BR112020026129A2

BR112020026129A2 - Ensaios proteômicos multiplex melhorados

Info

Publication number: BR112020026129A2
Application number: BR112020026129-7A
Authority: BR
Inventors: Stephan Kraemer; Evaldas Katilius; Dominic Zichi
Original assignee: Somalogic, Inc.
Priority date: 2018-06-22
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2021-03-16
Also published as: KR20210034597A; EP3810563A1; CA3104041A1; WO2019246289A1; AU2019290130A1; JP2021528646A; US20210247387A1; EP3810563A4; BR112020026129A8; MX2020013814A; IL279254A; BR112020026129B1; SG11202012472TA; CN112638845A

Abstract

métodos, dispositivos, reagentes e kits projetados para melhorar o desempenho de ensaios baseados em proteômica são fornecidos. tais métodos têm uma ampla utilidade em aplicações proteômicas para pesquisa e desenvolvimento, diagnósticos e terapêuticas, proporcionando uma redução ou eliminação do sinal de fundo e especificidade aprimorada para reagentes de ligação de proteínas em formatos de ensaio multiplex.

Description

"ENSAIOS PROTEÔMICOS MULTIPLEX MELHORADOS". CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente divulgação se refere geralmente ao campo de ensaios proteômicos e métodos, dispositivos, reagentes e kits projetados para melhorar o desempenho dos ensaios. Esses métodos têm uma ampla utilidade em aplicações proteômicas para pesquisa e desenvolvimento, diagnóstico e terapêutica. Especificamente, materiais e métodos são fornecidos para a redução ou eliminação do sinal de fundo e melhorar a especificidade dos reagentes de ligação de proteína em um formato de ensaio multiplex.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Ensaios dirigidos à detecção e quantificação de moléculas fisiologicamente significativas em amostras biológicas e outros tipos de amostras são ferramentas importantes na pesquisa científica e no campo da saúde. Por exemplo, os ensaios de arranjo multiplex empregam sondas ligadas à superfície para detectar moléculas alvo em uma amostra. As sondas ligadas à superfície podem ser oligonucleotídeos, peptídeos, polipeptídeos, proteínas, anticorpos, affϊbodies, aptâmeros ou outras moléculas (coletivamente biopolímeros) capazes de se ligar a moléculas alvo da amostra. Essas interações de ligação são a base para muitos dos métodos e dispositivos usados em uma variedade de campos diferentes, por exemplo, genômica, transcriptômica e proteômica.

[003] Os ensaios fornecem interação com o alvo baseada em solução e etapas de separação projetadas para remover componentes específicos de uma mistura de ensaio. No entanto, a sensibilidade e a especificidade de muitos formatos de ensaio são limitadas pela capacidade do método de detecção de resolver o sinal verdadeiro do sinal que surge devido a associações não específicas durante o ensaio e resulta em um sinal falso detectado. Isso é particularmente verdadeiro para ensaios multiplexados, independentemente do reagente de captura usado (por exemplo, anticorpo ou aptâmeros). Uma das principais fontes de ligação não específica são as interações não previstas do reagente de captura não específica com as moléculas alvo ou as interações de ligação não específicas. Esta divulgação descreve métodos para eliminar ou reduzir o sinal de fundo observado em ensaio proteômico baseado em multiplexado, enquanto mantém interações específicas do reagente alvo/captura.

SUMÁRIO

[004] Em algumas modalidades, é divulgado um método que compreende a) colocar em contato uma amostra de primeira diluição com um primeiro aptâmero, em que um primeiro complexo de afinidade de aptâmero é formado pela interação do primeiro aptâmero com sua molécula alvo, se a molécula alvo estiver presente na primeira amostra de diluição; b) colocar em contato uma amostra de segunda diluição com um segundo aptâmero, em que um segundo complexo de afinidade de aptâmero é formado pela interação do segundo aptâmero com sua molécula alvo, se a molécula alvo estiver presente na amostra de segunda diluição; c) incubar as amostras da primeira e da segunda diluição separadamente para permitir a formação do complexo de afinidade de aptâmero; d) transferir a primeira amostra de diluição com o primeiro complexo de afinidade de aptâmero para uma primeira mistura, em que o primeiro complexo de afinidade de aptâmero é capturado em um suporte sólido na primeira mistura; e) após a etapa d), a transferência da amostra de segunda diluição para a primeira mistura para formar uma segunda mistura, em que o segundo complexo de afinidade de aptâmero da segunda diluição é capturado em um suporte sólido na segunda mistura; f) detectar a presença ou determinar o nível do primeiro e segundo aptâmero do primeiro e segundo complexos de afinidade de aptâmero,

ou a presença ou quantidade de um ou mais dos primeiro e segundo complexos de afinidade de aptâmero; em que, a primeira diluição e a segunda diluição são diluições diferentes da mesma amostra de teste.

[005] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovação brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

[006] Em outro aspecto, o primeiro e o segundo complexos de afinidade de molécula de aptâmero alvo são complexos não covalentes.

[007] Em outro aspecto, a molécula alvo é selecionada de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

[008] Em outro aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou em que é de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

[009] Em outro aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

[0010] Em outro aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

[0011] Em outro aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[0012] Em outro aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%,

12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

[0013] Em outro aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[0014] Em outro aspecto, a detecção da presença ou a determinação do nível do primeiro e segundo reagentes de captura dissociados é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

[0015] Em outro aspecto, o primeiro aptâmero e/ou o segundo aptâmero, independentemente, compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[0016] Em outro aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[0017] Em outro aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[0018] Em outro aspecto, em que a porção é uma porção hidrofóbica.

[0019] Em outro aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[0020] Em outro aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[0021] Em outro aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[0022] Em outro aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda o contato de uma terceira amostra de diluição com um terceiro aptâmero, em que um terceiro complexo de afinidade de aptâmero é formado pela interação do terceiro aptâmero com sua molécula alvo se a molécula alvo estiver presente na amostra de terceira diluição;

[0023] Em outro aspecto, a terceira amostra de diluição é incubada separadamente da primeira e segunda amostras de diluição para permitir a formação de um complexo de afinidade de aptâmero do terceiro aptâmero com sua molécula alvo.

[0024] Em outro aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda a transferência da amostra da terceira diluição para a segunda mistura para formar uma terceira mistura, em que o terceiro complexo de afinidade de aptâmero da terceira diluição é capturado em um suporte sólido na terceira mistura.

[0025] Em outro aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda a detecção da presença ou determinação do nível do terceiro aptâmero do terceiro complexo de afinidade de aptâmero, ou a presença ou quantidade do terceiro complexo de afinidade de aptâmero;

[0026] Em outro aspecto, a terceira diluição é uma diluição diferente da primeira diluição e da segunda diluição da mesma amostra de teste.

[0027] Em outro aspecto, a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste selecionada de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%), de 15% a 30%, de 15% a 25%, cerca de 20%; de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%), de 0,1% a 0,8%, de 0,2% a 0,75%, cerca de 0,5%; e de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008%, de 0,003% a 0,007%, cerca de 0,005%.

[0028] Em outro aspecto, o terceiro aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[0029] Em outro aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[0030] Em outro aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[0031] Em outro aspecto, a porção é uma porção hidrofóbica.

[0032] Em outro aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[0033] Em outro aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[0034] Em outro aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[0035] Em algumas modalidades, é divulgado um método que compreende a) colocar em contato um primeiro reagente de captura com uma primeira diluição para formar uma primeira mistura e um segundo reagente de captura com uma segunda diluição para formar uma segunda mistura, em que cada um dos primeiro e segundo reagentes de captura são cada um imobilizado em um suporte sólido, e em que cada um dos primeiro e segundo reagentes de captura tem afinidade para uma molécula alvo diferente; b) incubar a primeira mistura e a segunda mistura separadamente, em que um primeiro complexo de afinidade reagente de captura-molécula alvo é formado na primeira mistura se a molécula alvo para a qual o primeiro reagente de captura tem afinidade estiver presente na primeira mistura, em que um o segundo complexo de afinidade reagente de captura-molécula alvo é formado na segunda mistura se a molécula alvo para a qual o segundo reagente de captura tem afinidade estiver presente na segunda mistura; c) liberar sequencialmente e combinar os complexos de afinidade em uma quarta mistura em uma ordem selecionada de (i) o primeiro complexo de afinidade reagente de captura-molécula alvo, seguido pelo segundo complexo de afinidade reagente de captura- molécula alvo e (ii) o segundo reagente de captura -complexo de afinidade de molécula alvo, seguido do primeiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura; d) anexar um primeiro marcador à molécula alvo dos primeiros e segundos complexos de afinidade reagente-molécula alvo de captura; e) contatar os complexos de afinidade reagente-molécula alvo de captura marcados com um ou mais suportes sólidos de modo que o marcador imobilize o primeiro e o segundo complexos de afinidade reagente-molécula alvo de captura em um ou mais suportes sólidos; f) dissociar os reagentes de captura dos complexos de afinidade reagente de captura-molécula alvo; g) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, a primeira diluição e a segunda diluição são diluições diferentes de uma amostra de teste.

[0036] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovação brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

[0037] Em um aspecto, o primeiro e o segundo complexos de afinidade de proteína alvo-reagente de captura são complexos não covalentes.

[0038] Em um aspecto, o primeiro reagente de captura e o segundo reagente de captura são, independentemente, selecionados de um aptâmero ou anticorpo.

[0039] Em outro aspecto, a molécula alvo é selecionada de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

[0040] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou é de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

[0041] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

[0042] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

[0043] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[0044] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

[0045] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[0046] Em outro aspecto, a detecção da presença ou a determinação do nível do primeiro e segundo reagentes de captura dissociados é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

[0047] Em um aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda o contato de um terceiro reagente de captura com uma terceira diluição para formar uma terceira mistura, em que o terceiro reagente de captura é imobilizado em um suporte sólido e em que o terceiro reagente de captura tem afinidade com uma molécula alvo diferente do que as moléculas alvo do primeiro e segundo reagentes de captura.

[0048] Em outro aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda a incubação da terceira mistura separadamente da primeira mistura e da segunda mistura, em que um terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é formado na terceira mistura se a molécula alvo com a qual o terceiro reagente de captura tem afinidade por estar presente na terceira mistura.

[0049] Em outro aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem adicionalmente a liberação sequencial e a combinação do terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura com o primeiro e segundo complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura na quarta mistura em uma ordem selecionada de (i) o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (ii) o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (iii) o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (iv) o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (v) o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; e (vi) o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura.

[0050] Em um aspecto, a terceira diluição é uma diluição diferente da primeira diluição e da segunda diluição da mesma amostra de teste.

[0051] Em um aspecto, a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste selecionada de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%), de 15% a 30%, de 15% a 25%, cerca de 20%; de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%), de 0,1% a 0,8%, de 0,2% a 0,75%, cerca de 0,5%; e de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008%, de 0,003% a 0,007%, cerca de 0,005%.

[0052] Em outro aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda a detecção da presença ou determinação do nível do terceiro aptâmero do terceiro complexo de afinidade de aptâmero, ou a presença ou quantidade do terceiro complexo de afinidade de aptâmero.

[0053] Em um aspecto, o aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[0054] Em um aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[0055] Em um aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[0056] Em um aspecto, a porção é uma porção hidrofóbica.

[0057] Em um aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[0058] Em um aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[0059] Em um aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[0060] Em algumas modalidades, é divulgado um método que compreende a) colocar em contato um primeiro reagente de captura com uma primeira diluição para formar uma primeira mistura, um segundo reagente de captura com uma segunda diluição para formar uma segunda mistura e um terceiro reagente de captura com uma terceira diluição para formar uma terceira mistura de diluição, em que cada um dos primeiro, segundo e terceiro reagentes de captura são cada um imobilizado em um suporte sólido, e em que cada um dos primeiro, segundo e terceiro reagentes de captura têm afinidade para uma molécula alvo diferente; b) incubar a primeira mistura, a segunda mistura e a terceira mistura separadamente, em que um primeiro complexo de afinidade reagente de captura-molécula alvo é formado na primeira mistura se a molécula alvo para a qual o primeiro reagente de captura tem afinidade estiver presente na primeira mistura, em que um segundo complexo de afinidade reagente de captura-molécula alvo é formado na segunda mistura se a molécula alvo para a qual o segundo reagente de captura tem afinidade está presente na segunda mistura, e em que um terceiro complexo de afinidade reagente de captura-molécula alvo é formado em a terceira mistura se a molécula alvo para a qual o terceiro reagente de captura tem afinidade estiver presente na terceira mistura; c) liberar sequencialmente e combinar os complexos de afinidade em uma quarta mistura em uma ordem selecionada de (i) o primeiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo terceiro reagente de captura- complexo de afinidade da molécula alvo; (ii) o primeiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade reagente- molécula alvo de captura; (iii) o segundo complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura; (iv) o segundo complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade reagente- molécula alvo de captura; (v) o terceiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura; e (vi) o terceiro complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade reagente-molécula alvo de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade reagente- molécula alvo de captura; d) anexar uma primeira marcação à molécula alvo do primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade reagente-molécula alvo de captura; e) contatar os complexos de afinidade de molécula alvo-reagente de captura marcados de primeiro, segundo e terceiro com um ou mais suportes sólidos de modo que a marcação imobilize os complexos de afinidade de molécula alvo- reagente de captura primeiro, segundo e terceiro para um ou mais suportes sólidos; f) dissociar os reagentes de captura dos complexos de afinidade reagente de captura-molécula alvo; g) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, a primeira diluição, a segunda diluição e a terceira diluição são diluições diferentes de uma amostra de teste.

[0061] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovação brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

[0062] Em um aspecto, o primeiro, o segundo d o terceiro complexos de afinidade de proteína alvo-reagente de captura são complexos não covalentes.

[0063] Em um aspecto, o primeiro reagente de captura, o segundo reagente de captura e o terceiro reagente de captura são, independentemente, selecionados de um aptâmero ou anticorpo.

[0064] Em outro aspecto, a molécula alvo é selecionada de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

[0065] Em outro aspecto, a detecção da presença ou a determinação do nível do primeiro e segundo reagentes de captura dissociados é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

[0066] Em um aspecto, o aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[0067] Em um aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[0068] Em um aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[0069] Em um aspecto, a porção é uma porção hidrofóbica.

[0070] Em um aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[0071] Em um aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma de porção de fluorobenzila, uma de porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[0072] Em um aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[0073] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%, a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou é 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou é de 15% a 30% ou é de 15% a 25% ou de cerca de 20%.

[0074] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%,

0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%.

[0075] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%.

[0076] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou é 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%.

[0077] Em um aspecto, a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou é de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%, a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%.

[0078] Em um aspecto a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou é 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%.

[0079] Os objetos, características e vantagens anteriores e outros da invenção tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada, que prossegue com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0080] Fig. 1. Determinadas uridinas e citidinas modificadas em posição 5 exemplares que podem ser incorporadas em aptâmeros.

[0081] Fig. 2. Certas modificações exemplares que podem estar presentes na posição 5 da uridina. A estrutura química da modificação C-5 inclui a ligação de amida exemplar que liga a modificação à posição 5 da uridina. As frações da posição 5 apresentadas incluem uma porção de benzil (por exemplo, Bn, PE e um PP), uma porção de naftil (por exemplo, Nap, 2Nap, NE), uma porção de butil (por exemplo, iBu), uma porção de fluorobenzil (por exemplo, FBn), uma porção de tirosil (por exemplo, um Tyr), um 3,4-metilenodioxibenzil (por exemplo, MBn), uma porção de morfolino (por exemplo, MOE), uma porção de benzofuranil (por exemplo, BF), uma porção de indol (por exemplo, Trp) e uma porção de hidroxipropil (por exemplo, Thr).

[0082] Fig. 3. Certas modificações exemplares que podem estar presentes na posição 5 da citidina. A estrutura química da modificação C-5 inclui a ligação de amida exemplar que liga a modificação à posição 5 da citidina. As frações da posição 5 apresentadas incluem uma porção de benzil (por exemplo, Bn, PE e um PP), uma porção de naftil (por exemplo, Nap, 2Nap, NE e 2NE) e uma porção de tirosil (por exemplo, uma Tyr).

[0083] Fig. 4. Fornece uma visão geral de exemplo dos conjuntos de diluição para uma amostra biológica, os conjuntos de reagentes de captura correspondentes para suas respectivas diluições e a visão geral do sistema de duas capturas (captura-1 e captura-2). Dois grupos de diluição diferentes podem ser criados de uma amostra biológica que inclui uma diluição Z% da amostra biológica ou DIL4 e uma diluição X% da amostra biológica ou DIL1, onde Z é maior que X (ou Z é uma diluição maior que a diluição X). Cada diluição tem seu próprio conjunto de reagentes de captura correspondentes (A3 para DIL1 e A1 para DIL4) que se ligam a um conjunto específico de proteínas. Os dois conjuntos de diluição diferentes foram transferidos juntos da etapa de captura-1 do ensaio para a etapa de captura-2 do ensaio.

[0084] Fig. 5. Fornece uma visão geral de exemplo dos conjuntos de diluição para uma amostra biológica, os conjuntos de reagentes de captura correspondentes para suas respectivas diluições e a visão geral do sistema de duas capturas (captura-1 e captura-2). Três grupos de diluição diferentes podem ser criados de uma amostra biológica que inclui uma diluição Z% da amostra biológica ou DIL3, uma diluição Y% da amostra biológica ou DIL2 e uma diluição X% da amostra biológica ou DIL1, onde Z é maior do que Y, e Y é maior do que X (ou Z é uma diluição maior do que a diluição Y, e a diluição Y é uma diluição maior do que a diluição X). Cada diluição tem seu próprio conjunto de reagentes de captura correspondentes (A3 para DIL1, A2 para DIL2 e A1 para DIL3) que se ligam a um conjunto específico de proteínas.

[0085] Fig. 6. Fornece uma visão geral dos três diferentes grupos de diluição de plasma que foram feitos: uma diluição de 0,005% (DIL1), uma diluição de 0,5% (DIL2) e uma diluição de 20% (DIL3), onde as proteínas de abundância relativa alta, média e baixa foram medidas, respectivamente. Além disso, os conjuntos de aptâmeros para cada um de DIL1, DIL2 e DIL3 foram A1, A2 e A3, respectivamente. O grupo A3 de aptâmeros tinha 4.271 aptâmeros diferentes (ou ~ 81% do número total de aptâmeros), o grupo A2 tinha 828 aptâmeros diferentes (ou ~ 16% do número total de aptâmeros) e o grupo A1 tinha 173 aptâmeros diferentes (~ 3% do número total de aptâmeros) para um total de 5.272 aptâmeros diferentes. Os três conjuntos de diluição diferentes foram transferidos juntos da etapa de captura-1 do ensaio para a etapa de captura-2 do ensaio.

[0086] Fig. 7. Fornece uma visão geral de exemplo dos conjuntos de diluição para uma amostra biológica, os conjuntos de reagentes de captura correspondentes para suas respectivas diluições e a visão geral do sistema sequencial de duas capturas (captura-1 e captura-2). Três grupos de diluição diferentes podem ser criados de uma amostra biológica que inclui uma diluição Z% da amostra biológica ou DIL3, uma diluição Y% da amostra biológica ou DIL2 e uma diluição X% da amostra biológica ou DIL1, onde Z é maior do que Y, e Y é maior do que X (ou Z é uma diluição maior do que a diluição Y, e a diluição Y é uma diluição maior do que a diluição X). Cada diluição tem seu próprio conjunto de reagentes de captura correspondentes (A3 para DIL1, A2 para DIL2 e A1 para DIL3) que se ligam a um conjunto específico de proteínas.

[0087] Fig. 8. Fornece uma visão geral dos três diferentes grupos de diluição de plasma que foram feitos: uma diluição de 0,005% (DIL1), uma diluição de 0,5% (DIL2) e uma diluição de 20% (DIL3), onde as proteínas de abundância relativa alta, média e baixa foram medidas, respectivamente. Além disso, os conjuntos de aptâmeros para cada um de DIL1, DIL2 e DIL3 foram A1, A2 e A3, respectivamente. O grupo A3 de aptâmeros tinha 4.271 aptâmeros diferentes (ou ~ 81% do número total de aptâmeros), o grupo A2 tinha 828 aptâmeros diferentes (ou ~ 16% do número total de aptâmeros) e o grupo A1 tinha 173 aptâmeros diferentes (~ 3% do número total de aptâmeros) para um total de 5.272 aptâmeros diferentes. Os três conjuntos de diluição diferentes foram transferidos sequencialmente da etapa de captura-1 do ensaio para a etapa de captura-2 do ensaio.

[0088] A Fig. 9. Fornece uma visão geral de exemplo dos conjuntos de diluição para uma amostra biológica, os conjuntos de reagentes de captura correspondentes para suas respectivas diluições e a visão geral do sistema de duas capturas (captura-1 e captura-2). Dois grupos de diluição diferentes podem ser criados de uma amostra biológica que inclui uma diluição Z% da amostra biológica ou DIL4 e uma diluição X% da amostra biológica ou DIL1, onde Z é maior que X (ou Z é uma diluição maior que a diluição X). Cada diluição tem seu próprio conjunto de reagentes de captura correspondentes (A3 para DIL1 e A1 para DIL4) que se ligam a um conjunto específico de proteínas. Os dois conjuntos de diluição diferentes foram transferidos sequencialmente da etapa de captura-1 do ensaio para a etapa de captura-2 do ensaio.

[0089] Fig. 10. A função de distribuição cumulativa (CDF) da razão do sinal do aptâmero para a Condição 1 (isto é, todos os três grupos de diluição DIL1, DIL2 e DIL3) para o sinal do aptâmero para cada uma das Condições 2, 3 e 4 (Tabela 2; onde apenas um dos grupos de diluição estava presente junto com os brancos) foi traçado para o ensaio como realizado onde todos os três conjuntos de diluição foram transferidos juntos da parte de captura-1 do ensaio para a parte de captura-2 do ensaio. A razão de sinais de aptâmero é representada por unidades fluorescentes relativas (RFU) derivadas de um arranjo de hibridização.

[0090] Fig. 11. A função de distribuição cumulativa (CDF) da razão do sinal do aptâmero para a Condição 1 (isto é, todos os três grupos de diluição DIL1, DIL2 e DIL3) para o sinal do aptâmero para cada uma das Condições 2, 3 e 4 (onde apenas um dos grupos de diluição estava presente junto com os brancos) foi traçado para o ensaio como realizado onde os três conjuntos de diluição foram transferidos sequencialmente da parte de captura-1 do ensaio para a parte de captura-2 do ensaio. A razão de sinais de aptâmero é representada por unidades fluorescentes relativas (RFU) derivadas de um arranjo de hibridização.

[0091] Fig. 12. Uma representação gráfica do número de analitos no intervalo linear (eixo Y; lado direito) junto com a mediana S/B (eixo Y; lado esquerdo) para cada uma das diluições de 40%, 20%, 10% e 5% (eixo X). Na diluição de 20% da amostra biológica, o número máximo de analitos no intervalo linear com a maior Mediana S/B é observado (onde as duas linhas se cruzam).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0092] Salvo observação em contrário, os termos técnicos são utilizados de acordo com o uso convencional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0- 19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632- 02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0093] Salvo definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta divulgação pertence. Os termos singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem os referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. "Compreendendo A ou B" significa a inclusão de A, ou B, ou A e B. É ainda para ser compreendido que todos os tamanhos de bases ou tamanhos de aminoácidos e todos os valores de peso molecular ou de massa molecular, dados para os ácidos nucleicos ou polipeptídeos, são aproximados e estão fornecidos para descrição.

