JP2021528646A - 改良されたプロテオミクスマルチプレックスアッセイ - Google Patents

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Abstract

プロテオミクスベースのアッセイの性能を改善するように設計された方法、デバイス、試薬及びキットが提供される。そのような方法は、マルチプレックスアッセイ形式においてバックグラウンドシグナルの減少または排除及びタンパク質結合試薬に対する特異性の改善を可能にすることによって、研究開発、診断及び治療のためのプロテオミクス用途において幅広い有用性を有する。
【選択図】図７

Description

本開示は、一般にプロテオミクスアッセイの分野、ならびにアッセイの性能を改善するように設計された方法、デバイス、試薬及びキットに関する。そのような方法は、研究開発、診断及び治療のためのプロテオミクス用途において幅広い有用性を有する。特に、マルチプレックスアッセイ形式においてバックグラウンドシグナルを減少または排除し、タンパク質結合試薬の特異性を改善する材料及び方法が提供される。
生体試料及び他の試料タイプにおける生理学的に重要な分子の検出及び定量化を対象とするアッセイは、科学研究及びヘルスケア分野の重要なツールである。例えば、マルチプレックスアレイアッセイは、表面結合プローブを用いて試料中の標的分子を検出する。表面結合プローブは、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、アフィボディ、アプタマーまたは試料の標的分子と結合できる他の分子（総称してバイオポリマー）である場合がある。これらの結合相互作用は、様々な異なる分野、例えば、ゲノミクス、トランスクリプトミクス及びプロテオミクスに使用される多くの方法及びデバイスの基礎である。
アッセイは、アッセイ混合物の特定の成分を除去するように設計された溶液ベースの標的相互作用及び分離ステップを提供する。しかしながら、多くのアッセイ形式の感度及び特異性は、アッセイ中の非特異的会合に起因して生じるシグナルから真のシグナルを分解する検出方法の能力によって制限され、これらは誤って検出されるシグナルをもたらす。このことは、使用される捕捉試薬（例えば、抗体またはアプタマー）に関係なく、多重化アッセイに特に当てはまる。非特異的結合の主な原因の１つは、標的分子との予期しない非特異的捕捉試薬相互作用または非特異的結合相互作用である。本開示は、標的／捕捉試薬の特異的相互作用を維持しながら、多重化に基づくプロテオミクスアッセイで観察されるバックグラウンドシグナルを排除または減少させる方法について記載する。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１希釈試料を第１アプタマーと接触させることであり、標的分子が第１希釈試料中に存在する場合、第１アプタマー親和性複合体が、第１アプタマーとその標的分子との相互作用によって形成されること、ｂ）第２希釈試料を第２アプタマーと接触させることであり、標的分子が第２希釈試料中に存在する場合、第２アプタマー親和性複合体が、第２アプタマーとその標的分子との相互作用によって形成されること、ｃ）アプタマー親和性複合体の形成を可能にするために、第１及び第２希釈試料を別々にインキュベートすること、ｄ）第１アプタマー親和性複合体を含む第１希釈試料を第１混合物に移すことであり、第１アプタマー親和性複合体が、第１混合物中の固体支持体上に捕捉されること、ｅ）ステップｄ）の後、第２希釈試料を第１混合物に移して第２混合物を形成することであり、第２希釈液の第２アプタマー親和性複合体が、第２混合物中の固体支持体上に捕捉されること、ｆ）第１及び第２アプタマー親和性複合体の第１アプタマー及び第２アプタマーの存在を検出すること、もしくはそのレベルを決定することであり、または１つ以上の第１及び第２アプタマー親和性複合体の存在もしくは量を検出することであり、第１希釈液及び第２希釈液が、同じ試験試料の異なる希釈液であることを含む。
一態様では、試験試料は、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
別の態様では、第１及び第２アプタマー−標的分子親和性複合体は、非共有結合複合体である。
別の態様では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される。
別の態様では、第１希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第２希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である。
別の態様では、第１希釈液は、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第２希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である。
別の態様では、第１希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第２希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である。
別の態様では、第１希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第２希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である。
別の態様では、第１希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第２希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である。
別の態様では、第１希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第２希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である。
別の態様では、解離した第１及び第２捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することは、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される。
別の態様では、第１アプタマー及び／または第２アプタマーは、独立して、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む。
別の態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
別の態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
別の態様では、その部分は疎水部分である。
別の態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
別の態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
別の態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
別の態様では、本明細書に開示される方法は、第３希釈試料を第３アプタマーと接触させることをさらに含み、標的分子が第３希釈試料中に存在する場合、第３アプタマー親和性複合体が、第３アプタマーとその標的分子との相互作用によって形成される。
別の態様では、第３希釈試料は、第１及び第２希釈試料とは別にインキュベートされ、第３アプタマーとその標的分子とのアプタマー親和性複合体の形成を可能にする。
別の態様では、本明細書に開示される方法は、第３希釈試料を第２混合物に移して第３混合物を形成することをさらに含み、第３希釈液の第３アプタマー親和性複合体は、第３混合物中の固体支持体上に捕捉される。
別の態様では、本明細書に開示される方法は、第３アプタマー親和性複合体の第３アプタマーの存在を検出すること、もしくはそのレベルを決定すること、または第３アプタマー親和性複合体の存在もしくは量を検出することをさらに含む。
別の態様では、第３希釈液は、同じ試験試料の第１希釈液及び第２希釈液とは異なる希釈液である。
別の態様では、第３希釈液は、５％〜３９％（または５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）、１５％〜３０％、１５％〜２５％、約２０％、０．０１％〜１％（または０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％）、０．１％〜０．８％、０．２％〜０．７５％、約０．５％、及び０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）、または０．００２％〜０．００８％、０．００３％〜０．００７％、約０．００５％から選択される試験試料の希釈液である。
別の態様では、第３アプタマーは、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む。
別の態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
別の態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
別の態様では、その部分は疎水部分である。
別の態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
別の態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
別の態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１捕捉試薬を第１希釈液と接触させて第１混合物を形成し、第２捕捉試薬を第２希釈液と接触させて第２混合物を形成することであり、第１及び第２捕捉試薬の各々が、それぞれ固体支持体上に固定化され、第１及び第２捕捉試薬の各々が、異なる標的分子に対して親和性を有すること、ｂ）第１混合物及び第２混合物を別々にインキュベートすることであり、第１捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第１混合物中に存在する場合、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第１混合物中に形成され、第２捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第２混合物中に存在する場合、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第２混合物中に形成されること、ｃ）（ｉ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び（ｉｉ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体から選択される順序で、親和性複合体を順に遊離させて第４混合物中において組み合わせること、ｄ）第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体の標的分子に第１タグを付けること、ｅ）タグが第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の固体支持体に固定化させるように、タグ付き第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の固体支持体に接触させること、ｆ）捕捉試薬を捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、ｇ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することであり、第１希釈液及び第２希釈液が、試験試料の異なる希釈液であることを含む。
一態様では、試験試料は、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
一態様では、第１及び第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体は、非共有結合複合体である。
一態様では、第１捕捉試薬及び第２捕捉試薬は、独立して、アプタマーまたは抗体から選択される。
一態様では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される。
一態様では、第１希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第２希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である。
一態様では、第１希釈液は、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第２希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である。
一態様では、第１希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第２希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である。
一態様では、第１希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第２希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である。
一態様では、第１希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第２希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である。
一態様では、第１希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第２希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である。
一態様では、解離した第１及び第２捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することは、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される。
別の態様では、本明細書に開示される方法は、第３捕捉試薬を第３希釈液と接触させて第３混合物を形成することをさらに含み、第３捕捉試薬が固体支持体上に固定化され、第３捕捉試薬が、第１及び第２捕捉試薬の標的分子とは異なる標的分子に対して親和性を有する。
別の態様では、本明細書に開示される方法は、第１混合物及び第２混合物とは別に第３混合物をインキュベートすることをさらに含み、第３捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第３混合物中に存在する場合、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第３混合物中に形成される。
別の態様では、本明細書に開示される方法は、（ｉ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉｉ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｖ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｖ）第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、及び（ｖｉ）第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体から選択される順序で順に遊離させて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体と第４混合物中に組み合わせることをさらに含む。
一態様では、第３希釈液は、同じ試験試料の第１希釈液及び第２希釈液とは異なる希釈液である。
一態様では、第３希釈液は、５％〜３９％（または５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）、１５％〜３０％、１５％〜２５％、約２０％、０．０１％〜１％（または０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％）、０．１％〜０．８％、０．２％〜０．７５％、約０．５％、及び０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）、または０．００２％〜０．００８％、０．００３％〜０．００７％、約０．００５％から選択される試験試料の希釈液である。
別の態様では、本明細書に開示される方法は、第３アプタマー親和性複合体の第３アプタマーの存在を検出すること、もしくはそのレベルを決定すること、または第３アプタマー親和性複合体の存在もしくは量を検出することをさらに含む。
一態様では、アプタマーは、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む。
一態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
一態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
一態様では、その部分は疎水部分である。
一態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
一態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
一態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１捕捉試薬を第１希釈液と接触させて第１混合物を形成し、第２捕捉試薬を第２希釈液と接触させて第２混合物を形成し、第３捕捉試薬を第３希釈液と接触させて第３希釈混合物を形成することであり、第１、第２、及び第３捕捉試薬の各々が、それぞれ固体支持体上に固定化され、第１、第２及び第３捕捉試薬の各々が、異なる標的分子に対して親和性を有すること、ｂ）第１混合物、第２混合物及び第３混合物を別々にインキュベートすることであり、第１捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第１混合物中に存在する場合、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第１混合物中に形成され、第２捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第２混合物中に存在する場合、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第２混合物中に形成され、第３捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第３混合物中に存在する場合、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第３混合物中に形成されること、ｃ）（ｉ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉｉ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｖ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｖ）第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、及び（ｖｉ）第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体から選択される順序で、親和性複合体を順に遊離させて第４混合物中において組み合わせること、ｄ）第１、第２、及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の標的分子に第１タグを付けること、ｅ）タグが第１、第２及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の固体支持体に固定化させるように、タグ付き第１、第２、及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の固体支持体に接触させること、ｆ）捕捉試薬を捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、ｇ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することであり、第１希釈液、第２希釈液、及び第３希釈液が、試験試料の異なる希釈液であることを含む。
一態様では、試験試料は、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
一態様では、第１、第２及び第３捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体は、非共有結合複合体である。
一態様では、第１捕捉試薬、第２捕捉試薬及び第３捕捉試薬は、独立して、アプタマーまたは抗体から選択される。
一態様では、標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される。
一態様では、解離した第１及び第２捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することは、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される。
一態様では、アプタマーは、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む。
一態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
一態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
一態様では、その部分は疎水部分である。
一態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
一態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
一態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
一態様では、第１希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第２希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第３希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である。
一態様では、第１希釈液は、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第２希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第３希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である。
一態様では、第１希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第２希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第３希釈液は、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である。
一態様では、第１希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第２希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第３希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である。
一態様では、第１希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第２希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、第３希釈液は、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である。
一態様では、第１希釈液は、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、第２希釈液は、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、第３希釈液は、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である。
本発明の前述の及び他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明からさらに明らかとなり、これは添付の図面に関連している。
アプタマー中に組み込まれてよい、ある特定の例示的な５位修飾ウリジン及びシチジン。 図１−１の続き。 図１−２の続き。 図１−３の続き。 図１−４の続き。 ウリジンの５位に存在してよい、ある特定の例示的な修飾。Ｃ−５修飾の化学構造は、修飾をウリジンの５位に連結する例示的なアミド結合を含む。示される５位部分としては、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ）、ブチル部分（例えば、ｉＢｕ）、フルオロベンジル部分（例えば、ＦＢｎ）、チロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）、３，４−メチレンジオキシベンジル（例えば、ＭＢｎ）、モルホリノ部分（例えば、ＭＯＥ）、ベンゾフラニル部分（例えば、ＢＦ）、インドール部分（例えば、Ｔｒｐ）ならびにヒドロキシプロピル部分（例えば、Ｔｈｒ）が挙げられる。 図２−１の続き。 図２−２の続き。 シチジンの５位に存在してよい、ある特定の例示的な修飾。Ｃ−５修飾の化学構造は、修飾をシチジンの５位に連結する例示的なアミド結合を含む。示される５位部分としては、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ、及び２ＮＥ）ならびにチロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）が挙げられる。 図３−１の続き。 生体試料の希釈セットの概要例、捕捉試薬の各々の希釈液に対応する捕捉試薬セット、ならびに２つのキャッチシステム（キャッチ−１及びキャッチ−２）の全体概要を提供する。２つの異なる希釈群を、生体試料のＺ％希釈液またはＤＩＬ４及び生体試料のＸ％希釈液またはＤＩＬ１を含む生体試料から作製してよく、ＺはＸよりも大きい（またはＺは、Ｘ希釈液よりも高い希釈液である）。各希釈液は、特定のタンパク質セットに結合する対応する捕捉試薬のその特有のセット（ＤＩＬ１にはＡ３及びＤＩＬ４にはＡ１）を有する。２つの異なる希釈セットを、アッセイのキャッチ−１ステップからアッセイのキャッチ−２ステップへと共に移した。 生体試料の希釈セットの概要例、捕捉試薬の各々の希釈液に対応する捕捉試薬セット、ならびに２つのキャッチシステム（キャッチ−１及びキャッチ−２）の全体概要を提供する。３つの異なる希釈群を、生体試料のＺ％希釈液またはＤＩＬ３、生体試料のＹ％希釈液またはＤＩＬ２及び生体試料のＸ％希釈液またはＤＩＬ１を含む生体試料から作製してよく、ＺはＹよりも大きく、ＹはＸよりも大きい（またはＺはＹ希釈液よりも高い希釈液であり、Ｙ希釈液はＸ希釈液よりも高い希釈液である）。各希釈液は、特定のタンパク質セットに結合する対応する捕捉試薬のその特有のセット（ＤＩＬ１にはＡ３、ＤＩＬ２にはＡ２及びＤＩＬ３にはＡ１）を有する。 ０．００５％希釈液（ＤＩＬ１）、０．５％希釈液（ＤＩＬ２）及び２０％希釈液（ＤＩＬ３）として作製した、血漿の３つの異なる希釈群の概要を提供し、それぞれ相対的に高い、中程度の及び低い存在量のタンパク質を測定した。さらに、ＤＩＬ１、ＤＩＬ２及びＤＩＬ３の各々についてのアプタマーセットは、それぞれＡ１、Ａ２及びＡ３であった。合計で５，２７２個の異なるアプタマーについて、アプタマーのＡ３群は、４，２７１個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約８１％）を有し、Ａ２群は、８２８個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約１６％）を有し、Ａ１群は、１７３個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約３％）を有する。３つの異なる希釈セットを、アッセイのキャッチ−１ステップからアッセイのキャッチ−２ステップへと共に移した。 生体試料の希釈セットの概要例、捕捉試薬の各々の希釈液に対応する捕捉試薬セット、ならびに逐次的な２つのキャッチシステム（キャッチ−１及びキャッチ−２）の全体概要を提供する。３つの異なる希釈群を、生体試料のＺ％希釈液またはＤＩＬ３、生体試料のＹ％希釈液またはＤＩＬ２及び生体試料のＸ％希釈液またはＤＩＬ１を含む生体試料から作製してよく、ＺはＹよりも大きく、ＹはＸよりも大きい（またはＺはＹ希釈液よりも高い希釈液であり、Ｙ希釈液はＸ希釈液よりも高い希釈液である）。各希釈液は、特定のタンパク質セットに結合する対応する捕捉試薬のその特有のセット（ＤＩＬ１にはＡ３、ＤＩＬ２にはＡ２及びＤＩＬ３にはＡ１）を有する。 ０．００５％希釈液（ＤＩＬ１）、０．５％希釈液（ＤＩＬ２）及び２０％希釈液（ＤＩＬ３）として作製した、血漿の３つの異なる希釈群の概要を提供し、それぞれ相対的に高い、中程度の及び低い存在量のタンパク質を測定した。さらに、ＤＩＬ１、ＤＩＬ２及びＤＩＬ３の各々についてのアプタマーセットは、それぞれＡ１、Ａ２及びＡ３であった。合計で５，２７２個の異なるアプタマーについて、アプタマーのＡ３群は、４，２７１個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約８１％）を有し、Ａ２群は、８２８個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約１６％）を有し、Ａ１群は、１７３個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約３％）を有する。３つの異なる希釈セットを、アッセイのキャッチ−１ステップからアッセイのキャッチ−２ステップへと順に移した。 生体試料の希釈セットの概要例、捕捉試薬の各々の希釈液に対応する捕捉試薬セット、ならびに２つのキャッチシステム（キャッチ−１及びキャッチ−２）の全体概要を提供する。２つの異なる希釈群を、生体試料のＺ％希釈液またはＤＩＬ４及び生体試料のＸ％希釈液またはＤＩＬ１を含む生体試料から作製してよく、ＺはＸよりも大きい（またはＺは、Ｘ希釈液よりも高い希釈液である）。各希釈液は、特定のタンパク質セットに結合する対応する捕捉試薬のその特有のセット（ＤＩＬ１にはＡ３及びＤＩＬ４にはＡ１）を有する。２つの異なる希釈セットを、アッセイのキャッチ−１ステップからアッセイのキャッチ−２ステップへと順に移した。 条件１（すなわち、３つの希釈群ＤＩＬ１、ＤＩＬ２及びＤＩＬ３全て）のアプタマーシグナルと、条件２、３及び４（表２、希釈群のうち１つのみがブランクと共に存在していた場合）の各々についてのアプタマーシグナルとの比に関する累積分布関数（ＣＤＦ）を、３つ全ての希釈セットをアッセイのキャッチ−１パートからアッセイのキャッチ−２パートへと共に移した場合に実施した通りに、アッセイについてプロットした。アプタマーシグナルの比は、ハイブリダイゼーションアレイから得られた相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表される。 条件１（すなわち、３つの希釈群ＤＩＬ１、ＤＩＬ２及びＤＩＬ３全て）のアプタマーシグナルと、条件２、３及び４（希釈群のうち１つのみがブランクと共に存在していた場合）の各々についてのアプタマーシグナルとの比に関する累積分布関数（ＣＤＦ）を、３つの希釈セットをアッセイのキャッチ−１パートからアッセイのキャッチ−２パートへと順に移した場合に実施した通りに、アッセイについてプロットした。アプタマーシグナルの比は、ハイブリダイゼーションアレイから得られた相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表される。 ４０％、２０％、１０％及び５％の希釈液（Ｘ軸）の各々について、中央値Ｓ／Ｂ（Ｙ軸、左側）と共に線形範囲内における分析物の数（Ｙ軸、右側）のグラフ表示。生体試料の２０％希釈液では、最大の中央値Ｓ／Ｂを有する線形範囲内における分析物の最大数が観察される（２本の線が交差する箇所）。
