JP2022552192A

JP2022552192A - レチノイン酸誘導遺伝子ｉタンパク質に結合する核酸化合物

Info

Publication number: JP2022552192A
Application number: JP2022520930A
Authority: JP
Inventors: ネボイシャジャンジック; エイミージェリナス
Original assignee: Somalogic Inc
Current assignee: Somalogic Inc
Priority date: 2019-10-16
Filing date: 2020-10-15
Publication date: 2022-12-15
Also published as: WO2021076713A1; US20220333113A1; EP4045656A1; CA3154410A1

Abstract

【課題】ヒトのレチノイン酸誘導遺伝子Ｉタンパク質（ＲＩＧ－Ｉ）への結合能のあるアプタマー、ＲＩＧ－Ｉ結合アプタマーをＲＩＧ－Ｉと共に含む組成物、及びその製造方法と使用方法の提供。【解決手段】本明細書では、ヒトのレチノイン酸誘導遺伝子Ｉタンパク質（ＲＩＧ－Ｉ）への結合能のあるアプタマー、ＲＩＧ－Ｉ結合アプタマーをＲＩＧ－Ｉと共に含む組成物、及びその製造方法と使用方法を記載する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／９１５，８４２号の優先権の利益を主張するものであり、いかなる目的であっても参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

本開示は一般に、核酸の分野に関し、具体的には、ヒトのレチノイン酸誘導遺伝子Ｉタンパク質（ＲＩＧ－Ｉ）への結合能のあるアプタマー、ＲＩＧ－Ｉ結合アプタマーとＲＩＧ－Ｉとを含む組成物、及びそのようなアプタマーを使用してＲＩＧ－Ｉを検出する方法に関する。

ＲＩＧ－Ｉは、ウイルスＲＮＡと結合し、インターフェロン（ＩＦＮ）産生のためのシグナル伝達を開始させることによって、抗ウイルス自然免疫における役割を果たす受容体である。ＲＩＧ－ＩのＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）は、ウイルスＲＮＡを検出するための重要なモチーフであり、多くのウイルスゲノムの折り畳まれた「フライパンの取っ手（ｐａｎｈａｎｄｌｅ）」構造で見られるＲＮＡ二重鎖の平滑末端の５’末端上かまたはウイルス複製中間体上の、三リン酸塩部分及び二リン酸塩部分に高い親和性で結合する。機構的には、ＲＩＧ－ＩＣＴＤへのＲＮＡ結合によりＲＩＧ－Ｉタンパク質構造全体のコンホメーション変化が誘導され、これがシグナル伝達カスケードを開始させ、ＩＦＮ誘導の開始を引き起こす。

ＲＩＧ－Ｉは、抗ウイルス免疫に必須の受容体であるが、この受容体の過剰活性化は、自己免疫から慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に至るまで様々な病理に関連している。ＣＴＤが果たす重要な役割、及びＲＩＧ－Ｉといくつかの異なる病理との関連を考えると、ＲＩＧ－Ｉタンパク質、例えば、ＲＩＧ－ＩのＣＴＤに、特異的に結合するタンパク質結合アプタマーが有益であろう。

本開示は、ヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質に特異的に結合するアプタマーを提供する。

本開示には、ヒトのレチノイン酸誘導遺伝子Ｉタンパク質（ＲＩＧ－Ｉ）への結合能のあるアプタマーが記載されている。その製造方法及び使用方法が記載されている。

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーが提供される。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーは、配列５’－ＰＥＰＳＺＶ－３’（配列番号４９）を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｚは、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、Ｖは、Ｃ、Ａ、またはＧである。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーは、配列５’－ＰＥＰＳＦＰ－３’（配列番号５０）を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、未修飾のＣ、Ｇ、またはＡである。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号４９及び５０を含む。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号４９及び５０ならびに配列５’－ＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５１）を含む。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さである。

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーは、配列５’－ＰＧＰＧＰＣＡ_ｎＰＧＰＧＰＰＰＺＡＺＱＱＣ_ｎＺＭＧＰＰＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５２）を含み、ここで、Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｚは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、Ｑは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＧであり、Ｍは、ＣまたはＡであり、下付き文字のｎは、独立して、各出現について、０または１である。

いくつかの実施形態では、Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する各ヌクレオシドは、独立して、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－フェネチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－チロシルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５－（Ｎ－イミジゾリルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－（Ｎ－Ｒ－トレオニニルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンクロリド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、及び５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジンから選択される。

いくつかの実施形態では、Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する各ヌクレオシドは、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）である。

いくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号６５～６７から選択される１つ以上の配列を含む。

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーは、配列番号４～４７及び６８～９９から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、または１００％同一な配列を含む。

いくつかの実施形態では、アプタマーは、５～６０ヌクレオチドの長さ、または３５～５０ヌクレオチドの長さ、または４０～５０ヌクレオチドの長さである。

いくつかの実施形態では、アプタマーが結合するＲＩＧ－Ｉタンパク質は、ヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質である。

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する結合親和性を有するアプタマーを選択するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する結合親和性を有するアプタマーを選択することを含み、これは、候補混合物とＲＩＧ－Ｉタンパク質とを接触させることであって、候補混合物が修飾核酸を含み、候補混合物の少なくとも１つまたはそれぞれの核酸にある１つ、いくつか、もしくはすべてのピリミジンがＣ－５修飾ピリミジンを含む、前記接触させること；候補混合物を低解離速度濃縮プロセスに曝露させることであって、候補混合物中の他の核酸と比べて標的分子からの解離の速度が遅い核酸がＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合して、核酸－標的分子複合体を形成する、前記曝露させること；候補混合物から低解離速度の核酸を分割すること；低解離速度の核酸を増幅させて、ＲＩＧ－Ｉタンパク質への結合能のある低解離速度の核酸配列に富む核酸混合物を生成すること、を含み、これにより、ＲＩＧ－Ｉタンパク質分子に対する低解離速度アプタマーが選択される。

いくつかの実施形態では、候補混合物は、配列５’－ＰＥＰＳＺＶ－３’（配列番号４９）を含む核酸を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｚは、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、Ｖは、Ｃ、Ａ、またはＧである。いくつかの実施形態では、候補混合物は、配列５’－ＰＥＰＳＦＰ－３’（配列番号５０）を含む核酸を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、未修飾のＣ、Ｇ、またはＡである。いくつかの実施形態では、候補混合物は、配列５’－ＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５１）を含む核酸を含む。

いくつかの実施形態では、各核酸は、独立して、３５～６０ヌクレオチドの長さ、または３５～５０ヌクレオチドの長さ、または４０～５０ヌクレオチドの長さである。

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質は、ヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質である。

本発明の前述及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図を参照しながら進められる以下の詳細な説明からさらに明らかになる。

３２の独立して誘導されたアプタマー配列の４０ヌクレオチドのランダム領域のアラインメントを示す。３２のアプタマー配列から同定された４つのパターンが示されている。「Ｊ」は、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）ウラシルである。２６の独立して誘導されたアプタマー配列の４０ヌクレオチドのランダム領域を示す。パターン４（配列番号６５）に整列する核酸塩基が、各配列内で強調表示されている。図１Ｂで示されている２６の独立した配列に基づくパターン４のヌクレオチド位置とコンセンサス配列を示す。コンセンサス配列を定義する各位置での、アプタマーパターン４における各核酸塩基の頻度も示されている。１７の独立して誘導されたアプタマー配列の４０ヌクレオチドのランダム領域を示す。パターン３（配列番号６６）に整列する核酸塩基が、各配列内で強調表示されている。図１Ｄで示されている１７の独立した配列に基づくパターン３のヌクレオチド位置とコンセンサス配列を示す。コンセンサス配列を定義する各位置での、アプタマーパターン３における各核酸塩基の頻度も示されている。２つの独立して誘導されたアプタマー配列の４０ヌクレオチドのランダム領域を示す。パターン１の一部分（配列番号６７）に整列する核酸塩基が、各配列内で強調表示されている。図１Ｆで示されている２つの独立した配列に基づくパターン１の一部分のヌクレオチド位置とコンセンサス配列を示す。コンセンサス配列を定義する各位置での、アプタマーパターン１の一部分における各核酸塩基の頻度も示されている。独立して誘導されたアプタマー配列に基づくパターン１～４を統合した場合のヌクレオチド位置とコンセンサス配列を示す。コンセンサス配列を定義する各位置での各核酸塩基の頻度も示されている。全長ＲＩＧ－Ｉタンパク質及び様々なＲＩＧ－Ｉタンパク質の切断型のタンパク質ドメインの略図を示す。図２Ａで、「ＣＡＲＤｓ」とは、カスパーゼの活性化及び動員ドメインを意味し、「ＨＤ」とは、ヘリカーゼドメインを意味し、「ＣＴＤ」とは、Ｃ末端調節ドメインを意味する。図２Ａに示されている略図は、Ｖｅｌａｅｔａｌ．ＴｈｅＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃＢａｓｉｓｆｏｒＶｉｒａｌＲＮＡＤｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅＲＩＧ－ＩＩｎｎａｔｅＩｍｍｕｎｅＳｅｎｓｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（５１）：４２５６４，２０１２からのものである。タンパク質濃度（ｘ軸）の関数としてプロットした結合アプタマーの割合（ｙ軸）のグラフ表示を示す。ヒトＲＩＧ－Ｉ－ＣＴＤタンパク質濃度は１×１０^－８Ｍ～１×１０^－１４Ｍの範囲であり、ｙ＝（最大－最小）（Ｐ_ｔ）／（Ｋ_ｄ＋Ｐ_ｔ）＋最小を用いて平衡結合定数（Ｋ_ｄ）を計算した。アプタマーに組み込まれ得る特定の例示的な５位修飾のウラシル及びシトシンを示す。ウラシルの５位に存在し得る特定の例示的修飾を示す。Ｃ－５修飾の化学構造には、ウラシルの５位に修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。図示の５位部分には、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ）、ブチル部分（例えば、ｉＢｕ）、フルオロベンジル部分（例えば、ＦＢｎ）、チロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）、３，４－メチレンジオキシベンジル（例えば、ＭＢｎ）、モルホリノ部分（例えば、ＭＯＥ）、ベンゾフラニル部分（例えば、ＢＦ）、インドール部分（例えば、Ｔｒｐ）及びヒドロキシプロピル部分（例えば、Ｔｈｒ）が含まれる。例示的なＣ－５修飾ピリミジンを含有するヌクレオシド、及びシトシンの５位に存在し得る修飾を示す。Ｃ－５修飾の化学構造には、シトシンの５位に修飾を連結する例示的アミド結合が含まれる。図示の５位部分には、ベンジル部分（例えば、Ｂｎ、ＰＥ及びＰＰ）、ナフチル部分（例えば、Ｎａｐ、２Ｎａｐ、ＮＥ、及び２ＮＥ）及びチロシル部分（例えば、Ｔｙｒ）が含まれる。