[0094] Além disso, os intervalos fornecidos neste documento são entendidos como sendo arredondamento para todos os valores dentro do intervalo. Por exemplo, um intervalo de 1 a 50 é entendido como incluindo qualquer número, combinação de números, ou sub-intervalo do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 (assim como suas frações, a menos que o contexto dite claramente o contrário). Qualquer intervalo de concentração, intervalo de porcentagem, intervalo de razão, ou intervalo de número inteiro deve ser entendido como incluindo o valor de qualquer número inteiro dentro do intervalo citado e, quando apropriado, suas frações (como um décimo e um centésimo de um número inteiro), a menos que indicado de outra forma. Além disso, deve-se entender que qualquer intervalo numérico citado neste documento em relação a qualquer característica física, tal como subunidades poliméricas, tamanho ou espessura, inclui qualquer número inteiro dentro do intervalo citado, a menos que indicado de outra forma. Conforme usado neste documento, "cerca de" ou "consistindo essencialmente em" significa ± 20% do intervalo, valor ou estrutura indicado, a menos que indicado em contrário. Conforme usado neste documento, os termos "inclui" e "compreende" tê significados amplos e são usados como sinônimos.

[0095] Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou nos testes da presente divulgação, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas neste documento estão incorporadas para referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente relatório descrito, incluindo explicações de termos, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser um fator limitante.

[0096] Conforme usado neste documento, o termo "nucleotídeo" refere-se a um ribonucleotídeo ou um desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada deste, bem como um análogo deste. Nucleotídeos incluem espécies que incluem purinas (por exemplo, adenina, hipoxantina, guanina e seus derivados e análogos) bem como pirimidinas (por exemplo, citosina, uracila, timina e seus derivados e análogos). Conforme usado neste documento, o termo "citidina" é usado genericamente para se referir a um ribonucleótido, desoxirribonucleótido ou ribonucleótido modificado compreendendo uma base de citosina, a menos que especificamente indicado em contrário. O termo "citidina" inclui citidinas 2'-modificadas, como 2'- flúor, 2'-metoxi etc. Similarmente, o termo "citidina modificada" ou uma citidina modificada específica também se refere a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo modificado (tal como 2'- flúor, 2'-metoxi etc.) compreendendo a base de citosina modificada, a menos que especificamente indicado de outra forma. O termo "uridina" é utilizado genericamente para se referir a um ribonucleótido, desoxirribonucleótido ou ribonucleótido modificado compreendendo uma base de uracila, a menos que especificamente indicado de outro modo. O termo "uridina" inclui uridinas modificadas em 2', como 2'- flúor, 2'-metoxi etc. Similarmente, o termo "uridina modificada" ou uma uridina modificada específica também se refere a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo modificado (tal como 2'- flúor, 2'-metoxi etc.) compreendendo a base de uracil modificada, a menos que especificamente indicado de outra forma.

[0097] Conforme usado neste documento, o termo "carboxamidecitidina modificada C-5" ou "citidina-5-carboxamida" ou "citidina modificada na posição 5" ou "citidina modificada C-5" refere- se a uma citidina com uma carboxiamida (-C(O)NH-) modificação na posição C-5 da citidina incluindo, mas não se limitando a, aquelas frações (RX1) ilustradas neste documento. Carboxicitidinas modificadas em C-5 de exemplo incluem, mas não estão limitadas a 5-(N-

benzilcarboxamida)-2'-desoxicitidina (referida como "BndC" e mostrada na Figura 3); 5-(N-2-feniletilcarboxamida)-2'-desoxicitidina (referida como "PEdC" e mostrada na Figura 3); 5-(N-3-fenilpropilcarboxamida)- 2'-desoxicitidina (referida como "PPdC" e mostrada na Figura 3); 5-(N- 1-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxicitidina (referida como "NapdC" e mostrada na Figura 3); 5-(N-2-naftilmetilcarboxamida)-2'-desoxicitidina (referida como "2NapdC" e mostrada na Figura 3); 5-(N-1-naftil-2- etilcarboxamida)-2'-desoxicitidina (referida como "NEdC" e mostrada na Figura 3); 5-(N-2-naftil-2-etilcarboxamida)-2'-desoxicitidina (referida como "2NEdC" e mostrada na Figura 3); e 5-(N-tirosilcarboxamida)-2'- desoxicitidina (referida como TyrdC e mostrada na Figura 3). Em algumas modalidades, as citidinas modificadas em C5, por exemplo, na sua forma trifosfato, são capazes de ser incorporadas em um oligonucleotídeo por uma polimerase (por exemplo, DNA-polimerase KOD).

[0098] As modificações químicas das citidinas modificadas com C- 5 descritas neste documento também podem ser combinados com, isoladamente ou em qualquer combinação, modificações de açúcar de posição 2', modificações em aminas exocíclicas e substituição de 4- tiocitidia e similares.

[0099] Conforme usado neste documento, o termo "carboxamidecitosina modificada em C-5" ou "citosina-5-carboxamida" ou "citosina modificada na posição 5" ou "citosina modificada em C-5" refere-se a uma base de citosina com uma modificação de carboxiamida (-C(O)NH-) na posição C-5 da citosina, incluindo, mas não se limitando a, aquelas frações (RX1) ilustradas neste documento. Carboxamidecitosinas modificadas em C-5 de exemplo incluem, mas não estão limitadas às citidinas modificadas mostradas na Figura 3.

[00100] Conforme usado neste documento, o termo "uridina modificada com C-5" ou "uridina modificada na posição 5" refere-se a uma uridina (tipicamente uma desoxiuridina) com uma modificação de carboxiamida (-C(O)NH-) na posição C-5 da uridina, por exemplo, conforme mostrado na Figura 1. Em algumas modalidades, as uridinas modificadas em C5, por exemplo, na sua forma trifosfato, são capazes de ser incorporadas em um oligonucleotídeo por uma polimerase (por exemplo, DNA-polimerase KOD). Exemplos de uridinas modificadas em posição 5 não limitativas incluem: 5-(N-benzilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-benzilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-benzilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PEdU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU), 5-(N-3,4-metilenodioxibenzilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU), 5-(N-4-fluorobenzilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU), 5-(N-3-fenilpropillcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PPdU), 5-(N-imidizolietilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-R-treoninilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, Cloreto de 5-(N-[1-(3-trimetilamônio)propil]carboxiamida)-2'- desoxiuridina, 5-(N-naftilmetillcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-[1-(2,3-di-hidroxipropil)]carboxiamida)-2'-desoxiuridina),

5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU), 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-benzilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, e 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina.

[00101] Conforme usado neste documento, os termos "modificar", "modificado", "modificação" e quaisquer variações destes, quando usados em referência a um oligonucleotídeo, significam que pelo menos uma das quatro bases constituintes (isto é, A, G, T/U e C) do oligonucleotídeo é um análogo ou éster de um nucleotídeo de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o nucleotídeo modificado confere resistência à nuclease ao oligonucleotídeo. As modificações adicionais podem incluir modificações de estrutura principal, metilações, combinações de pareamento de base incomuns, tais como as isobases isocitidina e isoguanidina, e similares. Modificações também podem incluir modificações de 3' e 5', tal como capping. Outras modificações podem incluir a substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídicas, tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos,

fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e aquelas com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas com intercalantes (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquelas contendo quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aquelas contendo alquilantes, e aquelas com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxil ordinariamente presentes no açúcar de um nucleotídeo pode ser substituído por um grupo de fosfonato ou um grupo fosfato; protegido por grupos de proteção padrão; ou ativado para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais ou para um suporte sólido. Os grupos OH terminais 5' e 3' podem ser fosforilados ou substituídos por aminas, frações de grupo de capping orgânico de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono, polímeros de polietilenoglicol (PEG) em uma modalidade variando de cerca de 10 a cerca de 80 kDa, polímeros de PEG em outra modalidade variando de cerca de 20 a cerca de 60 kDa, ou outros polímeros biológicos ou sintéticos hidrofílicos ou hidrofóbicos.

[00102] Como usado neste documento, "ácido nucleico", "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" são usados permutavelmente para se referir a um polímero de nucleotídeos e incluem DNA, RNA, híbridos de DNA/RNA e modificações destes tipos de ácidos nucleicos, oligonucleotídeos e polinucleotídeos, em que a ligação de várias entidades ou frações às unidades de nucleotídeos em qualquer posição está incluída. Os termos "polnucleotídeo", "oligonucleotídeo" e "ácido nucleico" incluem moléculas de fita dupla ou única, bem como moléculas de tripla hélice. Ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotídeo são termos mais amplos do que o termo aptâmero e, assim, os termos ácido nucleico, oligonculeotídeo e polinucleotídeo incluem polímeros de nucleotídeos que são aptâmeros, mas os termos ácido nucleico, oligonucleotídeo e polinucleotídeo não estão limitados a aptâmeros.

[00103] Polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo 2'-O-metila, 2'-O-alila, 2'-O-etila, 2'-O-propila, 2'- O-CH2CH2OCH3, 2'-fluoro, 2'-NH2 ou 2'-azido, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tais como metil ribose. Conforme observado neste documento, uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NRX 2 ("amidato"), P(O) RX, P(O)ORX', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada RX ou RX' são, independentemente, H ou alquil (C1-C20) substituído ou não substituído contendo opcionalmente uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. Substituição das formas análogas de açúcares, purinas e pirimidinas pode ser vantajosa na concepção de um produto final, como também podem as estruturas de cadeia principal alternativas como uma cadeia principal de poliamida, por exemplo.

[00104] Os polinculeotídeos também podem conter formas análogas de açúcar carbocíclico, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeo abásicos, tais como metil ribose.

[00105] Se estiver presente, uma modificação da estrutura do nucleotídeo pode ser conferida antes ou após uma montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes que não sejam nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado ainda após a polimerização, como por conjugação com um componente de marcação.

[00106] Conforme usado neste documento, o termo "pelo menos um nucleotídeo", ao se referir às modificações de um ácido nucleico, refere-se a um, vários ou todos os nucleotídeos no ácido nucleico, indicando que qualquer uma ou todas as ocorrências de qualquer um ou todos dentre A, C, T, G ou U em um ácido nucleico podem ser modificadas ou não.

[00107] Conforme usado neste documento, "ligante de ácido nucleico," "aptâmero," "SOMAmer", "aptâmero modificado" e "clone" são usados indistintamente para se referir a um ácido nucleico de ocorrência não natural que possui uma ação desejável em uma molécula alvo. Uma ação desejável inclui, mas não está limitada a, ligação do alvo, cataliticamente mudar o alvo, reagir o alvo de uma forma que modifica ou altera o alvo ou a atividade funcional do alvo, covalentemente anexar ao alvo (como um inibidor de suicídio) e facilitara reação entre o alvo e uma outra molécula. Em uma modalidade, a ação é a afinidade de ligação específica a uma molécula alvo, tal molécula alvo sendo uma estrutura tridimensional química que não um polinucleotídeo que se liga ao aptâmero através de um mecanismo independente de pareamento de base Watson/Crick ou formação de hélice tripla, em que o aptâmero não é um ácido nucleico tendo a função fisiológica conhecida de ser ligado pela molécula alvo. Aptâmeros para um determinado alvo incluem ácidos nucléicos que são identificados a partir de uma mistura candidata de ácidos nucléicos, onde o aptâmero é um ligante do alvo, por um método que compreende: (a) colocar em contato a mistura candidata com o alvo, em que os ácidos nucleicos tendo uma afinidade maior com o alvo em relação a outros ácidos nucléicos na mistura candidata pode ser particionada do restante da mistura candidata; (b) dividir os ácidos nucleicos de afinidade aumentada do restante da mistura candidata; e (c) amplificar os ácidos nucleicos de afinidade aumentada para produzir uma mistura enriquecida de ligando de ácidos nucleicos, em que os aptâmeros da molécula alvo são identificados. É reconhecido que as interações de afinidade são uma questão de grau; no entanto, neste contexto, a "afinidade de ligação específica" de um aptâmero para seu alvo significa que o aptâmero se liga ao seu alvo geralmente com grau de afinidade muito maior do que se liga a outros componentes não alvo em uma mistura ou amostra. Um "aptâmero", "SOMAmer" ou "ligante de ácido nucleico" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucleico que tem uma sequência específica de nucleotídeos. Um aptâmero pode incluir qualquer número adequado de nucleotídeos. "Aptâmeros" se refere a mais de um tal conjunto de moléculas. Aptâmeros diferentes podem ter números iguais ou diferentes de nucleotídeos. Aptâmeros podem ser DNA ou RNA e podem ser de fita simples, fita dupla, ou conter regiões de fita dupla ou tripla. Em algumas modalidades, os aptâmeros são preparados usando um processo SELEX, conforme descrito neste documento, ou conhecido na técnica.

[00108] Conforme usado neste documento, um "SOMAmer" ou aptâmero modificado de taxa de abrandamento refere-se a um aptâmero que tem características aprimoradas de taxa de abrandamento. SOMAmers são gerados usando os métodos aprimorados de SELEX descritos na Patente nº U.S. 7.947.447, intitulado "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".

[00109] Conforme usado neste documento, um aptâmero compreendendo dois tipos diferentes de pirimidinas modificadas em posição 5 ou pirimidinas modificadas em C-5 pode ser referido como

"aptâmeros modificados duplos", aptâmeros tendo "duas bases modificadas", aptâmeros tendo "duas modificações básicas" ou " duas bases modificadas ", aptâmero tendo " bases modificadas duplas ", todos podendo ser usados de forma intercambiável.

Uma biblioteca de aptâmeros ou biblioteca de aptâmero também pode usar a mesma terminologia.

Portanto, em algumas modalidades, um aptâmero compreende duas pirimidinas modificadas em posição 5 diferentes em que as duas pirimidinas modificadas em posição 5 são selecionadas de um NapdC e um NapdU, um NapdC e um PPdU, um NapdC e um MOEdU, um NapdC e um TyrdU, um NapdC e um ThrdU, um PPdC e um PPdU, um PPdC e um NapdU, um PPdC e um MOEdU, um PPdC e um TyrdU, um PPdC e um ThrdU, um NapdC e um 2NapdU, um NapdC e um TrpdU, um 2NapdC e um NapdU, e 2NapdC e um 2NapdU, um 2NapdC e um PPdU, um 2NapdC e um TrpdU, um 2NapdC e um TyrdU, um PPdC e um 2NapdU, um PPdC e um TrpdU, um PPdC e um TyrdU, um TyrdC e um TyrdU, um TrydC e um 2NapdU, um TyrdC e um PPdU, um TyrdC e um TrpdU, um TyrdC e um TyrdU e um TyrdC e um TyrdU.

Em algumas modalidades, um aptâmero compreende pelo menos uma uridina e/ou timidina modificada e pelo menos uma citidina modificada, em que pelo menos uma uridina modificada e/ou timidina é modificada na posição 5 com uma porção selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxibenzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranila, e em que a pelo menos uma citidina modificada é modificada na posição 5 com uma porção selecionada de uma porção de naftila, uma porção de tirosil e uma porção de benzil.

Em certas modalidades, a porção é ligada covalentemente à posição 5 da base através de um ligante compreendendo um grupo selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfido e um ligante de sulfona. Consulte a Figura 1 para obter mais exemplos de ligantes exemplares que podem ser usados para ligar covalentemente uma porção à posição 5 de uma pirimidina.

[00110] Conforme usado neste documento, um "grupo hidrofóbico" e "porção hidrofóbica" são usados indistintamente neste documento e referem-se a qualquer grupo ou porção que está descarregado, a maioria dos átomos do grupo ou porção são hidrogênio e carbono, o grupo ou porção tem um dipolo pequeno e/ou o grupo ou porção tende a se repelir da água. Estes grupos ou frações podem compreender um hidrocarboneto aromático ou um hidrocarboneto aromático plano. Métodos para determinar a hidrofobicidade ou se a molécula (ou grupo ou porção) é hidrofóbica são bem conhecidos na técnica e incluem métodos empiricamente derivados, bem como métodos de cálculo. Métodos exemplares são descritos em Zhu Chongqin et al. (2016) Characterizing hydrophobicity of amino acid side chains in a protein environment via measuring contact angle of a water nanodroplet on planar peptide network. Proc. Natl. Acad. Sci., 113 (46) págs. 12946-

12951. Conforme divulgado neste documento, frações hidrofóbicas exemplares incluem, mas não estão limitadas a, Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1. Outras frações hidrofóbicas exemplares incluem aquelas da Figura 3 (por exemplo, Bn, Nap, PE, PP, iBu, 2Nap, Try, NE, MBn, BF, BT, Trp).

[00111] Conforme usado neste documento, um aptâmero compreendendo um tipo único de pirimidina modificada em posição 5 ou pirimidina modificada em C-5 pode ser referido como "aptâmeros modificados únicos", aptâmeros tendo uma "base modificada única",

aptâmeros tendo uma "modificação de base única" ou "bases simples modificadas", todas podendo ser usadas de forma intercambiável. Uma biblioteca de aptâmeros ou biblioteca de aptâmero também pode usar a mesma terminologia. Conforme usado neste documento, "proteína" é usado sinonimamente com "peptídeo", "polipeptídeo", ou "fragmento de peptídeo". Um fragmento de peptídeo, proteína, peptídeo ou polipeptídeo "purificado" é substancialmente isento de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula, tecido ou fonte livre de célula da qual a sequência de aminoácidos é obtida, ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizado.

[00112] Em certas modalidades, um aptâmero compreende uma primeira pirimidina modificada em posição 5 e uma segunda pirimidina modificada em posição 5, em que a primeira pirimidina modificada em posição 5 compreende uma porção de tirosil na posição 5 da primeira pirimidina modificada em posição 5, e a segunda pirimidina modificada em posição 5 compreende uma porção de naftil ou porção de benzil na posição 5 na segunda pirimidina modificada em posição 5. Em uma modalidade relacionada, a primeira pirimidina modificada em posição 5 é um uracil. Em uma modalidade relacionada, a segunda pirimidina modificada em posição 5 é uma citosina. Em uma modalidade relacionada, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% das uracilas do aptâmero estão modificados na posição 5. Em uma modalidade relacionada, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% da citosinas do aptâmero são modificadas na posição 5.

[00113] Os versados na técnica de hibridização de ácido nucleico reconhecerão que os fatores comumente usados para impor ou controlar o rigor da hibridização incluem concentração de formamida

(ou outro reagente químico desnaturante), concentração de sal (isto é, força iônica), temperatura de hibridização, concentração de detergente, pH e a presença ou ausência de caótropos. Estringência ideal para uma combinação de sequência de sonda/alvo é frequentemente encontrada pela técnica bem conhecida de fixação de vários dos fatores de estringência mencionados acima e, em seguida, determinar o efeito de variar um único fator de estringência. Os mesmos fatores de restringência podem ser modulados para assim controlar o rigor de hibridação de um PNA com um ácido nucleico, excepto que a hibridação de um PNA é bastante independente da força iônica. O rigor ideal para um ensaio pode ser determinado experimentalmente pelo exame de cada fator de rigor até que o grau desejado de discriminação seja alcançado.

[00114] Conforme usado neste documento, "hibridização", "hibridização", "ligação" e termos semelhantes, no contexto de sequências de nucleotídeos, podem ser usados de forma intercambiável neste documento. A capacidade de duas sequências de nucleotídeos hibridizarem uma com a outra é baseada no grau de complementaridade das duas sequências, que por sua vez é baseada na porção de pares de nucleotídeos complementares correspondentes. Quanto mais nucleotídeos em uma determinada sequência são complementares a outra sequência, mais rigorosas podem ser as condições para a hibridização e mais específica será a ligação das duas sequências. O aumento da rigidez é obtido elevando a temperatura, aumentando a proporção de co-solventes, diminuindo a concentração de sal e semelhantes. A hibridização de pares de bases Watson/Crick complementares de sondas no microarranjo e do material alvo é geralmente preferencial, mas o emparelhamento de bases não Watson/Crick durante a hibridização também pode ocorrer.

[00115] Soluções de hibridização convencionais e processos para hibridização são descritos em J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (supra), incorporado neste documento por referência. As condições para hibridização incluem tipicamente (1) solução de alta força iônica, (2) a uma temperatura controlada, e (3) na presença de DNA carreador e surfactantes e quelantes de cátions divalentes, todos os quais são conhecidos na técnica.

[00116] Conforme usado neste documento, "biopolímero" é um polímero de um ou mais tipos de unidades de repetição. Biopolímeros são tipicamente encontrados em sistemas biológicos e incluem particularmente polissacarídeos (como carboidratos) e peptídeos (cujo termo é usado para incluir polipeptídeos e proteínas ligadas ou não a um polissacarídeo) e polinucleotídeos, bem como seus análogos, como os compostos de ou contendo análogos de aminoácidos ou grupos não-aminoácidos, ou análogos de nucleotídeos ou grupos não- nucleotídeos. Como tal, este termo inclui polinucleotídeos em que a estrutura convencional foi substituída por uma estrutura não natural ou sintética e ácidos nucleicos (ou análogos sintéticos ou naturais) em que uma ou mais das bases convencionais foram substituídas por um grupo (natural ou sintético) capaz de participar de interações de ligações de hidrogênio do tipo Watson-Crick. Os polinucleotídeos incluem configurações de fita simples ou múltipla, em que uma ou mais das fitas podem ou não estar completamente alinhadas com outra. Especificamente, um "biopolímero" inclui ácido desoxirribonucleico ou DNA (incluindo cDNA), ácido ribonucleico ou RNA e oligonucleotídeos, independentemente da fonte.

[00117] Conforme usado neste documento, "arranjo" inclui qualquer arranjo de uma, duas ou três dimensões de regiões endereçáveis com uma porção ou frações químicas específicas (por exemplo, biopolímeros, tais como moléculas de ácido nucleico de peptídeos, peptídeos ou sequências de polinucleotídeos) associadas a essa região, onde a porção ou frações químicas são imobilizadas na superfície dessa região. Por "imobilizado" entende-se que a porção ou frações estão estavelmente associadas à superfície do substrato na região, de modo que não se separem da região sob condições de uso do arranjo, por exemplo, hibridização e condições de lavagem e remoção. Conforme é conhecido na técnica, a porção ou frações podem ser ligadas covalentemente ou não covalentemente à superfície na região. Por exemplo, cada região pode se estender para uma terceira dimensão no caso em que o substrato é poroso, embora não tenha qualquer medição substancial de terceira dimensão (espessura) no caso em que o substrato é não poroso. Um arranjo pode conter mais de dez, mais de cem, mais de mila, mais de dez mil recursos, ou mesmo mais de cem mil recursos, em uma área de menos de 20 cm ou até menos de 10 cm. Por exemplo, os recursos podem ter larguras (isto é, diâmetro, para um ponto redondo) no intervalo de cerca de 10 μm a cerca de 1,0 cm. Em outras modalidades, cada característica pode ter uma largura no intervalo de cerca de 1,0 μm a cerca de 1,0 mm, tal como de cerca de 5,0 μm a cerca de 500 μm e incluindo de cerca de 10 μm a cerca de 200 μm. As características não redondas podem ter intervalos de área equivalentes às das características circulares com os intervalos de largura (diâmetro) anteriores. Uma determinada característica é composta de frações químicas, por exemplo, moléculas de ácido nucleico de peptídeo, peptídeos, ácidos nucleicos, que se ligam a (por exemplo, hibridizam) a molécula alvo (por exemplo, ácido nucleico alvo ou aptâmero), de modo que uma determinada característica corresponda para um alvo específico.

[00118] No caso de um arranjo, o "alvo" será referido como uma porção em uma fase móvel (normalmente fluido), a ser detectado por sondas ("sondas alvo") que estão ligadas ao substrato nas várias regiões. No entanto, qualquer uma das "sondas alvo" ou "alvo" pode ser aquela que deve ser detectada pela outra. Em algumas modalidades, o alvo é um oligonucleotídeo ou aptâmero. Em algumas modalidades, a sonda é uma molécula de ácido nucleico de peptídeo, peptídeo, proteína, oligonucleotídeo ou aptâmero.