別段の注記がない限り、専門用語は従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓにより出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）、Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により出版，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）に見出されてよい。
別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる、全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量の値は概算であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。
さらに、本明細書で提供される範囲は、その範囲内の全ての値の簡略表記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組合せ、または部分範囲（加えて、その内容に別段の明確な指示がない限り、その分数）を含むと理解される。いずれの濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、別段の指示がない限り、列挙される範囲内の任意の整数、ならびに適切な場合、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）の値も含むと理解されるべきである。また、任意の物理的特徴、例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどに関する、本明細書で列挙される数値範囲のいずれも、別段の指示がない限り、列挙される範囲内のいずれの整数も含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」または「から本質的になる」とは、別段の指示がない限り、示される範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語はオープンエンド形式であり、同義語として使用される。
本明細書に記載されるものと類似または同等の方法及び材料が本開示の実施または試験に使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それら全体が参照によって組み込まれる。矛盾する場合には、用語の説明を含む本明細書が優先されることになる。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定することを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾形態に加えて、それらの類似体を指す。ヌクレオチドとしては、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにそれらの誘導体及び類似体）に加えて、ピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、ならびにそれらの誘導体及び類似体）を含む種が挙げられる。本明細書で使用される場合、「シチジン」という用語は、別段の具体的な指示がない限り、シトシン塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチドを指すために一般的に使用される。「シチジン」という用語は、２’−修飾シチジン、例えば、２’−フルオロ、２’−メトキシなどを含む。同様に、「修飾シチジン」という用語または特定の修飾シチジンはまた、別段の具体的な指示がない限り、修飾シトシン塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチド（２’−フルオロ、２’−メトキシなど）を指す。「ウリジン」という用語は、別段の具体的な指示がない限り、ウラシル塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチドを指すために一般的に使用される。「ウリジン」という用語は、２’−修飾ウリジン、例えば、２’−フルオロ、２’−メトキシなどを含む。同様に、「修飾ウリジン」という用語または特定の修飾ウリジンはまた、別段の具体的な指示がない限り、修飾ウラシル塩基を含むリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または修飾リボヌクレオチド（２’−フルオロ、２’−メトキシなど）を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｃ−５修飾カルボキサミドシチジン」または「シチジン−５−カルボキサミド」または「５位修飾シチジン」または「Ｃ−５修飾シチジン」という用語は、シチジンのＣ−５位にカルボキシアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）修飾、例えば、本明細書に図示されるそれらの部分（ＲX1）を含むが、これに限定されない修飾を有するシチジンを指す。例示的なＣ−５修飾カルボキサミドシチジンとしては、５−（Ｎ−ベンジルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＢｎｄＣ」と称され、図３に示される）、５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＥｄＣ」と称され、図３に示される）、５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＰＰｄＣ」と称され、図３に示される）、５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮａｐｄＣ」と称され、図３に示される）、５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮａｐｄＣ」と称され、図３に示される）、５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「ＮＥｄＣ」と称され、図３に示される）、５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキサミド）−２’−デオキシシチジン（「２ＮＥｄＣ」と称され、図３に示される）、及び５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＴｙｒｄＣと称され、図３に示される）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃ５修飾シチジンは、例えば、それらの三リン酸形態で、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）によってオリゴヌクレオチド中に組み込むことができる。
本明細書に記載されるＣ−５修飾シチジンの化学修飾はまた、単独でまたは任意の組合せで、２’位の糖修飾、環外アミンでの修飾、及び４−チオシチジンの置換などと組み合わされ得る。
本明細書で使用される場合、「Ｃ−５修飾カルボキサミドシトシン」または「シトシン−５−カルボキサミド」または「５位修飾シトシン」または「Ｃ−５修飾シトシン」という用語は、シトシンのＣ−５位にカルボキシアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）修飾、例えば、本明細書に図示されるそれらの部分（ＲX1）を含むが、これに限定されない修飾を有するシトシン塩基を指す。例示的なＣ−５修飾カルボキサミドシトシンとしては、図３に示される修飾シチジンが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書で使用される場合、「Ｃ−５修飾ウリジン」または「５位修飾ウリジン」という用語は、例えば、図１に示されるような、ウリジンのＣ−５位にカルボキシアミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−）修飾を有するウリジン（典型的にはデオキシウリジン）を指す。いくつかの実施形態では、Ｃ５修飾ウリジンは、例えば、それらの三リン酸形態で、ポリメラーゼ（例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ）によってオリゴヌクレオチド中に組み込むことができる。非限定的で例示的な５位修飾ウリジンとしては、以下が挙げられる：
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−フェネチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、
５−（Ｎ−チオフェニルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、
５−（Ｎ−チロシルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、
５−（Ｎ−３，４−メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−４−フルオロベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、
５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、
５−（Ｎ−イミジゾリルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、
５−（Ｎ−Ｒ−スレオニニルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロリド、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−［１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−１−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−２−ナフチルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、及び
５−（Ｎ−３−ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン。
本明細書で使用される場合、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」という用語、及びその任意の変化形は、オリゴヌクレオチドに関連して使用される場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）のうち少なくとも１つが、天然に存在するヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。追加の修飾としては、骨格修飾、メチル化、稀な塩基対合の組合せ、例えば、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどが挙げられ得る。修飾としては、キャッピングなどの３’及び５’修飾も挙げられ得る。他の修飾としては、天然に存在するヌクレオチドのうち１つ以上と類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）による修飾及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）による修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、ならびに修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）による修飾などが挙げられ得る。さらに、通常はヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれかが、ホスホネート基もしくはリン酸基で置き換えられてよいか、標準的な保護基によって保護されてよいか、または追加のヌクレオチドへの、もしくは固体支持体への追加の結合を調製するために活性化されてよい。５’末端及び３’末端のＯＨ基がリン酸化され得るか、あるいはアミン、約１〜約２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分、一実施形態では、約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、別の実施形態では、約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性生体ポリマーもしくは合成ポリマーで置換され得る。
本明細書で使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用されてヌクレオチドのポリマーを指し、これらとしてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドならびにこれらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの修飾物が挙げられ、様々な実体または部分が任意の位置でヌクレオチド単位に結合することが含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、二本鎖または一本鎖分子に加えて三重らせん分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語の上位語であり、したがって、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。
ポリヌクレオチドはまた、一般に当該技術分野において既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、２’−フルオロ、２’−ＮＨ2または２’−アジド、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドなどを含み得る。本明細書で述べられるように、１つ以上のホスホジエステル結合が、代替連結基で置き換えられてよい。これらの代替連結基としては、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲX 2（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）ＲX、Ｐ（Ｏ）ＯＲX’、ＣＯまたはＣＨ2（「ホルムアセタール」）で置き換えられ、式中、各ＲXまたはＲX’は独立してＨである、またはエーテル（−Ｏ−）結合を場合により含有する置換もしくは非置換アルキル（Ｃ１〜Ｃ２０）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルである実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。糖、プリン、及びピリミジンの類似形態の置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替骨格構造が有利であり得るのと同様に、最終生成物の設計に有利であり得る。
ポリヌクレオチドはまた、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドなどの類似形態も含有し得る。
存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。ポリヌクレオチドは、重合後、例えば、標識化成分との複合化などによってさらに修飾され得る。
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つのヌクレオチド」という用語は、核酸の修飾を指す場合、核酸中の１つの、いくつかの、または全てのヌクレオチドを指し、これは核酸中のＡ、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＵのいずれかまたは全ての、いずれかまたは全ての存在が修飾されてもよいか、または修飾されなくともよいことを示している。
本明細書で使用される場合、「核酸リガンド」、「アプタマー」、「ＳＯＭＡｍｅｒ」、「修飾アプタマー」、及び「クローン」は交換可能に使用され、標的分子に対して望ましい作用を有する天然に存在しない核酸を指す。望ましい作用としては、標的の結合、標的を触媒的に変化させること、標的または標的の機能活性を改変または変化させる方法で標的と反応すること、標的への共有結合（自殺阻害剤におけるような）、及び標的と別の分子間の反応を促進させることが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、作用は標的分子に対する特異的結合親和性であり、そのような標的分子は、ワトソン／クリック塩基対合または三重らせん形成に依存しない機構によってアプタマーに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、アプタマーは、標的分子が結合している既知の生理機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーは、核酸の候補混合物から同定される核酸を含み、アプタマーは、以下を含む方法による、標的のリガンドである：（ａ）候補混合物を標的と接触させることであり、候補混合物中の他の核酸と比較して標的に対して高い親和性を有する核酸が、候補混合物の残部から分割され得ること、（ｂ）候補混合物の残部から高い親和性の核酸を分割すること、及び（ｃ）高い親和性の核酸を増幅して核酸のリガンド濃縮混合物を生成し、それによって標的分子のアプタマーが同定されること。親和性相互作用は、程度の問題であることが認識されるが、これに関連して、その標的に対するアプタマーの「特異的結合親和性」は、アプタマーが混合物または試料中の他の非標的成分に結合するよりも、一般にはるかに高い度合いの親和性でアプタマーがその標的に結合することを意味する。「アプタマー」、「ＳＯＭＡｍｅｒ」、または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子の１つの種類または種のコピーのセットである。アプタマーは、任意の好適な数のヌクレオチドを含み得る。「アプタマー」は、そのような分子の２つ以上のセットを指す。異なるアプタマーは、同数または異なる数のいずれかのヌクレオチドを有し得る。アプタマーはＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、一本鎖、二本鎖であってよいか、または二本鎖もしくは三本鎖領域を含有してよい。いくつかの実施形態では、アプタマーは、本明細書に記載されるような、または当該技術分野において既知のＳＥＬＥＸプロセスを使用して調製される。
本明細書で使用される場合、「ＳＯＭＡｍｅｒ」または遅いオフレート修飾アプタマーは、改善されたオフレート特性を有するアプタマーを指す。ＳＯＭＡｍｅｒは、「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」と題した米国特許第７，９４７，４４７号に記載されている改良されたＳＥＬＥＸ法を使用して生成され得る。
本明細書で使用される場合、２つの異なる種類の５位修飾ピリミジンまたはＣ−５修飾ピリミジンを含むアプタマーは、「二重修飾アプタマー」、「２つの修飾塩基」を有するアプタマー、「２塩基修飾」を有する、または「２塩基修飾されている」アプタマー、「二重修飾塩基」を有するアプタマーと称されてよく、それら全てが交換可能に使用されてよい。アプタマーのライブラリーまたはアプタマーライブラリーも、同じ専門用語を使用してよい。したがって、いくつかの実施形態では、アプタマーは２つの異なる５位修飾ピリミジンを含み、２つの異なる５位修飾ピリミジンは、ＮａｐｄＣ及びＮａｐｄＵ、ＮａｐｄＣ及びＰＰｄＵ、ＮａｐｄＣ及びＭＯＥｄＵ、ＮａｐｄＣ及びＴｙｒｄＵ、ＮａｐｄＣ及びＴｈｒｄＵ、ＰＰｄＣ及びＰＰｄＵ、ＰＰｄＣ及びＮａｐｄＵ、ＰＰｄＣ及びＭＯＥｄＵ、ＰＰｄＣ及びＴｙｒｄＵ、ＰＰｄＣ及びＴｈｒｄＵ、ＮａｐｄＣ及び２ＮａｐｄＵ、ＮａｐｄＣ及びＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＣ及びＮａｐｄＵ、ならびに２ＮａｐｄＣ及び２ＮａｐｄＵ、２ＮａｐｄＣ及びＰＰｄＵ、２ＮａｐｄＣ及びＴｒｐｄＵ、２ＮａｐｄＣ及びＴｙｒｄＵ、ＰＰｄＣ及び２ＮａｐｄＵ、ＰＰｄＣ及びＴｒｐｄＵ、ＰＰｄＣ及びＴｙｒｄＵ、ＴｙｒｄＣ及びＴｙｒｄＵ、ＴｒｙｄＣ及び２ＮａｐｄＵ、ＴｙｒｄＣ及びＰＰｄＵ、ＴｙｒｄＣ及びＴｒｐｄＵ、ＴｙｒｄＣ及びＴｙｒｄＵ、ならびにＴｙｒｄＣ及びＴｙｒｄＵから選択される。いくつかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも１つの修飾ウリジン及び／またはチミジンならびに少なくとも１つの修飾シチジンを含み、少なくとも１つの修飾ウリジン及び／またはチミジンは、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される部分によって５位で修飾され、少なくとも１つの修飾シチジンは、ナフチル部分、チロシル部分、及びベンジル部分から選択される部分によって５位で修飾される。ある特定の実施形態では、部分は、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される基を含むリンカーを介して塩基の５位に共有結合される。部分をピリミジンの５位に共有結合させるために使用されてよい例示的なリンカーのさらなる例については、図１を参照のこと。
本明細書で使用される場合、「疎水基」及び「疎水部分」は、本明細書では交換可能に使用され、非荷電である任意の基または部分を指し、基または部分の原子の大部分は水素及び炭素であり、基もしくは部分が小さな双極子を有する、及び／または基もしくは部分が水からはじかれる傾向がある。これらの基または部分は、芳香族炭化水素または平面芳香族炭化水素を含んでよい。疎水性または分子（もしくは基もしくは部分）が疎水性であるかどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知であり、経験的に得られた方法に加えて、算出方法を含む。例示的な方法が、Ｚｈｕ Ｃｈｏｎｇｑｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎｓ ｉｎ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｖｉａ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｇｌｅ ｏｆ ａ ｗａｔｅｒ ｎａｎｏｄｒｏｐｌｅｔ ｏｎ ｐｌａｎａｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１３（４６）ｐｇｓ．１２９４６−１２９５１に記載されている。本明細書に開示されるように、例示的な疎水部分としては、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩが挙げられるが、これらに限定されない。さらに例示的な疎水部分としては、図３のもの（例えば、Ｂｎ、Ｎａｐ、ＰＥ、ＰＰ、ｉＢｕ、２Ｎａｐ、Ｔｒｙ、ＮＥ、ＭＢｎ、ＢＦ、ＢＴ、Ｔｒｐ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、単一種類の５位修飾ピリミジンまたはＣ−５修飾ピリミジンを含むアプタマーは、「単一修飾アプタマー」、「単一修飾塩基」を有するアプタマー、「単一塩基修飾」を有する、または「単一塩基修飾されている」アプタマーと称されてよく、それら全てが交換可能に使用されてよい。アプタマーのライブラリーまたはアプタマーライブラリーも、同じ専門用語を使用してよい。本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義的に使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、アミノ酸配列が得られる細胞、組織、もしくは無細胞源からの細胞材料もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合に化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。
ある特定の実施形態では、アプタマーは、第１の５位修飾ピリミジン及び第２の５位修飾ピリミジンを含み、第１の５位修飾ピリミジンは、第１の５位修飾ピリミジンの５位にチロシル部分を含み、第２の５位修飾ピリミジンは、第２の５位修飾ピリミジンの５位にナフチル部分またはベンジル部分を含む。関連実施形態では、第１の５位修飾ピリミジンはウラシルである。関連実施形態では、第２の５位修飾ピリミジンはシトシンである。関連実施形態では、アプタマーのウラシルの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が５位で修飾される。関連実施形態では、アプタマーのシトシンの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が５位で修飾される。
核酸ハイブリダイゼーションの当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを与える、または制御するために一般的に使用される因子としては、ホルムアミド濃度（または他の化学的変性試薬）、塩濃度（すなわち、イオン強度）、ハイブリダイゼーション温度、界面活性剤濃度、ｐＨ及びカオトロープの有無が挙げられると認識することになる。プローブ／標的配列の組合せの最適なストリンジェンシーは、上述したストリンジェンシー因子のいくつかを固定し、次いで単一のストリンジェンシー因子を変化させる場合の効果を決定するという周知の技術によって多くの場合に見出される。ＰＮＡのハイブリダイゼーションがイオン強度に全く依存しないことを除いて、同じストリンジェンシー因子を調節し、それによってＰＮＡの核酸に対するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを制御することができる。アッセイの最適なストリンジェンシーは、所望の程度の識別が達成されるまで、各ストリンジェンシー因子の検査によって実験的に決定されてよい。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズすること」、「結合」及び同様の用語は、ヌクレオチド配列の文脈において、本明細書では交換可能に使用され得る。２つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする能力は、２つの配列の相補性の程度に基づいていて、同様に適合した相補的ヌクレオチド対の割合に基づいている。別の配列に相補的である所与の配列中のヌクレオチドが多いほど、ハイブリダイゼーションの条件はよりストリンジェントになり得、２つの配列の結合はより特異的になる。高いストリンジェンシーは、温度の上昇、共溶媒の比の増加、塩濃度の低下などによって達成される。マイクロアレイ上のプローブ及び標的材料の相補的ワトソン／クリック塩基対のハイブリダイゼーションが一般的には好ましいが、ハイブリダイゼーション中の非ワトソン／クリック塩基対合も生じ得る。
従来のハイブリダイゼーション溶液及びハイブリダイゼーションのプロセスは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（上記）に記載され、参照によって本明細書に組み込まれる。ハイブリダイゼーションの条件としては通常、（１）高イオン強度溶液、（２）制御された温度で、ならびに（３）担体ＤＮＡ及び界面活性剤及び二価カチオンのキレート剤の存在下であることが挙げられ、その全てが当該技術分野において既知である。
