KR20210034597A

KR20210034597A - 개선된 프로테오믹 멀티플렉스 검정

Info

Publication number: KR20210034597A
Application number: KR1020217002261A
Authority: KR
Inventors: 스테판 크래머; 에발다스 카틸러스; 도미닉 지치
Original assignee: 소마로직, 인크.
Priority date: 2018-06-22
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2021-03-30
Also published as: EP3810563A1; SG11202012472TA; BR112020026129A8; BR112020026129A2; CN112638845A; WO2019246289A1; JP2021528646A; US20210247387A1; IL279254A; CA3104041A1; BR112020026129B1; EP3810563A4; AU2019290130A1; MX2020013814A

Abstract

프로테오믹 기반 검정의 성능을 개선하도록 설계된 방법, 장치, 시약 및 키트가 제공된다. 이러한 방법은 멀티플렉스 검정 포맷에서 배경 신호의 감소 또는 제거 및 단백질 결합 시약에 대한 개선된 특이성을 제공함으로써 연구 및 개발, 진단 및 치료용 프로테오믹 적용에서 광범위한 유용성을 갖는다.

Description

개선된 프로테오믹 멀티플렉스 검정

본 개시는 일반적으로 프로테오믹 검정, 그리고 검정의 성능을 개선하도록 설계된 방법, 장치, 시약 및 키트 분야에 관한 것이다. 이러한 방법은 연구 및 개발, 진단 및 치료를 위한 프로테오믹 적용에서 광범위한 유용성을 갖는다. 구체적으로, 물질 및 방법은 배경 신호의 감소 또는 제거 및 멀티플렉스 검정 포맷에서 단백질 결합 시약의 특이성 개선을 위해 제공된다.

생물학적 샘플 및 다른 샘플 유형에서 생리적으로 중요한 분자의 검출 및 정량에 대한 검정은 과학 연구 및 헬스 케어 분야에서 중요한 도구이다. 예를 들어, 멀티플렉스 어레이 검정은 샘플에서 표적 분자를 검출하기 위해 표면 결합된 탐침을 채택한다. 표면-결합 탐침은 샘플로부터의 표적 분자와 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체, 아피바디, 앱타머 또는 다른 분자(종합적으로 생체중합체)일 수 있다. 이들 결합 상호작용은 다양한 상이한 분야, 예컨대, 게노믹스, 트랜스크립토믹스 및 프로테오믹스에서 사용되는 여러 방법 및 장치에 대한 기본이다.

검정은 검정 혼합물의 특정 성분을 제거하도록 설계된 용액-기반 표적 상호작용 및 분리 단계를 제공한다. 그러나 여러 검정 포맷의 민감도 및 특이성은 검출 방법이 검정 동안의 비특이적 연합으로 인해 발생하는 신호로부터 진짜 신호를 분해하는 검출 방법의 능력에 의해 제한되어 거짓(false) 검출 신호를 야기한다. 이는 특히 사용되는 포획 시약(예컨대, 항체 또는 압타머)과 무관한 멀티플렉스화 검정에 있어서 해당된다. 비특이적 결합의 핵심 원천 중 하나는 표적 분자와의 예상치 못한 비특이적 포획 시약 상호작용 또는 비특이적 결합 상호작용이다. 본 개시는 표적/포획 시약 특이적 상호작용을 유지하면서 멀티플렉스화 기반 프로테오믹 검정에서 관찰되는 배경 신호를 제거하거나 감소하는 방법을 기재한다.

일부 구현예에서, a) 제1 희석 샘플을 제1 압타머와 접촉시키는 단계로서, 표적 분자가 제1 희석 샘플에 존재하는 경우 제1 압타머와 그 표적 분자의 상호작용에 의해 제1 압타머 친화도 복합체가 형성되는, 단계; b) 제2 희석 샘플을 제2 압타머와 접촉시키는 단계로서, 표적 분자가 제2 희석 샘플에 존재하는 경우 제2 압타머와 그 표적 분자의 상호작용에 의해 제2 압타머 친화도 복합체가 형성되는, 단계; c) 제1 및 제2 희석 샘플을 별도로 인큐베이션하여 압타머 친화도 복합체 형성을 허용하는 단계; d) 제1 압타머 친화도 복합체를 갖는 제1 희석 샘플을 제1 혼합물로 전달하는 단계로서, 제1 압타머 친화도 복합체가 제1 혼합물의 고체 지지체 상에 포획되는 단계; e) 단계 d) 후, 제2 희석 샘플을 제1 혼합물로 전달하여 제2 혼합물을 형성하는 단계로서, 제2 희석의 제2 압타머 친화도 복합체가 제2 혼합물에서 고체 지지체 상에 포획되는, 단계; f) 제1 및 제2 압타머 친화도 복합체의 제1 압타머 및 제2 압타머의 존재 또는 수준, 또는 하나 이상의 제1 및 제2 압타머 친화도 복합체의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계를 포함하며; 제1 희석 및 제2 희석은 동일한 평가 샘플의 상이한 희석인 방법이 개시된다.

하나의 양태에서, 평가 샘플은 혈장, 혈청, 소변, 전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 백혈구연층, 가래, 누액, 점액, 비강 세척액, 비강 흡입물, 정액, 타액, 복강 세척액, 복수, 낭액, 수막액, 양수, 샘액, 림프액, 유두 흡입물, 기관지 흡입물, 기관지 솔질물(brushing), 활액, 관절 흡입물, 기관 분비물, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 제1 및 제2 압타머-표적 분자 친화도 복합체는 비공유 복합체이다.

또 다른 양태에서, 표적 분자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 박테리아, 대사물질, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포 및 조직으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 제1 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이고, 제2 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 제1 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이고; 제2 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 제1 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이고; 제2 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 제1 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 제2 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 제1 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 제2 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 제1 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 제2 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 해리된 제1 및 제2 포획 시약의 존재 검출 또는 수준의 결정은 PCR, 질량 분광측정, 핵산 서열분석, 차세대 서열분석(NGS) 또는 혼성화에 의해 수행된다.

또 다른 양태에서, 제1 압타머 및/또는 제2 압타머는, 독립적으로, 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함한다.

또 다른 양태에서, 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘은 피리미딘의 5-위치의 링커 및 링커에 부착된 모이어티를 포함한다.

또 다른 양태에서, 링커는 아미드 링커, 카보닐 링커, 프로피닐 링커, 알킨 링커, 에스테르 링커, 우레아 링커, 카바메이트 링커, 구아니딘 링커, 아미딘 링커, 설폭시드 링커, 및 설폰 링커로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

또 다른 양태에서, 모이어티는 도 1의 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV 및 XVI 그룹 모이어티로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 모이어티는 나프틸 모이어티, 벤질 모이어티, 플루오로벤질 모이어티, 티로실 모이어티, 인돌 모이어티, 모르폴리노 모이어티, 이소부틸 모이어티, 3,4-메틸렌디옥시 벤질 모이어티, 벤조티오페닐 모이어티, 및 벤조푸라닐 모이어티로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 5-위치 변형 피리미딘의 피리미딘은 유리딘, 시티딘 또는 티미딘이다.

또 다른 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 제3 희석 샘플을 제3 압타머와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 표적 분자가 제3 희석 샘플에 존재하는 경우 제3 압타머와 그 표적 분자의 상호작용에 의해 제3 압타머 친화도 복합체가 형성된다;

또 다른 양태에서, 제3 희석 샘플은 제1 및 제2 희석 샘플과 별도로 인큐베이션되어 제3 압타머와 그 표적 분자의 압타머 친화도 복합체 형성을 허용한다.

또 다른 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 제3 희석 샘플을 제2 혼합물로 전달하여 제3 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 희석의 제3 압타머 친화도 복합체가 제3 혼합물의 고체 지지체 상에 포획된다.

또 다른 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 제3 압타머 친화도 복합체의 제3 압타머의 존재 또는 수준, 또는 제3 압타머 친화도 복합체의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계를 추가로 포함한다;

또 다른 양태에서, 제3 희석은 동일한 평가 샘플의 제1 희석 및 제2 희석과 상이한 희석이다.

또 다른 양태에서, 제3 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 약 20%; 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%), 0.1% 내지 0.8%, 0.2% 내지 0.75%, 약 0.5%; 및 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%), 또는 0.002% 내지 0.008%, 0.003% 내지 0.007%, 약 0.005%로부터 선택되는 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 제3 압타머는 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함한다.

또 다른 양태에서, 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘은 피리미딘의 5-위치에서의 링커 및 링커에 부착된 모이어티를 포함한다.

또 다른 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

일부 구현예에서, a) 제1 포획 시약을 제1 희석과 접촉시켜 제1 혼합물을 형성하고 제2 포획 시약을 제2 희석과 접촉시켜 제2 혼합물을 형성하는 단계로서, 각각의 제1 및 제2 포획 시약이 각각 고체 지지체 상에 고정화되며, 각각의 제1 및 제2 포획 시약이 상이한 표적 분자에 대한 친화도를 가지는, 단계; b) 제1 혼합물 및 제2 혼합물을 별도로 인큐베이션하는 단계로서, 제1 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제1 혼합물에 존재하는 경우 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제1 혼합물에 형성되고, 제2 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제2 혼합물에 존재하는 경우 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제2 혼합물에 형성되는, 단계; c) (i) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 (ii) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 선택되는 순서로 친화도 복합체를 순차적으로 방출하고 제4 혼합물에서 조합하는 단계; d) 제1 태그를 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자에 부착하는 단계; e) 태그화된 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 고체 지지체와 접촉시켜 태그가 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 고체 지지체에 고정시키도록 하는 단계; f) 포획 시약을 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 해리하는 단계; g) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하며; 제1 희석 및 제2 희석은 평가 샘플의 상이한 희석인 방법이 개시된다.

하나의 양태에서, 평가 샘플은 혈장, 혈청, 소변, 전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 백혈구연층, 가래, 누액, 점액, 비강 세척액, 비강 흡입물, 정액, 타액, 복강 세척액, 복수, 낭액, 수막액, 양수, 샘액, 림프액, 유두 흡입물, 기관지 흡입물, 기관지 솔질물, 활액, 관절 흡입물, 기관 분비물, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 제1 및 제2 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체는 비공유 복합체이다.

하나의 양태에서, 제1 포획 시약 및 제2 포획 시약은, 독립적으로, 압타머 또는 항체로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 표적 분자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 박테리아, 대사물질, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포 및 조직으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며, 제2 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며; 2 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 제2 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 제2 희석은 0.001% 내지 0.009%(또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 제2 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 제2 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 해리된 제1 및 제2 포획 시약의 존재의 검출 또는 수준의 결정은 PCR, 질량 분광측정, 핵산 서열분석, 차세대 서열분석(NGS) 또는 혼성화에 의해 수행된다.

또 다른 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 제3 포획 시약을 제3 희석과 접촉시켜 제3 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 포획 시약은 고체 지지체 상에 고정화되고, 제3 포획 시약은 제1 및 제2 포획 시약의 표적 분자와 상이한 표적 분자에 대한 친화도를 갖는다.

또 다른 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 제3 혼합물을 제1 혼합물 및 제2 혼합물과 별도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제3 혼합물에 존재하는 경우, 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제3 혼합물에 형성된다.

또 다른 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체와 제3 포획 시약-표적 분자 친화도를 (i) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (ii) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iii) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iv) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (v) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; 및 (vi) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 선택되는 순서로 순차적으로 방출하고 제4 혼합물에서 조합하는 단계를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제3 희석은 동일한 평가 샘플의 제1 희석 및 제2 희석과 상이한 희석이다.

하나의 양태에서, 제3 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 약 20%; 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%), 0.1% 내지 0.8%, 0.2% 내지 0.75%, 약 0.5%; 및 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%), 또는 0.002% 내지 0.008%, 0.003% 내지 0.007%, 약 0.005%로부터 선택되는 평가 샘플의 희석이다.

또 다른 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 제3 압타머 친화도 복합체의 제3 압타머의 존재 또는 수준, 또는 제3 압타머 친화도 복합체의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 압타머는 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함한다.

하나의 양태에서, 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘은 피리미딘의 5-위치에서의 링커 및 링커에 부착된 모이어티를 포함한다.

하나의 양태에서, 링커는 아미드 링커, 카보닐 링커, 프로피닐 링커, 알킨 링커, 에스테르 링커, 우레아 링커, 카바메이트 링커, 구아니딘 링커, 아미딘 링커, 설폭시드 링커, 및 설폰 링커로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

하나의 양태에서, 모이어티는 도 1의 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV 및 XVI 그룹 모이어티로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 모이어티는 나프틸 모이어티, 벤질 모이어티, 플루오로벤질 모이어티, 티로실 모이어티, 인돌 모이어티, 모르폴리노 모이어티, 이소부틸 모이어티, 3,4-메틸렌디옥시 벤질 모이어티, 벤조티오페닐 모이어티, 및 벤조푸라닐 모이어티로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 5-위치 변형 피리미딘의 피리미딘은 유리딘, 시티딘 또는 티미딘이다.

일부 구현예에서, a) 제1 포획 시약을 제1 희석과 접촉시켜 제1 혼합물을 형성하고, 제2 포획 시약을 제2 희석과 접촉시켜 제2 혼합물을 형성하고, 제3 포획 시약을 제3 희석과 접촉시켜 제3 희석 혼합물을 형성하는 단계로서, 각각의 제1, 제2, 및 제3 포획 시약이 각각 고체 지지체 상에 고정화되고, 각각의 제1, 제2 및 제3 포획 시약이 상이한 표적 분자에 대한 친화도를 가지는, 단계; b) 제1 혼합물, 제2 혼합물 및 제3 혼합물을 별도로 인큐베이션하는 단계로서, 제1 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제1 혼합물에 존재하는 경우 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제1 혼합물에 형성되고, 제2 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제2 혼합물에 존재하는 경우 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제2 혼합물에 형성되고, 제3 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제3 혼합물에 존재하는 경우 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제3 혼합물에 형성되는, 단계; c) (i) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (ii) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iii) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iv) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (v) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; 및 (vi) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 선택되는 순서로 친화도 복합체를 순차적으로 방출하고 제4 혼합물에서 조합하는 단계; d) 제1 태그를 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자에 부착하는 단계; e) 태그화된 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 고체 지지체와 접촉시켜 태그가 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 고체 지지체에 고정시키도록 하는 단계; f) 포획 시약을 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 해리하는 단계; g) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하며; 제1 희석, 제2 희석, 및 제3 희석은 평가 샘플의 상이한 희석인 방법이 개시된다.

하나의 양태에서, 제1, 제2 및 제3 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체는 비공유 복합체이다.

하나의 양태에서, 제1 포획 시약, 제2 포획 시약 및 제3 포획 시약은, 독립적으로, 압타머 또는 항체로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이고, 제2 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이고; 제3 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며; 제2 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이고; 제3 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 제2 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이고; 제3 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 제2 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이고; 제3 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 제2 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이고; 제3 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제1 희석은 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며; 제2 희석은 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이고; 제3 희석은 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이다.

본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징, 및 장점은 첨부되는 도면을 참조하여 진행되는, 하기 상세한 설명으로부터 보다 뚜렷해질 것이다.

도 1. 압타머 내로 포함될 수 있는 특정한 예시적 5-위치 변형 유리딘 및 시티딘.
도 2. 유리딘의 5-위치에 존재할 수 있는 특정한 예시적 변형. C-5 변형의 화학적 구조에는 유리딘의 5-위치에 변형을 연결하는 예시적 아미드 결합이 포함된다. 나타낸 5-위치 모이어티에는 벤질 모이어티(예컨대, Bn, PE 및 PP), 나프틸 모이어티(예컨대, Nap, 2Nap, NE), 부틸 모이어티(예컨대, iBu), 플루오로벤질 모이어티(예컨대, FBn), 티로실 모이어티(예컨대, Tyr), 3,4-메틸렌디옥시 벤질(예컨대, MBn), 모르폴리노 모이어티(예컨대, MOE), 벤조푸라닐 모이어티(예컨대, BF), 인돌 모이어티(예컨대, Trp) 및 하이드록시프로필 모이어티(예컨대, Thr)가 포함된다.
도 3. 시티딘의 5-위치에 존재할 수 있는 특정한 예시적 변형. C-5 변형의 화학적 구조에는 시티딘의 5-위치에 변형을 연결하는 예시적 아미드 결합이 포함된다. 나타낸 5-위치 모이어티에는 벤질 모이어티(예컨대, Bn, PE 및 PP), 나프틸 모이어티(예컨대, Nap, 2Nap, NE, 및 2NE) 및 티로실 모이어티(예컨대, Tyr)가 포함된다.
도 4. 생물학적 샘플, 이의 각각의 희석에 대한 대응하는 포획 시약 세트의 예시적 개요, 및 2-캐치(catch) 시스템(캐치-1 및 캐치-2)의 일반적 개요를 제공한다. 2개의 상이한 희석 그룹이 생물학적 샘플 또는 DIL4의 Z% 희석 및 생물학적 샘플 또는 DIL1의 X% 희석이 포함되는 생물학적 샘플로부터 생성될 수 있고, Z는 X 초과이다(또는 Z는 X 희석보다 큰 희석이다). 각각의 희석은 단백질의 특정 세트에 결합하는 상응하는 포획 시약의 고유 세트(DIL1에 대해 A3 및 DIL4에 대해 A1)를 갖는다. 2개의 상이한 희석 세트를 함께 검정의 캐치-1 단계로부터 검정의 캐치-2 단계로 전달하였다.
도 5. 생물학적 샘플, 이의 각각의 희석에 상응하는 포획 시약 세트의 예시적 개요, 및 2-캐치 시스템(캐치-1 및 캐치-2)의 일반적 개요를 제공한다. 3개의 상이한 희석 그룹이 생물학적 샘플 또는 DIL3의 Z% 희석, 생물학적 샘플 또는 DIL2의 Y% 희석 및 생물학적 샘플 또는 DIL1의 X% 희석이 포함되는 생물학적 샘플로부터 생성될 수 있고, Z는 Y 초과이고, Y는 X 초과이다(또는 Z는 Y 희석보다 큰 희석이고, Y 희석은 X 희석보다 큰 희석이다). 각각의 희석은 단백질의 특정 세트에 결합하는 상응하는 포획 시약의 고유 세트(DIL1에 대해 A3, DIL2에 대해 A2 및 DIL3에 대해 A1)를 갖는다.
도 6. 상대적으로 고, 중 및 저 존재비 단백질이 각각 측정된, 0.005% 희석(DIL1), 0.5% 희석(DIL2) 및 20% 희석(DIL3)으로 제조된 3개의 상이한 혈장 희석 그룹의 개요를 제공한다. 또한, 각각의 DIL1, DIL2 및 DIL3의 압타머 세트는 각각 A1, A2 및 A3이었다. 총 5,272개의 상이한 압타머 중 압타머 A3 그룹은 4,271개의 상이한 압타머(또는 압타머 총 수의 약 81%)를 가졌고, A2 그룹은 828개의 상이한 압타머(또는 압타머 총 수의 약 16%)를 가졌고, A1 그룹은 173개의 상이한 압타머(압타머 총 수의 약 3%)를 가졌다. 3개의 상이한 희석 세트를 함께 검정의 캐치-1 단계부터 검정의 캐치-2 단계로 전달하였다.
도 7. 생물학적 샘플, 이의 각각의 희석에 상응하는 포획 시약 세트의 예시적 개요, 및 순차적 2-캐치 시스템(캐치-1 및 캐치-2)의 일반적 개요를 제공한다. 3개의 상이한 희석 그룹이 생물학적 샘플 또는 DIL3의 Z% 희석, 생물학적 샘플 또는 DIL2의 Y% 희석 및 생물학적 샘플 또는 DIL1의 X% 희석이 포함되는 생물학적 샘플로부터 생성될 수 있고, Z는 Y 초과이고, Y는 X 초과이다(또는 Z는 Y 희석보다 큰 희석이고, Y 희석은 X 희석보다 큰 희석이다). 각각의 희석은 단백질의 특정 세트에 결합하는 상응하는 포획 시약의 고유 세트(DIL1에 대해 A3, DIL2에 대해 A2 및 DIL3에 대해 A1)를 갖는다.
도 8. 상대적으로 고, 중 및 저 존재비 단백질이 각각 측정된, 0.005% 희석(DIL1), 0.5% 희석(DIL2) 및 20% 희석(DIL3)으로 제조된 3개의 상이한 혈장 희석 그룹의 개요를 제공한다. 또한, 각각의 DIL1, DIL2 및 DIL3의 압타머 세트는 각각 A1, A2 및 A3이었다. 총 5,272개의 상이한 압타머 중 압타머 A3 그룹은 4,271개의 상이한 압타머(또는 압타머 총 수의 약 81%)를 가졌고, A2 그룹은 828개의 상이한 압타머(또는 압타머 총 수의 약 16%)를 가졌고, A1 그룹은 173개의 상이한 압타머(압타머 총 수의 약 3%)를 가졌다. 3개의 상이한 희석 세트를 순차적으로 검정의 캐치-1 단계부터 검정의 캐치-2 단계로 전달하였다.
도 9. 생물학적 샘플, 이의 각각의 희석에 상응하는 포획 시약 세트의 예시적 개요, 및 2-캐치 시스템(캐치-1 및 캐치-2)의 일반적 개요를 제공한다. 2개의 상이한 희석 그룹이 생물학적 샘플 또는 DIL4의 Z% 희석 및 생물학적 샘플 또는 DIL1의 X% 희석이 포함되는 생물학적 샘플로부터 생성될 수 있고, Z는 X 초과이다(또는 Z는 X 희석보다 큰 희석이다). 각각의 희석은 단백질의 특정 세트에 결합하는 상응하는 포획 시약의 고유 세트(DIL1에 대해 A3 및 DIL4에 대해 A1)를 갖는다. 2개의 상이한 희석 세트를 순차적으로 검정의 캐치-1 단계부터 검정의 캐치-2 단계로 전달하였다.
도 10. 조건 1(즉, 전체 3개의 희석 그룹 DIL1, DIL2 및 DIL3)에 대한 압타머 신호 대 조건 2, 3 및 4(표 2; 하나의 희석 그룹만 블랭크와 함께 존재하는 경우) 각각에 대한 압타머 신호의 비의 누적 분포 함수(CDF)를 모든 3개 희석 세트가 함께 검정의 캐치-1 부분으로부터 검정의 캐치-2 부분으로 전달되는 바와 같이 수행되는 검정에 대해 도시하였다. 압타머 신호의 비를 혼성화 어레이로부터 유도된 상대 형광 단위(RFU)에 의해 나타낸다.
도 11. 조건 1(즉, 전체 3개의 희석 그룹 DIL1, DIL2 및 DIL3)에 대한 압타머 신호 대 조건 2, 3 및 4(하나의 희석 그룹만 블랭크와 함께 존재하는 경우) 각각에 대한 압타머 신호의 비의 누적 분포 함수(CDF)를 3개 희석 세트가 순차적으로 검정의 캐치-1 부분으로부터 검정의 캐치-2 부분으로 전달되는 바와 같이 수행되는 검정에 대해 도시하였다. 압타머 신호의 비를 혼성화 어레이로부터 유도된 상대 형광 단위(RFU)에 의해 나타낸다.
도 12. 각각의 희석 40%, 20%, 10% 및 5%(X-축)에 대해 중앙값 S/B(Y-축; 왼쪽)에 따른 선형 범위에서의 분석물질의 수(Y-축; 오른쪽)의 그래픽 표시. 생물학적 샘플의 20% 희석에서, 가장 큰 중앙값 S/B를 갖는 선형 범위에서의 분석물질의 최대 수가 관찰된다(2개 선이 교차하는 경우).

달리 주지되지 않는 한, 기술 용어는 통상적 활용에 따라 사용된다. 분자 생물학에서의 일반적 용어의 정의는 문헌[Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press 출판, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd. 출판, 1994 (ISBN 0-632-02182-9); 및 Robert A. Meyers(ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc. 출판, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 확인될 수 있다.

달리 설명되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 단수 용어("a", "an", 및 "the")에는 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 언급이 포함된다. "A 또는 B를 포함하는"은 A, 또는 B, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다. 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 주어지는 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 근사치이며, 설명을 위해 제공됨이 추가로 이해되어야 한다.

또한, 본원에서 제공되는 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50(뿐만 아니라 문맥 상 명확히 달리 나타내지 않는 한 이의 분수)으로 구성되는 군으로부터의 임의의 수, 수의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다. 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위, 또는 정수 범위는 열거되는 범위 내의 임의의 정수, 그리고 적절한 경우, 이의 분수(예컨대 정수의 1/10 및 1/100) 값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은, 임의의 물리적 특징에 관해 본원에서 열거되는 임의의 수치 범위는 달리 나타내지 않는 한, 열거되는 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 "약" 또는 "~로 본질적으로 구성되는"은 달리 나타내지 않는 한, 나타낸 범위, 값, 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 "포함된다" 및 "포함한다"는 개방형 말단이며 동의어로 사용된다.

본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 평가에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 아래에 기재된다. 본원에서 언급되는 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 이의 전문이 참조로 포함된다. 상충 시, 용어의 설명을 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다.