別段の注記がない限り、技術用語は従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、ＢｅｎｊａｍｉｎＬｅｗｉｎ，ＧｅｎｅｓＶ，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓにより出版，１９９４（ＩＳＢＮ０－１９－８５４２８７－９）、Ｋｅｎｄｒｅｗｅｔａｌ．（ｅｄｓ．），ＴｈｅＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅＬｔｄ．により出版，１９９４（ＩＳＢＮ０－６３２－０２１８２－９）、及びＲｏｂｅｒｔＡ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＤｅｓｋＲｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により出版，１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）に見出され得る。

本開示の様々な実施形態の検討を容易にするため、特定の用語について以下のように説明する。

アプタマー：アプタマーという用語は、本明細書で使用される場合、標的分子に対して望ましい作用を有する、天然には存在しない核酸を指す。望ましい作用としては、標的の結合、標的の活性の増強、及び標的の活性の阻害が含まれるが、これらに限定されない。アプタマーは、「核酸リガンド」とも呼ばれる。いくつかの実施形態では、アプタマーは、ＳＯＭＡｍｅｒである。本明細書で使用される場合、用語「アプタマー」には、別段の具体的な指示がない限り、アプタマー及びその薬学的に許容される塩が含まれる。

いくつかの実施形態では、アプタマーは、ワトソン／クリック塩基対形成または三重らせん形成とは独立した機構を介してＲＩＧ－Ｉと特異的に結合し、ここで、アプタマーは、ＲＩＧ－Ｉによって結合されるという既知の生理学的機能を有していない。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉと結合するアプタマーには、核酸の候補混合物から同定される核酸が含まれ、手段とする方法は、（ａ）候補混合物と標的とを接触させることであって、候補混合物中の他の核酸と比べて標的に対する親和性が高い核酸が、候補混合物の残部から分割され得る、前記接触させること、（ｂ）親和性がより高い核酸を候補混合物の残部から分割すること、及び（ｃ）親和性がより高い核酸を増幅させて、リガンドに富む核酸混合物を生成すること、を含み、これにより、ＲＩＧ－Ｉと結合するアプタマーが同定される。親和性相互作用は程度の問題であると認識されているが、この文脈では、自身の標的に「特異的に結合する」アプタマーとは、アプタマーがその標的に、混合物または試料中の他の非標的成分に結合する場合の親和性の程度よりもはるかに高い程度で結合することを意味する。「アプタマー」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する１つの型または種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーには、任意の好適な数のヌクレオチドを含めることができる。「アプタマー」とは、２つ以上のそのようなセットの分子を指す。異なるアプタマーは、同数のヌクレオチドを有することも、異なる数のヌクレオチドを有することもできる。アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの両方、及びいずれかまたは両方の修飾型を含んでよく、また、一本鎖、二本鎖であっても、あるいは二本鎖もしくは三本鎖領域、または他の任意の三次元構造を含有してもよい。

生物活性：生物活性という用語は、本明細書で使用される場合、生理学的または病態生理学的過程に影響を及ぼし得る、細胞間、細胞内または細胞外の１つ以上のプロセス（例えば、細胞間結合、リガンド－受容体結合、細胞シグナル伝達等）を指す。

Ｃ－５修飾ピリミジン：Ｃ－５修飾ピリミジンとは、本明細書で使用される場合、Ｃ－５位での修飾のあるピリミジンを指す。Ｃ－５修飾ピリミジンの例には、米国特許第５，７１９，２７３号及び同第５，９４５，５２７号に記載のものが含まれる。Ｃ－５修飾ピリミジンの特定の非限定的な例を本明細書で提供する。

ＲＩＧ－Ｉアプタマー：「ＲＩＧ－Ｉアプタマー」とは、本明細書で使用される場合、ＲＩＧ－Ｉタンパク質への結合能のあるアプタマーを指す。

修飾：本明細書で使用される場合、用語「修飾する」、「修飾されている」、「修飾」、及びその任意の変形は、オリゴヌクレオチドに関して使用される場合、そのオリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非天然部分、例えば、少なくとも１つの非天然糖部分、少なくとも１つの非天然ヌクレオシド間結合、少なくとも１つの非天然ヌクレオチド塩基部分、及び／または天然ではオリゴヌクレオチドに存在しない少なくとも１つの部分（例えば、炭素３個のスペーサーまたはヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）等）を含むことを意味する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの４つの構成ヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ／Ｕ、及びＣ）のうちの少なくとも１つは、修飾ヌクレオチドである。そのようないくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、天然に存在する塩基よりも疎水性である塩基部分を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。いくつかの実施形態では、アプタマーが、疎水性塩基部分を含む１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む場合、そのアプタマーは、その標的、例えばタンパク質に、主に疎水性相互作用を介して結合する。いくつかの実施形態では、そのような疎水性相互作用により高い結合効率と安定な共結晶複合体がもたらされる。Ｃ－５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾として、キャッピング等の３’及び５’の修飾も含めることができる。他の修飾としては、類似体による天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の置換、ヌクレオシド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）を用いるもの、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）を用いるもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）を用いるもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー型核酸等）を用いるもの等を挙げることができる。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、ホスホナート基もしくはリン酸基で置き換えられ得るか、標準的な保護基で保護され得るか、または追加のヌクレオチドもしくは固体支持体への追加の結合を調製するために活性化され得る。５’末端及び３’末端のＯＨ基を、リン酸化させるか、あるいはアミン、炭素原子約１～約２０個の有機キャッピング基部分、いくつかの実施形態において約１０～約８０ｋＤａの範囲であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、いくつかの実施形態において約２０～約６０ｋＤａの範囲であるＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性の生体高分子もしくは合成ポリマーで置換することができる。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ－５位のものである。これらの修飾は、直接Ｃ－５位でアミド結合を介するか、または他の種類の結合により生成することができる。

ポリヌクレオチドは、一般に当該技術分野で公知のリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態を含有することもでき、これには、２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロ－リボースもしくは２’－アジド－リボース、炭素環状糖類似体、α－アノマー型糖、エピマー型糖（アラビノース、キシロースまたはリキソース等）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体（メチルリボシド等）が含まれる。上記のように、１つ以上のホスホジエステル結合を代替的連結基により置き換えてよい。これらの代替的連結基には、リン酸塩が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、（Ｏ）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられている実施形態が挙げられ、ここで、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈであるか、またはエーテル（－Ｏ－）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を任意選択で含有する置換もしくは非置換のアルキル（１～２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。類似形態の糖、プリン、及びピリミジンの置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替的骨格構造が有利であり得るように、最終生成物を設計する際に有利になり得る。

調節する：本明細書で使用される場合、「調節する」とは、標的のレベル、安定性、プロセシング、及び／または活性を増大または減少させることにより変化させることを意味する。

核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指すために同じ意味で使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びそのような実体の修飾型が含まれる。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」には、二本鎖または一本鎖の分子ならびに三重らせん分子が含まれる。核酸という用語にはアプタマーが含まれるが、それに限定されない（すなわち、この用語には、ヌクレオチドの他のポリマーが含まれる）。

ヌクレアーゼ：本明細書で使用される場合、用語「ヌクレアーゼ」とは、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断する能力がある酵素を指す。本明細書で使用される場合、用語「エンドヌクレアーゼ」とは、オリゴヌクレオチドの内部の部位でホスホジエステル結合（複数可）を切断する酵素を指す。本明細書で使用される場合、用語「エキソヌクレアーゼ」とは、オリゴヌクレオチド末端ヌクレオチドを連結しているホスホジエステル結合（複数可）を切断する酵素を指す。生体液は典型的に、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼの両方の混合物を含有する。

ヌクレアーゼ耐性：本明細書で使用される場合、用語「ヌクレアーゼ耐性の」及び「ヌクレアーゼ耐性」とは、オリゴヌクレオチドがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの基質として機能する能力の低下であって、そのために、そのような酵素と接触した際に、そのオリゴヌクレオチドが分解されない、あるいはヌクレアーゼ耐性測定対象のオリゴヌクレオチドと長さ及び配列は同様であるが１つ以上の修飾を欠く対照オリゴヌクレオチドよりもり緩徐にもしくは低い程度で分解されることを指す。

ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはその修飾形態を指す。ヌクレオチドには、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン等）及びピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン等）を含む種が含まれる。塩基が、「Ａ」、「Ｃ」、「Ｇ」、「Ｕ」、または「Ｔ」として示されている場合、それは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方、及びその修飾形態を包含することを意図している。

薬学的に許容される：本明細書で使用される場合の薬学的に許容される、とは、動物、より具体的にはヒトでの使用のために、連邦もしくは州政府の規制当局により承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。

薬学的に許容される塩：ある化合物の薬学的に許容される塩（例えば、アプタマー）とは、本明細書で使用される場合、その化合物と、その化合物にイオン結合（複数可）を介して結合している１つ以上の追加の薬学的に許容される原子もしくは基と、を含有する生成物を指す。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される塩は、化合物を酸または塩基と接触させることによって生成される。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び酒石酸塩；アルカリ金属カチオン、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、アルカリ土類金属塩、例えば、ＭｇもしくはＣａ、または有機アミン塩が含まれ得るが、これらに限定されない。

医薬組成物：医薬組成物とは、本明細書で使用される場合、個体への投与に好適な形態にある、化合物（アプタマー等）を含む製剤を指す。医薬組成物は典型的には、その意図される投与経路に適合するよう製剤化される。投与経路の例としては、硝子体内、経腸及び非経口等、例えば、皮下注射もしくは注入、静脈内注射もしくは注入、関節内注射、動脈内注射及び注入、房水内注射及び移植、ならびに硝子体内注射及び移植が含まれるが、これらに限定されない。

タンパク質：本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義で使用される。「精製された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、精製タンパク質を取得する元となる細胞、組織、もしくは無細胞材料からの、細胞物質または他の汚染タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。

ＳＥＬＥＸ：ＳＥＬＥＸという用語は、本明細書で使用される場合、一般に、望ましい方法で標的分子と相互作用する核酸、例えば、あるタンパク質に高い親和性で結合する核酸の選択；及びそれらの選択された核酸の増幅を指す。ＳＥＬＥＸは、特定の標的分子に対して親和性が高いアプタマーを同定するために使用され得る。ＳＥＬＥＸという用語と「ＳＥＬＥＸ法」とは、同じ意味で使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉに結合するアプタマーを選択する方法が提供され、これは、（ａ）核酸の候補混合物を調製することであって、候補混合物が修飾核酸を含み、候補混合物の少なくとも１つまたはそれぞれの核酸にある少なくとも１つのピリミジンがＣ５位で化学的に修飾されている、前記調製すること、（ｂ）候補混合物をＲＩＧ－Ｉと接触させることであって、候補混合物中の他の核酸と比べてＲＩＧ－Ｉに対する親和性が高い核酸がＲＩＧ－Ｉと結合して、核酸－ＲＩＧ－Ｉ複合体を形成する、前記接触させること、（ｃ）親和性がより高い核酸を候補混合物の残部から分割すること、及び（ｄ）親和性がより高い核酸を増幅させて、より高い親和性でＲＩＧ－Ｉに結合する能力がある核酸配列に富む核酸混合物を生成すること、を含み、これにより、ＲＩＧ－Ｉに結合するアプタマーが同定される。特定の実施形態では、かかる方法にはさらに、低解離速度濃縮プロセスを実施することが含まれる。