[00119] O termo "amostra biológica", "amostra" e "amostra de teste" são usados indistintamente neste documento para se referir a qualquer material, fluido biológico, tecido ou célula obtido ou derivado de um indivíduo e amostra ambiental, animal ou alimentar. Isso inclui sangue (incluindo sangue total, leucócitos, células mononucleares do sangue periférico, camada leuco-plaquetária, plasma e soro), escarro, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, urina, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, fluido cístico, fluido meníngeo, fluido aminiótico, líquido glandular, fluido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico (por exemplo, lavagem bronquialveolar), escovação brônquica, líquido sinovial, aspirado de articulação, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano. Isso também inclui frações experimentalmente separadas de todas as anteriores. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fracionada em soro, plasma ou em frações contendo determinados tipos de células sanguíneas, como glóbulos vermelhos ou glóbulos brancos (leucócitos). Em algumas modalidades, uma amostra pode ser uma combinação de amostras de um indivíduo, tal como uma combinação de uma amostra de tecido e fluido. O termo "amostra biológica" também inclui materiais contendo material sólido homogeneizado, como a partir de uma amostra de fezes, uma amostra de tecido ou uma biópsia de tecido, por exemplo. O termo "amostra biológica" também inclui materiais derivados de uma cultura de tecidos ou uma cultura celular. Quaisquer métodos adequados para obter uma amostra biológica podem ser empregues; os métodos de exemplo incluem, por exemplo, flebotomia, descamação (por exemplo, descamação bucal) e um procedimento de biópsia por aspiração com agulha fina. Tecidos de exemplo suscetíveis à aspiração com agulha fina incluem linfonodo, pulmão, lavagens pulmonares, BAL (lavagem broncoalveolar), tireoide, mama, pâncreas e fígado. As amostras também podem ser coletadas, por exemplo, por micro-dissecção (por exemplo, micro-dissecção por captura a laser (LCM) ou micro- dissecção a laser (LMD)), lavagem da bexiga, descamação (por exemplo, uma descamação de PAP) ou lavagem dutal. Uma "amostra biológica" obtida ou derivada de um indivíduo inclui qualquer amostra que tenha sido processada de qualquer maneira adequada após ser obtida do indivíduo.

[00120] O termo "oligonucleotídeo ligado a uma superfície de um suporte sólido" ou "sonda ligada a um suporte sólido" ou um "alvo ligado a um suporte sólido" refere-se a moléculas de ácido nucleico de peptídeo, oligonucleotídeo, aptâmero, por exemplo, PNA (peptídeo nucleico ácido), molécula de LNA (ácido nucleico bloqueado) ou UNA (ácido nucleico desbloqueado) que está imobilizada em uma superfície de um substrato sólido, onde o substrato pode ter uma variedade de configurações, por exemplo, uma folha, esfera, partícula, lâmina, bolacha, teia, fibra, tubo, capilar, canal ou reservatório microfluídico ou outra estrutura. Em certas modalidades, as coleções de oligonucleotídeos ou elementos alvo empregados neste documento estão presentes em uma superfície do mesmo suporte plano, por exemplo, na forma de um arranjo. Deve ser entendido que os termos "sonda" e "alvo" são termos relativos e que uma molécula considerada como uma sonda em certos ensaios pode funcionar como um alvo em outros ensaios. A imobilização de oligonucleotídeos em um substrato ou superfície pode ser realizada por técnicas bem conhecidas, comumente disponíveis na literatura. Ver, por exemplo, AC Pease, et al., Proc. Nat. Acad. Sci, USA, 91: 5022-5026 (1994); Z. Guo, et al., Nucleic Acids Res, 22, 5456-65 (1994); e M. Schena, et al., Science, 270, 467-70 (1995), cada um incorporado neste documento por referência.

[00121] A química anterior da síntese de polinucleotídeos é descrita em detalhes, por exemplo, em Caruthers, Science 230: 281–285, 1985; Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53: 323–356; Hunkapillar et al., Nature 310: 105-110, 1984; e em "Synthesis of Oligonucleotide Derivatives in Design and Targeted Reaction of Oligonucleotide Derivatives", CRC Press, Boca Raton, Fla., páginas 100 et seq., US Pat. Nºs 4.458.066, 4.500.707, 5.153.319, 5.869.643, EP 0294196 e em outros lugares. As abordagens de fosforamidita e triéster de fosfito são mais amplamente usadas, mas outras abordagens incluem a abordagem de fosfodiéster, a abordagem de fosfotriéster e a abordagem de H-fosfonato. Os substratos são tipicamente funcionalizados para se ligarem ao primeiro monômero depositado. Técnicas adequadas para funcionalizar substratos com tais frações de ligação são descritas, por exemplo, em Southern, EM, Maskos, U. e Elder, JK, Genomics, 13, 1007-1017, 1992. No caso da fabricação de arranjo, diferentes monômeros e ativador podem ser depositados em diferentes endereços no substrato durante qualquer um dos ciclos, de modo que as diferentes características do arranjo completo tenham diferentes sequências de biopolímero desejadas. Uma ou mais etapas intermediárias adicionais podem ser necessárias em cada ciclo, tais como as etapas convencionais de oxidação, cobertura e lavagem no caso da fabricação in situ de arranjos de polinucleotídeos (novamente, essas etapas podem ser realizadas no procedimento de inundação). Ensaio Multiplex

[00122] Os ensaios de aptâmeros multiplexados em etapas de interação e separação de alvos baseados em solução são descritos,

por exemplo, nas Patentes US Nºs 7.855.054 e 7.964.356 e no Pedido PCT PCT/US2013/044792. Em uma modalidade, um ensaio multiplex é descrito neste documento no Exemplo 1.

[00123] Em um formato de ensaio multiplex em que várias proteínas alvo estão sendo medidas por vários reagentes de captura, a variação natural na abundância das diferentes proteínas alvo pode limitar a capacidade de certos reagentes de captura para medir certas proteínas alvo (por exemplo, proteínas alvo de alta abundância podem saturar o ensaio e prevenir ou reduzir a capacidade do ensaio de medir proteínas alvo de baixa abundância). Para abordar esta variação na amostra biológica, os reagentes de aptâmero podem ser separados em pelo menos dois grupos diferentes (Reagentes de Captura para DIL1 e Reagentes de Captura para DIL2), preferencialmente três grupos diferentes (A3 - Reagentes de Captura para DIL1; A2 - Reagentes de Captura para DIL2 e A1 - Reagentes de Captura para DIL3), com base na abundância de suas respectivas proteínas alvo na amostra biológica. Cada um dos grupos de reagentes de captura, A1, A2 e A3, cada um tem um conjunto diferente de aptâmeros, com os aptâmeros tendo afinidade específica para uma proteína alvo. A amostra biológica é diluída em dois (Diluição 1 ou DIL1 e Diluição 2 ou DIL2), preferencialmente três grupos de diluição diferentes (Diluição 1 ou DIL1; Diluição 2 ou DIL2 e Diluição 3 ou DIL3) para criar amostras de teste separadas com base nas concentrações relativas dos alvos proteicos a serem detectados pelos seus reagentes de captura. Assim, a amostra biológica é diluída em grupos de diluição de proteína alvo de alta, média e baixa abundância, onde os alvos de proteína menos abundantes são medidos no grupo menos diluído e os alvos de proteína mais abundantes são medidos no maior grupo diluído. Os reagentes de captura para seus respectivos grupos de diluição são incubados juntos (por exemplo, o conjunto A3 de aptâmeros são incubados com a amostra de teste da Diluição 1 ou DIL1; o conjunto A2 de aptâmeros são incubados com a amostra de teste da Diluição 2 ou DIL2 e o A1 conjunto de aptâmeros são incubados com a amostra de teste da Diluição 3 ou DIL3). O número total de aptâmeros para A1, A2 e A3 pode ser 4.000; 4.500; 5.000 ou mais aptâmeros.

[00124] A Figura 5 fornece uma visão geral de exemplo dos conjuntos de diluição para uma amostra biológica, os conjuntos de reagentes de captura correspondentes para suas respectivas diluições e a visão geral do sistema de duas capturas (captura-1 e captura-2). Três grupos de diluição diferentes podem ser criados de uma amostra biológica que inclui uma diluição Z% da amostra biológica ou DIL3, uma diluição Y% da amostra biológica ou DIL2 e uma diluição X% da amostra biológica ou DIL1, onde Z é maior do que Y, e Y é maior do que X (ou Z é uma diluição maior do que a diluição Y, e a diluição Y é uma diluição maior do que a diluição X). Cada diluição tem seu próprio conjunto de reagentes de captura correspondentes (A3 para DIL1, A2 para DIL2 e A1 para DIL3) que se ligam a um conjunto específico de proteínas.

[00125] A Figura 4 fornece uma visão geral de exemplo dos conjuntos de diluição para uma amostra biológica, os conjuntos de reagentes de captura correspondentes para suas respectivas diluições e a visão geral do sistema de duas capturas (captura-1 e captura-2). Dois grupos de diluição diferentes podem ser criados de uma amostra biológica que inclui uma diluição Z% da amostra biológica ou DIL4 e uma diluição X% da amostra biológica ou DIL1, onde Z é maior que X (ou Z é uma diluição maior que a diluição X). Cada diluição tem seu próprio conjunto de reagentes de captura correspondentes (A3 para DIL1 e A1 para DIL4) que se ligam a um conjunto específico de proteínas.

[00126] A Figura 7 fornece uma visão geral de exemplo dos conjuntos de diluição para uma amostra biológica, os conjuntos de reagentes de captura correspondentes para suas respectivas diluições e a visão geral do sistema sequencial de duas capturas (captura-1 e captura-2). Três grupos de diluição diferentes podem ser criados de uma amostra biológica que inclui uma diluição Z% da amostra biológica ou DIL3, uma diluição Y% da amostra biológica ou DIL2 e uma diluição X% da amostra biológica ou DIL1, onde Z é maior do que Y, e Y é maior do que X (ou Z é uma diluição maior do que a diluição Y, e a diluição Y é uma diluição maior do que a diluição X). Cada diluição tem seu próprio conjunto de reagentes de captura correspondentes (A3 para DIL1, A2 para DIL2 e A1 para DIL3) que se ligam a um conjunto específico de proteínas.

[00127] A presente divulgação descreve métodos aprimorados para realizar ensaios multiplexados com base em aptâmero e fotoaptâmero para a quantificação de uma ou mais moléculas alvo que podem estar presentes em uma amostra de teste em que o aptâmero (ou fotoaptâmero) pode ser separado do aptâmero complexo de afinidade alvo (ou complexo covalente fotoaptâmero alvo) para detecção final usando qualquer método de detecção de ácido nucleico adequado, na medida em que os materiais e métodos descritos neste documento podem ser usados para melhorar o desempenho geral do ensaio. Fotoaptâmeros são aptâmeros que compreendem grupos funcionais fotorreativos que permitem que os aptâmeros se liguem covalentemente ou "fotorreticulem" suas moléculas alvo.

[00128] Os ensaios multiplexados baseados em aptâmero e fotoaptâmero aprimorados descritos neste documento podem ser realizados com aptâmeros e fotoaptâmeros, incluindo, mas não se limitando aos aptâmeros e fotoaptâmeros descritos nas publicações listadas na Tabela 1. Tabela 1

Pedido Nº Data de Título Publicação WO Nº Depósito PCT/US2016/050908 09 de Methods for Developing WO/2017/044715 setembro de Personalized Drug Treatment 2016 Plans and Targeted Drug Development Based on Proteomic Profiles PCT/US2016/16712 05 de fevereiro Nucleic Acid Compounds for WO/2016/130414 de 2016 Binding Growth Differentiation Factor 8 PCT/US2015/62155 23 de Nucleic Acid Compounds for WO/2016/085860 novembro de Binding Growth 2015 Differentiation Factor 11 PCT/US2015/33355 29 de maio de Nucleic Acid Compounds for WO/2015/184372 2015 Binding to Complement Component 3 Protein PCT/US2014/054561 08 de PDGF and VEGF Aptamers WO/2015/035305 setembro de Having Improved Stability 2014 and Their Use in Treating PDGF and VEGF Mediated Diseases and Disorders PCT/US2014/024669 12 de março Aptamers That Bind to Il-6 WO/2014/159669 de 2014 and Their Use in Treating or Diagnosing Il-6 Mediated Conditions PCT/US2013/034493 28 de março Aptamers to PDGF and WO/2013/149086 de 2013 VEGF and Their Use in Treating PDGF and VEGF Mediated Conditions PCT/US2012/72094 28 de Aptamers and Diagnostic WO/2013/102096 dezembro de Methods for Detecting the 2012 EGF Receptor PCT/US2012/072101 28 de Aptamers and Diagnostic WO/2013/102101 dezembro de Methods for Detecting the 2012 EGF Receptor PCT/US2012/028632 09 de março Aptamers for Clostridium WO/2012/122540 de 2012 Difficile Diagnostics PCT/US2011/032017 12 de abril de Aptamers to β-NGF and Their WO/2011/130195 2011 Use in Treating β-NGF Mediated Diseases and Disorders PCT/US2011/027064 03 de março Aptamers to 4-1BB and Their WO/2011/109642 de 2011 Use in Treating Diseases and Disorders

[00129] Historicamente, duas limitações imprevistas surgiram da realização de ensaios baseados em aptâmero single e multiplex, incluindo ensaios de afinidade de aptâmero proteômico multiplexado. Em primeiro lugar, as interações de aptâmero/aptâmero foram identificadas como uma fonte primária de fundo de ensaio e uma limitação potencial à capacidade de multiplex. Em segundo lugar, verificou-se que os arranjos de amostra (principalmente soro e plasma) inibem a imobilização de aptâmeros biotinilados em arranjos substituídos por estreptavidina.

[00130] Uma aprimoração no ensaio, conforme descrito em Gold et al. (PLoS One (2010) 5 £ 12): el5005), compreendeu o uso de solventes orgânicos em alguns dos tampões de lavagem da etapa de captura-2 para diminuir a constante dielétrica do meio. A adição desses tampões de lavagem efetivamente acentuou a repulsão de carga semelhante de estruturas de fosfodiéster adjacentes dos aptâmeros, promovendo assim a dissociação de aptâmeros de interação causadores de fundo.

[00131] Outra aprimoração no processo envolve a adição de solventes orgânicos a alguns dos tampões de lavagem usados na etapa de captura-2 do ensaio, também neutraliza a tendência dos aptâmeros de interagir e, portanto, diminui o fundo e aumenta a capacidade de multiplex. No entanto, sua principal vantagem é neutralizar a inibição dependente do arranjo da adsorção de aptâmeros biotinilados aos arranjos de estreptavidina. Tal inibição é facilmente detectável mesmo em plasma ou soro a 5% v/v, e limita as concentrações do ensaio de trabalho a concentrações de plasma ou soro de 5-10%. Esta limitação, por sua vez, limita a sensibilidade do ensaio.

[00132] Ainda outro aprimoramento no ensaio multiplexado compreende a pré-imobilização dos aptâmeros marcados nos arranjos de suporte sólido antes da incubação (denominado "captura-0") com a solução de teste. A incubação com a solução de teste é então realizada com aptâmeros ligados, nos próprios recipientes de processamento. Conforme descrito neste documento apenas para fins de ilustração, aptâmeros biotinilados foram pré-imobilizados em arranjos de esferas de estreptavidina e a incubação com solução de teste realizada com os aptâmeros ligados a esferas. Esta etapa de pré-imobilização permite a imobilização sob condições em que os aptâmeros têm tendência diminuída de interagir e também permite lavagens muito rigorosas (com base e com sais caotrópicos) antes da incubação, interrompendo os aptâmeros em interação e removendo todos os aptâmeros não ligados através da biotina-estreptavidina muito robusta interação. Isso reduz o número de "aglomerados" de aptâmeros que atravessam o ensaio - aglomerados que, em alguma frequência detectável, retiveram a porção de biotina ou se tornaram biotinilados no ensaio. É importante notar que a irradiação cliva a maioria, mas não todas as frações de biotina fotocliváveis de aptâmeros, enquanto alguns aptâmeros tornam-se biotinilados por meio do tratamento com NHS-biotina destinado a "marcar" proteínas. O aptâmero biotinilado que é capturado na etapa de captura-2 cria fundo ao interagir com o aptâmero fotoclivado em massa, que é então liberado após a eluição. Também deve ser notado que um formato pré- imobilizado provavelmente suportará capacidades de multiplex muito altas, pois os painéis de aptâmeros podem ser imobilizados separadamente, em seguida, combinados na forma ligada a grânulos, evitando assim as condições em que os aptâmeros podem interagir e se agrupar.

[00133] Portanto, a pré-imobilização ignora a necessidade de adsorção de aptâmeros na presença de solução de analito, garantindo assim a imobilização quantitativa mesmo ao testar concentrações inibitórias de soluções de analito. Isso permite o uso de concentrações muito mais altas, até e incluindo pelo menos 40% v/v de plasma ou soro, em vez da concentração superior de 10% do processo, conforme descrito anteriormente (Gold et al. (Dezembro de 2010) PLoS One 5 (12): el5005) ou a concentração superior de 5% usada em edições mais recentes do processo, aumentando assim a sensibilidade em cerca de 4 a 8 vezes, bem como, aumentando a robustez geral do ensaio.

[00134] Outro aprimoramento no processo geral compreende o uso de um sal caotrópico em cerca de um pH neutro para eluição durante a etapa de captura-2, conforme descrito em detalhes abaixo. Métodos anteriores compreendiam o uso de cloreto de sódio em pH alto (10), que interrompe a hibridização do DNA e a interação aptâmero/aptâmero, bem como a interação proteína/aptâmero. Conforme observado acima, a hibridização de DNA e as interações aptâmero/aptâmero contribuem para o fundamento do ensaio. Os sais caotrópicos, incluindo, mas não se limitando a, perclorato de sódio, cloreto de lítio, cloreto de sódio e cloreto de magnésio em pH neutro, suportam a hibridização de DNA e interações aptâmero/aptâmero, enquanto interrompem as interações aptâmero/proteína. O resultado líquido é significativamente diminuído (cerca de 10 vezes) de fundo, com um aumento concomitante na sensibilidade do ensaio.

[00135] Conforme usado neste documento, "captura-1" refere-se à partição de um complexo de afinidade aptâmero-alvo ou complexo aptâmero-alvo covalente. O objetivo da captura-1 é remover substancialmente todos os componentes da amostra de teste que não estão associados ao aptâmero. A remoção da maioria de tais componentes geralmente melhorará a eficiência de marcação do alvo, removendo moléculas não-alvo da etapa de marcação do alvo usada para captura de captura-2 e pode levar a um fundamento de ensaio inferior. Em uma modalidade, um marcador é anexado ao aptâmero antes do ensaio, durante a preparação do ensaio ou durante o ensaio anexando o marcador ao aptâmero. Em uma modalidade, o marcador é um marcador liberável. Em uma modalidade, o marcador liberável compreende um ligante clivável e um marcador. Conforme descrito acima, o aptâmero marcado pode ser capturado em um suporte sólido, onde o suporte sólido compreende um elemento de captura apropriado para o marcador. O suporte sólido pode então ser lavado conforme descrito neste documento antes do equilíbrio com a amostra de teste para remover quaisquer materiais indesejados (Captura-0).

[00136] Conforme usado neste documento, "Captura-2" refere-se à partição de um complexo de afinidade aptâmero alvo ou complexo covalente aptâmero alvo com base na captura da molécula alvo. O objetivo da etapa de Captura-2 é remover o aptâmero livre ou não complexado da amostra de teste antes da detecção e quantificação opcional. A remoção do aptâmero livre da amostra permite a detecção da afinidade aptâmero alvo ou complexos covalentes aptâmero alvo por qualquer técnica de detecção de ácido nucleico adequada. Ao usar Q-PCR para detecção e quantificação opcional, a remoção do aptâmero livre é necessária para a detecção e quantificação precisas da molécula alvo.

[00137] Em uma modalidade, a molécula alvo é uma proteína ou peptídeo e aptâmero livre é particionado do complexo de afinidade de aptâmero alvo (ou covalente) (e o resto da amostra de teste) usando reagentes que podem ser incorporados em proteínas (e peptídeos) e complexos que incluem proteínas (ou peptídeos), como, por exemplo, um complexo aptâmero-afinidade alvo (ou covalente). A proteína marcada (ou peptídeo) e o complexo aptâmero-afinidade alvo (ou covalente) podem ser imobilizados em um suporte sólido, permitindo a partição da proteína (ou peptídeo) e do complexo aptâmero-afinidade alvo (ou covalente) do aptâmero livre. Tal marcação pode incluir, por exemplo, uma porção de biotina que pode ser incorporada na proteína ou peptídeo.

[00138] Em uma modalidade, um marcador de Captura-2 é anexado à proteína (ou peptídeo) antes do ensaio, durante a preparação do ensaio ou durante o ensaio, anexando quimicamente o marcador aos alvos. Em uma modalidade, o marcador de Captura-2 é um marcador liberável. Em uma modalidade, o marcador liberável compreende um ligante clivável e um marcador. Geralmente não é necessário, no entanto, liberar a proteína (ou peptídeo) do suporte sólido de Captura-

2. Conforme descrito acima, os alvos marcado pode ser capturado em um segundo suporte sólido, onde o suporte sólido compreende um elemento de captura apropriado para o marcador alvo. O suporte sólido é então lavado com várias soluções tamponadas incluindo soluções tamponadas compreendendo solventes orgânicos e soluções tamponadas compreendendo sais e/ou detergentes contendo sais e/ou detergentes.

[00139] Após lavar o segundo suporte sólido, os complexos aptâmero-afinidade alvo são, em seguida, submetidos a uma etapa de dissociação na qual os complexos são interrompidos para render aptâmero livre, enquanto as moléculas alvo em geral permanecem ligadasa ao suporte sólido através da interação de ligação do elemento de captura e marcador de captura alvo. O aptâmero pode ser liberado do complexo aptâmero-afinidade alvo por qualquer método que interrompa a estrutura do aptâmero ou do alvo. Isto pode ser alcançado através da lavagem dos complexos aptâmero-afinidade alvo em tampão de alto teor de sal, que dissocia os complexos aptâmero- alvo ligados não covalentemente. Aptâmeros livres eluídos são coletados e detectados. Em outra modalidade, pH alto ou baixo é usado para interromper os complexos aptâmero-afinidade alvo. Em outra modalidade, a alta temperatura é usada para dissociar complexos aptâmero-afinidade alvo. Em outra modalidade, uma combinação de qualquer um dos métodos acima pode ser usado. Em outra modalidade, a digestão proteolítica da porção de proteína do complexo aptâmero-afinidade alvo é usada para liberar o componente de aptâmero.

[00140] No caso de complexos covalentes aptâmero-alvo, a liberação do aptâmero para quantificação subsequente é realizada usando um ligante clivável no construto de aptâmero. Em outra modalidade, um ligante clivável no marcador alvo resultará na liberação do complexo covalente aptâmero-alvo.

[00141] A título de exemplo, o ensaio de afinidade proteômica (ensaio multiplex) pode ser praticado da seguinte forma:

[00142] Captura-0: 133 7,5% de pasta de estreptavidina-agarose em 1xSB17,Tw (40 mM de HEPES, 102 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 5 mM de MgCl2, 5 mM de KC1, 0,05% de Tween-20) foi adicionado a poços da placa de filtro (0,45 μιη de placas Millipore HV (Durapore cat# MAHVN4550)). A mistura de aptâmeros de 1,1x apropriada (todos os aptâmeros contêm um fluoróforo Cy3 e uma porção de biotina fotoclivável na extremidade 5 ') foi descongelada seguida por vórtex. A mistura de aptâmero de 1,1x foi então fervida por 10 min, agitada em vórtice por 30 s e deixada resfriar a 20 ° C em banho-maria por 20 min. O líquido nas placas de filtro contendo a pasta de estreptavidina- agarose foi então removido por centrifugação (1000x g durante 1 minuto). 100 μL de mistura de aptâmeros foram adicionados aos poços da placa de filtro (roboticamente). A mistura foi incubada a 25 °C durante 20 min em um agitador regulado para 850 rpm, protegido da luz.

