約60kDa之範圍內)或其他親水性或疏水性生物或合成聚合物取代。在一個實施例中，修飾具有嘧啶之C-5位置。此等修飾可直接經由在C-5位置之醯胺鍵聯產生或由其他類型之鍵聯產生。
多核苷酸亦可包含此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-端基異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、呱喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核苷)。如上所述，一或多個磷酸二酯鍵聯可經替代連接基團替代。此等替代連接基團包括其中磷酸酯經P(O)S(「硫代酸酯」)、P(S)S(「二硫代酸酯」)、(O)NR2(「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)替代之實施例，其中各R或R'獨立地為H、或經取代或未經取代之烷基(1-20C)，其可視情況含有醚(-O-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。多核苷酸中並非所有鍵聯皆需要一致。糖、嘌呤及嘧啶之類似形式之取代可在設計最終產物中為有利的，替代主鏈結構像例如聚醯胺主鏈亦可為有利的。
核酸酶：如本文所用，術語「核酸酶」係指能夠裂解寡核苷酸之核苷酸亞單位之間之磷酸二酯鍵的酶。如本文所用，術語「核酸內切酶」係指裂解在寡核苷酸內部位點處之磷酸二酯鍵的酶。如本文所用，術語「核酸外切酶」係指裂解連接寡核苷酸之端核苷酸之磷酸二 酯鍵的酶。生物流體通常包含核酸內切酶與核酸外切酶之混合物。
如本文所用，術語「核酸酶抗性的」及「核酸酶抗性」係指寡核苷酸充當核酸內切酶或核酸外切酶之受質的能力降低，以使得當與此種酶相接觸時，寡核苷酸未經降解抑或比由未經修飾核苷酸組成之寡核苷酸更慢降解。
C-5經修飾嘧啶：如本文所用，術語「C-5經修飾嘧啶」係指在C-5位置處具有修飾之嘧啶，包括但不限於在圖20及圖24中所示之彼等部分。C-5經修飾嘧啶之實例包括在美國專利第5,719,273號及第5,945,527號中所描述之彼等C-5經修飾嘧啶。C-5修飾之實例包括在C-5位置處用獨立地選自以下之取代基取代去氧尿苷：苄基甲醯胺(或者苄基胺基羰基)(Bn)、萘基甲基甲醯胺(或者萘基甲基胺基羰基)(Nap)、色胺基甲醯胺(或者色胺基羰基)(Trp)、苯乙基甲醯胺(或者苯乙基胺基羰基)(Pe)、苯硫基甲基甲醯胺(或者苯硫基甲基胺基羰基)(Th)及異丁基甲醯胺(或者異丁基胺基羰基)(iBu)，如以下立即說明。
C-5經修飾嘧啶之化學修飾亦可單獨地或以任何組合與2'-位置糖修飾、在環外胺處之修飾及4-硫代尿苷之取代等組合。
代表性C-5經修飾嘧啶包括：5-(N-苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-苯乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(PedU)、5-(N-苯硫基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(ThdU)、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]甲醯胺)-2'-去氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷或5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]甲醯胺)-2'-去氧尿苷)。
核苷酸可在寡核苷酸合成之前抑或之後經修飾。寡核苷酸中之核苷酸之序列可由一或多種非核苷酸組分中斷。可在聚合之後，諸如藉由與任何適合標記組分結合來進一步修飾經修飾之寡核苷酸。
如本文所用，術語「至少一個嘧啶」當提及核酸之修飾時係指核酸中之一個、若干或所有嘧啶，其指示核酸中任何或所有C、T或U之所有出現可為經修飾或未經修飾的。
調節：如本文所用，術語調節意謂藉由相對於參照表現水準增加或減少肽、蛋白質或多肽之表現水準來改變其表現水準，及/或藉由相對於參照穩定性及/或活性水準增加或降低肽、蛋白質或多肽之穩定性及/或活性水準來改變其穩定性及/或活性。
醫藥學上可接受：如本文所用，醫藥學上可接受意謂由美國聯邦政府或州政府之管理機構批準或在美國藥典或其他一般認可之藥典中列出以用於在動物中，且更特定言之在人類中使用。
醫藥學上可接受之鹽：如本文所用，化合物(例如，適體)之醫藥學上可接受之鹽係指包含離子鍵且通常藉由使該化合物與酸抑或鹼反應來產生、適合用於投與至個體之產物。醫藥學上可接受之鹽可包括但不限於酸加成鹽，包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、烷基磺酸鹽、芳基磺酸鹽、芳烷基磺酸鹽、乙酸鹽、苯甲酸鹽、檸檬酸鹽、順丁烯二酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、乳酸鹽及酒石酸鹽；鹼金屬陽離子諸如Li、Na、K；鹼土金屬鹽諸如Mg或Ca；或有機胺鹽。
醫藥組合物：如本文所用，醫藥組合物係指呈適合用於投與至個體之形式之包含GDF8適體的調配物。醫藥組合物通常經調配為與其預定投與途徑相容。投與途徑之實例包括但不限於，經口及非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、吸入、局部、經皮、經黏膜及經直腸投與。
SELEX：術語「SELEX」及「SELEX方法」在本文可互換用於一般指(1)選擇以合乎需要之方式與標靶分子相互作用(例如以高親和力結合蛋白質)之適體與(2)擴增彼等選定核酸之組合。SELEX方法可用於鑑別對特定標靶或生物標誌物具有高親和力之適體。
序列一致性：如本文所用，在兩個或兩個以上核酸序列之上下文中序列一致性為該等序列共有之一致核苷酸位置之數目的函數(即，一致性%=一致位置之數目/位置總數目×100)，其考慮間隙之數目及為最佳化兩個或兩個以上序列之比對而需引入之各間隙的長度。兩個或兩個以上序列之間之序列比較及一致性百分比之確定可使用數學演算法來完成，諸如在其內定參數下之BLAST及間隙BLAST程式(例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403,1990；亦參見在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST之BLASTN)。對於序列比較，通常一個序列充當與測試序列進行比較之參考序列。當使用序列比較演算法時，將測試及參考序列輸入電腦，必要時指定子序列座標，且指定序列演算法程式參數。序列比較演算法然後基於指定程式參數，計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。用於比較之序列的最佳比對可例如藉由Smith及Waterman,Adv.Appl.Math.,2：482,1981之局部同源性演算法，藉由Needleman及Wunsch,J.Mol.Biol.,48：443,1970之同源性比對演算法，藉由Pearson及Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444,1988之相似性搜尋法，藉由此等演算法之電腦化實施(威斯康辛遺傳學軟體套件(Wisconsin Genetics Software Package),Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)或藉由目視檢查(一般參見Ausubel,F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.及Wiley-Interscience出版(1987))。如本文所用，當描述核酸(諸如GDF8適體)之一致性百分比，該核酸之序列與參考核苷酸序列至少 例如約95%一致時，意欲該核酸序列與該參考序列一致，例外之處在於對於參考核酸序列之每100個核苷酸，該核酸序列可包括多達五個點突變。換言之，為獲得所要核酸序列，該核酸之序列與參考核酸序列至少約95%一致，參考序列中多達5%之核苷酸可經缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中總核苷酸數目之多達5%之一些數目的核苷酸可插入參考序列中(在本文稱為插入)。用於產生所要序列之參考序列之此等突變可發生在參考核苷酸序列之5'或3'端位置或介於彼等末端位置之間之任何處，單獨地散佈於參考序列中之核苷酸之間或以一或多個連續群組散佈於參考序列內。
SOMAmer：如本文所用，術語SOMAmer係指具有改良之解離速率特徵之適體。SOMAmer或者稱為慢解離速率修飾之適體，且可經由標題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國公開案第20090004667號中描述之經改良SELEX方法加以選擇，該公開案以全文引用之方式併入。在一些實施例中，慢解離速率適體(包括包含至少一個具有疏水性修飾之核苷酸的適體)具有之解離速率(t½)為
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2分鐘、
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4分鐘、
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5分鐘、
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8分鐘、
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10分鐘、
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15分鐘、
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30分鐘、