본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 이의 변형된 형태뿐만 아니라 이의 유사체를 나타낸다. 뉴클레오티드에는 퓨린(예컨대, 아데닌, 하이포잔틴, 구아닌, 및 이의 유도체 및 유사체)뿐만 아니라 피리미딘(예컨대, 시토신, 우라실, 티민, 및 이의 유도체 및 유사체)이 포함되는 종이 포함된다. 본원에서 사용되는 용어 "시티딘"은 구체적으로 다르게 나타내지 않는 한, 일반적으로 시토신 염기를 포함하는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 변형 리보뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용된다. 용어 "시티딘"에는 2'-플루오로, 2'-메톡시 등과 같은 2'-변형 시티딘이 포함된다. 유사하게, 용어 "변형 시티딘" 또는 특정한 변형 시티딘은 또한 구체적으로 다르게 나타내지 않는 한, 변형 시토신 염기를 포함하는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 변형 리보뉴클레오티드(예컨대 2'-플루오로, 2'-메톡시 등)를 나타낸다. 용어 "유리딘"은 구체적으로 다르게 나타내지 않는 한, 일반적으로 우라실 염기를 포함하는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 변형 리보뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용된다. 용어 "유리딘"에는 2'-플루오로, 2'-메톡시 등과 같은 2'-변형 유리딘이 포함된다. 유사하게, 용어 "변형 유리딘" 또는 특정한 변형 유리딘은 구체적으로 다르게 나타내지 않는 한, 또한 변형 우라실 염기를 포함하는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 변형 리보뉴클레오티드(예컨대 2'-플루오로, 2'-메톡시 등)를 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "C-5 변형 카복사미드시티딘" 또는 "시티딘-5-카복사미드" 또는 "5-위치 변형 시티딘" 또는 "C-5 변형 시티딘"은 비제한적으로 본원에서 예시되는 모이어티(R^X1)를 포함하는, 시티딘의 C-5 위치에 카복시아미드(-C(O)NH-) 변형을 갖는 시티딘을 나타낸다. 예시적 C-5 변형 카복사미드시티딘에는 비제한적으로 5-(N-벤질카복사미드)-2'-데옥시시티딘("BndC"로 나타내며 도 3에 나타냄); 5-(N-2-페닐에틸카복사미드)-2'-데옥시시티딘("PEdC"로 나타내며 도 3에 나타냄); 5-(N-3-페닐프로필카복사미드)-2'-데옥시시티딘("PPdC"로 나타내며 도 3에 나타냄); 5-(N-1-나프틸메틸카복사미드)-2'-데옥시시티딘("NapdC"로 나타내며 도 3에 나타냄); 5-(N-2-나프틸메틸카복사미드)-2'-데옥시시티딘("2NapdC"로 나타내며 도 3에 나타냄); 5-(N-1-나프틸-2-에틸카복사미드)-2'-데옥시시티딘("NEdC"로 나타내며 도 3에 나타냄); 5-(N-2-나프틸-2-에틸카복사미드)-2'-데옥시시티딘("2NEdC"로 나타내며 도 3에 나타냄); 및 5-(N-티로실카복시아미드)-2'-데옥시시티딘(TyrdC로 나타내며 도 3에 나타냄)이 포함된다. 일부 구현예에서, C5-변형 시티딘은 예컨대 이의 트리포스페이트 형태로, 폴리머라제(예컨대, KOD DNA 폴리머라제)에 의해 올리고뉴클레오티드 내에 포함될 수 있다.

본원에서 기재되는 C-5 변형 시티딘의 화학적 변형은 또한, 2'-위치 당 변형, 엑소사이클릭 아민에서의 변형, 및 4-티오시티딘의 치환 등과 단독으로 또는 임의의 조합으로 조합될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "C-5 변형 카복사미드시토신" 또는 "시토신-5-카복사미드" 또는 "5-위치 변형 시토신" 또는 "C-5 변형 시토신"은 비제한적으로 본원에서 예시되는 모이어티(R^X1)를 포함하는, 시토신의 C-5 위치에 카복시아미드(-C(O)NH-) 변형을 갖는 시토신 염기를 나타낸다. 예시적 C-5 변형 카복사미드시토신에는 비제한적으로 도 3에 나타낸 변형 시티딘이 포함된다.

본원에서 사용되는 용어 "C-5 변형 유리딘" 또는 "5-위치 변형 유리딘"은, 예컨대, 도 1에 나타낸 바와 같은, 유리딘의 C-5 위치에 카복시아미드(-C(O)NH-) 변형을 갖는 유리딘(전형적으로 데옥시유리딘)을 나타낸다. 일부 구현예에서, C5-변형 유리딘은 예컨대, 이의 트리포스페이트 형태로, 폴리머라제(예컨대, KOD DNA 폴리머라제)에 의해 올리고뉴클레오티드 내에 포함될 수 있다. 비제한적인 예시적 5-위치 변형 유리딘에는 하기가 포함된다:

5-(N-벤질카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(BndU),

5-(N-벤질카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-벤질카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-펜에틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(PEdU),

5-(N-티오페닐메틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(ThdU),

5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(iBudU),

5-(N-티로실카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(TyrdU),

5-(N-3,4-메틸렌디옥시벤질카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(MBndU),

5-(N-4-플루오로벤질카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(FBndU),

5-(N-3-페닐프로필카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(PPdU),

5-(N-이미디졸릴에틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(ImdU),

5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-이소부틸카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(TrpdU),

5-(N-R-트레오니닐카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(ThrdU),

5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-트립트아미노카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-[1-(3-트리메틸암모늄)프로필]카복시아미드)-2'-데옥시유리딘 클로라이드,

5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(NapdU),

5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-[1-(2,3-디하이드록시프로필)]카복시아미드)-2'-데옥시유리딘),

5-(N-2-나프틸메틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(2NapdU),

5-(N-2-나프틸메틸카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-2-나프틸메틸카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-1-나프틸에틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(NEdU),

5-(N-1-나프틸에틸카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-1-나프틸에틸카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-2-나프틸에틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(2NEdU),

5-(N-2-나프틸에틸카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-2-나프틸에틸카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-3-벤조푸라닐에틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(BFdU),

5-(N-3-벤조푸라닐에틸카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘,

5-(N-3-벤조푸라닐에틸카복시아미드)-2'-플루오로유리딘,

5-(N-3-벤조티오페닐에틸카복시아미드)-2'-데옥시유리딘(BTdU),

5-(N-3-벤조티오페닐에틸카복시아미드)-2'-O-메틸유리딘, 및

5-(N-3-벤조티오페닐에틸카복시아미드)-2'-플루오로유리딘.

본원에서 사용되는 용어 "변형하다", "변형된", "변형" 및 이의 임의의 변이는, 올리고뉴클레오티드에 대해 나타내며 사용되는 경우, 올리고뉴클레오티드의 4개 구성 뉴클레오티드 염기(즉, A, G, T/U, 및 C) 중 적어도 하나가 천연 생성 뉴클레오티드의 유사체 또는 에스테르임을 의미한다. 일부 구현예에서, 변형 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 내성을 부여한다. 추가적인 변형에는 골격 변형, 메틸화, 이소염기 이소시티딘 및 이소구아니딘과 같은 비일반적인 염기-페어링 등이 포함될 수 있다. 변형에는 또한, 캡핑과 같은 3' 및 5' 변형이 포함될 수 있다. 다른 변형에는 하나 이상의 천연 생성 뉴클레오티드의, 예를 들어, 미하전 결합을 갖는 것들(예컨대, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전 결합을 갖는 것들(예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 삽입제를 갖는 것들(예컨대, 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이터를 함유하는 것들(예컨대, 금속, 방사활성 금속, 붕소, 산화적 금속 등), 알킬화제를 함유하는 것들, 및 변형된 결합을 갖는 것들(예컨대, 알파 아노머 핵산 등)과 같은 유사한, 뉴클레오티드간 변형으로의 치환이 포함될 수 있다. 또한, 보통 뉴클레오티드의 당 상에 존재하는 임의의 하이드록실기는 포스포네이트기 또는 포스페이트기에 의해 대체되거나; 표준 보호기로 보호되거나; 추가적인 뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 대한 추가 결합을 제조하기 위해 활성화될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH기는 인산화되거나, 아민, 약 1 내지 약 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 모이어티, 하나의 구현예에서 약 10 내지 약 80 kDa 범위의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체, 또 다른 구현예에서 약 20 내지 약 60 kDa의 PEG 중합체, 또는 다른 친수성 또는 소수성 생물학적 또는 합성 중합체로 치환될 수 있다.

본원에서 사용되는 "핵산", "올리고뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 중합체를 나타내기 위해 상호 교환 가능하게 사용되며 DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드 및 이러한 종류의 핵산, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 변형이 포함되고, 임의의 위치에서의 뉴클레오티드 단위에 대한 다양한 대상물 또는 모이어티의 부착이 포함된다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", 및 "핵산"에는 이중- 또는 단일-가닥 분자뿐만 아니라 삼중-나선 분자가 포함된다. 핵산, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드는 용어 압타머에 비해 광의의 용어이며, 이에 따라 용어 핵산, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드에는 압타머인 뉴클레오티드 중합체가 포함되지만 용어 핵산, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드가 압타머로 제한되는 것은 아니다.

폴리뉴클레오티드는 또한 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-O-에틸, 2'-O-프로필, 2'-O-CH₂CH₂OCH₃, 2'-플루오로, 2'-NH₂ 또는 2'-아지도, 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스와 같은 에피머 당, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 메틸 리보시드와 같은 비염기성 뉴클레오시드 유사체를 포함하는, 당분야에 일반적으로 알려져 있는 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 본원에서 주지되는 바와 같이, 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대안적 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적 연결기에는 포스페이트가 P(O)S에 의해 대체되는("티오에이트"), P(S)S에 의해 대체되는("디티오에이트"), (O)NR^X ₂에 의해 대체되는("아미데이트"), P(O)R^X에 의해 대체되는, P(O)OR^X'에 의해 대체되는, CO에 의해 대체되는 또는 CH₂에 의해 대체되는("포름아세탈") 구현예가 포함되며, 식 중 각각의 R^X 또는 R^X'은 독립적으로 H 또는 선택적으로 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알키, 사이클로알케닐 또는 아랄딜을 함유하는, 치환 또는 비치환 알킬(C1~C20)이다. 폴리뉴클레오티드의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 유사한 형태의 당, 퓨린, 및 피리미딘의 치환은, 예를 들어 폴리아미드 골격과 같은 대안적 골격 구조가 할 수 있듯이, 최종 산물의 설계에서 유리할 수 있다.

폴리뉴클레오티드는 또한 유사한 형태의 카보사이클릭 당 유사체, α-아노머 당, 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스와 같은 에피머 당, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비고리형 유사체 및 메틸 리보시드와 같은 비염기성 뉴클레오시드 유사체를 함유할 수 있다.

존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 성분과의 접합에 의한 것과 같이, 중합 후 추가 변형될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "적어도 하나의 뉴클레오티드"는 핵산의 변형을 나타내는 경우, 핵산에서의 1개, 몇몇, 또는 모든 뉴클레오티드를 나타내어, 핵산에서 임의의 또는 모든 A, C, T, G 또는 U의 임의의 또는 모든 경우가 변형될 수도 변형되지 않을 수도 있음을 시사한다.

본원에서 사용되는 "핵산 리간드, "압타머", "SOMAmer", "변형 압타머", 및 "클론"은 표적 분자 상에서 요망되는 작용을 갖는 비-천연 생성 핵산을 나타내기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다. 요망되는 작용에는 비제한적으로 표적의 결합, 표적의 촉매적 변화, 표적 또는 표적의 기능적 활성을 변형하거나 변경하는 방식으의 표적과의 반응, 표적에 대한 공유 부착(자살 억제제에서와 같은 경우), 및 표적과 또 다른 분자 간 반응의 촉진이 포함된다. 하나의 구현예에서, 작용은 표적 분자에 대한 특이적 결합 친화도이며, 이러한 표적 분자는 왓슨/크릭 염기 페어링 또는 삼중 나선 형성과 무관한 기전을 통해 압타머에 결합하는 폴리뉴클레오티드 이외의 3차원 화학 구조이고, 압타머는 표적 분자에 의해 결합되는 알려진 생리적 기능을 갖는 핵산이 아니다. 주어진 표적에 대한 압타머에는 핵산의 후보 혼합물로부터 확인되는 핵산이 포함되며, 압타머는 하기를 포함하는 방법에 의한, 표적의 리간드이다: (a) 후보 혼합물을 표적과 접촉시키는 단계로서, 후보 혼합물에서 다른 핵산 대비 표적에 대해 증가된 친화도를 갖는 핵산이 나머지 후보 혼합물로부터 분할될 수 있는, 단계; (b) 증가된 친화도의 핵산을 나머지 후보 혼합물로부터 분할하는 단계; 및 (c) 증가된 친화도의 핵산을 증폭하여 핵산의 리간드-농축 혼합물을 산출함으로써, 표적 분자의 압타머가 확인되는 단계. 친화도 상호작용은 정도의 문제임이 인식된다; 그러나, 상기 맥락에서, 압타머의 그 표적에 대한 "특이적 결합 친화도"는 압타머가 일반적으로 혼합물 또는 샘플의 다른, 비-표적, 성분에 결합하는 것보다 훨씬 더 높은 정도의 친화도로 그 표적에 결합함을 의미한다. "압타머", "SOMAmer", 또는 "핵산 리간드"는 특정한 뉴클레오티드 서열을 갖는 한 유형 또는 종의 핵산 분자의 카피 세트이다. 압타머에는 임의의 적합한 수의 뉴클레오티드가 포함될 수 있다. "압타머"는 하나를 초과하는 이러한 분자 세트를 나타낸다. 상이한 압타머는 동일한 또는 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 압타머는 DNA 또는 RNA일 수 있고 단일 가닥, 이중 가닥일 수 있거나, 이중 가닥 또는 삼중 가닥 영역을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 압타머는 본원에서 기재되거나 당분야에 알려진 SELEX 공정을 사용하여 제조된다.

본원에서 사용되는 "SOMAmer" 또는 느린 오프율의 변형 압타머(Slow Off-Rate Modified Aptamer)는 개선된 오프율 특징을 갖는 압타머를 나타낸다. SOMAmer는 "개선된 오프율을 갖는 압타머의 생성 방법(Method for Generating Aptamer with Improved Off-Rates)"을 표제로 하는 미국 특허 번호 7,947,447에 기재된 개선된 SELEX 방법을 사용하여 생성될 수 있다.

본원에서 사용되는 2개의 상이한 유형의 5-위치 변형 피리미딘 또는 C-5 변형 피리미딘을 포함하는 압타머는 "이중 변형 압타머", "2개의 변형 염기"를 갖는 압타머, "2개의 염기 변형"을 갖는 또는 "2개의 염기가 변형된" 압타머, "이중 변형 염기"를 갖는 압타머로 나타낼 수 있고, 모두 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 압타머의 라이브러리 또는 압타머 라이브러리는 또한 동일한 용어를 사용할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 압타머는 2개의 상이한 5-위치 변형 피리미딘을 포함하며 여기서 2개의 상이한 5-위치 변형 피리미딘은 NapdC 및 NapdU, NapdC 및 PPdU, NapdC 및 MOEdU, NapdC 및 TyrdU, NapdC 및 ThrdU, PPdC 및 PPdU, PPdC 및 NapdU, PPdC 및 MOEdU, PPdC 및 TyrdU, PPdC 및 ThrdU, NapdC 및 2NapdU, NapdC 및 TrpdU, 2NapdC 및 NapdU, 및 2NapdC 및 2NapdU, 2NapdC 및 PPdU, 2NapdC 및 TrpdU, 2NapdC 및 TyrdU, PPdC 및 2NapdU, PPdC 및 TrpdU, PPdC 및 TyrdU, TyrdC 및 TyrdU, TrydC 및 2NapdU, TyrdC 및 PPdU, TyrdC 및 TrpdU, TyrdC 및 TyrdU, 및 TyrdC 및 TyrdU로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 압타머는 적어도 하나의 변형 유리딘 및/또는 티미딘 및 적어도 하나의 변형 시티딘을 포함하며, 적어도 하나의 변형 유리딘 및/또는 티미딘은 5-위치에서 나프틸 모이어티, 벤질 모이어티, 플루오로벤질 모이어티, 티로실 모이어티, 인돌 모이어티, 모르폴리노 모이어티, 이소부틸 모이어티, 3,4-메틸렌디옥시 벤질 모이어티, 벤조티오페닐 모이어티, 및 벤조푸라닐 모이어티로부터 선택되는 모이어티로 변형되고, 적어도 하나의 변형 시티딘은 5-위치에서 나프틸 모이어티, 티로실 모이어티, 및 벤질 모이어티로부터 선택되는 모이어티로 변형된다. 특정 구현예에서, 모이어티는 아미드 링커, 카보닐 링커, 프로피닐 링커, 알킨 링커, 에스테르 링커, 우레아 링커, 카바메이트 링커, 구아니딘 링커, 아미딘 링커, 설폭시드 링커, 및 설폰 링커로부터 선택되는 기를 포함하는 링커를 통해 염기의 5-위치에 공유 연결된다. 모이어티를 피리미딘의 5-위치에 공유 연결하기 위해 사용될 수 있는 예시적 링커의 추가 예에 대해서는 도 1을 참고한다.

본원에서 사용되는 "소수성 기" 및 "소수성 모이어티"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며 하전되지 않은, 기 또는 모이어티의 대부분의 원자가 수소 및 탄소인, 기 또는 모이어티가 소형 쌍극자를 갖고/갖거나 기 또는 모이어티가 물과 반발하는 경향이 있는 임의의 기 또는 모이어티를 나타낸다. 이들 기 또는 모이어티는 방향족 탄화수소 또는 평면상 방향족 탄화수소를 포함할 수 있다. 소수성 또는 분자(또는 기 또는 모이어티)가 소수성인지를 결정하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고 실험적으로 유도된 방법뿐만 아니라 계산 방법이 포함된다. 예시적 방법은 문헌[Zhu Chongqin et al. (2016) Characterizing hydrophobicity of amino acid side chains in a protein environment via measuring contact angle of a water nanodroplet on planar peptide network. Proc. Natl. Acad. Sci., 113 (46) pgs. 12946-12951]에 기재되어 있다. 본원에서 개시되는 예시적 소수성 모이어티에는 비제한적으로 도 1의 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV 및 XVI 그룹이 포함된다. 추가적인 예시적 소수성 모이어티에는 도 3의 모이어티(예컨대, Bn, Nap, PE, PP, iBu, 2Nap, Try, NE, MBn, BF, BT, Trp)가 포함된다.

본원에서 사용되는 단일 유형의 5-위치 변형 피리미딘 또는 C-5 변형 피리미딘을 포함하는 압타머는 "단일 변형 압타머", "단일 변형 염기"를 갖는 압타머, "단일 염기 변형"을 갖는 또는 "단일 염기 변형" 압타머로 나타낼 수 있고, 모두 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 압타머의 라이브러리 또는 압타머 라이브러리는 또한 동일한 용어를 사용할 수 있다. 본원에서 사용되는 "단백질"은 "펩티드", "폴리펩티드", 또는 "펩티드 단편"과 동의어로 사용된다. "정제된" 폴리펩티드, 단백질, 펩티드, 또는 펩티드 단편에는 그로부터 아미노산이 수득되는 세포, 조직, 또는 무세포 원천으로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염 단백질이 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없다.

특정 구현예에서, 압타머는 제1 5-위치 변형 피리미딘 및 제2 5-위치 변형 피리미딘을 포함하며, 제1 5-위치 변형 피리미딘은 제1 5-위치 변형 피리미딘의 5-위치에 티로실 모이어티를 포함하고, 제2 5-위치 변형 피리미딘은 제2 5-위치 변형 피리미딘의 5-위치에 나프틸 모이어티 또는 벤질 모이어티를 포함한다. 관련 구현예에서 제1 5-위치 변형 피리미딘은 우라실이다. 관련 구현예에서, 제2 5-위치 변형 피리미딘은 시토신이다. 관련 구현예에서, 압타머의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 우라실은 5-위치에서 변형된다. 관련 구현예에서, 압타머의 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 시토신은 5-위치에서 변형된다.

핵산 혼성화의 당업자는 혼성화의 엄격성을 부과하거나 제어하기 위해 일반적으로 사용되는 요인에 포름아미드 농도(또는 다른 화학적 변성 시약), 염 농도(즉, 이온 강도), 혼성화 온도, 세제 농도, pH 및 무질서유발제의 존재 또는 부재가 포함됨을 인식할 것이다. 탐침/표적 서열 조합을 위한 최적 엄격성은 종종 몇몇 상기 언급된 엄격성 요인을 고정한 후, 다양한 단일 엄격성 요인의 효과를 결정하는 널리 알려진 기법에 의해 확인된다. PNA의 혼성화가 이온 강도와 확실히 무관한 경우를 제외하고, 동일한 엄격성 요인이 조절되고 이에 따라 PNA의 핵산으로의 혼성화 엄격성을 제어할 수 있다. 검정을 위한 최적 엄격성은 요망되는 구별 정도가 달성될 때까지 각각의 엄격성 요인의 검사에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 "혼성화", "혼성화하는", "결합" 등의 용어는 뉴클레오티드 서열의 맥락에서, 본원에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열이 서로 혼성화하는 능력은 두 서열의 상보성 정도에 기반하며, 이는 다시 매칭되는 상보적 뉴클레오티드 페어의 분율에 기반한다. 주어진 서열에서 또 다른 서열과 상보적인 뉴클레오티드가 많을수록, 혼성화를 위한 조건은 더 엄격해질 수 있고 두 서열의 결합은 더 특이적일 것이다. 승온, 공-용매의 비 증가, 염 농도의 저하 등에 의해 증가된 엄격성이 달성된다. 마이크로어레이 및 표적 물질 상의 상보적 왓슨/크릭 염기쌍의 혼성화가 일반적으로 바람직하지만, 혼성화 동안 비-왓슨/크릭 염기쌍 형성도 일어날 수 있다.

통상적인 혼성화 용액 및 혼성화를 위한 공정은 본원에 참조로 포함되는 문헌[J. Sambrook,　Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (상기 문헌)]에 기재되어 있다. 혼성화를 위한 조건에는 전형적으로 (1) 높은 이온 강도의 용액, (2) 제어되는 온도, 및 (3) 운반체 DNA 및 계면활성제 그리고 2가 양이온의 킬레이터의 존재가 포함되며, 모두 당분야에 알려져 있다.

본원에서 사용되는 "생체중합체"는 하나 이상의 유형의 반복 단위의 중합체이다. 생체중합체는 전형적으로 생물학적 시스템에서 확인되며 특히 다당류(예컨대 탄수화물), 및 펩티드(이 용어는 다당류에 부착되건 부착되지 않건, 폴리펩티드, 및 단백질을 포함하기 위해 사용됨) 및 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 아미노산　유사체 또는 비-아미노산기, 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 비-뉴클레오티드기로 이루어지거나 이를 함유하는 화합물과 같은 이의 유사체가 포함된다. 이와 같이, 상기 용어에는 통상적인 골격이 비-천연 생성 또는 합성 골격으로 대체된 폴리뉴클레오티드, 및 하나 이상의 통상적 염기가 왓슨-크릭 유형 수소 결합 상호작용에 참여할 수 있는 기(천연 또는 합성)로 대체된 핵산(또는 합성 또는 천연 생성 유사체)이 포함된다. 폴리뉴클레오티드에는 단일 또는 다중 가닥 구성이 포함되며, 하나 이상의 가닥은 서로 전체적으로 정렬될 수도 정렬되지 않을 수도 있다. 구체적으로, "생체중합체"에는 원천과 상관없이, 데옥시리보핵산 또는 DNA(cDNA 포함), 리보핵산 또는 RNA 및 올리고뉴클레오티드가 포함된다.

본원에서 사용되는 "어레이"에는 그 영역과 연관된 특정한 화학적 모이어티 또는 모이어티들(예를 들어, 펩티드 핵산 분자, 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 같은 생체중합체)을 보유하는 지시 가능한 영역의 임의의 1차원, 2차원 또는 3차원 배열이 포함되며, 화학적 모이어티 또는 모이어티들은 그 영역의 표면 상에 고정화된다. "고정화된"이란 모이어티 또는 모이어티들이 그 영역에서의 기질 표면과 안정적으로 연합하여, 이들이 어레이의 사용 조건, 예컨대, 혼성화 및 세척 그리고 박리 조건 하에 그 영역으로부터 분리되지 않도록 함을 의미한다. 당분야에 알려진 바와 같이, 모이어티 또는 모이어티들은 영역 내 표면에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다. 예를 들어, 각각의 영역은 기질이 다공성인 경우 3차원으로 연장될 수 있는 반면, 기질이 비-다공성인 경우 임의의 실질적인 3차원 측정(두께)을 갖지 않을 수 있다. 어레이는 20 cm 미만 또는 심지어 10 cm 미만의 영역에서, 10 초과, 100 초과, 1000 초과 10000 초과의 특징부, 또는 심지어 100,000 초과의 특징부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특징부는 약 10 μm 내지 약 1.0 cm 범위의 폭(즉, 원형 점에 있어서, 지름)을 가질 수 있다. 다른 구현예에서 각각의 특징부는 약 5.0 μm 내지 약 500 μm와 같은, 그리고 약 10 μm 내지 약 200 μm를 포함하는, 약 1.0 μm 내지 약 1.0 mm 범위의 폭을 가질 수 있다. 비-원형 특징부는 상기 폭(지름) 범위를 갖는 원형 특징부에서와 동등한 면적 범위를 가질 수 있다. 주어진 특징부는 표적 분자(예컨대, 표적 핵산 또는 압타머)에 결합하여(예컨대, 혼성화하여), 주어진 특징부가 특정 표적에 대응하도록 하는 화학적 모이어티, 예컨대, 펩티드 핵산 분자, 펩티드, 핵산으로 이루어진다.