[00143] Lavagens de Captura-0: Após os 20 min de incubação, a solução foi removida por meio de filtração a vácuo. 190 1x CAPS aptâmero pré-lavagem tampão (50 mM CAPS, 1 mM EDTA, 0,05% Tw-20, pH 11,0) foi adicionado e a mistura foi incubada por 1 minuto com agitação. A solução de lavagem CAPS foi, em seguida, removida por meio de filtração a vácuo. A lavagem CAPS foi, em seguida, repetida uma vez. 190 μL 1x SX17-Tween foram adicionados e a mistura foi incubada por 1 min enquanto agitada. O 1x SB17-Tween foi então removido por meio de filtração a vácuo. Um adicional de 190 μL 1x SX17-Tw foi adicionado e a mistura foi incubada por 1 min enquanto agitada. O 1x SB17-Tw foi, em seguida, removido por centrifugação (1 min a 1000x g). Após a remoção do 1x SB17, Tw, 150 μL. Tampão de armazenamento Captura-0 (150 mM de NaCl, 40 mM de HEPES, 1 mM de EDTA, 0,02% de azida de sódio, 0,05% Tween- 20) foi adicionado e a placa de filtro foi cuidadosamente selada no perímetro da placa apenas e armazenada a 4°C em o escuro até o uso.

[00144] Preparação da amostra: Setenta e cinco (75) microlitros de 40% de diluente de amostra foram semeados em 40% de uma placa de amostra (a amostra final de 40% contém: 20 μΜ de bloco Z, 1 mM de benzamidina, 1 mM de EGTA, 40 mM de HEPES, 5 mM de MgCl2, 5 mM de KC1, 1% de Tween-20). Cento e noventa e cinco (195) microlitros de 1x SB17-Tw foram semeados em uma placa de amostra a 1%. Noventa (90) microlitros de 1x SB17-Tw foram semeados em uma placa de diluição de 1 a 10. Cento e trinta e três (133) microlitros · 1x SB17-Tw foram semeados em uma placa de amostra de 0,005%. As amostras foram descongeladas durante 10 min na Rack Thawing Station em uma incubadora a 25°C, em seguida, submetidas a vórtex e centrifugadas a 1000x g por 1 minuto. As tampas foram removidas dos tubos. As amostras foram misturadas (5 vezes com 50 μL) e 50 μL de amostra de 100% foram transferidos para a placa de amostra de 40% contendo os diluentes de amostra. A amostra de 40% foi, em seguida, misturada na placa de amostra pipetando para cima e para baixo (110 μL, 10 vezes). Cinco (5) μL de amostra de 40% foram, em seguida, transferidos para a placa de amostra de 1% contendo 1x SB17-Tw. Novamente, esta amostra foi misturada por pipetagem para cima e para baixo (120 μL, 10 vezes). Após a mistura, 10 μL da amostra de 1% foram transferidos para a placa de diluição de 1 a 10 contendo 1x SB17-Tw, que foi misturado por pipetagem para cima e para baixo (75 μL, 10 vezes). Sete (7) microlitros da amostra de 0,1% da placa de diluição de 1 a 10 foram transferidos para a placa de amostra de 0,005% contendo 1x SB17-Tw e misturados por pipetagem para cima e para baixo (110 μL, 10 vezes).

[00145] Preparação da placa antes da incubação: A solução de armazenamento de captura-0 foi removida das placas de filtro por meio de filtração a vácuo. Cento e noventa (190) microlitros de 1x SB17-Tw foram, em seguida, adicionados, seguido pela remoção das placas de filtro por meio de filtração a vácuo. Um adicional de 190 μL 1x SB17-Tw foi então adicionado às placas de filtro.

[00146] Incubação: O tampão SB17-Tw 1x foi removido das placas de filtro por centrifugação (1 min a 1000x g). Cem (100) microlitros da diluição de amostra apropriada foram adicionados às placas de filtro (três placas de filtro, uma para cada diluição de amostra 40% ou 20%, 1% ou 0,005%). As placas de filtro foram cuidadosamente seladas apenas no perímetro da placa, evitando a pressurização dos poços. A pressão causará vazamento durante a incubação. As placas foram, em seguida, incubadas durante 3,5 horas a 28°C no agitador térmico ajustado para 850 rpm, protegido da luz.

[00147] Processamento da placa de filtro: Após a incubação, as placas de filtro foram colocadas em coletores de vácuo e a amostra foi removida por filtração a vácuo. Cento e noventa (190) microlitros, lavagem de biotina (100 μΜ de biotina em 1x SB17-Tw) foi adicionado e o líquido foi removido por filtração a vácuo. A amostra foi então lavada 5x com 190 μL 1x SB17-Tw (filtração a vácuo). Cem (100) microlitros de NHS-biotina 1 mM em 1x SB17-Tw (preparado de fresco) foram adicionados e as placas de filtro foram manchadas em uma almofada absorvente e a mistura foi incubada por 5 minutos com agitação. O líquido foi removido por filtração a vácuo. Foram adicionados cento e vinte e cinco (125) microlitros de 20 mM de glicina em 1x SB17-Tw e o líquido foi removido por filtração a vácuo. Novamente 125 μL de glicina 20 mM em 1x SB17-Tw foram adicionados e o líquido removido por filtração a vácuo.

[00148] Posteriormente, as amostras foram lavadas 6x com 190 μL 1x SB17-Tw, sendo o líquido removido por filtração a vácuo. Oitenta e cinco (85) microlitros de tampão de fotoclivagem (2 μΜ bloco Z em 1x SB17-Tw) foram então adicionados a cada uma das placas de filtro.

[00149] Fotoclivagem: As placas de filtro foram manchadas em almofadas absorventes e foram irradiadas durante 6 min com uma lâmpada BlackRay UV com agitação (800 rpm, 25°C). As placas foram giradas 180 graus e irradiadas por mais 6 min sob a fonte de luz BlackRay. A placa de filtro de 40% foi colocada em uma placa de 96 poços vazia. A placa de filtro de 1% foi empilhada no topo da placa de filtro de 40% e a placa de filtro de 0,005% foi empilhada no topo da placa de filtro de 1%. A montagem das placas foi centrifugada durante 1 min a 1000x g. A placa de 96 poços com a amostra eluída foi colocada na plataforma do robô. Sessenta (60) por cento de glicerol em 1x SB17-Tw da incubadora a 37°C foi colocado no deck robótico.

[00150] Captura-2: Durante a configuração do ensaio, 50 μL de contas MyOne SA de 10 mg/mL (500 μg) foram adicionados a uma placa de 96 poços Omni-tubo ABgene para captura-2 e colocados no Cytomat. A placa de esferas de 96 poços de captura-2 foi suspensa por 90 s., colocada em bloco magnético por 60 s. e o sobrenadante foi removido. Ao mesmo tempo, ou sequencialmente, o eluato de captura- 1 de cada grupo de diluição foi transferido para a placa de esferas de captura-2 e incubado em um agitador térmico Peltier (1350 rpm, 5 min, 25°C). A placa foi transferida para um magneto a 25°C durante 2 minutos e o sobrenadante foi removido. Em seguida, 75 μL 1x SB17-

Tw foram adicionados e a amostra foi incubada em um agitador Peltier a 1350 rpm por 1 minuto a 37°C. Em seguida, 75 μL de glicerol a 60% em 1x SB17-Tw (aquecido a 37°C) foram adicionados e a amostra foi novamente incubada no Agitador Peltier a 1350 rpm por 1 minuto a 37°C. A placa foi transferida para um magneto aquecido a 37°C e incubado por 2 min, seguido pela remoção do sobrenadante. Este ciclo de lavagem de 1x SB17-Tw e glicerol a 37°C foi repetido mais duas vezes. A amostra foi, em seguida, lavada para remover o glicerol residual com 150 μL 1x SB17-Tw em um agitador Peltier (1350 rpm, 1 minuto, 25°C), seguido por 1 minuto em um bloco magnético de 25°C. O sobrenadante foi removido e 150 μL 1x SB17-Tw substituído com 0,5 M de NaCl foram adicionados e incubados a 1350 rpm por 1 minuto (25°C) seguido por 1 minuto em um bloco magnético de 25°C. O sobrenadante foi removido e 75 μL de tampão de eluição de perclorato (1,8 M de NaClC-4, 40 mM de PIPES, 1 mM de EDTA, 0,05% de Triton X-100, 1x controles de hibridização, pH = 6,8) foram adicionados seguido por uma incubação de 10 minutos em um agitador Peltier (25°C, 1350 rpm). A seguir, a placa foi transferida para um separador magnético e incubada por 90 s, sendo o sobrenadante recuperado.

[00151] Hibridação: Amostra eluída de vinte (20) microlitros foi adicionada roboticamente a uma placa de 96 poços vazia. Cinco (5) microlitros de tampão de bloqueio 10x Agilent contendo um segundo conjunto de controles de hibridização foram adicionados roboticamente às amostras eluídas. Em seguida, 25 μL de tampão de hibridização 2x Agilent HiRPM foram adicionados manualmente aos poços. Quarenta (40) microlitros da mistura de hibridização foram carregados na lâmina de gaxeta Agilent. O arranjo Agilent 8 por 15k foi adicionado à lâmina de gaxeta e o sanduíche foi apertado com uma braçadeira. O sanduíche foi, em seguida, incubado em rotação (20 rpm) por 19 horas a 55°C.

[00152] Lavagem Pós-Hibridação: O processamento da lâmina pós- hibridização foi realizado em um Processador Little Dipper (SciGene, Cat # 1080-40-1). Aproximadamente 750 mL de tampão de lavagem 1 (tampão de lavagem 1 de Oligo aCGH/ChlP-on-chip, Agilent Technologies) foram colocados em uma placa de vidro de coloração. Aproximadamente 750 mL de tampão de lavagem 1 (tampão de lavagem 1 de Oligo aCGH/ChlP-on-chip, Agilent Technologies) foi colocado no banho #1 do processador Little Dipper. Aproximadamente 750 mL de tampão de lavagem 2 (tampão de lavagem 1 de Oligo aCGH/ChlP-on-chip, Agilent Technologies) aquecido a 37°C foi colocado no banho #2 do processador Little Dipper. A velocidade de agitação magnética para ambos os banhos foi ajustada para 5. O controlador de temperatura para o Banho #1 não foi ligado, enquanto o controlador de temperatura para o Banho #2 foi definido para 37°C. Até doze conjuntos de lâmina/gaxeta foram desmontados sequencialmente na primeira placa de coloração contendo tampão de lavagem 1 e as lâminas foram colocadas em um ponto de estaleiramento de lâminas enquanto ainda submersas em tampão de lavagem 1. Uma vez que todos os conjuntos de lâmina/gaxetas foram desmontados, o suporte de lâminas foi rapidamente transferido para o Banho #1 do Processador Little Dipper e o protocolo de lavagem automatizado foi iniciado. O processador Little Dipper incubou as lâminas por 300 s no banho #1 a uma velocidade de 250 seguida por uma transferência para o banho #2 a 37°C, contendo o Agilent Wash 2 (Tampão de lavagem 2 Oligo aCGH/ChlP-on-chip, Agilent Technologies) e incubado por 300 s na velocidade 100. Posteriormente, o processador Little Dipper transferiu o ponto de estaleiramento de lâminas para a centrífuga embutida, onde as lâminas foram giradas por 300 s na velocidade 690.

[00153] Imagem de microarranjo: As lâminas de microarranjo foram fotografadas com uma varredura de microarranjo (Agilent G2565CA Microarray Scanner System, Agilent Technologies) no canal Cy3 com resolução de 5 μιm em configuração de 100% de PMT e a opção XRD habilitada em 0,05. As imagens tiff resultantes foram processadas usando o software de extração de recursos Agilent versão 10.7.3.1 com o protocolo GEl_107_Sep09.

[00154] Conforme usado neste documento, um elemento, porção ou ligante "liberável" ou "clivável" refere-se a uma estrutura molecular que pode ser quebrada para produzir dois componentes separados. Um elemento liberável (ou clivável) pode compreender uma única molécula em que uma ligação química pode ser quebrada (referido neste documento como um "ligante clivável alinhado"), ou pode compreender duas ou mais moléculas nas quais uma interação não covalente pode ser quebrada ou interrompida (referido neste documento como um "ligante de hibridização").

[00155] Em algumas modalidades, é necessário separar espacialmente certos grupos funcionais de outros, a fim de evitar interferência com as funcionalidades individuais. Por exemplo, a presença de uma marcação, que absorve certos comprimentos de onda da luz, próximo a um grupo fotoclivável pode interferir na eficiência da fotoclivagem. Portanto, é desejável separar esses grupos com uma porção não interferente que forneça separação espacial suficiente para recuperar a atividade total de fotoclivagem, por exemplo. Em algumas modalidades, um "ligante de espaçamento" foi introduzido em um aptâmero com funcionalidade de marcação e fotoclivagem.

[00156] "Suporte sólido" refere-se a qualquer substrato com uma superfície a que moléculas possam ser fixadas, diretamente ou indiretamente, através de ligações covalentes ou não-covalentes. O suporte sólido pode incluir qualquer material de substrato que seja capaz de fornecer suporte físico para os elementos de captura ou sondas que estão fixados à superfície.

O material geralmente é capaz de suportar condições relacionadas com a fixação dos elementos de captura ou sondas à superfície e qualquer tratamento, processamento ou manuseio posterior encontrado durante a realização de um ensaio.

Os materiais podem ser de ocorrência natural, sintéticos ou uma modificação de um material de ocorrência natural.

Os materiais de suporte sólidos adequados podem incluir silicone, um chip de wafer de silício, grafite, superfícies espelhadas, laminados, membranas, cerâmicas, plásticos (incluindo polímeros, tais como, por exemplo, poli(cloreto de vinil), copolímeros de ciclo-olefina, géis de agarose ou contas, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4- metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno (PTFE ou Teflon®), náilon, poli(butirato de vinil)), germânio, arsenieto de gálio, ouro, prata, filme de Langmuir Blodgett, um chip "flow-through", etc., usados isoladamente ou em conjunto com outros materiais.

Materiais rígidos adicionais podem ser considerados, como vidro, que inclui sílica e inclui ainda, por exemplo, o vidro disponível como Bioglass.

Outros materiais que podem ser empregados incluem materiais porosos, tais como, por exemplo, contas de vidro de poros controlados, Sepharose® de contas reticuladas ou resinas de agarose, ou copolímeros de bis-acrilamida reticulada e azalactona.

Outras esferas incluem nanopartículas, esferas de polímero, esferas de núcleo sólido, esferas paramagnéticas ou microesferas.

Quaisquer outros materiais conhecidos na técnica que sejam capazes de ter um ou mais grupos funcionais, como qualquer um de um grupo funcional de amino, carboxila, tiol ou hidroxila, por exemplo, incorporado à sua superfície, também são contemplados.

[00157] O material usado para um suporte sólido pode assumir qualquer uma de uma variedade de configurações que variam de simples a complexas. O suporte sólido pode ter qualquer uma de várias formas, incluindo uma tira, placa, disco, haste, partícula, conta, tubo, poço (microtitulação) e semelhantes. O suporte sólido pode ser poroso ou não poroso, magnético, paramagnético ou não magnético, polidisperso ou monodisperso, hidrofílico ou hidrofóbico. O suporte sólido também pode estar na forma de um gel ou pasta de partículas compactadas (como em um arranjo de coluna) ou fracamente compactadas.

[00158] Em uma modalidade, o suporte sólido com elemento de captura anexado é usado para capturar complexos aptâmero-afinidade alvo ou complexos covalentes aptâmero-alvo de uma mistura de teste. Em um exemplo particular, quando o marcador é uma porção de biotina, o suporte sólido poderia ser uma esfera ou resina revestida com estreptavidina, tal como Estreptavidina de Dynabeads M-280, Estreptavidina de Dynabeads MyOne, estreptavidina de Dynabeads M- 270 (Invitrogen), Resina de Estreptavidina Agarose (Pierce), Resina de Estreptavidina Ultralink, Esferas de Estreptavidina MagnaBind (ThermoFisher Scientific), Estreptavidina BioMag, Estreptavidina ProMag, Estreptavidina de Sílica (Bangs Laboratories), Estreptavidina Sefarose de Alta Eficiência (GE Healthcare),

[00159] Microesfera de Estreptavidina Poliestireno (Microspheres- Nanospheres), Partículas de Poliestireno Revestidas com Estreptavidina (Spherotech), ou qualquer outra esfera ou resina revestida com estreptavidina usadas comumente por um versado na técnica para capturar moléculas marcadas com biotina.

[00160] Conforme foi descrito acima, um objetivo da presente invenção é converter um sinal de proteína em um sinal de aptâmero. Como resultado, a quantidade de aptâmeros coletados/detectados é indicativa e pode ser diretamente proporcional à quantidade de moléculas alvo ligadas e à quantidade de moléculas alvo na amostra. Uma série de esquemas de detecção podem ser empregados sem eluir o complexo covalente aptâmero-afinidade alvo ou aptâmero-alvo do segundo suporte sólido após a partição de captura-2. Além das seguintes modalidades de métodos de detecção, outros métodos de detecção serão conhecidos por aqueles versados na técnica.

[00161] Muitos métodos de detecção requerem que um rótulo explícito seja incorporado ao aptâmero antes da detecção. Nessas modalidades, marcações, como, por exemplo, corantes fluorescentes ou quimioluminescentes podem ser incorporados em aptâmeros durante ou após a síntese usando técnicas padrão para a síntese de ácido nucleico. Marcações radioativos podem ser incorporados durante a síntese ou pós-síntese usando reações enzimáticas padrão com os reagentes apropriados. A marcação também pode ocorrer após a partição de captura-2 e eluição usando técnicas enzimáticas adequadas. Por exemplo, usando um primer com as marcações mencionadas acima, o PCR incorporará marcações no produto de amplificação dos aptâmeros eluídos. Ao usar uma técnica de gel para quantificação, marcações de massa de tamanhos diferentes também podem ser incorporados usando PCR. Essas marcações de massa também podem incorporar diferentes corantes fluorescentes ou quimioluminescentes para capacidade adicional de multiplexação. As marcações podem ser adicionadas indiretamente aos aptâmeros usando uma marca específica incorporada ao aptâmero, durante a síntese ou pós-sinteticamente e, em seguida, adicionando uma sonda que se associa com o marcador e porta a marcação. As marcações incluem aqueles descritos acima, bem como enzimas usadas em ensaios padrão para leituras colorimétricas, por exemplo. Estas enzimas funcionam em combinação com substratos enzimáticos e incluem enzimas como, por exemplo, peroxidase de rábano (HRP) e fosfatase alcalina (AP). As marcações também podem incluir materiais ou compostos que são grupos funcionais eletroquímicos para detecção eletroquímica.

[00162] Por exemplo, o aptâmero pode ser marcado, conforme descrito acima, com um isótopo radioativo, como 32 P antes de entrar em contato com a amostra de teste. Empregando qualquer um dos quatro ensaios básicos e variações destes, conforme discutido acima, a detecção de aptâmero pode ser simplesmente realizada quantificando a radioatividade no segundo suporte sólido no final do ensaio. As contagens de radioatividade serão diretamente proporcionais à quantidade de alvo na amostra de teste original. Da mesma forma, a marcação de um aptâmero com um corante fluorescente, como descrito acima, antes de entrar em contato com a amostra de teste permite uma leitura fluorescente simples diretamente no segundo suporte sólido. Um marcador quimioluminescente ou um ponto quântico pode ser empregado de forma semelhante para leitura direta a partir do segundo suporte sólido, não exigindo eluição de aptâmero.

[00163] Ao eluir o aptâmero ou liberar o complexo covalente fotoaptâmero-alvo do segundo suporte sólido, esquemas de detecção adicionais podem ser empregados além daqueles descritos acima. Por exemplo, o aptâmero liberado, fotoaptâmero ou complexo covalente fotoaptâmero-alvo pode ser executado em um gel PAGE e detectado e opcionalmente quantificado com uma coloração de ácido nucleico, como SYBR Gold. Alternativamente, o aptâmero liberado, fotoaptâmero ou complexo covalente de fotoaptâmero pode ser detectado e quantificado usando eletroforese em gel capilar (CGE) usando um marcador fluorescente incorporado no aptâmero como descrito acima. Outro esquema de detecção emprega PCR quantitativo para detectar e quantificar o aptâmero eluído usando SYBR Green, por exemplo. Alternativamente, o ensaio de DNA Invader® pode ser empregado para detectar e quantificar o aptâmero eluído. Outro esquema de detecção alternativo emprega sequenciamento de próxima geração.

[00164] Em outra modalidade, a quantidade ou concentração do complexo de afinidade aptâmero-alvo (ou complexo covalente aptâmero-alvo) é determinada usando um "farol molecular" durante um processo replicativo (ver, por exemplo, Tyagi et ah, Nat. Biotech. J_6: 49 53, 1998; Patente US N° 5.925.517). Um farol molecular é uma sonda de ácido nucleico específica que se dobra em uma alça em hairpin e contém um fluoróforo em uma extremidade e um inibidor na outra extremidade da estrutura em hairpin de modo que pouco ou nenhum sinal é gerado pelo fluoróforo quando o hairpin é formado. A sequência de alça é específica para uma sequência de polinucleotídeo alvo e, após a hibridização com a sequência de aptâmero, a hairpin se desdobra e, assim, gera um sinal fluorescente.

[00165] Para detecção multiplexada de um pequeno número de aptâmeros ainda ligados ao segundo suporte sólido, corantes fluorescentes com diferentes espectros de excitação/emissão podem ser empregados para detectar e quantificar dois, ou três, ou cinco, ou até dez aptâmeros individuais.

[00166] Pontos quânticos de tamanhos diferentes podem ser empregados para leituras multiplexadas. Os pontos quânticos podem ser introduzidos após particionar o aptâmero livre do segundo suporte sólido. Usando sequências de hibridização específicas de aptâmero anexadas a leituras multiplexadas de pontos quânticos exclusivos para 2, 3, 5 e até 10 aptâmeros podem ser realizadas. A marcação de aptâmeros diferentes com isótopos radioativos diferentes que podem ser detectados individualmente, como 32 P, 3 H, 113JC e 3 J5JS,

também pode ser usada para leituras multiplex limitadas.

[00167] Para a detecção multiplexada de aptâmeros liberados do segundo suporte sólido Captura-2, um único corante fluorescente, incorporado em cada aptâmero como descrito acima, pode ser usado com um método de quantificação que permite a identificação da sequência de aptâmero juntamente com a quantificação do nível do aptâmero. Os métodos incluem, mas não estão limitados a hibridização de chip de DNA, hibridização em microgrânulo, sequenciamento de próxima geração e análise de CGE.

[00168] Em uma modalidade, um arranjo de hibridização de DNA padrão, ou chip, é usado para hibridizar cada aptâmero ou fotoaptâmero a um único ou série de sondas únicas imobilizadas em uma lâmina ou chip, como arranjos Agilent, arranjos Illumina BeadChip, arranjos NimbleGen ou arranjos impressos personalizados. Cada sonda única é complementar a uma sequência no aptâmero. A sequência complementar pode ser um tag de hibridização único incorporado no aptâmero, ou uma porção da sequência do aptâmero, ou toda a sequência do aptâmero. Os aptâmeros liberados do suporte sólido Captura-2 são adicionados a um tampão de hibridização apropriado e processados usando métodos de hibridização padrão. Por exemplo, a solução de aptâmero é incubada por 12 horas com um arranjo de hibridização de DNA a cerca de 60 °C para garantir o rigor da hibridização. Os arranjos são lavados e, em seguida, digitalizados em um scanner de lâmina fluorescente, produzindo uma imagem da intensidade de hibridização do aptâmero em cada característica do arranjo. A segmentação e quantificação de imagens são realizadas por meio de software de processamento de imagens, como o ArrayVision. Em uma modalidade, os ensaios de aptâmeros multiplexados podem ser detectados usando até 25 aptâmeros, até 50 aptâmeros, até 100 aptâmeros, até 200 aptâmeros, até 500 aptâmeros, até 1000 aptâmeros e até 10.000 aptâmeros.

