CN112638845A - 改进的蛋白质组学多重测定 - Google Patents

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Abstract

提供了被设计来改进基于蛋白质组学的测定的性能的方法、装置、试剂和试剂盒。此类方法通过以多重测定形式提供背景信号的减少或消除和对蛋白质结合试剂的改进的特异性而在用于研究与开发、诊断学和治疗学的蛋白质组学应用中具有广泛效用。

Description

改进的蛋白质组学多重测定
技术领域
本公开总体上涉及蛋白质组学测定领域，以及经设计以改进所述测定的性能的方法、装置、试剂和试剂盒。此类方法在用于研究与开发、诊断学和治疗学的蛋白质组学应用中具有广泛效用。具体地，提供了以多重测定形式减少或消除背景信号以及提高蛋白质结合试剂的特异性的材料和方法。
背景技术
针对生物样品和其他样品类型中的生理学上重要的分子的检测和定量的诸多测定在科学研究和卫生保健领域是重要的工具。例如，多重阵列测定采用表面结合的探针来检测样品中的靶分子。表面结合的探针可以是能够与来自样品的靶分子结合的寡核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体、亲和体、适体或其他分子(统称为生物聚合物)。这些结合相互作用是在各种不同领域(例如，基因组学、转录组学和蛋白质组学)中使用的许多方法和装置的基础。
测定提供了被设计来除去测定混合物的特定组分的基于溶液的靶标相互作用和分离步骤。然而，许多测定形式的灵敏度和特异性因检测方法在测定期间从由于非特异性缔合产生的信号中解析真信号且产生错误检测信号的能力而受到限制。不管使用何种捕获试剂(例如，抗体或适体)，对于多重测定而言尤其如此。非特异性结合的关键来源之一是与靶分子的非预期的非特异性捕获试剂相互作用或非特异性结合相互作用。本公开描述了消除或减少在基于多重的蛋白质组学测定中观察到的背景信号、同时维持靶标/捕获试剂特异性相互作用的方法。
发明内容
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)使第一稀释液样品与第一适体接触，其中如果所述第一稀释液样品中存在靶分子，则通过所述第一适体与其靶分子的相互作用形成第一适体亲和力复合物；b)使第二稀释液样品与第二适体接触，其中如果所述第二稀释液样品中存在靶分子，则通过所述第二适体与其靶分子的相互作用形成第二适体亲和力复合物；c)分别孵育所述第一稀释液样品和所述第二稀释液样品以允许适体亲和力复合物形成；d)将具有所述第一适体亲和力复合物的所述第一稀释液样品转移至第一混合物，其中所述第一适体亲和力复合物被捕获在所述第一混合物中的固体载体上；e)在步骤d)之后，将所述第二稀释液样品转移至所述第一混合物以形成第二混合物，其中所述第二稀释液的所述第二适体亲和力复合物被捕获在所述第二混合物中的固体载体上；f)检测所述第一适体亲和力复合物和所述第二适体亲和力复合物的所述第一适体和所述第二适体的存在或测定所述第一适体亲和力复合物和所述第二适体亲和力复合物的所述第一适体和所述第二适体的水平，或一种或多种第一适体亲和力复合物和第二适体亲和力复合物的存在或量；其中，所述第一稀释液和所述第二稀释液是同一测试样品的不同稀释液。
在一个方面，所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
在另一个方面，所述第一适体-靶分子亲和力复合物和所述第二适体-靶分子亲和力复合物是非共价复合物。
在另一个方面，所述靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
在另一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或其中是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
在另一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
在另一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
在另一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
在另一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
在另一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
在另一个方面，检测所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的存在或测定所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的水平通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行。
在另一个方面，所述第一适体和/或所述第二适体独立地包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在另一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在另一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在另一个方面，其中所述部分是疏水性部分。
在另一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在另一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在另一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在另一个方面，本文公开的方法还包括使第三稀释液样品与第三适体接触，其中如果所述第三稀释液样品中存在靶分子，则通过所述第三适体与其靶分子的相互作用形成第三适体亲和力复合物；
在另一个方面，将所述第三稀释液样品与所述第一稀释液样品和第二稀释液样品分开孵育以允许所述第三适体与其靶分子的适体亲和力复合物形成。
在另一个方面，本文公开的方法还包括将所述第三稀释液样品转移至所述第二混合物以形成第三混合物，其中第三稀释液的第三适体亲和力复合物被捕获在所述第三混合物中的固体载体上。
在另一个方面，本文公开的方法还包括检测所述第三适体亲和力复合物的第三适体的存在或测定所述第三适体亲和力复合物的第三适体的水平，或所述第三适体亲和力复合物的存在或量；
在另一个方面，所述第三稀释液是与同一测试样品的第一稀释液和第二稀释液不同的稀释液。