本明細書で使用される場合、「バイオポリマー」は、１種以上の反復単位のポリマーである。バイオポリマーは通常、生体系に見られ、特に多糖（炭水化物など）、ならびにペプチド（この用語は、多糖に結合しているか否かを問わず、ポリペプチド、及びタンパク質を含むために使用される）ならびにポリヌクレオチドに加えて、それらの類似体、例えば、アミノ酸類似体もしくは非アミノ酸基、またはヌクレオチド類似体もしくは非ヌクレオチド基で構成される、またはそれらを含有するそれらの化合物などを含む。そのため、本用語は、従来の骨格が天然に存在しない、または合成骨格で置き換えられているポリヌクレオチド、及び従来の塩基のうち１つ以上が、ワトソン・クリック型水素結合相互作用に関与できる基（天然または合成）で置き換えられている核酸（または合成もしくは天然に存在する類似体）を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または多重鎖構成を含み、１本以上の鎖が別の鎖と完全にアラインメントされる、またはアラインメントされない場合がある。特に、「バイオポリマー」は、供給源にかかわらず、デオキシリボ核酸またはＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、リボ核酸またはＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「アレイ」は、アドレス可能な領域と関連する特定の１つ以上の化学部分（例えば、ペプチド核酸分子、ペプチドまたはポリヌクレオチド配列などのバイオポリマー）を持つその領域の任意の一次元、二次元または三次元配置を含み、１つ以上の化学部分は、その領域の表面上に固定化される。「固定化される」とは、１つ以上の部分がアレイを使用する条件下、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄及びストリッピング条件下で領域から分離しないように、１つ以上の部分が領域内の基板表面と安定して会合することを意味する。当該技術分野において既知の通り、１つ以上の部分は、その領域の表面に共有結合または非共有結合する場合がある。例えば、各領域は、基板が多孔性である場合には三次元に拡張する場合もあるが、基板が非多孔性である場合には実質的な三次元測定値（厚さ）を一切有することはない。アレイは、２０ｃｍ未満あるいは１０ｃｍ未満の領域に、１０超、１００超、１０００超、１万超のフィーチャー、あるいは１０万超のフィーチャーを含有する場合がある。例えば、フィーチャーは、約１０μｍ〜約１．０ｃｍの範囲内に幅（すなわち、円形スポットでは直径）を有する場合がある。他の実施形態では、各フィーチャーは、約１．０μｍ〜約１．０ｍｍ、例えば、約５．０μｍ〜約５００μｍなど、及び約１０μｍ〜約２００μｍを含む範囲内に幅を有する場合がある。非円形フィーチャーは、前述の幅（直径）範囲を有する円形フィーチャーの範囲と同等の領域範囲を有する場合がある。所与のフィーチャーは、所与のフィーチャーが特定の標的に対応するように、標的分子（例えば、標的核酸またはアプタマー）に結合する（例えば、ハイブリダイズする）化学部分、例えば、ペプチド核酸分子、ペプチド、核酸で構成される。
アレイの場合、「標的」は、様々な領域で基板に結合しているプローブ（「標的プローブ」）によって検出される、移動相（通常は流体）の部分として参照されることになる。しかしながら、「標的」または「標的プローブ」のいずれかが、他方によって検出されることになるものであってもよい。いくつかの実施形態では、標的は、オリゴヌクレオチドまたはアプタマーである。いくつかの実施形態では、プローブは、ペプチド核酸分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドまたはアプタマーである。
「生体試料」、「試料」、及び「試験試料」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、個体、及び環境、動物、または食品試料から得られる、またはさもなければそれらに由来する任意の材料、生体液、組織、または細胞を指す。これとしては、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿、及び血清を含む）、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、呼気、尿、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液（例えば、気管支肺胞洗浄液）、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、ならびに脳脊髄液が挙げられる。これとしては、前述の全ての実験的に分離された画分も挙げられる。例えば、血液試料は、血清、血漿に、または特定の種類の血球、例えば、赤血球もしくは白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））などを含有する画分に分画され得る。いくつかの実施形態では、試料は、個体からの試料の組合せ、例えば、組織及び液体試料の組合せなどであり得る。「生体試料」という用語は、例えば、糞便試料、組織試料、または組織生検などからのホモジナイズされた固体材料を含有する材料も含む。「生体試料」という用語は、組織培養または細胞培養に由来する材料も含む。生体試料を得るための任意の好適な方法が用いられ得、例示的な方法としては、例えば、静脈切開、スワブ（例えば、頬スワブ）、及び穿刺吸引細胞診手順が挙げられる。穿刺吸引が可能な例示的な組織としては、リンパ節、肺、肺洗浄液、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄液）、甲状腺、乳房、膵臓、及び肝臓が挙げられる。試料はまた、例えば、マイクロダイセクション（例えば、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）もしくはレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、塗抹（例えば、ＰＡＰ塗抹）、または管洗浄によって収集され得る。個体から得られる、または個体に由来する「生体試料」としては、個体から得られた後に任意の好適な方法で処理されている任意のそのような試料が挙げられる。
「固体支持体の表面に結合したオリゴヌクレオチド」または「固体支持体に結合したプローブ」または「固体支持体に結合した標的」という語句は、固体基板の表面上に固定化されたペプチド核酸分子、オリゴヌクレオチド、アプタマー、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（ロックド核酸）またはＵＮＡ（アンロックド核酸）分子を指し、基板は様々な構成、例えば、シート、ビーズ、粒子、スライド、ウエハ、ウェブ、ファイバー、チューブ、キャピラリー、マイクロ流体チャネルもしくはリザーバ、または他の構造を有し得る。ある特定の実施形態では、本明細書で用いられるオリゴヌクレオチドまたは標的要素の収集物は、例えば、アレイの形態で、同じ平面支持体の表面上に存在する。「プローブ」及び「標的」という用語は相対的な用語であり、ある特定のアッセイでプローブと見なされる分子が、他のアッセイでは標的として機能する可能性があると理解されるべきである。基板または表面上へのオリゴヌクレオチドの固定化は、文献中で一般的に利用可能な周知の技術によって達成され得る。例えば、Ａ．Ｃ．Ｐｅａｓｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，９１：５０２２−５０２６（１９９４）、Ｚ．Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２２，５４５６−６５（１９９４）、及びＭ．Ｓｃｈｅｎａ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７０，４６７−７０（１９９５）を参照し、各々が参照によって本明細書に組み込まれる。
ポリヌクレオチドの合成の前述した化学は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：２８１−２８５，１９８５、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１０，１９８４、及び“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ”，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，ｐａｇｅｓ １００以下参照、米国特許第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第５，１５３，３１９号、同第５，８６９，６４３号、ＥＰ０２９４１９６、及び他の箇所で詳細に記載されている。ホスホラミダイト及び亜リン酸トリエステルアプローチが最も広く使用されているが、他のアプローチとしては、ホスホジエステルアプローチ、ホスホトリエステルアプローチ及びＨ−ホスホネートアプローチが挙げられる。基板は通常、最初に堆積したモノマーに結合するように機能化される。そのような結合部分を含む基板を機能化するための好適な技術は、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｍａｓｋｏｓ，Ｕ．ａｎｄ Ｅｌｄｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１３，１００７−１０１７，１９９２に記載されている。アレイ製作の場合、異なるモノマー及び活性剤は、完成したアレイの異なるフィーチャーが、異なる所望のバイオポリマー配列を有することになるように、任意の１サイクル中に基板上の異なるアドレスに堆積される場合がある。ポリヌクレオチドアレイのｉｎ ｓｉｔｕ製作の場合、１つ以上のさらなる中間ステップ、例えば、従来の酸化、キャッピング及び洗浄ステップなどが、各サイクルで必要となる場合がある（ここでも、これらのステップはフラッディング手順で実行されてよい）。
マルチプレックスアッセイ
溶液ベースの標的相互作用及び分離ステップにおける多重化アプタマーアッセイは、例えば、米国特許第７，８５５，０５４号及び同第７，９６４，３５６号ならびにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０４４７９２に記載されている。一実施形態では、マルチプレックスアッセイは、本明細書の実施例１に記載されている。
複数の標的タンパク質が複数の捕捉試薬によって測定されるマルチプレックスアッセイ形式では、異なる標的タンパク質の存在量の自然な変動によって、ある特定の標的タンパク質を測定するある特定の捕捉試薬の能力が制限され得る（例えば、高存在量の標的タンパク質がアッセイを飽和させ、低存在量の標的タンパク質を測定するアッセイの能力を妨害または低減させる可能性がある）。生体試料のこの変動に対処するために、アプタマー試薬は、生体試料中におけるそれらの各々のタンパク質標的の存在量に基づいて、少なくとも２つの異なる群（ＤＩＬ１の捕捉試薬及びＤＩＬ２の捕捉試薬）、好ましくは３つの異なる群（Ａ３−ＤＩＬ１の捕捉試薬、Ａ２−ＤＩＬ２の捕捉試薬及びＡ１−ＤＩＬ３の捕捉試薬）に分割されてよい。捕捉試薬群のＡ１、Ａ２及びＡ３の各々は、それぞれ異なるアプタマーのセットを有し、アプタマーは標的タンパク質に対して特異的親和性を有している。生体試料は、タンパク質標的の捕捉試薬によって検出されるそれらの相対濃度に基づいて、２つ（希釈液１またはＤＩＬ１及び希釈液２またはＤＩＬ２）、好ましくは３つの異なる希釈群（希釈液１またはＤＩＬ１、希釈液２またはＤＩＬ２及び希釈液３またはＤＩＬ３）に希釈され、個別の試験試料を作製する。したがって、生体試料は、高、中及び低存在量の標的タンパク質希釈群に希釈され、最も存在量の少ないタンパク質標的が最小希釈群で測定され、最も存在量の多いタンパク質標的が最大希釈群で測定される。捕捉試薬の各々の希釈群に対する捕捉試薬は、一緒にインキュベートされる（例えば、アプタマーのＡ３セットは、希釈液１またはＤＩＬ１の試験試料とインキュベートされ、アプタマーのＡ２セットは、希釈液２またはＤＩＬ２の試験試料とインキュベートされ、アプタマーのＡ１セットは、希釈液３またはＤＩＬ３の試験試料とインキュベートされる）。Ａ１、Ａ２及びＡ３のアプタマーの総数は、４，０００個、４，５００個、５，０００個以上のアプタマーであってよい。
図５は、生体試料の希釈セットの概要例、捕捉試薬の各々の希釈液に対応する捕捉試薬セット、ならびに２つのキャッチシステム（キャッチ−１及びキャッチ−２）の全体概要を提供する。３つの異なる希釈群を、生体試料のＺ％希釈液またはＤＩＬ３、生体試料のＹ％希釈液またはＤＩＬ２及び生体試料のＸ％希釈液またはＤＩＬ１を含む生体試料から作製してよく、ＺはＹよりも大きく、ＹはＸよりも大きい（またはＺはＹ希釈液よりも高い希釈液であり、Ｙ希釈液はＸ希釈液よりも高い希釈液である）。各希釈液は、特定のタンパク質セットに結合する対応する捕捉試薬のその特有のセット（ＤＩＬ１にはＡ３、ＤＩＬ２にはＡ２及びＤＩＬ３にはＡ１）を有する。
図４は、生体試料の希釈セットの概要例、捕捉試薬の各々の希釈液に対応する捕捉試薬セット、ならびに２つのキャッチシステム（キャッチ−１及びキャッチ−２）の全体概要を提供する。２つの異なる希釈群を、生体試料のＺ％希釈液またはＤＩＬ４及び生体試料のＸ％希釈液またはＤＩＬ１を含む生体試料から作製してよく、ＺはＸよりも大きい（またはＺは、Ｘ希釈液よりも高い希釈液である）。各希釈液は、特定のタンパク質セットに結合する対応する捕捉試薬のその特有のセット（ＤＩＬ１にはＡ３及びＤＩＬ４にはＡ１）を有する。
図７は、生体試料の希釈セットの概要例、捕捉試薬の各々の希釈液に対応する捕捉試薬セット、ならびに逐次的な２つのキャッチシステム（キャッチ−１及びキャッチ−２）の全体概要を提供する。３つの異なる希釈群を、生体試料のＺ％希釈液またはＤＩＬ３、生体試料のＹ％希釈液またはＤＩＬ２及び生体試料のＸ％希釈液またはＤＩＬ１を含む生体試料から作製してよく、ＺはＹよりも大きく、ＹはＸよりも大きい（またはＺはＹ希釈液よりも高い希釈液であり、Ｙ希釈液はＸ希釈液よりも高い希釈液である）。各希釈液は、特定のタンパク質セットに結合する対応する捕捉試薬のその特有のセット（ＤＩＬ１にはＡ３、ＤＩＬ２にはＡ２及びＤＩＬ３にはＡ１）を有する。
本開示は、試験試料中に存在する可能性がある１つ以上の標的分子（複数可）の定量化を目的としたアプタマー及び光アプタマーベースの多重化アッセイを実施する方法の改良について記載し、本明細書に記載される材料及び方法が、全体的なアッセイ性能を改善するために使用され得る限り、任意の好適な核酸検出方法を使用する最終検出を目的として、アプタマー（または光アプタマー）は、アプタマー−標的親和性複合体（または光アプタマー−標的共有結合複合体）から分離され得る。光アプタマーは、アプタマーがそれらの標的分子と共有結合または「光架橋」することを可能にする光反応性官能基を含むアプタマーである。
本明細書に記載される改良されたアプタマー及び光アプタマーベースの多重化アッセイは、アプタマー及び光アプタマー、例えば、表１に列挙される刊行物に記載されるそれらのアプタマー及び光アプタマーを含むが、これらに限定されないものを用いて実施され得る。
Figure 2021528646
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歴史的に、多重化プロテオミクスアプタマー親和性アッセイを含む、シングルプレックス及びマルチプレックスアプタマーベースのアッセイの実施から、２つの予期しない制限が生じた。最初に、アプタマー／アプタマー相互作用が、アッセイバックグラウンドの主な原因及びマルチプレックス能力に対する制限の可能性として同定された。第２に、試料マトリックス（主に血清及び血漿）が、ストレプトアビジン置換マトリックス上へのビオチン化アプタマーの固定化を阻害することが見出された。
アッセイの改良は、Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ（２０１０）５（１２）：ｅｌ５００５）に記載されている通り、媒体の誘電率を低下させるために、キャッチ−２ステップの洗浄緩衝液の一部に有機溶媒の使用を含んだ。これらの洗浄緩衝液の添加によって、アプタマーの隣接するホスホジエステル骨格の同電荷反発が効果的に強調され、それゆえバックグラウンドを引き起こす相互作用するアプタマーの解離を促進させた。
プロセスの別の改良は、アッセイのキャッチ−２ステップで使用される洗浄緩衝液の一部に有機溶媒を添加することを含み、これもアプタマーが相互作用する傾向に逆らうため、バックグラウンドを減少させてマルチプレックス能力を高める。しかしながら、その主な利点は、ストレプトアビジンマトリックスへのビオチン化アプタマー吸着のマトリックス依存的阻害を抑制することである。そのような阻害は、５％ｖ／ｖの血漿または血清でも容易に検出可能であり、有効なアッセイ濃度を５〜１０％の血漿または血清濃度に制限する。この制限により、同様にアッセイ感度が制限される。
多重化アッセイのさらに別の改良は、試験溶液とのインキュベーション（「キャッチ−０」と称される）前に、固体支持体マトリックス上にタグ付きアプタマーをあらかじめ固定化することを含む。次いで、試験溶液とのインキュベーションは、処理容器それ自体の中で、結合したアプタマーを用いて実施される。例示のみを目的として本明細書に記載されるように、ビオチン化アプタマーをストレプトアビジンビーズマトリックス上にあらかじめ固定化し、試験溶液とのインキュベーションを、ビーズ結合アプタマーを用いて実施した。このあらかじめ固定化するステップによって、アプタマーが相互作用する傾向を減少させる条件下での固定化が可能となり、さらにインキュベーション前の非常にストリンジェントな洗浄（塩基による、及びカオトロピック塩による）が可能となり、相互作用するアプタマーを破壊し、非常に強力なビオチン−ストレプトアビジン相互作用によって結合していない全てのアプタマーを除去する。これによって、アッセイを妨害するアプタマー「凝集塊」の数が減少し、この凝集塊は、ある検出可能な頻度でビオチン部分を保持しているか、またはアッセイ中でビオチン化される。照射によって、全てではないが大半の光切断可能なビオチン部分がアプタマーから切断される一方で、一部のアプタマーは、タンパク質の「タグ付け」を目的としたＮＨＳ−ビオチン処理によってビオチン化されることは注目に値する。キャッチ−２ステップで捕捉されたビオチン化アプタマーは、大量の光切断されたアプタマーと相互作用することによってバックグラウンドを作成し、次いで溶出時に遊離される。アプタマーパネルが別々に固定化され、次いでビーズ結合形態で組み合わされることで、アプタマーが相互作用して凝集する可能性がある条件を回避できる可能性があるため、あらかじめ固定化された形式は非常に高いマルチプレックス能力を支持する可能性があるという点にも留意すべきである。
したがって、あらかじめ固定化することによって、分析物溶液の存在下におけるアプタマー吸着の必要性が回避され、それゆえ、分析物溶液の阻害濃度をアッセイする場合であっても、定量的固定化を確実に行う。これによって、これまでに記載されているような（Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．（Ｄｅｃ．２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５（１２）：ｅｌ５００５）、プロセスの１０％最高濃度またはプロセスのより最近の版で使用される５％最高濃度ではなく、最大かつ少なくとも４０％ｖ／ｖの血漿または血清を含む、はるかに高い濃度の使用が可能となり、それによって感度がおよそ４〜８倍に増加することに加えて、アッセイの全体的な頑健性を向上させる。
プロセス全体の別の改良は、以下で詳細に記載されるように、キャッチ−２ステップ中の溶出のためにほぼ中性ｐＨでカオトロピック塩を使用することを含む。以前の方法は、高ｐＨ（１０）で塩化ナトリウムを使用することを含んでいて、これはＤＮＡハイブリダイゼーション及びアプタマー／アプタマー相互作用に加えて、タンパク質／アプタマー相互作用を妨害する。上述の通り、ＤＮＡハイブリダイゼーション及びアプタマー／アプタマー相互作用は、アッセイバックグラウンドの一因となる。カオトロピック塩、例えば、中性ｐＨの過塩素酸ナトリウム、塩化リチウム、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムを含むが、これらに限定されないものが、アプタマー／タンパク質相互作用を妨害しながら、ＤＮＡハイブリダイゼーション及びアプタマー／アプタマー相互作用を支持する。最終的な結果は、バックグラウンドの大幅な減少（約１０倍）と、それに伴うアッセイ感度の上昇である。
本明細書で使用される場合、「キャッチ−１」は、アプタマー−標的親和性複合体またはアプタマー−標的共有結合複合体の分割を指す。キャッチ−１の目的は、アプタマーと会合しない、試験試料中における成分の実質的に全てを除去することである。そのような成分の大部分を除去すると、一般にキャッチ−２捕捉に使用される標的タグ付けステップから非標的分子を除去することによって、標的タグ付け効率が向上することになり、アッセイバックグラウンドの低下につながる可能性がある。一実施形態では、タグは、アッセイ前、アッセイの準備中、またはアッセイ中のいずれかでタグをアプタマーに付加することによってアプタマーに結合される。一実施形態では、タグは遊離可能なタグである。一実施形態では、遊離可能なタグは、切断可能なリンカー及びタグを含む。上記の通り、タグ付きアプタマーは、固体支持体上に捕捉され得、固体支持体はタグに適した捕捉要素を含む。次いで、固体支持体は、試験試料と平衡化する前に本明細書に記載されるように洗浄され、不必要な物質を全て除去し得る（キャッチ−０）。
本明細書で使用される場合、「キャッチ−２」は、標的分子の捕捉に基づく、アプタマー−標的親和性複合体またはアプタマー−標的共有結合複合体の分割を指す。キャッチ−２ステップの目的は、検出及び任意の定量化前に、試験試料から遊離、または非複合化アプタマーを除去することである。試料から遊離アプタマーを除去すると、任意の好適な核酸検出技術によるアプタマー−標的親和性またはアプタマー−標的共有結合複合体の検出が可能となる。検出及び任意の定量化にＱ−ＰＣＲを使用する場合、標的分子の正確な検出及び定量化のために遊離アプタマーの除去が必要である。
一実施形態では、標的分子はタンパク質またはペプチドであり、遊離アプタマーは、タンパク質（及びペプチド）に組み込まれ得る試薬ならびにタンパク質（またはペプチド）を含む複合体、例えば、アプタマー−標的親和性（または共有結合）複合体などを使用して、アプタマー−標的親和性（または共有結合）複合体（及び試験試料の残部）から分割される。タグ付きタンパク質（またはペプチド）及びアプタマー−標的親和性（または共有結合）複合体は、固体支持体上に固定化されて、遊離アプタマーからのタンパク質（またはペプチド）及びアプタマー−標的親和性（または共有結合）複合体の分割を可能にし得る。そのようなタグ付けとしては、例えば、タンパク質またはペプチドに組み込まれ得るビオチン部分が挙げられ得る。
一実施形態では、キャッチ−２タグは、アッセイ前、アッセイの準備中、またはアッセイ中のいずれかでタグを標的に化学的に結合させることによって、タンパク質（またはペプチド）に結合される。一実施形態では、キャッチ−２タグは遊離可能なタグである。一実施形態では、遊離可能なタグは、切断可能なリンカー及びタグを含む。しかしながら、一般にキャッチ−２固体支持体からタンパク質（またはペプチド）を遊離させる必要はない。上記の通り、タグ付き標的は、第２固体支持体上に捕捉され得、固体支持体は標的タグに適した捕捉要素を含む。次いで、固体支持体は、有機溶媒を含む緩衝溶液ならびに塩及び／または塩を含有する界面活性剤及び／または界面活性剤を含む緩衝溶液を含む、様々な緩衝溶液で洗浄される。
第２固体支持体を洗浄した後、次いで、アプタマー−標的親和性複合体は、複合体が破壊されて遊離アプタマーを生成する解離ステップに供される一方で、標的分子は一般に、捕捉要素と標的捕捉タグとの結合相互作用によって固体支持体に結合したままである。アプタマーは、アプタマーまたは標的のいずれかの構造を破壊する任意の方法によって、アプタマー−標的親和性複合体から遊離され得る。これは、非共有結合アプタマー−標的複合体を解離させる高塩緩衝液中で、支持体結合アプタマー−標的親和性複合体を洗浄することによって達成される可能性がある。溶出した遊離アプタマーは収集かつ検出される。別の実施形態では、高または低ｐＨがアプタマー−標的親和性複合体を破壊するために使用される。別の実施形態では、高温がアプタマー−標的親和性複合体を解離させるために使用される。別の実施形態では、上記方法のいずれかの組合せが使用されてよい。別の実施形態では、アプタマー−標的親和性複合体のタンパク質部分のタンパク質分解消化が、アプタマー成分を遊離させるために使用される。
アプタマー−標的共有結合複合体の場合、後続の定量化を目的としたアプタマーの遊離は、アプタマー構築物中の切断可能なリンカーを使用して達成される。別の実施形態では、標的タグ中の切断可能なリンカーは、アプタマー−標的共有結合複合体の遊離をもたらすことになる。
例として、プロテオミクス親和性アッセイ（マルチプレックスアッセイ）は、以下の通りに実施されてよい：
キャッチ−０：１倍ＳＢ１７、Ｔｗ（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０２ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中の１３３の７．５％ストレプトアビジン−アガローススラリーを、フィルタープレート（０．４５μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＨＶプレート（Ｄｕｒａｐｏｒｅカタログ番号ＭＡＨＶＮ４５５０））のウェルに添加した。適切な１．１倍アプタマー混合物（全てのアプタマーが、５’末端にＣｙ３フルオロフォア及び光切断可能なビオチン部分を含有する）を解凍し、続いてボルテックスした。次いで、１．１倍アプタマー混合物を１０分間煮沸し、３０秒間ボルテックスして水浴中で２０分間、２０℃に冷却させた。次いで、ストレプトアビジンアガローススラリーを含有するフィルタープレート中の液体を、遠心分離（１０００×ｇで１分間）によって除去した。１００μＬのアプタマー混合物を、フィルタープレートのウェルに（ロボット制御で）添加した。混合物を、遮光して８５０ｒｐｍに設定したシェーカー上で、２５℃で２０分間インキュベートした。
キャッチ−０洗浄：２０分のインキュベーション後、溶液を真空濾過によって除去した。１９０の１倍ＣＡＰＳアプタマー予洗緩衝液（５０ｍＭ ＣＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗ−２０、ｐＨ１１．０）を添加し、混合物を振盪しながら１分間インキュベートした。次いで、ＣＡＰＳ洗浄液を真空濾過によって除去した。次いで、ＣＡＰＳ洗浄を１回繰り返した。１９０μＬの１倍ＳＸ１７−Ｔｗｅｅｎを添加し、混合物を振盪しながら１分間インキュベートした。次いで、１倍ＳＢ１７−Ｔｗｅｅｎを真空濾過によって除去した。さらに１９０μＬの１倍ＳＸ１７−Ｔｗを添加し、混合物を振盪しながら１分間インキュベートした。次いで、１倍ＳＢ１７−Ｔｗを遠心分離（１０００×ｇで１分）によって除去した。１倍ＳＢ１７、Ｔｗの除去後、１５０μＬのキャッチ−０保存緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％アジ化ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、フィルタープレートをプレートの外周部のみで慎重に密封し、使用するまで暗所において４℃で保存した。
試料調製：７５マイクロリットルの４０％試料希釈剤を、４０％試料プレートに入れた（最終４０％試料は、２０μＭ Ｚ−ブロック、１ｍＭベンズアミジン、１ｍＭ ＥＧＴＡ、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する）。１９５マイクロリットルの１倍ＳＢ１７−Ｔｗを１％試料プレートに入れた。９０マイクロリットルの１倍ＳＢ１７−Ｔｗを１：１０希釈プレートに入れた。１３３マイクロリットルの１倍ＳＢ１７−Ｔｗを０．００５％試料プレートに入れた。試料を、２５℃のインキュベーター内のＲａｃｋ Ｔｈａｗｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ上で１０分間解凍し、次いでボルテックスして１０００×ｇで１分間回転させた。キャップをチューブから取り外した。試料を混合し（５０μＬで５回）、５０μＬの１００％試料を、試料希釈剤を含有する４０％試料プレートに移した。次いで、４０％試料を、ピペットで吸引及び吐出すること（１１０μＬ、１０回）によって試料プレート上で混合した。次いで、５μＬの４０％試料を、１倍ＳＢ１７−Ｔｗを含有する１％試料プレートに移した。この試料を、ピペットで吸引及び吐出すること（１２０μＬ、１０回）によって再び混合した。混合した後、１０μＬの１％試料を、１倍ＳＢ１７−Ｔｗを含有する１：１０希釈プレートに移し、これをピペットで吸引及び吐出すること（７５μＬ、１０回）によって混合した。１：１０希釈プレートからの７マイクロリットルの０．１％試料を、１倍ＳＢ１７−Ｔｗを含有する０．００５％試料プレートに移し、ピペットで吸引及び吐出すること（１１０μＬ、１０回）によって混合した。
インキュベーション前のプレート調製：キャッチ−０保存溶液を、真空濾過によってフィルタープレートから除去した。次いで、１９０マイクロリットルの１倍ＳＢ１７−Ｔｗを添加し、続いて真空濾過によってフィルタープレートから除去した。次いで、さらに１９０μＬの１倍ＳＢ１７−Ｔｗをフィルタープレートに添加した。
インキュベーション：１倍ＳＢ１７−Ｔｗ緩衝液を、遠心分離（１０００×ｇで１分間）によってフィルタープレートから除去した。１００マイクロリットルの適切な試料希釈液をフィルタープレート（３つのフィルタープレート、すなわち、４０％もしくは２０％、１％、または０．００５％の各試料希釈液に１つ）に添加した。フィルタープレートをプレートの外周部のみで慎重に密封し、ウェルへの加圧を回避した。圧力は、インキュベーション中に漏出を引き起こすことになる。次いで、プレートを、遮光して８５０ｒｐｍに設定したサーモシェーカー上で、２８℃で３．５時間インキュベートした。