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60分鐘、
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90分鐘、
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120分鐘、
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150分鐘、
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180分鐘、
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210分鐘或
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240分鐘。
標靶分子：「標靶」、「標靶分子」及「分析物」在本文可互換用於指可存在於樣品中之任何所關注分子。該術語包括特定分子之任何微小變化，諸如在蛋白質之情況下，例如氨基酸序列中之微小變化，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾(諸如與標記性組分結合)，其不實質上改變分子之特性。「標靶分子」、「標靶」或「分析物」係指一種類型或物種之分子或多分子結構之一組複本。「標靶分子」、「標靶」及「分析物」係指一種以上類型或物種之分子或多分子結構。例示性標靶分子包括蛋白質、多肽、核 酸、碳水化合物、脂質、多糖、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、親和體「affybody」、抗體類比物、病毒、病原體、毒性物質、受質、代謝物、過渡態類似物、輔因數、抑制劑、藥物、染料、營養素、生長因數、細胞、組織及前述中任一者之任何片段或部分。在一些實施例中，標靶分子為蛋白質，在此情況下標靶分子可稱為「標靶蛋白質」。
聚陰離子抑制劑：聚陰離子抑制劑為包含或模擬核酸分子之聚陰離子磷酸主鏈的抑制劑分子。在一些實施例中，聚陰離子抑制劑包括在與適體之結合反應中以增加結合條件之嚴格性。非限制性例示性聚陰離子抑制劑包括硫酸葡聚糖、肝素、Z-阻斷劑、聚dI/dC、經超音波處理或經剪切之鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA、dNTP等。
Z-阻斷劑：如本文所用之Z-阻斷劑為序列5'-(AC-BndU-BndU)7-AC-3'之單鏈寡核苷酸，其中BndU指示經苄基取代之去氧尿苷殘基。Z-阻斷劑可使用習知亞磷醯胺化學合成。
本文提供之範圍應理解為該範圍內之所有值之速記法。例如，範圍1至50應理解為包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50之任何數值、數值組合或子範圍(除非上下文另外明確規定，否則以及其分數)。除非另外指出，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括所列舉範圍內之任何整數值，且在適當時包括其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。因此，除非另外指出，否則本文列舉之涉及任何物理特徵之任何數值範圍諸如聚合物亞單位、大小或厚度應理解為包括所列舉範圍內之任何整數。如本文所用，除非另外指出，「大約」或「基本上由......組成」意謂所指示範圍、值或結構之±20%。如本文 所用，術語「包括」及「包含」為開放性且同義使用。應理解，如本文所用之術語「一個/種(a/an)」係指所列舉組分中之「一或多種」。使用替代(例如，「或」)應理解為意謂多個替代中之任一、兩者或其任何組合。
II.概述 A生長分化因數8(GDF8；肌抑素)蛋白及GDF11蛋白
肌抑素及GDF11之天然成熟形式為同二聚體且藉由序列比對為約90%一致，其中109個胺基酸殘基中之98個匹配。參見GDF11(蛋白質ID 095390；胺基酸1至407；SEQ ID NO：57)及肌抑素(蛋白質014793；胺基酸1至375；SEQ ID NO：58)之胺基酸序列比對，成熟形式由灰色條指示。GDF11及肌抑素前肽原之胺基酸序列之比對在以下示出。成熟蛋白質部分用灰色條突出顯示。
Figure 105103922-A0202-12-0020-1
GDF11及GDF8據認為共有共同祖先及共同調控機制，但關於其組織特異性不同(分別主要在心臟及肌肉中)。
肌抑素(GDF8)在人類、小鼠及大鼠之間為100%一致。人類、小鼠及大鼠肌抑素蛋白(成熟)之胺基酸序列比對在以下示出。人類肌抑素(GDF8)蛋白質ID為O14793；例示性人類成熟GDF8在以下示出； SEQ ID NO：51)。小鼠GDF8蛋白質ID為O08689；例示性小鼠成熟GDF8在以下示出；SEQ ID NO：52)。大鼠GDF11蛋白質ID為O35312；例示性大鼠成熟GDF8在以下示出；SEQ ID NO：53)。
Figure 105103922-A0202-12-0021-2
成熟GDF11在人類與小鼠之間為100%一致，且在大鼠中99%一致。人類、小鼠及大鼠GDF11蛋白(成熟)之胺基酸序列比對在以下示出。人類GDF11蛋白質ID為O95390；例示性人類成熟GDF11在以下示出；SEQ ID NO：54)。小鼠GDF11蛋白質ID為Q9Z1W4；例示性小鼠成熟GDF8在以下示出；SEQ ID NO：55)。大鼠GDF11蛋白質ID為Q9Z217；例示性大鼠成熟GDF8在以下示出；SEQ ID NO：56)。
Figure 105103922-A0202-12-0021-3
B SELEX
SELEX一般包括製備核酸之候選混合物，將該候選混合物與所要標靶分子結合以形成親和複合物，使該等親和複合物與未結合之候選核酸分離，使該核酸與該親和複合物分離且分開，純化該核酸，及鑑別特異性適體序列。該方法可包括多輪以進一步精製選定適體之親和力。該方法可包括在該方法中之一或多個點處之擴增步驟。參見例如標題為「Nucleic Acid Ligands」之美國專利第5,475,096號。該SELEX方法可用於產生共價結合其標靶之適體以及非共價結合其標靶之適體。參見例如標題為「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Chemi-SELEX.」之美國專利第 5,705,337號。
該SELEX方法可用於鑑別高親和力適體，該等適體含有經修飾核苷酸，該等經修飾核苷酸對適體賦予經改良之特徵，諸如經改良之活體內穩定性或經改良之遞送特徵。此類修飾之實例包括在核糖及/或磷酸及/或鹼基位置處之化學取代。經SELEX方法鑑別之含有經修飾核苷酸之適體描述於標題為「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」之美國專利第5,660,985號中，該專利描述含有在嘧啶之5'及2'位置處經化學修飾之核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利第5,580,737號(參見上文)描述含有用2'-胺基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)及/或2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之一或多個核苷酸之高特異性適體。亦參見，標題為「SELEX and PHOTOSELEX」之美國專利申請公開案20090098549，其描述具有擴增物理及化學性質之核酸文庫及其在SELEX及光SELEX中之用途。
SELEX亦可用於鑑別具有合乎需要之解離速率特徵之適體。參見標題為「Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates」之美國專利申請公開案20090004667，其描述用於產生可結合標靶分子之適體的經改良SELEX方法。如上所述，此等慢解離速率適體稱為「SOMAmer」。描述用於自其對應標靶分子產生具有較慢解離速率之適體或SOMAmer及光適體或SOMAmer的方法。該等方法涉及使候選混合物與標靶分子相接觸，允許發生核酸-標靶複合物之形成，及進行慢解離速率增濃過程，其中具有快解離速率之核酸-標靶複合物將解離且不重組，同時具有慢解離速率之複合物將保持完整。此外，該等方法包括在候選核酸混合物之產生中使用經修飾核苷酸以產生具有經改良解離速率性能之適體或SOMAmer。
此分析之變化形式採用包含光反應性官能基之適體，該等官能基使該等適體能夠共價結合或「光交聯」其標靶分子。參見例如標題 為「Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip」之美國專利第6,544,776號。此等光反應性適體亦稱為光適體。參見例如美國專利第5,763,177號、美國專利第6,001,577號及美國專利第6,291,184號，其各自標題為「Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment：Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX」；亦參見，例如標題為「Photoselection of Nucleic Acid Ligands」之美國專利第6,458,539號。在使微陣列與樣品相接觸且光適體具有結合其標靶分子之機會之後，光適體經光活化，且洗滌固體支撐物以除去任何非特異性結合之分子。可使用苛刻洗滌條件，因為結合光適體之標靶分子由於由光適體上之光活化官能基產生之共價鍵而一般不除去。