어레이의 경우, "표적"은 다양한 영역에서 기질에 결합되는 탐침("표적 탐침")에 의해 검출될 이동상(전형적으로 유체)에서의 모이어티로서 나타낼 것이다. 그러나, "표적" 또는 "표적 탐침" 중 어느 것이든 다른 것에 의해 검출될 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적은 올리고뉴클레오티드 또는 압타머이다. 일부 구현예에서, 탐침은 펩티드 핵산 분자, 펩티드, 단백질, 올리고뉴클레오티드 또는 압타머이다.

용어 "생물학적 샘플", "샘플", 및 "평가 샘플"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되어 개체, 및 환경, 동물, 또는 식품 샘플로부터 수득되거나 달리 유래되는 임의의 물질, 생물학적 유체, 조직, 또는 세포를 나타낸다. 여기에는 혈액(전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 백혈구연층, 혈장, 및 혈청 포함), 가래, 누액, 점액, 비강 세척액, 비강 흡입물, 호흡, 소변, 정액, 타액, 복강 세척액, 복수, 낭액, 수막액, 양수, 샘액, 림프액, 유두 흡입물, 기관지 흡입물(예컨대, 기관지폐포 세척액), 기관지 솔질물, 활액, 관절 흡입물, 기관 분비물, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액이 포함된다. 여기에는 또한 모든 상기물의 실험적으로 분리된 분획이 포함된다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청, 혈장, 또는 적혈구 또는 백혈구 세포(백혈구)와 같은 특정 유형의 혈액 세포를 함유하는 분획으로 분획화될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 조직 및 유체 샘플의 조합과 같은, 개체로부터의 샘플의 조합일 수 있다. 용어 "생물학적 샘플"에는 또한, 예를 들어, 대변 샘플, 조직 샘플, 또는 조직 생검과 같은 균질화된 고체 물질을 함유하는 물질이 포함된다. 용어 "생물학적 샘플"에는 또한 조직 배양 또는 세포 배양으로부터 유래된 물질이 포함된다. 생물학적 샘플을 수득하기 위한 임의의 적합한 방법이 채택될 수 있다; 예시적 방법에는, 예컨대, 정맥절개, 면봉채취(예컨대, 볼 면봉채취), 및 미세 바늘 흡입물 생검 절차가 포함된다. 미세 바늘 흡입에 적합한 예시적 조직에는 림프절, 폐, 폐 세척물, BAL(기관지폐포 세척액), 갑상샘, 유방, 췌장, 및 간이 포함된다. 샘플은 또한, 예컨대, 미세 절제(예컨대, 레이저 포획 미세 절제(LCM) 또는 레이저 미세 절제(LMD)), 방광 세척물, 도말(예컨대, PAP 도말), 또는 샘 세척액에 의해 수집될 수 있다. 개체로부터 수득되거나 유래되는 "생물학적 샘플"에는 개체로부터 수득된 후 임의의 적합한 방식으로 가공된 임의의 이러한 샘플이 포함된다.

어구 "고체 지지체의 표면에 결합된 올리고뉴클레오티드" 또는 "고체 지지체에 결합된 탐침" 또는 "고체 지지체에 결합된 표적"은 고체 기질의 표면 상에 고정화된 펩티드 핵산 분자, 올리고뉴클레오티드, 압타머, 예컨대, PNA(펩티드 핵산), LNA(잠긴 핵산) 또는 UNA(잠기지 않은 핵산) 분자를 나타내며, 기질은 다양한 구성, 예컨대 시트, 비드, 입자, 슬라이드, 웨이퍼, 웹, 섬유, 튜브, 모세관, 미세유체 채널 또는 저장소, 또는 다른 구조를 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 채택되는 올리고뉴클레오티드 또는 표적 요소의 수집은, 예컨대, 어레이 형태로, 동일한 평면상 지지체의 표면 상에 존재한다. 용어 "탐침" 및 "표적"은 상대적인 용어이며 특정한 검정에서 탐침으로 간주되는 분자가 다른 검정에서 표적으로 기능할 수 있음이 이해되어야 한다. 기질 또는 표면 상의 올리고뉴클레오티드의 고정화는 문헌에서 일반적으로 이용 가능한, 잘 알려진 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 각각 본원에 참조로 포함되는, 문헌[A. C. Pease, et al.,　Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 91:5022-5026 (1994); Z. Guo, et al.,　Nucleic Acids Res,　22, 5456-65 (1994); 및 M. Schena, et al.,　Science,　270, 467-70 (1995)]을 참고한다.

폴리뉴클레오티드 합성의 상기 화학은, 예를 들어 문헌[Caruthers, Science 230: 281-285, 1985; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 323-356; Hunkapillar et al., Nature 310: 105-110, 1984; 및 in "Synthesis of Oligonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction of Oligonucleotide Derivatives", CRC Press, Boca Raton, Fla., pages 100 et seq., U.S. 특허 번호 4,458,066, 4,500,707, 5,153,319, 5,869,643, EP 0294196] 및 다른 곳에 상세히 기재되어 있다. 포스포르아미다이트 및 포스파이트 트리에스테르 접근이 가장 널리 사용되지만, 다른 접근에는 포스포디에스테르 접근, 포스포트리에스테르 접근 및 H-포스포네이트 접근이 포함된다. 기질은 전형적으로 제1 침착된 단량체에 결합하도록 작용화된다. 이러한 연결 모이어티로의 기질 작용화를 위해 적합한 기법은, 예를 들어, 문헌[Southern, E. M., Maskos, U. 및 Elder, J. K., Genomics, 13, 1007-1017, 1992]에 기재되어 있다. 어레이 제작의 경우, 상이한 단량체 및 활성화제가 임의의 한 사이클 동안 기질 상의 상이한 위치에 침착될 수 있어서 완성된 어레이의 상이한 특징부가 상이한 요망되는 생체중합체 서열을 가질 것이다. 폴리뉴클레오티드 어레이의 원 위치 제작의 경우 통상적 산화, 캡핑 및 세척 단계와 같은 하나 이상의 중간 추가 단계가 각각의 사이클에서 요구될 수 있다(또한, 이들 단계는 플러딩(flooding) 절차에서 수행될 수 있음).

멀티플렉스 검정

용액-기반 표적 상호작용에서의 멀티플렉스화 압타머 검정 및 분리 단계는, 예컨대 U.S. 특허 번호 7,855,054 및 7,964,356 및 PCT 출원 PCT/US2013/044792에 기재되어 있다. 하나의 구현예에서, 멀티플렉스 검정은 본원에서 실시예 1에 기재되어 있다.

여러 표적 단백질이 여러 포획 시약에 의해 측정되는 멀티플렉스 검정 포맷에서, 상이한 표적 단백질의 존재비의 자연적 변이는 특정한 포획 시약이 특정한 표적 단백질을 측정하는 능력을 제한할 수 있다(예컨대, 고존재비 표적 단백질은 검정을 포화시키고 검정이 저존재비 표적 단백질을 측정하는 능력을 방지하거나 감소시킬 수 있음). 생물학적 샘플에서 상기 변이를 해결하기 위해, 압타머 시약은 생물학적 샘플에서 이의 각각의 단백질 표적의 존재비에 기반하여, 적어도 2개의 상이한 그룹(DIL1에 대한 포획 시약 및 DIL2에 대한 포획 시약), 바람직하게는 3개의 상이한 그룹(A3 - DIL1에 대한 포획 시약; A2 - DIL2에 대한 포획 시약 및 A1 - DIL3에 대한 포획 시약)으로 구분될 수 있다. 각각의 포획 시약 그룹, A1, A2 및 A3은 각각 상이한 압타머 세트를 가지며, 압타머는 표적 단백질에 대해 특이적 친화도를 갖는다. 생물학적 샘플은 2개(희석 1 또는 DIL1 및 희석 2 또는 DIL2), 바람직하게는 3개의, 상이한 희석 그룹(희석 1 또는 DIL1; 희석 2 또는 DIL2 및 희석 3 또는 DIL3)으로 희석되어 이의 포획 시약에 의해 검출된 단백질 표적의 상대 농도에 기반하여 평가 샘플의 분리를 생성한다. 따라서, 생물학적 샘플은 고, 중 및 저 존재비의 표적 단백질 희석 그룹으로 희석되며, 최소 존재비의 단백질 표적은 최소 희석된 그룹에서 측정되고, 최고 존재비의 단백질 표적은 최대 희석된 그룹에서 측정된다. 이의 각각의 희석 그룹에 대한 포획 시약은 함께 인큐베이션된다(예컨대, 압타머의 A3 세트가 희석 1 또는 DIL1의 평가 샘플과 인큐베이션되고; 압타머의 A2 세트가 희석 2 또는 DIL2의 평가 샘플과 인큐베이션되고 압타머의 A1 세트가 희석 3 또는 DIL3의 평가 샘플과 인큐베이션됨). A1, A2 및 A3에 대한 압타머의 총 수는 4,000; 4,500; 5,000개 또는 그 초과의 압타머일 수 있다.

도 5는 생물학적 샘플에 대한 희석 세트, 이의 각각의 희석에 상응하는 포획 시약 세트의 예시적 개요, 및 2-캐치 시스템(캐치-1 및 캐치-2)의 일반적 개요를 제공한다. 3개의 상이한 희석 그룹이 생물학적 샘플 또는 DIL3의 Z% 희석, 생물학적 샘플 또는 DIL2의 Y% 희석 및 생물학적 샘플 또는 DIL1의 X% 희석이 포함되는 생물학적 샘플로부터 생성될 수 있고, Z는 Y 초과이고, Y는 X 초과이다(또는 Z는 Y 희석보다 큰 희석이고, Y 희석은 X 희석보다 큰 희석이다). 각각의 희석은 단백질의 특정 세트에 결합하는 상응하는 포획 시약의 고유 세트(DIL1에 대해 A3, DIL2에 대해 A2 및 DIL3에 대해 A1)를 갖는다.

도 4는 생물학적 샘플에 대한 희석 세트, 이의 각각의 희석에 상응하는 포획 시약 세트의 예시적 개요, 및 2-캐치 시스템(캐치-1 및 캐치-2)의 일반적 개요를 제공한다. 2개의 상이한 희석 그룹이 생물학적 샘플 또는 DIL4의 Z% 희석 및 생물학적 샘플 또는 DIL1의 X% 희석이 포함되는 생물학적 샘플로부터 생성될 수 있고, Z는 X 초과이다(또는 Z는 X 희석보다 큰 희석이다). 각각의 희석은 단백질의 특정 세트에 결합하는 상응하는 포획 시약의 고유 세트(DIL1에 대해 A3 및 DIL4에 대해 A1)를 갖는다.

도 7은 생물학적 샘플에 대한 희석 세트, 이의 각각의 희석에 상응하는 포획 시약 세트의 예시적 개요, 및 순차적 2-캐치 시스템(캐치-1 및 캐치-2)의 일반적 개요를 제공한다. 3개의 상이한 희석 그룹이 생물학적 샘플 또는 DIL3의 Z% 희석, 생물학적 샘플 또는 DIL2의 Y% 희석 및 생물학적 샘플 또는 DIL1의 X% 희석이 포함되는 생물학적 샘플로부터 생성될 수 있고, Z는 Y 초과이고, Y는 X 초과이다(또는 Z는 Y 희석보다 큰 희석이고, Y 희석은 X 희석보다 큰 희석이다). 각각의 희석은 단백질의 특정 세트에 결합하는 상응하는 포획 시약의 고유 세트(DIL1에 대해 A3, DIL2에 대해 A2 및 DIL3에 대해 A1)를 갖는다.

본 개시는 평가 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 표적 분자(들)의 정량을 위해 압타머- 및 광압타머-기반 멀티플렉스화 검정을 수행하기 위한 개선된 방법을 기재하며 여기서 압타머(또는 광압타머)는 본원에서 기재되는 물질 및 방법이 전반적인 검정 성능을 개선하기 위해 사용될 수 있는 만큼, 임의의 적합한 핵산 검출 방법을 사용하여 최종 검출을 위해 압타머-표적 친화도 복합체(또는 광압타머-표적 공유 복합체)와 분리될 수 있다. 광압타머는 압타머가 이의 표적 분자에 공유 결합하거나 "광가교할" 수 있도록 하는 광반응성 작용기를 포함하는 압타머이다.

본원에서 기재되는 개선된 압타머- 및 광압타머-기반 멀티플렉스화 검정은 비제한적으로 표 1에 기재된 문헌에서 기재되는 압타머 및 광압타머를 포함하는, 압타머 및 광압타머로 수행될 수 있다.

출원 번호	출원일	표제	WO 공개 번호
PCT/US2016/050908	2016년 9월 09일	Methods for Developing Personalized Drug Treatment Plans and Targeted Drug Development Based on Proteomic Profiles	WO/2017/044715
PCT/US2016/16712	2016년 2월 05일	Nucleic Acid Compounds for Binding Growth Differentiation Factor 8	WO/2016/130414
PCT/US2015/62155	2015년 11월 23일	Nucleic Acid Compounds for Binding Growth Differentiation Factor 11	WO/2016/085860
PCT/US2015/33355	2015년 5월 29일	Nucleic Acid Compounds for Binding to Complement Component 3 Protein	WO/2015/184372
PCT/US2014/054561	2014년 9월 08일	PDGF and VEGF Aptamers Having Improved Stability and Their Use in Treating PDGF and VEGF Mediated Diseases and Disorders	WO/2015/035305
PCT/US2014/024669	2014년 3월 12일	Aptamers That Bind to Il-6 and Their Use in Treating or Diagnosing Il-6 Mediated Conditions	WO/2014/159669
PCT/US2013/034493	2013년 3월 28일	Aptamers to PDGF and VEGF and Their Use in Treating PDGF and VEGF Mediated Conditions	WO/2013/149086
PCT/US2012/72094	2012년 12월 28일	Aptamers and Diagnostic Methods for Detecting the EGF Receptor	WO/2013/102096
PCT/US2012/072101	2012년 12월 28일	Aptamers and Diagnostic Methods for Detecting the EGF Receptor	WO/2013/102101
PCT/US2012/028632	2012년 3월 09일	Aptamers for　Clostridium Difficile　Diagnostics	WO/2012/122540
PCT/US2011/032017	2011년 4월 12일	Aptamers to β-NGF and Their Use in Treating β-NGF Mediated Diseases and Disorders	WO/2011/130195
PCT/US2011/027064	2011년 3월 03일	Aptamers to 4-1BB and Their Use in Treating Diseases and Disorders	WO/2011/109642

역사적으로, 멀티플렉스화 프로테오믹 압타머 친화도 검정을 포함하는, 싱글-플렉스 및 멀티-플렉스 압타머 기반 검정의 수행으로부터 2가지 예상치 못한 한계가 도출되었다. 첫 번째로, 압타머/압타머 상호작용이 검정 배경의 일차적인 원천 및 멀티플렉스능에 대한 잠재적 한계로 확인되었다. 두 번째로, 샘플 매트릭스(일차적으로 혈청 및 혈장)가 스트렙타비딘-치환 매트릭스 상의 바이오틴화된 압타머의 고정화를 억제하는 것으로 확인되었다.

Gold 등(PLoS One(2010) 5￡12): el5005)에 기재된 바와 같이, 검정에서의 개선은 배지의 유전 상수를 제거하기 위한 캐치-2 단계의 일부 세척 완충액 중 유기 용매의 사용으로 이루어졌다. 이들 세척 완충액의 첨가는 압타머의 인접한 포스포디에스테르 골격의 유사-전하 반발을 효과적으로 부각시키고, 이에 따라 압타머와의 배경-유도 상호작용의 해리를 촉진하였다.

공정에서의 또 다른 개선에는 검정의 캐치-2 단계의 일부 세척 완충액 중 유기 용매의 첨가가 관여되며, 이는 또한 압타머가 상호작용하는 경향성에 대처하고, 이에 따라 배경을 감소시키고 멀티플렉스능을 증가시킨다. 그러나, 그 일차적인 장점은 스트렙타비딘 매트릭스에 대해 바이오틴화된 압타머 흡착의 매트릭스-의존적 억제에 대항하는 것이다. 이러한 억제는 5% v/v 혈장 또는 혈청에서도 용이하게 검출 가능하며, 5~10% 혈장 또는 혈청 농도까지 작업 검정 농도를 제한한다. 상기 제한은 다시 검정 민감도를 제한한다.

멀티플렉스화 검정에 대한 또 다른 개선은 평가 용액과의 인큐베이션("캐치-0"으로 명명됨) 전에 고체 지지체 매트릭스 상의 태그화된 압타머의 사전-고정화를 포함한다. 이어서 평가 용액과의 인큐베이션이 가공 용기 자체에서, 결합된 압타머와 함께 수행된다. 단지 예시 목적을 위해 본원에서 기재된 바와 같이, 바이오틴화된 압타머가 스트렙타비딘 비드 매트릭스 상에 사전-고정화되었고, 평가 용액과의 인큐베이션을 비드-결합 압타머와 수행하였다. 상기 사전-고정화 단계는 압타머가 상호작용하는 경향성이 감소된 조건 하에 고정화를 구현하고 또한 인큐베이션 전에 매우 엄격한 세척(염기로 및 무질서유발 염으로)을 구현하여, 압타머의 상호작용을 손상시키고 매우 강력한 바이오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통해 결합되지 않은 모든 압타머를 제거한다. 이는 검정을 방해하는 압타머 "덩어리" - 일부 검출 가능한 빈도로 바이오틴 모이어티를 보유하거나 검정에서 바이오틴화되는 덩어리 - 의 수를 감소시킨다. 방사선 조사가 압타머로부터 전체는 아니지만, 대부분의 광절단 가능한 바이오틴 모이어티를 절단하지만, 일부 압타머는 단백질을 "태그"하기 위한 NHS-바이오틴 처리를 통해 바이오틴화될 수 있음을 주지할 필요가 있다. 캐치-2 단계에 포획되는 바이오틴화된 압타머는 부피가 큰 광절단된 압타머와의 상호작용에 의해 배경을 생성한 후, 용출 시 방출된다. 또한 압타머 패널이 별도로 고정화된 후 비드-결합 형태로 조합되고, 이에 따라 압타머가 상호작용하고 응집할 수 있는 조건을 우회할 수 있으므로, 사전-고정화된 포맷이 매우 큰 멀티플렉스능을 지지할 수 있을 것임이 주지되어야 한다.

따라서, 사전-고정화는 분석물질 용액의 존재 하에 압타머 흡착에 대한 필요성을 우회하고, 이에 따라 분석물질의 억제 농도를 검정하는 경우에도 정량적 고정화를 보장한다. 이는 이전에 기재된 바와 같이(Gold et al. (Dec. 2010) PLoS One 5(12):el5005) 공정의 10% 최대 농도 또는 보다 최신판 공정에서 사용되는 5% 최대 농도가 아닌, 최대로 적어도 40% v/v 혈장 또는 혈청의, 훨씬 더 높은 농도의 사용을 구현함으로써 민감도를 대략 4- 내지 8-배 증가시킬 뿐만 아니라 검정의 전반적 강도를 증가시킨다.

전반적 공정에 대한 또 다른 개선은 아래에서 상세히 기재되는 바와 같이 캐치-2 단계 동안 용출을 위해 대략 중성 pH에서의 무질서유발 염의 사용을 포함한다. 선행 기술의 방법은 DNA 혼성화 및 압타머/압타머 상호작용뿐만 아니라 단백질/압타머 상호작용을 손상시키는, 고 pH(10)에서의 나트륨 클로라이드의 사용을 포함하였다. 상기 주지된 바와 같이, DNA 혼성화 및 압타머/압타머 상호작용은 검정 배경에 기여한다. 중성 pH에서 비제한적으로 나트륨 퍼클로레이트, 리튬 클로라이드, 나트륨 클로라이드 및 마그네슘 클로라이드를 포함하는 무질서유발 염은 DNA 혼성화 및 압타머/압타머 상호작용을 뒷받침하는 반면, 압타머/단백질 상호작용을 손상시킨다. 전체 결과는 검정 민감도의 동시적 상승과 함께, 유의미하게 감소된(약 10배) 배경이다.

본원에서 사용되는 "캐치-1"은 압타머-표적 친화도 복합체 또는 압타머-표적 공유 복합체의 분할을 나타낸다. 캐치-1의 목적은 압타머와 연합되지 않은 평가 샘플에서의 실질적으로 모든 성분을 제거하는 것이다. 대부분의 이러한 성분의 제거는 캐치-2 포획을 위해 사용되는 표적 태그화 단계로부터 비-표적 분자를 제거함으로써 일반적으로 표적 태그화 효율을 개선할 것이며 더 낮은 검정 배경으로 이어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 태그는 압타머에 태그를 덧붙임으로써 검정 전에, 검정의 준비 동안, 또는 검정 동안 압타머에 부착된다. 하나의 구현예에서, 태그는 방출 가능한 태그이다. 하나의 구현예에서, 방출 가능한 태그는 절단 가능한 링커 및 태그를 포함한다. 상술된 바와 같이, 태그화된 압타머는 고체 지지체 상에 포획될 수 있고 고체 지지체는 태그에 적절한 포획 요소를 포함한다. 이어서 고체 지지체는 임의의 원치않는 물질을 제거하기 위해 평가 샘플과의 평형화 전에 본원에서 기재된 바와 같이 세척될 수 있다(캐치-0).

본원에서 사용되는 "캐치-2"는 표적 분자의 포획에 기반한 압타머-표적 친화도 복합체 또는 압타머-표적 공유 복합체의 분할을 나타낸다. 캐치-2 단계의 목적은 검출 및 선택적 정량 전에 평가 샘플로부터 자유, 또는 복합체화되지 않은, 압타머를 제거하는 것이다. 샘플로부터의 자유 압타머의 제거는 임의의 적합한 핵산 검출 기법에 의한 압타머-표적 친화도 또는 압타머-표적 공유 복합체의 검출을 허용한다. 검출 및 선택적 정량을 위해 Q-PCR을 사용하는 경우, 표적 분자의 정확한 검출 및 정량을 위해 자유 압타머의 제거가 필요하다.

하나의 구현예에서, 표적 분자는 단백질 또는 펩티드이며 자유 압타머는, 예를 들어, 압타머-표적 친화도(또는 공유) 복합체와 같은, 단백질(및 펩티드) 및 단백질(또는 펩티드)이 포함되는 복합체 내에 포함될 수 있는 시약을 사용하여 압타머-표적 친화도(또는 공유) 복합체(및 나머지 평가 샘플)로부터 분할된다. 태그화된 단백질(또는 펩티드) 및 압타머-표적 친화도(또는 공유) 복합체는 고체 지지체 상에 고정화되어, 자유 압타머로부터 단백질(또는 펩티드) 및 압타머-표적 친화도(또는 공유) 복합체의 분할을 구현할 수 있다. 이러한 태그화에는, 예를 들어, 단백질 또는 펩티드 내로 포함될 수 있는 바이오틴 모이어티가 포함될 수 있다.

하나의 구현예에서, 캐치-2 태그는 표적에 태그를 화학적으로 부착함으로써 검정 전에, 검정의 준비 동안, 또는 검정 동안 단백질(또는 펩티드)에 부착된다. 하나의 구현예에서 캐치-2 태그는 방출 가능한 태그이다. 하나의 구현예에서, 방출 가능한 태그는 절단 가능한 링커 및 태그를 포함한다. 그러나 단백질(또는 펩티드)을 캐치-2 고체 지지체로부터 방출하는 것이 일반적으로 필요하지는 않다. 상술된 바와 같이, 태그화된 표적은 제2 고체 지지체 상에 포획될 수 있고 고체 지지체는 표적 태그에 적절한 포획 요소를 포함한다. 이어서 고체 지지체는 유기 용매를 포함하는 완충된 용액 및 염 및/또는 세제를 함유하는 염 및/또는 세제를 포함하는 완충된 용액을 포함하는 다양한 완충된 용액으로 세척된다.

제2 고체 지지체의 세척 후, 압타머-표적 친화도 복합체는 표적 분자가 일반적으로 포획 요소 및 표적 포획 태그의 결합 상호작용을 통해 고체 지지체에 결합된 채 유지되면서 복합체가 손상되어 자유 압타머를 산출하는 해리 단계를 거친다. 압타머는 압타머 또는 표적의 구조를 손상시키는 임의의 방법에 의해 압타머-표적 친화도 복합체로부터 방출될 수 있다. 이는 비공유 결합된 압타머-표적 복합체를 해리하는 고 염 완충액 중 지지체 결합된 압타머-표적 친화도 복합체의 세척을 통해 달성될 수 있다. 용출된 자유 압타머가 수집되고 검출된다. 또 다른 구현예에서, 고 또는 저 pH가 압타머-표적 친화도 복합체를 손상시키기 위해 사용된다. 또 다른 구현예에서 고온이 압타머-표적 친화도 복합체를 손상시키기 위해 사용된다. 또 다른 구현예에서, 임의의 상기 방법의 조합이 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 압타머-표적 친화도 복합체의 단백질 모이어티의 단백분해 소화가 압타머 성분을 방출하기 위해 사용된다.

압타머-표적 공유 복합체의 경우, 후속 정량을 위한 압타머의 방출은 압타머 작제물 중 절단 가능한 링커를 사용하여 달성된다. 또 다른 구현예에서, 표적 태그에서의 절단 가능한 링커는 압타머-표적 공유 복합체의 방출을 유도할 것이다.