[00169] Em uma modalidade, microgrânulos endereçáveis com sondas de DNA únicas complementares aos aptâmeros, conforme descrito acima, são usadas para hibridização. Os micro-grânulos podem ser endereçados com corantes fluorescentes exclusivos, como a tecnologia de esferas Luminex, ou usar marcações de código de barras como na tecnologia Illumina VeraCode, ou transponders alimentados por laser. Em uma modalidade, os aptâmeros liberados do suporte sólido Captura-2 são adicionados a um tampão de hibridização apropriado e processados usando métodos de hibridização de mico-grânulos padrão. Por exemplo, a solução de aptâmero é incubada por duas horas com um conjunto de micro- grânulos a cerca de 60°C para garantir o rigor da hibridização. As soluções são então processadas em um instrumento Luminex que conta os tipos de grânulos individuais e quantifica o sinal fluorescente do aptâmero. Em outra modalidade, os grânulos VeraCode são colocados em contato com a solução de aptâmero e hibridizados por duas horas a cerca de 60°C e, em seguida, depositados em uma superfície em grade e digitalizados usando um scanner de slides para identificação e quantificação de fluorescência. Em outra modalidade, os micro-grânulos do transponder são incubados com a amostra de aptâmero a cerca de 60°C e então quantificadas usando um dispositivo apropriado para os micro-grânulos do transponder. Em uma modalidade, os ensaios de aptâmeros multiplex podem ser detectados por hibridização em micro-grânulos usando até 25 aptâmeros, até 50 aptâmeros, até 100 aptâmeros, até 200 aptâmeros e até 500 aptâmeros.

[00170] A amostra contendo os aptâmeros eluídos pode ser processada para incorporar tags de massa únicos juntamente com marcadores fluorescentes, conforme descrito acima. Os aptâmeros marcados com massa são então injetados em um instrumento CGE, essencialmente um sequenciador de DNA, e os aptâmeros são identificados por suas massas únicas e quantificados usando fluorescência do corante incorporado durante a reação de marcação. Um exemplo exemplar dessa técnica foi desenvolvido pela Althea Technologies.

[00171] Em muitos dos métodos descritos acima, a solução de aptâmeros pode ser amplificada e opcionalmente marcada antes da quantificação. A amplificação de PCR padrão pode ser usada com a solução de aptâmeros eluídos do suporte sólido Captura-2. Tal amplificação pode ser usada antes da hibridização do arranjo de DNA, hibridização de microgrânulo e leitura CGE.

[00172] Em outra modalidade, o complexo de afinidade aptâmero- alvo (ou complexo covalente aptâmero-alvo) é detectado e/ou quantificado usando Q-PCR. Tal como utilizado neste documento, "Q- PCR" refere-se a uma reação de PCR realizada de tal forma e sob tais condições controladas que os resultados do ensaio sejam quantitativos, isto é, o ensaio é capaz de quantificar a quantidade ou concentração de aptâmero presente em a amostra de teste.

[00173] Em uma modalidade, a quantidade ou concentração do complexo de afinidade aptâmero-alvo (ou complexo aptâmero-alvo covalente) na amostra de teste é determinada usando TaqMan® PCR. Esta técnica geralmente se baseia na atividade de exonuclease 5'-3' da enzima de replicação do oligonucleotídeo para gerar um sinal de uma sequência direcionada. Uma sonda TaqMan é selecionada com base na sequência do aptâmero a ser quantificado e geralmente inclui um fluoróforo na extremidade 5', como 6-carboxifluoresceína, por exemplo, e um inibidor na extremidade 3', tal como, por exemplo, um 6 -carboxitetrametilfluoresceína, para gerar sinal conforme a sequência do aptâmero é amplificada usando a reação em cadeia da polimerase

(PCR). À medida que a polimerase copia a sequência do aptâmero, a atividade de exonuclease libera o fluoróforo da sonda, que é hibridizada a jusante dos primers de PCR, gerando assim o sinal. O sinal aumenta conforme o produto replicativo é produzido. A quantidade de produto de PCR depende tanto do número de ciclos replicativos realizados, quanto da concentração inicial do aptâmero.

[00174] Em outra modalidade, a quantidade ou concentração de um complexo de afinidade aptâmero-alvo (ou complexo covalente aptâmero-alvo) é determinada usando um corante fluorescente intercalante durante o processo replicativo. O corante intercalante, como, por exemplo, SYBR® green, gera um grande sinal fluorescente na presença de DNA de fita dupla em comparação com o sinal fluorescente gerado na presença de DNA de fita simples. Como o produto de DNA de fita dupla é formado durante a PCR, o sinal produzido pelo corante aumenta. A magnitude do sinal produzido depende do número de ciclos de PCR e da concentração inicial do aptâmero.

[00175] Em outra modalidade, o complexo de afinidade aptâmero- alvo (ou complexo covalente aptâmero-alvo) é detectado e/ou quantificado usando espectometria em massa. Tags de massa única podem ser introduzidos usando técnicas enzimáticas descritas acima. Para leitura de espectroscopia de massa, nenhuma marcação de detecção é necessária, em vez disso, a própria massa é usada para identificar e, usando técnicas comumente usadas por aqueles versados na técnica, quantificada com base na localização e área sob os picos de massa gerados durante a análise de espectroscopia de massa. Um exemplo de espectroscopia de massa é o sistema MassARRAY® desenvolvido pela Sequenom.

[00176] Um programa de computador pode ser utilizado para realizar uma ou mais etapas de qualquer um dos métodos divulgados neste documento. Outro aspecto da presente divulgação é um produto de programa de computador que compreende um meio de armazenamento legível por computador tendo um programa de computador armazenado no mesmo que, quando carregado em um computador, executa ou auxilia no desempenho de qualquer um dos métodos divulgados neste documento.

[00177] Um aspecto da divulgação é um produto de qualquer um dos métodos divulgados neste documento, a saber, um resultado de ensaio, que pode ser avaliado no sítio do teste ou pode ser enviado para outro sítio para avaliação e comunicação a uma parte interessada em uma localização remota, se desejado. Conforme usado neste documento, "local remoto" se refere a um local que é fisicamente diferente daquele em que os resultados são obtidos. Consequentemente, os resultados podem ser enviados para uma sala diferente, um prédio diferente, uma parte diferente da cidade, uma cidade diferente e assim por diante. Os dados podem ser transmitidos por qualquer meio adequado, como, por exemplo, fax, correio, entrega durante a noite, e-maila, ftp, correio de voz e semelhantes.

[00178] As informações de "comunicação" referem-se à transmissão dos dados que representam essas informações como sinais elétricos em um canal de comunicação adequado (por exemplo, uma rede privada ou pública). "Encaminhamento" de um item se refere a qualquer meio de levar esse item de um local para o próximo, seja transportando fisicamente esse item ou de outra forma (quando for possível) e inclui, pelo menos no caso de dados, o transporte físico de um meio de transporte os dados ou a comunicação dos dados. Nucleotídeos Modificados

[00179] Em certas modalidades, a divulgação proporciona oligonucleotídeos, tais como aptâmeros, que compreendem dois tipos diferentes de nucleotídeos de base modificada. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos compreendem dois tipos diferentes de pirimidinas modificadas na posição 5. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende pelo menos uma citidina modificada com C5 e pelo menos uma uridina modificada com C5. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende duas citidinas diferentes modificadas em C5. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo compreende duas uridinas diferentes modificadas com C5. Uridinas e citidinas modificadas com C5 exemplares não limitantes são mostradas, por exemplo, na Figura 1. Certas uridinas modificadas com C5 exemplificativas não limitantes são mostradas na Figura 2, e certas citidinas C5 modificadas não limitantes são mostradas na Figura 3. Preparação de Oligonucleotídeos

[00180] A síntese automatizada de oligodesoxinucleosídeos é prática de rotina em muitos laboratórios (ver, por exemplo, Matteucci, M. D. e Caruthers, M. H., (1990) J. Am. Chem. Soc., 103:3185-3191, cujos conteúdos estão incorporados por meios deste por referência integralmente). A síntese de oligorribonucleosídeos também é bem conhecida (ver, por exemplo, Scaringe, S. A., et al., (1990) Nucleic Acids Res. 18:5433-5441, cujos conteúdos estão incorporados por meio deste por referência integralmente). Como observado neste documento, as fosforamiditas são úteis para a incorporação do nucleosídeo modificado em um oligonucleotídeo por síntese química, e os trifosfatos são úteis para a incorporação do nucleosídeo modificado em um oligonucleotídeo por síntese enzimática. (Ver, por exemplo, Vaught, J.D. et al. (2004) J. Am. Chem. Soc., 126:11231-11237; Vaught, J. V., et al. (2010) J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151; Gait, M. J. "Oligonucleotide Synthesis a practical approach" (1984) IRL Press (Oxford, UK); Herdewijn, P. "Oligonucleotide Synthesis" (2005) (Humana Press, Totowa, N.J. (cada um dos quais está incorporado neste documento integralmente por referência).

[00181] "Alvo" ou "molécula alvo" ou "alvo" refere-se, neste documento, a qualquer composto em que um ácido nucleico pode agir de uma forma desejável. Uma molécula alvo pode ser uma proteína, peptídeo, ácido nucleico, carboidrato, lipídio, polissacarídeo, glicoproteína, hormônio, receptor, antígeno, anticorpo, vírus, patógeno, substância tóxica, substrato, metabólito, análogo de estado de transição, cofator, inibidor, fármaco, tintura, nutriente, fator de crescimento, célula, tecido, qualquer parte ou fragmento de qualquer um dos acima etc., sem limitação. Praticamente qualquer efetor químico ou biológico pode ser um alvo apropriado. Moléculas de qualquer tamanho podem servir como alvos. Um alvo também pode ser modificado em determinadas maneiras para aumentar a probabilidade ou a força de uma interação entre o alvo e o ácido nucleico. Um alvo também pode incluir qualquer alteração menor de um determinado composto ou molécula, tais como, no caso de uma proteína, por exemplo, pequenas variações na sequência de aminoácidos, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tais como conjugação com uma componente de marcação, que não altera substancialmente a identidade da molécula. Uma "molécula alvo" ou "alvo" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de moléculas ou estrutura multimolecular que é capaz de ligação a um aptâmero. "Moléculas alvo" ou "alvos" referem-se a mais de um tal conjunto de moléculas. Modalidades do processo SELEX em que o alvo é um peptídeo são descritas em Patente US N°. 6.376.190, intitulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein." Em algumas modalidades, um alvo é uma proteína.

[00182] Como usado neste documento, "molécula competidora" e "competidor" são usados indistintamente para se referir a qualquer molécula que possa formar um complexo não específico com uma molécula não-alvo. Neste contexto, moléculas não-alvo incluem aptâmeros livres, em que, por exemplo, um competidor pode ser utilizado para inibir a ligação de aptâmero (religação), não especificamente, a uma outra molécula não-alvo. Uma "molécula competidora" ou "competidor" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula. "Moléculas competidoras" ou "competidores" referem-se a mais de um conjunto de moléculas. As moléculas competidoras incluem, mas não se limitam a, oligonucleotídeos, poliânions (por exemplo, heparina, DNA de esperma de arenque, DNA de esperma de salmão, tRNA, sulfato de dextrano, polidextrano, polímeros fosfodiéster abásicos, dNTPs e pirofosfato). Em várias modalidades, uma combinação de um ou mais competidores pode ser usada.

[00183] Como usado neste documento, "complexo não específico" refere-se a uma associação não covalente entre duas ou mais moléculas além de um aptâmero e sua molécula alvo. Um complexo não específico representa uma interação entre as classes de moléculas. Os complexos não-específicos incluem complexos formados entre um aptâmero e uma molécula não-alvo, um competidor e uma molécula não-alvo, um competidor e uma molécula alvo e uma molécula-alvo e uma molécula não-alvo.

[00184] Numa outra modalidade, um competidor polianiônico (por exemplo, sulfato de dextrano ou outro material polianiônico) é utilizado no processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta para facilitar a identificação de um aptâmero que é refratário à presença do poliânion. Neste contexto, "aptâmero refratário polianiônico" é um aptâmero que é capaz de formar um complexo de aptâmero/alvo que tem menos probabilidade de se dissociar na solução que contém também material refratário polianiônico do que um complexo de aptâmero/alvo que inclui um aptâmero refratário não-polianiônico.

Desta maneira, os aptâmeros refratários polianiônicos podem ser utilizados na realização dos métodos analíticos para detectar a presença ou a quantidade ou a concentração de um alvo numa amostra, onde o método de detecção inclui o uso do material polianiônico (por exemplo, sulfato de dextrano), ao qual o aptâmero é refratário.

[00185] Assim, numa modalidade, um método para a produção de um aptâmero refratário polianiônico é fornecido. Nesta modalidade, após o contato de uma mistura candidata de ácidos nucleicos com o alvo. O alvo e os ácidos nucleicos na mistura candidata podem chegar ao equilíbrio. Um competidor polianiônico é introduzido e é deixado para incubar na solução por um período de tempo suficiente para assegurar que a maior parte dos aptâmeros de taxa de dissociação lenta na mistura candidata se dissociam da molécula alvo. Além disso, os aptâmeros na mistura candidata que podem se dissociar na presença do competidor polianiônico serão liberados da molécula alvo. A mistura é submetida à partição para isolar os aptâmeros de taxa de dissociação lenta e de alta afinidade que se mantiveram em associação com a molécula alvo e para remover quaisquer materiais não complexados da solução. O aptâmero pode então ser liberado da molécula alvo e isolado. O aptâmero isolado também pode ser amplificado e ciclos adicionais de seleção aplicados para aumentar o desempenho global dos aptâmeros selecionados. Este processo também pode ser usado com um tempo de incubação mínimo, se a seleção de aptâmeros de taxa de dissociação lenta não for necessária para uma aplicação específica. Sais

[00186] Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar e/ou manusear um sal correspondente do composto, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são discutidos em Berge et al. (1977) "Pharmaceutically Acceptable Salts" J. Pharm. Sci. 66:1-19.

[00187] Por exemplo, se o composto for aniônico, ou tiver um grupo funcional que possa ser aniônico (por exemplo, -COOH pode ser - COO−), então um sal pode ser formado com um cátion adequado. Exemplos de cátions inorgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, íons de metal alcalino, tais como Na+ e K+, cátions de alcalinos terrosos, tais como Ca2+ e Mg2+, e outros cátions, tais como Al+3. Exemplos de cátions orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, íon amônio (isto é, NH4 +) e íons amônio substituídos (por exemplo, NH3RX+, NH2RX 2 + , NHRX 3 + , NRX 4 + ). Exemplos de alguns íons amônio substituídos adequados são aqueles derivados de: etilamina, dietilamina, diciclo-hexilamina, trietilamina, butilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina, benzilamina, fenilbenzilamina, colina, meglumina e trometamina, bem como aminoácidos, como lisina e arginina. Um exemplo de um íon amônio quaternário comum é N(CH3)4 +.

[00188] Se o composto for catiônico, ou tiver um grupo funcional que possa ser catiônico (por exemplo,-NH2 pode ser -NH3+), então, um sal pode ser formado com um ânion adequado. Os exemplos de ânions inorgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, àqueles derivados dos seguintes ácidos inorgânicos: clorídrico, bromídrico, iodídrico, sulfúrico, sulfuroso, nítrico, nitroso, fosfórico e fosforoso.

[00189] Exemplos de ânions orgânicos adequados incluem, mas não estão limitados a, derivados dos seguintes ácidos orgânicos: 2- acetioxibenzoico, acético, ascórbico, aspártico, benzoico, canforsulfônico, cinâmico, cítrico, edético, etanodissulfônico, etanossulfônico, fumárico, glucoheptônico, glucônico, glutâmico, glicólico, hidroximaleico, carboxílico hidroxinaftaleno, isetiônico, láctico,

lactobiônico, láurico, maleico, málico, metanossulfônico, múcico, oleico, oxálico, palmítico, pamoico, pantotênico, fenilacético, fenilsulfônico, propiônico, pirúvico, salicílico, esteárico, succínico, sulfanílico, tartárico, toluenossulfônico e valérico. Exemplos de ânions orgânicos poliméricos adequados incluem, mas não estão limitados a, derivados dos seguintes ácidos poliméricos: ácido tânico, carboximetilcelulose.

[00190] A menos que especificado em contrário, uma referência a um composto em particular inclui também as formas de sal dos mesmos. Outras Modalidades

[00191] Em algumas modalidades, é divulgado um método compreendendo a) o contato de uma primeira amostra de teste com um primeiro conjunto de aptâmeros para formar uma primeira mistura, em que a primeira amostra de teste é uma diluição de Z% da amostra biológica, em que Z é de 5% para 39% (ou 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39) diluição de uma amostra biológica, e há pelo menos A3 aptâmeros diferentes no primeiro conjunto de aptâmeros; b) contatar uma segunda amostra de teste com um segundo conjunto de aptâmeros para formar uma segunda mistura, em que a segunda amostra de teste é uma diluição de Y% da amostra biológica, em que Y é menor que Z, e em que existem pelo menos A 2 aptâmeros diferentes no segundo conjunto de aptâmeros; c) contatar uma terceira amostra de teste com um terceiro conjunto de aptâmeros para formar uma terceira mistura, em que a terceira amostra de teste é uma diluição de X% da amostra biológica, em que X é menor que Y, e há pelo menos A1 aptâmeros diferentes em o terceiro conjunto de aptâmeros; d) incubar a primeira, segunda e terceira misturas para permitir a formação de complexos aptâmero-proteína e remover a maioria dos aptâmeros que não formaram complexos aptâmero- proteína; e) coletar os aptâmeros dos complexos aptâmero-proteína por dissociação dos complexos aptâmero-proteína; f) detectar ou quantificar os aptâmeros coletados; em que, a maioria dos aptâmeros do primeiro conjunto de aptâmeros, segundo conjunto de aptâmeros e terceiro conjunto de aptâmeros, cada um tem afinidade para uma proteína alvo diferente na amostra de teste e são capazes de formar um complexo aptâmero-proteína com sua proteína alvo, e em que A3 é maior que A2e A2 é maior que A2; e em que a soma de A1, A2 e A3 é de pelo menos 4.000.

[00192] Em um aspecto, Z é de 10% a 30%, ou de 15% a 25%, ou cerca de 20%.

[00193] Em um aspecto, Y é de 0,01% a 1% (ou 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75 ou cerca de 0,5%.

[00194] Em um aspecto, X é de 0,001% a 0,009% (ou 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 ou 0,009) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[00195] Em um aspecto, a soma deA1, A2 e A3 é de pelo menos

4.500 ou 5.000.

[00196] Em um aspecto, A3 é de 50% a 90% (ou 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90%) da soma de A1, A2 e A3; ou de 60% a 85% da soma de A1, A2 e A3; ou cerca de 80% ou 81% da soma de A1, A2 e A3.

[00197] Em um aspecto, A2 é de 10% a 49% (ou 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ou 49%) da soma de A1, A2 e A3; ou de 12% a 35% da soma de A1, A2 e A3; ou de 15% a 30% da soma de A 1, A2 e A3; ou cerca de 15% ou 16% da soma de A1, A2 e A3.

[00198] Em um aspecto, A1 é de 1% a 9% (ou 1%, 2%, 3%, 4%, 5%,

6%, 7%, 8% ou 9%) da soma de A1, A2 e A3; ou de 2% a 7% da soma de A1, A2 e A3; ou de 3% a 6% da soma deA1, A2 e A3; ou cerca de 3% ou 4% da soma de A1, A2 e A3.

[00199] Em um aspecto, A3 é pelo menos 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500, 5000 (ou é de 900 a 16.500 ou de 2.000 a 15.000 ou de

3.000 a 12.000 ou de 4.000 a 10.000).

[00200] Em um aspecto, A2 é pelo menos 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820, 900 (ou é de 500 a 3500 ou de 700 a 2500, ou de 800 a 2000).

[00201] Em um aspecto, A1 é pelo menos 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 173 (ou é de 100 a 700 ou 100 a 650).

[00202] Em um aspecto, a primeira mistura, a segunda mistura e a terceira mistura são incubadas separadamente uma da outra.

[00203] Em um aspecto, os métodos neste documento compreendem ainda combinar a primeira mistura, a segunda mistura e a terceira mistura juntas após as misturas serem incubadas para permitir a formação do complexo aptâmero-proteína.

[00204] Em um aspecto, os métodos neste documento compreendem ainda combinar sequencialmente a primeira mistura, a segunda e a terceira mistura juntas após as misturas serem incubadas para permitir a formação do complexo aptâmero-proteína.

[00205] Em um aspecto, a combinação sequencial é realizada em uma ordem selecionada de i) a primeira mistura, seguida pela segunda mistura, seguida pela terceira mistura; ii) a primeira mistura, seguida da terceira mistura, seguida da segunda mistura; iii) a segunda mistura, seguida pela primeira mistura, seguida pela terceira mistura; iv) a segunda mistura, seguida pela terceira mistura, seguida pela primeira mistura; v) a terceira mistura, seguida da segunda mistura,

seguida da primeira mistura; e vi) a terceira mistura, seguida pela primeira mistura, seguida pela segunda mistura.

[00206] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de sangue, plasma, escarro sérico, respiração, urina, sêmen, saliva, fluido meníngeo, fluido amniótico, fluido glandular, fluido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, fluido sinovial, aspirado de articulação, células, um extrato celular e fluido cerebrospinal.

[00207] Em um aspecto, a detecção ou quantificação é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

[00208] Em um aspecto, os pelo menos A3 aptâmeros diferentes são diferentes uns dos outros por pelo menos uma diferença de nucleotídeo e/ou pelo menos uma modificação de nucleotídeo.

[00209] Em um aspecto, os pelo menos A2 aptâmeros diferentes são diferentes uns dos outros por pelo menos uma diferença de nucleotídeo e/ou pelo menos uma modificação de nucleotídeo.

[00210] Em um aspecto, os pelo menos A1 aptâmeros diferentes são diferentes uns dos outros por pelo menos uma diferença de nucleotídeo e/ou pelo menos uma modificação de nucleotídeo.

[00211] Em um aspecto, os pelo menos A3 aptâmeros diferentes, os pelo menos A2 aptâmeros diferentes e os pelo menos A1 aptâmeros diferentes são diferentes um do outro por pelo menos uma diferença de nucleotídeo e/ou pelo menos uma modificação de nucleotídeo.

[00212] Os métodos de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que um ou mais aptâmeros do primeiro conjunto, segundo conjunto e terceiro conjunto de aptâmeros compreendem pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[00213] Em um aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[00214] Em um aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[00215] Em um aspecto, a porção é uma porção hidrofóbica.

[00216] Em um aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[00217] Em um aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[00218] Em um aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[00219] Em algumas modalidades, um método é divulgado compreendendo a) contatar uma primeira amostra de teste com pelo menos um primeiro aptâmero para formar uma primeira mistura, em que a primeira amostra de teste é pelo menos uma diluição de X% de uma amostra de teste; b) contatar uma segunda amostra de teste com pelo menos um segundo aptâmero para formar uma segunda mistura, em que a segunda amostra de teste é uma diluição de Y% da amostra de teste, em que X é menor que Y; c) contatar uma terceira amostra de teste com pelo menos um terceiro aptâmero para formar uma terceira mistura, em que a terceira amostra de teste é uma diluição de Z% da amostra de teste, em que Y é menor que Z; d) incubar a primeira, segunda e terceira misturas para permitir a formação de complexos aptâmero-proteína e remover a maioria dos aptâmeros que não formaram complexos aptâmero-proteína; e) coletar os aptâmeros dos complexos aptâmero-proteína por dissociação dos complexos aptâmero-proteína; f) detectar ou quantificar os aptâmeros coletados; em que, o pelo menos um primeiro aptâmero, o pelo menos um segundo aptâmero e o pelo menos um terceiro aptâmero, cada um tem afinidade para uma proteína diferente e são capazes de formar um complexo aptâmero-proteína quando a proteína está presente no respectivo teste amostra; em que a primeira, a segunda e a terceira amostras de teste são uma diluição diferente da mesma amostra de teste.

[00220] Em um aspecto, Z% é de 5% a 39% (ou 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39%) ou de 10% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

[00221] Em um aspecto, Y% é de 0,01% a 1% (ou 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,7% ou cerca de 0,5%.

[00222] Em um aspecto, X% é de 0,001% a 0,009% (ou 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 ou 0,009) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[00223] Em um aspecto, a primeira mistura compreende uma pluralidade de aptâmeros.

[00224] Em um aspecto, a primeira mistura compreende pelo menos 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 173 (ou é de 100 a 700 ou 100 a 650) aptâmeros diferentes.

[00225] Em um aspecto, a segunda mistura compreende uma pluralidade de aptâmeros.

[00226] Em um aspecto, a segunda mistura compreende pelo menos 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820, 900 (ou é de 500 a 3500 ou de 700 a 2500, ou de 800 a 2000) aptâmeros diferentes.