在此等分析形式兩者中，適體或SOMAmer在與樣品相接觸之前固定在固體支撐物上。然而，在某些情況下，在與樣品相接觸之前固定適體或SOMAmer可能不提供最佳分析。例如，預先固定適體或SOMAmer可導致適體或SOMAmer與標靶分子在固體支撐物之表面上之無效混合，可能導致漫長反應時間且因此延長之培育期以允許適體或SOMAmer與其標靶分子之有效結合。此外，當光適體或光SOMAmer用於分析中時且取決於用作固體支撐物之材料，該固體支撐物可傾向於散射或吸收用於實現光適體或光SOMAmer與其標靶分子之間之共價鍵之形成的光。此外，取決於所採用之方法，偵測結合至其適體或光SOMAmer之標靶分子可受制於不精確度，因為固體支撐物之表面亦可暴露於所使用之任何標記劑且由任何標記劑影響。最終，將適體或SOMAmer固定在固體支撐物上一般涉及在使適體或SOMAmer暴露於樣品之前之適體或SOMAmer製備步驟(亦即，固定)，且此製備步驟可影響適體或SOMAmer之活性或功能性。
亦描述了允許SOMAmer捕獲溶液中之其標靶且然後採用分離步 驟之SOMAmer分析，該等分離步驟被設計來在偵測之前除去SOMAmer-標靶混合物之特定組分(參見標題為「Multiplexed Analyses of Test Samples」之美國專利申請公開案20090042206)。所描述之SOMAmer分析方法使能夠藉由偵測且定量核酸(亦即，SOMAmer)來偵測且定量測試樣品中之非核酸標靶(例如，蛋白質標靶)。所描述之方法產生用於偵測且定量非核酸標靶之核酸替代物(亦即，SOMAmer)，因此允許廣泛核酸技術(包括擴增)之應用於更廣泛範圍之所要標靶，包括蛋白質標靶。
其中標靶為肽之SELEX方法之實施例描述於標題為「Modified SELEX Processes Without Purified Protein」之美國專利第6,376,190號中。在本發明情況下，標靶為GDF8蛋白。
C經化學修飾之適體
適體可包含改良適體性質及特徵之經修飾核苷酸。此類改良之非限制性實例包括活體內穩定性、針對降解之穩定性、對其標靶之結合親和力及/或經改良之遞送特徵。
此類修飾之實例包括在核苷酸之核糖及/或磷酸及/或鹼基位置處之化學取代。經SELEX方法鑑別之含有經修飾核苷酸之適體描述於標題為「High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides」之美國專利第5,660,985號中，該專利描述含有在嘧啶之5'及2'位置處經化學修飾之核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利第5,580,737號(參見上文)描述含有用2'-胺基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)及/或2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之一或多個核苷酸之高特異性適體。亦參見，標題為「SELEX and PHOTOSELEX」之美國專利申請公開案第20090098549號，其描述具有擴增物理及化學性質之核酸文庫及其在SELEX及photoSELEX中之用途。
C-5修飾之具體實例包括用獨立地選自以下之取代基取代C-5位 置處之去氧核苷：苄基甲醯胺(或者苄基胺基羰基)(Bn)、萘基甲基甲醯胺(或者萘基甲基胺基羰基)(Nap)、色胺基甲醯胺(或者色胺基羰基)(Trp)及異丁基甲醯胺(或者異丁基胺基羰基)(iBu)，如以下即將所示。
Figure 105103922-A0202-12-0025-4
C-5經修飾嘧啶之化學修飾亦可單獨地或以任何組合與2'-位置糖修飾、在環外胺處之修飾及4-硫代尿苷之取代等組合。
代表性C-5經修飾嘧啶包括：5-(N-苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-0-甲基尿苷、5-(N-苄基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-0-甲基尿苷、5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-0-甲基尿苷、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷、5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]甲醯胺)-2'-去氧尿苷氯化物、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-0-甲基尿苷、5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷或5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]甲醯胺)-2'-去氧尿苷)。
如果存在，可在多核苷酸之組裝之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可由非核苷酸組分間斷。多核苷酸可在聚合之後進行進一步修飾，諸如藉由與標記組分結合。
可併入本揭示案之核酸序列中之經修飾核苷酸(例如，C-5經修飾嘧啶)的額外非限制性實例包括以下：
Figure 105103922-A0202-12-0026-6
鹼基=尿苷(U)或胞苷(C)(連接為至5-位置)
K=R’基加(CH2)n連接基，其中n=0-3
R'係如下定義：
Figure 105103922-A0202-12-0027-7
且R"、R'''及R''''係如下定義：其中R''''係選自由以下組成之群：支鏈或線性低碳烷基(C1-C20)；鹵素(F、Cl、Br、I)；腈(CN)；硼酸(BO2H2)；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR")；一級醯胺(CONH2)；二級醯胺(CONHR")；三級醯胺(CONR"R''')；磺醯胺(SO2NH2)；N-烷基磺醯胺(SONHR")。
其中R"、R'''係選自由以下組成之群：支鏈或線性低碳烷基(C1-C2)； 苯基(C6H5)；經R''''取代之苯基環(R''''C6H4)；其中R''''為以上所定義；羧酸(COOH)；羧酸酯(COOR''''')；其中R'''''為支鏈或線性低碳烷基(C1-C20)；及環烷基；其中R"=R'''=(CH2)n；其中n=2-10。
其他C-5經修飾嘧啶核苷酸包括以下：
Figure 105103922-A0202-12-0028-8
在一些實施例中，經修飾核苷酸賦予對適體之核酸酶抗性。具有在C-5位置之取代的嘧啶為經修飾核苷酸之實例。修飾可包括主鏈修飾、甲基化、不尋常鹼基配對組合諸如異鹼基、異胞苷及異胍等。修飾亦可包括3'及5'修飾，諸如封端。其他修飾可包括用類似物取代一或多種天然存在之核苷酸，核苷酸間修飾諸如具有不帶電鍵聯之彼等核苷酸間修飾(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電荷鍵聯之彼等核苷酸間修飾(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、具有嵌入劑之彼等核苷酸間修飾(例如，吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑之彼等核苷酸間修飾(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、含有烷化劑之彼等核苷酸間修飾及具有經修飾鍵聯之彼等核苷酸間修飾(例如，α端基異構核酸等)。此外，通常存在於核苷酸之糖上之任何羥基可經膦酸酯基或磷酸酯基替 代；經標準保護基保護；或經活化以製備與額外核苷酸或固體支撐物之額外鍵聯。5'和3'端OH基團可經磷酸化或經胺、約1至約20個碳原子之有機封端基團部分、聚乙二醇(PEG)聚合物(在一個實施例中，約10至約80kDa之範圍內)、PEG聚合物(在另一個實施例中，約20至約60kDa之範圍內)或其他親水性或疏水性生物或合成聚合物取代。在一個實施例中，修飾具有嘧啶之C-5位置。此等修飾可直接經由在C-5位置之醯胺鍵聯產生或由其他類型之鍵聯產生。
適體亦可包含此項技術中一般已知之核糖或去氧核糖之類似形式，包括2'-0-甲基-、2'-0-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、a-端基異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖)、呱喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物及無鹼基核苷類似物(諸如甲基核苷)。如上所述，一或多個磷酸二酯鍵聯可經替代連接基團替代。此等替代連接基團包括其中磷酸酯經P(0)S(「硫代酸酯」)、P(S)S(「二硫代酸酯」)、(0)NR2(「醯胺化物」)、P(0)R、P(0)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)替代之實施例，其中各R或R'獨立地為H、或經取代或未經取代之烷基(1-20C)，其可視情況含有醚(-0-)鍵聯、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。適體中並非所有鍵聯皆需要一致。糖、嘌呤及嘧啶之類似形式之取代可在設計最終產物中為有利的，替代主鏈結構像例如聚醯胺主鏈亦可為有利的。
可包括或併入適體中之C-5經修飾嘧啶之具體實例包括但不限於本文之結構。雖然用於該結構之命名規約假定X為-H(亦即，DNA)，但其亦涵蓋以下結構，其中X可為-OH(RNA)或本文所述之其他取代基(例如，-OCH3；-O-烯丙基；-F；-OEt；-OPr；-NH2；-疊氮基或-OCH2CH2OCH3)，R'可為-H；-OAc；-OBz；-OCH2CH2OCH3及-OSiMe2tBu且R"可為-H；DMT及三磷酸(-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)-O-P(O)(OH)2)，及其鹽。
例示性NapdU結構(5-[N-(1-萘基甲基)甲醯胺]-2’-去氧尿苷)(其中X為H)：
Figure 105103922-A0202-12-0030-9
例示性2NapdU結構(5-[N-(2-萘基甲基)甲醯胺]-2’-去氧尿苷)(其中X為H)：
Figure 105103922-A0202-12-0030-10