フィルタープレートの処理：インキュベーション後、フィルタープレートを真空マニホールド上に置き、試料を真空濾過によって除去した。１９０マイクロリットルのビオチン洗浄液（１倍ＳＢ１７−Ｔｗ中１００μＭのビオチン）を添加し、液体を真空濾過によって除去した。次いで、試料を１９０μＬの１倍ＳＢ１７−Ｔｗで５回洗浄した（真空濾過）。１倍ＳＢ１７−Ｔｗ中の１００マイクロリットルの１ｍＭ ＮＨＳ−ビオチン（新たに調製した）を添加し、フィルタープレートを吸収パッド上で吸着させ、混合物を振盪しながら５分間インキュベートした。液体を真空濾過によって除去した。１倍ＳＢ１７−Ｔｗ中の１２５マイクロリットルの２０ｍＭグリシンを添加し、液体を真空濾過によって除去した。再度、１倍ＳＢ１７−Ｔｗ中の１２５μＬの２０ｍＭグリシンを添加し、液体を真空濾過によって除去した。
続いて、試料を１９０μＬの１倍ＳＢ１７−Ｔｗで６回洗浄し、液体を真空濾過によって除去した。次いで、８５マイクロリットルの光切断緩衝液（１倍ＳＢ１７−Ｔｗ中２μＭのＺ−ブロック）をフィルタープレートの各々に添加した。
光切断：フィルタープレートを吸収パッド上で吸着させ、振盪しながら（８００ｒｐｍ、２５℃）ＢｌａｃｋＲａｙ ＵＶランプで６分間照射した。プレートを１８０度回転させ、ＢｌａｃｋＲａｙ光源下でさらに６分間照射した。４０％フィルタープレートを、空の９６ウェルプレート上に置いた。１％フィルタープレートを４０％フィルタープレートの上に重ねて、０．００５％フィルタープレートを１％フィルタープレートの上に重ねた。プレートのアセンブリを１０００×ｇで１分間回転させた。溶出した試料を含む９６ウェルプレートを、ロボットデッキ上に置いた。３７℃のインキュベーターから、１倍ＳＢ１７−Ｔｗ中の６０パーセントグリセロールをロボットデッキ上に置いた。
キャッチ−２：アッセイの設定中、５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＭｙＯｎｅ ＳＡビーズ（５００μｇ）を、キャッチ−２のためにＡＢｇｅｎｅ Ｏｍｎｉチューブの９６ウェルプレートに添加し、Ｃｙｔｏｍａｔ内に置いた。キャッチ−２の９６ウェルビーズプレートを９０秒間懸濁させて磁石ブロック上に６０秒間置き、上清を除去した。同時に、または順に、各希釈群からのキャッチ−１溶出液をキャッチ−２ビーズプレートに移し、ペルチェサーモシェーカー上でインキュベートした（１３５０ｒｐｍ、５分、２５℃）。プレートを２５℃の磁石に２分間移し、上清を除去した。次に、７５μＬの１倍ＳＢ１７−Ｔｗを添加し、試料をペルチェシェーカー上において１３５０ｒｐｍ、３７℃で１分間インキュベートした。次いで、１倍ＳＢ１７−Ｔｗ中の７５μＬの６０％グリセロール（３７℃に加熱）を添加し、試料を再度、ペルチェシェーカー上において１３５０ｒｐｍ、３７℃で１分間インキュベートした。プレートを３７℃に加熱した磁石に移して２分間インキュベートし、続いて上清を除去した。この３７℃の１倍ＳＢ１７−Ｔｗ及びグリセロール洗浄サイクルを、さらに２回繰り返した。次いで、試料を、ペルチェシェーカー上（１３５０ｒｐｍ、１分、２５℃）で１５０μＬの１倍ＳＢ１７−Ｔｗを用いて残ったグリセロールを除去するために洗浄し、続いて１分間２５℃の磁気ブロック上に置いた。上清を除去し、０．５Ｍ ＮａＣｌで置換した１５０μＬの１倍ＳＢ１７−Ｔｗを添加し、１３５０ｒｐｍで１分間インキュベートして（２５℃）、続いて１分間２５℃の磁気ブロック上に置いた。上清を除去し、７５μＬの過塩素酸塩溶出緩衝液（１．８Ｍ ＮａＣｌＣ−４、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１倍ハイブリダイゼーション対照、ｐＨ＝６．８）を添加し、続いてペルチェシェーカー上で１０分間インキュベートした（２５℃、１３５０ｒｐｍ）。その後、プレートを磁気分離機に移し、９０秒間インキュベートして上清を回収した。
ハイブリダイゼーション：２０マイクロリットルの溶出した試料を、空の９６ウェルプレートにロボット制御で添加した。ハイブリダイゼーション対照の第２セットを含有する５マイクロリットルの１０倍Ａｇｉｌｅｎｔブロッキング緩衝液を、溶出した試料にロボット制御で添加した。次いで、２５μＬの２倍Ａｇｉｌｅｎｔ ＨｉＲＰＭハイブリダイゼーション緩衝液を、手作業でウェルに添加した。４０マイクロリットルのハイブリダイゼーション混合物を、Ａｇｉｌｅｎｔガスケットスライド上に載せた。Ａｇｉｌｅｎｔの８×１５ｋアレイをガスケットスライド上に添加し、サンドイッチしたものをクランプで締め付けた。次いで、サンドイッチしたものを回転させながら（２０ｒｐｍ）５５℃で１９時間インキュベートした。
ハイブリダイゼーション後の洗浄：ハイブリダイゼーション後のスライド処理を、Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（ＳｃｉＧｅｎｅ、カタログ番号１０８０−４０−１）上で実施した。およそ７５０ｍＬの洗浄緩衝液１（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈｌＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１つのガラス製染色皿に入れた。およそ７５０ｍＬの洗浄緩衝液１（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈｌＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒの槽１に入れた。３７℃に加熱したおよそ７５０ｍＬの洗浄緩衝液２（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈｌＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒの槽２に入れた。両方の槽の磁気攪拌速度を５に設定した。槽１の温度調節器は作動させなかったが、槽２の温度調節器を３７℃に設定した。最大１２個のスライド／ガスケットアセンブリを、洗浄緩衝液１を含有する第１染色皿内で順に分解し、依然として洗浄緩衝液１に浸漬した状態のスライドをスライドラック内に入れた。全てのスライド／ガスケットアセンブリを分解したら、スライドラックをＬｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒの槽１に迅速に移して、自動洗浄プロトコールを開始した。Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒによって、槽１内でスライドが２５０の速度で３００秒間インキュベートされ、続いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｗａｓｈ ２（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈｌＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する３７℃の槽２に移し、速度１００で３００秒間インキュベートした。その後、Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒは、内蔵の遠心分離機にスライドラックを移し、スライドを速度６９０で３００秒間回転させた。
マイクロアレイイメージング：マイクロアレイスライドを、５μｍ解像度、１００％ＰＭＴ設定でＣｙ３チャネルにおいてマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＣＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてイメージングし、ＸＲＤオプションを０．０５で有効にした。得られたｔｉｆｆ画像を、ＧＥ１＿１０７＿Ｓｅｐ０９プロトコールを用いたＡｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアバージョン１０．７．３．１を使用して処理した。
本明細書で使用される場合、「遊離可能な」または「切断可能な」要素、部分、またはリンカーは、破壊されて２つの別個の成分を生成し得る分子構造を指す。遊離可能な（もしくは切断可能な）要素は、化学結合が切断され得る単一分子を含んでよいか（本明細書では「インライン切断可能なリンカー」と称される）、またはその要素は、非共有結合性相互作用が切断もしくは破壊され得る２つ以上の分子を含んでよい（本明細書では「ハイブリダイゼーションリンカー」と称される）。
いくつかの実施形態では、個々の官能基との干渉を防ぐために、ある特定の官能基を他の官能基から空間的に分離する必要がある。例えば、光切断可能な基に最も近い標識の存在は、ある特定の光の波長を吸収し、光切断の効率を妨げ得る。したがって、そのような基を、例えば、光切断の完全な活性を回復させるのに十分な空間的分離を提供する非干渉部分を用いて分離させることが望ましい。いくつかの実施形態では、「スペーシングリンカー」が、標識及び光切断機能の両方を有するアプタマーに導入されている。
「固体支持体」は、分子が共有結合または非共有結合のいずれかによって、直接的または間接的に結合される可能性がある表面を有する任意の基板を指す。固体支持体は、表面に結合されている捕捉要素またはプローブに物理的支持を提供できる任意の基板材料を含んでよい。材料は、一般に捕捉要素またはプローブの表面への結合及びアッセイの実施中に直面する任意の後続の処置、取扱い、または処理に関連する条件に耐えることができる。材料は、天然に存在するもの、合成のもの、または天然に存在する材料を改変したものであってよい。好適な固体支持材料としては、シリコン、シリコンウエハチップ、グラファイト、鏡面、積層体、膜、セラミック、プラスチック（ポリマー、例えば、ポリ（塩化ビニル）、シクロ−オレフィンコポリマー、アガロースゲルまたはビーズ、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはＴｅｆｌｏｎ（登録商標））、ナイロン、ポリ（酪酸ビニル）などを含む）、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、金、銀、Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、フロースルーチップなどが挙げられ、単独で、または他の材料と組み合わせるかのいずれかで使用されてよい。追加の硬質材料、例えば、ガラスなどが考慮されてよく、これはシリカを含み、さらに例えば、バイオガラスとして入手可能なガラスを含む。用いられてもよい他の材料としては、例えば、コントロールドポアガラスビーズ、架橋ビーズＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）もしくはアガロース樹脂、または架橋ビス−アクリルアミドとアザラクトンとのコポリマーなどの多孔質材料が挙げられる。他のビーズとしては、ナノ粒子、ポリマービーズ、固体コアビーズ、常磁性ビーズ、またはマイクロビーズが挙げられる。例えば、材料の表面上に組み込まれた１つ以上の官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基のいずれかなどを有することができる当該技術分野において既知の任意の他の材料も企図される。
固体支持体に使用される材料は、単純なものから複雑なものにまでわたる様々な構成のいずれかを取る場合がある。固体支持体は、ストリップ、プレート、ディスク、ロッド、粒子、ビーズ、チューブ、ウェル（マイクロタイター）などを含む、多数の形状のうちのいずれか１つを有し得る。固体支持体は、多孔質または非多孔質、磁性、常磁性、または非磁性、多分散または単分散、親水性または疎水性であってよい。固体支持体はまた、密に充填された（カラムマトリックスにおけるような）または緩やかに充填された粒子のゲルまたはスラリーの形態であってもよい。
一実施形態では、捕捉要素が結合している固体支持体が、試験混合物からタグ付きアプタマー−標的親和性複合体またはアプタマー−標的共有結合複合体を捕捉するために使用される。１つの特定の例では、タグがビオチン部分である場合、固体支持体は、ストレプトアビジンコーティングビーズまたは樹脂、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２７０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）、ストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂、ＭａｇｎａＢｉｎｄストレプトアビジンビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＢｉｏＭａｇストレプトアビジン、ＰｒｏＭａｇストレプトアビジン、シリカストレプトアビジン（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ストレプトアビジンセファロースＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、
ストレプトアビジンポリスチレンミクロスフェア（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ−Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ）、ストレプトアビジンコーティングポリスチレン粒子（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ）、またはビオチンタグ付き分子を捕捉するために当業者が一般的に使用する任意の他のストレプトアビジンコーティングビーズもしくは樹脂などであり得る。
上記に記載されている通り、本発明の１つの目的は、タンパク質シグナルをアプタマーシグナルに変換することである。結果として、収集／検出されるアプタマーの量は、結合した標的分子の量及び試料中の標的分子の量を示し、かつそれらに正比例する可能性がある。多数の検出スキームが、キャッチ−２分割後に第２固体支持体からアプタマー−標的親和性またはアプタマー−標的共有結合複合体を溶出させることなく、用いられ得る。以下の検出方法の実施形態に加えて、他の検出方法が当業者に既知となる。
多くの検出方法は、検出前にアプタマー中に組み込まれる明示的な標識を必要とする。これらの実施形態では、標識、例えば、蛍光色素または化学発光色素などが、核酸合成のための標準的な技術を使用して、合成中または合成後のいずれかでアプタマー中に組み込まれ得る。放射性標識は、適切な試薬との標準的な酵素反応を使用して、合成中または合成後のいずれかで組み込まれ得る。標識化はまた、好適な酵素技術を使用することによって、キャッチ−２分割及び溶出後に行われ得る。例えば、上述した標識を有するプライマーを使用し、ＰＣＲによって、溶出したアプタマーの増幅産物中に標識が組み込まれることになる。定量化のためにゲル技術を使用する場合、異なるサイズの質量標識が同様にＰＣＲを使用して組み込まれ得る。これらの質量標識はまた、さらなるマルチプレックス能力のために、異なる蛍光色素または化学発光色素も組み込み得る。標識は、合成中または合成後のいずれかにアプタマー中に組み込まれる特異的タグを使用し、次いでタグと会合し、かつ標識を保持するプローブを付加することによって、間接的にアプタマーに付加されてよい。標識は、上記に記載されるものに加えて、例えば、比色分析読取りのための標準的アッセイに使用される酵素を含む。これらの酵素は、酵素基質と組み合わされて作用し、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素を含む。標識は、電気化学的検出のための電気化学的官能基である物質または化合物も含んでよい。
例えば、アプタマーは、試験試料を接触させる前に、上記の通りに３２Ｐなどの放射性同位体で標識されてよい。４つの基本的アッセイ、及び上述したようなその変更形態のうちいずれか１つを用いて、アプタマー検出は、アッセイの終了時に第２固体支持体上の放射能を定量化することによって容易に達成されてよい。放射能の数値は、元の試験試料中における標的の量に正比例することになる。同様に、試験試料を接触させる前に、上記の通りに蛍光色素を有するアプタマーを標識化することによって、第２固体支持体上での直接の簡単な蛍光読取りが可能となる。同様に、化学発光標識または量子ドットが、アプタマーの溶出を必要とすることなく、第２固体支持体からの直接的な読取りに用いられ得る。
第２固体支持体からアプタマーを溶出させること、または光アプタマー−標的共有結合複合体を遊離させることによって、追加の検出スキームが、上記に記載されるものに加えて用いられ得る。例えば、遊離したアプタマー、光アプタマーまたは光アプタマー−標的共有結合複合体を、ＰＡＧＥゲル上で泳動させて検出し、場合により、ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄなどの核酸染料によって定量化し得る。あるいは、遊離したアプタマー、光アプタマーまたは光アプタマー共有結合複合体は、上記の通りにアプタマーに組み込まれた蛍光標識を使用するキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用して検出かつ定量化され得る。別の検出スキームは定量ＰＣＲを用いて、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを使用し、溶出したアプタマーを検出かつ定量化する。あるいは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）ＤＮＡアッセイが、溶出したアプタマーを検出かつ定量化するために用いられてよい。別の代替の検出スキームは、次世代シーケンシングを用いる。
別の実施形態では、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）の量または濃度は、複製プロセス中に「分子ビーコン」を使用して決定される（例えば、Ｔｙａｇｉ ｅｔ ａｈ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｊ＿６：４９ ５３，１９９８、米国特許第５，９２５，５１７号を参照のこと）。分子ビーコンとは、折り畳まれてヘアピンループとなり、ヘアピンが形成される時にフルオロフォアによってシグナルがほとんどまたは全く生成されないように、ヘアピン構造の一方の端にフルオロフォア及び他方の端にクエンチャーを含有する特異的核酸プローブである。ループ配列は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的であり、アプタマー配列にハイブリダイズすると、ヘアピンの折り畳み構造がほどけ、それによって蛍光シグナルを生成する。
第２固体支持体に依然として結合している少数のアプタマーの多重化検出のために、異なる励起／発光スペクトルを有する蛍光色素が、２個、または３個、または５個、または最大で１０個の個々のアプタマーを検出かつ定量化するために用いられ得る。
同様に、異なるサイズの量子ドットが、多重化読取りのために用いられ得る。量子ドットは、第２固体支持体から遊離アプタマーを分割した後で導入され得る。特有の量子ドットに結合したアプタマー特異的ハイブリダイゼーション配列を使用することによって、２個、３個、５個、及び最大で１０個のアプタマーの多重化読取りが実施され得る。個々に検出され得る異なる放射性同位体、例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１１３ＪＣ、及び３Ｊ５ＪＳなどを有する異なるアプタマーの標識化も、限定的なマルチプレックス読取りに使用され得る。
キャッチ−２の第２固体支持体から遊離されるアプタマーの多重化検出のために、上記の通りに各アプタマー中に組み込まれる単一の蛍光色素が、アプタマーレベルの定量化と共にアプタマー配列の同定を可能にする定量化方法と合わせて使用され得る。方法としては、ＤＮＡチップハイブリダイゼーション、マイクロビーズハイブリダイゼーション、次世代シーケンシング及びＣＧＥ分析が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、標準的なＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、またはチップが、スライドまたはチップ、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔアレイ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＢｅａｄＣｈｉｐアレイ、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎアレイまたはカスタムプリントしたアレイなどに固定化された特有のプローブまたは一連の特有のプローブに各アプタマーまたは光アプタマーをハイブリダイズさせるために使用される。特有の各プローブは、アプタマー上の配列に相補的である。相補配列は、アプタマー、またはアプタマー配列の一部、または全アプタマー配列中に組み込まれる特有のハイブリダイゼーションタグであってよい。キャッチ−２の固体支持体から遊離されたアプタマーは、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加され、標準的なハイブリダイゼーション法を使用して処理される。例えば、アプタマー溶液をＤＮＡハイブリダイゼーションアレイと共に約６０℃で１２時間インキュベートし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確保する。アレイを洗浄し、次いで蛍光スライドスキャナーで走査して、アレイの各フィーチャーについてアプタマーハイブリダイゼーション強度の画像を生成する。画像のセグメント化及び定量化は、ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎなどの画像処理ソフトウェアを使用して達成される。一実施形態では、多重化アプタマーアッセイは、最大２５個のアプタマー、最大５０個のアプタマー、最大１００個のアプタマー、最大２００個のアプタマー、最大５００個のアプタマー、最大１０００個のアプタマー、及び最大１０，０００個のアプタマーを使用して検出され得る。
一実施形態では、上記のようなアプタマーに相補的な特有のＤＮＡプローブを有するアドレス可能なマイクロビーズが、ハイブリダイゼーションに使用される。マイクロビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ技術などの特有の蛍光色素を用いてアドレス可能であってよいか、またはＩｌｌｕｍｉｎａ ＶｅｒａＣｏｄｅ技術におけるようなバーコード標識、もしくはレーザー出力トランスポンダーを使用してよい。一実施形態では、キャッチ−２の固体支持体から遊離されたアプタマーは、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加され、標準的なマイクロビーズハイブリダイゼーション法を使用して処理される。例えば、アプタマー溶液をマイクロビーズのセットと共に約６０℃で２時間インキュベートし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確保する。次いで、溶液を、個々のビーズタイプを計数し、アプタマー蛍光シグナルを定量化するＬｕｍｉｎｅｘ機器上で処理する。別の実施形態では、ＶｅｒａＣｏｄｅビーズをアプタマー溶液と接触させて約６０℃で２時間ハイブリダイズし、次いでグリッド入りの表面上に堆積させて、同定及び蛍光定量化のためにスライドスキャナーを使用して走査する。別の実施形態では、トランスポンダーマイクロビーズをアプタマー試料と共に約６０℃でインキュベートし、次いでトランスポンダーマイクロビーズに適切なデバイスを使用して定量化する。一実施形態では、マルチプレックスアプタマーアッセイは、最大２５個のアプタマー、最大５０個のアプタマー、最大１００個のアプタマー、最大２００個のアプタマー、及び最大５００個のアプタマーを使用して、マイクロビーズへのハイブリダイゼーションによって検出され得る。
溶出したアプタマーを含有する試料を、上記のような蛍光標識と共に特有の質量タグを組み込むように処理できる。次いで、質量標識アプタマーを、本質的にはＤＮＡシーケンサーであるＣＧＥ機器に注入し、アプタマーをそれらの特有の質量によって同定して、標識反応中に組み込まれた色素からの蛍光を使用して定量化する。この技術の１つの例示的な例は、Ａｌｔｈｅａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって開発されている。
上記に記載される方法の多くでは、アプタマーの溶液は増幅され、場合により定量化前にタグ付けされ得る。標準的なＰＣＲ増幅が、キャッチ−２の固体支持体から溶出したアプタマーの溶液と共に使用され得る。そのような増幅は、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション、マイクロビーズハイブリダイゼーション、及びＣＧＥ読取りの前に使用され得る。
別の実施形態では、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）は、Ｑ−ＰＣＲを使用して検出及び／または定量化される。本明細書で使用される場合、「Ｑ−ＰＣＲ」は、アッセイの結果が定量的である、すなわち、アッセイが、試験試料中に存在するアプタマーの量または濃度を定量化できるような方法で、かつそのような制御条件下で実施されるＰＣＲ反応を指す。
一実施形態では、試験試料中のアプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）の量または濃度は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを使用して決定される。この技術は一般に、標的配列からシグナルを生成させるために、オリゴヌクレオチド複製酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。ＴａｑＭａｎプローブは、定量化されるアプタマーの配列に基づいて選択され、５’末端フルオロフォア、例えば、６−カルボキシフルオレセインなど、及び３’末端クエンチャー、例えば、６−カルボキシテトラメチルフルオレセインなどを一般に含み、アプタマー配列がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅される場合にシグナルを生成する。ポリメラーゼがアプタマー配列をコピーする場合、ＰＣＲプライマーの下流にアニーリングされたプローブからエキソヌクレアーゼ活性によってフルオロフォアが遊離され、それによってシグナルを生成する。シグナルは、複製産物が生成されると増加する。ＰＣＲ産物の量は、実施される複製サイクルの回数に加えて、アプタマーの開始濃度の両方に依存する。
別の実施形態では、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）の量または濃度は、複製プロセス中にインターカレート蛍光色素を使用して決定される。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンなどのインターカレート色素は、一本鎖ＤＮＡの存在下で生成される蛍光シグナルと比較した場合、二本鎖ＤＮＡの存在下で多数の蛍光シグナルを生成する。二本鎖ＤＮＡ産物がＰＣＲ中に形成される場合、色素によって生成されるシグナルが増加する。生成されるシグナルの大きさは、ＰＣＲサイクル回数及びアプタマーの開始濃度の両方に依存する。
別の実施形態では、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）は、質量分析を使用して検出及び／または定量化される。特有の質量タグは、上記に記載される酵素技術を使用して導入され得る。質量分析読取りのために、検出標識は全く必要なく、むしろ質量自体が同定のために使用され、当業者によって一般的に使用される技術を使用し、質量分析法による分析中に生成される質量ピークの位置及びその下面積に基づいた定量化の両方が行われる。質量分析を使用する例は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍによって開発されたＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システムである。
コンピュータプログラムが、本明細書に開示される方法のいずれかのうち１つ以上のステップを実施するために利用されてよい。本開示の別の態様は、コンピュータプログラムが格納されたコンピュータ可読記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品であり、コンピュータに読み込まれると、本明細書に開示される方法のいずれかを実行するか、またはその実行を補助する。
本開示の一態様は、本明細書に開示される方法のいずれかの産物、すなわち、アッセイ結果であり、これは試験場所で評価されてよいか、または所望により、評価及び遠隔地の関係者に対する連絡のために別の場所に送られてもよい。本明細書で使用される場合、「遠隔地」は、結果が得られる場所とは物理的に異なる場所を指す。したがって、結果は、異なる部屋、異なる建物、都市の異なる地域、異なる都市などに送られてよい。データは、任意の好適な手段、例えば、ファクシミリ、郵便、翌日配達、ｅメール、ｆｔｐ、ボイスメールなどによって伝達されてよい。
情報を「通信する」とは、好適な通信チャネル（例えば、プライベートまたはパブリックネットワーク）を介した電気信号としてその情報を表すデータの伝達を指す。項目を「転送する」とは、その項目を物理的に輸送することによって、または別の手段によって（それが可能である場合）、その項目をある場所から次の場所に移動させる任意の手段を指し、少なくともデータの場合、データを保持する媒体またはデータを通信する媒体を物理的に輸送することを含む。