在另一个方面，所述第三稀释液是测试样品的选自5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)、15％至30％、15％至25％、约20％；0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)、0.1％至0.8％、0.2％至0.75％、约0.5％；以及0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)、或0.002％至0.008％、0.003％至0.007％、约0.005％的稀释液。
在另一个方面，所述第三适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在另一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在另一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在另一个方面，所述部分是疏水性部分。
在另一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在另一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在另一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)使第一捕获试剂与第一稀释液接触以形成第一混合物，并使第二捕获试剂与第二稀释液接触以形成第二混合物，其中所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂中的每一者各自被固定在固体载体上，并且其中所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂中的每一者对不同的靶分子具有亲和力；b)分别孵育所述第一混合物和所述第二混合物，其中如果所述第一混合物中存在所述第一捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第一混合物中形成第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，其中如果所述第二混合物中存在所述第二捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第二混合物中形成第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；c)以选自以下的顺序将所述亲和力复合物顺序地释放并合并在第四混合物中：(i)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，和(ii)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；d)将第一标签连接至所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物的靶分子；e)使所述标记的第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物与一个或多个固体载体接触，以使得所述标签将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物固定至所述一个或多个固体载体；f)使所述捕获试剂从所述捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；g)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；其中，所述第一稀释液和所述第二稀释液是测试样品的不同稀释液。
在一个方面，所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
在一个方面，所述第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物是非共价复合物。
在一个方面，所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂独立地选自适体或抗体。
在一个方面，所述靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
在一个方面，检测所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的存在或测定所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的水平通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行。
在另一个方面，本文公开的方法还包括使第三捕获试剂与第三稀释液接触以形成第三混合物，其中所述第三捕获试剂被固定在固体载体上，并且其中所述第三捕获试剂对与所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂的靶分子不同的靶分子具有亲和力。
在另一个方面，本文公开的方法还包括将所述第三混合物与所述第一混合物和所述第二混合物分开孵育，其中如果所述第三混合物中存在所述第三捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第三混合物中形成第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物。
在另一个方面，本文公开的方法还包括以选自以下的顺序将所述第三捕获试剂-靶分子亲和力与所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物顺序地释放并合并在所述第四混合物中：(i)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(ii)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iii)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iv)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(v)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；以及(vi)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物。
在一个方面，所述第三稀释液是与同一测试样品的第一稀释液和第二稀释液不同的稀释液。
在一个方面，所述第三稀释液是测试样品的选自5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)、15％至30％、15％至25％、约20％；0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)、0.1％至0.8％、0.2％至0.75％、约0.5％；以及0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)、或0.002％至0.008％、0.003％至0.007％、约0.005％的稀释液。