配列同一性：本明細書で使用される場合、２つ以上の核酸配列との関連における配列同一性とは、その配列により共有される、同一のヌクレオチド位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／比較される２配列のうち短い方での位置総数×１００）であり、その際、ギャップの数、及び２つ以上の配列のアラインメントを最適化するために導入する必要がある各ギャップの長さを考慮に入れる。２つ以上の配列間の配列比較及び同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラム等の数学アルゴリズムをそのデフォルトのパラメータで使用して達成することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。配列比較の場合、典型的には１つの配列が参照配列となり、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列（複数可）の配列同一性パーセントを計算する。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：４８２，１９８１の局所的相同性アルゴリズムによるか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３，１９７０の相同性アラインメントアルゴリズムによるか、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４，１９８８の類似性検索法によるか、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅ，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）によるか、または目視検査によって（概要は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）により出版）を参照のこと）行うことができる。本明細書で使用される場合、アプタマー等の核酸の同一性パーセントの記載では、参照核酸塩基配列と少なくとも、例えば、約９５％同一である配列の場合、その核酸配列に、参照核酸配列の各１００ヌクレオチドあたり最大で５つの点変異が含まれ得ることを除いては、その核酸配列は参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、所望の核酸配列、すなわち、参照核酸配列と少なくとも約９５％同一な配列を得るために、参照配列中の最大５％のヌクレオチドが欠失もしくは別のヌクレオチドで置換され得るか、または参照配列中の総ヌクレオチド数の５％を最大とするいくつかのヌクレオチドが参照配列に挿入され得る（本明細書では挿入と呼ぶ）。所望の配列を生成するための参照配列のこれらの変異は、参照核酸塩基配列の５’末端もしくは３’末端の位置、またはそれらの末端に挟まれた位置において、参照配列内のヌクレオチド間に個々別々に、または参照配列内部に１つ以上の連続する群になって散在して出現し得る。

ＳＯＭＡｍｅｒ：本明細書で使用される場合、「ＳＯＭＡｍｅｒ」または低解離速度の修飾アプタマーとは、解離速度（ｔ_１／２）が３０分以上、６０分以上、９０分以上、１２０分以上、１５０分以上、１８０分以上、２１０分以上、または２４０分以上であるアプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む）を指す。いくつかの実施形態では、ＳＯＭＡｍｅｒは、“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＧｅｎｅｒａｔｉｎｇＡｐｔａｍｅｒｓｗｉｔｈＩｍｐｒｏｖｅｄＯｆｆ－Ｒａｔｅｓ”と題された米国特許第７，９４７，４４７号に記載の改良ＳＥＬＥＸ法を使用して生成される。

標的分子：標的分子（または標的）とは、本明細書で使用される場合、アプタマーが望ましい様態で作用することができるポリヌクレオチド以外の、三次元化学構造を有する任意の化合物または分子を指す。標的分子の非限定的な例としては、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、毒性物質、基質、代謝物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養、増殖因子、細胞、組織、前述のうちのいずれかの任意の部分または断片等が挙げられる。事実上、いかなる化学的または生物学的エフェクターも好適な標的であり得る。どの大きさの分子でも標的となり得る。標的はまた、標的と核酸の間の相互作用の可能性または強度を高めるために、特定の方法で修飾され得る。標的にはまた、特定の化合物または分子の任意の小規模変異、例えば、タンパク質の場合は、例えば、そのアミノ酸配列の小規模変異、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化、またはその分子の固有性を実質的に変化させることのない他の任意の操作もしくは修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーション等も含まれ得る。「標的分子」または「標的」は、アプタマーに対する結合能のある、１つの型または種の分子または多分子構造のコピーのセットである。「標的分子」または「標的」とは、２つ以上のそのようなセットの分子を指す。いくつかの実施形態では、標的分子は、ヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質である。

治療的有効量：本明細書で使用される場合、用語「治療的有効量」とは一般に、本明細書に記載されるように予防、軽減、または治療されるべき障害または状態の少なくとも１つの症状を改善するために必要な量を意味する。本開示のアプタマーに関する場合の語句「治療的有効量」とは、特定の薬理学的応答を提供するアプタマー投与量であり、その応答のために、そのような治療を必要とするかなりの数の個体でアプタマーが投与される、アプタマー投与量を意味する。特定の個体に対して特定の場合に投与されるアプタマーの治療的有効量は、そのような投与量を当業者が治療的有効量であるとみなしたとしても、本明細書に記載される状態／疾患の治療において常に有効であるとは限らないことが強調される。

単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確な指示がない限り、複数の指示対象が含まれる。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、またはＢ、またはＡとＢが含まれることを意味する。核酸またはポリペプチドについて与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及びすべての分子量または分子質量の値は概数であり、説明のために提供されていることがさらに理解されるべきである。

さらに、本明細書で提供される範囲は、その範囲内の値のすべてが省略されていると理解される。例えば、１～５０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲（ならびにその分数、ただし、文脈で特に明確な指示がある場合を除く）が含まれることが理解される。いかなる濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲も、特に指示がない限り、記述範囲内のあらゆる整数値、及び必要に応じ、その分数値（整数の１０分の１及び１００分の１等）を含むと理解されるべきである。また、ポリマーのサブユニット、サイズまたは厚さ等の任意の物理的特徴に関して本明細書で引用される任意の数字範囲は、特に指示がない限り、記述範囲内のいかなる整数も含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」または「から本質的になる」とは、特に指示がない限り、示されている範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、非限定的であり、かつ同義で使用される。本明細書で使用される場合の用語「ａ」及び「ａｎ」は、列挙されている構成要素のうちの「１つ以上」を指すことを理解されるべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のうちの１つ、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。

本開示の実施または試験においては本明細書に記載される方法及び材料と類似または同等のものを使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合は、用語の説明も含め、本明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定することを意図しない。

例示的実施形態
本発明は、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と特異的に結合するアプタマー（「ＲＩＧ－Ｉアプタマー」と呼ばれる場合もある）を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーは、配列５’－ＰＥＰＳＺＶ－３’（配列番号４９）を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、Ａ、またはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｚは、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、Ｖは、Ｃ、Ａ、またはＧである。いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーは、配列５’－ＰＥＰＳＦＰ－３’（配列番号５０）を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、未修飾のＣ、Ｇ、またはＡである。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号４９及び５０を含む。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは、配列番号４９及び５０ならびに配列５’－ＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５１）を含む。そのようないくつかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さである。

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーは、配列５’－ＰＧＰＧＰＣＡ_ｎＰＧＰＧＰＰＰＺＡＺＱＱＣ_ｎＺＭＧＰＰＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５２）を含み、ここで、Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｚは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、Ｑは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＧであり、Ｍは、ＣまたはＡであり、ｎは、独立して、各出現について、０または１である。

いくつかの実施形態では、アプタマーは、３５～６０ヌクレオチドの長さ、または３５～５０ヌクレオチドの長さ、または４０～５０ヌクレオチドの長さである。

本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、アプタマーは、３５～６０ヌクレオチドの長さ、または３５～５０ヌクレオチドの長さ、または４０～５０ヌクレオチドの長さであり得る。

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーには、最大１００ヌクレオチド、最大９５ヌクレオチド、最大９０ヌクレオチド、最大８５ヌクレオチド、最大８０ヌクレオチド、最大７５ヌクレオチド、最大７０ヌクレオチド、最大６５ヌクレオチド、最大６０ヌクレオチド、最大５５ヌクレオチド、最大５０ヌクレオチド、最大４５ヌクレオチド、最大４０ヌクレオチド、または最大３５ヌクレオチドが含まれ得る。

本開示の別の態様では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉに対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約１０ｎＭ以下であり得る。別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約１５ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約２０ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約２５ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約３０ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約３５ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約４０ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約４５ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約５０ｎＭ以下である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が約２ｐＭ～約１０ｎＭの範囲（または２ｐＭ、３ｐＭ、４ｐＭ、５ｐＭ、６ｐＭ、７ｐＭ、８ｐＭ、９ｐＭ、１０ｐＭ、１５ｐＭ、２０ｐＭ、２５ｐＭ、３０ｐＭ、３５ｐＭ、４０ｐＭ、４５ｐＭ、５０ｐＭ、６０ｐＭ、７０ｐＭ、８０ｐＭ、９０ｐＭ、１００ｐＭ、１５０ｐＭ、２００ｐＭ、２５０ｐＭ、３００ｐＭ、３５０ｐＭ、４００ｐＭ、４５０ｐＭ、５００ｐＭ、５５０ｐＭ、６００ｐＭ、６５０ｐＭ、７００ｐＭ、７５０ｐＭ、８００ｐＭ、８５０ｐＭ、９００ｐＭ、９５０ｐＭ、１０００ｐＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭもしくは１０ｎＭ）である。さらに別の例示的実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアプタマーは、ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する解離定数（Ｋ_ｄ）が少なくとも２ｐＭの範囲（または少なくとも２ｐＭ、３ｐＭ、４ｐＭ、５ｐＭ、６ｐＭ、７ｐＭ、８ｐＭ、９ｐＭ、１０ｐＭ、１５ｐＭ、２０ｐＭ、２５ｐＭ、３０ｐＭ、３５ｐＭ、４０ｐＭ、４５ｐＭ、５０ｐＭ、６０ｐＭ、７０ｐＭ、８０ｐＭ、９０ｐＭ、１００ｐＭ、１５０ｐＭ、２００ｐＭ、２５０ｐＭ、３００ｐＭ、３５０ｐＭ、４００ｐＭ、４５０ｐＭ、５００ｐＭ、５５０ｐＭ、６００ｐＭ、６５０ｐＭ、７００ｐＭ、７５０ｐＭ、８００ｐＭ、８５０ｐＭ、９００ｐＭ、９５０ｐＭ、１０００ｐＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭもしくは１０ｎＭ）である。好適な解離定数は、実施例２に記載のように、多点滴定を使用して、ｙ＝（最大－最小）（タンパク質）／（Ｋ_ｄ＋タンパク質）＋最小という方程式に当てはめる結合アッセイで決定することができる。解離定数の決定は、解離定数が測定される条件に大きく依存し、そのため、これらの数値は、例えば平衡時間等のような要因に関して大幅に変動し得ることを理解されるべきである。