[00227] Em um aspecto, a terceira mistura compreende uma pluralidade de aptâmeros.

[00228] Em um aspecto, a terceira mistura compreende pelo menos 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500, 5000 (ou é de 900 a 16.500 ou de 2.000 a 15.000 ou de 3.000 a 12.000 ou de 4.000 a 10.000) aptâmeros diferentes.

[00229] Em um aspecto, a primeira mistura, a segunda mistura e a terceira mistura são incubadas separadamente uma da outra.

[00230] Em um aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda combinar a primeira mistura, a segunda mistura e a terceira mistura juntas após as misturas serem incubadas para permitir a formação do complexo aptâmero-proteína.

[00231] Em um aspecto, os métodos divulgados neste documento compreendem ainda combinar sequencialmente a primeira mistura, a segunda e a terceira mistura juntas após as misturas serem incubadas para permitir a formação do complexo aptâmero-proteína.

[00232] Em um aspecto, a combinação sequencial é realizada em uma ordem selecionada de i) a primeira mistura, seguida pela segunda mistura, seguida pela terceira mistura; ii) a primeira mistura, seguida da terceira mistura, seguida da segunda mistura; iii) a segunda mistura, seguida pela primeira mistura, seguida pela terceira mistura; iv) a segunda mistura, seguida pela terceira mistura, seguida pela primeira mistura; v) a terceira mistura, seguida da segunda mistura, seguida da primeira mistura; e vi) a terceira mistura, seguida pela primeira mistura, seguida pela segunda mistura.

[00233] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de sangue, plasma, escarro sérico, respiração, urina, sêmen, saliva, fluido meníngeo, fluido amniótico, fluido glandular, fluido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, fluido sinovial, aspirado de articulação, células, um extrato celular e fluido cerebrospinal.

[00234] Em um aspecto, a detecção ou quantificação é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

[00235] Os métodos de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que o pelo menos um primeiro aptâmero, o pelo menos um segundo aptâmero, o pelo menos um terceiro aptâmero e a pluralidade de aptâmeros compreendem pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[00236] Em um aspecto, em que a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[00237] Em um aspecto, em que o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[00238] Em um aspecto, em que a porção é uma porção hidrofóbica.

[00239] Em um aspecto, em que a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[00240] Em um aspecto, em que a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[00241] Em um aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[00242] Os métodos de qualquer um dos parágrafos anteriores, em que os aptâmeros diferem uns dos outros por pelo menos uma diferença de nucleotídeo e/ou pelo menos uma modificação de nucleotídeo.

[00243] Em algumas modalidades, é divulgado um sistema que compreende a) um primeiro receptáculo tendo uma primeira mistura compreendendo uma primeira amostra de teste com um primeiro conjunto de aptâmeros, em que a primeira amostra de teste é uma diluição de Z% de uma amostra de teste, e há pelo menos A3 aptâmeros diferentes no primeiro conjunto de aptâmeros; b) um segundo receptáculo tendo uma segunda mistura compreendendo uma segunda amostra de teste com um segundo conjunto de aptâmeros, em que a segunda amostra de teste é uma diluição de Y% da amostra de teste, em que Y é menor que Z, e há pelo menos A2 diferentes aptâmeros no segundo conjunto de aptâmeros; c) um terceiro receptáculo tendo uma terceira mistura compreendendo uma terceira amostra de teste com um terceiro conjunto de aptâmeros, em que a terceira amostra de teste é uma diluição de X% da amostra de teste, em que X é menor que Y, e há pelo menosA1 diferente aptâmeros no terceiro conjunto de aptâmeros; e em que, a maioria dos aptâmeros do primeiro conjunto de aptâmeros, segundo conjunto de aptâmeros e terceiro conjunto de aptâmeros têm afinidade para uma proteína na amostra de teste e são capazes de formar um complexo aptâmero-proteína e em que A3 é maior que A2, e A2 é maior que A1; e em que a soma de A1, A2 e A3 é de pelo menos 4.000; e em que o sistema é usado para detectar proteínas na amostra de teste, e a primeira, segunda e terceira amostras de teste são uma diluição diferente da mesma amostra de teste.

[00244] Em um aspecto, Z% é de 5% a 39% (ou 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,

31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39%) ou de 10% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

[00245] Em um aspecto, Y% é de 0,01% a 1% (ou 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,7% ou cerca de 0,5%.

[00246] Em um aspecto, X% é de 0,001 a 0,009% (ou 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[00247] Em algumas modalidades, é divulgado um sistema que compreende a) um primeiro receptáculo tendo uma primeira mistura compreendendo uma primeira amostra de teste com pelo menos um primeiro aptâmero, em que a primeira amostra de teste é uma diluição de Z% de uma amostra de teste; b) um segundo receptáculo tendo uma segunda mistura compreendendo uma segunda amostra de teste com pelo menos um segundo aptâmero, em que a segunda amostra de teste é uma diluição de Y% da amostra de teste, em que Y é menor que Z; c) um terceiro receptáculo tendo uma terceira mistura compreendendo uma terceira amostra de teste com pelo menos um terceiro aptâmero, em que a terceira amostra de teste é uma diluição de X% da amostra de teste, em que X é menor que Y; em que, o pelo menos um primeiro aptâmero, o pelo menos um segundo aptâmero e o pelo menos um terceiro aptâmero, cada um tem afinidade para uma proteína diferente e são capazes de formar um complexo aptâmero- proteína quando a proteína está presente na amostra biológica; e em que o sistema é usado para detectar proteínas na amostra de teste, e a primeira, segunda e terceira amostras de teste são uma diluição diferente da mesma amostra de teste.

[00248] Em um aspecto, Z% é de 5% a 39% (ou 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30,

[00249] Em um aspecto, Y% é de 0,01% a 1% (ou 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,7% ou cerca de 0,5%.

[00250] Em um aspecto, X% é de 0,001 a 0,009% (ou 0,001, 0,002, 0,003, 0,004, 0,005, 0,006, 0,007, 0,008 ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

[00251] Em algumas modalidades, é divulgada uma formulação compreendendo um primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura um segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura e um terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura em que o primeiro reagente de captura do complexo de afinidade de molécula alvo formado em uma diluição de cerca de 0,005% de uma amostra de teste, o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura formado em cerca de uma diluição de 0,5% da amostra de teste e o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura formado em cerca de uma diluição de 20% da amostra de teste.

[00252] Em um aspecto, independentemente, o primeiro reagente de captura do primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura o segundo reagente de captura do segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura e o terceiro reagente de captura do terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura são selecionados a partir de um aptâmero ou anticorpo.

[00253] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas,

muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovação brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

[00254] Em um aspecto, a molécula alvo de cada um do primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura e o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é selecionado de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, uma fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

[00255] Em um aspecto, o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura e o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura são complexos não covalentes.

[00256] Em um aspecto, cada um dentre o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura e o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura formado em suas respectivas diluições da amostra de teste antes de serem combinados na formulação.

[00257] Em um aspecto, o aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[00258] Em um aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[00259] Em um aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[00260] Em um aspecto, a porção é uma porção hidrofóbica.

[00261] Em um aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[00262] Em um aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[00263] Em um aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[00264] Em algumas modalidades, é divulgada uma formulação compreendendo uma pluralidade dos primeiros complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, uma pluralidade dos segundos complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e uma pluralidade dos terceiros complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, em que o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura formado em uma diluição de cerca de 0,005% de uma amostra de teste, o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura formado em cerca de uma diluição de 0,5% da amostra de teste e o terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura formado em cerca de uma diluição de 20% da amostra de teste.

[00265] Em um aspecto, independentemente, a pluralidade de primeiros reagentes de captura da pluralidade dos primeiros complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, a pluralidade de segundos reagentes de captura da pluralidade dos segundos complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e a pluralidade de os terceiros reagentes de captura da pluralidade dos terceiros complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura são selecionados a partir de um aptâmero ou anticorpo.

[00266] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovação brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

[00267] Em um aspecto, a molécula alvo de cada um do primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura e o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é selecionado de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, uma fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

[00268] Em um aspecto, a pluralidade do primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, a pluralidade do segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e a pluralidade do terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura são complexos não covalentes.

[00269] Em um aspecto, cada um dentre a pluralidade do primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, a pluralidade do segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e a pluralidade do terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura formado em suas respectivas diluições da amostra de teste antes de serem combinados no formulação.

[00270] Em um aspecto, o aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[00271] Em um aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[00272] Em um aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[00273] Em um aspecto, a porção é uma porção hidrofóbica.

[00274] Em um aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[00275] Em um aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[00276] Em um aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[00277] Em um aspecto, a pluralidade de primeiros reagentes de captura da pluralidade do primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura é de cerca de 100, 110, 120, 130, 140, 150,

160, 170 ou 173; ou é de 100 a 700; ou de 100 a 650 reagentes de captura.

[00278] Em um aspecto, a pluralidade dos segundos reagentes de captura da pluralidade do segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura é cerca de 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820 ou 900; ou é de 500 a 3500; ou é de cerca de 700 a 2500; ou é de 800 a 2000; ou cerca de 828 reagentes de captura.

[00279] Em um aspecto, a pluralidade dos terceiros reagentes de captura da pluralidade do terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura é de cerca de 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500 ou 5000; ou é de cerca de 900 a 16.500; ou de cerca de 2.000 a

15.000; ou de cerca de 3.000 a 12.000; ou de cerca de 4.000 a 10.000; ou cerca de 4271 reagentes de captura.

[00280] Em algumas modalidades, é divulgado um método que compreende a) combinar sequencialmente um primeiro grupo de diluição com um segundo grupo de diluição, em que o primeiro grupo de diluição é uma diluição de X% de uma amostra de teste e compreende um primeiro reagente de captura ligado a uma primeira formação de proteína alvo um primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, o segundo grupo de diluição é uma diluição de Y% da amostra de teste e compreende um segundo reagente de captura ligado a uma segunda proteína alvo formando um segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e em que o e as segundas proteínas alvo são proteínas diferentes, e em que X é menor que Y; b) dissociar os reagentes de captura de seus respectivos complexos de afinidade de proteína alvo- reagente de captura; e c) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados.

[00281] Em alguns aspectos dos métodos divulgados neste documento, os métodos compreendem ainda uma combinação sequencial de um terceiro grupo de diluição com o primeiro e o segundo grupos de diluição, em que o terceiro grupo de diluição é uma diluição de Z% da amostra de teste e compreende um terceiro reagente de captura ligado a uma terceira proteína alvo formando um terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, em que a terceira proteína alvo é diferente da primeira e da segunda proteínas alvo, em que Y é menor que Z.

[00282] Em um aspecto, o primeiro reagente de captura e o segundo reagente de captura são um aptâmero ou anticorpo.

[00283] Em um aspecto, a primeira diluição e os grupos de segunda diluição são diluições da mesma amostra de teste

[00284] Em um aspecto, a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovação brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

[00285] Em um aspecto, o terceiro grupo de diluição é uma diluição diferente da mesma amostra de teste e/ou em que o terceiro reagente de captura é um aptâmero ou anticorpo.

[00286] Em um aspecto, o primeiro e o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura são complexos não covalentes.

[00287] Em um aspecto, o primeiro grupo de diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou em que X% é 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou X% é de 0,002% a 0,008% ou X% é de 0,003% a 0,007% ou X% é cerca de 0,005%.

[00288] Em um aspecto, o segundo grupo de diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou em que Y% é 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou Y% é de 0,1% a 0,8% ou Y% é de 0,2% a 0,75% ou Y% é cerca de 0,5%.

[00289] Em um aspecto, o terceiro grupo de diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou Z% é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%), ou Z% é de 15% a 30%, ou Z% é de 15% a 25% ou Z% é cerca de 20%.

[00290] Em um aspecto, o primeiro grupo de diluição compreende ainda uma pluralidade de primeiros reagentes de captura.

[00291] Em um aspecto, o segundo grupo de diluição compreende ainda uma pluralidade de segundos reagentes de captura.

[00292] Em um aspecto, o terceiro grupo de diluição compreende ainda uma pluralidade de terceiros reagentes de captura.

[00293] Em um aspecto, o primeiro grupo de diluição compreende ainda uma pluralidade de complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura.

[00294] Em um aspecto, o segundo grupo de diluição compreende ainda uma pluralidade de complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura.

[00295] Em um aspecto, o terceiro grupo de diluição compreende ainda uma pluralidade de terceiro complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura.

[00296] Em um aspecto, a combinação sequencial do primeiro grupo de diluição com o segundo grupo de diluição compreende ainda uma etapa de lavagem após combinar o primeiro e o segundo grupos de diluição.

[00297] Em um aspecto, a combinação sequencial do terceiro grupo de diluição com o primeiro e o segundo grupos de diluição compreende ainda uma etapa de lavagem após a combinação do primeiro, segundo e terceiro grupos de diluição.

[00298] Em um aspecto, a pluralidade de primeiros reagentes de captura é de cerca de 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170 ou 173; ou é de 100 a 700; ou de 100 a 650 reagentes de captura.

[00299] Em um aspecto, a pluralidade de segundos reagentes de captura é de cerca de 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 820 ou 900; ou é de 500 a 3500; ou é de cerca de 700 a 2500; ou é de 800 a 2000; ou cerca de 828 reagentes de captura.

[00300] Em um aspecto, a pluralidade dos terceiros reagentes de captura é de cerca de 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4200, 4270, 4500 ou 5000; ou é de cerca de 900 a 16.500; ou de cerca de 2.000 a 15.000; ou de cerca de 3.000 a 12.000; ou de cerca de 4.000 a 10.000; ou cerca de 4271 reagentes de captura.

[00301] Em um aspecto, antes da combinação sequencial do primeiro e segundo grupos de diluição, o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura do primeiro grupo de diluição e o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura do segundo grupo de diluição são cada um imobilizado em um primeiro suporte sólido em seus respectivos grupos de diluição e liberado do primeiro suporte sólido para combinar sequencialmente.

[00302] Em um aspecto, antes da combinação sequencial do terceiro grupo de diluição com o primeiro e segundo grupos de diluição, o terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura do terceiro grupo de diluição é imobilizado em um primeiro suporte sólido em seu respectivo grupo de diluição, e liberado do primeiro suporte sólido para combinar sequencialmente.

[00303] Em um aspecto, o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura foi imobilizado em seu primeiro suporte sólido por associação do reagente de captura com o suporte sólido.

[00304] Em um aspecto, o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura foi imobilizado em seu primeiro suporte sólido por associação do reagente de captura com o suporte sólido.

[00305] Em um aspecto, o terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura foi imobilizado em seu primeiro suporte sólido por associação do reagente de captura com o suporte sólido.

[00306] Em outro aspecto, a detecção da presença ou a determinação do nível do primeiro e segundo reagentes de captura dissociados é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

[00307] Em um aspecto, o aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

[00308] Em um aspecto, a pelo menos uma pirimidina modificada com posição 5 compreende um ligante na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante.

[00309] Em um aspecto, o ligante é selecionado de um ligante de amida, um ligante de carbonila, um ligante de propinila, um ligante de alquino, um ligante de éster, um ligante de ureia, um ligante de carbamato, um ligante de guanidina, um ligante de amidina, um ligante de sulfóxido e um ligante de sulfona.

[00310] Em um aspecto, a porção é uma porção hidrofóbica.

[00311] Em um aspecto, a porção é selecionada das frações dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

[00312] Em um aspecto, a porção é selecionada de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodioxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranil.

[00313] Em um aspecto, a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

[00314] Em um aspecto, o aptâmero tem 35-100 nucleotídeos de comprimento.

[00315] Em um aspecto, o aptâmero compreende um domínio de ligação de proteína de consenso.

[00316] Em um aspecto, o aptâmero compreende pirimidinas modificadas em 5 posições numerando 3-20.

[00317] Em um aspecto, a ordem da combinação sequencial dos grupos de diluição é selecionada a partir da combinação do primeiro grupo de diluição com o segundo grupo de diluição seguido pelo terceiro grupo de diluição; combinar o primeiro grupo de diluição com o terceiro grupo de diluição seguido pelo segundo grupo de diluição; combinar o segundo grupo de diluição com o terceiro grupo de diluição seguido pelo primeiro grupo de diluição; combinar o segundo grupo de diluição com o primeiro grupo de diluição seguido pelo terceiro grupo de diluição; combinar o terceiro grupo de diluição com o primeiro grupo de diluição seguido pelo segundo grupo de diluição; e combinar o terceiro grupo de diluição com o segundo grupo de diluição seguido pelo primeiro grupo de diluição.

[00318] Em um aspecto, a ordem da combinação sequencial dos grupos de diluição é selecionada a partir da combinação do primeiro grupo de diluição com o segundo grupo de diluição e combinação do segundo grupo de diluição com o primeiro grupo de diluição.

[00319] Em um aspecto, a detecção da presença ou determinação do nível dos reagentes de captura dissociados é um substituto para a detecção da presença ou determinação do nível da proteína alvo.

[00320] Em algumas modalidades, é divulgado um método compreendendo a) a liberação de um primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um primeiro suporte sólido e a transferência do primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para uma primeira mistura; b) liberação de um segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um segundo suporte sólido e transferência do segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para a primeira mistura, combinando assim o primeiro e o segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura na primeira mistura; c) anexar um primeiro tag à molécula alvo dos primeiros e segundos complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; d) contatar os complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura marcados com um ou mais terceiros suporte (s) sólido (s) de modo que o tag imobilize os primeiro e segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura em um ou mais terceiros suportes sólidos (s); e) dissociar os reagentes de captura do primeiro e segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; e f) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura foram formados em uma diluição diferente da mesma amostra de teste.

[00321] Em algumas modalidades, é divulgado um método que compreende a) o contato de um primeiro reagente de captura imobilizado em um primeiro suporte sólido com uma primeira diluição para formar uma primeira mistura e o contato de um segundo reagente de captura imobilizado em um segundo suporte sólido com uma segunda diluição para formar uma segunda mistura, e em que cada um dos primeiro e segundo reagentes de captura são capazes de se ligar a uma molécula alvo; b) incubar a primeira mistura e a segunda mistura separadamente, em que um primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura é formado na primeira mistura se a molécula alvo para a qual o primeiro reagente de captura tem afinidade está presente na primeira mistura, e em que um o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura é formado na segunda mistura se a molécula alvo para a qual o segundo reagente de captura tem afinidade estiver presente na segunda mistura; c) liberar o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura do primeiro suporte sólido e transferir o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para uma terceira mistura; d) liberar o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura do segundo suporte sólido; e) após a etapa c), transferir o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para a terceira mistura, combinando assim o primeiro e segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura na terceira mistura; f) anexar um primeiro tag à molécula alvo dos primeiros e segundos complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; g) colocar em contato os primeiros e segundos complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura marcados com um terceiro suporte sólido de modo que o tag imobilize o primeiro e o segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura no terceiro suporte sólido; h) dissociar os reagentes de captura de seus respectivos complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e i) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, a primeira diluição e a segunda diluição são diluições diferentes de uma amostra de teste.

[00322] Em algumas modalidades, é divulgado um método compreendendo a) a liberação de um primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um primeiro suporte sólido e a transferência do primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para uma primeira mistura; b) liberar um segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um segundo suporte sólido e transferir o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para a primeira mistura, combinando assim o primeiro e segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; c) liberar um terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um terceiro suporte sólido e transferir o terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para a primeira mistura, combinando assim o primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; d) anexar um primeiro tag à molécula alvo do primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; e) contatar os complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura marcados de primeiro, segundo e terceiro com um ou mais quartos suporte (s) sólido (s) de modo que o tag imobilize os complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de primeira, segunda e terceira em um ou mais quarto (s)

suporte (s) sólido (s); f) dissociar os reagentes de captura do primeiro, segundo e terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; e g) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e o terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura foram formados em uma diluição diferente da mesma amostra de teste.

[00323] Em algumas modalidades, é divulgado um método compreendendo a) liberar um primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um primeiro suporte sólido e a transferência do primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para uma primeira mistura; b) liberar um segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um segundo suporte sólido e transferência do segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para a primeira mistura, combinando assim o primeiro e o segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura na primeira mistura; c) dissociar os reagentes de captura do primeiro e segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; e f) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura foram formados em uma diluição diferente da mesma amostra de teste.

[00324] Em algumas modalidades, é divulgado um método compreendendo a) liberar um primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um primeiro suporte sólido e a transferência do primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para uma primeira mistura; b) liberar um segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um segundo suporte sólido e transferência do segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para a primeira mistura, combinando assim o primeiro e o segundo complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura na primeira mistura; c) liberar um terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura de um terceiro suporte sólido e transferência do terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura para a primeira mistura, combinando assim o primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura no primeiro mistura; e) dissociar os reagentes de captura do primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de proteína alvo e reagente de captura; e f) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, o primeiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura, o segundo complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura e o terceiro complexo de afinidade de proteína alvo e reagente de captura foram formados em uma diluição diferente da mesma amostra de teste.

[00325] Em qualquer um dos métodos, formulações e sistemas descritos neste documento, os métodos, formulações e/ou sistemas compreendem ainda uma molécula competidora.

[00326] Em qualquer um dos métodos, formulações e sistemas aqui descritos, os métodos, formulações e/ou sistemas, a molécula competidora está a uma concentração de cerca de 10 µM a cerca de 120 µM (ou 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 ou 120 µM); ou de cerca de 15 µM a cerca de 80 µM; ou cerca de 20 µM; ou cerca de 30 µM ou cerca de 60 µM.

[00327] Em qualquer um dos métodos, formulações e sistemas descritos neste documento, os métodos, formulações e/ou sistemas, a molécula competidora é selecionada de oligonucleotídeos, poliânions, heparina, DNA de esperma de arenque, DNA de esperma de salmão, tRNA, sulfato de dextrana, polidextrano, fosfodiéster abásico polímeros, dNTPs e pirofosfato.

[00328] Em qualquer um dos métodos, formulações e sistemas descritos neste documento, os métodos, formulações e/ou sistemas, a molécula competidora é um oligonucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeos de (A-C-BndU-BndU)7AC.

[00329] Em qualquer um dos métodos, formulações e sistemas descritos neste documento, os métodos, formulações e/ou sistemas, a molécula competidora está a uma concentração de cerca de 30 µM para uma amostra de teste, em que a amostra de teste é plasma.

[00330] Em qualquer um dos métodos, formulações e sistemas descritos neste documento, os métodos, formulações e/ou sistemas, a molécula competidora está a uma concentração de cerca de 60 µM para uma amostra de teste, em que a amostra de teste é soro.

EXEMPLOS

[00331] Os exemplos a seguir são apresentados a fim de ilustrar mais completamente algumas modalidades da invenção. Eles não devem, de nenhuma forma, ser considerados como limitantes do amplo escopo da invenção. Os versados na técnica podem facilmente adotar os princípios subjacentes desta descoberta para projetar vários compostos sem se desviar do espírito da atual invenção. Exemplo 1. Análise de Aptâmero Multiplexado de Amostras

[00332] Este exemplo descreve o ensaio de aptâmero multiplex usado para analisar amostras e controles. Método de Ensaio de Aptâmero Multiplex

[00333] Todas as etapas do ensaio de aptâmero multiplex foram realizadas à temperatura ambiente, a menos que indicado de outra forma. Preparação de Soluções de Master Mix Aptâmero.