修飾ヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示は、アプタマーなどのオリゴヌクレオチドを提供し、これは異なる２種類の塩基修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、異なる２種類の５位修飾ピリミジンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣ５修飾シチジン及び少なくとも１つのＣ５修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つの異なるＣ５修飾シチジンを含む。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２つの異なるＣ５修飾ウリジンを含む。非限定的で例示的なＣ５修飾ウリジン及びシチジンは、例えば、図１に示されている。ある特定の非限定的で例示的なＣ５修飾ウリジンは図２に示され、ある特定の非限定的で例示的なＣ５修飾シチジンは、図３に示されている。
オリゴヌクレオチドの調製
オリゴデオキシヌクレオシドの自動合成は、多くの実験室で日常的に実施されている（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３：３１８５−３１９１を参照し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。オリゴリボヌクレオシドの合成も周知である（例えば、Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：５４３３−５４４１を参照し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。本明細書で述べられる通り、ホスホラミダイトは、化学合成によるオリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオシドの組込みに有用であり、三リン酸は、酵素合成によるオリゴヌクレオチドへの修飾ヌクレオシドの組込みに有用である。例えば、Ｖａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２６：１１２３１−１１２３７、Ｖａｕｇｈｔ，Ｊ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３２，４１４１−４１５１、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”（１９８４）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（２００５）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．を参照のこと（その各々の全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
「標的」または「標的分子」または「標的」は、本明細書では、核酸が所望の、または目的の方法で作用し得る任意の化合物を指す。標的分子は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、成長因子、細胞、組織、前述したいずれかの任意の部分または断片などであり得るが、これらに限定されない。実質的に、あらゆる化学的または生物学的エフェクターが好適な標的であってよい。任意のサイズの分子が標的として機能し得る。標的はまた、標的と核酸との間における相互作用の可能性または強度を高めるために、ある特定の方法で改変され得る。標的はまた、特定の化合物または分子の任意のわずかな変化、例えば、タンパク質の場合、アミノ酸配列のわずかな変化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、分子の同一性を実質的に変化させない標識化成分との複合化などを含み得る。「標的分子」または「標的」は、アプタマーに結合できる分子または多分子構造の１種類または１種のコピーセットである。「標的分子」または「標的」は、そのような分子の２つ以上のセットを指す。標的がペプチドであるＳＥＬＥＸプロセスの実施形態は、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＳＥＬＥＸ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ」と題した米国特許第６，３７６，１９０号に記載されている。いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。
本明細書で使用される場合、「競合分子」及び「競合物」は交換可能に使用され、非標的分子と非特異的複合体を形成し得る任意の分子を指す。この文脈において、非標的分子は遊離アプタマーを含み、例えば、アプタマーが別の非標的分子に非特異的に結合（再結合）するのを阻害するために競合物が使用され得る。「競合分子」または「競合物」は、分子の１種類または１種のコピーセットである。「競合分子」または「競合物」は、そのような分子の２つ以上のセットを指す。競合分子としては、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン（例えば、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、デキストラン硫酸、ポリデキストラン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、及びピロリン酸塩）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、１つ以上の競合物の組合せが使用され得る。
本明細書で使用される場合、「非特異的複合体」は、アプタマー及びその標的分子以外の２つ以上の分子間における非共有会合を指す。非特異的複合体は、分子のクラス間の相互作用を表す。非特異的複合体は、アプタマーと非標的分子、競合物と非標的分子、競合物と標的分子、及び標的分子と非標的分子との間で形成される複合体を含む。
別の実施形態では、ポリアニオン競合物（例えば、デキストラン硫酸または別のポリアニオン材料）が、ポリアニオンの存在に難分解性であるアプタマーの同定を容易にするために、遅いオフレート濃縮プロセスで使用される。この文脈において、「ポリアニオン難分解性アプタマー」は、非ポリアニオン難分解性アプタマーを含むアプタマー／標的複合体よりも、ポリアニオン難分解性材料も含有する溶液中で解離する可能性が低いアプタマー／標的複合体を形成できるアプタマーである。このようにして、ポリアニオン難分解性アプタマーは、試料中における標的の存在または量または濃度を検出するための分析方法の実施に使用され得、その検出方法は、アプタマーが難分解性であるポリアニオン材料（例えば、デキストラン硫酸）の使用を含む。
したがって、一実施形態では、ポリアニオン難分解性アプタマーを作製する方法が提供される。本実施形態では、核酸の候補混合物を標的と接触させた後、候補混合物中の標的及び核酸を平衡状態にさせる。ポリアニオン競合物を導入し、候補混合物中の高速オフレートアプタマーのほとんどが標的分子から確実に解離するのに十分な時間で、溶液中においてインキュベートさせる。また、ポリアニオン競合物の存在下で解離する可能性のある候補混合物中のアプタマーは、標的分子から遊離されることになる。混合物を分割して、標的分子と会合したままである高親和性の遅いオフレートアプタマーを単離し、溶液から非複合化材料を全て除去する。次いで、アプタマーを標的分子から遊離させて単離することができる。単離したアプタマーの増幅も行い、選択の追加ラウンドを適用して、選択したアプタマーの全体的な性能を高めることもできる。このプロセスは、遅いオフレートアプタマーの選択が特定の用途に必要でない場合、最小限のインキュベーション時間で使用されてもよい。
塩
化合物の対応する塩、例えば、薬学的に許容される塩を調製、精製、及び／または取り扱うことが便利である、または望ましい場合がある。薬学的に許容される塩の例は、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｓａｌｔｓ”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９で述べられている。
例えば、化合物がアニオン性であるか、またはアニオン性の可能性がある官能基を有する（例えば、−ＣＯＯＨが−ＣＯＯ-の可能性がある）場合、塩は好適なカチオンで形成される場合がある。好適な無機カチオンの例としては、Ｎａ+及びＫ+などのアルカリ金属イオン、Ｃａ2+及びＭｇ2+などのアルカリ土類カチオン、ならびにＡｌ3+などの他のカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわち、ＮＨ4 +）及び置換アンモニウムイオン（例えば、ＮＨ3ＲX+、ＮＨ2ＲX 2 +、ＮＨＲX 3 +、ＮＲX 4 +）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例は、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミンに加えて、アミノ酸、例えば、リジン及びアルギニンなどから得られるものである。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ3）4 +である。
化合物がカチオン性であるか、またはカチオン性の可能性がある官能基を有する（例えば、−ＮＨ2が−ＮＨ3 +の可能性がある）場合、塩は好適なアニオンで形成される場合がある。好適な無機アニオンの例としては、以下の無機酸から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、亜硫酸、硝酸、亜硝酸、リン酸、及び亜リン酸。
好適な有機アニオンの例としては、以下の有機酸から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない：２−アセトキシ安息香酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、エデト酸、エタンジスルホン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヒドロキシマレイン酸、ヒドロキシナフタレンカルボン酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、粘液酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモン酸、パントテン酸、フェニル酢酸、フェニルスルホン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、トルエンスルホン酸、及び吉草酸。好適なポリマー有機アニオンの例としては、以下のポリマー酸から得られるものが挙げられるが、これらに限定されない：タンニン酸、カルボキシメチルセルロース。
別段の指定がない限り、特定の化合物への言及は、その塩の形態も含む。
他の実施形態
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１試験試料をアプタマーの第１セットと接触させて第１混合物を形成することであり、第１試験試料が生体試料のＺ％希釈液であり、Ｚが生体試料の５％〜３９％（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９）の希釈液であり、アプタマーの第１セット中に少なくともＡ3の異なるアプタマーが存在すること、ｂ）第２試験試料をアプタマーの第２セットと接触させて第２混合物を形成することであり、第２試験試料が生体試料のＹ％希釈液であり、ＹはＺ未満であり、アプタマーの第２セット中に少なくともＡ2の異なるアプタマーが存在すること、ｃ）第３試験試料をアプタマーの第３セットと接触させて第３混合物を形成することであり、第３試験試料が生体試料のＸ％希釈液であり、ＸはＹ未満であり、アプタマーの第３セット中に少なくともＡ1の異なるアプタマーが存在すること、ｄ）第１、第２及び第３混合物をインキュベートしてアプタマー−タンパク質複合体の形成を可能にし、アプタマー−タンパク質複合体を形成しなかったアプタマーの大部分を除去すること、ｅ）アプタマー−タンパク質複合体を解離させることによって、アプタマー−タンパク質複合体からアプタマーを収集すること、ｆ）収集したアプタマーを検出または定量化することであり、アプタマーの第１セット、アプタマーの第２セット及びアプタマーの第３セットにおけるアプタマーの大部分が各々、試験試料中の異なる標的タンパク質に対して親和性を有し、その標的タンパク質とのアプタマー−タンパク質複合体を形成することが可能であり、Ａ3はＡ2よりも大きく、Ａ2はＡ1よりも大きく、Ａ1、Ａ2及びＡ3の合計が少なくとも４，０００であることを含む。
一態様では、Ｚは１０％〜３０％、または１５％〜２５％、または約２０％である。
一態様では、Ｙは、０．０１％〜１％（もしくは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１）または０．１％〜０．８％または０．２％〜０．７５％または約０．５％である。
一態様では、Ｘは、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８もしくは０．００９）または０．００２％〜０．００８％または０．００３％〜０．００７％または約０．００５％である。
一態様では、Ａ1、Ａ2及びＡ3の合計は、少なくとも４，５００または５０００である。
一態様では、Ａ3は、Ａ1、Ａ2及びＡ3の合計の５０％〜９０％（もしくは５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％もしくは９０％）、またはＡ1、Ａ2及びＡ３の合計の６０％〜８５％、またはＡ1、Ａ2及びＡ3の合計の約８０％もしくは８１％である。
一態様では、Ａ2は、Ａ1、Ａ2及びＡ3の合計の１０％〜４９％（もしくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％もしくは４９％）、またはＡ1、Ａ2及びＡ３の合計の１２％〜３５％、またはＡ1、Ａ2及びＡ３の合計の１５％〜３０％、またはＡ1、Ａ2及びＡ3の合計の約１５％もしくは１６％である。
一態様では、Ａ1は、Ａ1、Ａ2及びＡ3の合計の１％〜９％（もしくは１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％もしくは９％）、またはＡ1、Ａ2及びＡ３の合計の２％〜７％、またはＡ1、Ａ2及びＡ３の合計の３％〜６％、またはＡ1、Ａ2及びＡ3の合計の約３％もしくは４％である。
一態様では、Ａ3は、少なくとも４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４２００、４２７０、４５００、５０００である（または９００〜１６，５００もしくは２０００〜１５，０００もしくは３，０００〜１２，０００もしくは４，０００〜１０，０００である）。
一態様では、Ａ2は、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８２０、９００である（または５００〜３５００もしくは７００〜２５００、もしくは８００〜２０００である）。
一態様では、Ａ1は、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７３である（または１００〜７００もしくは１００〜６５０である）。
一態様では、第１混合物、第２混合物及び第３混合物は、互いに別々にインキュベートされる。
一態様では、本明細書における方法は、混合物がアプタマー−タンパク質複合体の形成を可能にするためにインキュベートされた後、第１混合物、第２混合物及び第３混合物を互いに組み合わせることをさらに含む。
一態様では、本明細書における方法は、混合物がアプタマー−タンパク質複合体の形成を可能にするためにインキュベートされた後、第１混合物、第２及び第３混合物を互いに順に組み合わせることをさらに含む。
一態様では、逐次的な組合せは、ｉ）第１混合物、続いて第２混合物、続いて第３混合物、ｉｉ）第１混合物、続いて第３混合物、続いて第２混合物、ｉｉｉ）第２混合物、続いて第１混合物、続いて第３混合物、ｉｖ）第２混合物、続いて第３混合物、続いて第１混合物、ｖ）第３混合物、続いて第２混合物、続いて第１混合物、及びｖｉ）第３混合物、続いて第１混合物、続いて第２混合物から選択される順序で実施される。
一態様では、試験試料は、血液、血漿、血清、痰、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
一態様では、検出または定量化は、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される。
一態様では、少なくともＡ3の異なるアプタマーは、少なくとも１つのヌクレオチドの違い及び／または少なくとも１つのヌクレオチド修飾によって互いに異なる。
一態様では、少なくともＡ2の異なるアプタマーは、少なくとも１つのヌクレオチドの違い及び／または少なくとも１つのヌクレオチド修飾によって互いに異なる。
一態様では、少なくともＡ1の異なるアプタマーは、少なくとも１つのヌクレオチドの違い及び／または少なくとも１つのヌクレオチド修飾によって互いに異なる。
一態様では、少なくともＡ3の異なるアプタマー、少なくともＡ2の異なるアプタマー及び少なくともＡ1の異なるアプタマーは、少なくとも１つのヌクレオチドの違い及び／または少なくとも１つのヌクレオチド修飾によって互いに異なる。
以下に続く段落のいずれか１つの方法であって、アプタマーの第１セット、第２セット及び第３セットの１つ以上のアプタマーが、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む、方法。
一態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
一態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
一態様では、その部分は疎水部分である。
一態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
一態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
一態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１試験試料を少なくとも１個の第１アプタマーと接触させて第１混合物を形成することであり、第１試験試料が試験試料の少なくともＸ％希釈液であること、ｂ）第２試験試料を少なくとも１個の第２アプタマーと接触させて第２混合物を形成することであり、第２試験試料が試験試料のＹ％希釈液であり、ＸがＹ未満であること、ｃ）第３試験試料を少なくとも１個の第３アプタマーと接触させて第３混合物を形成することであり、第３試験試料が試験試料のＺ％希釈液であり、ＹがＺ未満であること、ｄ）第１、第２及び第３混合物をインキュベートしてアプタマー−タンパク質複合体の形成を可能にし、アプタマー−タンパク質複合体を形成しなかったアプタマーの大部分を除去すること、ｅ）アプタマー−タンパク質複合体を解離させることによって、アプタマー−タンパク質複合体からアプタマーを収集すること、ｆ）収集したアプタマーを検出または定量化することであり、少なくとも１個の第１アプタマー、少なくとも１個の第２アプタマー及び少なくとも１個の第３アプタマーが各々、異なるタンパク質に対して親和性を有し、タンパク質が各々の試験試料中に存在する場合にアプタマー−タンパク質複合体を形成することが可能であり、第１、第２及び第３試験試料が、同じ試験試料の異なる希釈液であることを含む。
一態様では、Ｚ％は、５％〜３９％（もしくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９％）または１０％〜３０％または１５％〜２５％または約２０％である。
一態様では、Ｙ％は、０．０１％〜１％（もしくは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１％）または０．１％〜０．８％または０．２％〜０．７％または約０．５％である。
一態様では、Ｘ％は、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８もしくは０．００９）または０．００２％〜０．００８％または０．００３％〜０．００７％または約０．００５％である。
一態様では、第１混合物は、複数のアプタマーを含む。
一態様では、第１混合物は、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７３個の（または１００〜７００個もしくは１００〜６５０個である）異なるアプタマーを含む。
一態様では、第２混合物は、複数のアプタマーを含む。
一態様では、第２混合物は、少なくとも２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８２０、９００個の（または５００〜３５００個もしくは７００〜２５００個、もしくは８００〜２０００個である）異なるアプタマーを含む。
一態様では、第３混合物は、複数のアプタマーを含む。
一態様では、第３混合物は、少なくとも４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４２００、４２７０、４５００、５０００個の（または９００〜１６，５００個もしくは２０００〜１５，０００個もしくは３，０００〜１２，０００個もしくは４，０００〜１０，０００個である）異なるアプタマーを含む。
一態様では、第１混合物、第２混合物及び第３混合物は、互いに別々にインキュベートされる。
一態様では、本明細書に開示される方法は、混合物がアプタマー−タンパク質複合体の形成を可能にするためにインキュベートされた後、第１混合物、第２混合物及び第３混合物を互いに組み合わせることをさらに含む。
一態様では、本明細書に開示される方法は、混合物がアプタマー−タンパク質複合体の形成を可能にするためにインキュベートされた後、第１混合物、第２及び第３混合物を互いに順に組み合わせることをさらに含む。
一態様では、逐次的な組合せは、ｉ）第１混合物、続いて第２混合物、続いて第３混合物、ｉｉ）第１混合物、続いて第３混合物、続いて第２混合物、ｉｉｉ）第２混合物、続いて第１混合物、続いて第３混合物、ｉｖ）第２混合物、続いて第３混合物、続いて第１混合物、ｖ）第３混合物、続いて第２混合物、続いて第１混合物、及びｖｉ）第３混合物、続いて第１混合物、続いて第２混合物から選択される順序で実施される。
一態様では、試験試料は、血液、血漿、血清、痰、呼気、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
一態様では、検出または定量化は、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される。
以下に続く段落のいずれか１つの方法であって、少なくとも１個の第１アプタマー、少なくとも１個の第２アプタマー、少なくとも１個の第３アプタマー、及び複数のアプタマーが、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む、方法。
一態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
一態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
一態様では、その部分は疎水部分である。
一態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
一態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
一態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
以下に続く段落のいずれか１つの方法であって、アプタマーが少なくとも１つのヌクレオチドの違い及び／または少なくとも１つのヌクレオチド修飾によって互いに異なる、方法。
いくつかの実施形態では、開示されるシステムは、ａ）第１試験試料をアプタマーの第１セットと共に含む第１混合物を有する第１容器であって、第１試験試料が試験試料のＺ％希釈液であり、アプタマーの第１セット中に少なくともＡ3の異なるアプタマーが存在すること、ｂ）第２試験試料をアプタマーの第２セットと共に含む第２混合物を有する第２容器であって、第２試験試料が試験試料のＹ％希釈液であり、ＹはＺ未満であり、アプタマーの第２セット中に少なくともＡ2の異なるアプタマーが存在すること、ｃ）第３試験試料をアプタマーの第３セットと共に含む第３混合物を有する第３容器であって、第３試験試料が試験試料のＸ％希釈液であり、ＸはＹ未満であり、アプタマーの第３セット中に少なくともＡ1の異なるアプタマーが存在し、アプタマーの第１セット、アプタマーの第２セット及びアプタマーの第３セットにおけるアプタマーの大部分が、試験試料中のタンパク質に対して親和性を有し、アプタマー−タンパク質複合体を形成することが可能であり、Ａ3はＡ2よりも大きく、Ａ2はＡ1よりも大きく、Ａ1、Ａ2及びＡ3の合計が少なくとも４，０００であり、システムは試験試料中でタンパク質を検出するために使用され、第１、第２及び第３試験試料が、同じ試験試料の異なる希釈液であることを含む。
一態様では、Ｚ％は、５％〜３９％（もしくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９％）または１０％〜３０％または１５％〜２５％または約２０％である。
一態様では、Ｙ％は、０．０１％〜１％（もしくは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１％）または０．１％〜０．８％または０．２％〜０．７％または約０．５％である。
一態様では、Ｘ％は、０．００１〜０．００９％（もしくは０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８もしくは０．００９％）または０．００２％〜０．００８％または０．００３％〜０．００７％または約０．００５％である。
いくつかの実施形態では、開示されるシステムは、ａ）第１試験試料を少なくとも１個の第１アプタマーと共に含む第１混合物を有する第１容器であって、第１試験試料が試験試料のＺ％希釈液であること、ｂ）第２試験試料を少なくとも１個の第２アプタマーと共に含む第２混合物を有する第２容器であって、第２試験試料が試験試料のＹ％希釈液であり、ＹがＺ未満であること、ｃ）第３試験試料を少なくとも１個の第３アプタマーと共に含む第３混合物を有する第３容器であって、第３試験試料が試験試料のＸ％希釈液であり、ＸはＹ未満であり、少なくとも１個の第１アプタマー、少なくとも１個の第２アプタマー及び少なくとも１個の第３アプタマーが各々、異なるタンパク質に対して親和性を有し、タンパク質が生体試料中に存在する場合にアプタマー−タンパク質複合体を形成することが可能であり、システムは試験試料中でタンパク質を検出するために使用され、第１、第２及び第３試験試料が、同じ試験試料の異なる希釈液であることを含む。
一態様では、Ｚ％は、５％〜３９％（もしくは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８もしくは３９％）または１０％〜３０％または１５％〜２５％または約２０％である。
一態様では、Ｙ％は、０．０１％〜１％（もしくは０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９もしくは１％）または０．１％〜０．８％または０．２％〜０．７％または約０．５％である。
一態様では、Ｘ％は、０．００１〜０．００９％（もしくは０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８もしくは０．００９％）または０．００２％〜０．００８％または０．００３％〜０．００７％または約０．００５％である。
いくつかの実施形態では、開示される製剤は、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を含み、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、試験試料の約０．００５％希釈液中で形成され、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、試験試料の約０．５％希釈液中で形成され、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、試験試料の約２０％希釈液中で形成される。
一態様では、独立して、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体の第１捕捉試薬、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体の第２捕捉試薬、及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の第３捕捉試薬は、アプタマーまたは抗体から選択される。
一態様では、試験試料は、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
一態様では、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の各々の標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される。
一態様では、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、非共有結合複合体である。
一態様では、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の各々は、製剤中で組み合わされる前に試験試料のそれらの各々の希釈液中で形成される。
一態様では、アプタマーは、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む。
一態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
一態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
一態様では、その部分は疎水部分である。
一態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