예로서, 프로테오믹 친화도 검정(멀티플렉스 검정)은 하기와 같이 실시될 수 있다:

캐치-0: 1xSB17,Tw(40 mM HEPES, 102 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0.05% Tween-20) 중 133 7.5% 스트렙타비딘-아가로스 슬러리를 필터 플레이트(0.45 μm Millipore HV 플레이트(Durapore cat# MAHVN4550))의 웰에 첨가하였다. 적절한 1.1x 압타머 혼합물(모든 압타머는 5' 말단 상에 절단 가능한 바이오틴 모이어티 및 Cy3 형광단을 함유함)을 해동한 후 볼텍싱하였다. 이어서 1.1x 압타머 혼합물을 10분 동안 끓이고, 30초 동안 볼텍싱하고, 20분 동안 수조에서 20℃로 냉각되도록 두었다. 이어서 스트렙타비딘 아가로스 슬러리를 함유하는 필터 플레이트의 액체를 원심분리(1분 동안 1000x g)에 의해 제거하였다. 100 μL의 압타머 혼합물을 필터 플레이트의 웰에 첨가하였다(로보트로). 혼합물을 850 rpm으로 설정된 진탕기 상에서 20분 동안 25℃에서 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호하였다.

캐치-0 세척: 20분 인큐베이션 후, 용액을 진공 여과에 의해 제거하였다. 190 1x CAPS 압타머 사전세척 완충액(50 mM CAPS, 1 mM EDTA, 0.05% Tw-20, pH 11.0)을 첨가하고 혼합물을 진탕하면서 1분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 CAPS 세척 용액을 진공 여과를 통해 제거하였다. 그 후 CAPS 세척을 1회 반복하였다. 190 μL 1x SX17-Tween을 첨가하고 혼합물을 진탕하며 1분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 1x SB17-Tween을 진공 여과를 통해 제거하였다. 추가적인 190 μL 1x SX17-Tw를 첨가하고 혼합물을 진탕하며 1분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 1x SB17-Tw를 원심분리(1000x g에서 1분)에 의해 제거하였다. 1x SB17-Tw의 제거 후, 150 μL 캐치-0 보관 완충액(150 mM NaCl, 40 mM HEPES, 1 mM EDTA, 0.02% 나트륨 아지드, 0.05% Tween-20)을 첨가하고 필터 플레이트를 플레이트 주변만 조심스럽게 밀봉하여 사용 전까지 암소에서 4℃에 보관하였다.

샘플 준비: 75 마이크로리터의 40% 샘플 희석을 40% 샘플 플레이트에 플레이팅하였다(최종 40% 샘플은 20 μM Z-블록, 1 mM 벤즈아미딘, 1 mM EGTA, 40 mM HEPES, 5 mM MgCl2, 5 mM KC1, 1% Tween-20을 함유함). 195 마이크로리터의 1x SB17-Tw를 1% 샘플 플레이트에 플레이팅하였다. 90 마이크로리터의 1x SB17-Tw를 10개의 희석 플레이트 중 1개에 플레이팅하였다. 133 마이크로리터의 1x SB17-Tw를 0.005% 샘플 플레이트에 플레이팅하였다. 샘플을 25℃ 인큐베이터에서 랙 해동 스테이션(Rack Thawing Station) 상에서 10분 동안 해동한 후, 볼텍싱하고, 1분 동안 1000x g에서 회전시켰다. 튜브에서 캡을 제거하였다. 샘플을 혼합하고(50 μL로 5회) 50 μL 100% 샘플을 샘플 희석제를 함유하는 40% 샘플 플레이트로 옮겼다. 이어서 40% 샘플을 위아래로 피펫팅하여(110 μL, 10회) 샘플 플레이트 상에서 혼합하였다. 이어서 5 μL의 40% 샘플을 1x SB17-Tw를 함유하는 1% 샘플 플레이트로 옮겼다. 다시 상기 샘플을 위아래로 피펫팅하여(120 μL, 10회) 혼합하였다. 혼합 후, 10 μL의 1% 샘플을 1x SB17-Tw를 함유하는 10개의 희석 플레이트 중 하나로 옮기고, 이를 위아래로 피펫팅하여(75 μL, 10회) 혼합하였다. 10개의 희석 플레이트 중 하나로부터의 7 마이크로리터의 0.1% 샘플을 1x SB17-Tw를 함유하는 0.005% 샘플 플레이트 내로 옮기고 위아래로 피펫팅하여(110 μL, 10회) 혼합하였다.

인큐베이션 전 플레이트 준비: 캐치-0 보관 용액을 진공 여과를 통해 필터 플레이트로부터 제거하였다. 이어서 190 마이크로리터의 1x SB17-Tw를 첨가한 후 진공 여과를 통해 필터 플레이트로부터 제거하였다. 그 후 추가적인 190 μL 1x SB17-Tw를 필터 플레이트에 첨가하였다.

인큐베이션: 1x SB17-Tw 완충액을 원심분리(1분, 1000x g에서)에 의해 필터 플레이트로부터 제거하였다. 100 마이크로리터의 적절한 샘플 희석을 필터 플레이트(3개의 필터 플레이트, 각각의 샘플 희석 40% 또는 20%, 1%, 또는 0.005%에 대해 하나씩)에 첨가하였다. 필터 플레이트를 웰에 압력을 가하지 않으면서, 플레이트 둘레만 조심스럽게 밀봉하였다. 압력은 인큐베이션 동안 누출을 유도할 것이다. 이어서 플레이트를 850 rpm으로 설정된 열진탕기 상에서 28℃에서 3.5시간 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호하였다.

필터 플레이트 가공: 인큐베이션 후, 필터 플레이트를 진공 매니폴드 상에 배치하고, 샘플을 진공 여과에 의해 제거하였다. 190 마이크로리터, 바이오틴 세척물(1x SB17-Tw 중 100 μM 바이오틴)을 첨가하고 액체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 이어서 샘플을 190 μL 1x SB17-Tw로 5x 세척하였다(진공 여과). 1x SB17-Tw(신선 제조됨) 중 100 마이크로리터의 1 mM NHS-바이오틴을 첨가하고, 필터 플레이트를 흡수 패드 상에 블로팅하고 혼합물을 진탕하며 5분 동안 인큐베이션하였다. 액체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 1x SB17-Tw 중 125 마이크로리터 20 mM 글리신을 첨가하고 액체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 다시 1x SB17-Tw 중 125 μL 20 mM 글리신을 첨가하고 액체를 진공 여과에 의해 제거하였다.

이후, 샘플을 190 μL 1x SB17-Tw로 6x 세척하고, 액체는 진공 여과에 의해 제거하였다. 이어서 85 마이크로리터의 광절단 완충액(1x SB17-Tw 중 2 μM Z-블록)을 각각의 필터 플레이트에 첨가하였다.

광절단: 필터 플레이트를 흡수 패드 상에 블로팅하고 진탕하며(800 rpm, 25℃) BlackRay UV 램프로 6분 동안 조사하였다. 플레이트를 180도 회전시키고 BlackRay 광원 하에 추가 6분 동안 조사하였다. 40% 필터 플레이트를 빈 96-웰 플레이트 상에 배치하였다. 1% 필터 플레이트를 40% 필터 플레이트 상부에 적층하고 0.005% 필터 플레이트를 1% 필터 플레이트 상부에 적층하였다. 플레이팅 어셈블리를 1000x g에서 1분 동안 회전시켰다. 용출된 샘플을 갖는 96-웰 플레이트를 로보트 덱 상에 배치하였다. 37℃ 인큐베이터로부터 1x SB17-Tw 중 60% 글리세롤을 로보트 덱 상에 배치하였다.

캐치-2: 검정 설정 동안 50 μL의 10 mg/mL MyOne SA 비드(500 μg)를 캐치-2를 위한 ABgene Omni-튜브 96-웰 플레이트에 첨가하고 Cytomat에 배치하였다. 캐치-2 96-웰 비드 플레이트를 90초 동안 현탁하고, 60초 동안 자석 블록 상에 배치하고, 상청액을 제거하였다. 동시에, 또는 순차적으로, 각각의 희석 그룹으로부터의 캐치-1 용출액을 캐치-2 비드 플레이트로 전달하고 Peltier 열진탕기(1350 rpm, 5분, 25℃) 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 2분 동안 25℃ 자석으로 전달하고 상청액을 제거하였다. 다음으로 75 μL 1x SB17-Tw를 첨가하고 샘플을 37℃에서 1분 동안 1350 rpm으로 Peltier 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 다음으로 1x SB17-Tw(37℃로 가열됨) 중 75 μL 60% 글리세롤을 첨가하고 샘플을 37℃에서 1분 동안 1350 rpm에서 Peltier 진탕기 상에서 다시 인큐베이션하였다. 플레이트를 37℃로 가열된 자석으로 전달하고 2분 동안 인큐베이션한 후 상청액을 제거하였다. 상기 37℃ 1x SB17-Tw 및 글리세롤 세척 사이클을 2회 더 반복하였다. 이어서 샘플을 Peltier 진탕기(1350 rpm, 1분, 25℃) 상에서 150 μL 1x SB17-Tw로 세척하여 잔여 글리세롤을 제거한 후, 25℃ 자기 블록 상에서 1분 동안 두었다. 상청액을 제거하고 0.5 M NaCl로 치환된 150 μL 1x SB17-Tw를 첨가하고 1분 동안 1350 rpm에서(25℃), 이어서 25℃ 자기 블록 상에서 1분 동안 인큐베이션하였다. 상청액을 제거하고 75 μL 퍼클로레이트 용출 완충액(1.8 M NaClC-4, 40 mM PIPES, 1 mM EDTA, 0.05% Triton X-100, 1x 혼성화 대조군, pH=6.8)을 첨가한 후 Peltier 진탕기(25℃, 1350 rpm) 상에서 10분 인큐베이션하였다. 플레이트를 자기 분리장치로 전달하여 90초 동안 인큐베이션하고, 상청액을 회수하였다.

혼성화: 20마이크로리터의 용출된 샘플을 로보트로 빈 96-웰 플레이트로 첨가하였다. 제2 세트의 혼성화 대조군을 함유하는 5마이크로리터 10x Agilent 차단 완충액을 용출된 샘플에 로보트로 첨가하였다. 이어서 25 μL 2x Agilent HiRPM 혼성화 완충액을 웰에 수동 첨가하였다. 40마이크로리터의 혼성화 혼합물을 Agilent 개스킷 슬라이드 상에 로딩하였다. Agilent 8 × 15k 어레이를 개스킷 슬라이드 상에 첨가하고 샌드위치를 클램프로 조였다. 이어서 샌드위치를 55℃에서 19시간 동안 회전 인큐베이션하였다(20 rpm).

혼성화-후 세척: 혼성화 후 슬라이드 가공을 Little Dipper 프로세서(SciGene, Cat# 1080-40-1) 상에서 수행하였다. 대략 750 mL 세척 완충액 1(Oligo aCGH/ChlP-온-칩 세척 완충액 1, Agilent Technologies)을 1개의 유리 염색 디쉬 내로 배치하였다. 대략 750 mL 세척 완충액 1(Oligo aCGH/ChlP-온-칩 세척 완충액 1, Agilent Technologies)을 Little Dipper 프로세서의 조(Bath) #1 내에 배치하였다. 37℃로 가열된 대략 750 mL 세척 완충액 2(Oligo aCGH/ChlP-온-칩 세척 완충액 1, Agilent Technologies)를 Little Dipper 프로세서의 조 #2 내에 배치하였다. 두 조에 대한 자기 교반 속도는 5로 설정하였다. 조 #1에 대한 온도 제어장치는 켜지 않은 반면, 조 #2에 대한 온도 제어장치는 37℃로 설정하였다. 최대 12개의 슬라이드/개스킷 어셈블리를 세척 완충액 1을 함유하는 제1 염색 디쉬 내로 순차적으로 디스어셈블리하고 슬라이드를 여전히 세척 완충액 1 중에 침지시킨 채 슬라이드 랙 내에 배치하였다. 모든 슬라이드/개스킷 어셈블리가 디스어셈블리되면, 슬라이드 랙을 Little Dipper 프로세서의 조 #1 내로 빨리 전달하고 자동화된 세척 프로토콜을 시작하였다. Little Dipper 프로세서로 슬라이드를 250의 속도로 조 #1에서 300초 동안 인큐베이션한 후, Agilent Wash 2(Oligo aCGH/ChlP-온-칩 세척 완충액 2, Agilent Technologies)를 함유하는 37℃ 조 #2로 전달하고 100의 속도로 300초 동안 인큐베이션하였다. 이후 Little Dipper 프로세서를 빌트-인 원심분리기로의 슬라이드 랙으로 전달하고, 슬라이드를 690의 속도로 300초 동안 회전시켰다.

마이크로어레이 이미지화: 마이크로어레이 슬라이드를 100% PMT 설정의 5 μm 해상도 및 0.05로 구현된 XRD 옵션으로 Cy3-채널에서 마이크로어레이 스캐너(Agilent G2565CA 마이크로어레이 스캐너 시스템, Agilent Technologies)로 이미지화하였다. 생성된 tiff 이미지를 GEl_107_Sep09 프로토콜로 Agilent 특징부 추출 소프트웨어 버전 10.7.3.1을 사용하여 가공하였다.

본원에서 사용되는 "방출 가능한" 또는 "절단 가능한" 요소, 모이어티, 또는 링커는 분해되어 2개의 별도 성분을 생성할 수 있는 분자 구조를 나타낸다. 방출 가능한(또는 절단 가능한) 요소는 화학적 결합이 절단될 수 있는(본원에서 "인라인 절단 가능한 링커"로 나타냄) 단일 분자를 포함할 수 있거나, 비공유 상호작용이 절단되거나 손상될 수 있는(본원에서 "혼성화 링커"로 나타냄) 2개 이상의 분자를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 개별 작용부와의 간섭을 방지하기 위해, 특정한 작용기를 다른 작용기와 공간적으로 분리하는 것이 필요하다. 예를 들어, 광절단 가능한 기 근처의, 특정 광 파장을 흡수하는, 표지의 존재는 광절단의 효율을 방해할 수 있다. 따라서 이러한 기를, 예를 들어, 전체 광절단 활성을 회복하기 위해 충분한 공간적 분리를 제공하는 비-간섭 모이어티와 분리하는 것이 요망된다. 일부 구현예에서, "스페이싱 링커"가 표지 및 광절단 작용부를 모두 갖는 압타머 내로 도입될 수 있다.

"고체 지지체"는 분자가 공유 또는 비공유 결합을 통해, 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 갖는 임의의 기질을 나타낸다. 고체 지지체에는 표면에 부착되는 포획 요소 또는 탐침에 대해 물리적 지지를 제공할 수 있는 임의의 기질 물질이 포함될 수 있다. 물질은 일반적으로 표면에 대한 포획 요소 또는 탐침의 부착 및 검정의 수행 동안 직면하는 임의의 후속 처리, 취급, 또는 가공에 관련된 조건을 견딜 수 있다. 물질은 천연 생성, 합성, 또는 천연 생성 물질의 변형일 수 있다. 적합한 고체 지지체 물질에는 이들 자체로 또는 다른 물질과 함께 사용되는, 실리콘, 실리콘 웨이퍼 칩, 그래파이트, 미러처리된 표면, 라미네이트, 멤브레인, 세라믹, 플라스틱(예컨대, 폴리(비닐 클로라이드), 사이클로-올레핀 공중합체, 아가로스 겔 또는 비드, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸 부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE 또는 Teflon®), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트)와 같은 중합체를 포함함), 게르마늄, 갈륨 아르세니드, 금, 은, Langmuir Blodgett 필름, 플로우 쓰루 칩 등이 포함될 수 있다. 실리카가 포함되며 추가로, 예를 들어 Bioglass로 이용 가능한 유리가 포함되는, 유리와 같은 추가적인 강성 물질이 고려될 수 있다. 채택될 수 있는 다른 물질에는, 예를 들어, 제어되는 포어 글래스 비드, 가교된 비드화 세파로스® 또는 아가로스 수지, 또는 가교된 비스-아크릴아미드 및 아자락톤의 공중합체와 같은 다공성 물질이 포함된다. 다른 비드에는 나노입자, 중합체 비드, 고체 코어 비드, 상자성 비드, 또는 마이크로비드가 포함된다. 예를 들어, 그 표면 상에 포함되는, 임의의 아미노, 카복실, 티올, 또는 하이드록실 작용기와 같은 하나 이상의 작용기를 가질 수 있는 당분야에 알려져 있는 임의의 다른 물질이 또한 고려된다.

고체 지지체에 사용되는 물질은 단순부터 복합까지의 범위의 임의의 다양한 구성을 취할 수 있다. 고체 지지체는 스트립, 플레이트, 디스크, 막대, 입자, 비드, 튜브, 웰(마이크로타이터) 등을 포함하는 여러 형태 중 임의의 하나를 가질 수 있다. 고체 지지체는 다공성 또는 비-다공성, 자성, 상자성, 또는 비-자성, 다중분산성 또는 단일분산성, 소수성 또는 소수성일 수 있다. 고체 지지체는 또한 조밀하게-패킹된(칼럼 매트릭스에서와 같이) 또는 느슨하게-패킹된 입자의 겔 또는 슬러리 형태일 수 있다.

하나의 구현예에서, 부착된 포획 요소를 갖는 고체 지지체가 평가 혼합물로부터 태그화된 압타머-표적 친화도 복합체 또는 압타머-표적 공유 복합체를 포획하기 위해 사용된다. 하나의 특정예에서, 태그가 바이오틴 모이어티인 경우, 고체 지지체는 Dynabeads M-280 스트렙타비딘, Dynabeads MyOne 스트렙타비딘, Dynabeads M-270 스트렙타비딘(Invitrogen), 스트렙타비딘 아가로스 수지(Pierce), 스트렙타비딘 Ultralink 수지, MagnaBind 스트렙타비딘 비드(ThermoFisher Scientific), BioMag 스트렙타비딘, ProMag 스트렙타비딘, 실리카 스트렙타비딘(Bangs Laboratories), 스트렙타비딘 세파로스 고성능(GE Healthcare)과 같은 스트렙타비딘-코팅 비드 또는 수지일 수 있다.

스트렙타비딘 폴리스티렌 마이크로스피어(Microspheres-Nanospheres), 스트렙타비딘 코팅된 폴리스티렌 입자(Spherotech), 또는 임의의 다른 스트렙타비딘 코팅된 비드 또는 수지가 바이오틴-태그화 분자를 포획하기 위해 당업자에 의해 일반적으로 사용된다.

상술된 바와 같이, 본 발명의 하나의 목적은 단백질 신호를 압타머 신호로 전환하는 것이다. 결과적으로 수집되는/검출되는 압타머의 양은, 결합된 표적 분자의 양 및 샘플 중 표적 분자의 양을 시사하고, 이와 정비례할 수 있다. 여러 검출 방식이 캐치-2 분할 후 제2 고체 지지체로부터 압타머-표적 친화도 또는 압타머-표적 공유 복합체를 용출하지 않고 채택될 수 있다. 검출 방법의 하기 구현예에 더하여, 다른 검출 방법이 당업자에게 알려져 있을 것이다.

여러 검출 방법은 검출 전 압타머 내로 포함될 명백한 표지를 필요로 한다. 이들 구현예에서, 예를 들어, 형광 또는 화학발광 염료와 같은 표지는 핵산 합성을 위한 표준 기법을 사용하여 합성 동안 또는 후에 압타머 내로 포함될 수 있다. 방사활성 표지는 적절한 시약과의 표준 효소 반응을 사용하여 합성 동안 또는 합성 후에 포함될 수 있다. 표지화는 또한 적합한 효소 기법을 사용함으로써 캐치-2 분할 및 용출 후 일어날 수 있다. 예를 들어, 상기 언급된 표지를 갖는 프라이머를 사용하여, PCR로 용출된 압타머의 증폭 산물 내에 표지를 포함시킬 것이다. 정량을 위해 겔 기법을 사용하는 경우, 상이한 크기의 질량 표지가 또한 PCR을 사용하여 포함될 수 있다. 이들 질량 표지는 또한 추가적인 멀티플렉스화능을 위한 상이한 형광 또는 화학발광 염료를 포함할 수 있다. 표지는 합성 동안 또는 합성 후, 압타머 내로 포함된 특이적 태그를 사용한 후, 태그와 연합하고 표지를 운반하는 탐침을 추가함으로써 압타머에 간접적으로 추가될 수 있다. 표지에는 상술된 것들뿐만 아니라 예를 들어, 비색 판독을 위해 표준 검정에서 사용되는 효소가 포함된다. 이들 효소는 효소 기질과 조합 작용하며, 예를 들어, 홀스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 및 알칼리성 포스파타제(AP)와 같은 효소가 포함된다. 표지에는 또한 전기화학적 검출을 위한 전기화학적 작용기인 물질 또는 화합물이 포함될 수 있다.

예를 들어, 압타머는 평가 샘플과의 접촉 전에 32P와 같은 방사활성 동위원소로, 상술된 바와 같이 표지될 수 있다. 상기 논의된 바와 같은 4개의 기본 검정 중 임의의 하나, 및 이의 변이를 채택하여, 압타머 검출은 검정 종료 시 제2 고체 지지체 상의 방사활성을 정량함으로써 간단히 달성될 수 있다. 방사활성 카운트는 원래 평가 샘플에서의 표적의 양과 정비례할 것이다. 유사하게, 평가 샘플의 접촉 전, 상술된 바와 같은, 형광 염료로의 압타머의 표지화는 제2 고체 지지체 상에서 직접 간단한 형광 판독을 허용한다. 화학발광 표지 또는 퀀텀 도트는 압타머 용출을 필요로 하지 않고, 제2 고체 지지체로부터의 직접적 판독을 위해 유사하게 채택될 수 있다.

제2 고체 지지체로부터 압타머를 용출시키거나 광압타머-표적 공유 복합체를 방출함으로써, 추가적인 검출 방식이 상술된 것들에 부가하여 채택될 수 있다. 예를 들어, 방출된 압타머, 광압타머 또는 광압타머-표적 공유 복합체를 PAGE 겔 상에서 걸고 검출하고 선택적으로 SYBR Gold와 같은 핵산 염료로 정량할 수 있다. 대안적으로, 방출된 압타머, 광압타머 또는 광압타머 공유 복합체는 상술된 바와 같이 압타머에 포함된 형광 표지를 사용하는 모세관 겔 전기영동(CGE)을 사용하여 검출되고 정량될 수 있다. 또 다른 검출 방식은, 예를 들어, SYBR Green을 사용하여 용출된 압타머를 검출하고 정량하기 위해 정량적 PCR을 채택한다. 대안적으로, Invader® DNA 검정이 용출된 압타머를 검출하고 정량하기 위해 채택될 수 있다. 또 다른 대안적인 검출 방식은 차세대 서열분석을 채택한다.

또 다른 구현예에서, 압타머-표적 친화도 복합체(또는 압타머-표적 공유 복합체)의 양 또는 농도는 복제 공정 동안 "분자 신호(beacon)"을 사용하여 결정된다(예컨대, Tyagi et ah, Nat. Biotech. J_6:49 53, 1998; U.S. 특허 번호 5,925,517 참고). 분자 신호는 헤어핀 루프로 폴딩되고 헤어핀이 형성되는 경우 형광단에 의한 신호가 거의 또는 전혀 생성되지 않도록 헤어핀 구조의 하나의 말단 상에 형광단 및 다른 말단 상에 켄처를 함유하는 특이적 핵산 탐침이다. 루프 서열은 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 특이적이고, 압타머 서열에 혼성화 시, 헤어핀의 폴딩이 풀리고 이에 따라 형광 신호를 생성한다.

제2 고체 지지체에 여전히 결합된 소수의 압타머의 멀티플렉스화된 검출을 위해, 상이한 여기/방출 스펙트럼을 갖는 형광 염료가 2개, 또는 3개, 또는 5개, 또는 최대 10개의 개별 압타머를 검출하고 정량하기 위해 채택될 수 있다.

유사하게 상이한 크기의 퀀텀 도트가 멀티플렉스화된 판독을 위해 채택될 수 있다. 퀀텀 도트는 제2 고체 지지체로부터 자유 압타머의 분할 후 도입될 수 있다. 고유한 퀀텀 도트에 부착된 압타머 특이적 혼성화 서열을 사용함으로써, 2, 3, 5, 및 최대 10개 압타머에 대한 멀티플렉스화된 판독이 수행될 수 있다. 32P, 3H, 113JC, 및 3 J5JS와 같은, 개별적으로 검출될 수 있는 상이한 방사활성 동위원소를 이용한 상이한 압타머의 표지화가 또한 제한된 멀티플렉스 판독을 위해 사용될 수 있다.

캐치-2 제2 고체 지지체로부터 방출된 압타머의 멀티플렉스화된 검출을 위해, 상술된 바와 같이 각각의 압타머 내에 포함된, 단일 형광 염료가 압타머 수준의 정량과 함께 압타머 서열의 확인을 허용하는 정량 방법과 함께 사용될 수 있다. 방법에는 비제한적으로 DNA 칩 혼성화, 마이크로비드 혼성화, 차세대 서열분석 및 CGE 분석이 포함된다.