例示性PPdU結構(5-[N-(苯基-3-丙基)甲醯胺]-2’-去氧尿苷)(其中X為H)：
Figure 105103922-A0202-12-0030-12
例示性TrpdU結構(5-[N-(3-吲哚-2-乙基)甲醯胺]-2’-去氧尿苷)(其中X為H)：
Figure 105103922-A0202-12-0030-13
例示性2NEdU結構5-[N-(2-萘基-2-乙基)甲醯胺]-2’-去氧尿苷)(其中X為H)：
Figure 105103922-A0202-12-0031-14
提供以下實例以說明某些具體特徵及/或實施例。此等實例不應解釋為將本揭示案限制為所描述之具體特徵或實施例。
D例示性GDF8適體
本文提供結合GDF8之適體。在一些實施例中，適體結合GDF8之親和力小於10nM。在一些此類實施例中，當在相同結合條件下量測兩種親和力時該適體結合GDF11之親和力比對GDF8之親和力弱至少10倍。在一些實施例中，該適體結合GDF8之親和力介於0.5nM與10nM之間，且結合GDF11之親和力大於50nM、或大於100nM、或大於150nM、或大於200nM或大於300nM。在一些實施例中，該適體在相同條件下不結合GDF11，在該等條件下該適體結合GDF8之親和力小於10nM。在一些實施例中，該適體結合GDF8之親和力小於8nM、或小於7nM、或小於6nM、或小於5nM、或小於4nM、或小於3nM、或小於2nM、或小於1nM；或介於0.1nM與10nM之間、介於0.1nM與8nM之間或介於0.1nM與5nM之間。
在一些實施例中，使用本文所述之分析測定親和力。在一些實施例中，在聚陰離子抑制劑存在下測定親和力。非限制性例示性聚陰離子抑制劑在本文描述。在一些實施例中，在Z阻斷劑存在下測定親和力。
在一些實施例中，結合GDF8之適體包含序列： 5’-GWWR1CnR2ZGnGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KWnAGX2 nWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：1)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
在一些實施例中，提供結合GDF8之適體，其中該適體包含序列5’-GWWR1R2ZGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KAGWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：49)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
在一些實施例中，結合GDF8之適體包含選自以下之序列：a)5’-X1GWWR1CnR2ZGnGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KWnAGX2 nWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：2)；或b)5’-WGWWAGZGWX2CWWX1AWGAGWCWAD-3’(SEQ ID NO：3)其中W、Z、R1、R2、X1、X2、K、D及n係如上定義。
在一些實施例中，至少一個X1為W。在一些實施例中，各X1為W。在一些實施例中，至少一個或兩個R1為A。在一些實施例中，至少一個或兩個R2為G。在一些實施例中，至少一個或兩個Z為A。在一些實施例中，K為G。在一些實施例中，D為G。在一些實施例中，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個或8個n為0。在一些實施例中，所有n皆為0。在一些實施例中，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個或8個n為1。
在一些實施例中，提供GDF8適體，其中該適體包含序列5’-GWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAG-3’(SEQ ID NO：4)，其中各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶。
在本文所述之任何實施例中，各W獨立地選自本文所述之C-5經修飾嘧啶。在一些實施例中，各P係選自：5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)， 5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個W各自獨立地選自5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷及5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
在一些實施例中，GDF8適體包含選自SEQ ID NO：5至48之序列。在一些實施例中，GDF8適體包含選自SEQ ID NO：5至19、26至28、30至32及34至48之序列。在一些實施例中，GDF8適體包含選自SEQ ID NO：5至19、26至28及30至32之序列。
在一些實施例中，GDF8適體可包括達約100個核苷酸、達約95個核苷酸、達約90個核苷酸、達約85個核苷酸、達約80個核苷酸、達約75個核苷酸、達約70個核苷酸、達約65個核苷酸、達約60個核苷酸、達約55個核苷酸、達約50個核苷酸、達約45個核苷酸、達約40個核苷酸、達約35個核苷酸、達約30個核苷酸、達約25個核苷酸及達約20個核苷酸。
在一些實施例中，GDF8適體可與選自SEQ ID NO：5至19、26至28、30至32及34至48之序列至少約95%一致、至少約90%一致、至少約85%一致、至少約80%一致或至少約75%一致。在另一個實施例中，GDF8適體包含選自SEQ ID NO：5至19、26至28、30至32及34至 48之序列。在另一個實施例中，GDF8適體包含來自SEQ ID NO：5至19、26至28、30至32及34至48之序列之片段，該序列結合GDF8之親和力(Kd)小於100nM、小於50nM、小於20nM或小於10nM。在相關態樣，其片段為約25至49個核苷酸長(或約23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48或49個核苷酸長)。
在一些實施例中，GDF8適體可對GDF8具有約10nM或10nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約15nM或15nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約20nM或20nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約25nM或25nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約30nM或30nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約35nM或35nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約40nM或40nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約45nM或45nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約50nM或50nM以下之解離常數(K d )。在另一個例示性實施例中，GDF8適體對GDF8蛋白具有約3-10nM(或3、4、5、6、7、8、9或10nM)範圍內之解離常數(K d )。適合解離常數可用結合分析使用多點滴定且擬合方程y=(最大值-最小值)(蛋白質)/(K d +蛋白質)+最小值來測定，如本文所述。在其他實施例中，GDF8適體為具有小於或等於包含SEQ ID NO：5之序列之適體的K d 之K d 的適體。
在一些實施例中，適體包含可偵測標記。
偵測GDF8之方法
在一些實施例中，提供偵測樣品中之GDF8的方法，該等方法包括使該樣品與本文所述之適體相接觸。在一些實施例中，提供在GDF11存在下偵測或定量GDF8之方法，該等方法包括使疑似含有GDF8及GDF11兩者之樣品與本文所述之適體相接觸。在一些實施例中，提供區分樣品中之GDF8與GDF11的方法，該方法包括使該樣品與本文所述之適體相接觸。在一些實施例中，該方法包括使樣品與本文所述之GDF8適體在聚陰離子抑制劑存在下相接觸。
偵測及/或定量由GDF8適體結合之GDF8可使用此項技術中之方法及/或本文所述之方法來完成。在一些實施例中，GDF8適體包含可偵測標記。在一些實施例中，GDF8適體結合至固體支撐物，或包含可捕獲在固體支撐物上之結合對之成員(例如，生物素化適體可結合至包含抗生蛋白鏈菌素之固體支撐物)。
包括GDF8適體組合物之套組
本揭示案提供包括本文所述之任何GDF8適體之套組。此類套組可包括例如，(1)至少一種GDF8適體；及(2)至少一種醫藥學上可接受之載劑，諸如溶劑或溶液。額外套組組件可視情況包括例如：(1)本文所鑑別之任何醫藥學上可接受之賦形劑，諸如穩定劑、緩衝劑等，(2)用於容納及/或混合該等套組組件之至少一個容器、小瓶或類似裝置；及(3)遞送裝置。
實例 實例1：具有GDF8結合特異性之適體之選擇及鑑別
此實例提供用於選擇及產生結合成熟GDF8蛋白之適體的代表性方法。
選擇對GDF8具有特異性之適體的先前嘗試一直具有挑戰性。使用SELEX方法比較所選定若干適體對肌抑素(GDF8)及GDF11之蛋白質結合親和力在以下表1中示出。
Figure 105103922-A0202-12-0037-15