在另一个方面，本文公开的方法还包括检测所述第三适体亲和力复合物的第三适体的存在或测定所述第三适体亲和力复合物的第三适体的水平，或所述第三适体亲和力复合物的存在或量。
在一个方面，所述适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在一个方面，所述部分是疏水性部分。
在一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)使第一捕获试剂与第一稀释液接触以形成第一混合物，使第二捕获试剂与第二稀释液接触以形成第二混合物，并使第三捕获试剂与第三稀释液接触以形成第三稀释液混合物，其中所述第一捕获试剂、所述第二捕获试剂和所述第三捕获试剂中的每一者各自被固定在固体载体上，并且其中所述第一捕获试剂、所述第二捕获试剂和所述第三捕获试剂中的每一者对不同的靶分子具有亲和力；b)分别孵育所述第一混合物、所述第二混合物和所述第三混合物，其中如果所述第一混合物中存在所述第一捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第一混合物中形成第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，其中如果所述第二混合物中存在所述第二捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第二混合物中形成第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，并且其中如果所述第三混合物中存在所述第三捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第三混合物中形成第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；c)以选自以下的顺序将所述亲和力复合物顺序地释放并合并在第四混合物中：(i)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(ii)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iii)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iv)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(v)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；以及(vi)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；d)将第一标签连接至所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物的靶分子；e)使所述标记的第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物与一个或多个固体载体接触，以使得所述标签将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物固定至所述一个或多个固体载体；f)使所述捕获试剂从所述捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；g)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；其中，所述第一稀释液、所述第二稀释液和所述第三稀释液是测试样品的不同稀释液。
在一个方面，所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
在一个方面，所述第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物是非共价复合物。
在一个方面，所述第一捕获试剂、所述第二捕获试剂和所述第三捕获试剂独立地选自适体或抗体。
在一个方面，所述靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
在一个方面，检测所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的存在或测定所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的水平通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行。
在一个方面，所述适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在一个方面，所述部分是疏水性部分。
在一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或其中是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
在一个方面，所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
本发明的前述和其它目的、特征和优点将从以下详细描述变得更加显而易见，所述详细描述参考附图进行。
附图说明
图1.可掺入适体中的某些示例性的5-位修饰的尿苷和胞苷。
图2.可在尿苷的5-位存在的某些示例性修饰。C-5修饰的化学结构包括将修饰连接至尿苷的5-位的示例性酰胺键联。所示的5-位部分包括苄基部分(例如，Bn、PE和PP)、萘基部分(例如，Nap、2Nap、NE)、丁基部分(例如，iBu)、氟苄基部分(例如，FBn)、酪氨酰基部分(例如，Tyr)、3,4-亚甲基二氧基苄基(例如，MBn)、吗啉代部分(例如，MOE)、苯并呋喃基部分(例如，BF)、吲哚部分(例如，Trp)和羟丙基部分(例如，Thr)。
图3.可在胞苷的5-位存在的某些示例性修饰。C-5修饰的化学结构包括将修饰连接至胞苷的5-位的示例性酰胺键联。所示的5-位部分包括苄基部分(例如，Bn、PE和PP)、萘基部分(例如，Nap、2Nap、NE和2NE)和酪氨酰基部分(例如，Tyr)。
图4.提供生物样品的稀释液组、其相应稀释液的相应捕获试剂组的示例性概览，以及双捕获系统(catch-1和catch-2)的总体概览。可从生物样品创建两个不同的稀释液组，包括生物样品的Z％稀释液或DIL4和生物样品的X％稀释液或DIL1，其中Z大于X(或Z是比X稀释度更大的稀释度)。每种稀释液均具有与一组特定蛋白质结合的其自己的一组相应的捕获试剂(对于DIL1为A3且对于DIL4为A1)。将两个不同的稀释液组从测定的catch-1步骤一起转移至测定的catch-2步骤。