本明細書に記載される実施形態のいずれかでは、アプタマー、すなわち、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡのヌクレオチドまたはその組み合わせを含む。

ＳＥＬＥＸ
ＳＥＬＥＸには一般に、核酸の候補混合物を調製すること、候補混合物と所望の標的分子とを結合させて親和性複合体を形成させること、未結合の候補核酸から親和性複合体を分離すること、親和性複合体から核酸を分離し単離すること、核酸を精製すること、及び特定のアプタマー配列を同定することが含まれる。工程には、選択されたアプタマーの親和性をさらに高めるために複数ラウンドが含まれ得る。工程には、その工程の１つ以上のポイントにおいて増幅ステップを含めることができる。例えば、”ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ”と題された米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。自身の標的と共有結合で結合するアプタマー、及び自身の標的と非共有結合で結合するアプタマーを生成するためにＳＥＬＥＸ法を使用することができる。例えば、“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ－ＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第５，７０５，３３７号を参照のこと。

例えば、改善された生体内安定性または改善された送達特性等の、改善された特徴をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定するためにＳＥＬＥＸ法を使用することができる。そのような修飾の例には、リボース及び／またはリン酸塩及び／または塩基の位置での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ法で同定された、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、“ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題された米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、それには、ピリミジンの５’位及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）には、２’－アミノ（２’－ＮＨ２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び／または２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーが記載されている。物理的特性及び化学的特性が拡張された核酸ライブラリー、ならびにＳＥＬＥＸ及びフォトＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用を記載している“ＳＥＬＥＸａｎｄＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ”と題された米国特許出願公開第２００９００９８５４９号も参照のこと。

ＳＥＬＥＸはまた、望ましい解離速度特性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。標的分子に結合することができるアプタマーを生成するための改良ＳＥＬＥＸ方法が記載されている“ＭｅｔｈｏｄｆｏｒＧｅｎｅｒａｔｉｎｇＡｐｔａｍｅｒｓｗｉｔｈＩｍｐｒｏｖｅｄＯｆｆ－Ｒａｔｅｓ”と題された米国特許出願公開第２００９０００４６６７号を参照のこと。上述のように、これらの低解離速度アプタマーは「ＳＯＭＡｍｅｒ」として知られている。各自の標的分子からの解離速度が遅いアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ及びフォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）またはＳＯＭＡｍｅｒを生成する方法が記載されている。かかる方法は、候補混合物と標的分子とを接触させること、核酸－標的複合体の形成を生じさせること、及び低解離速度濃縮プロセス、すなわち、解離速度が速い核酸－標的複合体は解離して再形成することはなく、解離速度が遅い複合体が完全な状態で残るプロセスを実施することを伴う。さらに、方法には、解離速度性能が改善されたアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒが生成されるよう、候補核酸混合物の生成における修飾ヌクレオチドの使用が含まれる。

このアッセイの変形では、アプタマーが自身の標的分子と共有結合で結合するかまたは「光架橋する」ことを可能にする光反応性官能基を含めたアプタマーを使用する。例えば、“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＢｉｏｃｈｉｐ”と題された米国特許第６，５４４，７７６号を参照のこと。これらの光反応性アプタマーはフォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）とも呼ばれる。例えば、各々が“ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＥｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓｂｙＥｘｐｏｎｅｎｔｉａｌＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＰｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓａｎｄＳｏｌｕｔｉｏｎＳＥＬＥＸ”と題された米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、及び米国特許第６，２９１，１８４号を参照のこと。また、例えば、“ＰｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓ”と題された米国特許第６，４５８，５３９号も参照のこと。マイクロアレイを試料と接触させ、フォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）に自身の標的分子に結合する機会を与えた後、フォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）が光活性化され、固体支持体を洗浄して非特異的に結合した分子を除去する。フォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）に結合している標的分子は一般に、フォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）上の光活性化官能基（複数可）により生じた共有結合のために除去されないことから、過酷な洗浄条件を使用してよい。

これらのアッセイフォーマットのいずれにおいても、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒは、試料と接触させる前に固体支持体に固定化される。しかしながら、特定の状況下では、試料と接触させる前にアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒを固定化しても、最適なアッセイが得られない場合がある。例えば、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの事前固定化では、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒと固体支持体表面の標的分子との混合効率が悪くなる場合があり、おそらく反応時間が長くなり、そのため、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒが自身の標的分子に効率的に結合することを可能にするためのインキュベーション期間の長期化につながる。さらに、アッセイでフォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）またはフォトＳＯＭＡｍｅｒが使用される場合、固体支持体として使用される材料に応じて、固体支持体が、使用される光を散乱または吸収する傾向があり、フォトアプタマー（ｐｈｏｔｏａｐｔａｍｅｒ）またはフォトＳＯＭＡｍｅｒとそれらの標的分子との間での共有結合の形成に影響を与える場合がある。さらに、使用される方法によっては、固体支持体の表面もまた、使用される標識物質に曝露され、それによる影響をうける場合があることから、アプタマーまたはフォトＳＯＭＡｍｅｒに結合しているそれらの標的分子の検出が不正確になり得る。最後に、固体支持体上へのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの固定化では一般に、試料へのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの曝露より前にアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの調製ステップ（すなわち、固定化）を伴うが、この調製ステップが、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒの活性または機能性に影響を与える場合がある。

ＳＯＭＡｍｅｒにその標的を溶液中で捕捉させて、その次に、ＳＯＭＡｍｅｒと標的の混合物の特定の成分を除去するよう設計された分離ステップを検出より前に採り入れているＳＯＭＡｍｅｒアッセイもまた報告されている（“ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＡｎａｌｙｓｅｓｏｆＴｅｓｔＳａｍｐｌｅｓ”と題された米国特許出願公開第２００９００４２２０６号を参照のこと）。記載されているＳＯＭＡｍｅｒアッセイ方法は、核酸（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を検出及び定量化することによって、試験試料中の核酸以外の標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量を可能にする。記載されている方法では、核酸以外の標的を検出及び定量化するための核酸サロゲート（すなわち、ＳＯＭＡｍｅｒ）を作製し、これにより、増幅等の多種多様な核酸技術を、タンパク質標的等の広範な所望の標的に適用することを可能にしている。

標的がペプチドであるＳＥＬＥＸ法の実施形態が、“ＭｏｄｉｆｉｅｄＳＥＬＥＸＰｒｏｃｅｓｓｅｓＷｉｔｈｏｕｔＰｕｒｉｆｉｅｄＰｒｏｔｅｉｎ”と題された米国特許第６，３７６，１９０号に記載されている。ここでの場合、標的は、ＲＩＧ－Ｉ－タンパク質である。

アプタマーでの化学修飾
アプタマーは、その特性及び特徴を改善する修飾ヌクレオチドを含有し得る。そのような改善の非限定的な例としては、インビボ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／または送達特性改善が挙げられる。

そのような修飾の例には、ヌクレオチドのリボース及び／またはリン酸塩及び／または塩基の位置での化学的置換が含まれる。ＳＥＬＥＸ法で同定された、修飾ヌクレオチドを含有するアプタマーは、“ＨｉｇｈＡｆｆｉｎｉｔｙＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＬｉｇａｎｄｓＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＭｏｄｉｆｉｅｄＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”と題された米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、それには、ピリミジンの５’位及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドが記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）には、２’－アミノ（２’－ＮＨ_２）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、及び／または２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーが記載されている。物理的特性及び化学的特性が拡張された核酸ライブラリー、ならびにＳＥＬＥＸ及びフォトＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用を記載している“ＳＥＬＥＸａｎｄＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ”と題された米国特許出願公開第２００９００９８５４９号も参照のこと。

Ｃ－５修飾を含むヌクレオシドの具体例としては、この直下に例示されているように、ベンジルカルボキシアミド（別法では、ベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（別法では、ナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（別法では、トリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、及びイソブチルカルボキシアミド（別法では、イソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）から独立して選択される置換基での、Ｃ－５位のデオキシウリジンの置換が挙げられる。

Ｃ－５修飾ピリミジンの化学修飾はまた、単独または任意の組み合わせで、２’位の糖修飾、環外アミンにおける修飾、及び４－チオウリジンの置換等と組み合わせることができる。

Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する代表的ヌクレオシドとしては、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－０－メチルウリジン、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－０－メチルウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－０－メチルウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンクロリド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－０－メチルウリジン、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジンまたは５－（Ｎ－［ｌ－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン）が挙げられる。

ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在する場合、ポリヌクレオチドのアセンブリの前でも後でも付与することができる。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分を割り込ませることができる。ポリヌクレオチドは、重合後に、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより、さらに修飾することができる。

さらに、Ｃ－５修飾ピリミジンを含有するヌクレオチドには、以下が含まれる。

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。Ｃ－５位に置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの一例である。修飾としては、骨格修飾、メチル化、稀な塩基対合の組み合わせ、例えば、イソ塩基のイソシチジンとイソグアニジン等を挙げることができる。修飾として、キャッピング等の３’及び５’の修飾も含めることができる。他の修飾としては、類似体による天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の置換、ヌクレオシド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）を用いるもの、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）を用いるもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）を用いるもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー型核酸等）を用いるもの等を挙げることができる。さらに、ヌクレオチドの糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、ホスホナート基もしくはリン酸基で置き換えられ得るか、標準的な保護基で保護され得るか、または追加のヌクレオチドもしくは固体支持体への追加の結合を調製するために活性化され得る。５’末端及び３’末端のＯＨ基を、リン酸化させるか、あるいはアミン、炭素原子約１～約２０個の有機キャッピング基部分、一実施形態において約１０～約８０ｋＤａの範囲であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、別の実施形態において約２０～約６０ｋＤａの範囲であるＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性の生体高分子もしくは合成ポリマーで置換することができる。一実施形態では、修飾は、ピリミジンのＣ－５位のものである。これらの修飾は、直接Ｃ－５位でアミド結合を介するか、または他の種類の結合によって生成することができる。

ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野で一般に知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態、例えば、２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｏ－アリル、２’－フルオロ－リボースもしくは２’－アジド－リボース、炭素環状の糖類似体、ａ－アノマー型糖、エピマー型糖（アラビノース、キシロースまたはリキソース等）、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体及び脱塩基ヌクレオシド類似体（メチルリボシド等）を含有することもできる。上記のように、１つ以上のホスホジエステル結合を代替的連結基により置き換えてよい。これらの代替的連結基としては、リン酸塩が、Ｐ（０）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、（０）ＮＲ_２（「アミダート」）、Ｐ（０）Ｒ、Ｐ（０）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられている実施形態が挙げられ、ここで、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈであるか、またはエーテル（－０－）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を任意選択で含有する置換もしくは非置換のアルキル（１－２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド内のすべての結合が同一である必要はない。類似形態の糖、プリン、及びピリミジンの置換は、例えば、ポリアミド骨格のような代替的骨格構造が有利であり得るように、最終生成物を設計する際に有利になり得る。