如表1中所示，選擇為結合GDF8之適體一般亦對GDF11具有親和力。GDF8與GDF11對每種適體之結合親和力的比率亦在表1中示出。該等比率自一(1)以下(亦即，相較於GDF11，該適體對肌抑素具有較佳親和力)至大於一(亦即，相較於肌抑素，該適體對GDF11具有較佳親和力)之比率變化。然而，此等親和力差異不足以在蛋白質結合分析中區分肌抑素及GDF11。因此，不能區分GDF11及GDF8之存在及/或水準。鑒於鑑別可區分GDF8與GDF11之GDF8適體之挑戰，將反向選擇策略引入SELEX方法中。
使用慢解離速率增濃過程進行之適體選擇
使用本文所述之SELEX方法進行具有GDF8之SELEX。此外，涉及被動反向選擇之方案修飾應用於選擇不結合GDF11或對GDF8具有比對GDF11更大親和力之GDF8適體。
被動反向選擇用呈未經標記形式之非所要標靶(GDF11)，藉由在選擇期間將該標靶添加至PCB(含有凝血酶原、酪蛋白及白蛋白之蛋白質競爭緩衝液)、除去缺乏對GDF8超過GDF11之偏好性之序列來進行。GDF11與GDF8之比率在第一輪中為1：1(各自100pmol)、在第二輪中為2：1(20pmol GDF11及10pmol GDF8)，且在SELEX之隨後輪中隨著GDF8標靶濃度降低而增加(20pmol GDF11及0.1pmol GDF8或約200：1)。
候選混合物之製備
藉由退火至生物素化ssDNA範本之DNA聚合物之聚合酶延伸來製備部分隨機化ssDNA寡核苷酸之候選混合物(在以下表2中示出)。候選混合物含有40核苷酸隨機化基因盒，其含有dATP、dGTP、dCTP及5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)。
Figure 105103922-A0202-12-0038-16
B'=生物素
將5毫升之抗生蛋白鏈菌素加UltraLink樹脂(PIERCE)之50%漿液用2.5mL之20mM NaOH洗滌一次，用2.5mL之SB18T0.05(40mM HEPES(4-(2-羥基乙基)呱嗪-1-乙磺酸)緩衝液(用NaOH調整至pH 7.5)、102mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2及0.05% TWEEN 20)洗滌兩次且用2.5mL之16mM NaCl洗滌兩次。將具有兩個生物素殘基(在序列中指定為B')及40個隨機化位置(在序列中指定為N40)之180奈莫耳之範本1(SEQ ID NO：59)添加至經洗滌之UltraLink SA珠粒且在37℃下旋轉2.5小時。然後將珠粒用16mM NaCl洗滌三次。在每次洗滌之間，藉由離心回收珠粒。
將四分之一之珠粒(現在含有45nmol捕獲範本)懸浮於1.5mL之延伸反應緩衝液(含有45nmol之引子(SEQ ID NO：60)、1X SQ20緩衝液(120mM Tris-HCl(pH7.8)、10mM KCl、7mM MgSO4、6mM(NH4)2SO4、0.001% BSA及0.1% TritonX-100)、470單位之KOD XLDNA聚合酶(EMD MILLIPORE)及各自1mM之dATP、dCTP、dGTP及TrpdUTP)中。使珠粒在旋轉下在68℃下培育2小時。然後將珠粒用 SB18T0.01(如上之SB18，但具有0.01% TWEEN-20)洗滌一次，且用16mM NaCl洗滌兩次。
用1.0mL之40mM NaOH從珠粒上溶離適體文庫。將經溶離文庫立即用15μL之中和劑(700mM HCl，180mM HEPES，0.45% TWEEN-20)中和。溶離再重複兩次，且匯集溶離物。將文庫用AMICON Ultracel YM-10過濾器濃縮至大約0.4mL且藉由紫外線吸收光譜學測定文庫之濃度。
人類GDF8之生物素標記
將在於大腸桿菌(Peprotech，目錄號120-11)中過度表現之後以同源二聚形式純化之未經標記之重組人類GDF8蛋白藉由NHS-PEO4-生物素(PIERCE，EZ-Link NHS-PEG4-生物素)與含有一級胺之殘基的共價偶合生物素化。將蛋白質(於80μL中1600pmol)與4倍莫耳過量之NHS-PEG4-生物素混合且允許反應在20℃下培育1小時。在反應完成之後，使用ZebaTM脫鹽旋轉管柱(PIERCE)除去未經反應之NHS-PEG4-生物素，其中緩衝液已交換至SB18T0.05。
使用慢解離速率增濃過程進行之適體選擇
用針對親和力及慢解離速率之選擇完成總計9輪SELEX方法。在每輪之前，進行反向選擇以降低背景且降低獲得具有與蛋白質之非特異性結合之適體的可能性。此外，單獨類型之反向選擇應用於不會結合緊密相關之90%一致之蛋白質GDF11之GDF8適體之強制選擇。如下進行反向選擇。
對於第1輪，將100μL之含有於SB18T0.05中之大約1nmole DNA的DNA候選混合物在95℃下加熱5分鐘且隨後冷卻至70℃持續5分鐘，隨後冷卻至48℃持續5分鐘，且隨後轉移至37℃阻斷劑持續5分鐘。隨後將樣品與10μL之蛋白質競爭混合物(0.1% HSA、10μM酪蛋白、10μM凝血酶原及SB18T0.05中之10μM未經標記之GDF11)及1mg(100 μL)之抗生蛋白鏈菌素珠粒組合。
對於第2-9輪，將自前一輪獲得之68μL等分試樣之DNA候選混合物(自前一輪獲得之68%之eDNA)與13μL之5x SB18T0.05混合。將樣品加熱至95℃持續3分鐘且以0.1℃/秒之速率冷卻至37℃。隨後將樣品與9μL之蛋白質競爭混合物(0.1% HSA、於SB18T0.05中之10μM凝血酶原及於SB18T0.05中之10μM未經標記之GDF11)及0.1mg(10μL)之SA珠粒組合且在37℃下在混合下培育10分鐘(標準SELEX)。藉由磁性分離除去珠粒。
在第一反向選擇之後，將標靶蛋白質預先固定在SA珠粒上以用於第1輪選擇過程。為了完成此，將0.5mg之SA珠粒與50pmoles之經生物素標記之標靶蛋白質(肌抑素同二聚體)混合且在37℃下在振盪下培育30分鐘。藉由用SB18T0.05洗滌珠粒兩次來除去未結合之標靶。將反向選擇之DNA候選混合物(100μL)添加至珠粒且在37℃下在混合下培育60分鐘。在第一輪中未採用慢解離速率增濃過程且僅將珠粒用100μL SB18T0.05洗滌5次各自持續2分鐘。在洗滌之後，藉由添加45μL之8mM NaOH且在37℃下在混合下培育5分鐘從珠粒溶離結合之適體。在珠粒之磁性分離之後將含有適體之溶離物(40μL)轉移至新管。用45μL之8mM NaOH再重複一次溶離，且在37℃下在混合下培育5分鐘。將溶離物組合(80uL)且藉由添加20μL之32mM HCl及2μL Tris-HCl pH 7.5中和溶液。
對於第2-9輪，用如以下描述之DNA候選混合物及標靶蛋白質進行選擇，同時用DNA候選混合物但無標靶蛋白質並行進行一致選擇。自針對具有標靶蛋白質(信號S)及無標靶蛋白質之樣品(背景B)之PCR獲得之Ct值的比較用作指導以降低下一輪中之標靶濃度。若△Ct值大於4但小於8，則標靶蛋白質在下一輪中降低三倍。若△Ct值大於8，則標靶在下一輪中降低10倍。
在此等方案之後，在多輪標準SELEX之後肌抑素濃度之降低為3倍(第6輪)、10倍(第7輪)、30倍(第8輪)及100倍(第9輪)。
對於第2輪，將經標記之標靶蛋白質(於10μL中之5pmoles肌抑素同二聚體)與40μL之反向選擇之DNA候選混合物混合且在37℃下培育15分鐘。藉由添加50μL之10mM硫酸葡聚糖、隨後立即添加0.1mg之SA珠粒來開始慢解離速率增濃過程。允許此在37℃下在混合下培育15分鐘。隨後將珠粒用100μL之SB18T0.05洗滌5次。藉由添加105μL之高氯酸鈉溶離緩衝液(1.8M NaClO4、40mM PIPES pH 6.8、1mM EDTA、0.05% Triton X-100)且在37℃下在混合下培育10分鐘來自珠粒溶離適體鏈。將珠粒藉由磁性分離除去且將100μL之適體溶離物轉移至含有引子捕獲珠粒(25μL之2.5mg/mL SA珠粒，其中連接12.5pmol引子2(SEQ ID NO：61))之新管且允許在50℃下在混合下培育30分鐘。隨後將珠粒用100μL之SB18T0.05洗滌三次。藉由添加85μL之40mM NaOH自珠粒溶離適體鏈，且將溶離物(80μL)用20μL之160mM HCl及2μL之500mM Tris-HCl pH 7.5中和。
如針對第2輪所述進行第3輪至第9輪選擇，例外之處在於在添加珠粒之前15分鐘(第3-4輪)、30分鐘(第5輪)、45分鐘(第6輪)、60分鐘(第7輪)、75分鐘(第8輪)或90分鐘(第9-11輪)添加硫酸葡聚糖。用0.1mg中和親和素塗佈之Sera-Mag SpeedBeads(Fisher Scientific，目錄號09-981-155，或後文稱為NA珠粒，第3、5、7、9輪)或用0.1mg之SA珠粒(第4、6、8輪)進行分配。
在9輪SELEX之後獲得之池顯示對許可離子激流ePCR及測序(表3)之良好活性。對於各池，針對主要候選物之競爭序列分析、隨後結合分析獲得384個序列。
表3.用標準SELEX及用GDF11被動反向選擇獲得之肌抑素適體池之親和力資料。
Figure 105103922-A0202-12-0042-17
適體擴增及純化
將來自各輪之選定適體DNA藉由QPCR擴增且定量。將48μL DNA添加至12μL QPCR混合物(10X KOD DNA聚合酶緩衝液；Novagen #71157，稀釋至5X，25mM MgCl2,、10μM正向PCR引子(引子1，SEQ ID NO：60)、10μM生物素化反向PCR引子(引子2，SEQ ID NO：61)、5X SYBR Green I、0.075U/μL KOD XL DNA聚合酶及各自1mM dATP、dCTP、dGTP及dTTP)且在A BIO-RAD MyIQ QPCR儀器中用以下方案熱循環：96℃持續15秒、55℃持續10秒及68℃持續30秒之1個循環；隨後96℃持續15秒、68℃持續1分鐘之30個循環。用儀器軟體進行定量，且將有及無標靶蛋白質之選定DNA之複本的數目進行比較以測定信號/背景比率。