하나의 구현예에서, 표준 DNA 혼성화 어레이, 또는 칩이 Agilent 어레이, Illumina BeadChip 어레이, NimbleGen 어레이 또는 맞춤 인쇄된 어레이와 같은 슬라이드 또는 칩 상에 고정화된 고유한 또는 일련의 고유한 탐침에 각각의 압타머 또는 광압타머를 혼성화하기 위해 사용된다. 각각의 고유한 탐침은 압타머 상의 서열과 상보적이다. 상보적 서열은 압타머, 또는 압타머 서열의 일부, 또는 전체 압타머 서열에 포함된 고유한 혼성화 태그일 수 있다. 캐치-2 고체 지지체로부터 방출된 압타머는 적절한 혼성화 완충액에 첨가되고 표준 혼성화 방법을 사용하여 가공된다. 예를 들어, 압타머 용액은 혼성화의 엄격성을 보장하기 위해 약 60℃에서 DNA 혼성화 어레이와 12시간 동안 인큐베이션된다. 어레이는 세척된 후 형광 슬라이드 스캐너에서 스캐닝되어, 어레이의 각각의 특징부에 대한 압타머 혼성화 세기의 이미지를 생성한다. 이미지 분절화 및 정량은 ArrayVision과 같은 이미지 가공 소프트웨어를 사용해서 수행된다. 하나의 구현예에서, 멀티플렉스화된 압타머 검정은 최대 25개 압타머, 최대 50개 압타머, 최대 100개 압타머, 최대 200개 압타머, 최대 500개 압타머, 최대 1000개 압타머, 및 최대 10,000개 압타머를 사용하여 검출될 수 있다.

하나의 구현예에서, 상술된 바와 같은 압타머에 상보적인 고유한 DNA 탐침을 갖는 지정 가능한 마이크로비드가 혼성화를 위해 사용된다. 마이크로비드는 Luminex 비드 기술과 같은 고유한 형광 염료로 지정 가능하거나, Illumina VeraCode 기술 또는 레이저 구동 응답기에서와 같이 바 코드 표지를 사용할 수 있다. 하나의 구현예에서, 캐치-2 고체 지지체로부터 방출된 압타머는 적절한 혼성화 완충액에 첨가되고 표준 마이크로비드 혼성화 방법을 사용하여 가공된다. 예를 들어, 압타머 용액은 혼성화의 엄격성을 보장하기 위해 약 60℃에서 마이크로비드 세트와 2시간 동안 인큐베이션된다. 이어서 용액은 개별 비드 유형을 카운팅하고 압타머 형광 신호를 정량하는 Luminex 기기 상에서 가공된다. 또 다른 구현예에서, VeraCode 비드는 압타머 용액과 접촉되고 약 60℃에서 2시간 동안 혼성화된 후, 그리드화된 표면 상에 침착되고 확인 및 형광 정량을 위해 슬라이드 스캐너를 사용해서 스캐닝된다. 또 다른 구현예에서, 응답기 마이크로비드는 약 60℃에서 압타머 샘플과 인큐베이션된 후 응답기 마이크로비드를 위해 적절한 장치를 사용하여 정량된다. 하나의 구현예에서, 멀티플렉스 압타머 검정은 최대 25개 압타머, 최대 50개 압타머, 최대 100개 압타머, 최대 200개 압타머, 및 최대 500개 압타머를 사용하여 마이크로비드에 대한 혼성화에 의해 검출될 수 있다.

용출된 압타머를 함유하는 샘플은 상술된 바와 같이 형광 표지와 함께 고유한 질량 태그를 포함하도록 가공될 수 있다. 이어서 질량 표지된 압타머가 CGE 기기, 본질적으로 DNA 서열분석기 내로 주입되고, 압타머는 표지화 반응 동안 포함된 염료로부터의 형광을 사용하여 이의 고유한 질량에 의해 확인되고 정량된다. 상기 기법의 하나의 예시적인 예가 Althea Technologies에 의해 개발되었다.

상술된 여러 방법에서, 압타머의 용액이 증폭되고 선택적으로 정량 전에 태그화될 수 있다. 표준 PCR 증폭이 캐치-2 고체 지지체로부터 용출된 압타머 용액과 함께 사용될 수 있다. 이러한 증폭은 DNA 어레이 혼성화, 마이크로비드 혼성화, 및 CGE 판독 전에 사용될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 압타머-표적 친화도 복합체(또는 압타머-표적 공유 복합체)는 Q-PCR을 사용해서 검출되고/되거나 정량된다. 본원에서 사용되는 "Q-PCR"은 검정 결과가 정량적인, 즉 검정이 평가 샘플에 존재하는 압타머의 양 또는 농도를 정량할 수 있는 제어되는 조건 및 방식으로 수행되는 PCR 반응을 나타낸다.

하나의 구현예에서, 평가 샘플에서 압타머-표적 친화도 복합체(또는 압타머-표적 공유 복합체)의 양 또는 농도는 TaqMan® PCR을 사용하여 결정된다. 상기 기법은 일반적으로 표적화된 서열로부터 신호를 생성하기 위해 올리고뉴클레오티드 복제 효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성에 의존한다. TaqMan 탐침은 정량될 압타머의 서열에 기반하여 선택되며, 압타머 서열이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 증폭됨에 따라 신호를 생성하기 위해, 일반적으로 예를 들어 6-카복시플루오레신과 같은 5'-말단 형광단, 및 예를 들어 6-카복시테트라메틸플루오레신과 같은 3'-말단 켄처가 포함된다. 폴리머라제가 압타머 서열을 카피함에 따라, 엑소뉴클레아제 활성은 탐침으로부터 형광단을 자유화하며, 이는 PCR 프라이머로부터 하류에 어닐링됨으로써 신호를 생성한다. 복제 산물이 생성됨에 따라 신호는 증가한다. PCR 산물의 양은 수행되는 복제 사이클의 수뿐만 아니라 압타머의 시작 농도 모두에 의존한다.

또 다른 구현예에서, 압타머-표적 친화도 복합체(또는 압타머-표적 공유 복합체)의 양 또는 농도는 복제 공정 동안 개재 형광 염료를 사용하여 결정된다. 예를 들어, SYBR® green과 같은, 개재 염료는 단일-가닥 DNA의 존재 하에 생성되는 형광 신호에 비해 이중-가닥 DNA의 존재 하에 큰 형광 신호를 생성한다. 이중-가닥 DNA 산물이 PCR 동안 형성됨에 따라, 염료에 의해 생성되는 신호가 증가한다. 생성되는 신호의 크기는 PCR 사이클의 수 및 압타머의 시작 농도 둘 다에 의존한다.

또 다른 구현예에서, 압타머-표적 친화도 복합체(또는 압타머-표적 공유 복합체)는 질량 분광측정을 사용하여 검출되고/되거나 정량된다. 고유한 질량 태그는 상술된 바와 같은 효소적 기법을 사용하여 도입될 수 있다. 질량 분광측정 판독을 위해, 검출 표지는 요구되지 않고, 오히려 질량 자체가 당업자에 의해 일반적으로 사용되는 기법을 사용하여 질량 분광측정 분석 동안 생성되는 질량 피크 위치 및 질량 피크 하 면적에 기반하여 확인하고 또한 정량하기 위해 사용된다. 질량 분광측정을 사용하는 일례는 Sequenom에 의해 개발된 MassARRAY® 시스템이다.

컴퓨터 프로그램이 임의의 본원에서 개시되는 방법의 하나 이상의 단계를 수행하기 위해 이용될 수 있다. 본 개시의 또 다른 양태는 컴퓨터로 로딩되는 경우, 임의의 본원에서 개시되는 방법의 성능을 수행하거나 보조하는, 저장된 컴퓨터 프로그램을 갖는 컴퓨터로 읽을 수 있는 저장 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품이다.

본 개시의 하나의 양태는 임의의 본원에서 개시되는 방법의 산물, 즉 검정 결과이며, 이는 평가 장소에서 평가될 수 있거나 요망되는 경우, 원격 위치의 관심 당사자와의 또 다른 평가 및 커뮤니케이션 장소로 운송될 수 있다. 본원에서 사용되는 "원격 위치"는 결과가 수득되는 위치와 물리적으로 상이한 위치를 나타낸다. 따라서, 결과는 상이한 방, 상이한 건물, 상이한 도시 부분, 상이한 도시 등으로 송부될 수 있다. 데이터는, 예컨대, 팩시밀리, 우편, 밤샘 배달, 이메일, ftp, 보이스 메일 등과 같은 임의의 적합한 수단에 의해 전송될 수 있다.

"커뮤니케이션" 정보는 적합한 커뮤니케이션 채널(예를 들어, 사적 또는 공개 네트워크)에 걸쳐 전기적 신호로 그 정보를 나타내는 데이터의 전송을 나타낸다. 품목의 "포워딩(Forwarding)"은 그 품목을 물리적으로 수송하건 다르게 수송하건(가능한 경우) 한 위치에서 다른 위치로 품목을 얻는 임의의 수단을 나타내며, 적어도 데이터의 경우, 데이터를 운반하는 매체를 물리적으로 수송하거나 데이터를 커뮤니케이션하는 것이 포함된다.

변형 뉴클레오티드

특정 구현예에서, 본 개시는 압타머와 같은 올리고뉴클레오티드를 제공하며, 이는 2가지 상이한 유형의 염기-변형 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 2가지 상이한 유형의 5-위치 변형 피리미딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 C5-변형 시티딘 및 적어도 하나의 C5-변형 유리딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 2개의 상이한 C5-변형 시티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 올리고뉴클레오티드는 2개의 상이한 C5-변형 유리딘을 포함한다. 비제한적인 예시적 C5-변형 유리딘 및 시티딘을, 예를 들어, 도 1에 나타낸다. 특정한 비제한적인 예시적 C5-변형 유리딘을 도 2에 나타내며, 특정한 비제한적인 예시적 C5-변형 시티딘을 도 3에 나타낸다.

올리고뉴클레오티드의 제조

올리고데옥시뉴클레오시드의 자동화된 합성은 여러 실험실에서 일상적인 실시이다(예컨대, 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는, Matteucci, M. D. and Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191 참고). 올리고리보뉴클레오시드의 합성도 잘 알려져 있다(예컨대 그 내용의 전문이 본원에 참조로 포함되는, Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441 참고). 본원에서 주지된 바와 같이, 포스포르아미다이트는 화학적 합성에 의한 변형 뉴클레오시드의 올리고뉴클레오티드로의 포함을 위해 유용하며, 트리포스페이트는 효소적 합성에 의한 변형 뉴클레오시드의 올리고뉴클레오티드로의 포함을 위해 유용하다(예컨대, Vaught, J. D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc., 126:11231-11237; Vaught, J. V., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis a practical approach" (1984) IRL Press (Oxford, UK); Herdewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Totowa, N.J. 참고(그 각각의 전문이 본원에 참조로 포함됨).

"표적" 또는 "표적 분자" 또는 "표적"은 본원에서 그에 대해 핵산이 요망되거나 의도되는 방식으로 작용할 수 있는 임의의 화합물을 나타낸다. 표적 분자는 비제한적으로 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원체, 독성 성분, 기질, 대사물질, 전이 상태 유사체, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포, 조직, 임의의 상기의 임의의 부분 또는 단편 등일 수 있다. 실질적으로 임의의 화학적 또는 생물학적 효과기가 적합한 표적일 수 있다. 임의의 크기의 분자가 표적으로 작용할 수 있다. 표적은 또한 표적 및 핵산 간 상호작용의 가능성 또는 강도를 증강시키기 위한 특정한 방식으로 변형될 수 있다. 표적에는 또한 단백질의 경우, 예를 들어 아미노산 서열의 소소한 변이, 디설피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 분자의 정체성을 실질적으로 변경하지 않는, 표지화 성분과의 컨주게이션과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형과 같은, 특정 화합물 또는 분자의 임의의 소소한 변이가 포함될 수 있다. "표적 분자" 또는 "표적"은 압타머에 결합할 수 있는 한 유형 또는 종의 분자 또는 다중분자 구조의 카피 세트이다. "표적 분자" 또는 "표적"은 하나를 초과하는 이러한 분자의 세트를 나타낸다. 표적이 펩티드인 SELEX 공정의 구현예는 "Modified SELEX Processes Without Purified Protein"을 표제로 하는 U.S. 특허 번호 6,376,190에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 표적은 단백질이다.

본원에서 사용되는, "경쟁인자 분자" 및 "경쟁인자"는 비-표적 분자와 비특이적 복합체를 형성할 수 있는 임의의 분자를 나타내기 위해 상호 교환 가능하게 사용된다. 상기 맥락에서, 비-표적 분자에는 자유 압타머가 포함되며, 예를 들어, 경쟁인자는 압타머가 비특이적으로 또 다른 비-표적 분자에 결합(재결합)하는 것을 억제하기 위해 사용될 수 있다. "경쟁인자 분자" 또는 "경쟁인자"는 하나의 유형 또는 종의 분자의 카피 세트이다. "경쟁인자 분자" 또는 "경쟁인자"는 하나를 초과하는 이러한 분자의 세트를 나타낸다. 경쟁인자 분자에는 비제한적으로 올리고뉴클레오티드, 다중음이온(예컨대, 헤파린, 청어 정자 DNA, 연어 정자 DNA, tRNA, 덱스트란 설페이트, 폴리덱스트란, 비염기성 포스포디에스테르 중합체, dNTP, 및 피로포스페이트)이 포함된다. 다양한 구현예에서, 하나 이상의 경쟁인자의 조합이 사용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "비-특이적 복합체"는 압타머 및 그 표적 분자가 아닌 2개 이상의 분자 간 비공유 연합을 나타낸다. 비특이적 복합체는 분자 클래스 간 상호작용을 나타낸다. 비특이적 복합체에는 압타머 및 비-표적 분자, 경쟁인자 및 비-표적 분자, 경쟁인자 및 표적 분자, 및 표적 분자 및 비-표적 분자 간 형성되는 복합체가 포함된다.

또 다른 구현예에서, 다중음이온 경쟁인자(예컨대, 덱스트란 설페이트 또는 또 다른 다중음이온 물질)는 다중음이온의 존재에 대해 저항성인 압타머의 확인을 촉진하기 위해 느린 오프율의 농축 공정에서 사용된다. 상기 맥락에서, "다중음이온 저항성 압타머"는 다중음이온 저항성 물질을 함유하는 용액에서 비다중음이온 저항성 압타머가 포함되는 압타머/표적 복합체보다 해리할 가능성이 더 적은 압타머/표적 복합체를 형성할 수 있는 압타머이다. 상기 방식으로, 다중음이온 저항성 압타머는 샘플에서 표적의 존재 또는 양 또는 농도를 검출하기 위한 분석 방법의 수행에서 사용될 수 있고, 검출 방법에는 그에 대해 압타머가 저항성인 다중음이온 물질(예컨대 덱스트란 설페이트)의 사용이 포함된다.

따라서, 하나의 구현예에서, 다중음이온 저항성 압타머를 제조하는 방법이 제공된다. 상기 구현예에서, 핵산 후보 혼합물과 표적의 접촉 후. 후보 혼합물 중 표적 및 핵산은 평형에 이르도록 둔다. 다중음이온 경쟁인자가 도입되고 후보 혼합물에서 대부분의 빠른 오프율의 압타머가 표적 분자로부터 해리됨을 보장하기 충분한 시기 동안 용액 중에 인큐베이션하며 둔다. 또한, 다중음이온 경쟁인자의 존재 하에 해리할 수 있는 후보 혼합물 중 압타머가 표적 분자로부터 방출될 것이다. 혼합물은 표적 분자와 연합된 채 유지된 고친화도, 느린 오프율의 압타머를 단리하고, 임의의 복합체화되지 않은 물질을 용액으로부터 제거하기 위해 분할된다. 이어서 압타머가 표적 분자로부터 방출되고 단리될 수 있다. 단리된 압타머는 또한 증폭될 수 있고, 추가 라운드의 선택이 선택된 압타머의 전반적 성능을 증가시키기 위해 적용될 수 있다. 상기 공정은 또한 느린 오프율의 압타머의 선택이 특정 적용을 위해 필요하지 않은 경우 최소 인큐베이션과 함께 사용될 수 있다.

염

화합물의 대응하는 염, 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 염을 제조하고, 정제하고, 및/또는 취급하는 것이 편리하거나 요망될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염의 예는 문헌[Berge et al. (1977) "Pharmaceutically Acceptable Salts" J. Pharm. Sci. 66:1-19]에서 논의된다.

예를 들어, 화합물이 음이온성인 경우, 또는 음이온성일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대, -COOH는 -COO^-일 수 있음), 적합한 양이온과 염이 형성될 수 있다. 적합한 무기 양이온의 예에는 비제한적으로 Na⁺ 및 K⁺와 같은 알칼리 금속 이온, Ca²⁺ 및 Mg²⁺와 같은 알칼리 토 양이온, 및 Al⁺³와 같은 다른 양이온이 포함된다. 적합한 유기 양이온의 예에는 비제한적으로 암모늄 이온(즉, NH₄ ⁺) 및 치환된 암모늄 이온(예컨대, NH₃R^X+, NH₂R^X ₂ ⁺, NHR^X ₃ ⁺, NR^X ₄ ⁺)이 포함된다. 일부 적합한 치환된 암모늄 이온의 예는 하기로부터 유래된 것들이다: 에틸아민, 디에틸아민, 디사이클로헥실아민, 트리에틸아민, 부틸아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페라진, 벤질아민, 페닐벤질아민, 콜린, 메굴민, 및 트로메타민뿐만 아니라 라이신 및 아르기닌과 같은 아미노산. 일반적인 사차 암모늄 이온의 일례는 N(CH₃)₄ ⁺이다.

화합물이 양이온성인 경우, 또는 양이온성일 수 있는 작용기를 갖는 경우(예컨대, -NH₂는 -NH₃ ⁺일 수 있음), 적합한 음이온과 염이 형성될 수 있다. 적합한 무기 음이온의 예에는 비제한적으로 하기 무기 산으로부터 유래된 것들이 포함된다: 염화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 아황산, 질산, 아질산, 인산, 및 아질산.

적합한 유기 음이온의 예에는 비제한적으로 하기 유기 산으로부터 유래된 것들이 포함된다: 2-아세티옥시벤조산, 아세트산, 아스코르브산, 아스파르트산, 벤조산, 캄포르설폰산, 신남산, 시트르산, 에데트산, 에탄디설폰산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루크헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 하이드록시말레산, 하이드록시나프탈렌 카복실산, 이세티온산, 락트산, 락토바이온산, 라우르산, 말레산, 말산, 메탄설폰산, 뮤신산, 올레산, 옥살산, 팔미트산, 파모산, 판토텐산, 페닐아세트산, 페닐설폰산, 프로피온산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 숙신산, 설파닐산, 타르타르산, 톨루엔설폰산, 및 발레르산. 적합한 중합체성 유기 음이온의 예에는 비제한적으로 하기 중합체 산으로부터 유래된 것들이 포함된다: 주석산, 카복시메틸 셀룰로스.

달리 특정되지 않는 한, 특정 화합물에 대한 언급에는 또한 이의 염 형태가 포함된다.

다른 구현예

일부 구현예에서, a) 제1 평가 샘플을 제1 세트의 압타머와 접촉시켜 제1 혼합물을 형성하는 단계로서, 제1 평가 샘플이 생물학적 샘플의 Z% 희석이며, Z는 생물학적 샘플의 5% 내지 39% (또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39) 희석이고, 제1 세트의 압타머에는 적어도 A₃개의 상이한 압타머가 존재하는, 단계; b) 제2 평가 샘플을 제2 세트의 압타머와 접촉시켜 제2 혼합물을 형성하는 단계로서, 제2 평가 샘플이 생물학적 샘플의 Y% 희석이며, Y는 Z 미만이고, 제2 세트의 압타머에는 적어도 A₂개의 상이한 압타머가 존재하는, 단계; c) 제3 평가 샘플을 제3 세트의 압타머와 접촉시켜 제3 혼합물을 형성하는 단계로서, 제3 평가 샘플이 생물학적 샘플의 X% 희석이며, X는 Y 미만이고, 제3 세트의 압타머에는 적어도 A₁개의 상이한 압타머가 존재하는, 단계; d) 제1, 제2 및 제3 혼합물을 인큐베이션하여 압타머-단백질 복합체의 형성을 허용하고, 압타머-단백질 복합체를 형성하지 않은 대부분의 압타머를 제거하는 단계; e) 압타머-단백질 복합체를 해리함으로써 압타머-단백질 복합체로부터 압타머를 수집하는 단계; f) 수집된 압타머를 검출하거나 정량하는 단계를 포함하는 방법이 개시되며; 대부분의 제1 세트의 압타머, 제2 세트의 압타머 및 제3 세트의 압타머가 각각 평가 샘플에서 상이한 표적 단백질에 대한 친화도를 가지며, 그 표적 단백질과 압타머-단백질 복합체를 형성할 수 있고, A₃은 A₂ 초과이고, A₂는 A₂ 초과이고; A₁, A₂ 및 A₃의 합은 적어도 4,000이다.

하나의 양태에서, Z는 10% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%이다.

하나의 양태에서, Y는 0.01% 내지 1% (또는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75 또는 약 0.5%이다.

하나의 양태에서, X는 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008 또는 0.009) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%이다.

하나의 양태에서, A₁, A₂ 및 A₃의 합은 적어도 4,500 또는 5,000이다.

하나의 양태에서, A₃은 A₁, A₂ 및 A₃의 합의 50% 내지 90% (또는 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90%)이거나; A₁, A₂ 및 A3의 합의 60% 내지 85%이거나; A₁, A₂ 및 A₃의 합의 약 80% 또는 81%이다.

하나의 양태에서, A₂는 A₁, A₂ 및 A₃의 합의 10% 내지 49% (또는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 49%)이거나; A₁, A₂ 및 A3의 합의 12% 내지 35%이거나; A₁, A₂ 및 A3의 합의 15% 내지 30%이거나; A₁, A₂ 및 A₃의 합의 약 15% 또는 16%이다.

하나의 양태에서, A₁은 A₁, A₂ 및 A₃의 합의 1% 내지 9% (또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% 또는 9%)이거나; A₁, A₂ 및 A3의 합의 2% 내지 7%이거나; A₁, A₂ 및 A3의 합의 3% 내지 6%이거나; A₁, A₂ 및 A₃의 합의 약 3% 또는 4%이다.

하나의 양태에서, A₃은 적어도 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500, 5000(또는 900 내지 16,500 또는 2000 내지 15,000 또는 3,000 내지 12,000 또는 4,000 내지 10,000)이다.

하나의 양태에서, A₂는 적어도 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820, 900(또는 500 내지 3500 또는 700 내지 2500, 또는 800 내지 2000)이다.

하나의 양태에서, A₁은 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 173 (또는 100 내지 700 또는 100 내지 650)이다.

하나의 양태에서, 제1 혼합물, 제2 혼합물 및 제3 혼합물은 서로 별도로 인큐베이션된다.

하나의 양태에서, 본원에서의 방법은 혼합물을 인큐베이션하여 압타머-단백질 복합체 형성을 허용한 후 제1 혼합물, 제2 혼합물 및 제3 혼합물을 함께 조합하는 단계를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 본원에서의 방법은 혼합물을 인큐베이션하여 압타머-단백질 복합체 형성을 허용한 후 제1 혼합물, 제2 혼합물 및 제3 혼합물을 함께 순차적으로 조합하는 단계를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 순차적 조합은 i) 제1 혼합물, 이어서 제2 혼합물, 이어서 제3 혼합물; ii) 제1 혼합물, 이어서 제3 혼합물, 이어서 제2 혼합물; iii) 제2 혼합물, 이어서 제1 혼합물, 이어서 제3 혼합물; iv) 제2 혼합물, 이어서 제3 혼합물, 이어서 제1 혼합물; v) 제3 혼합물, 이어서 제2 혼합물, 이어서 제1 혼합물; 및 vi) 제3 혼합물, 이어서 제1 혼합물, 이어서 제2 혼합물로부터 선택되는 순서로 수행된다.

하나의 양태에서, 평가 샘플은 혈액, 혈장, 혈청 가래, 호흡, 소변, 정액, 타액, 수막액, 양수, 샘액, 림프액, 유두 흡입물, 기관지 흡입물, 활액, 관절 흡입물, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 검출 또는 정량은 PCR, 질량 분광측정, 핵산 서열분석, 차세대 서열분석(NGS) 또는 혼성화에 의해 수행된다.

하나의 양태에서, 적어도 A₃개의 상이한 압타머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 차이 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형만큼 서로 상이하다.

하나의 양태에서, 적어도 A₂개의 상이한 압타머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 차이 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형만큼 서로 상이하다.

하나의 양태에서, 적어도 A₁개의 상이한 압타머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 차이 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형만큼 서로 상이하다.

하나의 양태에서, 적어도 A₃개의 상이한 압타머, 적어도 A₂개의 상이한 압타머 및 적어도 A₁개의 상이한 압타머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 차이 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형만큼 서로 상이하다.

임의의 하나의 상기 단락의 방법에서, 제1 세트, 제2 세트 및 제3 세트의 압타머 중 하나 이상의 압타머는 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함한다.