图5.提供生物样品的稀释液组、其相应稀释液的相应捕获试剂组的示例性概览，以及双捕获系统(catch-1和catch-2)的总体概览。可从生物样品创建三个不同的稀释液组，包括生物样品的Z％稀释液或DIL3、生物样品的Y％稀释液或DIL2和生物样品的X％稀释液或DIL1，其中Z大于Y，并且Y大于X(或Z是比Y稀释度更大的稀释度，并Y稀释度是比X稀释度更大的稀释度)。每种稀释液均具有与一组特定蛋白质结合的其自己的一组相应的捕获试剂(对于DIL1为A3、对于DIL2为A2且对于DIL3为A1)。
图6.提供所制备的三个不同的血浆稀释液组的概览：0.005％稀释液(DIL1)、0.5％稀释液(DIL2)和20％稀释液(DIL3)，其中分别测量了相对高丰度蛋白质、中等丰度蛋白质和低丰度蛋白质。此外，DIL1、DIL2和DIL3中的每一者的适体组分别是A1、A2和A3。对于总计5,272个不同的适体，A3组适体具有4,271个不同的适体(或适体总数的约81％)，A2组具有828个不同的适体(或适体总数的约16％)，并且A1组具有173个不同的适体(适体总数的约3％)。将三个不同的稀释液组从测定的catch-1步骤一起转移至测定的catch-2步骤。
图7.提供生物样品的稀释液组、其相应稀释液的相应捕获试剂组的示例性概览，以及顺序双捕获系统(catch-1和catch-2)的总体概览。可从生物样品创建三个不同的稀释液组，包括生物样品的Z％稀释液或DIL3、生物样品的Y％稀释液或DIL2和生物样品的X％稀释液或DIL1，其中Z大于Y，并且Y大于X(或Z是比Y稀释度更大的稀释度，并Y稀释度是比X稀释度更大的稀释度)。每种稀释液均具有与一组特定蛋白质结合的其自己的一组相应的捕获试剂(对于DIL1为A3、对于DIL2为A2且对于DIL3为A1)。
图8.提供所制备的三个不同的血浆稀释液组的概览：0.005％稀释液(DIL1)、0.5％稀释液(DIL2)和20％稀释液(DIL3)，其中分别测量了相对高丰度蛋白质、中等丰度蛋白质和低丰度蛋白质。此外，DIL1、DIL2和DIL3中的每一者的适体组分别是A1、A2和A3。对于总计5,272个不同的适体，A3组适体具有4,271个不同的适体(或适体总数的约81％)，A2组具有828个不同的适体(或适体总数的约16％)，并且A1组具有173个不同的适体(适体总数的约3％)。将三个不同的稀释液组从测定的catch-1步骤顺序转移至测定的catch-2步骤。
图9.提供生物样品的稀释液组、其相应稀释液的相应捕获试剂组的示例性概览，以及双捕获系统(catch-1和catch-2)的总体概览。可从生物样品创建两个不同的稀释液组，包括生物样品的Z％稀释液或DIL4和生物样品的X％稀释液或DIL1，其中Z大于X(或Z是比X稀释度更大的稀释度)。每种稀释液均具有与一组特定蛋白质结合的其自己的一组相应的捕获试剂(对于DIL1为A3且对于DIL4为A1)。将两个不同的稀释液组从测定的catch-1步骤顺序转移至测定的catch-2步骤。
图10.针对所进行的测定绘制条件1(即，所有三个稀释液组DIL1、DIL2和DIL3)的适体信号与条件2、3和4(表2；其中所述稀释液组中仅一个与空白一起存在)中的每一者的适体信号的比率的累积分布函数(CDF)，其中所有三个稀释液组都从测定的catch-1部分一起转移至测定的catch-2部分。适体信号的比率由源自杂交阵列的相对荧光单位(RFU)表示。
图11.针对所进行的测定绘制条件1(即，所有三个稀释液组DIL1、DIL2和DIL3)的适体信号与条件2、3和4(其中所述稀释液组中仅一个与空白一起存在)中的每一者的适体信号的比率的累积分布函数(CDF)，其中三个稀释液组从测定的catch-1部分顺序转移至测定的catch-2部分。适体信号的比率由源自杂交阵列的相对荧光单位(RFU)表示。
图12.对于40％、20％、10％和5％的稀释度中的每一者(X轴)，线性范围(Y轴；右侧)连同中值S/B(Y轴；左侧)的分析物数量的图形表示。在生物样品的20％稀释度下，观察到具有最大中值S/B的线性范围的最大分析物数量(其中两条线相交)。
具体实施方式
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,由Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(编辑),The Encyclopedia of Molecular Biology,由BlackwellScience Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及Robert A.Meyers(编辑),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。
除非另外说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有如本公开内容所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另外清楚地指示，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数形式的指代物。“包含A或B”是指包括A、或B、或A和B。应进一步理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值均为近似值，并且被提供用于描述。
此外，本文提供的范围应理解为所述范围内的所有值的简写。例如，1至50的范围应理解为包括来自由以下各项组成的组的任何数字、数字组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(以及其分数，除非上下文另外清楚地规定)。除非另外指出，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括列举的范围内的任何整数值，并且当适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。因此，除非另外指出，否则本文列举的涉及任何物理特征的任何数字范围如聚合物亚基、大小或厚度应该被理解为包括列举的范围内的任何整数。如本文所用，除非另外指出，否则“大约”或“基本上由......组成”意指所指示的范围、值或结构的±20％。如本文所用，术语“包括”和“包含”是开放式的并且同义使用。
尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可于本公开的实践或测试中，但以下描述适合的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其它参考文献以引用的方式整体并入。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。此外，所述材料、方法和示例仅是说明性的而非意图具有限制性。