本開示はさらに、配列番号４～４７及び６８～９９からなる群から選択される２つ以上の核酸配列を含む製剤を提供する。

別の態様では、Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する各ヌクレオシドは、独立して、
５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－フェネチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－チロシルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５－（Ｎ－イミジゾリルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－（Ｎ－Ｒ－トレオニニルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンクロリド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、及び５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジンから選択される。

別の態様では、Ｃ－５修飾ピリミジンを含有するヌクレオシドは、独立して、
５－（Ｎ－１－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、及び５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジンから選択される。

別の態様では、Ｃ－５修飾ピリミジンを含有するヌクレオシドは、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）である。

別の態様では、製剤の２つ以上の核酸分子は各々、独立して、３５～６０ヌクレオチドの長さ、もしくは３５～５０ヌクレオチドの長さ、もしくは４０～５０ヌクレオチドの長さであるか、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０の追加のヌクレオチドをさらに含む。

別の態様では、補体成分３（ＲＩＧ－Ｉ）タンパク質は、ヒト補体成分３（ＲＩＧ－Ｉ）タンパク質である。

アプタマーを含む医薬組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される少なくとも１つのアプタマーと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と、含む医薬組成物を提供する。好適な担体は、ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓにより出版されている“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｔｗｅｎｔｙ－ｆｉｒｓｔＥｄｉｔｉｏｎ”に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に記載のアプタマーは、任意の薬学的に許容される剤形で使用することができ、これには、注射用剤形、液体分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム剤、凍結乾燥製剤、乾燥粉末、錠剤、カプセル、放出制御製剤、速溶性（ｆａｓｔｍｅｌｔ）製剤、遅延放出製剤、徐放性製剤、パルス放出製剤、即放性と放出制御の混合型製剤等が含まれるが、これらに限定されない。具体的には、本明細書に記載のアプタマーは、（ａ）硝子体内、経口、肺、静脈内、動脈内、髄腔内、関節内、直腸、点眼、結腸、非経口、大槽内、腟内、腹腔内、局所、口腔、経鼻、及び外用投与のいずれかから選択される投与用に製剤化すること、（ｂ）液体分散液、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム剤、錠剤、小袋及びカプセルのいずれかから選択される剤形に製剤化すること、（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥粉末、速溶性（ｆａｓｔｍｅｌｔ）製剤、放出制御製剤、遅延放出製剤、徐放性製剤、パルス放出製剤、及び即放性と放出制御の混合型製剤のいずれかから選択される剤形に製剤化すること、または（ｄ）それらの任意の組み合わせで製剤化すること、が可能である。

非経口、皮内、または皮下の適用に使用される溶液もしくは懸濁液は、以下の成分のうち１つ以上を含むことができる：（１）注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の無菌希釈剤、（２）ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤、（３）アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、（４）エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤、（５）酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等の緩衝剤、及び（５）塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張性調節用薬剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジもしくは複数用量バイアルに密封することができる。

注射使用に好適な医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液、及び無菌の注射用の溶液もしくは分散液の用時調製のための無菌粉末が含まれ得る。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、ＣｒｅｍｏｐｈｏｒＥＬ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、組成物は無菌であるべきであり、かつ、容易に注射針を通過できる程度に流動性があるべきである。医薬組成物は、製造及び保管の条件下で安定であるべきであり、かつ、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。

用語「安定な」とは、本明細書で使用される場合、対象への投与に好適な状態または条件のままであることを意味する。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びその好適な混合物等を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合に要求される粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、マンニトールまたはソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウム等の無機塩を組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。

無菌注射液は、適切な溶媒に適切な量で入れた活性試薬（例えば、アプタマー）を、上掲成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせと必要に応じて組み合わせ、その後、濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒及び他の任意の所望成分を含有する無菌ビヒクルに、少なくとも１つのアプタマーを組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液調製用の無菌粉末の場合、例示的調製方法には、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれ、そのどちらでも、アプタマーと追加の所望成分との粉末は、それより前のそれらの無菌濾過溶液から得られる。

［００１７６］いくつかの実施形態では、アプタマーは、硝子体内注射用に製剤化される。硝子体内投与のための好適な製剤は、例えば、ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓにより出版されている“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｔｗｅｎｔｙ－ｆｉｒｓｔＥｄｉｔｉｏｎ”に記載されている。眼薬物送達は、例えば、Ｒａｗａｓ－Ｑａｌａｊｉｅｔａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．ＥｙｅＲｅｓ．３７：３４５、Ｂｏｃｈｏｔｅｔａｌ．（２０１２）Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌＲｅｌｅａｓｅ１６１：６２８、Ｙａｓｕｋａｗａｅｔａｌ．（２０１１）ＲｅｃｅｎｔＰａｔ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖ．Ｆｏｒｍｕｌ．５：１、及びＤｏｓｈｉｅｔａｌ．（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２６：１０４において考察されている。いくつかの実施形態では、アプタマーを含む医薬組成物は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１１週間に１回、１２週間に１回、または１２週間に１回より少ない頻度で硝子体内注射により投与される。

経口組成物には一般に、不活性希釈剤または食用担体が含まれる。それらは、例えば、ゼラチンカプセルに密封することも、または圧縮して錠剤にすることもできる。経口治療投与の目的の場合、アプタマーを添加剤と組み合わせて、錠剤、トローチ剤、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤として使用するための液体担体を使用して調製することもでき、ここで、液体担体中の化合物は経口で適用され、口中ですすいで喀出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性のある結合剤、及び／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。

吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素等のガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーからのエアロゾルスプレー、噴霧液体、または好適なデバイスからの乾燥粉末の形態で送達される。経粘膜または経皮による投与の場合、透過対象の障壁に適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般に当該技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与の場合は、洗浄液、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、点鼻薬または坐剤の使用により達成することができる。経皮投与の場合、活性試薬は、当該技術分野で一般に知られているような軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）、軟膏（ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、またはクリームに製剤化する。試薬はまた、坐剤（例えば、カカオ脂及び他のグリセリド類等の従来の坐薬基剤を用いて）または直腸送達のための停留浣腸の形態で調製することもできる。

いくつかの実施形態では、アプタマーは、体からの急速な排出から保護する担体を用いて調製される。例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達システム等の放出制御製剤を使用することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生物分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者には明らかであろう。材料はまた、ＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。

リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に指向させるリポソームを含む）はまた、薬理学的に許容される担体として使用することもできる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載のような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。

さらに、アプタマーの懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーもまた送達のために使用され得る。任意選択で、懸濁液にはまた、化合物の溶解度を高め、高濃度溶液の調製を可能にするための好適な安定化剤または薬剤が含まれ得る。

場合によっては、投与の簡便性及び投与量の均一性のために、経口または非経口の組成物を投与単位形態で製剤化することが特に都合がよい場合がある。本明細書で使用される場合の投与単位形態とは、治療されるべき対象にとっての単位用量として適している物理的個別単位であって、各単位が、要求される医薬担体と共同で所望の治療効果を生み出すよう計算された所定量のアプタマーを含有しているものを指す。本明細書に記載のアプタマーの投与単位形態の仕様は、特定のアプタマーの特性及び達成すべき特定の治療効果、ならびに個人の治療用のそのような活性薬剤を配合する技術に本質的な制約により決定され、かつ、それらに直接依存する。

少なくとも１つのアプタマーを含む医薬組成物には、１つ以上の医薬品添加剤を含めることができる。そのような添加剤の例としては、結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁剤、甘味料、香味剤、保存剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、及び他の添加剤が挙げられるが、これらに限定されない。そのような添加剤は、当該技術分野で公知である。例示的添加剤としては、（１）様々なセルロース及び架橋ポルビニルピロリドン、微結晶セルロース、例えば、ＡｖｉｃｅｌＰＨ１０１とＡｖｉｃｅｌＰＨＩ０２、ケイ化微結晶セルロース（ＰｒｏＳｏｌｖＳＭＣＣ（商標））、トラガカントガム及びゼラチンが含まれる、結合剤、（２）様々なデンプン、乳糖、乳糖水和物、及び無水乳糖等の充填剤、（３）アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、トウモロコシデンプン、軽度に架橋したポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、及び化工デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、及びそれらの混合物等の崩壊剤、（４）圧縮対象粉末の流動性に対して作用する薬剤が含まれ、また、ステアリン酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素（例えば、Ａｅｒｏｓｉｌ２００）、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルが含まれる、滑沢剤、（５）コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤、（６）ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸とその塩、パラヒドロキシ安息香酸の他のエステル（ブチルパラベン等）、アルコール（エチルアルコールまたはベンジルアルコール等）、フェノール化合物（フェノール等）、または第四級化合物（塩化ベンザルコニウム等）等の保存剤、（７）薬学的に許容される不活性賦形剤（微結晶セルロース、乳糖、リン酸水素カルシウム、糖類、及び／または前述のうちのいずれかの混合物等）等の希釈剤；希釈剤の例として、微結晶セルロース（ＡｖｉｃｅｌＰＨ１０１とＡｖｉｃｅｌＰＨＩ０２等）；乳糖（乳糖水和物、無水乳糖、及びＰｈａｒｍａｔｏｓｅＤＣＬ２１等）；リン酸水素カルシウム（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ等）；マンニトール；デンプン；ソルビトール；ショ糖；及びグルコースが含まれる、（８）任意の天然または人工の甘味料が含まれる甘味剤（ショ糖、サッカリンスクロース（ｓａｃｃｈａｒｉｎｓｕｃｒｏｓｅ）、キシリトール、サッカリンナトリウム、シクラミン酸塩、アスパルタム、及びアセスルファム等）、（９）香味剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味剤、Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ（ＭＡＦＣＯの商標）、バブルガム風味、果実風味等、ならびに（１０）有機酸と炭酸塩または炭酸水素塩のような発泡性対が含まれる発泡剤が挙げられる。好適な有機酸としては、例えば、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、アジピン酸、コハク酸、及びアルギン酸ならびに無水物及び酸性塩が挙げられる。好適な炭酸塩及び炭酸水素塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸グリシンナトリウム、Ｌ－リジン炭酸塩、及びアルギニン炭酸塩が挙げられる。別法として、発泡性対の炭酸水素ナトリウム成分のみが存在し得る。

様々な実施形態では、本明細書に記載される製剤は実質的に純粋である。本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」とは、その活性成分（例えば、アプタマー）が、存在している主要な種である（すなわち、それが、モルベースで、組成物中の他のどの個々の種よりも豊富である）ことを意味する。いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、組成物であって、活性成分が、存在している全巨大分子種のうちの少なくとも約５０パーセント（モルベースで）を構成しているものである。一般に、実質的に純粋な組成物には、組成物中に存在する全巨大分子種のうち約８０％超が含まれる。様々な実施形態では、実質的に純粋な組成物には、組成物中に存在する全巨大分子種のうち少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％が含まれる。様々な実施形態では、活性成分は均質に精製され（汚染種は、従来の検出方法によって組成物で検出することができない）、その組成物が本質的に単一の巨大分子種からなる。