하나의 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

일부 구현예에서, a) 제1 평가 샘플을 적어도 하나의 제1 압타머와 접촉시켜 제1 혼합물을 형성하는 단계로서, 제1 평가 샘플이 평가 샘플의 적어도 X% 희석인, 단계; b) 제2 평가 샘플을 적어도 하나의 제2 압타머와 접촉시켜 제2 혼합물을 형성하는 단계로서, 제2 평가 샘플이 평가 샘플의 Y% 희석이며, X는 Y 미만인, 단계; c) 제3 평가 샘플을 적어도 하나의 제3 압타머와 접촉시켜 제3 혼합물을 형성하는 단계로서, 제3 평가 샘플이 평가 샘플의 Z% 희석이며, Y는 Z 미만인 단계; d) 제1, 제2 및 제3 혼합물을 인큐베이션하여 압타머-단백질 복합체의 형성을 허용하고, 압타머-단백질 복합체를 형성하지 않은 대부분의 압타머를 제거하는 단계; e) 압타머-단백질 복합체를 해리함으로써 압타머-단백질 복합체로부터 압타머를 수집하는 단계; f) 수집된 압타머를 검출하거나 정량하는 단계를 포함하는 방법이 개시되며; 적어도 하나의 제1 압타머, 적어도 하나의 제2 압타머 및 적어도 하나의 제3 압타머가 각각 상이한 단백질에 대해 친화도를 가지며, 단백질이 각각의 평가 샘플에 존재하는 경우 압타머-단백질 복합체를 형성할 수 있고; 제1, 제2 및 제3 평가 샘플은 동일한 평가 샘플의 상이한 희석이다.

하나의 양태에서, Z%는 5% 내지 39% (또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 또는 39%) 또는 10% 내지 30% 또는 15% 내지 25% 또는 약 20%이다.

하나의 양태에서, Y%는 0.01% 내지 1% (또는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.7% 또는 약 0.5%이다.

하나의 양태에서, X%는 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008 또는 0.009) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%이다.

하나의 양태에서, 제1 혼합물은 복수의 압타머를 포함한다.

하나의 양태에서, 제1 혼합물은 적어도 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 173 (또는 100 내지 700 또는 100 내지 650)개의 상이한 압타머를 포함한다.

하나의 양태에서, 제2 혼합물은 복수의 압타머를 포함한다.

하나의 양태에서, 제2 혼합물은 적어도 적어도 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820, 900 (또는 500 내지 3500 또는 700 내지 2500, 또는 800 내지 2000)개의 상이한 압타머를 포함한다.

하나의 양태에서, 제3 혼합물은 복수의 압타머를 포함한다.

하나의 양태에서, 제3 혼합물은 적어도 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500, 5000(또는 900 내지 16,500 또는 2000 내지 15,000 또는 3,000 내지 12,000 또는 4,000 내지 10,000)개의 상이한 압타머를 포함한다.

하나의 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 혼합물을 인큐베이션하여 압타머-단백질 복합체 형성을 허용한 후, 제1 혼합물, 제2 혼합물 및 제3 혼합물을 함께 조합하는 단계를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 본원에서 개시되는 방법은 혼합물을 인큐베이션하여 압타머-단백질 복합체 형성을 허용한 후, 제1 혼합물, 제2 혼합물 및 제3 혼합물을 함께 순차적으로 조합하는 단계를 추가로 포함한다.

임의의 하나의 앞 단락의 방법에서, 적어도 하나의 제1 압타머, 적어도 하나의 제2 압타머, 적어도 하나의 제3 압타머, 및 복수의 압타머는 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함한다.

하나의 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

임의의 하나의 앞 단락의 방법에서, 압타머는 적어도 하나의 뉴클레오티드 차이 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형만큼 서로 상이하다.

일부 구현예에서, a) 제1 세트의 압타머와 함께 제1 평가 샘플을 포함하는 제1 혼합물을 갖는 제1 저장소로서, 제1 평가 샘플이 평가 샘플의 Z% 희석이며, 제1 세트의 압타머에 적어도 A₃개의 상이한 압타머가 존재하는, 제1 저장소; b) 제2 세트의 압타머와 함께 제2 평가 샘플을 포함하는 제2 혼합물을 갖는 제2 저장소로서, 제2 평가 샘플이 평가 샘플의 Y% 희석이며, Y가 Z 미만이고, 제2 세트의 압타머에 적어도 A₂개의 상이한 압타머가 존재하는, 제2 저장소; c) 제3 세트의 압타머와 함께 제3 평가 샘플을 포함하는 제3 혼합물을 갖는 제3 저장소로서, 제3 평가 샘플이 평가 샘플의 X% 희석이며, X가 Y 미만이고, 제3 세트의 압타머에 적어도 A₁개의 상이한 압타머가 존재하는, 제3 저장소를 포함하는 시스템이 개시되며; 대부분의 제1 세트의 압타머, 제2 세트의 압타머 및 제3 세트의 압타머는 평가 샘플에서 단백질에 대한 친화도를 가지며, 압타머-단백질 복합체를 형성할 수 있고, A₃은 A₂ 초과이고, A₂는A₁ 초과이고; A₁, A₂ 및 A₃의 합은 적어도 4,000이고; 시스템은 평가 샘플에서 단백질을 검출하기 위해 사용되고, 제1, 제2 및 제3 평가 샘플은 동일한 평가 샘플의 상이한 희석이다.

하나의 양태에서, X%는 0.001 내지 0.009% (또는 0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.005, 0.006, 0.007, 0.008 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%이다.

일부 구현예에서, a) 적어도 하나의 제1 압타머와 함께 제1 평가 샘플을 포함하는 제1 혼합물을 갖는 제1 저장소로서, 제1 평가 샘플이 평가 샘플의 Z% 희석인, 제1 저장소; b) 적어도 하나의 제2 압타머와 함께 제2 평가 샘플을 포함하는 제2 혼합물을 갖는 제2 저장소로서, 제2 평가 샘플이 평가 샘플의 Y% 희석이며, Y가 Z 미만인, 제2 저장소; c) 적어도 하나의 제3 압타머와 함께 제3 평가 샘플을 포함하는 제3 혼합물을 갖는 제3 저장소로서, 제3 평가 샘플이 평가 샘플의 X% 희석이며, X가 Y 미만인, 제3 저장소를 포함하는 시스템이 개시되며; 적어도 하나의 제1 압타머, 적어도 하나의 제2 압타머 및 적어도 하나의 제3 압타머는 각각 상이한 단백질에 대한 친화도를 가지며, 단백질이 생물학적 샘플에 존재하는 경우 압타머-단백질 복합체를 형성할 수 있고; 시스템은 평가 샘플에서 단백질을 검출하기 위해 사용되고, 제1, 제2 및 제3 평가 샘플은 동일한 평가 샘플의 상이한 희석이다.

일부 구현예에서, 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 포함하는 제형이 개시되며, 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 평가 샘플의 약 0.005% 희석으로 형성되었고, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 평가 샘플의 약 0.5% 희석으로 형성되었고, 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 평가 샘플의 약 20% 희석으로 형성되었다.

하나의 양태에서, 독립적으로, 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 제1 포획 시약, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 제2 포획 시약, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 제3 포획 시약은 압타머 또는 항체로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 각각의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 박테리아, 대사물질, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포 및 조직으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 비공유 복합체이다.

하나의 양태에서, 각각의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 제형에서 조합되기 전에 평가 샘플의 이의 각각의 희석으로 형성된다.

하나의 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

일부 구현예에서, 복수의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 복수의 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 복수의 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 포함하는 제형이 개시되며, 복수의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 평가 샘플의 약 0.005% 희석으로 형성되고, 복수의 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 평가 샘플의 약 0.5% 희석으로 형성되고, 복수의 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 평가 샘플의 약 20% 희석으로 형성된다.

하나의 양태에서, 독립적으로, 복수의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 복수의 제1 포획 시약, 복수의 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 복수의 제2 포획 시약, 및 복수의 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 복수의 제3 포획 시약은 압타머 또는 항체로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 복수의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 복수의 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 복수의 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 비공유 복합체이다.

하나의 양태에서, 각각의 복수의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 복수의 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 복수의 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 제형에서 조합되기 전에 평가 샘플의 이의 각각의 희석으로 형성된다.

하나의 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

하나의 양태에서, 복수의 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 복수의 제1 포획 시약은 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 또는 173; 또는 100 내지 700; 또는 100 내지 650개 포획 시약이다.

하나의 양태에서, 복수의 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 복수의 제2 포획 시약은 약 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820 또는 900; 또는 500 내지 3500; 또는 약 700 내지 2500; 또는 800 내지 2000; 또는 약 828개 포획 시약이다.

하나의 양태에서, 복수의 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 복수의 제3 포획 시약은 약 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500 또는 5000; 또는 약 900 내지 16,500; 또는 약 2000 내지 15,000; 또는 약 3,000 내지 12,000; 또는 약 4,000 내지 10,000; 또는 약 4271개 포획 시약이다.

일부 구현예에서, a) 제1 희석 그룹을 제2 희석 그룹과 순차적으로 조합하는 단계로서, 제1 희석 그룹이 평가 샘플의 X% 희석이며 제1 표적 단백질에 결합되어 제1 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체를 형성하는 제1 포획 시약을 포함하며, 제2 희석 그룹이 평가 샘플의 Y% 희석이고 제2 표적 단백질에 결합되어 제2 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체를 형성하는 제2 포획 시약을 포함하고, 제1 및 제2 표적 단백질이 상이한 단백질이고, X가 Y 미만인, 단계; b) 이의 각각의 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체로부터 포획 시약을 해리하는 단계; 및 c) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.

본원에서 개시되는 방법의 일부 양태에서, 방법은 제3 희석 그룹을 제1 및 제2 희석 그룹과 순차적으로 조합하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 희석 그룹이 평가 샘플의 Z% 희석이고 제3 표적 단백질에 결합되어 제3 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체를 형성하는 제3 포획 시약을 포함하며, 제3 표적 단백질이 제1 및 제2 표적 단백질과 상이하고, Y가 Z 미만이다.

하나의 양태에서, 제1 포획 시약 및 제2 포획 시약은 압타머 또는 항체이다.

하나의 양태에서, 제1 희석 및 제2 희석 그룹은 동일한 평가 샘플의 희석이다.

하나의 양태에서, 제3 희석 그룹은 동일한 평가 샘플의 상이한 희석이고/이거나 제3 포획 시약은 압타머 또는 항체이다.

하나의 양태에서, 제1 희석 그룹은 0.001% 내지 0.009% (또는 X%는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%임)의 평가 샘플의 희석이거나 X%는 0.002% 내지 0.008%이거나 X%는 0.003% 내지 0.007%이거나 X%는 약 0.005%이다.

하나의 양태에서, 제2 희석 그룹은 0.01% 내지 1% (또는 Y%는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%임)의 평가 샘플의 희석이거나 Y%는 0.1% 내지 0.8%이거나 Y%는 0.2% 내지 0.75%이거나 Y%는 약 0.5%이다.

하나의 양태에서, 제3 희석 그룹은 5% 내지 39% (또는 Z%는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%임)의 평가 샘플의 희석이거나, Z%는 15% 내지 30%이거나, Z%는 15% 내지 25%이거나, Z%는 약 20%이다.

하나의 양태에서, 제1 희석 그룹은 복수의 제1 포획 시약을 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제2 희석 그룹은 복수의 제2 포획 시약을 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제3 희석 그룹은 복수의 제3 포획 시약을 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제1 희석 그룹은 복수의 제1 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제2 희석 그룹은 복수의 제2 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제3 희석 그룹은 복수의 제3 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제1 희석 그룹과 제2 희석 그룹의 순차적 조합은 제1 및 제2 희석 그룹의 조합 후 세척 단계를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 제3 희석 그룹과 제1 및 제2 희석 그룹의 순차적 조합은 제1, 제2 및 제3 희석 그룹의 조합 후 세척 단계를 추가로 포함한다.

하나의 양태에서, 복수의 제1 포획 시약은 약 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 또는 173; 또는 100 내지 700; 또는 100 내지 650개 포획 시약이다.

하나의 양태에서, 복수의 제2 포획 시약은 약 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820 또는 900; 또는 500 내지 3500; 또는 약 700 내지 2500; 또는 800 내지 2000; 또는 약 828개 포획 시약이다.

하나의 양태에서, 복수의 제3 포획 시약은 약 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500 또는 5000; 또는 약 900 내지 16,500; 또는 약 2000 내지 15,000; 또는 약 3,000 내지 12,000; 또는 약 4,000 내지 10,000; 또는 약 4271개 포획 시약이다.

하나의 양태에서, 제1 및 제2 희석 그룹의 순차적 조합 전에, 제1 희석 그룹의 제1 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체 및 제2 희석 그룹의 제2 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체는 이의 각각의 희석 그룹에서 제1 고체 지지체 상에 각각 고정화되며, 순차적으로 조합하기 위해 제1 고체 지지체로부터 방출된다.

하나의 양태에서, 제3 희석 그룹과 제1 및 제2 희석 그룹의 순차적 조합 전에, 제3 희석 그룹의 제3 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체는 이의 각각의 희석 그룹에서 제1 고체 지지체 상에 고정화되며, 순차적으로 조합하기 위해 제1 고체 지지체로부터 방출된다.

하나의 양태에서, 제1 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체는 포획 시약과 고체 지지체의 연합에 의해 그 제1 고체 지지체 상에 고정화되었다.

하나의 양태에서, 제2 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체는 포획 시약과 고체 지지체의 연합에 의해 그 제1 고체 지지체 상에 고정화되었다.

하나의 양태에서, 제3 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체는 포획 시약과 고체 지지체의 연합에 의해 그 제1 고체 지지체 상에 고정화되었다.

하나의 양태에서, 모이어티는 소수성 모이어티이다.

하나의 양태에서, 압타머는 35~100 뉴클레오티드 길이이다.

하나의 양태에서, 압타머는 공통 단백질 결합 도메인을 포함한다.

하나의 양태에서, 압타머는 3~20개의 5-위치 변형 피리미딘을 포함한다.

하나의 양태에서, 희석 그룹의 순차적 조합 순서는 제1 희석 그룹과 제2 희석 그룹 이어서 제3 희석 그룹의 조합; 제1 희석 그룹과 제3 희석 그룹 이어서 제2 희석 그룹의 조합; 제2 희석 그룹과 제3 희석 그룹 이어서 제1 희석 그룹의 조합; 제2 희석 그룹과 제1 희석 그룹 이어서 제3 희석 그룹의 조합; 제3 희석 그룹과 제1 희석 그룹 이어서 제2 희석 그룹의 조합; 및 제3 희석 그룹과 제2 희석 그룹 이어서 제1 희석 그룹의 조합으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 희석 그룹의 순차적 조합 순서는 제1 희석 그룹과 제2 희석 그룹의 조합 및 제2 희석 그룹과 제1 희석 그룹의 조합으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 해리된 포획 시약의 존재 검출 또는 수준 결정은 표적 단백질의 존재의 검출 또는 수준의 결정을 위한 대리물이다.

일부 구현예에서, a) 제1 고체 지지체로부터 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하는 단계; b) 제2 고체 지지체로부터 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하여 제1 혼합물에서 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 조합하는 단계; c) 제1 태그를 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자에 부착하는 단계; d) 태그화된 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 제3 고체 지지체(들)와 접촉시켜 태그가 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 제3 고체 지지체(들)에 고정시키도록 하는 단계; e) 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 포획 시약을 해리하는 단계; 및 f) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 개시되며; 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 동일한 평가 샘플의 상이한 희석에서 각각 형성된다.

일부 구현예에서, a) 제1 고체 지지체 상에 고정화된 제1 포획 시약을 제1 희석과 접촉시켜 제1 혼합물을 형성하고, 제2 고체 지지체 상에 고정화된 제2 포획 시약을 제2 희석과 접촉시켜 제2 혼합물을 형성하고, 각각의 제1 및 제2 포획 시약이 표적 분자와 결합할 수 있는, 단계; b) 제1 혼합물 및 제2 혼합물을 별도로 인큐베이션하는 단계로서, 제1 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제1 혼합물에 존재하는 경우 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제1 혼합물에 형성되고, 제2 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제2 혼합물에 존재하는 경우 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제2 혼합물에 형성되는, 단계; c) 제1 고체 지지체로부터 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제3 혼합물로 전달하는 단계; d) 제2 고체 지지체로부터 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하는 단계; e) 단계 c) 후, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제3 혼합물로 전달하고, 이에 따라 제3 혼합물에서 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 조합하는 단계; f) 제1 태그를 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자에 부착하는 단계; g) 태그화된 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제3 고체 지지체와 접촉시켜 태그가 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제3 고체 지지체에 고정시키도록 하는 단계; h) 이의 각각의 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 포획 시약을 해리하는 단계 및 i) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 개시되며; 제1 희석 및 제2 희석은 평가 샘플의 상이한 희석이다.

일부 구현예에서, a) 제1 고체 지지체로부터 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하는 단계; b) 제2 고체 지지체로부터 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하고, 이에 따라 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 조합하는 단계; c) 제3 고체 지지체로부터 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하고, 이에 따라 제1, 제2 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 조합하는 단계; d) 제1 태그를 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자에 부착하는 단계; e) 태그화된 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 제4 고체 지지체(들)와 접촉시켜 태그가 제1, 제2 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 제4 고체 지지체(들)에 고정시키도록 하는 단계; f) 제1, 제2 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 포획 시약을 해리하는 단계; 및 g) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 개시되며; 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 각각 동일한 평가 샘플의 상이한 희석에서 형성되었다.

일부 구현예에서, a) 제1 고체 지지체로부터 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하는 단계; b) 제2 고체 지지체로부터 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하고, 이에 따라 제1 혼합물에서 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 조합하는 단계; c) 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 포획 시약을 해리하는 단계; 및 f) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 개시되며; 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 각각 동일한 평가 샘플의 상이한 희석에서 형성되었다.

일부 구현예에서, a) 제1 고체 지지체로부터 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하는 단계; b) 제2 고체 지지체로부터 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하고, 이에 따라 제1 혼합물에서 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 조합하는 단계; c) 제3 고체 지지체로부터 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 방출하고 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 제1 혼합물로 전달하고, 이에 따라 제1 혼합물에서 제1, 제2 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 조합하는 단계; e) 제1, 제2 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 포획 시약을 해리하는 단계; 및 f) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계를 포함하는 방법이 개시되며, 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체는 각각 동일한 평가 샘플의 상이한 희석에서 형성되었다.

본원에서 기재되는 임의의 하나의 방법, 제형 및 시스템에서, 방법, 제형 및/또는 시스템은 경쟁인자 분자를 추가로 포함한다.

본원에서 기재되는 임의의 하나의 방법, 제형 및 시스템, 방법, 제형 및/또는 시스템에서, 경쟁인자 분자는 약 10 μM 내지 120 μM (또는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120 μM); 또는 약 15 μM 내지 약 80 μM; 또는 약 20 μM; 또는 약 30 μM 또는 약 60 μM의 농도이다.

본원에서 기재되는 임의의 하나의 방법, 제형 및 시스템, 방법, 제형 및/또는 시스템에서, 경쟁인자 분자는 올리고뉴클레오티드, 다중음이온, 헤파린, 청어 정자 DNA, 연어 정자 DNA, tRNA, 덱스트란 설페이트, 폴리덱스트란, 비염기성 포스포디에스테르 중합체, dNTP, 및 피로포스페이트로부터 선택된다.

본원에서 기재되는 임의의 하나의 방법, 제형 및 시스템, 방법, 제형 및/또는 시스템에서, 경쟁인자 분자는 (A-C-BndU-BndU)₇AC의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드이다.

본원에서 기재되는 임의의 하나의 방법, 제형 및 시스템, 방법, 제형 및/또는 시스템에서, 경쟁인자 분자는 평가 샘플에 있어서 약 30 μM의 농도이며, 평가 샘플은 혈장이다.

본원에서 기재되는 임의의 하나의 방법, 제형 및 시스템, 방법, 제형 및/또는 시스템에서, 경쟁인자 분자는 평가 샘플에 있어서 약 60 μM의 농도이며, 평가 샘플은 혈청이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 일부 구현예를 보다 자세히 예시하기 위해 제시된다. 그러나, 이는 어떠한 방식으로든, 본 발명의 광의의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 당업자는 본 발명의 정신에서 벗어나지 않고 다양한 화합물을 설계하기 위해 본 발견의 내재 원리를 쉽게 차용할 수 있다.

실시예 1. 샘플의 멀티플렉스화 압타머 분석

본 실시예는 샘플 및 대조군을 분석하기 위해 사용되는 멀티플렉스 압타머 검정을 설명한다.

멀티플렉스 압타머 검정 방법

멀티플렉스 압타머 검정의 모든 단계는 달리 나타내지 않는 한, 실온에서 수행하였다.

압타머 마스터 혼합물 용액의 제조.

5272개 압타머를 3개의 고유한 혼합물 Dil1, Dil2 및 Dil3으로 그룹화하였고 각각 20%, 0.5% 및 0.005%의 혈장 또는 혈청 샘플 희석에 대응하였다. 각각의 압타머를 갖는 매칭되는 혈장 및 혈청 샘플의 희석 시리즈를 검정하고 가장 큰 선형 신호 범위를 제공한 샘플 희석을 확인함으로써 혼합물에 대한 압타머의 할당을 실험적으로 결정하였다. 압타머의 분리 및 혈장 또는 혈청 샘플의 상이한 희석(20%, 0.5% 또는 0.005%)과의 혼합은 검정이 10⁷-배 범위의 단백질 농도에 걸칠 수 있게 한다. 압타머 마스터 혼합물에 대한 스톡 용액을 4 nM의 각각의 압타머로 HE-Tween 완충액(10 mM Hepes, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.05% Tween 20) 중에 제조하고 -20℃에서 냉동 보관하였다. 4271개 압타머를 Dil1 혼합물에서, 828개 압타머를 Dil2에서 그리고 173개 압타머를 Dil3 혼합물에서 혼합하였다. 사용 전에, 스톡 용액을 0.55 nM의 각각의 압타머의 작업 농도로 HE-Tween 완충액 중에 희석하고 개별 용도의 분취물로 분취하였다. 캐치-0 플레이트 제조를 위해 압타머 마스터 혼합물을 사용하기 전에, 10분 동안 95℃에서, 이어서 사용 전에 적어도 30분 동안 25℃에서 인큐베이션함으로써 작업 용액을 가열-냉각하여 압타머를 재폴딩시켰다.

캐치-0 플레이트 제조.

60 μL의 스트렙타비딘 Mag 세파로스 10% 슬러리(GE Healthcare, 28-9857)를 100 μL의 가열-냉각 압타머 마스터 혼합물과 조합하였다. 혼합물을 175 μL의 검정 완충액(40 mM HEPES, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 0.05% Tween-20)으로 1회 세척한 후 96-웰 플레이트(Thermo Scientific, AB-0769)의 각각의 웰에 분배하였다. 플레이트를 ThermoMixer C 진탕기(Eppendorf) 상에서 850 rpm으로 진탕하며 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 인큐베이션 후, 6 μL의 MB 블록 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8, 0.01% Tween 중 50 mM D-바이오틴)을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 진탕하며 2분 동안 추가 인큐베이션하였다. 이어서 플레이트를 175 μL의 검정 완충액으로 세척하고, 850 rpm으로 ThermoMixer C 상에서 진탕하며 1분의 세척 사이클에 이어 30초 동안 자석 상에서 분리하였다. 세척 용액을 제거한 후, 비드를 175 μL의 검정 완충액 중에 재현탁하고 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

캐치-2 비드 제조.

검정의 로보트 가공의 시작 전에, 멀티플렉스 압타머 검정의 캐치-2 단계를 위해 사용된 MyOne 스트렙타비딘 C1 비드(Dynabeads, 부품 번호 35002D, Thermo Scientific)의 10 mg/mL 비드 슬러리를 5분 동안 MB Prep 완충액(10 mM Tris-HCl, pH8, 1 mM EDTA, 0.4% SDS) 상에서 벌크로 1회 세척한 후, 검정 완충액으로 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 비드를 10 mg/mL 농도로 재현탁하고 75 μL의 비드 슬러리를 캐치-2 플레이트의 각각의 웰 내로 분배하였다. 검정의 시작 시, 캐치-2 플레이트를 알루미늄 어댑터에 배치하고 Fluent 덱 상의 적절한 위치에 배치하였다.

샘플 해동 및 희석.

-80℃에서 Matrix 튜브에 보관된 100% 혈장 또는 혈청 샘플의 65 μL 분취물을 10분 동안 실온에서 인큐베이션함으로써 해동하였다. 해동을 촉진하기 위해, 튜브를 Matrix 튜브 랙을 통해 공기를 순환시킨 팬 장치의 상부 상에 배치하였다. 해동 후, 샘플을 1분 동안 1000×g에서 원심분리하고 샘플 희석을 위해 Fluent 로보트 덱 상에 배치하였다. 35 μL의 해동된 샘플을 140 μL의 적절한 샘플 희석제를 함유하는 96-웰 플레이트 내로 옮김으로써 20% 샘플 용액을 제조하였다. 혈장에 대한 샘플 희석제는 50 mM Hepes, pH 7.5, 100 mM NaCl, 8 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1.25 mM EGTA, 1.2 mM 벤즈아미딘, 37.5 μM Z-블록 및 1.2% Tween-20이었다. 혈청 샘플 희석제는 75 μM Z-블록을 함유하였고, 다른 성분은 혈장 샘플 희석제에서와 동일한 농도였다. 0.5% 및 0.005% 희석된 샘플을 제조하는 후속 희석을 Fluent 로보트 상에서 연속 희석을 사용하여 검정 완충액 내로 제조하였다. 0.5% 샘플 희석을 제조하기 위해, 45 μL의 20% 샘플을 180 μL의 검정 완충액과 혼합함으로써 20% 샘플의 4%로의 중간 희석을 제조한 후, 25 μL의 4% 희석된 샘플을 175 μL의 검정 완충액과 혼합함으로써 0.5% 샘플을 제조하였다. 0.005% 샘플을 제조하기 위해, 20 μL의 0.5% 샘플을 180 μL의 검정 완충액과 혼합함으로써 0.05% 중간 희석을 제조한 후, 20 μL의 0.05% 샘플을 180 μL의 검정 완충액과 혼합함으로써 0.005% 샘플을 제조하였다.