一態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
一態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
いくつかの実施形態では、開示される製剤は、複数の第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、複数の第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び複数の第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を含み、複数の第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、試験試料の約０．００５％希釈液中で形成され、複数の第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、試験試料の約０．５％希釈液中で形成され、複数の第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、試験試料の約２０％希釈液中で形成される。
一態様では、独立して、複数の第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体の複数の第１捕捉試薬、複数の第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体の複数の第２捕捉試薬、及び複数の第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の複数の第３捕捉試薬は、アプタマーまたは抗体から選択される。
一態様では、試験試料は、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
一態様では、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の各々の標的分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される。
一態様では、複数の第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、複数の第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び複数の第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体は、非共有結合複合体である。
一態様では、複数の第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、複数の第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び複数の第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の各々は、製剤中で組み合わされる前に試験試料のそれらの各々の希釈液中で形成される。
一態様では、アプタマーは、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む。
一態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
一態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
一態様では、その部分は疎水部分である。
一態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
一態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
一態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
一態様では、複数の第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体の複数の第１捕捉試薬は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０もしくは１７３であるか、または１００〜７００、または１００〜６５０の捕捉試薬である。
一態様では、複数の第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体の複数の第２捕捉試薬は、約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８２０もしくは９００であるか、または５００〜３５００であるか、または約７００〜２５００であるか、または８００〜２０００、または約８２８の捕捉試薬である。
一態様では、複数の第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の複数の第３捕捉試薬は、約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４２００、４２７０、４５００もしくは５０００であるか、または約９００〜１６，５００、または約２０００〜１５，０００、または約３，０００〜１２，０００、または約４，０００〜１０，０００、または約４２７１の捕捉試薬である。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１希釈群を第２希釈群と順に組み合わせることであって、第１希釈群が試験試料のＸ％希釈液であり、第１捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体を形成する第１標的タンパク質に結合した第１捕捉試薬を含み、第２希釈群が試験試料のＹ％希釈液であり、第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体を形成する第２標的タンパク質に結合した第２捕捉試薬を含み、第１及び第２標的タンパク質が異なるタンパク質であり、ＸがＹ未満であること、ｂ）捕捉試薬をそれらの各々の捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体から解離させること、ならびにｃ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することを含む。
本明細書に開示される方法のいくつかの態様では、本方法は、第３希釈群を第１及び第２希釈群と順に組み合わせることをさらに含み、第３希釈群が試験試料のＺ％希釈液であり、第３捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体を形成する第３標的タンパク質に結合した第３捕捉試薬を含み、第３標的タンパク質は第１及び第２標的タンパク質とは異なり、ＹがＺ未満である。
一態様では、第１捕捉試薬及び第２捕捉試薬は、アプタマーまたは抗体である。
一態様では、第１希釈群及び第２希釈群は、同じ試験試料の希釈液である。
一態様では、試験試料は、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される。
一態様では、第３希釈群は、同じ試験試料の異なる希釈液であり、及び／または第３捕捉試薬は、アプタマーもしくは抗体である。
一態様では、第１及び第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体は、非共有結合複合体である。
一態様では、第１希釈群は、０．００１％〜０．００９％の試験試料の希釈液であり（もしくはＸ％は、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）、またはＸ％は０．００２％〜０．００８％であり、またはＸ％は０．００３％〜０．００７％であり、またはＸ％は約０．００５％である。
一態様では、第２希釈群は、０．０１％〜１％の試験試料の希釈液であり（もしくはＹ％は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）、またはＹ％は０．１％〜０．８％であり、またはＹ％は０．２％〜０．７５％であり、またはＹ％は約０．５％である。
一態様では、第３希釈群は、５％〜３９％の試験試料の希釈液であり（もしくはＺ％は、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）、またはＺ％は１５％〜３０％であり、またはＺ％は１５％〜２５％であり、またはＺ％は約２０％である。
一態様では、第１希釈群は、複数の第１捕捉試薬をさらに含む。
一態様では、第２希釈群は、複数の第２捕捉試薬をさらに含む。
一態様では、第３希釈群は、複数の第３捕捉試薬をさらに含む。
一態様では、第１希釈群は、複数の第１捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体をさらに含む。
一態様では、第２希釈群は、複数の第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体をさらに含む。
一態様では、第３希釈群は、複数の第３捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体をさらに含む。
一態様では、第１希釈群を第２希釈群と順に組み合わせることは、第１及び第２希釈群を組み合わせた後に洗浄ステップをさらに含む。
一態様では、第３希釈群を第１及び第２希釈群と順に組み合わせることは、第１、第２及び第３希釈群を組み合わせた後に洗浄ステップをさらに含む。
一態様では、複数の第１捕捉試薬は、約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０もしくは１７３であるか、または１００〜７００、または１００〜６５０の捕捉試薬である。
一態様では、複数の第２捕捉試薬は、約２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８２０もしくは９００であるか、または５００〜３５００であるか、または約７００〜２５００であるか、または８００〜２０００、または約８２８の捕捉試薬である。
一態様では、複数の第３捕捉試薬は、約４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４２００、４２７０、４５００もしくは５０００であるか、または約９００〜１６，５００、または約２０００〜１５，０００、または約３，０００〜１２，０００、または約４，０００〜１０，０００、または約４２７１の捕捉試薬である。
一態様では、第１及び第２希釈群を順に組み合わせる前に、第１希釈群の第１捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体及び第２希釈群の第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体は各々、それらの各々の希釈群中における第１固体支持体上に固定化され、順に組み合わせるために第１固体支持体から遊離される。
一態様では、第３希釈群を第１及び第２希釈群と順に組み合わせる前に、第３希釈群の第３捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体は、その各々の希釈群中における第１固体支持体上に固定化され、順に組み合わせるために第１固体支持体から遊離される。
一態様では、第１捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体を、捕捉試薬と固体支持体との会合によって、その第１固体支持体上に固定化した。
一態様では、第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体を、捕捉試薬と固体支持体との会合によって、その第１固体支持体上に固定化した。
一態様では、第３捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体を、捕捉試薬と固体支持体との会合によって、その第１固体支持体上に固定化した。
一態様では、解離した第１及び第２捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することは、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される。
一態様では、アプタマーは、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む。
一態様では、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンは、ピリミジンの５位にリンカーと、リンカーに結合した部分を含む。
一態様では、リンカーは、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される。
一態様では、その部分は疎水部分である。
一態様では、その部分は、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される。
一態様では、その部分は、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される。
一態様では、５位修飾ピリミジンのピリミジンは、ウリジン、シチジンまたはチミジンである。
一態様では、アプタマーは、３５〜１００ヌクレオチド長である。
一態様では、アプタマーは、コンセンサスタンパク質結合ドメインを含む。
一態様では、アプタマーは、３〜２０の番号を付けた５位修飾ピリミジンを含む。
一態様では、希釈群を順に組み合わせる順序は、第１希釈群を第２希釈群と、続いて第３希釈群と組み合わせること、第１希釈群を第３希釈群と、続いて第２希釈群と組み合わせること、第２希釈群を第３希釈群と、続いて第１希釈群と組み合わせること、第２希釈群を第１希釈群と、続いて第３希釈群と組み合わせること、第３希釈群を第１希釈群と、続いて第２希釈群と組み合わせること、及び第３希釈群を第２希釈群と、続いて第１希釈群と組み合わせることから選択される。
一態様では、希釈群を順に組み合わせる順序は、第１希釈群を第２希釈群と組み合わせること及び第２希釈群を第１希釈群と組み合わせることから選択される。
一態様では、解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することは、標的タンパク質の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することの代用である。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１固体支持体から遊離させ、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すこと、ｂ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第２固体支持体から遊離させ、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すことにより、第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物中で組み合わせること、ｃ）第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体の標的分子に第１タグを付けること、ｄ）タグが第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の第３固体支持体（複数可）に固定化させるように、タグ付き第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の第３固体支持体（複数可）に接触させること、ｅ）捕捉試薬を第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、ならびにｆ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することであり、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体が各々、同じ試験試料の異なる希釈液中で形成されたことを含む。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１固体支持体上に固定化した第１捕捉試薬を第１希釈液と接触させて第１混合物を形成し、第２固体支持体上に固定化した第２捕捉試薬を第２希釈液と接触させて第２混合物を形成することであり、第１及び第２捕捉試薬の各々が標的分子に結合できること、ｂ）第１混合物及び第２混合物を別々にインキュベートすることであり、第１捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第１混合物中に存在する場合、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第１混合物中に形成され、第２捕捉試薬が親和性を有する標的分子が第２混合物中に存在する場合、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体が第２混合物中に形成されること、ｃ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１固体支持体から遊離させ、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第３混合物に移すこと、ｄ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第２固体支持体から遊離させること、ｅ）ステップｃ）後、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第３混合物に移すことにより、第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第３混合物中で組み合わせること、ｆ）第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体の標的分子に第１タグを付けること、ｇ）タグが第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第３固体支持体に固定化させるように、タグ付き第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第３固体支持体に接触させること、ｈ）捕捉試薬をそれらの各々の捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、ならびにｉ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することであり、第１希釈液及び第２希釈液が、試験試料の異なる希釈液であることを含む。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１固体支持体から遊離させ、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すこと、ｂ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第２固体支持体から遊離させ、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すことにより、第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を組み合わせること、ｃ）第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第３固体支持体から遊離させ、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すことにより、第１、第２及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を組み合わせること、ｄ）第１、第２、及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の標的分子に第１タグを付けること、ｅ）タグが第１、第２及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の第４固体支持体（複数可）に固定化させるように、タグ付き第１、第２、及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の第４固体支持体（複数可）に接触させること、ｆ）捕捉試薬を第１、第２及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、ならびにｇ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することであり、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体が各々、同じ試験試料の異なる希釈液中で形成されたことを含む。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１固体支持体から遊離させ、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すこと、ｂ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第２固体支持体から遊離させ、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すことにより、第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物中で組み合わせること、ｃ）捕捉試薬を第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、ならびにｆ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することであり、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体が各々、同じ試験試料の異なる希釈液中で形成されたことを含む。
いくつかの実施形態では、開示される本方法は、ａ）第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１固体支持体から遊離させ、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すこと、ｂ）第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第２固体支持体から遊離させ、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すことにより、第１及び第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物中で組み合わせること、ｃ）第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第３固体支持体から遊離させ、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物に移すことにより、第１、第２及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を第１混合物中で組み合わせること、ｅ）捕捉試薬を第１、第２及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、ならびにｆ）解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することであり、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体が各々、同じ試験試料の異なる希釈液中で形成されたことを含む。
本明細書に記載される方法、製剤及びシステムのいずれか１つでは、方法、製剤及び／またはシステムは、競合分子をさらに含む。
本明細書に記載される方法、製剤及びシステムのいずれか１つ、方法、製剤及び／またはシステムでは、競合分子は、約１０μＭ〜約１２０μＭ（もしくは１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５もしくは１２０μＭ）、または約１５μＭ〜約８０μＭ、または約２０μＭ、または約３０μＭまたは約６０μＭの濃度である。
本明細書に記載される方法、製剤及びシステムのいずれか１つ、方法、製剤及び／またはシステムでは、競合分子は、オリゴヌクレオチド、ポリアニオン、ヘパリン、ニシン精子ＤＮＡ、サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、デキストラン硫酸、ポリデキストラン、脱塩基ホスホジエステルポリマー、ｄＮＴＰ、及びピロリン酸塩から選択される。
本明細書に記載される方法、製剤及びシステムのいずれか１つ、方法、製剤及び／またはシステムでは、競合分子は、（Ａ−Ｃ−ＢｎｄＵ−ＢｎｄＵ）7ＡＣのヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。
本明細書に記載される方法、製剤及びシステムのいずれか１つ、方法、製剤及び／またはシステムでは、競合分子は、試験試料に対して約３０μＭの濃度であり、試験試料は血漿である。
本明細書に記載される方法、製剤及びシステムのいずれか１つ、方法、製剤及び／またはシステムでは、競合分子は、試験試料に対して約６０μＭの濃度であり、試験試料は血清である。
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をより完全に例証するために提示される。しかしながら、それらは、本発明の広範な範囲を限定するものとして解釈されるべきでは決してない。当業者は、本発明の趣旨から逸脱することなく、本発見の基礎となる原理を容易に採用し、様々な化合物を設計することができる。
実施例１．試料の多重化アプタマー分析
本実施例は、試料及び対照物の分析に使用されるマルチプレックスアプタマーアッセイについて記載する。
マルチプレックスアプタマーアッセイ法
マルチプレックスアプタマーアッセイの全てのステップを、別段の指示がない限り、室温で実施した。
アプタマーマスターミックス溶液の調製。
５２７２個のアプタマーを、３つの独自の混合物であるＤｉｌ１、Ｄｉｌ２及びＤｉｌ３にグループ分けし、それぞれ２０％、０．５％及び０．００５％の血漿または血清試料希釈液に対応した。混合物へのアプタマーの割当てを、血漿及び血清試料を各アプタマーと適合させた希釈系列をアッセイし、シグナルの最大線形範囲を示した試料希釈液を同定することによって経験的に決定した。アプタマーの分離及び血漿または血清試料の異なる希釈液（２０％、０．５％または０．００５％）との混合によって、アッセイがタンパク質濃度の１０7倍範囲に及ぶことが可能となる。アプタマーマスターミックスのストック溶液を、ＨＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中において４ｎＭの各アプタマーで調製し、−２０℃で凍結保存した。４２７１個のアプタマーをＤｉｌ１混合物に、８２８個のアプタマーをＤｉｌ２に、及び１７３個のアプタマーをＤｉｌ３混合物に混合した。使用前に、ストック溶液をＨＥ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で希釈して各アプタマーの作用濃度を０．５５ｎＭにし、個々の使用アリコートに分取した。キャッチ−０プレートの調製にアプタマーマスターミックスを使用する前に、標準溶液を、使用前に９５℃で１０分間、次いで２５℃で少なくとも３０分間インキュベートすることによって、加熱・冷却してアプタマーをリフォールディングさせた。
キャッチ０プレートの調製。
６０μＬのストレプトアビジンマグセファロース１０％スラリー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８−９８５７）を、１００μＬの加熱・冷却したアプタマーマスターミックスと組み合わせた。混合物を１７５μＬのアッセイ緩衝液（４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、次いで９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＡＢ−０７６９）の各ウェルに分注した。プレートを、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃシェーカー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）上において８５０ｒｐｍで振盪しながら、２５℃で３０分間インキュベートした。３０分間のインキュベーション後、６μＬのＭＢブロック緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の５０ｍＭ Ｄ−ビオチン、ｐＨ８、０．０１％Ｔｗｅｅｎ）をプレートの各ウェルに添加し、プレートをさらに２分間、振盪しながらインキュベートした。次いで、プレートを１７５μＬのアッセイ緩衝液で洗浄し、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ Ｃ上において８５０ｒｐｍで振盪する１分間の洗浄サイクルを行い、続いて磁石上で３０秒間分離させた。洗浄液を除去した後、ビーズを１７５μＬのアッセイ緩衝液中に再懸濁させ、使用するまで−２０℃で保存した。
キャッチ−２ビーズの調製。
アッセイのロボット処理を開始する前に、マルチプレックスアプタマーアッセイのキャッチ−２ステップに使用したＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、製品番号３５００２Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１０ｍｇ／ｍＬのビーズスラリーを、ＭＢ Ｐｒｅｐ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％ＳＤＳ）で５分間、まとめて１回洗浄し、続いてアッセイ緩衝液で２回洗浄した。最後の洗浄後、ビーズを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再懸濁させ、７５μＬのビーズスラリーをキャッチ−２プレートの各ウェルに分注した。アッセイの開始時に、キャッチ−２プレートをアルミニウムアダプター内に置き、Ｆｌｕｅｎｔデッキ上の適切な位置に置いた。