如本文所用，术语“核苷酸”是指核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或其修饰形式以及其类似物。核苷酸所包括的物质包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)。如本文所用，除非另外明确指出，否则术语“胞苷”通常是指包含胞嘧啶碱基的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核糖核苷酸。术语“胞苷”包括2'-修饰的胞苷，如2'-氟、2'-甲氧基等。类似地，除非另外明确指出，术语“经修饰的胞苷”或特定经修饰的胞苷也指包含经修饰的胞嘧啶碱基的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核糖核苷酸(如2'-氟、2'-甲氧基等)。除非另外明确指出，否则术语“尿苷”通常是指包含尿嘧啶碱基的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核糖核苷酸。术语“尿苷”包括2'-修饰的尿苷，如2'-氟、2'-甲氧基等。类似地，除非另外明确指出，术语“经修饰的尿苷”或特定经修饰的尿苷也指包含经修饰的尿嘧啶碱基的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或经修饰的核糖核苷酸(如2'-氟，2'-甲氧基等)。
如本文所用，术语“C-5修饰的甲酰胺胞苷”或“胞苷-5-甲酰胺”或“5-位修饰的胞苷”或“C-5修饰的胞苷”是指在胞苷的C-5位具有甲酰胺(-C(O)NH-)修饰的胞苷，包括但不限于本文所示的那些部分(RX1)。示例性C-5修饰的甲酰胺胞苷包括但不限于5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(称为“BndC”并且在图3中示出)；5-(N-2-苯基乙基甲酰胺)-2′-脱氧胞苷(称为“PEdC”并且在图3中示出)；5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(称为“PPdC”并且在图3中示出)；5-(N-1-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(称为“NapdC”并且在图3中示出)；5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(称为“2NapdC”并且在图3中示出)；5-(N-1-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(称为“NEdC”并且在图3中示出)；5-(N-2-萘基-2-乙基甲酰胺)-2'-脱氧胞苷(称为“2NEdC”并且在图3中示出)；以及5-(N-酪氨酰基甲酰胺)-2′-脱氧胞苷(称为TyrdC并且在图3中示出)。在一些实施方案中，C5修饰的胞苷(例如呈其三磷酸形式)能够通过聚合酶(例如，KOD DNA聚合酶)掺入寡核苷酸中。
本文所述的C-5修饰的胞苷的化学修饰也可单独地或以任何组合与2'-位糖修饰、在环外胺的修饰和4-硫代尿苷的取代等组合。
如本文所用，术语“C-5修饰的甲酰胺胞嘧啶”或“胞嘧啶-5-甲酰胺”或“5-位修饰的胞嘧啶”或“C-5修饰的胞嘧啶”是指在胞嘧啶的C-5位置具有甲酰胺(-C(O)NH-)修饰的胞嘧啶碱基，包括但不限于本文所示的那些部分(RX1)。示例性的C-5修饰的甲酰胺胞嘧啶包括但不限于图3中所示的经修饰的胞苷。
如本文所用，术语“C-5修饰的尿苷”或“5-位修饰的尿苷”是指在尿苷的C-5位具有甲酰胺(-C(O)NH-)修饰的尿苷(通常为脱氧尿苷)，例如，如图1中所示。在一些实施方案中，C5修饰的尿苷(例如呈其三磷酸形式)能够通过聚合酶(例如，KOD DNA聚合酶)掺入寡核苷酸中。非限制性的示例性5-位修饰的尿苷包括：
5-(N-苄基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(BndU)，
5-(N-苄基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-苄基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-苯乙基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(PEdU)，
5-(N-苯硫基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThdU)，
5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(iBudU)，
5-(N-酪氨酰基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(TyrdU)，
5-(N-3,4-亚甲基二氧基苄基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(MBndU)，
5-(N-4-氟苄基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(FBndU)，
5-(N-3-苯基丙基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(PPdU)，
5-(N-咪唑基乙基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(ImdU)，
5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-异丁基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(TrpdU)，
5-(N-R-苏氨酰基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(ThrdU)，
5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-色氨基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-[1-(3-三甲基铵)丙基]甲酰胺)-2'-脱氧尿苷氯化物，
5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(NapdU)，
5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-萘基甲基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-[1-(2,3-二羟基丙基)]甲酰胺)-2'-脱氧尿苷)，