在擴增之後，將PCR產物經由生物素化反義鏈捕獲在SA珠粒上。將1.25mL SA珠粒(10mg/mL)用14mL 20mM NaOH洗滌一次，用14mL SB18T0.05洗滌兩次，再懸浮於1.25mL 3M NaCl+0.05% TWEEN中且儲存在4℃下。將25μL SA珠粒(於3M NaCl中10mg/mL)添加至50μL雙鏈QPCR產物且在25℃下在混合下培育5分鐘。藉由添加100μL之40mM NaOH且在37℃下在混合下培育5分鐘從珠粒溶離「有義」鏈。將經溶離鏈丟棄且將珠粒用SB18T洗滌兩次且用16mM NaCl洗滌一次。
藉由自經固定之反義鏈因數延伸來製備含有TrpdUTP之適體有義鏈。將珠粒懸浮於40μL引子延伸反應混合物(1X引子延伸緩衝液(120mM Tris-HCl pH 7.8、10mM KCl、7mM MgSO4、6mM(NH4)2SO4、 0.1% TRITON X-100及0.001%胎牛血清白蛋白)、2.5μM正向引子(引子1，SEQ ID NO：60)、各自0.5mM dATP、dCTP、dGTP及TrpdUTP、及0.015U/μL KOD XL DNA聚合酶)中在68℃下在混合下培育60分鐘。將珠粒用SB18T0.05洗滌3次，且藉由添加45μL之40mM NaOH且在37℃下在混合下培育5分鐘從珠粒溶離適體鏈。在磁性分離之後將40μL適體溶離物轉移至新管，且用45μL之40mM NaOH且在37℃下在混合下培育5分鐘再重複一次溶離。將溶離物合併(80uL)，將溶液用20μL 160mM HCl中和並用10μL of 0.1M HEPES,pH 7.5緩衝。
選擇嚴格性及回饋
將選擇步驟之相對標靶蛋白濃度按照以下準則回應於QPCR信號(△Ct)每輪降低：若△Ct<4，則[P](i+1)=[P](i)
若4
Figure 105103922-A0202-12-0043-113
△Ct<8，則[P](i+1)=[P](i)/3.2
若△Ct
Figure 105103922-A0202-12-0043-114
8，則[P](i+1)=[P](i)/10
其中[P]=蛋白質濃度且i=當前輪數。
在各輪選擇之後，測定經增濃DNA混合物之會聚狀態。將10μL雙鏈QPCR產物用含有1X SYBR Green I之4mM MgCl2稀釋至200μL。使用C0t分析針對會聚對樣品進行分析，該C0t分析量測雙鏈寡核苷酸之複合混合物之雜交時間。按以下方案將樣品進行熱循環：98℃持續1分鐘、85℃持續1分鐘之3個循環；98℃持續1分鐘、隨後85℃持續30分鐘之2個循環。在85℃下30分鐘期間，以5秒間隔量測螢光圖像。繪製熒光強度作為時間對數之函數的圖，觀察到每一輪SELEX之雜交率提高，這指示序列會聚。
經增濃之池測序及適體鑑別
在9輪SELEX之後，對經會聚之池進行測序。如下進行序列製 備。使用含有唯一條碼/索引序列(針對各池之唯一序列識別字)之SELEX文庫特異性引子藉由PCR擴增該池。使用Quant-iTTMPicoGreen® dsDNA試劑(LIFE TECHNOLOGIES)分析定量各別PCR產物，以等莫耳濃度組合，且使用AMICON Ultra-0.5離心過濾器裝置(MILLIPORE)濃縮/緩衝交換。然後藉由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)純化混合物，且使用Amicon Ultra-0.5離心過濾器裝置濃縮溶離物，且藉由PAGE視覺化以確認最終混合物之大小、純度及產率。將樣品提交至SeqWright Genomic Services(GE HEALTHCARE,Houston,TX)以用於離子激流PGM測序。自含有超過40,000個序列之序列池，使用局部比對演算法使用定制軟體隨機選擇384個序列且針對會聚進行分析，該定制軟體測定序列計數/複本數目且鑑別常見會聚模式。在池中具有最大表現度/複本數目之序列及來自每種會聚模式之至少一個序列經選擇用於進一步表徵。值得注意，從序列分析及基元鑑別中除去來自SELEX適體池之具有序列品質分數為「低」(即Phred品質分數為20或低於20)之彼等序列讀數。
藉由功能分析進行之適體鑒別
序列模式1最初經由與肌抑素及GDF11之競爭結合分析自序列14583-49_3(SEQ ID NO：5)鑑別(參見實例2)。序列中之字母「W」指示TrpdU。
適體ID 14583-49_3：5'-ctctgAWACGGCCWWAGWGWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAGACCA caaca-3'(SEQ ID NO：5)
並行地，藉由分析池14583中之384序列之間之相關序列的豐度且藉由與用同一TrpdU文庫使用GDF11在SELEX中獲得之序列的競爭分析來經由電腦類比鑑別序列模式1。序列模式1在使用被動反向選擇 來自肌抑素SELEX之池14583中高度增濃(9%)且在來自GDF11 SELEX之池14582中不存在。參見表4。
Figure 105103922-A0202-12-0045-18
實例2：適體與肌抑素(GDF8)蛋白對GDF11之平衡結合常數(K d )
此實例提供適體-GDF8及適體-GDF11蛋白之蛋白質結合親和力(K d )，及相較於GDF11優先結合GDF8之適體的鑑別。
對經由本文所述之反向選擇SELEX方法選擇之若干適體純系進行進一步表徵且針對相較於GDF11優先結合GDF8進行選擇(參見表5)。在作為非特異性競爭者之0.1-1μM Z-阻斷劑(隨機寡核苷酸序列)不存在及存在下進行結合分析。具有BndU之適體作為C-5經修飾嘧啶(BndU GDF11適體)，其係先前經由SELEX在無反向選擇步驟情況下所選擇且用作結合GDF11及GDF8兩者之對照。使用BndU GDF11適體之先前結合實驗顯示其一般對GDF11及GDF8無差別。
Figure 105103922-A0202-12-0045-19
*5’-CTCTGAACWWCWAAWGWCWCWWGCAWWWWAWCGCAWWGAW WWCWCCAACA-3’(SEQ ID NO：62)
適體池14583(TrpdU適體)(其已使用被動反向選擇藉由SELEX獲得)含有較少對肌抑素具有高親和力之核苷酸序列，及對肌抑素具有變化程度之選擇性(參見K d 比率，其中較大數值指示相較於GDF11對肌抑素之更大特異性)。特定言之，適體純系14583-49_3(TrpdU)當在0.1μM Z-阻斷劑存在下測試時顯示相較於GDF11對肌抑素之約8.5倍差別K d (亦即，0.13nM對1.11 nM之K d )且展現對GDF-11之低接合平臺期(圖1)。
表5之其他適體純系表示具有模式A之高豐度序列(參見以上表4)。適體純系14583-19對肌抑素具有1.16nM之K d ，但亦對GDF11具有0.42nM之K d (圖2)。
實例3：肌抑素適體14583-49之SELEX後截短及分析
此實例提供14583-49_3適體之截短序列之SELEX後肌抑素結合親和力及能夠結合至肌抑素之核心最小序列長度之鑑別。
適體14583-49(含有TrpdU)截短指示23聚體序列5'-GWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAG-3'(適體14583-49_30；SEQ ID NO：32)能夠結合肌抑素。然而，24聚體序列5'-WGWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAG-3'(適體純系14583-49_29；SEQ ID NO：31)之活性顯示稍微更好結合之肌抑素(2.28E-10之K d )(參見圖3)。此與在與14583-49相關之活性純系之家族中發現之保守基元5’-WGWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAG-3’(SEQ ID NO：31)一致。
24聚體截短適體純系14583-49_29；SEQ ID NO：31)與全長50聚體適體14583-49_3；SEQ ID NO：5)活性相等(對24聚體2.28E-10之K d 且對50聚體1.32E-10之K d )，但顯示肌抑素對GDF11之結合之間之相對較佳區分(對肌抑素2.28E-10之K d 且對GDF-11>3.20E-07之K d )(圖4)。
實例4：額外GDF8適體序列
此實例提供使用主要GDF8選擇性適體結合序列(14583-49_3)進行之SELEX適體池之BLAST分析的結果。此分析導致鑑別亦包含共同或核心基元之額外適體序列。關於序列之比對參見表6。
自表6中之序列的比對，可獲得若干基元序列，其中各基元維持與自實例3及4中之14583-49_3適體序列的比對鑑別之基元(或共同序列)之重疊。
以下基元可自表6中之基元定義：5’-GWWR1CnR2ZGnGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KWnAGX2 nWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：1)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。測定在表6中示出之某些序列對肌抑素之親和力。適體14583-49_35(SEQ ID NO：35)據發現對肌抑素具有之親和力(Kd)為9.8nM且適體14583-49_36(SEQ ID NO：40)據發現對肌抑素具有之親和力(Kd)為17.3nM。相比之下，適體14583-49_37(SEQ ID NO：42)及14583-49_38(SEQ ID NO：47)據發現對肌抑素具有之(Kd)大於320nM。
從該資料，可自表6中之基元定義子基元：5’-GWWR1R2ZGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KAGWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：49)，其中： 各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
Figure 105103922-A0202-12-0048-20
Figure 105103922-A0202-12-0049-21
<110> 美商身體邏輯股份有限公司(SOMALOGIC,INC.)