[00334] 5272 aptâmeros foram agrupados em três misturas exclusivas, Dil1, Dil2 e Dil3 e correspondentes às diluições de amostra de plasma ou soro de 20%, 0,5% e 0,005%, respectivamente. A atribuição de um aptâmero a uma mistura foi determinada empiricamente pelo ensaio de uma série de diluições de amostras de plasma e soro correspondentes com cada aptâmero e pela identificação da diluição da amostra que deu a maior faixa linear de sinal. A segregação de aptâmeros e a mistura com diferentes diluições de amostra de plasma ou soro (20%, 0,5% ou 0,005%) permitem que o ensaio alcance uma faixa de 107vezes as concentrações de proteína. As soluções-mãe para a mistura principal de aptâmero foram preparadas em tampão HE-Tween (Hepes 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, Tween 20 a 0,05%) a 4 nM de cada aptâmero e armazenadas congeladas a -20 °C. 4271 aptâmeros foram misturados na mistura Dil1, 828 aptâmeros na mistura Dil2 e 173 aptâmeros na mistura Dil3. Antes do uso, as soluções-mãe foram diluídas em tampão HE-Tween para uma concentração de trabalho de 0,55 nM cada aptâmero e aliquotadas em alíquotas de uso individual. Antes de usar misturas principais de aptâmeros para a preparação da placa Captura-0, as soluções de trabalho foram resfriadas por calor para redobrar os aptâmeros por incubação a 95°C por 10 minutos e depois a 25°C por pelo menos 30 minutos antes do uso. Preparação da placa Captura-0.

[00335] 60 µL de pasta de Estreptavidina Mag Sepharose 10% (GE Healthcare, 28-9857) foram combinados com 100 µL da mistura principal de aptâmero resfriada por calor. A mistura foi lavada uma vez com 175 µL do Tampão de Ensaio (HEPES 40 mM, pH 7,5, NaCl de 100 mM, KCl de 5 mM, MgCl2 de 5 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 a

0,05%) e então dispensado a cada poço de um Placa de 96 poços (Thermo Scientific, AB-0769). As placas foram incubadas durante 30 minutos a 25°C com agitação a 850 rpm no agitador ThermoMixer C (Eppendorf). Após 30 min de incubação, 6 µL do tampão MB Block (50 mM D-Biotina em 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0,01% Tween) foram adicionados a cada poço da placa e as placas foram incubadas adicionalmente por 2 min com agitação. As placas foram então lavadas com 175 µL do Tampão de Ensaio, ciclo de lavagem de 1 min de agitação no ThermoMixer C a 850 rpm seguido por separação no ímã por 30 segundos. Após a remoção da solução de lavagem, as contas foram ressuspensas em 175 µL de tampão de ensaio e armazenadas a -20°C até o uso. Preparação do grânulo Captura-2.

[00336] Antes do início do processamento robótico do ensaio, 10 mg/mL de pasta fluida de esferas MyOne Streptavidin C1 (Dynabeads, número da peça 35002D, Thermo Scientific) usada para a etapa Captura-2 do ensaio de aptâmero multiplex foi lavada em massa uma vez que o MB Tampão de preparação (Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, SDS a 0,4%) durante 5 min seguido por duas lavagens com tampão de ensaio. Após a última lavagem, as contas foram ressuspensas na concentração de 10 mg/mL e 75 µL de pasta de contas foram dispensadas em cada poço da placa Captura-2. No início do ensaio, a placa Captura-2 foi colocada no adaptador de alumínio e colocada na posição apropriada no deck Fluent. Descongelamento e diluições da amostra.

[00337] Alíquotas de 65 µL de amostras de plasma ou soro 100%, armazenadas em tubos Matrix a -80°C, foram descongeladas por incubação à temperatura ambiente por dez minutos. Para facilitar o descongelamento, os tubos foram colocados no topo da unidade de ventilação que circulou o ar através do suporte de tubos Matrix. Após o descongelamento, as amostras foram centrifugadas a 1000 × g por 1 min e colocadas na plataforma do Robot Fluent para diluição da amostra. Uma solução de amostra de 20% foi preparada pela transferência de 35 µL da amostra descongelada para placas de 96 poços contendo 140 µL do diluente de amostra apropriado. O diluente de amostra para plasma foi Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 8 mM, KCl 5 mM, EGTA 1,25 mM, benzamidina 1,2 mM, Bloco Z 37,5 µM e Tween-20 1,2%. O diluente da amostra de soro continha 75 µM de bloco Z, os outros componentes tinham a mesma concentração do diluente da amostra de plasma. Diluições subsequentes para fazer amostras diluídas de 0,5% e 0,005% foram feitas em Tampão de Ensaio usando diluições em série no Robot Fluent. Para fazer uma diluição de amostra de 0,5%, a diluição intermediária de amostra de 20% a 4% foi feita misturando 45 µL de amostra de 20% com 180 µL de Tampão de Ensaio, em seguida, amostra de 0,5% foi feita misturando 25 µL de amostra diluída de 4% com 175 µL de Tampão de Ensaio. Para fazer a amostra de 0,005%, a diluição intermediária de 0,05% foi feita misturando 20 µL de amostra de 0,5% com 180 µL de Tampão de Ensaio, então a amostra de 0,005% foi feita misturando 20 µL de amostra de 0,05% com 180 µL de Tampão de Ensaio. Etapa de ligação de amostra.

[00338] Placas Captura-0 preparadas pela imobilização das misturas de aptâmeros nos grânulos de Sepharose Magnética de Estreptavidina, conforme descrito acima. As placas congeladas foram descongeladas durante 30 min a 25°C e foram lavadas uma vez com 175 µL de Tampão de Ensaio. 100 µL de cada diluição de amostra (20%, 0,5% e 0,005%) foram adicionados às placas contendo grânulos com três misturas principais de aptâmeros diferentes (Dil1, Dil2 e Dil3, respectivamente). As placas Captura-0 foram então seladas com selos de folha de alumínio (Microseal 'F' Foil, Bio-Rad) e colocadas nos agitadores rotativos de 4 placas (PHMP-4, Grant Bio) ajustados para 850 rpm, 28ºC. A etapa de ligação da amostra foi realizada durante 3,5 horas. Processamento de ensaio de aptâmero multiplex no Robot Fluent.

[00339] Depois que a etapa de ligação da amostra foi concluída, as placas Captura-0 foram colocadas em adaptadores de placa de alumínio e colocadas no convés do Robot. As etapas de lavagem de grânulos magnéticos foram realizadas usando uma placa de temperatura controlada. Para todas as etapas de processamento robótico, as placas foram ajustadas à temperatura de 25°C, exceto para as lavagens Captura-2, conforme descrito abaixo. As placas foram lavadas 4 vezes com 175 µL de Tampão de Ensaio, cada ciclo de lavagem foi programado para agitar as placas a 1000 rpm por pelo menos 1 min seguido pela separação dos grânulos magnéticos por pelo menos 30 segundos antes da aspiração do tampão. Durante o último ciclo de lavagem, o reagente Tag foi preparado diluindo o reagente Tag 100x (EZ-Link NHS-PEG4-Biotina, número da peça 21363, Thermo, solução 100 mM preparada em DMSO anidro)1: 100 no tampão de ensaio e despejado no convés do Robot. 100 µL de reagente Tag foram adicionados a cada um dos poços nas placas e incubados com agitação a 1200 rpm durante 5 min para biotinilar proteínas capturadas na superfície do grânulo. As reações de biotinilação foram interrompidas por adição de 175 µL de tampão de interrupção (glicina 20 mM em tampão de ensaio) a cada poço. As placas foram incubadas estáticas durante 3 minutos e depois lavadas 4 vezes com 175 µL de tampão de ensaio, as lavagens foram realizadas nas mesmas condições descritas acima. Foto-clivagem e desafio cinético.

[00340] Após a última lavagem das placas, 90 µL de tampão de fotoclivagem (2 µM de um competidor de oligonucleotídeo em tampão de ensaio; o competidor tem a sequência de nucleotídeos de 5′- (AC- Bn-Bn)7-AC-3′, onde Bn indica que um resíduo de desoxiuridina substituído com benzil na posição 5) foi adicionado a cada poço das placas. As placas foram movidas para uma subestação de fotoclivagem no convés Fluent. A subestação consiste na fonte de luz BlackRay (lâmpadas de bancada da série UVP XX, 365 nm) e três agitadores Bioshake 3000-T (Q Instruments). As placas foram irradiadas durante 20 minutos com agitação a 1000 rpm. Captura de grânulos Captura-2.

[00341] No final do processo de fotoclivagem, o tampão foi removido da placa Captura-2 por separação magnética, a placa foi lavada uma vez com 100 µL de tampão de ensaio. O eluato foto- clivado contendo complexos de aptâmero-proteína foi removido de cada placa Captura-0 começando com a placa de diluição 3. Todos os 90 µL da solução foram primeiro transferidos para a placa Captura-1 Eluate posicionada no agitador com ímãs levantados para reter quaisquer grânulos de Sepharose Magnética de Estreptavidina que possam ter sido aspiradas. Depois disso, a solução foi transferida para a placa Captura-2 e a placa foi incubada por 3 min com agitação a 1400 rpm a 25°C. Após a incubação por 3 min, os grânulos magnéticos foram separados por 90 segundos, a solução foi removida da placa e a solução da placa Dil2 fotoclivada foi adicionada à placa. Seguindo um processo idêntico, a solução da placa Dil1 foi adicionada e incubada por 3 min. No final dos 3 min de incubação, 6 µL do tampão MB Block foram adicionados à suspensão de grânulos magnéticos e os grânulos foram incubados durante 2 min com agitação a 1200 rpm a 25°C. Após esta incubação, a placa foi transferida para um agitador diferente que foi pré-ajustado para 38°C de temperatura. Os grânulos magnéticos foram separados por 2 minutos antes de remover a solução.

Em seguida, a placa Captura-2 foi lavada 4 vezes com 175 µL de tampão de lavagem MB (20% de glicerol em tampão de ensaio), cada ciclo de lavagem foi programado para agitar os grânulos a 1200 rpm por 1 min e permitir que as contas dividissem no ímã por 3,5 minutos.

Durante a última etapa de separação do grânulo, a temperatura do agitador foi ajustada para 25°C.

Em seguida, os grânulos foram lavados uma vez com 175 µL de tampão de ensaio.

Para esta etapa de lavagem, os grânulos foram agitados a 1200 rpm por 1 min e depois permitidas que se separassem no ímã por 2 minutos.

Após a etapa de lavagem, os aptâmeros foram eluídos dos complexos aptâmero-proteína purificados usando tampão de eluição (NaClO4de 1,8 M, PIPES 40 mM, pH 6,8, EDTA de 1mM, Triton X-100 0,05%). A eluição foi feita usando 75 µL de tampão de eluição durante 10 min a 25°C com agitação de contas a 1250 rpm. 70 µL do eluato foram transferidos para a placa de arquivo e separados no ímã para particionar quaisquer grânulos magnéticos que possam ter sido aspirados. 10 µL do material eluído foram transferidos para a placa de meia área preta, diluídos 1:5 no tampão de ensaio e usados para medir os sinais de fluorescência de cianina 3 que são monitorados como QC do ensaio interno. 20 µL do material eluído foram transferidos para a placa contendo 5 µL da solução de Bloqueio de Hibridização (Kit de Hibridização Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Grande Volume, Agilent Technologies 5188–5380, contendo um pico de sequência de DNA marcada com Cianina 3 complementar às pontas de prova do marcador de canto nos arranjos da Agilent). Esta placa foi removida do convés do robô e posteriormente processada para hibridização (veja abaixo). A placa de arquivo com a solução eluída restante foi selada a quente usando folha de alumínio e armazenada a -20 °C.

Hibridização.

[00342] 25 µL de tampão de hibridização 2x Agilent (Kit de hibridização Oligo aCGH/ChIP-on-chip, Agilent Technologies, número de peça 5188–5380) foram pipetados manualmente para cada poço da placa contendo as amostras eluídas e o tampão de bloqueio. 40 µL desta solução foram pipetados manualmente em cada ''poço'' da lâmina de gaxeta de hibridização (Hybridization Gasket Slide - 8 microarranjos por formato de lâmina, Agilent Technologies). Lâminas de microarranjo Agilent SurePrint G3 8x60k personalizadas contendo 10 sondas por arranjo complementares a cada aptâmero foram colocadas nas lâminas de gaxeta de acordo com o protocolo do fabricante. Cada conjunto (Hybridization Chamber Kit - SureHyb habilitado, Agilent Technologies) foi firmemente preso e carregado em um forno de hibridização por 19 horas a 55 °C girando a 20 rpm. Lavagem pós-hibridização.

[00343] A lavagem das lâminas foi realizada usando o processador Little Dipper (modelo 650C, Scigene). Aproximadamente 700 mL de tampão de lavagem 1 (tampão de lavagem 1 de Oligo aCGH/ChIP-on- chip, Agilent Technologies) foram despejados em uma grande placa de coloração de vidro e usados para separar lâminas de microarranjo das lâminas de gaxeta. Depois de desmontadas, as lâminas foram rapidamente transferidas para um suporte de lâminas em um banho contendo tampão de lavagem 1 na Little Dipper. As lâminas foram lavadas durante cinco minutos em tampão de lavagem 1 com mistura por meio de barra de agitação magnética. O suporte de lâminas foi então transferido para o banho com tampão de lavagem 2 a 37°C (tampão de lavagem 2 de Oligo aCGH/ChIP-onchip, Agilent Technologies) e incubado por cinco minutos com agitação. O suporte de lâminas foi removido lentamente do segundo banho e então transferido para um banho contendo acetonitrila e incubado por cinco minutos com agitação.

Imagiologia de Microarranjo.

[00344] As lâminas de microarranjo foram fotografadas com um scanner de microarranjo (Agilent G4900DA Microarray Scanner System, Agilent Technologies) em canais de Cianina 3 com resolução de 3 µm com configuração de 100% PMT e a opção de 20 bits habilitada. As imagens tiff resultantes foram processadas usando o software Agilent Feature Extraction (versão 10.7.3.1 ou superior) com o protocolo GE1_1200_Jun14. Exemplo 2: Captura de molécula alvo não específica em um ensaio multiplex

[00345] Este exemplo fornece uma descrição de captura e transporte de moléculas alvo não específicas em um ensaio multiplex de captura múltipla.

[00346] Geralmente, a sensibilidade e a especificidade de muitos formatos de ensaio são afetadas pela capacidade do método de detecção de resolver o sinal verdadeiro do sinal que surge devido a associações inespecíficas durante o ensaio, o que resulta em um sinal detectável indesejado (falso positivo ou "ruído" do ensaio). Isso é particularmente verdadeiro para ensaios multiplexados. Foi observado que uma das principais fontes de ligação não específica está uma função de interações imprevistas de molécula alvo do reagente de captura. Este exemplo descreve como as interações não específicas de molécula alvo do reagente de captura podem criar sinal indesejado ou "ruído" em um ensaio.

[00347] Para este exemplo, um ensaio multiplex baseado em aptâmero com um sistema de duas capturas e múltiplas diluições da amostra de teste foram usados para modelar a captura de molécula alvo não específica (por exemplo, proteína) e transporte devido a interações imprevistas de aptâmero-molécula alvo, o que resulta em sinais de ensaio que estão fora da faixa dinâmica do ensaio e diminuem a sensibilidade e especificidade do ensaio.

[00348] Resumidamente, o ensaio baseado em aptâmero foi realizado incubando um reagente de aptâmero, que foi imobilizado em um primeiro suporte sólido (por exemplo, grânulo de estreptavidina usando uma biotina no reagente), com uma amostra biológica (por exemplo, soro ou plasma) e permitindo a proteínas na amostra biológica para se ligarem ao seu aptâmero cognato (denominado "captura-1"). Um tag foi então anexado à proteína e os complexos aptâmero-proteína alvo foram então liberados do primeiro suporte sólido e expostos a um segundo suporte sólido, pelo qual o complexo aptâmero-proteína alvo foi imobilizado através da etiqueta na proteína (denominado "Captura-2"). Os complexos foram então lavados para remover quaisquer aptâmeros e proteínas não ligados de captura-2. Após a lavagem, o aptâmero foi liberado do complexo aptâmero- proteína alvo no segundo suporte sólido e capturado para fins de detecção (por exemplo, arranjo de hibridização). A quantificação do aptâmero foi usada como substituto para a quantidade de proteína na amostra biológica. O ensaio baseado em aptâmero pode ser usado com um único reagente de aptâmero ou uma pluralidade de reagentes de aptâmero (ou formato multiplex).

[00349] Para este exemplo, três grupos de diluição diferentes de uma amostra de plasma foram feitos (o soro também foi submetido ao mesmo "estudo de transporte de proteína e os resultados são paralelos aos do soro; dados não mostrados). A figura 6 fornece uma visão geral dos três diferentes grupos de diluição de plasma que foram feitos: uma diluição de 0,005% (DIL1), uma diluição de 0,5% (DIL2) e uma diluição de 20% (DIL3), onde as proteínas de abundância relativa alta, média e baixa foram medidas, respectivamente. Além disso, os conjuntos de aptâmeros para cada um de DIL1, DIL2 e DIL3 foram A1, A2 e A3, respectivamente. O grupo A3 de aptâmeros tinha 4.271 aptâmeros diferentes (ou ~ 81% do número total de aptâmeros), o grupo A2 tinha 828 aptâmeros diferentes (ou ~ 16% do número total de aptâmeros) e o grupo A1 tinha 173 aptâmeros diferentes (~ 3% do número total de aptâmeros) para um total de 5.272 aptâmeros diferentes.

[00350] Cinco condições diferentes foram testadas para determinar se há um efeito de transporte de proteína no ensaio multiplex. Essas condições são mostradas na Tabela 2 abaixo. Tabela 2. DIL1 (0,005%) ou DIL2 (0,5%) DIL3 (20%) Condição em Branco1 ou em Branco2 ou em Branco 3 1 plasma plasma plasma 2 plasma em branco em branco 3 em branco plasma em branco 4 em branco em branco plasma 5 em branco em branco em branco

[00351] Cada condição foi submetida ao ensaio multiplex baseado em aptâmero com um sistema two-captura, conforme descrito acima. As condições diferem na presença ou não de uma amostra biológica (por exemplo, plasma) ou um branco, que era um tampão de ensaio sem amostra biológica e, portanto, sem proteína. Cada grupo de diluição, independentemente se uma amostra biológica diluída estava presente ou um branco, foi incubado com seu respectivo grupo de aptâmeros (A1 com DIL1 ou Branco1; A2 com DIL2 ou Branco2 e A3 com DIL3 ou Branco3). Em cada caso, os aptâmeros de cada grupo de aptâmeros foram pré-imobilizados em um primeiro suporte sólido antes de serem incubados com sua respectiva diluição ou branco (captura- 1). Após a incubação, um tag foi então anexado à proteína (se presente), e os complexos aptâmero-proteína alvo (se presentes) foram então liberados do primeiro suporte sólido nas três diluições e/ou brancos separados e combinados em uma única mistura ao mesmo tempo, e depois exposto a um segundo suporte sólido, por meio do qual o complexo aptâmero-proteína alvo (se presente) foi imobilizado por meio do tag na proteína (denominado "captura-2"). Os complexos foram então lavados para remover quaisquer aptâmeros e proteínas não ligados de captura-2. Após a lavagem, o aptâmero foi liberado do complexo aptâmero-proteína alvo no segundo suporte sólido e capturado para fins de detecção via arranjo de hibridização. A quantificação do aptâmero por meio de unidades fluorescentes relativas (RFU's) foi usada como substituto para a quantidade de proteína na amostra biológica.

[00352] A Condição 1 foi o plasma diluído nos três grupos de diluição (DIL1 na diluição de 0,005%; DIL2 na diluição de 0,5% e DIL3 na diluição de 20%), que foram incubados com seus respectivos grupos de aptâmeros (A1, A2 e A3). A condição 2 tinha a diluição de plasma DIL1 (0,005%) e Branco1 e Branco2 em vez de DIL2 e DIL3, respectivamente, que foram incubados com seus respectivos grupos de aptâmeros (A1, A2 e A3). A condição 3 tinha a diluição de plasma DIL2 (0,5%) e Branco 1 e Branco3 em vez de DIL1 e DIL3, respectivamente, que foram incubados com seus respectivos grupos de aptâmeros (A1, A2 e A3). A condição 4 tinha a diluição de plasma DIL3 (20%) e Branco 1 e Branco2 em vez de DIL1 e DIL2, respectivamente, que foram incubados com seus respectivos grupos de aptâmeros (A1, A2 e A3). Por último, a Condição 5 não teve diluições de plasma e teve todos os brancos (Branco1, Branco2 e Branco3), que foram incubados com seus respectivos grupos de aptâmeros (A1, A2 e A3). Cada condição foi submetida ao ensaio captura-1 e captura-2 descrito no Exemplo 1, em que a diluição e/ou brancos foram combinados todos juntos após serem liberados de captura-1 para mover para a parte captura-2 do ensaio.

[00353] Para quantificar qualquer transporte de proteína, a função de distribuição cumulativa (CDF) da razão do sinal do aptâmero para a Condição 1 (ou seja, todos os três grupos de diluição DIL1, DIL2 e DIL3) para o sinal do aptâmero para cada uma das Condições 2, 3 e 4 (onde apenas um dos grupos de diluição estava presente junto com os brancos) foi plotado (ver Figura 10). A razão de sinais de aptâmero é representada por unidades fluorescentes relativas (RFU) derivadas de um arranjo de hibridização. A Figura 10 mostra que para a Condição 4, onde apenas a diluição de 20% (DIL3) da amostra de plasma está presente, que a razão dos valores de RFU para os aptâmeros na Condição 1 para os mesmos aptâmeros na Condição 4 é de cerca de

1. Em contraste, para a Condição 3, onde apenas a diluição de 0,5% (DIL2) da amostra de plasma está presente, a razão dos valores de RFU para os aptâmeros da Condição 1 em relação aos mesmos aptâmeros na Condição 3 é de cerca de 1 a 6, com cerca de 45% ou mais dos aptâmeros da Condição 1 sinalizando cerca de 2 a 6 vezes mais do que os mesmos aptâmeros para a Condição 3. Ao olhar para a sinalização de um único aptâmero sob a Condição 3 (por exemplo, o aptâmero que se liga à proteína ASM3A é parte do grupo A2 do aptâmero, que é incubado com a diluição DIL2) em relação à Condição 1, o aptâmero ASM3A tem 5 pastas superior na Condição 1 em comparação com a Condição 3. Para a Condição 2, onde apenas a diluição de 0,005% (DIL1) da amostra de plasma está presente, a razão do valor de RFU para os aptâmeros da Condição 1 em relação aos mesmos aptâmeros na Condição 2 é também de cerca de 1 a 6 vezes, com cerca de 20% ou mais dos aptâmeros da Condição 1 sinalizando cerca de 2 a 6 vezes mais do que os mesmos aptâmeros para a Condição 2. Ao comparar o aptâmero que se liga à proteína ApoE, que faz parte do grupo de aptâmero A1 e incubado com a diluição DIL1, este aptâmero tinha um valor de RFU 200 vezes maior na Condição 1 em comparação com a Condição 2, um RFU 80 vezes maior valor na Condição 1 em comparação com a Condição 4 e um valor de RFU 600 vezes maior na Condição 1 em comparação com a Condição 3.

[00354] Estes dados mostram que o sinal está sendo detectado no ensaio, quando todas as três amostras de diluições são combinadas ao mesmo tempo na fase captura-2 do ensaio, para a amostra de diluição de plasma a 0,5% (DIL2) e a amostra de diluição de plasma a 0,005% (DIL1) resultou do transporte de proteína da amostra de diluição de plasma a 20% (DIL3). Esta transferência de proteína é provavelmente devido às proteínas na amostra de diluição de plasma de 20% (DIL3) sendo não especificamente ligadas a um aptâmero no grupo de aptâmero A3, durante a fase captura-1 do ensaio, sendo liberadas em solução por, por exemplo, fotoclivagem do primeiro suporte sólido (captura-1) e transferida para a fase captura-2 do ensaio onde todos os três grupos de diluição e grupos de aptâmeros são combinados ao mesmo tempo. Nesta fase do ensaio, quando um competidor é adicionado para evitar interações não específicas de aptâmero-proteína, as proteínas carreadoras não especificamente da diluição de plasma de 20% são permitidas para interagir com os grupos aptâmeros não ligados do aptâmero A2 e aptâmero A1, e subsequentemente encontram seu aptâmero cognato para formar complexos estáveis. Estes carregamentos de proteína: complexos de aptâmero são então interrompidos e o aptâmero é detectado no arranjo de hibridização como um sinal positivo, que é tecnicamente um sinal positivo falso ou "ruído". Esses mesmos dados foram observados com soro como amostra biológica (dados não mostrados).