샘플 결합 단계.

상술된 바와 같은 스트렙타비딘 자성 세파로스 비드 상에 압타머 혼합물을 고정화함으로써 캐치-0 플레이트를 제조하였다. 냉동된 플레이트를 25℃에서 30분 동안 해동하고 175 μL의 검정 완충액으로 1회 세척하였다. 100 μL의 각각의 샘플 희석(20%, 0.5% 및 0.005%)을 3개의 상이한 압타머 마스터 혼합물(각각 Dil1, Dil2 및 Dil3)을 갖는 비드 함유 플레이트에 첨가하였다. 이어서 캐치-0 플레이트를 알루미늄 호일 씰(Microseal 'F' 호일, Bio-Rad)로 밀봉하고 850 rpm, 28℃로 설정된 4-플레이트 회전 진탕기(PHMP-4, Grant Bio)에 배치하였다. 샘플 결합 단계를 3.5 시간 동안 수행하였다.

Fluent 로보트 상의 멀티플렉스 압타머 검정 가공.

샘플 결합 단계가 종료된 후, 캐치-0 플레이트를 알루미늄 플레이트 어댑터 내에 배치하고 로보트 덱 상에 배치하였다. 온도-제어 플레이트를 사용하여 자기 비드 세척 단계를 수행하였다. 모든 로보트 가공 단계에 있어서, 아래에 기재된 바와 같은 캐치-2 세척을 제외하고 플레이트를 25℃ 온도로 설정하였다. 플레이트를 175 μL의 검정 완충액으로 4회 세척하였고, 각각의 세척 사이클은 적어도 1분 동안 1000 rpm에서 플레이트의 진탕에 이어 완충액 흡입 전 적어도 30초 동안 자기 비드를 분리하도록 프로그래밍하였다. 마지막 세척 사이클 동안, 검정 완충액 중 100x 태그 시약(EZ-Link NHS-PEG₄-바이오틴, 부품 번호 21363, Thermo, 무수 DMSO 중에 제조된 100 mM 용액)을 1:100 희석함으로써 태그 시약을 제조하고 로보트 덱 상의 홈통(trough)에 부었다. 100 μL의 태그 시약을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 5분 동안 1200 rpm에서 진탕하며 인큐베이션하여 비드 표면 상에 포획된 단백질을 바이오틴화하였다. 175 μL의 Quench 완충액(검정 완충액 중 20 mM 글리신)의 각각의 웰로의 첨가에 의해 바이오틴화 반응을 켄칭하였다. 플레이트를 3분 동안 정적으로 인큐베이션한 후 175 μL의 검정 완충액으로 4회 세척하고, 상술된 바와 동일한 조건 하에 세척을 수행하였다.

광-절단 및 역학적 챌린지.

플레이트의 마지막 세척 후, 90 μL의 광절단 완충액(검정 완충액 중 2 μM의 올리고뉴클레오티드 경쟁인자; 경쟁인자는 뉴클레오티드 서열 5'-(AC-Bn-Bn)₇-AC-3'을 가지며, 식 중 Bn은 5-위치 벤질-치환 데옥시유리딘 잔기를 나타냄)을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 Fluent 덱 상의 광절단 서브스테이션으로 이동시켰다. 서브스테이션은 BlackRay 광원(UVP XX-시리즈 벤치 램프, 365 nm) 및 3개의 Bioshake 3000-T 진탕기(Q Instruments)로 구성된다. 플레이트를 1000 rpm에서 진탕하며 20분 동안 조사하였다.

캐치-2 비드 포획.

광절단 공정의 종료 시, 완충액을 자기 분리를 통해 캐치-2 플레이트로부터 제거하고, 플레이트를 100 μL의 검정 완충액으로 1회 세척하였다. 압타머-단백질 복합체를 함유하는 광-절단 용출물을 희석 3 플레이트로 시작해서 각각의 캐치-0 플레이트로부터 제거하였다. 먼저 모든 90 μL의 용액을 상승된 자석을 갖는 진탕기 상에 배치된 캐치-1 용출물 플레이트로 전달하여 흡입되었을 수 있는 임의의 스트렙타비딘 자기 세파로스 비드를 포획하였다. 그 후, 용액을 캐치-2 플레이트로 전달하고 플레이트를 25℃에서 1400 rpm으로 진탕하며 3분 동안 인큐베이션하였다. 3분 동안 인큐베이션 후, 자기 비드를 90초 동안 분리하고, 용액을 플레이트로부터 제거하고, 광절단된 Dil2 플레이트 용액을 플레이트에 첨가하였다. 동일한 공정 후, Dil1 플레이트로부터의 용액을 첨가하고 3분 동안 인큐베이션하였다. 3분 인큐베이션의 종료 시, 6 μL의 MB 블록 완충액을 자기 비드 현탁액에 첨가하고 비드를 25℃에서 1200 rpm으로 진탕하며 2분 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션 후, 플레이트를 38℃ 온도로 사전설정된 상이한 진탕기로 전달하였다. 용액을 제거하기 전 2분 동안 비드를 분리하였다. 이어서, 캐치-2 플레이트를 175 μL의 MB 세척 완충액(검정 완충액 중 20% 글리세롤)으로 4회 세척하고, 1분 동안 1200 rpm으로 비드를 진탕하고 비드가 3.5분 동안 자석 상에서 분할하도록 각각의 세척 사이클을 프로그래밍하였다. 최종 비드 분리 단계 동안, 진탕기 온도는 25℃로 설정하였다. 이어서 비드를 175 μL의 검정 완충액으로 1회 세척하였다. 상기 세척 단계에 있어서, 비드를 1분 동안 1200 rpm에서 진탕한 후, 자석 상에서 1분 동안 분리되도록 두었다. 세척 단계 후, 압타머를 용출 완충액(1.8 M NaClO₄, 40 mM PIPES, pH 6.8, 1 mM EDTA, 0.05% Triton X-100)을 사용하여 정제된 압타머-단백질 복합체로부터 용출하였다. 1250 rpm에서 비드를 진탕하며 25℃에서 10분 동안 75 μL의 용출 완충액을 사용하여 용출을 수행하였다. 70 μL의 용출물을 아카이브 플레이트로 전달하고 자석 상에서 분리하여 흡입되었을 수 있는 임의의 자기 비드를 분할하였다. 10 μL의 용출된 물질을 검은색 절반-영역 플레이트로 전달하고, 검정 완충액 중 1:5로 희석하고, 내부 검정 QC로서 모니터링되는 시아닌 3 형광 신호를 측정하기 위해 사용하였다. 20 μL의 용출된 물질을 5 μL의 혼성화 차단 용액(Oligo aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트, 대부피, Agilent Technologies 5188-5380, Agilent 어레이 상의 코너 마커 탐침과 상보적인 시아닌 3-표지 DNA 서열의 스파이크를 함유함)을 함유하는 플레이트로 전달하였다. 상기 플레이트를 로보트 덱으로부터 제거하고 혼성화를 위해 추가 가공하였다(아래 참고). 잔여 용출 용액을 갖는 아카이브 플레이트를 알루미늄 호일을 사용하여 열-밀봉하고 -20℃에 보관하였다.

혼성화.

25 μL의 2x Agilent 혼성화 완충액(Oligo aCGH/ChIP-온-칩 혼성화 키트, Agilent Technologies, 부품 번호 5188-5380)을 용출된 샘플 및 차단 완충액을 함유하는 플레이트의 각각의 웰에 수동 피펫팅하였다. 40 μL의 상기 용액을 혼성화 개스킷 슬라이드(혼성화 개스킷 슬라이드 - 슬라이드 포맷 당 8개 마이크로어레이, Agilent Technologies)의 각각의 "웰" 내로 수동 피펫팅하였다. 각각의 압타머와 상보적인 어레이 당 10개의 탐침을 함유하는 맞춤 SurePrint G3 8x60k Agilent 마이크로어레이 슬라이드를 제조업체의 프로토콜에 따라 개스킷 슬라이드 상에 배치하였다. 각각의 어셈블리(혼성화 챔버 키트 - SureHyb 구현, Agilent Technologies)를 단단히 조이고 20 rpm에서 회전하며 55℃에서 19시간 동안 혼성화 오븐 내로 로딩하였다.

혼성화-후 세척.

Little Dipper 프로세서(모델 650C, Scigene)를 사용하여 슬라이드 세척을 수행하였다. 대략 700 mL의 세척 완충액 1(Oligo aCGH/ChIP-온-칩 세척 완충액 1, Agilent Technologies)을 큰 유리 염색 디쉬 내로 붓고 개스킷 슬라이드로부터 마이크로어레이 슬라이드를 분리하기 위해 사용하였다. 일단 디스어셈블리되면, 슬라이드를 Little Dipper 상에서 세척 완충액 1을 함유하는 조 내의 슬라이드 랙 내로 빠르게 전달하였다. 슬라이드를 자기 교반 막대를 통해 혼합하며 세척 완충액 1 중에 5분 동안 세척하였다. 이어서 슬라이드 랙을 37℃ 세척 완충액 2(Oligo aCGH/ChIP-온칩 세척 완충액 2, Agilent Technologies)를 갖는 조로 전달하고 교반하며 5분 동안 인큐베이션하도록 두었다. 슬라이드 랙을 두 번째 조로부터 천천히 제거한 후 아세토니트릴 함유 조로 옮기고 교반하며 5분 동안 인큐베이션하였다.

마이크로어레이 이미지화.

마이크로어레이 슬라이드를 100% PMT 설정 및 20-비트 옵션을 구현하여 3 μm 해상도로 시아닌 3-채널에서 마이크로어레이 스캐너(Agilent G4900DA 마이크로어레이 스캐너 시스템, Agilent Technologies)로 이미지화하였다. 생성 tiff 이미지를 GE1_1200_Jun14 프로토콜로 Agilent 특징부 추출 소프트웨어(버전 10.7.3.1 이상)를 사용하여 가공하였다.

실시예 2: 멀티플렉스 검정에서의 비특이적 표적 분자 포획

본 실시예는 멀티-캐치 멀티플렉스 검정에서 비특이적 표적 분자 포획 및 캐리오버(carry-over)의 설명을 제공한다.

일반적으로, 여러 검정 포맷의 민감도 및 특이성은 원치 않는 검출 가능한 신호(위양성 또는 검정 "노이즈")를 생성하는, 검출 방법이 검정 동안의 비특이적 연합으로 인해 발생하는 신호로부터 실제 신호를 분해하는 능력에 의해 영향을 받는다. 이는 특히 멀티플렉스화 검정에 있어서 해당된다. 비특이적 결합의 주요 원천 중 하나는 예상치 못한 포획-시약-표적 분자 상호작용의 함수인 것으로 관찰되었다. 본 실시예는 비특이적 포획-시약-표적 분자 상호작용이 검정에서 어떻게 원치않는 신호 또는 "노이즈"를 생성할 수 있는지를 설명한다.

본 실시예에 있어서, 2-캐치 시스템 및 평가 샘플의 다중 희석을 포함하는 압타머 기반 멀티플렉스 검정을 사용하여, 검정의 동적 영역 밖에 속하는 검정 신호를 생성하며, 검정의 민감도 및 특이성을 감소시키는 예상치 못한 압타머-표적 분자 상호작용으로 인한 비특이적 표적 분자(예컨대, 단백질) 포획 및 캐리오버를 모델링하였다.

간략하게, 제1 고체 지지체(예컨대, 시약 상의 바이오틴을 사용하는 스트렙타비딘-비드)에 고정화된 압타머 시약을, 생물학적　샘플(예컨대, 혈청 또는 혈장)과 인큐베이션하고, 생물학적 샘플 중 단백질이 이의 인지체 압타머("캐치-1"로 명명됨)에 결합하도록 둠으로써 압타머 기반 검정을 수행하였다. 이어서 태그를 단백질에 부착한 후, 압타머-단백질 표적 복합체를 제1 고체 지지체로부터 방출하고, 제2 고체 지지체에 노출시킴으로써, 압타머-표적 단백질 복합체를 단백질 상의 태그를 통해 고정화하였다("캐치-2"로 명명됨). 이어서 복합체를 세척하여 임의의 결합되지 않은 압타머 및 단백질을 캐치-2로부터 제거하였다. 세척 후, 압타머를 제2 고체 지지체 상의 압타머-표적 단백질 복합체로부터 방출하고 검출 목적을 위해 포획하였다(예컨대, 혼성화 어레이). 압타머의 정량을 생물학적 샘플에서 단백질의 양에 대한 대리물로 사용하였다. 압타머 기반 검정은 단일 압타머 시약 또는 복수의 압타머 시약(또는 멀티플렉스 포맷)과 함께 사용할 수 있다.

본 실시예에 있어서, 혈장 샘플의 3개의 상이한 희석 그룹을 제조하였다(혈청으로 또한 동일한 "단백질 캐리오버 연구를 거쳤고 결과는 혈청의 결과와 병행됨; 데이터는 나타내지 않음). 도 6은 상대적으로 고, 중 및 저 존재비의 단백질을 각각 측정한, 0.005% 희석(DIL1), 0.5% 희석(DIL2) 및 20% 희석(DIL3)을 제조한, 3개의 상이한 혈장 희석 그룹의 개요를 제공한다. 또한, 각각의 DIL1, DIL2 및 DIL3에 대한 압타머 세트는 각각 A1, A2 및 A3이었다. 압타머의 A3 그룹은 4,271개의 상이한 압타머(또는 압타머 총 수의 약 81%)를 가졌고, A2 그룹은 828개의 상이한 압타머(또는 압타머 총 수의 약 16%)를 가졌고 A1 그룹은 총 5,272개의 상이한 압타머에 있어서 173개의 상이한 압타머(압타머 총 수의 약 3%)를 갖는다.

5개의 상이한 조건을 평가하여 멀티플렉스 검정에 단백질 캐리오버 효과가 존재하는지를 결정하였다. 이들 조건을 아래의 표 2에 나타낸다.

조건	DIL1(0.005%) 또는 블랭크1	DIL2(0.5%) 또는 블랭크2	DIL3(20%) 또는 블랭크3
1	혈장	혈장	혈장
2	혈장	블랭크	블랭크
3	블랭크	혈장	블랭크
4	블랭크	블랭크	혈장
5	블랭크	블랭크	블랭크

각각의 조건으로 상술된 바와 같은 2-캐치 시스템을 이용하여 압타머 기반 멀티플렉스 검정을 거쳤다. 조건은 생물학적 샘플(예컨대, 혈장)이 존재하는지 아니면 생물학적 샘플을 갖지 않고 이에 따라 단백질을 갖지 않는 검정 완충액인 블랭크인지 여부에 따라 상이하다. 각각의 희석 그룹을, 희석된 생물학적 샘플이 존재하는지 또는 블랭크인지와 무관하게, 그 각각의 압타머 그룹(A1와 DIL1 또는 블랭크1; A2와 DIL2 또는 블랭크2 및 A3과 DIL3 또는 블랭크3)과 인큐베이션하였다. 각각의 경우, 각각의 압타머 그룹으로부터의 압타머를 이의 각각의 희석 또는 블랭크(캐치-1)와 인큐베이션하기 전에 제1 고체 지지체 상에서 사전-고정화하였다. 이어서 인큐베이션 후, 태그를 단백질(존재하는 경우)에 부착하고, 이어서 압타머-단백질 표적 복합체(존재하는 경우)를 3개의 별도 희석 및/또는 블랭크 중 제1 고체 지지체로부터 방출하고 동시에 단일 혼합물로 조합한 후, 제2 고체 지지체에 노출시키고, 이에 의해 압타머-표적 단백질 복합체(존재하는 경우)를 단백질("캐치-2"로 명명됨) 상에서 태그를 통해 고정화하였다. 이어서 복합체를 세척하여 임의의 결합되지 않은 압타머 및 단백질을 캐치-2로부터 제거하였다. 세척 후, 압타머를 제2 고체 지지체 상에서 압타머-표적 단백질 복합체로부터 방출하고 혼성화 어레이를 통해 검출 목적을 위해 포획하였다. 상대 형광 단위(RFU)를 통한 압타머의 정량을 생물학적 샘플에서 단백질의 양에 대한 대리물로 사용하였다.

조건 1은 3개 희석 그룹(0.005% 희석의 DIL1; 0.5% 희석의 DIL2 및 20% 희석의 DIL3)으로 희석된 혈장이었고, 이를 이의 각각의 압타머 그룹(A1, A2 및 A3)과 인큐베이션하였다. 조건 2는 DIL1 혈장 희석(0.005%) 및 각각 DIL2 및 DIL3 대신 블랭크1 및 블랭크2를 가졌고, 이를 이의 각각의 압타머 그룹(A1, A2 및 A3)과 인큐베이션하였다. 조건 3은 DIL2 혈장 희석(0.5%) 및 각각 DIL1 및 DIL3 대신 블랭크1 및 블랭크3을 가졌고, 이를 이의 각각의 압타머 그룹(A1, A2 및 A3)과 인큐베이션하였다. 조건 4는 DIL3 혈장 희석(20%) 및 각각 DIL1 및 DIL2 대신 블랭크1 및 블랭크2를 가졌고, 이를 이의 각각의 압타머 그룹(A1, A2 및 A3)과 인큐베이션하였다. 마지막으로, 조건 5는 혈장 희석을 갖지 않았고 전체 블랭크(블랭크1, 블랭크2 및 블랭크3)를 가졌으며, 이를 이의 각각의 압타머 그룹(A1, A2 및 A3)과 인큐베이션하였다. 각각의 조건으로 실시예 1에 기재된 캐치-1 및 캐치-2 검정을 거쳤고, 이에 의해 희석 및/또는 블랭크를 캐치-1로부터 방출된 후 모두 함께 조합하여 검정의 캐치-2 부분으로 이동시켰다.

임의의 단백질 캐리오버를 정량하기 위해, 조건 1(즉, 전체 3개 희석 그룹 DIL1, DIL2 및 DIL3)에 대한 압타머 신호 대 조건 2, 3 및 4(블랭크와 함께 하나의 희석 그룹만 존재함) 각각에 대한 압타머 신호의 비의 누적 분포 함수(CDF)를 도시하였다(도 10 참고). 압타머 신호의 비를 혼성화 어레이로부터 유도된 상대 형광 단위(RFU)로 나타낸다. 도 10은 혈장 샘플의 20% 희석(DIL3)만 존재하는 조건 4에 있어서, 조건 1에서의 압타머 대 조건 4에서의 동일한 압타머에 대한 RFU 값의 비가 약 1임을 나타낸다. 대조적으로, 혈장 샘플의 0.5% 희석(DIL2)만 존재하는 조건 3에 있어서, 조건 1에서의 압타머 대 조건 3에서의 동일한 압타머에 대한 RFU 값의 비는 약 1 내지 6으로, 조건 1의 압타머의 약 45% 이상은 조건 3에 있어서의 동일한 압타머보다 약 2 내지 6배 더 큰 신호를 낸다. 조건 1 대비 조건 3(예컨대 단백질 ASM3A에 결합하는 압타머가 압타머의 A2 그룹의 일부이며, 이를 DIL2 희석과 인큐베이션함) 하의 단일 압타머의 신호전달 확인에서, ASM3A 압타머는 조건 3 대비 조건 1에서 5배 더 높다. 혈장 샘플의 0.005% 희석(DIL1)만 존재하는 조건 2에 있어서, 조건 1에서의 압타머 대 조건 2에서의 동일한 압타머에 대한 RFU 값의 비가 또한 약 1 내지 6배이며, 조건 1의 압타머의 약 20% 이상은 조건 2에 있어서의 동일한 압타머보다 약 2 내지 6배 더 큰 신호를 낸다. A1 압타머 그룹의 일부이며 DIL1 희석과 인큐베이션되는, ApoE 단백질에 결합하는 압타머의 비교에서, 상기 압타머는 조건 2 대비 조건 1에서 200배 초과의 RFU 값, 조건 4 대비 조건 1에서 80배 초과의 RFU 값, 및 조건 3 대비 조건 1에서 600배 초과의 RFU 값을 가졌다.

이들 데이터는 0.5% 혈장 희석 샘플(DIL2) 및 0.005% 혈장 희석 샘플(DIL1)에 있어서, 모든 3개 희석 샘플이 검정의 캐치-2상에서 동시에 조합되는 경우, 검정에서 검출되는 신호가 20% 혈장 희석 샘플(DIL3)로부터의 단백질 캐리오버로 생성되었음을 나타낸다. 상기 단백질 캐리오버는 검정의 캐치-1상 동안, 20% 혈장 희석 샘플(DIL3)에서의 단백질이 A3 압타머 그룹에서 압타머에 비특이적으로 결합되고, 예를 들어, 제1 고체 지지체(캐치-1)로부터의 광절단에 의해, 용액 내로 방출되고 모든 3개 희석 그룹 및 압타머 그룹이 동시에 조합되는 검정의 캐치-2상으로 전달되기 때문일 수 있다. 검정의 상기 상에서, 경쟁인자가 비특이적 압타머-단백질 상호작용을 방지하기 위해 첨가되는 경우, 20% 혈장 희석으로부터 비특이적으로 캐리오버된 단백질은 A2 압타머 및 A1 압타머 그룹으로부터의 결합되지 않은 압타머와 상호작용하도록 허용되고, 이후 이의 인지체 압타머에 직면하여 안정한 복합체를 형성한다. 이어서 이들 단백질 캐리오버:압타머 복합체가 손상되고 압타머는 양성 신호로서 혼성화 어레이 상에서 검출되고, 이는 기술적으로 위양성 신호 또는 "노이즈"이다. 이들 동일한 데이터는 생물학적 샘플로서 혈청을 이용하여 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).

이들 데이터는 멀티플렉스 검정이 검정의 동적 범위 내에 유지되고, 검정의 민감도 및 특이성이 최대화됨을 확실히 하기 위해 단백질 캐리오버 경감 전략이 요구된다는 것을 시사한다.

실시예 3: 멀티플렉스 검정에서 비특이적 표적 분자 포획을 감소시키기 위한 경감 전략

본 실시예는 다중-캐치 멀티플렉스 검정에서 비특이적 표적 분자 포획 및 캐리오버를 감소시키기 위한 예시적 경감 전략의 설명을 제공한다.

실시예 1은 다중-캐치 멀티플렉스 검정에서의 양성 신호가 어떻게 검정 및 그 원천에서의 비특이적 표적 분자 포획 및 캐리오버로부터 유도될 수 있는지에 대한 설명을 제공하였다. 상기 다중-캐치 멀티플렉스 검정에서 원치않는 단백질 캐리오버를 경감시키기 위해, 각각의 압타머 그룹과 함께, 생물학적 샘플의 희석 샘플의 순차적 방출 및 캐치를 검정의 캐치-1상으로부터 검정의 캐치-2상으로의 전달 과정에서 수행하였다. 2 희석 및 3 희석 순차적 캐치 포맷의 일반적 개요를 각각 도 9 및 7에 나타낸다.

본 실시예에 있어서, 동일한 3개의 상이한 혈장 희석 그룹(DIL3, DIL2 및 DIL1)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 동일한 압타머 그룹(A1, A2 및 A3)과 함께 제조하였다(도 8 참고). 또한, 실시예 1에서 표 2에 기재된 바와 동일한 조건을 사용하였다. 실시예 1에 따라, 검정의 캐치-1상에 대해 기재된 동일한 접근을 따랐다; 그러나, 본 실시예에 있어서, 상이한 희석 그룹 또는 블랭크를 개별 방출하고 실시예 1에 따른 동시 대신 순차적으로 검정의 캐치-2상으로 전달하였다(도 8 참고). 조건 1에 대해 보다 구체적으로, 압타머 그룹 A1과 인큐베이션한 DIL1 그룹(DIL1-A1 그룹)을 캐치-1로부터 방출하고, 제2 고체 지지체(캐치-2) 상에 고정화하고, 세척하였다. 다음으로, 압타머 그룹 A2와 인큐베이션한 DIL2 그룹을 캐치-1로부터 방출하고, 이미 캐치-2 상에 고정화된 DIL1-A1 그룹과 조합한 후, 제2 고체 지지체(캐치-2) 상에 고정화하였다. 그리고, 압타머 그룹 A3과 인큐베이션한 DIL3 그룹을 캐치-1로부터 방출하고, 제2 고체 지지체(캐치-1) 상에 고정화하고, 세척하였다. 표 2에 개략된 바와 같이, 희석된 생물학적 샘플 대신 블랭크(블랭크 1, 2 및/또는 3)를 포함한 잔여 조건(조건 2, 3, 4 및 5)으로 동일한 순차적 캐치 접근을 거쳤다.