<120> 用於結合生長分化因數8之核酸化合物
<140> TW 105103922
<141> 2016-02-05
<150> US 62/113,866
<151> 2015-02-09
<160> 63
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：結合GDF8之適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n為a或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> n(若存在)為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n為g或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n(若存在)為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n(若存在)為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n為a或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n為g、a或C-5經修飾嘧啶
<400> 1
Figure 105103922-A0305-02-0053-1
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：結合GDF8之適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n為a或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n(若存在)為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n為g或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n(若存在)為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n(若存在)為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(31)
<223> n為a或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n為g、a或C-5經修飾嘧啶
<400> 2
Figure 105103922-A0305-02-0055-2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：結合GDF8之適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n為a或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 3
Figure 105103922-A0305-02-0056-3
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：結合GDF8之適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<400> 4
Figure 105103922-A0305-02-0057-4
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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Figure 105103922-A0305-02-0058-5
<210> 6
<211> 48
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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Figure 105103922-A0305-02-0059-6
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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Figure 105103922-A0305-02-0059-7
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14583-49_6
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<400> 8
Figure 105103922-A0305-02-0060-8
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(7)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(13)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n為TrpdU
<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<400> 9
Figure 105103922-A0305-02-0061-9
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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Figure 105103922-A0305-02-0062-10
<210> 11
<211> 38
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<220>
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<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> n為TrpdU
<400> 11
Figure 105103922-A0305-02-0063-11
<210> 12
<211> 36
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> n為TrpdU
<400> 12
Figure 105103922-A0305-02-0063-12
<210> 13
<211> 34
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<213> 人工序列
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(5)
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<220>
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<223> n為TrpdU
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Figure 105103922-A0305-02-0064-13
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14583-49_12
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
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<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<223> n為TrpdU
<400> 14
Figure 105103922-A0305-02-0065-14
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<223> n為TrpdU
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Figure 105103922-A0305-02-0065-15
<210> 16
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(31)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n為TrpdU
<400> 16
Figure 105103922-A0305-02-0066-16
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14583-49_15
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(31)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n為TrpdU
<400> 17
Figure 105103922-A0305-02-0067-17
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14583-49_16
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(31)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n為TrpdU
<400> 18
Figure 105103922-A0305-02-0068-18
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14583-49_17
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(31)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(33)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (37)..(37)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(39)
<223> n為TrpdU
<400> 19
Figure 105103922-A0305-02-0069-19
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Figure 105103922-A0305-02-0082-36
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Figure 105103922-A0305-02-0083-37
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<400> 38
Figure 105103922-A0305-02-0084-38
<210> 39
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
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<400> 39
Figure 105103922-A0305-02-0085-39
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
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<400> 40
Figure 105103922-A0305-02-0086-40
<210> 41
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
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<400> 41
Figure 105103922-A0305-02-0086-41
<210> 42
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
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<400> 42
Figure 105103922-A0305-02-0087-42
<210> 43
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
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<400> 43
Figure 105103922-A0305-02-0088-43
<210> 44
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
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<400> 44
Figure 105103922-A0305-02-0089-44
<210> 45
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<400> 45
Figure 105103922-A0305-02-0090-45
<210> 46
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223> n為TrpdU
<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<400> 46
Figure 105103922-A0305-02-0091-46
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<222> (12)..(12)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
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<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(35)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n為TrpdU
<400> 47
Figure 105103922-A0305-02-0092-47
<210> 48
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：適體核苷酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(10)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(26)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (35)..(36)
<223> n為TrpdU
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n為TrpdU
<400> 48
Figure 105103922-A0305-02-0093-48
<210> 49
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：結合GDF8之適體
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(3)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> n為a或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> n為a、C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> n(若存在)為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> 可能不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n為g或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n為C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(25)
<223> n為C-5經修飾嘧啶或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> n為a或C-5經修飾嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n為g、a或C-5經修飾嘧啶
<400> 49
Figure 105103922-A0305-02-0094-49
<210> 50
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(109)
<223> 非限制性例示性成熟人類GDF11蛋白
<400> 50
Figure 105103922-A0305-02-0095-50
<210> 51
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(109)
<223> 人類肌抑素(GDF8)蛋白質ID為014793；例示性人類成熟GDF8
<400> 51
Figure 105103922-A0305-02-0095-51
Figure 105103922-A0305-02-0096-52
<210> 52
<211> 109
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(109)
<223> 小鼠GDF8蛋白質ID為008689；例示性小鼠成熟GDF8