試料の解凍及び希釈。
マトリックスチューブ内に−８０℃で保存した１００％血漿または血清試料の６５μＬのアリコートを、室温で１０分間インキュベートすることによって解凍した。解凍を容易にするために、チューブを、マトリックスチューブラックを通して空気を循環させるファンユニットの上部に置いた。解凍後、試料を１０００×ｇで１分間遠心分離し、試料を希釈するためにＦｌｕｅｎｔロボットデッキ上に置いた。２０％試料溶液を、３５μＬの解凍した試料を１４０μＬの適切な試料希釈剤を含有する９６ウェルプレートに移すことによって調製した。血漿の試料希釈剤は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＥＧＴＡ、１．２ｍＭのベンズアミジン、３７．５μＭのＺ−ブロック及び１．２％Ｔｗｅｅｎ−２０であった。血清試料希釈剤は、７５μＭのＺ−ブロックを含有し、他の成分は血漿試料希釈剤と同じ濃度であった。その後、０．５％及び０．００５％に希釈した試料を作製するために、Ｆｌｕｅｎｔロボット上で段階希釈を使用してアッセイ緩衝液で希釈した。０．５％試料希釈液を作製するために、２０％試料から４％への中間希釈液を、４５μＬの２０％試料を１８０μＬのアッセイ緩衝液と混合することによって作製し、次いで０．５％試料を、２５μＬの４％希釈試料を１７５μＬのアッセイ緩衝液と混合することによって作製した。０．００５％試料を作製するために、０．０５％中間希釈液を、２０μＬの０．５％試料を１８０μＬのアッセイ緩衝液と混合することによって作製し、次いで０．００５％試料を、２０μＬの０．０５％試料を１８０μＬのアッセイ緩衝液と混合することによって作製した。
試料結合ステップ。
キャッチ−０プレートを、上記の通りにストレプトアビジン磁気セファロースビーズ上にアプタマーミックスを固定化することによって調製した。凍結プレートを２５℃で３０分間解凍し、１７５μＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄した。１００μＬの各試料希釈液（２０％、０．５％及び０．００５％）を、３つの異なるアプタマーマスターミックス（それぞれＤｉｌ１、Ｄｉｌ２及びＤｉｌ３）を含むビーズを含有するプレートに添加した。次いで、キャッチ−０プレートをアルミホイルシール（Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ‘Ｆ’Ｆｏｉｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で密封し、８５０ｒｐｍ、２８℃に設定した４プレート回転シェーカー（ＰＨＭＰ−４、Ｇｒａｎｔ Ｂｉｏ）内に置いた。試料結合ステップを３．５時間実施した。
Ｆｌｕｅｎｔロボット上でのマルチプレックスアプタマーアッセイ処理。
試料結合ステップが完了した後、キャッチ−０プレートをアルミニウムプレートアダプター内に置き、ロボットデッキ上に置いた。磁気ビーズ洗浄ステップを、温度制御プレートを使用して実施した。全てのロボット処理ステップでは、以下に記載したようなキャッチ−２洗浄を除いて、プレートを２５℃の温度に設定した。プレートを１７５μＬのアッセイ緩衝液で４回洗浄し、各洗浄サイクルをプログラムして、プレートを１０００ｒｐｍで少なくとも１分間振盪し、続いて磁気ビーズを少なくとも３０秒間分離させてから緩衝液を吸引した。最後の洗浄サイクル中に、タグ試薬を、１００倍タグ試薬（ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＧ4−ビオチン、製品番号２１３６３、Ｔｈｅｒｍｏ、無水ＤＭＳＯ中で調製した１００ｍＭ溶液）をアッセイ緩衝液で１：１００に希釈することによって調製し、ロボットデッキ上の溝槽中に注いだ。１００μＬのタグ試薬をプレートのウェルの各々に添加し、１２００ｒｐｍで５分間振盪しながらインキュベートして、ビーズ表面上で捕捉したタンパク質をビオチン化した。ビオチン化反応を、１７５μＬのクエンチ緩衝液（アッセイ緩衝液中の２０ｍＭグリシン）を各ウェルに添加することによってクエンチした。プレートを静置して３分間インキュベートし、次いで１７５μＬのアッセイ緩衝液で４回洗浄して、上記に記載したものと同じ条件下で洗浄を実施した。
光切断及び動的課題。
プレートを最後に洗浄した後、９０μＬの光切断緩衝液（アッセイ緩衝液中の２μＭのオリゴヌクレオチド競合物、競合物は５’−（ＡＣ−Ｂｎ−Ｂｎ）7−ＡＣ−３’のヌクレオチド配列を有し、式中Ｂｎは、５位ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す）を、プレートの各ウェルに添加した。プレートをＦｌｕｅｎｔデッキ上の光切断サブステーションに移動させた。サブステーションは、ＢｌａｃｋＲａｙ光源（ＵＶＰ ＸＸシリーズベンチランプ、３６５ｎｍ）及び３つのＢｉｏｓｈａｋｅ ３０００−Ｔシェーカー（Ｑ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）からなる。プレートを１０００ｒｐｍで振盪しながら２０分間照射した。
キャッチ−２ビーズ捕捉。
光切断プロセスの最後に、緩衝液を磁気分離によってキャッチ−２プレートから除去し、プレートを１００μＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄した。アプタマー−タンパク質複合体を含有する光切断した溶出液を、希釈液３プレートから開始して各キャッチ−０プレートから除去した。９０μＬの溶液を全て、シェーカー上に配置したキャッチ−１溶出液プレートに最初に移し、磁石を上げて、吸引される可能性がある全てのストレプトアビジン磁気セファロースビーズを捕捉した。その後、溶液をキャッチ−２プレートに移し、プレートを１４００ｒｐｍ、２５℃で振盪しながら３分間インキュベートした。３分間のインキュベーション後、磁気ビーズを９０秒間分離させて溶液をプレートから除去し、光切断したＤｉｌ２プレート溶液をプレートに添加した。同一プロセス後、Ｄｉｌ１プレートからの溶液を添加し、３分間インキュベートした。３分間のインキュベーションの最後に、６μＬのＭＢブロック緩衝液を磁気ビーズ懸濁液に添加し、ビーズを１２００ｒｐｍ、２５℃で振盪しながら２分間インキュベートした。このインキュベーション後、プレートを３８℃の温度にプリセットした別のシェーカーに移した。磁気ビーズを２分間分離させてから溶液を除去した。次いで、キャッチ−２プレートを１７５μＬのＭＢ洗浄緩衝液（アッセイ緩衝液中の２０％グリセロール）で４回洗浄し、各洗浄サイクルをプログラムして、ビーズを１２００ｒｐｍで１分間振盪してビーズを３．５分間、磁石の上で分割させた。最後のビーズ分離ステップ中に、シェーカー温度を２５℃に設定した。次いで、ビーズを１７５μＬのアッセイ緩衝液で１回洗浄した。この洗浄ステップでは、ビーズを１２００ｒｐｍで１分間振盪し、次いで磁石上で２分間分離させた。洗浄ステップ後、アプタマーを、溶出緩衝液（１．８Ｍ ＮａＣｌＯ4、４０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を使用して、精製したアプタマー−タンパク質複合体から溶出した。溶出を、７５μＬの溶出緩衝液を使用して２５℃で１０分間、ビーズを１２５０ｒｐｍで振盪しながら行った。７０μＬの溶出液をアーカイブプレートに移し、磁石上で分離させて、吸引される可能性のある全ての磁気ビーズを分割した。１０μＬの溶出物質を黒色ハーフエリアプレートに移し、アッセイ緩衝液で１：５に希釈して、内部アッセイＱＣとしてモニターするシアニン３蛍光シグナルの測定に使用した。２０μＬの溶出物質を、５μＬのハイブリダイゼーションブロッキング溶液（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、大容量、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ５１８８−５３８０、Ａｇｉｌｅｎｔアレイ上のコーナーマーカープローブに相補的なシアニン３標識ＤＮＡ配列のスパイクを含有する）を含有するプレートに移した。このプレートをロボットデッキから取り外し、ハイブリダイゼーションのためにさらに処理した（以下を参照のこと）。溶出液が残ったままのアーカイブプレートを、アルミホイルを使用して熱密封し、−２０℃で保存した。
ハイブリダイゼーション。
２５μＬの２倍Ａｇｉｌｅｎｔハイブリダイゼーション緩衝液（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、製品番号５１８８−５３８０）を、溶出試料及びブロッキング緩衝液を含有するプレートの各ウェルに手作業でピペット分注した。４０μＬのこの溶液を、ハイブリダイゼーションガスケットスライド（ハイブリダイゼーションガスケットスライド−スライド形式あたり８マイクロアレイ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の各「ウェル」に手作業でピペット分注した。各アプタマーに相補的な、アレイあたり１０個のプローブを含有するカスタムＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ ８×６０ｋ Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイスライドを、製造業者のプロトコールに従ってガスケットスライド上に置いた。各アセンブリ（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ Ｋｉｔ−ＳｕｒｅＨｙｂ対応、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をしっかりと固定し、ハイブリダイゼーションオーブンに載せて５５℃で１９時間、２０ｒｐｍで回転させた。
ハイブリダイゼーション後の洗浄。
スライド洗浄を、Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（モデル６５０Ｃ、Ｓｃｉｇｅｎｅ）を使用して実施した。およそ７００ｍＬの洗浄緩衝液１（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−ｏｎ−ｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を大きなガラス製染色皿に注ぎ、ガスケットスライドからのマイクロアレイスライドの分離に使用した。分解させたらすぐに、スライドを、Ｌｉｔｔｌｅ Ｄｉｐｐｅｒ上の洗浄緩衝液１を含有する槽内のスライドラックに迅速に移した。スライドを、マグネチックスターバーによって混合しながら、洗浄緩衝液１で５分間洗浄した。次いで、スライドラックを３７℃の洗浄緩衝液２（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−ｏｎｃｈｉｐ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ ２、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた槽に移し、攪拌しながら５分間インキュベートした。スライドラックを第２槽からゆっくりと取り出し、次いでアセトニトリルを含有する槽に移して、攪拌しながら５分間インキュベートした。
マイクロアレイイメージング。
マイクロアレイスライドを、３μｍ解像度、１００％ＰＭＴ設定でシアニン３チャネルにおいてマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ４９００ＤＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてイメージングし、２０ビットオプションを有効にした。得られたｔｉｆｆ画像を、ＧＥ１＿１２００＿Ｊｕｎ１４プロトコールを用いたＡｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェア（バージョン１０．７．３．１以上）を使用して処理した。
実施例２：マルチプレックスアッセイでの非特異的標的分子の捕捉
本実施例は、マルチキャッチマルチプレックスアッセイにおける非特異的標的分子の捕捉及びキャリーオーバーに関する記載を提供する。
一般に、多くのアッセイ形式の感度及び特異性は、アッセイ中の非特異的会合に起因して生じるシグナルから真のシグナルを分解する検出方法の能力に影響を受け、これは望ましくない検出可能なシグナル（偽陽性またはアッセイ「ノイズ」）をもたらす。これは、多重化アッセイに特に当てはまる。非特異的結合の主な原因の１つは、予期しない捕捉試薬−標的分子相互作用の機能であることが観察されている。本実施例は、非特異的捕捉試薬−標的分子相互作用によって、アッセイ中で不必要なシグナルまたは「ノイズ」がどのように生成される場合があるかについて記載する。
本実施例では、２つのキャッチシステム及び試験試料の複数の希釈液を用いたアプタマーベースのマルチプレックスアッセイを使用して、予期しないアプタマー−標的分子相互作用に起因する非特異的標的分子（例えば、タンパク質）の捕捉及びキャリーオーバーをモデル化したが、これらはアッセイのダイナミックレンジ外となるアッセイシグナルをもたらし、アッセイの感度及び特異性を低下させる。
簡潔に述べると、アプタマーベースのアッセイを、第１固体支持体（例えば、試薬上のビオチンを使用するストレプトアビジンビーズ）に固定化したアプタマー試薬を生体試料（例えば、血清または血漿）と共にインキュベートし、生体試料中のタンパク質がそれらの同族アプタマーに結合するのを可能にすることによって実施した（「キャッチ−１」と称される）。次いで、タグをタンパク質に結合し、次いでアプタマー−タンパク質標的複合体を第１固体支持体から遊離させて第２固体支持体に曝露することにより、アプタマー−標的タンパク質複合体を、タンパク質上のタグを介して固定化させた（「キャッチ−２」と称される）。次いで、複合体を洗浄し、キャッチ−２から非結合アプタマー及びタンパク質を全て除去した。洗浄後、アプタマーを第２固体支持体上のアプタマー−標的タンパク質複合体から遊離させ、検出目的で捕捉した（例えば、ハイブリダイゼーションアレイ）。アプタマーの定量化を、生体試料中のタンパク質量の代用として使用した。アプタマーベースのアッセイを、単一のアプタマー試薬または複数のアプタマー試薬（もしくはマルチプレックス形式）と共に使用してよい。
本実施例では、血漿試料の３つの異なる希釈群を作製した（血清も同じ「タンパク質キャリーオーバー試験に供し、結果は血清の結果と同等である、データは示さず）。図６は、０．００５％希釈液（ＤＩＬ１）、０．５％希釈液（ＤＩＬ２）及び２０％希釈液（ＤＩＬ３）として作製した、血漿の３つの異なる希釈群の概要を提供し、それぞれ相対的に高い、中程度の及び低い存在量のタンパク質を測定した。さらに、ＤＩＬ１、ＤＩＬ２及びＤＩＬ３の各々についてのアプタマーセットは、それぞれＡ１、Ａ２及びＡ３であった。合計で５，２７２個の異なるアプタマーについて、アプタマーのＡ３群は、４，２７１個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約８１％）を有し、Ａ２群は、８２８個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約１６％）を有し、Ａ１群は、１７３個の異なるアプタマー（またはアプタマーの総数の約３％）を有する。
５つの異なる条件を試験し、マルチプレックスアッセイにおいてタンパク質キャリーオーバー効果が存在するかどうかを決定した。これらの条件を以下の表２に示す。
Figure 2021528646
各条件を、上記に記載したような２つのキャッチシステムを用いたアプタマーベースのマルチプレックスアッセイに供した。条件は、生体試料（例えば、血漿）が存在するか否か、またはブランク、すなわち、生体試料を全く含まないために、タンパク質を全く含まないアッセイ緩衝液であったのか否かという点で異なる。各希釈群を、希釈した生体試料が存在するのか、またはブランクであるかに関係なく、その各々のアプタマー群と共に（Ａ１はＤＩＬ１またはブランク１と、Ａ２はＤＩＬ２またはブランク２と、及びＡ３はＤＩＬ３またはブランク３と共に）インキュベートした。いずれの場合も、各アプタマー群からのアプタマーを、それらの各々の希釈液またはブランクと共にインキュベートする前に、第１固体支持体上にあらかじめ固定化した（キャッチ−１）。インキュベーション後、次いでタグをタンパク質（存在する場合）に結合し、次いでアプタマー−タンパク質標的複合体（存在する場合）を、３つの別個の希釈液及び／またはブランク中で第１固体支持体から遊離させ、それらを同時に組み合わせて単一の混合物とし、次いで第２固体支持に曝露することにより、アプタマー−標的タンパク質複合体（存在する場合）を、タンパク質上のタグを介して固定化させた（「キャッチ−２」と称される）。次いで、複合体を洗浄し、キャッチ−２から非結合アプタマー及びタンパク質を全て除去した。洗浄後、アプタマーを第２固体支持体上のアプタマー−標的タンパク質複合体から遊離させ、検出目的でハイブリダイゼーションアレイによって捕捉した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）によるアプタマーの定量化を、生体試料中のタンパク質量の代用として使用した。
条件１は、血漿を３つの希釈群に希釈したもの（０．００５％希釈のＤＩＬ１、０．５％希釈のＤＩＬ２及び２０％希釈のＤＩＬ３）であって、それらの各々のアプタマー群（Ａ１、Ａ２及びＡ３）と共にインキュベートした。条件２は、ＤＩＬ１血漿希釈液（０．００５％）と、それぞれＤＩＬ２及びＤＩＬ３の代わりに、ブランク１及びブランク２を有し、それらの各々のアプタマー群（Ａ１、Ａ２及びＡ３）と共にインキュベートした。条件３は、ＤＩＬ２血漿希釈液（０．５％）と、それぞれＤＩＬ１及びＤＩＬ３の代わりに、ブランク１及びブランク３を有し、それらの各々のアプタマー群（Ａ１、Ａ２及びＡ３）と共にインキュベートした。条件４は、ＤＩＬ３血漿希釈液（２０％）と、それぞれＤＩＬ１及びＤＩＬ２の代わりに、ブランク１及びブランク２を有し、それらの各々のアプタマー群（Ａ１、Ａ２及びＡ３）と共にインキュベートした。最後に、条件５は血漿希釈液を一切含まず、全てのブランク（ブランク１、ブランク２及びブランク３）を有し、それらの各々のアプタマー群（Ａ１、Ａ２及びＡ３）と共にインキュベートした。各条件を、実施例１に記載したキャッチ−１及びキャッチ−２アッセイに供することにより、希釈液及び／またはブランクを、キャッチ−１から遊離させた後に全てを一緒に組み合わせ、アッセイのキャッチ−２パートに移した。
全てのタンパク質キャリーオーバーを定量化するために、条件１（すなわち、３つの希釈群ＤＩＬ１、ＤＩＬ２及びＤＩＬ３全て）のアプタマーシグナルと、条件２、３及び４（希釈群のうち１つのみがブランクと共に存在していた場合）の各々についてのアプタマーシグナルとの比に関する累積分布関数（ＣＤＦ）をプロットした（図１０を参照のこと）。アプタマーシグナルの比を、ハイブリダイゼーションアレイから得られた相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表す。図１０は、血漿試料の２０％希釈液（ＤＩＬ３）のみが存在する条件４の場合、条件１のアプタマーと条件４の同じアプタマーとのＲＦＵ値の比が約１であることを示している。対照的に、血漿試料の０．５％希釈液（ＤＩＬ２）のみが存在する条件３の場合、条件１のアプタマーと条件３の同じアプタマーとを比較したＲＦＵ値の比は約１〜６であり、条件１のアプタマーの約４５％以上が、条件３の同じアプタマーよりも約２〜６倍高くシグナルを発している。条件１と比較して、条件３下における単一アプタマー（例えば、タンパク質ＡＳＭ３Ａと結合するアプタマーが、ＤＩＬ２希釈液と共にインキュベートされるＡ２群のアプタマーの一部である）のシグナル伝達を見ると、ＡＳＭ３Ａアプタマーは、条件３と比較して条件１では５倍高い。血漿試料の０．００５％希釈液（ＤＩＬ１）のみが存在する条件２の場合、条件１のアプタマーと条件２の同じアプタマーとを比較したＲＦＵ値の比も約１〜６倍であり、条件１のアプタマーの約２０％以上が、条件２の同じアプタマーよりも約２〜６倍高くシグナルを発している。Ａ１アプタマー群の一部であり、ＤＩＬ１希釈液と共にインキュベートされる、ＡｐｏＥタンパク質に結合するアプタマーを比較すると、このアプタマーは、条件２と比較して条件１では２００倍高いＲＦＵ値を有し、条件４と比較して条件１では８０倍高いＲＦＵ値を有し、条件３と比較して条件１では６００倍高いＲＦＵ値を有した。
これらのデータは、３つの希釈試料全てをアッセイのキャッチ−２フェーズで同時に組み合わせる場合に、アッセイで検出される０．５％血漿希釈試料（ＤＩＬ２）及び０．００５％血漿希釈試料（ＤＩＬ１）のシグナルが、２０％血漿希釈試料（ＤＩＬ３）のタンパク質キャリーオーバーに起因したことを示している。このタンパク質キャリーオーバーは、Ａ３アプタマー群のアプタマーに非特異的に結合する２０％血漿希釈試料（ＤＩＬ３）中のタンパク質に起因すると思われ、これらをアッセイのキャッチ−１フェーズ中に、例えば、第１固体支持体からの光切断によって溶液から遊離し（キャッチ−１）、３つの希釈群全てとアプタマー群を同時に組み合わせるアッセイのキャッチ−２フェーズに移す。アッセイのこのフェーズで、競合物を添加して非特異的アプタマー−タンパク質相互作用を予防する場合、２０％血漿希釈液から非特異的にキャリーオーバーしたタンパク質を、Ａ２アプタマー群及びＡ１アプタマー群の非結合アプタマーと相互作用させ、続いてそれらの同族アプタマーに遭遇して安定した複合体を形成させる。次いで、これらのタンパク質キャリーオーバー：アプタマー複合体を破壊して、アプタマーをハイブリダイゼーションアレイ上で陽性シグナルとして検出し、これが技術的には偽陽性シグナルまたは「ノイズ」である。これらの同じデータを、生体試料としての血清で観察した（データは示さず）。
これらのデータは、タンパク質キャリーオーバー軽減戦略が、マルチプレックスアッセイがアッセイのダイナミックレンジ内に留まり、アッセイの感度及び特異性を最大化させることを保証するのに必要であることを示している。
実施例３：マルチプレックスアッセイにおいて非特異的標的分子の捕捉を減少させる軽減戦略
本実施例は、マルチキャッチマルチプレックスアッセイにおける非特異的標的分子の捕捉及びキャリーオーバーを減少させる例示的な軽減戦略に関する記載を提供する。
実施例１は、マルチキャッチマルチプレックスアッセイの陽性シグナルが、アッセイにおける非特異的標的分子の捕捉及びキャリーオーバーからどのように誘導される可能性があるのか、ならびにその起源に関する記載を提供した。このマルチキャッチマルチプレックスアッセイにおいて不必要なタンパク質キャリーオーバーを軽減するために、生体試料の希釈試料の逐次的な遊離及び捕捉を、各々のアプタマー群と共に、アッセイのキャッチ−１フェーズからアッセイのキャッチ−２フェーズへの移行の過程で実施した。２つの逐次的な希釈キャッチ形式及び３つの逐次的な希釈キャッチ形式の全体概要を、それぞれ図９及び７に示す。
本実施例では、血漿の同じ３つの異なる希釈群（ＤＩＬ３、ＤＩＬ２及びＤＩＬ１）を、実施例１に記載したものと同じアプタマー群（Ａ１、Ａ２及びＡ３）と共に作製した（図８を参照のこと）。さらに、実施例１の表２に記載したものと同じ条件を使用した。実施例１に従って、アッセイのキャッチ−１フェーズについて記載したものと同じアプローチに従ったが、本実施例では、異なる希釈群またはブランクを別個に遊離させ、実施例１のように同時にではなく、アッセイのキャッチ−２フェーズに順に移した（図８を参照のこと）。より具体的に条件１では、アプタマー群Ａ１とインキュベートしたＤＩＬ１群（ＤＩＬ１−Ａ１群）をキャッチ−１から遊離させ、第２固体支持体（キャッチ−２）上に固定化して洗浄した。次に、アプタマー群Ａ２とインキュベートしたＤＩＬ２群をキャッチ−１から遊離させ、キャッチ−２上にすでに固定化したＤＩＬ１−Ａ１群と組み合わせ、次いで第２固体支持（キャッチ−２）上に固定化した。そして、アプタマー群Ａ３とインキュベートしたＤＩＬ３群をキャッチ−１から遊離させ、第２固体支持（キャッチ−２）に固定化して洗浄した。表２で概説したように、希釈した生体試料の代わりにブランク（ブランク１、２及び／または３）を含んだ残りの条件（条件２、３、４及び５）を、同じ逐次的キャッチアプローチに供した。
全てのタンパク質キャリーオーバーを定量化するために、条件１（すなわち、３つの希釈群ＤＩＬ１、ＤＩＬ２及びＤＩＬ３全て）のアプタマーシグナルと、条件２、３及び４（希釈群のうち１つのみがブランクと共に存在していた場合）の各々についてのアプタマーシグナルとの比に関する累積分布関数（ＣＤＦ）をプロットした（図１１を参照のこと）。アプタマーシグナルの比を、ハイブリダイゼーションアレイから得られた相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表す。マルチプレックスアッセイの非逐次的なバージョンと同様に、図１１は、血漿試料の２０％希釈液（ＤＩＬ３）のみが存在する条件４の場合、条件１のアプタマーと条件４の同じアプタマーとのＲＦＵ値の比が約１であることを示している。血漿試料の０．５％希釈液（ＤＩＬ２）のみが存在する条件３の場合、条件１のアプタマーと条件３の同じアプタマーとを比較したＲＦＵ値の比は約１〜６であるが、条件１のアプタマーの約５％未満のみが、条件３の同じアプタマーよりも約２〜６倍高くシグナルを発している（アッセイの非逐次的なキャッチ−２バージョンの４５％に対して）。さらに、血漿試料の０．００５％希釈液（ＤＩＬ１）のみが存在する条件２の場合、条件１のアプタマーと条件２の同じアプタマーとを比較したＲＦＵ値の比も約１〜６倍であるが、条件１のアプタマーの約１０％未満のみが、条件２の同じアプタマーよりも約２〜６倍高くシグナルを発している（アッセイの非逐次的なキャッチ−２バージョンの２０％に対して）。これらの同じデータを、生体試料としての血清で観察した（データは示さず）。
これらのデータは、２つ以上の希釈した生体試料セットをその各々のインキュベートした捕捉試薬と共に、アッセイの第１キャッチフェーズからアッセイの第２キャッチフェーズへと順に移すことによって、タンパク質キャリーオーバーが、２つ以上の試料希釈セットを有する２つのキャッチマルチプレックスアッセイで軽減される可能性があることを示している。この逐次的な移行アプローチによって、マルチプレックスアッセイがアッセイのダイナミックレンジ内に留まり、アッセイの感度及び特異性を最大化してアッセイ中の存在し得る偽陽性シグナルまたは「ノイズ」を減少させることが保証される。
実施例４：マルチプレックスアッセイにおいて中央値シグナル対バックグラウンド比が最も高い、線形範囲内の分析物数を最大化するための生体試料の希釈液選択
本実施例は、マルチプレックスアッセイにおいて最大の中央値シグナル対バックグラウンドシグナル比を依然として維持しながら、線形範囲内の分析物数を最大化させる生体試料の希釈レベルを選択することに関する記載を提供する。
複数の標的タンパク質が複数の捕捉試薬によって測定されるマルチプレックスアッセイ形式では、異なる標的タンパク質の存在量の自然な変動によって、ある特定の標的タンパク質を測定するある特定の捕捉試薬の能力が制限され得る（例えば、高存在量の標的タンパク質がアッセイを飽和させ、低存在量の標的タンパク質を測定するアッセイの能力を妨害または低減させる可能性がある）。生体試料中におけるこの変動に対処するために、アプタマー試薬を、生体試料中のそれらの各々のタンパク質標的量に基づいて、少なくとも２つの異なる群、好ましくは３つの異なる群に分ける。生体試料を少なくとも２つ、好ましくは３つの異なる希釈群に希釈し、タンパク質標的の捕捉試薬によって検出されるそれらの相対濃度に基づいて別個の試験試料を作製する。したがって、生体試料を高、中及び低存在量の標的タンパク質希釈群に希釈し、最も存在量の少ないタンパク質標的を最小希釈群で測定し、最も存在量の多いタンパク質標的を最大希釈群で測定する。アプタマーベースのマルチキャッチマルチプレックスアッセイでは歴史的に、生体試料の３つの希釈群は、４０％希釈液、１％希釈液及び０．００５％希釈液であった。
本実施例では、４０％希釈群を再考し、異なる希釈液がマルチキャッチマルチプレックスアッセイにより大きな利益をもたらす（例えば、アッセイの線形範囲内で分析物数を最大化させる、及び／または中央値シグナル対バックグラウンドシグナル比を改善する）ことになるのかどうかを決定した。この希釈群は、緩衝液のみと比較して、若干の非特異的結合、シグナルの非線形性及び陰性対照からのより高いシグナルを示す。
簡潔に述べると、いくつかの希釈群を、３人の異なる対象の血漿から作製した（４０％、２０％、１０％及び５％希釈群）。９０３個のアプタマーのプールを、３人の対象全ての異なる希釈群と共にインキュベートし、本明細書に記載した２つのキャッチマルチプレックスアッセイに使用した。
ハイブリダイゼーションアレイのアプタマーによって測定されるような、希釈液（４０％、２０％、１０％及び５％）の各々の線形範囲内にある分析物数を決定した。４０％希釈液の場合、２４６個の分析物が線形範囲内にあり、２０％希釈液の場合は３８８個の分析物が線形範囲内にあり、１０％希釈液の場合は５１７個の分析物が線形範囲内にあり、５％希釈液の場合は５８５個の分析物が線形範囲内にあった。９０３個のうち残りの２５９個は、線形範囲を有しなかった。したがって、これらのデータは、試料の希釈度が増加すると、線形範囲内の分析物数が増加することを示している（すなわち、試料が希釈されるほど、線形範囲内の分析物数が増加する）。
各希釈液（４０％、２０％、１０％及び５％）は、異なる中央値シグナル対バックグラウンドシグナル比（または中央値Ｓ／Ｂ）を示した。４０％希釈液の場合、中央値Ｓ／Ｂは１０であり、２０％希釈液の場合、中央値Ｓ／Ｂは７．８であり、１０％希釈液の場合、中央値Ｓ／Ｂは５．４であり、５％希釈液の場合、中央値Ｓ／Ｂは３．７であった。したがって、これらのデータは、試料をさらに希釈すると中央値Ｓ／Ｂが低下することを示している。