임의의 단백질 캐리오버를 정량하기 위해, 조건 1(즉, 전체 3개 희석 그룹 DIL1, DIL2 및 DIL3)에 대한 압타머 신호 대 조건 2, 3 및 4(블랭크와 함께 하나의 희석 그룹만 존재하였음) 각각에 대한 압타머 신호의 비의 누적 분포 함수(CDF)를 도시하였다(도 11 참고). 압타머 신호의 비를 혼성화 어레이로부터 유도된 상대 형광 단위(RFU)로 나타낸다. 멀티플렉스 검정의 비순차적 버전과 유사하게, 도 11은 혈장 샘플의 20% 희석(DIL3)만 존재하는 조건 4에 있어서, 조건 1에서의 압타머 대 조건 4에서의 동일한 압타머에 대한 RFU 값의 비가 약 1임을 나타낸다. 혈장 샘플의 0.5% 희석(DIL2)만 존재하는 조건 3에 있어서, 조건 1에서의 압타머 대 조건 3에서의 동일한 압타머에 대한 RFU 값의 비는 약 1 내지 6이다; 그러나, 조건 1의 압타머의 약 5% 미만만 조건 3에 대한 동일한 압타머에 비해 약 2 내지 6배 더 큰 신호를 내었다(검정의 비순차적 캐치-2 버전에서의 45% 대비). 또한, 혈장 샘플의 0.005% 희석(DIL1)만 존재하는 조건 2에 있어서, 조건 1에서의 압타머 대 조건 2에서의 동일한 압타머에 대한 RFU 값의 비가 또한 약 1 내지 6배이다; 그러나, 조건 1의 압타머의 약 10% 미만만 조건 2에 대한 동일한 압타머에 비해 약 2 내지 6배 더 큰 신호를 내었다(검정의 비순차적 캐치-2 버전에서의 20% 대비). 이들 동일한 데이터가 생물학적 샘플로서 혈청을 이용하여 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음).

이들 데이터는 그 각각의 인큐베이션된 포획 시약을 갖는 2개 이상의 희석된 생물학적 샘플 세트를 검정의 제1 캐치상으로부터 검정의 제2 캐치상으로 순차적으로 전달함으로써, 2개 이상의 샘플 희석 세트를 갖는 2-캐치 멀티플렉스 검정에서 단백질 캐리오버가 경감될 수 있음을 시사한다. 상기 순차적 전달 접근은 멀티플렉스 검정이 검정의 동적 범위 내에 유지되며, 검정의 민감도 및 특이성이 최대화되고, 검정에서 잠재적인 위양성 신호 또는 "노이즈"를 감소시킴을 확실히 한다.

실시예 4: 멀티플렉스 검정에서 가장 높은 중앙값 신호 대 배경 비를 갖는 선형 범위에서 분석물질의 수를 최대화하기 위한 생물학적 샘플에 대한 희석 선택

본 실시예는 멀티플렉스 검정에서 가장 큰 중앙값 신호 대 배경 신호 비를 여전히 유지하면서 선형 범위에서 분석물질의 수를 최대화하는 생물학적 샘플의 희석 수준을 선택하기 위한 설명을 제공한다.

여러 표적 단백질이 여러 포획 시약에 의해 측정되는 멀티플렉스 검정 포맷에서, 상이한 표적 단백질 존재비의 자연적 변이는 특정한 포획 시약이 특정한 표적 단백질을 측정하는 능력을 제한할 수 있다(예컨대, 고 존재비의 표적 단백질은 검정을 포화시키고 검정이 저 존재비의 표적 단백질을 측정하는 능력을 방지하거나 감소시킬 수 있음). 생물학적 샘플에서 상기 변이를 해결하기 위해, 압타머 시약을 생물학적 샘플에서 이의 각각의 단백질 표적의 존재비에 기반하여, 적어도 2개의 상이한 그룹, 바람직하게는 3개의 상이한 그룹으로 구분한다. 생물학적 샘플을 적어도 2개, 바람직하게는 3개의, 상이한 희석 그룹으로 희석하여 이의 포획 시약에 의해 검출될 단백질 표적의 상대 농도에 기반한 별도 평가 샘플을 생성한다. 따라서, 생물학적 샘플을 고, 중 및 저 존재비의 표적 단백질 희석 그룹으로 희석하고, 가장 낮은 존재비의 단백질 표적은 가장 적게 희석된 그룹에서 측정하고, 가장 존재비가 큰 단백질 표적은 가장 많이 희석된 그룹에서 측정한다. 압타머 기반 다중-캐치 멀티플렉스 검정에 대해 역사적으로, 생물학적 샘플에 대한 3개의 희석 그룹은 40% 희석, 1% 희석 및 0.005% 희석이었다.

본 실시예에 있어서, 40% 희석 그룹을 재고하여 상이한 희석이 다중-캐치 멀티플렉스 검정에 더 큰 이익을 제공할(검정의 선형 범위에서 분석물질의 수를 최대화하고/하거나 중앙값 신호 대 배경 신호 비를 개선할) 것인지를 결정하였다. 상기 희석 그룹은 완충액 단독에 비해 일부 비특이적 결합, 신호 비선형성 및 음성 대조군으로부터 더 큰 신호를 나타낸다.

간략하게, 3명의 상이한 대상체로부터의 혈장으로부터 몇몇 희석 그룹(40%, 20%, 10% 및 5% 희석 그룹)을 제조하였다. 903개의 압타머 풀을 모든 3명의 대상체로부터의 상이한 희석 그룹과 인큐베이션하고 본원에서 기재되는 2-캐치 멀티플렉스 검정에서 사용하였다.

혼성화 어레이에서 압타머에 의해 측정되는 각각의 희석(40%, 20%, 10% 및 5%)에 대한 선형 범위에서의 분석물질의 수를 결정하였다. 40% 희석에 있어서, 246개 분석물질이 선형 범위에 있었고, 20% 희석에 있어서, 388개 분석물질이 선형 범위에 있었고, 10% 희석에 있어서, 517개 분석물질이 선형 범위에 있었고, 5% 희석에 있어서, 585개 분석물질이 선형 범위에 있었다. 903개 중 나머지 259개는 선형 범위를 갖지 않았다. 따라서, 이들 데이터는 샘플의 희석이 증가함에 따라 선형 범위에서의 분석물질의 수가 증가함을 시사한다(즉, 샘플의 희석이 클수록 선형 범위에서 더 많은 수의 분석물질을 제공함).

각각의 희석(40%, 20%, 10% 및 5%)은 상이한 중앙값 신호 대 배경 신호 비(또는 중앙값 S/B)를 나타내었다. 40% 희석에 있어서, 중앙값 S/B는 10이었고, 20% 희석에 있어서, 중앙값 S/B는 7.8이었고, 10% 희석에 있어서, 중앙값 S/B는 5.4였고, 5% 희석에 있어서, 중앙값 S/B는 3.7이었다. 따라서, 이들 데이터는 샘플이 추가 희석됨에 따라 중앙값 S/B가 감소함을 시사한다.

상기 데이터는 선형 범위에서의 분석물질의 수 및 샘플 희석 정도에 관련된 중앙값 S/B 간 긴장관계가 존재함을 시사한다. 더 작은 희석을 갖는 더 큰 중앙값 S/B와 함께 더 큰 희석을 갖는 선형 범위에서의 분석물질의 수에서 관찰된 개선의 균형수립에서, 2-캐치 멀티플렉스 압타머 검정을 위해 생물학적 샘플에 대한 "최적" 희석을 위해 "중간 단계"를 선택하였다. 도 12는 각각 40%, 20%, 10% 및 5% 희석에 대한 중앙값 S/B와 함께 선형 범위에서의 분석물질의 수의 그래픽 표시이다. 도 12에 따르면, 생물학적 샘플의 20% 희석에서, 가장 큰 중앙값 S/B를 갖는 선형 범위에서의 분석물질의 최대 수가 관찰된다(2개 라인에 교차하는 경우). 따라서, 다중-캐치 멀티플렉스 압타머 검정에서 사용되는 3개 희석 중, "저 존재비의" 단백질을 표적화하는 압타머는 40% 희석보다 생물학적 샘플의 20% 희석과 인큐베이션하는 데 더 적합하다.

요약하면, 본원에서의 실시예 섹션에 기재된 멀티플렉스 검정은 20%, 0.5% 및 0.005% 샘플 희석 포맷을 사용한다. 또한, 혈청에서 더 높은 경쟁인자 분자 농도는 동일한 개체로부터의 혈청 및 혈장에서의 측정 간 더 우수한 상관성을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). 또한, 더 낮은 샘플 농도(예컨대 40%에서 20%로)와 더 높은 경쟁인자 분자 농도(20 μM 대비 30 μM 또는 60 μM)는 증가된 스파이크 및 회수, 선형 범위에서의 분석물질의 수 증가 및 더 적은 비특이적 결합을 유도하였다. 샘플 희석제 중 경쟁인자 분자(Z-블록; 서열 ((A-C-BndU-BndU)₇AC)을 갖는 올리고뉴클레오티드의 농도는 혈청에 대해 60 μM이었고 혈장 샘플에 대해 30 μM이었다. 이전 검정 포맷은 혈청 및 혈장에 대해 20 μM Z-블록을 사용하였다. 혈청 중 더 높은 경쟁인자 분자 농도는 동일한 개체로부터의 혈청 및 혈장에서의 측정 간 더 우수한 상관성을 유도하였다(데이터는 나타내지 않음). 감소된 비특이적 결합은 광절단 후 복합체 형성을 위해 이용 가능한 더 적은 양의 단백질을 생성할 것이다.

Claims

방법으로서,
a) 제1 희석 샘플을 제1 압타머와 접촉시키는 단계로서, 표적 분자가 제1 희석 샘플에 존재하는 경우 제1 압타머와 그 표적 분자의 상호작용에 의해 제1 압타머 친화도 복합체가 형성되는, 단계;
b) 제2 희석 샘플을 제2 압타머와 접촉시키는 단계로서, 표적 분자가 제2 희석 샘플에 존재하는 경우 제2 압타머와 그 표적 분자의 상호작용에 의해 제2 압타머 친화도 복합체가 형성되는, 단계;
c) 제1 및 제2 희석 샘플을 별도로 인큐베이션하여 압타머 친화도 복합체 형성을 허용하는 단계;
d) 제1 압타머 친화도 복합체를 갖는 제1 희석 샘플을 제1 혼합물로 전달하는 단계로서, 제1 압타머 친화도 복합체가 제1 혼합물의 고체 지지체 상에 포획되는, 단계;
e) 단계 d) 후, 제2 희석 샘플을 제1 혼합물로 전달하여 제2 혼합물을 형성하는 단계로서, 제2 희석의 제2 압타머 친화도 복합체가 제2 혼합물에서 고체 지지체 상에 포획되는, 단계;
f) 제1 및 제2 압타머 친화도 복합체의 제1 압타머 및 제2 압타머의 존재 또는 수준, 또는 하나 이상의 제1 및 제2 압타머 친화도 복합체의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계;
를 포함하되, 상기 제1 희석 및 상기 제2 희석은 동일한 평가 샘플의 상이한 희석인 방법.
제1항에 있어서, 상기 평가 샘플이 혈장, 혈청, 소변, 전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 백혈구연층, 가래, 누액, 점액, 비강 세척액, 비강 흡입물, 정액, 타액, 복강 세척액, 복수, 낭액, 수막액, 양수, 샘액, 림프액, 유두 흡입물, 기관지 흡입물, 기관지 솔질물, 활액, 관절 흡입물, 기관 분비물, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 압타머-표적 분자 친화도 복합체가 비공유 복합체인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 박테리아, 대사물질, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포 및 조직으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며, 상기 제2 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 상기 제2 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 상기 제2 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제1항에 있어서, 상기 해리된 제1 및 제2 포획 시약의 존재의 검출 또는 수준의 결정이 PCR, 질량 분광측정, 핵산 서열분석, 차세대 서열분석(NGS) 또는 혼성화에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 압타머 및/또는 상기 제2 압타머가, 독립적으로, 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘이 피리미딘의 5-위치에서의 링커 및 링커에 부착된 모이어티를 포함하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 링커가 아미드 링커, 카보닐 링커, 프로피닐 링커, 알킨 링커, 에스테르 링커, 우레아 링커, 카바메이트 링커, 구아니딘 링커, 아미딘 링커, 설폭시드 링커, 및 설폰 링커로부터 선택되는 방법.
제13항에 있어서, 상기 모이어티가 소수성 모이어티인 방법.
제15항에 있어서, 상기 모이어티가 도 1의 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV 및 XVI 그룹 모이어티로부터 선택되는 방법.
제15항에 있어서, 상기 모이어티가 나프틸 모이어티, 벤질 모이어티, 플루오로벤질 모이어티, 티로실 모이어티, 인돌 모이어티, 모르폴리노 모이어티, 이소부틸 모이어티, 3,4-메틸렌디옥시 벤질 모이어티, 벤조티오페닐 모이어티, 및 벤조푸라닐 모이어티로부터 선택되는 방법.
제12항에 있어서, 상기 5-위치 변형 피리미딘의 피리미딘이 유리딘, 시티딘 또는 티미딘인 방법.
제1항에 있어서, 제3 희석 샘플을 제3 압타머와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 표적 분자가 제3 희석 샘플에 존재하는 경우 제3 압타머와 그 표적 분자의 상호작용에 의해 제3 압타머 친화도 복합체가 형성되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 제3 희석 샘플이 상기 제1 및 제2 희석 샘플과 별도로 인큐베이션되어 제3 압타머와 그 표적 분자의 압타머 친화도 복합체 형성을 허용하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 제3 희석 샘플을 상기 제2 혼합물로 전달하여 제3 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제3 희석의 제3 압타머 친화도 복합체가 상기 제3 혼합물에서 고체 지지체 상에 포획되는 방법.
제21항에 있어서, 상기 제3 압타머 친화도 복합체의 제3 압타머의 존재 또는 수준, 또는 상기 제3 압타머 친화도 복합체의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 제3 희석이 상기 동일한 평가 샘플의 제1 희석 및 제2 희석과 상이한 희석인 방법.
제19항에 있어서, 상기 제3 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 약 20%; 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%), 0.1% 내지 0.8%, 0.2% 내지 0.75%, 약 0.5%; 및 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%), 또는 0.002% 내지 0.008%, 0.003% 내지 0.007%, 약 0.005%로부터 선택되는 평가 샘플의 희석인 방법.
제19항에 있어서, 상기 제3 압타머가 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘이 피리미딘의 5-위치에서의 링커 및 링커에 부착된 모이어티를 포함하는 방법.
제26항에 있어서, 상기 링커가 아미드 링커, 카보닐 링커, 프로피닐 링커, 알킨 링커, 에스테르 링커, 우레아 링커, 카바메이트 링커, 구아니딘 링커, 아미딘 링커, 설폭시드 링커, 및 설폰 링커로부터 선택되는 방법.
제26항에 있어서, 상기 모이어티가 소수성 모이어티인 방법.
제28항에 있어서, 상기 모이어티가 도 1의 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV 및 XVI 그룹 모이어티로부터 선택되는 방법.
제28항에 있어서, 상기 모이어티가 나프틸 모이어티, 벤질 모이어티, 플루오로벤질 모이어티, 티로실 모이어티, 인돌 모이어티, 모르폴리노 모이어티, 이소부틸 모이어티, 3,4-메틸렌디옥시 벤질 모이어티, 벤조티오페닐 모이어티, 및 벤조푸라닐 모이어티로부터 선택되는 방법.
제25항에 있어서, 상기 5-위치 변형 피리미딘의 피리미딘이 유리딘, 시티딘 또는 티미딘인 방법.
방법으로서,
a) 제1 포획 시약을 제1 희석과 접촉시켜 제1 혼합물을 형성하고 제2 포획 시약을 제2 희석과 접촉시켜 제2 혼합물을 형성하는 단계로서, 각각의 제1 및 제2 포획 시약이 각각 고체 지지체 상에 고정화되며, 각각의 제1 및 제2 포획 시약이 상이한 표적 분자에 대한 친화도를 가지는, 단계;
b) 제1 혼합물 및 제2 혼합물을 별도로 인큐베이션하는 단계로서, 제1 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제1 혼합물에 존재하는 경우 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제1 혼합물에 형성되고, 제2 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제2 혼합물에 존재하는 경우 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제2 혼합물에 형성되는, 단계;
c) (i) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체 및 (ii) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 선택되는 순서로 친화도 복합체를 순차적으로 방출하고 제4 혼합물에서 조합하는 단계;
d) 제1 태그를 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자에 부착하는 단계;
e) 태그화된 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 고체 지지체와 접촉시켜 태그가 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 고체 지지체에 고정시키도록 하는 단계;
f) 포획 시약을 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 해리하는 단계;
g) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계;
를 포함하되, 상기 제1 희석 및 상기 제2 희석이 평가 샘플의 상이한 희석인 방법.
제32항에 있어서, 상기 평가 샘플이 혈장, 혈청, 소변, 전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 백혈구연층, 가래, 누액, 점액, 비강 세척액, 비강 흡입물, 정액, 타액, 복강 세척액, 복수, 낭액, 수막액, 양수, 샘액, 림프액, 유두 흡입물, 기관지 흡입물, 기관지 솔질물, 활액, 관절 흡입물, 기관 분비물, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액으로부터 선택되는 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 및 제2 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체가 비공유 복합체인 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 포획 시약 및 상기 제2 포획 시약이, 독립적으로, 압타머 또는 항체로부터 선택되는 방법.
제32항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 박테리아, 대사물질, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포 및 조직으로부터 선택되는 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며, 상기 제2 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 상기 제2 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제32항에 있어서, 상기 제1 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며, 상기 제2 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제32항에 있어서, 상기 해리된 제1 및 제2 포획 시약의 존재의 검출 또는 수준의 결정이 PCR, 질량 분광측정, 핵산 서열분석, 차세대 서열분석(NGS) 또는 혼성화에 의해 수행되는 방법.
제32항에 있어서, 제3 포획 시약을 제3 회석과 접촉시켜 제3 혼합물을 형성하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제3 포획 시약이 고체 지지체 상에 고정화되고, 상기 제3 포획 시약이 상기 제1 및 제2 포획 시약의 표적 분자와 상이한 표적 분자에 대한 친화도를 갖는 방법.
제44항에 있어서, 상기 제3 혼합물을 상기 제1 혼합물 및 상기 제2 혼합물과 별도로 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제3 혼합물에 존재하는 경우 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제3 혼합물에 형성되는 방법.
제45항에 있어서, 상기 제1 및 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체와 제3 포획 시약-표적 분자 친화도를 (i) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (ii) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iii) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iv) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (v) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; 및 (vi) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 선택되는 순서로 순차적으로 방출하고 제4 혼합물에서 조합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제45항에 있어서, 상기 제3 희석이 동일한 평가 샘플의 상기 제1 회석 및 상기 제2 희석과 상이한 희석인 방법.
제45항에 있어서, 상기 제3 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 약 20%; 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%), 0.1% 내지 0.8%, 0.2% 내지 0.75%, 약 0.5%; 및 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%), 또는 0.002% 내지 0.008%, 0.003% 내지 0.007%, 약 0.005%로부터 선택되는 평가 샘플의 희석인 방법.
제46항에 있어서, 상기 제3 압타머 친화도 복합체의 제3 압타머의 존재 또는 수준, 또는 상기 제3 압타머 친화도 복합체의 존재 또는 양을 검출하거나 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제32항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 압타머가 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함하는 방법.
제50항에 있어서, 상기 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘이 피리미딘의 5-위치에서의 링커 및 링커에 부착된 모이어티를 포함하는 방법.
제51항에 있어서, 상기 링커가 아미드 링커, 카보닐 링커, 프로피닐 링커, 알킨 링커, 에스테르 링커, 우레아 링커, 카바메이트 링커, 구아니딘 링커, 아미딘 링커, 설폭시드 링커, 및 설폰 링커로부터 선택되는 방법.
제51항에 있어서, 상기 모이어티가 소수성 모이어티인 방법.
제53항에 있어서, 상기 모이어티가 도 1의 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV 및 XVI 그룹 모이어티로부터 선택되는 방법.
제53항에 있어서, 상기 모이어티가 나프틸 모이어티, 벤질 모이어티, 플루오로벤질 모이어티, 티로실 모이어티, 인돌 모이어티, 모르폴리노 모이어티, 이소부틸 모이어티, 3,4-메틸렌디옥시 벤질 모이어티, 벤조티오페닐 모이어티, 및 벤조푸라닐 모이어티로부터 선택되는 방법.
제50항에 있어서, 상기 5-위치 변형 피리미딘의 피리미딘이 유리딘, 시티딘 또는 티미딘인 방법.
방법으로서,
a) 제1 포획 시약을 제1 희석과 접촉시켜 제1 혼합물을 형성하고, 제2 포획 시약을 제2 희석과 접촉시켜 제2 혼합물을 형성하고, 제3 포획 시약을 제3 희석과 접촉시켜 제3 희석 혼합물을 형성하는 단계로서, 각각의 제1, 제2, 및 제3 포획 시약이 각각 고체 지지체 상에 고정화되고, 각각의 제1, 제2 및 제3 포획 시약이 상이한 표적 분자에 대한 친화도를 가지는, 단계;
b) 제1 혼합물, 제2 혼합물 및 제3 혼합물을 별도로 인큐베이션하는 단계로서, 제1 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제1 혼합물에 존재하는 경우 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제1 혼합물에 형성되고, 제2 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제2 혼합물에 존재하는 경우 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제2 혼합물에 형성되고, 제3 포획 시약이 친화도를 갖는 표적 분자가 제3 혼합물에 존재하는 경우 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체가 제3 혼합물에 형성되는, 단계;
c) (i) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (ii) 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iii) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (iv) 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; (v) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체; 및 (vi) 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제2 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체, 이어서 제1 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 선택되는 순서로 친화도 복합체를 순차적으로 방출하고 제4 혼합물에서 조합하는 단계;
d) 제1 태그를 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체의 표적 분자에 부착하는 단계;
e) 태그화된 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 고체 지지체와 접촉시켜 태그가 제1, 제2, 및 제3 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체를 하나 이상의 하나 고체 지지체에 고정시키도록 하는 단계;
f) 포획 시약을 포획 시약-표적 분자 친화도 복합체로부터 해리하는 단계;
g) 해리된 포획 시약의 존재를 검출하거나 수준을 결정하는 단계;
를 포함하되, 상기 제1 희석, 상기 제2 희석, 및 제3 희석이 평가 샘플의 상이한 희석인 방법.
제57항에 있어서, 상기 평가 샘플이 혈장, 혈청, 소변, 전혈, 백혈구, 말초혈 단핵 세포, 백혈구연층, 가래, 누액, 점액, 비강 세척액, 비강 흡입물, 정액, 타액, 복강 세척액, 복수, 낭액, 수막액, 양수, 샘액, 림프액, 유두 흡입물, 기관지 흡입물, 기관지 솔질물, 활액, 관절 흡입물, 기관 분비물, 세포, 세포 추출물, 및 뇌척수액으로부터 선택되는 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1, 제2 및 제3 포획 시약-표적 단백질 친화도 복합체가 비공유 복합체인 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1 포획 시약, 상기 제2 포획 시약 및 상기 제3 포획 시약이, 독립적으로, 압타머 또는 항체로부터 선택되는 방법.
제57항에 있어서, 상기 표적 분자가 단백질, 펩티드, 탄수화물, 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 박테리아, 대사물질, 보조인자, 억제제, 약물, 염료, 영양소, 성장 인자, 세포 및 조직으로부터 선택되는 방법.
제57항에 있어서, 상기 해리된 제1 및 제2 포획 시약의 존재의 검출 또는 수준의 결정이 PCR, 질량 분광측정, 핵산 서열분석, 차세대 서열분석(NGS) 또는 혼성화에 의해 수행되는 방법.
제60항에 있어서, 상기 압타머가 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘을 포함하는 방법.
제63항에 있어서, 상기 적어도 하나의 5-위치 변형 피리미딘이 피리미딘의 5-위치에서의 링커 및 링커에 부착된 모이어티를 포함하는 방법.
제64항에 있어서, 상기 링커가 아미드 링커, 카보닐 링커, 프로피닐 링커, 알킨 링커, 에스테르 링커, 우레아 링커, 카바메이트 링커, 구아니딘 링커, 아미딘 링커, 설폭시드 링커, 및 설폰 링커로부터 선택되는 방법.
제64항에 있어서, 상기 모이어티가 소수성 모이어티인 방법.
제66항에 있어서, 상기 모이어티가 도 1의 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV 및 XVI 그룹 모이어티로부터 선택되는 방법.
제66항에 있어서, 상기 모이어티가 나프틸 모이어티, 벤질 모이어티, 플루오로벤질 모이어티, 티로실 모이어티, 인돌 모이어티, 모르폴리노 모이어티, 이소부틸 모이어티, 3,4-메틸렌디옥시 벤질 모이어티, 벤조티오페닐 모이어티, 및 벤조푸라닐 모이어티로부터 선택되는 방법.
제63항에 있어서, 상기 5-위치 변형 피리미딘의 피리미딘이 유리딘, 시티딘 또는 티미딘인 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008% 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며, 상기 제2 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이고; 상기 제3 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이고; 상기 제3 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이고; 상기 제3 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이고; 상기 제3 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8%, 또는 0.2% 내지 0.75%, 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석이고; 상기 제3 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007% 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석인 방법.
제57항에 있어서, 상기 제1 희석이 5% 내지 39% (또는 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% 또는 39%), 또는 15% 내지 30%, 또는 15% 내지 25%, 또는 약 20%의 평가 샘플의 희석이며; 상기 제2 희석이 0.001% 내지 0.009% (또는 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008% 또는 0.009%) 또는 0.002% 내지 0.008%, 또는 0.003% 내지 0.007%, 또는 약 0.005%의 평가 샘플의 희석이고; 상기 제3 희석이 0.01% 내지 1% (또는 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9% 또는 1%) 또는 0.1% 내지 0.8% 또는 0.2% 내지 0.75% 또는 약 0.5%의 평가 샘플의 희석인 방법.