アプタマーを含むキット
本開示は、本明細書に記載のアプタマーのうちいずれかを含むキットを提供する。そのようなキットは、例えば、（１）少なくとも１つのアプタマー、及び（２）溶媒または溶液等の少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含むことができる。追加のキット構成要素には、任意選択で、例えば、（１）本明細書で特定される薬学的に許容される添加剤のうちのいずれか、例えば、安定化剤、緩衝剤等、（２）キット構成要素を保持及び／または混合するための少なくとも１つの容器、バイアルもしくは同様の器具、ならびに（３）送達器具を含めることができる。

ある特定の特徴及び／または実施形態を例示するために以下の実施例を提供する。これらの実施例は、本開示を、記載されている特定の特徴または実施形態に制限するものと解釈されるべきではない。

実施例１：ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する結合特異性を有するアプタマーの選択及び同定
本実施例では、ヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質に対するＤＮＡアプタマーの選択及び生成のための代表的方法を提供する。

候補混合物の調製
部分的にランダム化されているｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドの候補混合物を、ビオチン化ｓｓＤＮＡ鋳型にアニールしたＤＮＡプライマーのポリメラーゼ伸長によって調製した（下表１に示す）。候補混合物には、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及び５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン三リン酸（ＰＰｄＵＴＰ）を含有する、４０ヌクレオチドのランダム化カセットを含有していた。

Ｂ’＝ビオチン
７５０マイクロリットルのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎＰｌｕｓＵｌｔｒａＬｉｎｋＲｅｓｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ）５０％スラリーを、３．５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１（ＮａＯＨでｐＨ７．５に調整した４０ｍＭのＨＥＰＥＳ（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－エタンスルホン酸）緩衝液、１０２ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．０１％ＴＷＥＥＮ（商標）２０）で１回、及び３．５ｍＬの１６ｍＭＮａＣｌで３回洗浄した。２つのビオチン残基（配列でＢ’として表記）と、４０のランダム化された位置（配列でＮ_４０として表記）とを有する、３０ナノモルの鋳型１（配列番号１）を、洗浄済みＵｌｔｒａＬｉｎｋＳＡビーズに加え、３７℃で３０分間回転させた。次いで、ビーズを１６ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄した。各洗浄の合間に、ビーズを遠心分離により回収した。この時点でビーズは捕捉した鋳型を含有しており、これらを０．７５ｍＬの伸長反応緩衝液［２０ｎｍｏｌのプライマー１（配列番号２）、１ＸＳＱ２０緩衝液（１２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭのＫＣｌ、７ｍＭのＭｇＳＯ_４、６ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．００１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００）、７５ユニットのＫＯＤＸＬＤＮＡポリメラーゼ（ＥＭＤＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）、ならびに０．５ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びＰＰｄＵＴＰを含有］に懸濁した。ビーズを６８℃で２時間インキュベートした。次いで、ビーズを１６ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄した。０．５ｍＬの２０ｍＭＮａＯＨでビーズからアプタマーライブラリーを溶出させた。溶出したライブラリーを、１５μＬの１ＮＨＣｌ及び１０μＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）及び１μＬの１０％ＴＷＥＥＮ－２０で直ちに中和させた。ライブラリーを、ＡＭＩＣＯＮＵｌｔｒａｃｅｌＹＭ－１０フィルターで約０．０９ｍＬまで濃縮し、ライブラリーの濃度を紫外吸収分光法によって決定した。

ヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質のビオチン標識
Ｅ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａＩＩ細胞から精製したタグなしヒトＲＩＧ－ＩＣ末端ドメインタンパク質（アミノ酸７９２～９２５、配列番号５６）を、ＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ，ＥＺ－ＬｉｎｋＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチン）と第一級アミン含有残基との共有結合によるカップリングによってビオチン化した。タンパク質（１４μＬ中２７０ｐｍｏｌ）を、２２倍モル過剰のＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンと混合し、反応物を室温で４５分間インキュベートした。反応完了後、緩衝液を交換し、未反応ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ビオチンを、ＹＭ３フィルター（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を使用して限外濾過によって除去した。交換緩衝液はＳＢ１８Ｔ０．０１であった。

標的タンパク質の固定化
ＳＥＬＥＸのラウンド１からラウンド３及びラウンド７～９のために、ビオチン標識した標的タンパク質を、ＭｙＯｎｅ－ＳＡ常磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅＳＡ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、または以下、ＳＡビーズと呼ぶ）に固定化した。ビーズ（２５０ｍｇ）を２５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で３回洗浄することによって調製した。最後に、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１に１０ｍｇ／ｍＬで懸濁し、使用するまで４℃で保存した。

ＳＥＬＥＸのラウンド４からラウンド６のために、Ｈｉｓタグの付いた生成標的タンパク質をＨｉｓ－ｔａｇＤｙｎａｂｅａｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）常磁性ビーズ（ＭｙＯｎｅＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、または以下、Ｈｉｓビーズと呼ぶ）に固定化した。ビーズ（４０ｍｇ）を、２０ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で３回洗浄することによって調製した。最後に、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１に２．５ｍｇ／ｍＬで懸濁し、使用するまで４℃で保存した。

低解離速度濃縮プロセスによるアプタマー選択
親和性と低解離速度についての選択をもってＳＥＬＥＸ法の合計９ラウンドを完了した。バックグラウンドを抑制するため、及びタンパク質への非特異的結合のあるアプタマーが取得される可能性を減らすため、各ラウンドの前に対抗選択を実施した。対抗選択を以下のとおり実施した。

ラウンド１では、約１ｎｍｏｌｅのＤＮＡを含むＳＢ１８Ｔ０．０１を含有する１００μＬのＤＮＡ候補混合物を９５℃で５分間加熱し、その後、７０℃まで５分間、次いで、４８℃まで５分間冷却した後、３７℃でのブロックに５分間移した。その後、試料を、１０μＬのタンパク質競合混合物（ＳＢ１８Ｔ０．０１中に、０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭのプロトロンビン）、及び０．１ｍｇ（１０μＬ）のＳＡビーズと合わせ、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。

ラウンド２～９では、前のラウンドから得られたＤＮＡ候補混合物の６５μＬの分注（前のラウンドから得られたｅＤＮＡの６５％）を、１６μＬの５ｘＳＢ１８Ｔ０．０１と混合した。試料を９５℃まで３分間加熱し、０．１℃／秒の速度で３７℃まで冷却した。その後、試料を、９μＬのタンパク質競合混合物（ＳＢ１８Ｔ０．０１中に、０．１％ＨＳＡ、１０μＭのカゼイン、及び１０μＭのプロトロンビン）、及び０．１ｍｇ（１０μＬ）のＳＡビーズ（ラウンド２～３、ラウンド７～９）または０．０２５ｍｇ（１０ｕＬ）のＨｉｓビーズ（ラウンド４～６）と合わせ、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去した。

最初の対抗選択に続いて、ラウンド１の選択工程のために標的タンパク質をＳＡビーズに事前に固定化した。これを達成するために、０．５ｍｇのタンパク質ＳＡビーズを、１００ｐｍｏｌｅの短ヘアピンＲＮＡ（以下、ＨＰ１０と呼ぶ）と予混合した５０ｐｍｏｌｅの標的タンパク質と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で洗浄することにより未結合標的を除去した。対抗選択されたＤＮＡ候補混合物（１００μＬ）をビーズに加え、混合しながら３７℃で６０分間インキュベートした。最初のラウンドでは低解離速度濃縮プロセスは使用せず、ビーズは、１００μＬのビオチン洗浄（ＳＢ１８Ｔ０．０１中に２５μＭのビオチン）で２回、及び１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で３回、簡易洗浄された。洗浄に続き、８５μＬの２ｍＭＮａＯＨを加え、混合しながら３７℃で５分間インキュベートすることによってビーズから結合したアプタマーを溶出させた。ビーズの磁気分離後、アプタマー含有溶出液（８０μＬ）を新たなチューブに移し、２０μＬの中和緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭのＨＣｌ）を加えて溶液を中和させた。

ラウンド２～９では、ＤＮＡ候補混合物及び以下に記載の標的タンパク質を用いて選択を実施し、並行して、ＤＮＡ候補混合物は用いるが、標的タンパク質は用いずに同一の選択を実施した。標的タンパク質を含む試料（シグナルＳ）のＰＣＲと、標的タンパク質を含まない試料（バックグラウンドＢ）のＰＣＲから取得されたＣｔ値の比較を、次ラウンドでの標的濃度を減少させるための指標として使用した。デルタＣｔ値が４を超えるが８未満であった場合は、次ラウンドにおいて標的タンパク質を３分の１に減らした。デルタＣｔ値が８を超えた場合は、次ラウンドにおいて標的を１０分の１に減らした。

ラウンド２では、標識された標的タンパク質（１０μＬ中５ｐｍｏｌｅ）を、２５ｐｍｏｌｅのＨＰ１０及び４０μＬの対抗選択されたＤＮＡ候補混合物と混合し、３７℃で１５分間インキュベートした。低解離速度濃縮プロセスを、５０μＬの１０ｍＭデキストラン硫酸を加え、その後、直ちに０．１ｍｇのＳＡビーズを加えることにより開始した。これを、混合しながら３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ビーズを、１００μＬのビオチン洗浄で２回、及び１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で３回洗浄した。１００μＬの過塩素酸ナトリウムを加え、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートすることによってビーズからアプタマー鎖を溶出させた。ビーズを磁気分離によって除去し、１００μＬのアプタマー溶出液を新たなチューブに移した。
ラウンド３及びラウンド７～９を、ラウンド２で記載されているように実施したが、ただし、標的タンパク質の量は、ラウンド７では１．６ｐｍｏｌｅ、ラウンド８では０．５ｐｍｏｌｅ、及びラウンド９では０．１６ｐｍｏｌｅであった。ＳＡビーズを加える前に、デキストラン硫酸を１０分間（ラウンド３）、４５分間（ラウンド７）、１２０分間（ラウンド８及び９）加えた。

ラウンド４～６を、Ｈｉｓタグ付き標的タンパク質を使用して実施した。ラウンド４では、標的（１０μＬ中１．６ｐｍｏｌｅ）を、２５ｐｍｏｌｅのＨＰ１０及び４０μＬの対抗選択されたＤＮＡ候補混合物と混合し、混合しながら３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、低解離速度濃縮プロセスを、５０μＬの１０ｍＭのデキストラン硫酸を加えることにより開始し、混合物を、混合しながらさらに２０分間インキュベートした。標的タンパク質－アプタマー複合体を捕捉するためにＨｉｓビーズ（０．０２５ｍｇ）を加えた（混合しながら３７℃にて１５分間インキュベーション）。その後、ビーズを、１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で５回洗浄した。１００μＬの過塩素酸ナトリウムを加え、混合しながら３７℃で１０分間インキュベートすることによってビーズから結合したアプタマーを溶出させた。ビーズを磁気分離によって除去し、１００μＬのアプタマー溶出液を新たなチューブに移した。