[00355] Esses dados indicam que uma estratégia de mitigação de transporte de proteína é necessária para garantir que um ensaio multiplex permaneça dentro da faixa dinâmica do ensaio e que a sensibilidade e especificidade do ensaio sejam maximizadas. Exemplo 3: Estratégias de mitigação para reduzir a captura de molécula alvo não específica em um ensaio multiplex

[00356] Este exemplo fornece uma descrição de uma estratégia de mitigação exemplar para reduzir a captura e transporte de molécula alvo não específica em um ensaio multiplex de captura múltipla.

[00357] O Exemplo 1 forneceu uma descrição de como os sinais positivos em um ensaio multiplex de captura múltipla podem ser derivados da captura não específica da molécula alvo e transporte no ensaio e sua origem. A fim de mitigar o transporte de proteína indesejado neste ensaio multiplex multi-captura, uma liberação sequencial e captura das amostras de diluição da amostra biológica, juntamente com o respectivo grupo de aptâmero, foi realizada no curso da transferência da captura- 1 fase do ensaio para a fase captura-2 do ensaio. Uma visão geral de um formato de captura sequencial de duas diluições e três diluições é mostrada nas Figuras 9 e 7, respectivamente.

[00358] Para este exemplo, os mesmos três grupos de diluição diferentes de plasma foram feitos (DIL3, DIL2 e DIL1) juntamente com os mesmos grupos de aptâmeros (A1, A2 e A3), conforme descrito no Exemplo 1 (ver Figura 8). Além disso, foram utilizadas as mesmas condições descritas na Tabela 2 do Exemplo 1. Por exemplo 1, a mesma abordagem descrita para a fase captura-1 do ensaio foi seguida; no entanto, para este exemplo, os diferentes grupos de diluição ou brancos foram liberados individualmente e transferidos para a fase captura-2 do ensaio sequencialmente em vez de ao mesmo tempo por exemplo 1 (ver Figura 8). Mais especificamente para a Condição 1, o grupo DIL1 que foi incubado com o grupo aptâmero A1 (grupo DIL1-A1) foi liberado de captura-1 e imobilizado em um segundo suporte sólido (captura-2) e lavado. Em seguida, o grupo DIL2 que foi incubado com o aptâmero do grupo A2, foi liberado de captura-1, combinado com o grupo DIL1-A1 que já estava imobilizado em captura-2 e, em seguida, imobilizado em um segundo suporte sólido (captura-2). E, o grupo DIL3 que foi incubado com o aptâmero do grupo A3 foi liberado de captura-1 e imobilizado em um segundo suporte sólido (captura-1) e lavado. As condições de fresagem (Condições 2, 3, 4 e 5) que incluíram um branco (Branco 1, 2 e/ou 3) em vez de uma amostra biológica diluída, conforme descrito na Tabela 2, foram sujeitas à mesma abordagem de captura sequencial.

[00359] Para quantificar qualquer transporte de proteína, a função de distribuição cumulativa (CDF) da razão do sinal do aptâmero para a Condição 1 (ou seja, todos os três grupos de diluição DIL1, DIL2 e DIL3) para o sinal do aptâmero para cada uma das Condições 2, 3 e 4 (onde apenas um dos grupos de diluição estava presente junto com os brancos) foi plotado (ver Figura 11). A razão de sinais de aptâmero é representada por unidades fluorescentes relativas (RFU) derivadas de um arranjo de hibridização. Semelhante à versão não sequencial do ensaio multiplex, a Figura 11 mostra que para a Condição 4, onde apenas a diluição de 20% (DIL3) da amostra de plasma está presente, a razão dos valores de RFU para os aptâmeros na Condição 1 para os mesmos aptâmeros na Condição 4 é cerca de 1. Para a Condição 3, onde apenas a diluição de 0,5% (DIL2) da amostra de plasma está presente, a razão dos valores de RFU para os aptâmeros da Condição 1 em relação aos mesmos aptâmeros na Condição 3 é de cerca de 1 a 6; no entanto, apenas menos do que cerca de 5% dos aptâmeros da Condição 1 sinalizam cerca de 2 a 6 vezes mais do que os mesmos aptâmeros para a Condição 3 (versus 45% na versão captura-2 não sequencial do ensaio). Além disso, para a Condição 2, onde apenas a diluição de 0,005% (DIL1) da amostra de plasma está presente, a razão do valor de RFU para os aptâmeros da Condição 1 em relação aos mesmos aptâmeros na Condição 2 é também de cerca de 1 a 6 vezes; no entanto, apenas menos do que cerca de 10% dos aptâmeros da Condição 1 sinalizando cerca de 2 a 6 vezes maior do que os mesmos aptâmeros para a Condição 2 (versus 20% para a versão captura-2 não sequencial do ensaio). Esses mesmos dados foram observados com soro como amostra biológica (dados não mostrados).

[00360] Estes dados indicam que o transporte de proteína pode ser mitigado em um ensaio multiplex de duas capturas tendo dois ou mais conjuntos de diluição de amostra transferindo sequencialmente os dois ou mais conjuntos de amostras biológicas diluídas com seus respectivos reagentes de captura incubados da primeira fase de captura do ensaio para a segunda fase de captura do ensaio. Esta abordagem de transferência sequencial garante que um ensaio multiplex permaneça dentro da faixa dinâmica do ensaio, que a sensibilidade e especificidade do ensaio sejam maximizadas e reduz potenciais sinais positivos falsos ou "ruído" no ensaio. Exemplo 4: Seleção de diluição para uma amostra biológica para maximizar o número de analitos na faixa linear tendo a razão mais alta do sinal mediano para o sinal de fundo em um ensaio multiplex

[00361] Este exemplo fornece uma descrição para selecionar o nível de diluição de uma amostra biológica que maximiza o número de analitos na faixa linear enquanto ainda mantém a maior razão de sinal mediano para o sinal de fundo em um ensaio multiplex.

[00362] Em um formato de ensaio multiplex em que várias proteínas alvo estão sendo medidas por vários reagentes de captura, a variação natural na abundância das diferentes proteínas alvo pode limitar a capacidade de certos reagentes de captura para medir certas proteínas alvo (por exemplo, proteínas alvo de alta abundância podem saturar o ensaio e prevenir ou reduzir a capacidade do ensaio de medir proteínas alvo de baixa abundância). Para abordar esta variação na amostra biológica, os reagentes de aptâmero são separados em pelo menos dois grupos diferentes, de preferência três grupos diferentes, com base na abundância de seu respectivo alvo de proteína na amostra biológica. A amostra biológica é diluída em pelo menos dois, de preferência três, grupos de diluição diferentes para criar amostras de teste separadas com base nas concentrações relativas dos alvos de proteína a serem detectados pelos seus reagentes de captura. Assim, a amostra biológica é diluída em grupos de diluição de proteína alvo de alta, média e baixa abundância, onde os alvos de proteína menos abundantes são medidos no grupo menos diluído e os alvos de proteína mais abundantes são medidos no maior grupo diluído. Historicamente, para o ensaio multiplex multi-captura baseado em aptâmero, os três grupos de diluição para uma amostra biológica foram uma diluição de 40%, diluição de 1% e uma diluição de 0,005%.

[00363] Para este exemplo, o grupo de diluição de 40% foi revisitado para determinar se uma diluição diferente proporcionaria maior benefício para o ensaio multiplex multi-captura (por exemplo, maximizar o número de analitos na faixa linear do ensaio e/ou melhorar a razão do sinal mediano para o sinal de fundo). Este grupo de diluição exibe alguma ligação não específica, não linearidade de sinal e sinais mais elevados de controles negativos em comparação com o tampão sozinho.

[00364] Resumidamente, vários grupos de diluição foram feitos de plasma (um grupo de diluição de 40%, 20%, 10% e 5%) de três indivíduos diferentes. Um conjunto de 903 aptâmeros foi incubado com os diferentes grupos de diluição de todos os três sujeitos e usado no ensaio multiplex de duas capturas descritas neste documento.

[00365] Foi determinado o número de analitos no intervalo linear para cada uma das diluições (40%, 20%, 10% e 5%) conforme medido por aptâmeros no arranjo de hibridização. Para a diluição de 40%, 246 analitos estavam na faixa linear, para a diluição de 20%, 388 analitos estavam na faixa linear, para a diluição de 10%, 517 analitos estavam na faixa linear, e para a diluição de 5%, 585 os analitos estavam na faixa linear. Os 259 restantes dos 903 não tinham uma faixa linear. Assim, esses dados indicam que à medida que a diluição da amostra aumenta, o número de analitos na faixa linear aumenta (ou seja, uma amostra mais diluída fornece um número maior de analitos na faixa linear).

[00366] Cada diluição (40%, 20%, 10% e 5%) exibiu uma razão diferente do sinal mediano para o sinal de fundo (ou S/B mediana). Para a diluição de 40%, a S/B mediana foi 10, para a diluição de 20%, a S/B mediana foi 7,8, para a diluição de 10%, a S/B mediana foi 5,4 e para a diluição de 5%, a S/B mediana foi 3,7. Assim, esses dados indicam que a S/B mediana diminui à medida que a amostra é diluída.

[00367] Os dados acima indicam que existe uma tensão entre o número de analitos na faixa linear e a S/B Mediana relacionada ao grau de diluição da amostra. Ao equilibrar as melhorias observadas para o número de analitos na faixa linear com maiores diluições junto com a maior S/B Mediana com menor diluição, um "meio-termo" foi selecionado para a diluição "ideal" para a amostra biológica para os dois capturar ensaio de aptâmero multiplex. A Figura 12 é uma representação gráfica do número de analitos na faixa linear junto com a S/B Mediana para cada uma das diluições de 40%, 20%, 10% e 5%. Pela figura 12, na diluição de 20% da amostra biológica, o número máximo de analitos no intervalo linear com a maior Mediana S/B é observado (onde as duas linhas se cruzam). Assim, das três diluições usadas no ensaio de aptâmero multiplex multi-captura, os aptâmeros que visam proteínas de "baixa abundância" são mais adequados para serem incubados com uma diluição de 20% da amostra biológica em vez de uma diluição de 40%.

[00368] Em resumo, o ensaio multiplex descrito na seção de Exemplos neste documento, usa os formatos de diluição de amostra de 20%, 0,5% e 0,005%. Além disso, a concentração de molécula competidora mais alta no soro resultou em melhores correlações entre as medições no soro e no plasma do mesmo indivíduo (dados não mostrados). Além disso, uma concentração de molécula competidora mais alta (30 µM ou 60 µM em comparação com 20 µM) com concentração de amostra mais baixa (por exemplo, 40% a 20%) resultou em aumento de pico e recuperação, um aumento no número de analitos na faixa linear e menos ligação não específica. A concentração da molécula competidora (bloco Z; oligonucleotídeo com a sequência ((A-C-BndU-BndU)7AC) nos diluentes de amostra foi de 60 µM para soro e 30 µM para amostras de plasma. Os formatos de ensaio anteriores usavam bloco Z de 20 µM para soro e plasma. A concentração de molécula competidora mais alta no soro resultou em melhores correlações entre as medições no soro e no plasma do mesmo indivíduo (dados não mostrados). A diminuição da ligação não específica deve resultar em uma quantidade menor de proteínas disponíveis para a formação do complexo após a fotoclivagem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar uma primeira amostra de diluição em contato com um primeiro aptâmero, em que um primeiro complexo de afinidade do aptâmero é formado pela interação do primeiro aptâmero com sua molécula alvo se a molécula alvo estiver presente na primeira amostra de diluição; b) colocar uma segunda amostra de diluição em contato com um segundo aptâmero, em que um segundo complexo de afinidade do aptâmero é formado pela interação do segundo aptâmero com sua molécula alvo se a molécula alvo estiver presente na segunda amostra de diluição; c) incubar a primeira e segunda amostras de diluição separadamente para permitir a formação do complexo de afinidade do aptâmero; d) transferir a primeira amostra de diluição com o primeiro complexo de afinidade do aptâmero para uma primeira mistura, em que o primeiro complexo de afinidade do aptâmero é capturado em um suporte sólido na primeira mistura; e) após a etapa d), transferir a segunda amostra de diluição para a primeira mistura para formar uma segunda mistura, em que o segundo complexo de afinidade do aptâmero da segunda diluição é capturado em um suporte sólido na segunda mistura; f) detectar a presença ou determinar o nível do primeiro e segundo aptâmeros do primeiro e segundo complexos de afinidade do aptâmero, ou a presença ou quantidade de um ou mais dentre o primeiro e segundo complexos de afinidade do aptâmero; em que a primeira diluição e a segunda diluição são diluições diferentes da mesma amostra de teste.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovagem brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo complexos de afinidade aptâmero-molécula alvo são complexos não covalentes.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula alvo é selecionada a partir de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou a determinação do nível do primeiro e segundo reagentes de captura dissociados é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (Next-Generation Sequencing, NGS) ou hibridização.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro aptâmero e/ou o segundo aptâmero, independentemente, compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5 compreende um ligante peptídico na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante peptídico.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é selecionado a partir de um ligante peptídico de amida, um ligante peptídico de carbonila, um ligante peptídico de propinila, um ligante peptídico de alquino, um ligante peptídico de éster, um ligante peptídico de ureia, um ligante peptídico de carbamato, um ligante peptídico de guanidina, um ligante peptídico de amidina, um ligante peptídico de sulfóxido e um ligante peptídico de sulfona.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a porção é uma porção hidrofóbica.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir das porções dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodióxi benzila, uma porção de benzotiofenila e uma porção de benzofuranila.

18. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o contato de uma terceira amostra de diluição com um terceiro aptâmero, em que um terceiro complexo de afinidade de aptâmero é formado pela interação do terceiro aptâmero com sua molécula alvo se a molécula alvo estiver presente na terceira amostra de diluição;

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a terceira amostra de diluição é incubada separadamente da primeira e segunda amostras de diluição para permitir a formação de um complexo de afinidade de aptâmero do terceiro aptâmero com sua molécula alvo.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a transferência da terceira amostra de diluição para a segunda mistura para formar uma terceira mistura, em que o terceiro complexo de afinidade de aptâmero da terceira diluição é capturado em um suporte sólido na terceira mistura.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda detectar a presença de ou determinar o nível do terceiro aptâmero do terceiro complexo de afinidade de aptâmero ou a presença ou quantidade do terceiro complexo de afinidade de aptâmero;

23. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a terceira diluição é uma diluição diferente da primeira diluição e da segunda diluição da mesma amostra de teste.

24. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste selecionada de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%), de 15% a 30%, de 15% a 25%, cerca de 20%; de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%,

0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%), de 0,1% a 0,8%, de 0,2% a 0,75%, cerca de 0,5%; e de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008%, de 0,003% a 0,007%, cerca de 0,005%.

25. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o terceiro aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5 compreende um ligante peptídico na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante peptídico.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é selecionado a partir de um ligante peptídico de amida, um ligante peptídico de carbonila, um ligante peptídico de propinila, um ligante peptídico de alquino, um ligante peptídico de éster, um ligante peptídico de ureia, um ligante peptídico de carbamato, um ligante peptídico de guanidina, um ligante peptídico de amidina, um ligante peptídico de sulfóxido e um ligante peptídico de sulfona.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a porção é uma porção hidrofóbica.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir das porções dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

30. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila,

uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodióxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranila.

31. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

32. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar um primeiro reagente de captura em contato com uma primeira diluição para formar uma primeira mistura e um segundo reagente de captura com uma segunda diluição para formar uma segunda mistura, em que cada um dentre o primeiro e segundo reagentes de captura é imobilizado em um suporte sólido e em que cada um dentre o primeiro e segundo reagentes de captura tem afinidade com uma molécula alvo diferente; b) incubar a primeira mistura e a segunda mistura separadamente, em que um primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é formado na primeira mistura se a molécula alvo com a qual o primeiro reagente de captura tem afinidade estiver presente na primeira mistura, em que um segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é formado na segunda mistura se a molécula alvo com a qual o segundo reagente de captura tem afinidade estiver presente na segunda mistura; c) liberar sequencialmente e combinar os complexos de afinidade em uma quarta mistura em uma ordem selecionada dentre (i) o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura e (ii) o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido do primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura;

d) ligar um primeiro marcador à molécula alvo dos primeiro e segundo complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; e) colocar o primeiro e segundo complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura marcados em contato com um ou mais suportes sólidos, de modo que o marcador imobilize o primeiro e segundo complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura em um ou mais suportes sólidos; f) dissociar os reagentes de captura dos complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; g) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que a primeira diluição e a segunda diluição são diluições diferentes de uma amostra de teste.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovagem brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura são complexos não covalentes.

35. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o primeiro reagente de captura e o segundo reagente de captura são, independentemente, selecionados a partir de um aptâmero ou anticorpo.

36. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a molécula alvo é selecionada a partir de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

37. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

38. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

39. Método, de acordo com a reivindicação 32,

caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou de 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20%.

40. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

41. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou de 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%.

42. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou cerca de 20% e a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%.

43. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou a determinação do nível do primeiro e segundo reagentes de captura dissociados é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

44. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o contato de um terceiro reagente de captura com uma terceira diluição para formar uma terceira mistura, em que o terceiro reagente de captura é imobilizado em um suporte sólido e em que o terceiro reagente de captura tem afinidade com uma molécula alvo diferente do que as moléculas alvo do primeiro e segundo reagentes de captura.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a incubação da terceira mistura separadamente da primeira mistura e da segunda mistura, em que um terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é formado na terceira mistura se a molécula alvo com a qual o terceiro reagente de captura tem afinidade por estar presente na terceira mistura.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a liberação sequencial e a combinação do terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura com o primeiro e segundo complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura na quarta mistura em uma ordem selecionada de (i) o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (ii) o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (iii) o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (iv) o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (v) o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; e (vi) o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a terceira diluição é uma diluição diferente da primeira diluição e da segunda diluição da mesma amostra de teste.

48. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste selecionada de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%), de 15% a 30%, de 15% a 25%, cerca de 20%; de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%), de 0,1% a 0,8%, de 0,2% a 0,75%, cerca de 0,5%; e de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008%, de 0,003% a 0,007%, cerca de 0,005%.

49. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que compreende ainda detectar a presença do ou determinar o nível do terceiro aptâmero do terceiro complexo de afinidade de aptâmero ou a presença ou quantidade do terceiro complexo de afinidade de aptâmero.

50. Método, de acordo com as reivindicações 32 a 49, caracterizado pelo fato de que o aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5 compreende um ligante peptídico na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante peptídico.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51,

caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é selecionado a partir de um ligante peptídico de amida, um ligante peptídico de carbonila, um ligante peptídico de propinila, um ligante peptídico de alquino, um ligante peptídico de éster, um ligante peptídico de ureia, um ligante peptídico de carbamato, um ligante peptídico de guanidina, um ligante peptídico de amidina, um ligante peptídico de sulfóxido e um ligante peptídico de sulfona.

53. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a porção é uma porção hidrofóbica.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir das porções dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodióxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranila.

56. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

57. Método, caracterizado pelo fato de que compreende: a) colocar um primeiro reagente de captura com uma primeira diluição para formar uma primeira mistura, um segundo reagente de captura com uma segunda diluição para formar uma segunda mistura e um terceiro reagente de captura em contato com uma terceira diluição para formar uma terceira mistura de diluição, em que cada um dentre o primeiro, segundo e terceiro reagentes de captura é imobilizado em um suporte sólido e em que cada um dentre o primeiro, segundo e terceiro reagentes de captura tem afinidade com uma molécula alvo diferente; b) incubar a primeira mistura, a segunda mistura e a terceira mistura separadamente, em que um primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é formado na primeira mistura se a molécula alvo com a qual o primeiro reagente de captura tem afinidade estiver presente na primeira mistura, em que um segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é formado na segunda mistura se a molécula alvo com a qual o segundo reagente de captura tem afinidade está presente na segunda mistura e em que um terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura é formado na terceira mistura se a molécula alvo com a qual o terceiro reagente de captura tem afinidade estiver presente na terceira mistura; c) liberar sequencialmente e combinar os complexos de afinidade em uma quarta mistura em uma ordem selecionada de (i) o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (ii) o primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (iii) o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (iv) o segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; (v) o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; e (vi) o terceiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo segundo complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura, seguido pelo primeiro complexo de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; d) ligar um primeiro marcador à molécula alvo dos primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; e) colocar o primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura marcados em contato com um ou mais suportes sólidos, de modo que o marcador imobilize o primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura em um ou mais suportes sólidos; f) dissociar os reagentes de captura dos complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura; g) detectar a presença ou determinar o nível dos reagentes de captura dissociados; em que, a primeira diluição, a segunda diluição e a terceira diluição são diluições diferentes de uma amostra de teste.

58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a amostra de teste é selecionada de plasma, soro, urina, sangue total, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada leucocitária, expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, sêmen, saliva, lavagens peritoneais, ascite, líquido cístico, líquido meníngeo, líquido amniótico, líquido glandular, líquido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, escovagem brônquica, líquido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular e líquido cefalorraquidiano.

59. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o primeiro, segundo e terceiro complexos de afinidade de molécula alvo e reagente de captura são complexos não covalentes.

60. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o primeiro reagente de captura, o segundo reagente de captura e o terceiro reagente de captura são, independentemente, selecionados de um aptâmero ou anticorpo.

61. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a molécula alvo é selecionada a partir de uma proteína, um peptídeo, um carboidrato, um polissacarídeo, uma glicoproteína, um hormônio, um receptor, um antígeno, um anticorpo, um vírus, uma bactéria, um metabólito, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, uma célula e um tecido.

62. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a detecção da presença ou a determinação do nível do primeiro e segundo reagentes de captura dissociados é realizada por PCR, espectrometria de massa, sequenciamento de ácido nucleico, sequenciamento de próxima geração (NGS) ou hibridização.

63. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o aptâmero compreende pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma pirimidina modificada na posição 5 compreende um ligante peptídico na posição 5 da pirimidina e uma porção ligada ao ligante peptídico.

65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o ligante peptídico é selecionado a partir de um ligante peptídico de amida, um ligante peptídico de carbonila, um ligante peptídico de propinila, um ligante peptídico de alquino, um ligante peptídico de éster, um ligante peptídico de ureia, um ligante peptídico de carbamato, um ligante peptídico de guanidina, um ligante peptídico de amidina, um ligante peptídico de sulfóxido e um ligante peptídico de sulfona.

66. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a porção é uma porção hidrofóbica.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir das porções dos Grupos I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, XI, XII, XIII, XV e XVI da Figura 1.

68. Método, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a porção é selecionada a partir de uma porção de naftila, uma porção de benzila, uma porção de fluorobenzila, uma porção de tirosila, uma porção de indol, uma porção de morfolino, uma porção de isobutila, uma porção de 3,4-metilenodióxi benzila, uma porção de benzotiofenil e uma porção de benzofuranila.

69. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a pirimidina da pirimidina modificada na posição 5 é uma uridina, citidina ou timidina.

70. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou cerca de 0,005%, a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou é

0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou é de 15% a 30% ou é de 15% a 25% ou de cerca de 20%.

71. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%.

72. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%,

20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%.

73. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou é 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou cerca de 0,5%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%.

74. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou é de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%, a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%,

0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%.

75. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a primeira diluição é uma diluição da amostra de teste de 5% a 39% (ou é 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38% ou 39%) ou de 15% a 30% ou de 15% a 25% ou de cerca de 20%; a segunda diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,001% a 0,009% (ou 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,006%, 0,007%, 0,008% ou 0,009%) ou de 0,002% a 0,008% ou de 0,003% a 0,007% ou de cerca de 0,005%; e a terceira diluição é uma diluição da amostra de teste de 0,01% a 1% (ou é 0,01%, 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08%, 0,09%, 0,1%, 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9% ou 1%) ou de 0,1% a 0,8% ou de 0,2% a 0,75% ou de cerca de 0,5%.