上記データは、試料の希釈度に関連して線形範囲内の分析物数と中央値Ｓ／Ｂとの間に緊張関係があることを示している。希釈度が低いとより高くなる中央値Ｓ／Ｂと共に、希釈度が高い線形範囲内の分析物数で観察した改善のバランスを取るように、「中間」を、２つのキャッチマルチプレックスアプタマーアッセイの生体試料の「最適な」希釈液として選択した。図１２は、４０％、２０％、１０％及び５％の希釈液の各々について、中央値Ｓ／Ｂと共に線形範囲内における分析物の数のグラフ表示である。図１２によると、生体試料の２０％希釈液では、最大の中央値Ｓ／Ｂを有する線形範囲内の分析物の最大数を観察する（２本の線が交差する箇所）。したがって、マルチキャッチマルチプレックスアプタマーアッセイで使用した３つの希釈液のうち、「低存在量」のタンパク質を標的とするアプタマーが、４０％希釈液ではなく、生体試料の２０％希釈液と共にインキュベートするのにより適している。
要約すると、本明細書の実施例セクションに記載したマルチプレックスアッセイは、２０％、０．５％及び０．００５％の試料希釈液形式を使用する。さらに、血清中のより高い競合分子濃度は、同じ個体からの血清及び血漿中の測定値間に良好な相関をもたらした（データは示さず）。加えて、競合分子の濃度が高く（２０μＭと比較して３０μＭまたは６０μＭ）、試料濃度が低い（例えば、４０％〜２０％）と、スパイク及び回収率の増加、線形範囲内の分析物数の増加及び非特異的結合の低下をもたらした。試料希釈剤中の競合分子（Ｚ−ブロック、配列（（Ａ−Ｃ−ＢｎｄＵ−ＢｎｄＵ）7ＡＣ）を有するオリゴヌクレオチド）の濃度は、血清試料で６０μＭ及び血漿試料で３０μＭであった。これまでのアッセイ形式では、血清及び血漿に２０μＭのＺ−ブロックを使用していた。血清中のより高い競合分子濃度は、同じ個体からの血清及び血漿中の測定値間に良好な相関をもたらした（データは示さず）。非特異的結合の低下によって、光切断後の複合体形成に利用可能なタンパク質の量がより少なくなるはずである。

Claims (75)

  1. 方法であって、
    ａ）第１希釈試料を第１アプタマーと接触させることであり、第１アプタマー親和性複合体が、前記第１アプタマーとその標的分子との相互作用によって、前記標的分子が前記第１希釈試料中に存在する場合に形成される、前記接触させること、
    ｂ）第２希釈試料を第２アプタマーと接触させることであり、第２アプタマー親和性複合体が、前記第２アプタマーとその標的分子との相互作用によって、前記標的分子が前記第２希釈試料中に存在する場合に形成される、前記接触させること、
    ｃ）アプタマー親和性複合体の形成を可能にするために、前記第１希釈試料及び前記第２希釈試料を別々にインキュベートすること、
    ｄ）前記第１アプタマー親和性複合体を含む前記第１希釈試料を第１混合物に移すことであり、前記第１アプタマー親和性複合体が、前記第１混合物中の固体支持体上に捕捉される、前記移すこと、
    ｅ）ステップｄ）の後、前記第２希釈試料を前記第１混合物に移して第２混合物を形成することであり、前記第２希釈液の前記第２アプタマー親和性複合体が、前記第２混合物中の固体支持体上に捕捉される、前記形成すること、
    ｆ）前記第１アプタマー親和性複合体及び前記第２アプタマー親和性複合体の前記第１アプタマー及び前記第２アプタマーの存在を検出すること、もしくはそのレベルを決定すること、または１つ以上の前記第１アプタマー親和性複合体及び前記第２アプタマー親和性複合体の存在もしくは量を検出すること、
    を含み、
    前記第１希釈液及び前記第２希釈液が、同じ試験試料の異なる希釈液である、
    前記方法。
  2. 前記試験試料が、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１アプタマー−標的分子親和性複合体及び前記第２アプタマー−標的分子親和性複合体が、非共有結合複合体である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記第１希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第２希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記第１希釈液が、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第２希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記第１希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第２希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である、請求項１に記載の方法。
  8. 前記第１希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第２希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である、請求項１に記載の方法。
  9. 前記第１希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第２希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である、請求項１に記載の方法。
  10. 前記第１希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第２希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である、請求項１に記載の方法。
  11. 解離した第１及び第２捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定することが、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される、請求項１に記載の方法。
  12. 前記第１アプタマー及び／または前記第２アプタマーが、独立して、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記少なくとも１つの５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの前記５位にリンカーと、前記リンカーに結合した部分とを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記リンカーが、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記部分が疎水部分である、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記部分が、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記部分が、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される、請求項１５に記載の方法。
  18. 前記５位修飾ピリミジンの前記ピリミジンが、ウリジン、シチジンまたはチミジンである、請求項１２に記載の方法。
  19. 第３希釈試料を第３アプタマーと接触させることをさらに含み、第３アプタマー親和性複合体が、前記第３アプタマーとその標的分子との相互作用によって、前記標的分子が前記第３希釈試料中に存在する場合形成される、請求項１に記載の方法。
  20. 前記第３希釈試料が、前記第１希釈試料及び前記第２希釈試料とは別にインキュベートされ、前記第３アプタマーとその前記標的分子とのアプタマー親和性複合体の形成を可能にする、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記第３希釈試料を前記第２混合物に移して第３混合物を形成することをさらに含み、前記第３希釈液の前記第３アプタマー親和性複合体が、前記第３混合物中の固体支持体上に捕捉される、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記第３アプタマー親和性複合体の前記第３アプタマーの存在を検出すること、もしくはそのレベルを決定すること、または前記第３アプタマー親和性複合体の存在もしくは量を検出することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記第３希釈液が、同じ試験試料の前記第１希釈液及び前記第２希釈液とは異なる希釈液である、請求項１９に記載の方法。
  24. 前記第３希釈液が、５％〜３９％（または５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）、１５％〜３０％、１５％〜２５％、約２０％；０．０１％〜１％（または０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％）、０．１％〜０．８％、０．２％〜０．７５％、約０．５％；及び０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）、または０．００２％〜０．００８％、０．００３％〜０．００７％、約０．００５％から選択される前記試験試料の希釈液である、請求項１９に記載の方法。
  25. 前記第３アプタマーが、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む、請求項１９に記載の方法。
  26. 前記少なくとも１つの５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの前記５位にリンカーと、前記リンカーに結合した部分とを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記リンカーが、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記部分が疎水部分である、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記部分が、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記部分が、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記５位修飾ピリミジンの前記ピリミジンが、ウリジン、シチジンまたはチミジンである、請求項２５に記載の方法。
  32. 方法であって、
    ａ）第１捕捉試薬を第１希釈液と接触させて第１混合物を形成し、第２捕捉試薬を第２希釈液と接触させて第２混合物を形成することであり、前記第１捕捉試薬及び前記第２捕捉試薬の各々が、それぞれ固体支持体上に固定化され、前記第１捕捉試薬及び前記第２捕捉試薬の各々が、異なる標的分子に対して親和性を有する、前記形成すること、
    ｂ）前記第１混合物及び前記第２混合物を別々にインキュベートすることであり、前記第１捕捉試薬が親和性を有する前記標的分子が前記第１混合物中に存在する場合、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体が前記第１混合物中に形成され、前記第２捕捉試薬が親和性を有する前記標的分子が前記第２混合物中に存在する場合、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体が前記第２混合物中に形成される、前記インキュベートすること、
    ｃ）（ｉ）前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び（ｉｉ）前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体から選択される順序で、第４混合物中において前記親和性複合体を順に遊離させて組み合わせること、
    ｄ）前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体の前記標的分子に第１タグを付けること、
    ｅ）前記タグ付き第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び前記タグ付き第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の固体支持体に接触させて、前記タグが前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体を前記１つ以上の固体支持体に固定化させるようにすること、
    ｆ）前記捕捉試薬を前記捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、
    ｇ）前記解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定すること、
    を含み、
    前記第１希釈液及び前記第２希釈液が、試験試料の異なる希釈液である、
    前記方法。
  33. 前記試験試料が、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記第１捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体及び前記第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体が、非共有結合複合体である、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記第１捕捉試薬及び前記第２捕捉試薬が、独立して、アプタマーまたは抗体から選択される、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記第１希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第２希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記第１希釈液が、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第２希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記第１希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第２希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記第１希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第２希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である、請求項３２に記載の方法。
  41. 前記第１希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第２希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である、請求項３２に記載の方法。
  42. 前記第１希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第２希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である、請求項３２に記載の方法。
  43. 前記解離した第１捕捉試薬及び前記解離した第２捕捉試薬の前記存在の前記検出またはその前記レベルの前記決定が、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される、請求項３２に記載の方法。
  44. 第３捕捉試薬を第３希釈液と接触させて第３混合物を形成することをさらに含み、前記第３捕捉試薬が固体支持体上に固定化され、前記第３捕捉試薬が、前記第１捕捉試薬及び前記第２捕捉試薬の前記標的分子とは異なる標的分子に対して親和性を有する、請求項３２に記載の方法。
  45. 前記第１混合物及び前記第２混合物とは別に前記第３混合物をインキュベートすることをさらに含み、前記第３捕捉試薬が親和性を有する前記標的分子が前記第３混合物中に存在する場合、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体が前記第３混合物中に形成される、請求項４４に記載の方法。
  46. （ｉ）前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉ）前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉｉ）前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｖ）前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｖ）前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、及び（ｖｉ）前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体から選択される順序で順に遊離させて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体と前記第４混合物中に組み合わせることをさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記第３希釈液が、同じ試験試料の前記第１希釈液及び前記第２希釈液とは異なる希釈液である、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記第３希釈液が、５％〜３９％（または５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）、１５％〜３０％、１５％〜２５％、約２０％；０．０１％〜１％（または０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％）、０．１％〜０．８％、０．２％〜０．７５％、約０．５％；及び０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）、または０．００２％〜０．００８％、０．００３％〜０．００７％、約０．００５％から選択される前記試験試料の希釈液である、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記第３アプタマー親和性複合体の前記第３アプタマーの存在を検出すること、もしくはそのレベルを決定すること、または前記第３アプタマー親和性複合体の存在もしくは量を検出することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
  50. 前記アプタマーが、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む、請求項３２〜４９に記載の方法。
  51. 前記少なくとも１つの５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの前記５位にリンカーと、前記リンカーに結合した部分とを含む、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記リンカーが、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記部分が疎水部分である、請求項５１に記載の方法。
  54. 前記部分が、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記部分が、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記５位修飾ピリミジンの前記ピリミジンが、ウリジン、シチジンまたはチミジンである、請求項５０に記載の方法。
  57. 方法であって、
    ａ）第１捕捉試薬を第１希釈液と接触させて第１混合物を形成し、第２捕捉試薬を第２希釈液と接触させて第２混合物を形成し、第３捕捉試薬を第３希釈液と接触させて第３希釈混合物を形成することであり、前記第１捕捉試薬、前記第２捕捉試薬、及び前記第３捕捉試薬の各々が、それぞれ固体支持体上に固定化され、前記第１捕捉試薬、前記第２捕捉試薬、及び前記第３捕捉試薬の各々が、異なる標的分子に対して親和性を有する、前記形成すること、
    ｂ）前記第１混合物、前記第２混合物及び前記第３混合物を別々にインキュベートすることであり、前記第１捕捉試薬が親和性を有する前記標的分子が前記第１混合物中に存在する場合、第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体が前記第１混合物中に形成され、前記第２捕捉試薬が親和性を有する前記標的分子が前記第２混合物中に存在する場合、第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体が前記第２混合物中に形成され、前記第３捕捉試薬が親和性を有する前記標的分子が前記第３混合物中に存在する場合、第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体が前記第３混合物中に形成される、前記インキュベートすること、
    ｃ）（ｉ）前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉ）前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｉｉ）前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｉｖ）前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体、（ｖ）前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、及び（ｖｉ）前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体に続いて、前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体から選択される順序で、前記親和性複合体を順に遊離させて第４混合物中において組み合わせること、
    ｄ）前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、及び前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体の前記標的分子に第１タグを付けること、
    ｅ）前記タグ付き第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、前記タグ付き第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体、及び前記タグ付き第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を１つ以上の固体支持体に接触させて、前記タグが前記第１捕捉試薬−標的分子親和性複合体、前記第２捕捉試薬−標的分子親和性複合体及び前記第３捕捉試薬−標的分子親和性複合体を前記１つ以上の固体支持体に固定化させるようにすること、
    ｆ）前記捕捉試薬を前記捕捉試薬−標的分子親和性複合体から解離させること、
    ｇ）前記解離した捕捉試薬の存在を検出すること、またはそのレベルを決定すること、
    を含み、
    前記第１希釈液、前記第２希釈液、及び前記第３希釈液が、試験試料の異なる希釈液である、
    前記方法。
  58. 前記試験試料が、血漿、血清、尿、全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、痰、涙、粘液、鼻洗浄液、鼻吸引液、精液、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、気管支擦過液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液から選択される、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記第１捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体、前記第２捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体及び前記第３捕捉試薬−標的タンパク質親和性複合体が、非共有結合複合体である、請求項５７に記載の方法。
  60. 前記第１捕捉試薬、前記第２捕捉試薬及び前記第３捕捉試薬が、独立して、アプタマーまたは抗体から選択される、請求項５７に記載の方法。
  61. 前記標的分子が、タンパク質、ペプチド、炭水化物、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、細菌、代謝産物、補因子、阻害剤、薬物、染料、栄養素、成長因子、細胞及び組織から選択される、請求項５７に記載の方法。
  62. 前記解離した第１捕捉試薬及び前記解離した第２捕捉試薬の前記存在の前記検出またはその前記レベルの前記決定が、ＰＣＲ、質量分析、核酸シーケンシング、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）またはハイブリダイゼーションによって実施される、請求項５７に記載の方法。
  63. 前記アプタマーが、少なくとも１つの５位修飾ピリミジンを含む、請求項６０に記載の方法。
  64. 前記少なくとも１つの５位修飾ピリミジンが、前記ピリミジンの前記５位にリンカーと、前記リンカーに結合した部分とを含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記リンカーが、アミドリンカー、カルボニルリンカー、プロピニルリンカー、アルキンリンカー、エステルリンカー、尿素リンカー、カルバメートリンカー、グアニジンリンカー、アミジンリンカー、スルホキシドリンカー、及びスルホンリンカーから選択される、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記部分が疎水部分である、請求項６４に記載の方法。
  67. 前記部分が、図１の群Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＶ及びＸＶＩの部分から選択される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記部分が、ナフチル部分、ベンジル部分、フルオロベンジル部分、チロシル部分、インドール部分、モルホリノ部分、イソブチル部分、３，４−メチレンジオキシベンジル部分、ベンゾチオフェニル部分、及びベンゾフラニル部分から選択される、請求項６６に記載の方法。
  69. 前記５位修飾ピリミジンの前記ピリミジンが、ウリジン、シチジンまたはチミジンである、請求項６３に記載の方法。
  70. 前記第１希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第２希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第３希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である、請求項５７に記載の方法。
  71. 前記第１希釈液が、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第２希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第３希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である、請求項５７に記載の方法。
  72. 前記第１希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第２希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第３希釈液が、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である、請求項５７に記載の方法。
  73. 前記第１希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第２希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第３希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％である、請求項５７に記載の方法。
  74. 前記第１希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第２希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％であり、前記第３希釈液が、０．００１％〜０．００９％（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％）の前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％である、請求項５７に記載の方法。
  75. 前記第１希釈液が、５％〜３９％の（もしくは５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％もしくは３９％である）前記試験試料の希釈液であり、または１５％〜３０％であり、または１５％〜２５％であり、または約２０％であり、前記第２希釈液が、０．００１％〜０．００９％の（もしくは０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％もしくは０．００９％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．００２％〜０．００８％であり、または０．００３％〜０．００７％であり、または約０．００５％であり、前記第３希釈液が、０．０１％〜１％の（もしくは０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％である）前記試験試料の希釈液であり、または０．１％〜０．８％であり、または０．２％〜０．７５％であり、または約０．５％である、請求項５７に記載の方法。
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