<400> 52
Figure 105103922-A0305-02-0096-53
<210> 53
<211> 109
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(109)
<223> 大鼠GDF11蛋白質ID為035312；例示性大鼠成熟GDF8
<400> 53
Figure 105103922-A0305-02-0097-54
<210> 54
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(109)
<223> 人類GDF11蛋白質ID為095390；例示性人類成熟GDF11
<400> 54
Figure 105103922-A0305-02-0097-55
Figure 105103922-A0305-02-0098-56
<210> 55
<211> 109
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(109)
<223> 小鼠GDF11蛋白質ID為Q9Z1W4；例示性小鼠成熟GDF8
<400> 55
Figure 105103922-A0305-02-0098-57
<210> 56
<211> 103
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> 大鼠GDF11蛋白質ID為Q9Z217；例示性大鼠成熟GDF8
<400> 56
Figure 105103922-A0305-02-0098-58
Figure 105103922-A0305-02-0099-59
<210> 57
<211> 407
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(407)
<223> GDF11(蛋白質ID 095390：胺基酸1至407
<400> 57
Figure 105103922-A0305-02-0099-60
Figure 105103922-A0305-02-0100-61
Figure 105103922-A0305-02-0101-62
<210> 58
<211> 375
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(375)
<223> 肌抑素(蛋白質ID 014793：胺基酸1至375
<400> 58
Figure 105103922-A0305-02-0101-63
Figure 105103922-A0305-02-0102-64
<210> 59
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：模板1
<220>
<221> 經修飾_鹼基
<222> (1)..(2)
<223> 生物素
<220>
<221> misc_feature
<222> (31)..(70)
<223> n為a、c、g或t
<400> 59
Figure 105103922-A0305-02-0103-65
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：引子1
<400> 60
Figure 105103922-A0305-02-0103-66
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：引子2
<220>
<221> 經修飾_鹼基
<222> (1)..(2)
<223> 生物素
<400> 61
Figure 105103922-A0305-02-0103-67
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14583-19
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> 每個n為TrpdU
<400> 62
Figure 105103922-A0305-02-0103-68
<210> 63
<211> 109
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(109)
<223> 非限制性例示性成熟人類GDF8蛋白
<400> 63
Figure 105103922-A0305-02-0104-69

Claims (56)

  1. 一種結合GDF8之適體，其中該適體包含序列5’-GWWR1CnR2ZGnGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KWnAGX2 nWCX1Z D-3’(SEQ ID NO：1)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
  2. 如請求項1之適體，其中該適體結合GDF8之親和力小於10nM，其中在相同條件下，該適體結合GDF11之親和力比對GDF8之親和力弱至少10倍或不結合GDF11。
  3. 如請求項2之適體，其中該適體結合GDF11之親和力比對GDF8之該親和力弱至少20倍，或弱至少30倍，或弱至少50倍。
  4. 如請求項2或請求項3之適體，其中該適體結合GDF11之親和力大於50nM、或大於100nM、或大於150nM、或大於200nM、或大於250nM，或大於300nM。
  5. 如請求項2或3之適體，其中該適體結合GDF8之親和力小於8nM、或小於7nM、或小於6nM、或小於5nM、或小於4nM、或小於3nM、或小於2nM，或小於1nM。
  6. 如請求項2之適體，其中該適體不結合GDF11。
  7. 如請求項2、3及6中任一項之適體，其中使用包括聚陰離子抑制劑之結合分析來測定親和力。
  8. 如請求項7之適體，其中該聚陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z-阻斷劑、聚dI/dC、經超音波處理或經剪切之鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA及dNTP。
  9. 如請求項1之適體，其中該適體包含序列：5’-X1GWWR1CnR2ZGnGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KWnAGX2 nWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：2)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
  10. 如請求項1之適體，其中該適體包含序列：5’-GWWR1R2ZGWCnX2CWnWWX1AnR1CnX1KAGWCX1ZD-3’(SEQ ID NO：49)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；R1及R2各自獨立地選自G及A；各Z獨立地選自A及W；K係選自G及W；D係選自G、A及W；及各n獨立地選自0及1。
  11. 如請求項1、9及10中任一項之適體，其中至少一個R1為A。
  12. 如請求項11之適體，其中各R1為A。
  13. 如請求項1、9及10中任一項之適體，其中至少一個R2為G。
  14. 如請求項13之適體，其中各R2為G。
  15. 如請求項1、9及10中任一項之適體，其中K為G。
  16. 如請求項1、9及10中任一項之適體，其中至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個、至少7個或8個n為0。
  17. 如請求項16之適體，其中各n為0。
  18. 如請求項1、9及10中任一項之適體，其中1、2或3個n為1，且該等n中之其餘者為0。
  19. 如請求項1之適體，其中該適體包含序列：5’-WGWWAGZGWX2CWWX1AWGAGWCWAD-3’(SEQ ID NO：3)，其中：各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶；X1及X2各自獨立地選自W及C；Z係選自A及W；及D係選自G、A及W。
  20. 如請求項1、9及10中任一項之適體，其中至少一個X1為W。
  21. 如請求項20之適體，其中各X1為W。
  22. 如請求項1、9、10及19中任一項之適體，其中至少一個X2為C。
  23. 如請求項22之適體，其中各X2為C。
  24. 如請求項1之適體，其中該適體包含序列5’-GWWAGAGWCCWWWAWGAGWCWAG-3’(SEQ ID NO：4)，其中各W獨立地且在每次出現時為C-5經修飾嘧啶。
  25. 如請求項1、9、10、19及24中任一項之適體，其中各W獨立地且在每次出現時係選自：5-(N-苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BndU)，5-(N-苄基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷， 5-(N-苄基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-苯乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(PEdU)，5-(N-苯硫基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(ThdU)，5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(iBudU)，5-(N-酪胺醯基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TyrdU)，5-(N-3,4-亞甲基二氧基苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(MBndU)，5-(N-4-氟苄基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(FBndU)，5-(N-3-苯基丙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(PPdU)，5-(N-咪唑基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(ImdU)，5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-異丁基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)，5-(N-R-酥胺醯基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(ThrdU)，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-[1-(3-三甲基銨)丙基]甲醯胺)-2'-去氧尿苷氯化物，5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-[1-(2,3-二羥基丙基)]甲醯胺)-2'-去氧尿苷)，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷， 5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
  26. 如請求項1、9、10、19及24中任一項之適體，其中各W獨立地且在每次出現時係選自：。5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NapdU)，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NapdU)，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基甲基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(NEdU)，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-1-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(2NEdU)，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-2-萘基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷， 5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BFdU)，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，5-(N-3-苯並呋喃基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(BTdU)，5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷，及5-(N-3-苯並噻吩基乙基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
  27. 如請求項1、9、10、19及24中任一項之適體，其中至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少6個W各自獨立地選自5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷及5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
  28. 如請求項27之適體，其中各W獨立地選自5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-去氧尿苷(TrpdU)、5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-O-甲基尿苷及5-(N-色胺基甲醯胺)-2'-氟尿苷。
  29. 如請求項1之適體，其中該適體包含選自SEQ ID NO：5至48之序列。
  30. 如請求項1之適體，其中該適體包含選自SEQ ID NO：5至19、26至28、30至32及34至48之序列。
  31. 如請求項1之適體，其中該適體包含選自SEQ ID NO：5至19、26至28、30至32、34至41、43至46及48之序列。
  32. 如請求項1至3、9、10、19、24及29至31中任一項之適體，其中該適體由18至200個核苷酸、或18至150個核苷酸、或18至100個核苷酸、或18至75個核苷酸、或18至50個核苷酸、或20至150個核苷酸、或20至100個核苷酸、或20至75個核苷酸、或20至50個核苷酸、或23至200個核苷酸、或23至150個核苷酸、或23至100個核苷酸、或23至75個核苷酸、或23至50個核苷酸組成，其中各核苷酸可獨立地為經修飾或未經修飾之核苷酸。
  33. 如請求項1至3、9、10、19、24及29至31中任一項之適體，其中該適體包含可偵測標記。
  34. 如請求項2或3之適體，其中GDF8為人類、小鼠或大鼠GDF8且GDF11為人類、小鼠或大鼠GDF11。
  35. 如請求項34之適體，其中GDF8為包含SEQ ID NO：63之序列的成熟人類GDF8且GDF11為包含SEQ ID NO：50之序列的成熟人類GDF11。
  36. 一種偵測樣品中之GDF8的方法，該方法包括使來自該樣品之蛋白質與如請求項1至3、9、10、19、24及29至31中任一項之適體相接觸。
  37. 如請求項36之方法，其中該適體結合GDF11之親和力比對GDF8之親和力弱至少10倍或不結合GDF11。
  38. 一種測定樣品是否包含GDF8之方法，該方法包括使來自該樣品之蛋白質與如請求項1至3、9、10、19、24及29至31中任一項之適體相接觸。
  39. 如請求項38之方法，其中該樣品包含GDF11。
  40. 如請求項36之方法，其中該方法包括使該樣品與該適體在嚴格條件下相接觸。
  41. 如請求項40之方法，其中該嚴格條件包括聚陰離子抑制劑。
  42. 如請求項41之方法，其中該聚陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z-阻斷劑、聚dI/dC、經超音波處理或經剪切之鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA及dNTP。
  43. 如請求項36之方法，其中該樣品為來自人類之樣品。
  44. 如請求項43之方法，其中該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。
  45. 如請求項44之方法，其中該組織樣品係選自心肌組織、骨骼肌 組織、胰腺組織、軟骨組織及神經組織。
  46. 如請求項36之方法，其中該等蛋白質已與該樣品之至少一種其他組分分離。
  47. 如請求項36之方法，其中該等蛋白質尚未與該樣品之其他組分分離。
  48. 一種組合物，其包含如請求項1至3、9、10、19、24及29至31中任一項之適體及來自樣品之蛋白質。
  49. 如請求項48之組合物，其中該樣品包含GDF11。
  50. 如請求項48之組合物，其包含聚陰離子抑制劑。
  51. 如請求項50之組合物，其中該聚陰離子抑制劑係選自硫酸葡聚糖、肝素、Z-阻斷劑、聚dI/dC、經超音波處理或經剪切之鮭魚精DNA、小牛胸腺DNA及dNTP。
  52. 如請求項48之組合物，其中該樣品為來自人類之樣品。
  53. 如請求項52之組合物，其中該樣品係選自血液、血清、血漿、唾液、尿液及組織樣品。
  54. 如請求項53之組合物，其中該組織樣品係選自心肌組織、骨骼肌組織、胰腺組織、軟骨組織及神經組織。
  55. 如請求項48之組合物，其中該等蛋白質已與該樣品之至少一種其他組分分離。
  56. 如請求項48之組合物，其中該等蛋白質尚未與該樣品之其他組分分離。
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