ラウンド５及び６を、ラウンド４のように実施したが、ただし、３０分間のデキストランチャレンジを使用した。

ラウンド２～９では、過塩素酸溶出の後、０．０６２５ｍｇ（２５μＬ）の、プライマー２（配列番号３）と予め結合させたＳＡビーズ（以下、プライマービーズと呼ぶ）で１００μＬのアプタマー溶出液を捕捉し、振盪しながら５０℃で１０分間インキュベートし、続いて、振盪しながら２５℃でのインキュベーションを１０分間行った。ビーズを１００μＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、及び１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。結合したアプタマーを８０μＬの水で溶出させ、７５℃で２分間インキュベートした。ビーズを磁気分離によって除去し、８０μＬのアプタマー溶出液を新たなチューブに移した。プライマービーズは、２０ｍｇのＳＡビーズ（２ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を２ｍＬの２０ｍＭＮａＯＨで１回、２ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回洗浄したもの）を、０．７５ｍＬの１ＭＮａＣｌ、０．０１％ｔｗｅｅｎ－２０中に再懸濁し、４ｎｍｏｌｅのプライマー２（配列番号３）を加えることによって調製した。混合物を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ビーズを１ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、及び１ｍＬの１６ｍＭＮａＣｌで２回洗浄した。ビーズを５ＭＮａＣｌ、０．０１％ｔｗｅｅｎ－２０中に２．５ｍｇ／ｍｌとなるよう再懸濁した。

アプタマーの増幅及び精製
各ラウンドからの選択されたアプタマーＤＮＡをＱＰＣＲにより増幅させ、定量した。１２μＬのＱＰＣＲＭｉｘ（１０ＸＫＯＤＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＢｕｆｆｅｒ；Ｎｏｖａｇｅｎ＃７１１５７の５Ｘ希釈、２５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５μＭのフォワードＰＣＲプライマー（プライマー１、配列番号２）、５μＭのビオチン化リバースＰＣＲプライマー（プライマー２、配列番号３）、５ＸＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、０．０７５Ｕ／μＬのＫＯＤＸＬＤＮＡポリメラーゼ、及び１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ）に、４８μＬのＤＮＡを加え、Ｂｉｏ－ＲａｄＭｙＩＱＱＰＣＲ装置で以下のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにかけた：９６℃で１５秒、５５℃で１０秒、及び７１℃で３０分を１サイクル；続いて、９６℃で１５秒、７１℃で１分を３０サイクル。装置のソフトウェアで定量を実施し、標的タンパク質を含む場合と含まない場合の選択されたＤＮＡのコピー数を比較して、シグナル／バックグラウンド比を決定した。

増幅後、ＰＣＲ産物をビオチン化アンチセンス鎖によりＳＡビーズに捕捉した。２５ｍＬのＳＡビーズ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、２５ｍＬの２０ｍＭＮａＯＨで１回、２５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１で２回洗浄して２５ｍＬのＳＢ１８Ｔ０．０１に再懸濁し、４℃で保存した。２５μＬのＳＡビーズ（ＳＢ１８Ｔ０．０１中に１０ｍｇ／ｍＬ）を、５０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物に加え、混合しながら２５℃で５分間インキュベートした。「センス」鎖は、１００μＬの２０ｍＭＮａＯＨを加えて、混合しながら２５℃で１分間インキュベートすることによってビーズから溶出させた。溶出した鎖を廃棄し、ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄した。

ＰＰｄＵＴＰを含有するアプタマーセンス鎖を、固定化したアンチセンス鎖からのプライマー伸長により調製した。４０μＬのプライマー伸長反応混合物（１Ｘプライマー伸長緩衝液（１２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、７ｍＭのＭｇＳＯ_４、６ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１％ＴＲＩＴＯＮＸ－１００及び０．００１％ウシ血清アルブミン）、３μＭのフォワードプライマー（プライマー１、配列番号２）、０．５ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びＰＰｄＵＴＰ、ならびに０．０１５Ｕ／μＬのＫＯＤＸＬＤＮＡポリメラーゼ）中にビーズを懸濁し、混合しながら７１℃で３０分間インキュベートした。ビーズをＳＢ１８Ｔ０．０１で２回、１６ｍＭのＮａＣｌで１回洗浄し、８５μＬの２０ｍＭＮａＯＨを加え、混合しながら３７℃で１分間インキュベートすることによってビーズからアプタマー鎖を溶出させた。磁気分離後に８０μＬのアプタマー溶出液を新たなチューブに移し、２０μＬの８０ｍＭＨＣｌで中和させ、５μＬの０．１ＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で緩衝した。

選択の厳密性とフィードバック
選択ステップの相対的標的タンパク質濃度を、各ラウンドでＱＰＣＲシグナル（ΔＣｔ）に応じて以下の規則に従って下げた：
ΔＣｔ＜４の場合、［Ｐ］_{（ｉ＋１）}＝［Ｐ］_（ｉ）
４≦ΔＣｔ＜８の場合、［Ｐ］_{（ｉ＋１）}＝［Ｐ］_（ｉ）／３．２
ΔＣｔ≧８の場合、［Ｐ］_{（ｉ＋１）}＝［Ｐ］_（ｉ）／１０

式中、［Ｐ］＝タンパク質濃度、及びｉ＝現在のラウンド番号

各選択ラウンドの後で、濃縮されたＤＮＡ混合物の収束状態を決定した。１０μＬの二本鎖ＱＰＣＲ産物を、１ＸＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ含有４ｍＭＭｇＣｌ_２で２００μＬに希釈した。二本鎖オリゴヌクレオチドの複合体混合物のハイブリダイゼーション時間を測定するＣ_０ｔ分析を使用して、試料を収束について分析した。試料を、以下のプロトコルに従ってサーマルサイクラーにかけた：９８℃で１分、８５℃で１分を３サイクル；９８℃で１分、次いで、８５℃で３０分を２サイクル。この８５℃で３０分の間に、５秒間隔で蛍光画像を測定した。蛍光強度を時間の対数の関数としてプロットしたところ、各ＳＥＬＥＸラウンドでハイブリダイゼーション速度の増加が観察され、配列の収束を示している。

濃縮プールの配列決定とアプタマーの同定
ＳＥＬＥＸの９ラウンドの後、ラウンド７及びラウンド９からの収束プールを配列決定した。配列準備を以下のとおり実施した。固有のバーコード／インデックス配列（各プールの固有の配列識別子）を含有するＳＥＬＥＸライブラリー特異的プライマーを使用して、プールをＰＣＲで増幅させた。個々のＰＣＲ産物を、Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）アッセイを使用して定量し、等モル濃度で合わせ、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５遠心式フィルターデバイス（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮／緩衝液交換を行った。その後、混合物をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で精製し、溶出液を、ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ－０．５遠心式フィルターデバイスを使用して濃縮し、ＰＡＧＥで視覚化して最終混合物のサイズ、純度及び収量を確認した。試料は、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔＰＧＭシーケンシングのためにＳｅｑＷｒｉｇｈｔＧｅｎｏｍｉｃＳｅｒｖｉｃｅｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）に提出された。配列のカウント／コピー数を決定し、ローカルアラインメントアルゴリズムを使用して共通収束パターンを特定するという特注ソフトウェアを使用して、４０，０００超の配列を含有する各配列プールから３８４をランダムに選択し、収束について分析した。プール内で表現／コピー数が最も大きい配列、及びあらゆる収束パターンから少なくとも１つの配列を、さらなる特徴付けのために選択した。

配列パターンの１ａ及び１ｂは、最初に、配列１４８３２～５５（配列番号６８）、及び１４８３３～１４９（配列番号６９）の４０ヌクレオチドのランダム領域から同定された。パターン１ａを有する配列及びそれらの同等物（差異５％未満）は、３つの保存された領域を含有しており、ラウンド７のプールの４％、ラウンド９のプールの１３％を占めていた。配列パターン１において見られる３パターンのうちの２つまたは３パターンのうちの１つを含有したラウンド７及びラウンド９のプールにおいて追加の配列を同定した。特定のアプタマーの配列を下表２に示す。配列パターンを下表３に示す。特定のアプタマーの４０ヌクレオチドのランダム領域を有する配列パターンのアラインメントを図１Ａ、図Ｂ、図Ｄ、及び図Ｆに示す。

アプタマー合成
結合能の決定のため、個々のアプタマーを固相合成によって調製した。固相合成に使用したアミダイト試薬の修飾デオキシウリジン－５－カルボキサミドを以下により調製した：５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－５－トリフルオロエトキシカルボニル－２’－デオキシウリジン（Ｎｏｍｕｒａｅｔａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：２７８４）と、適切な［１－ナフチルメチルアミン］第一級アミンとの縮合（ＲＮＨ_２，１．２当量；Ｅｔ_３Ｎ、３当量；アセトニトリル；６０℃；４時間）；２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトによる３’－Ｏ－ホスフィチジル化（３’－Ｏ－ｐｈｏｐｈｉｔｉｄｙｌａｔｉｏｎ）（１．２当量；ｉＰｒ_２ＥｔＮ、３当量；ＣＨ_２Ｃｌ_２；－１０～０℃；４時間）、及び中性シリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによる精製（Ｓｔｉｌｌ，ｅｔａｌ．（１９７８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４３：２９２３）。ホスホロアミダイト法（ＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ（１９８１）ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２２：１８５９）を、本明細書に記載される固有の塩基修飾を説明するためにプロトコルにいくつかの調整を加えて使用して、固相合成によってアプタマーを調製した。脱トリチル化を、１０％ジクロロ酢酸含有トルエンを４５秒用いて達成し；カップリングを、アセトニトリル：ジクロロメタン（１：１）中の０．１Ｍのホスホロアミダイト、５－ベンジルメルカプトテトラゾールで活性化させ、５分間３回反応させて達成し；キャッピングと酸化を装置ベンダーの推奨事項に従って実施した。脱保護は、Ｐａｒｒステンレス鋼リアクターで最適化された圧力、時間、及び温度の下、気体状のアンモニアまたはメチルアミンによりもたらされた。生成物を脱イオン水（ｄＩｗａｔｅｒ）で好適な９６ウェルプレートに溶出させ、ＬＣＭＳでの特徴付け用に統計的に検体採取し（√Ｎ＋１）、ＵＶ分光光度法で定量し、緩衝水溶液中でタンパク質結合親和性について試験した。

表３において、Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｚは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、Ｖは、Ｃ、ＡまたはＧであり、Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、未修飾のＣ、ＧまたはＡであり、Ｑは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＧであり、Ｍは、ＣまたはＡであり、ｎは、独立して、各出現について、０または１である。

実施例２：ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対するアプタマーの平衡結合定数（Ｋ_ｄ）
本実施例では、アプタマー－ＲＩＧ－Ｉタンパク質の結合親和性を測定するため、及びＫ_ｄを決定するために本明細書で使用される方法を提供する。アプタマー１４８３２－５５＿３（配列番号４）、１４８３３－１０＿３（配列番号１７）、及び下表４に示される１４８３２－５５＿３の切断型の結合親和性を決定した。簡単に言えば、ＲＩＧ－ＩＣＴＤへの結合についての電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）によって、ならびに野生型全長ＲＩＧ－Ｉ、ＲＩＧ－Ｉ－変異体、及び他のＲＩＧ－Ｉ切断型への結合についてのフィルター結合アッセイによって、修飾アプタマーの結合定数（Ｋ_ｄ値）を決定した。結合アッセイに使用されるＲＩＧ－Ｉタンパク質をＥ．ｃｏｌｉＲｏｓｅｔｔａＩＩ細胞から精製した。修飾アプタマーのＫ_ｄ値を、２０％グリセロールと１ｍＭのＤＴＴを添加したＳＢ１８Ｔ０．０１緩衝液中（ＥＭＳＡ）または１ｍＭのＤＴＴを添加したＳＢ１８Ｔ０．０１中（フィルター結合）で測定した。修飾アプタマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）及びγ－［^３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）を使用して５’末端標識した。放射標識アプタマー（２０，０００～４０，０００ＣＰＭ、約０．０３ｎＭ）を、１０^－９～１０^－１４Ｍ（ＥＭＳＡ）または１０^－７～１０^－１２Ｍ（フィルター結合）の範囲の様々な濃度のＲＩＧ－Ｉタンパク質と混合し、３７℃で４０分間インキュベートした。

ＥＭＳＡの場合、結合した複合体を、０．５ＸＴＢＥ緩衝液（４４．５ｍＭのＴｒｉｓ塩基、４４．５ｍＭのホウ酸、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））中で１２０Ｖにて４５分間実施した１０％ＴＢＥゲル上で遊離ＤＮＡから分離した。ゲルを、ホスホイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）スクリーンに－２０℃で一晩曝露し、結合アプタマーの割合をホスフォイメージャー（ＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ９５００，ＧＥ）で定量し、データをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で分析した。

フィルター結合の場合、結合した複合体をＺｏｒｂａｘビーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で分割し、Ｄｕｒａｐｏｒｅフィルタープレート（ＥＭＤＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に捕捉させ、結合アプタマーの割合をホスフォイメージャー（ＴｙｐｈｏｏｎＦＬＡ９５００，ＧＥ）で定量し、データをＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（ＧＥ）で分析した。

結合親和性を決定するため、方程式：
ｙ＝（最大－最小）（タンパク質）／（Ｋ_ｄ＋タンパク質）＋最小、を使用してデータを当てはめ、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍバージョン７．００を使用してプロットした。

結合結果を表５に示す。結合アッセイに使用されるＲＩＧ－Ｉタンパク質のアミノ酸配列を表６に示し、またＶｅｌａｅｔａｌ．ＴｈｅＴｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃＢａｓｉｓｆｏｒＶｉｒａｌＲＮＡＤｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅＲＩＧ－ＩＩｎｎａｔｅＩｍｍｕｎｅＳｅｎｓｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（５１）：４２５６４，２０１２からの特定のＲＩＧ－Ｉタンパク質の略図を図２Ａに示す。

Claims

ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーであって、配列５’－ＰＥＰＳＺＶ－３’（配列番号４９）
［ここで、
Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、
Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、
Ｓは、ＧまたはＣであり、
Ｚは、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、
Ｖは、Ｃ、Ａ、またはＧである］
を含み、かつ
少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さである、前記アプタマー。
ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーであって、配列５’－ＰＥＰＳＦＰ－３’（配列番号５０）
［ここで、
Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、
Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、
Ｓは、ＧまたはＣであり、
Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、未修飾のＣ、Ｇ、またはＡである］
を含み、かつ
少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さである、前記アプタマー。
ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーであって、配列５’－ＰＥＰＳＺＶ－３’（配列番号４９）及び配列５’－ＰＥＰＳＦＰ－３’（配列番号５０）
［ここで、
Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、
Ｅは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、
Ｓは、独立して、各出現について、ＧまたはＣであり、
Ｚは、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、
Ｖは、Ｃ、ＡまたはＧであり、かつ
Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、未修飾のＣ、ＧまたはＡである］
を含み、
少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さである、前記アプタマー。
ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーであって、配列５’－ＰＥＰＳＺＶ－３’（配列番号４９）、配列５’－ＰＥＰＳＦＰ－３’（配列番号５０）、及び配列５’－ＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５１）
［ここで、
Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、
Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、
Ｓは、ＧまたはＣであり、
Ｚは、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、
Ｖは、Ｃ、ＡまたはＧであり、かつ
Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、未修飾のＣ、ＧまたはＡである］
を含み、
少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さである、前記アプタマー。
ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーであって、配列５’－ＰＧＰＧＰＣＡ_ｎＰＧＰＧＰＰＰＺＡＺＱＱＣ_ｎＺＭＧＰＰＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５２）
［ここで、
Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、
Ｚは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、
Ｑは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＧであり、
Ｍは、ＣまたはＡであり、かつ
ｎは、独立して、各出現について、０または１である］
を含み、
少なくとも３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチドの長さである、前記アプタマー。
Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する各ヌクレオシドが、独立して、
５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－フェネチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－チロシルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５－（Ｎ－イミジゾリルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－（Ｎ－Ｒ－トレオニニルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンクロリド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、及び５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジンから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する各ヌクレオシドが、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載のアプタマー。
前記アプタマーが、配列番号６５の配列を含み、Ｊで表される各ヌクレオシドが５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
前記アプタマーが、配列番号６６の配列を含み、Ｊで表される各ヌクレオシドが５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
前記アプタマーが、配列番号６７の配列を含み、Ｊで表される各ヌクレオシドが５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
前記アプタマーが、配列番号４～４７及び６８～９９から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％同一な配列を含み、Ｊで表される各ヌクレオシドが５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
前記アプタマーが、配列番号４～４７及び６８～９９から選択される配列を含み、Ｊで表される各ヌクレオシドが５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合するアプタマーであって、配列番号４～４７及び６８～９９から選択される配列を含み、Ｊで表される各ヌクレオシドが５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンである、前記アプタマー。
前記アプタマーが、３５～６０ヌクレオチドの長さ、または３５～５０ヌクレオチドの長さ、または４０～５０ヌクレオチドの長さである、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
前記ＲＩＧ－Ｉタンパク質がヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマー。
先行請求項のいずれか１項に記載のアプタマーとＲＩＧ－Ｉタンパク質とを含む、組成物。
前記ＲＩＧ－Ｉタンパク質がヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質である、請求項１６に記載の組成物。
ＲＩＧ－Ｉタンパク質に対する結合親和性を有するアプタマーを選択するための方法であって、
（ａ）候補混合物とＲＩＧ－Ｉタンパク質とを接触させることであって、前記候補混合物が修飾核酸を含み、前記候補混合物の少なくとも１つまたはそれぞれの核酸にある１つ、いくつか、もしくはすべてのピリミジンがＣ－５修飾ピリミジンを含む、前記接触させること、
（ｂ）前記候補混合物を低解離速度濃縮プロセスに曝露させることであって、前記候補混合物中の他の核酸と比べて前記標的分子からの解離の速度が遅い核酸が前記ＲＩＧ－Ｉタンパク質と結合して、核酸－標的分子複合体を形成する、前記曝露させること、
（ｃ）前記候補混合物から低解離速度の核酸を分割すること、
（ｄ）前記低解離速度の核酸を増幅させて、前記ＲＩＧ－Ｉタンパク質への結合能のある低解離速度の核酸配列に富む核酸混合物を生成すること、
を含み、これにより、前記ＲＩＧ－Ｉタンパク質分子に対する低解離速度アプタマーが選択される、前記方法。
前記候補混合物が、配列５’－ＰＥＰＳＺＶ－３’（配列番号４９）を含む核酸を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、Ａ、またはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｚは、Ｃ－５修飾ピリミジンまたはＡであり、Ｖは、Ｃ、Ａ、またはＧである、請求項１８に記載の方法。
前記候補混合物が、配列５’－ＰＥＰＳＦＰ－３’（配列番号５０）を含む核酸を含み、ここで、各Ｐは、独立して、各出現について、Ｃ－５修飾ピリミジンであり、Ｅは、Ｃ－５修飾ピリミジン、ＡまたはＧであり、Ｓは、ＧまたはＣであり、Ｆは、Ｃ－５修飾ピリミジン、Ｃ、Ｇ、またはＡである、請求項１８または１９に記載の方法。
前記候補混合物が、配列５’－ＡＡＰＧＡＰＧＡＧＧ－３’（配列番号５１）を含む核酸を含む、請求項１８～２０のいずれか１項に記載の方法。
各核酸が、独立して、３５～６０ヌクレオチドの長さ、または３５～５０ヌクレオチドの長さ、または４０～５０ヌクレオチドの長さである、請求項１８～２１のいずれか１項に記載の方法。
Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する各ヌクレオシドが、独立して、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ベンジルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－フェネチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＥｄＵ）、５－（Ｎ－チオフェニルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５－（Ｎ－チロシルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｙｒｄＵ）、５－（Ｎ－３，４－メチレンジオキシベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＭＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－４－フルオロベンジルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＦＢｎｄＵ）、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）、５－（Ｎ－イミジゾリルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＩｍｄＵ）、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－イソブチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５－（Ｎ－Ｒ－トレオニニルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＴｈｒｄＵ）、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－トリプタミノカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（３－トリメチルアンモニウム）プロピル］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジンクロリド、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－［１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮａｐｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルメチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－１－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（２ＮＥｄＵ）、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－２－ナフチルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＦｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾフラニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジン、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＢＴｄＵ）、５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－Ｏ－メチルウリジン、及び５－（Ｎ－３－ベンゾチオフェニルエチルカルボキシアミド）－２’－フルオロウリジンから選択される、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
Ｃ－５修飾ピリミジンを含有する各ヌクレオシドが、５－（Ｎ－３－フェニルプロピルカルボキシアミド）－２’－デオキシウリジン（ＰＰｄＵ）である、請求項１８～２２のいずれか１項に記載の方法。
前記ＲＩＧ－Ｉタンパク質がヒトＲＩＧ－Ｉタンパク質である、請求項１８～２４のいずれか１項に記載の方法。