5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(2NapdU)，
5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-2-萘基甲基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-1-萘基乙基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(NEdU)，
5-(N-1-萘基乙基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-1-萘基乙基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-2-萘基乙基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(2NEdU)，
5-(N-2-萘基乙基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-2-萘基乙基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(BFdU)，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，
5-(N-3-苯并呋喃基乙基甲酰胺)-2'-氟尿苷，
5-(N-3-苯并苯硫基乙基甲酰胺)-2'-脱氧尿苷(BTdU)，
5-(N-3-苯并苯硫基乙基甲酰胺)-2'-O-甲基尿苷，以及
5-(N-3-苯并苯硫基乙基甲酰胺)-2’-氟尿苷。
如本文所用，当用于提及寡核苷酸时，术语“修饰(modify)”、“经修饰的(modified)”、“修饰(modification)”及其任何变化形式意指寡核苷酸的四种组成性核苷酸碱基(即A、G、T/U和C)中的至少一种是天然存在的核苷酸的类似物或酯。在一些实施方案中，经修饰的核苷酸赋予寡核苷酸核酸酶抗性。另外的修饰可包括主链修饰、甲基化、不寻常的碱基配对组合，如异碱基异胞苷和异胍等。修饰还可包括3'和5'修饰，如加帽。其他修饰可包括，用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，例如像，具有不带电荷的键联(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酸酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)等)和具有带电荷的键联(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些、具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合剂(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)的那些、含有烷化剂(alkylator)的那些以及具有修饰的键联(例如，α端基异构核酸等)的那些。此外，通常存在于核苷酸的糖上的任何羟基均可被膦酸酯基团、磷酸酯基团置换；被标准的保护基团保护；或被活化以制备与另外核苷酸或与固体载体的另外键联。5′和3′末端OH基团可被磷酸化或被胺、约1至约20个碳原子的有机加帽基团部分、在一个实施方案中约10至约80kDa范围内的聚乙二醇(PEG)聚合物、在另一个实施方案中约20至约60kDa范围内的PEG聚合物或其它亲水性或疏水性生物或合成聚合物取代。
如本文所用，“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用来指核苷酸的聚合物，并且包括DNA、RNA、DNA/RNA杂合体和这些种类的核酸、寡核苷酸和多核苷酸的修饰，其中包括各种实体或部分与任何位置的核苷酸单元的连接。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”包括双链或单链分子以及三螺旋分子。核酸、寡核苷酸和多核苷酸是比术语适体更广义的术语，且因此术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸包括为适体的核苷酸的聚合物，但术语核酸、寡核苷酸和多核苷酸不限于适体。
多核苷酸还可含有本领域通常已知的核糖或脱氧核糖的类似形式，包括2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-O-乙基、2'-O-丙基、2'-O-CH2CH2OCH3、2'-氟、2'-NH2或2'叠氮基、碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及无碱基核苷类似物(如甲基核苷)。如本文所述，一个或多个磷酸二酯键联可被替代的连接基团置换。这些替代的连接基团包括其中磷酸酯被P(O)S(“硫代酸酯”)、P(S)S(“二硫代酸酯”)、(O)NRX 2(“酰胺化物”)、P(O)RX、P(O)ORX'、CO或CH2(“甲缩醛”)置换的实施方案，其中各个RX或RX'独立地是H、或任选地含有醚(-O-)键联的取代的或未取代的烷基(C1-C20)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有键联都需要相同。糖、嘌呤和嘧啶的类似形式的取代在设计最终产物时可能是有利的，例如，替代的主链结构如聚酰胺主链也可在设计最终产物时是有利的。
多核苷酸还可含有碳环糖类似物、α-端基异构糖、差向异构糖(如阿拉伯糖、木糖或来苏糖)、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及无碱基核苷类似物(如甲基核苷)的类似形式。
如果存在，可在聚合物的组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可被非核苷酸组分间断。多核苷酸可在聚合之后进行进一步被修饰，如通过与标记组分缀合。
如本文所用，当提及核酸的修饰时，术语“至少一个核苷酸”是指核酸中的一个、几个或所有核苷酸，从而表明核酸中的A、C、T、G或U的任何一者或所有的任何或所有出现都可被修饰或不被修饰。
如本文中所使用，“核酸配体”、“适体”、“SOMAmer”、“修饰的适体”和“克隆”可互换用于指对靶分子具有所需要的作用的非天然存在的核酸。所需要的作用包括但不限于结合靶标、催化地改变靶标、以修改或改变靶标或靶标功能活性的方式与靶标反应、共价连接于靶标(如在自杀性抑制剂中)和促进靶标与另一个分子之间的反应。在一个实施方案中，所述作用是针对靶分子的特异性结合亲和力，这种靶分子是通过与沃森/克里克(Watson/Crick)碱基配对或三螺旋形成无关的机制结合至适体的除多核苷酸以外的三维化学结构，其中适体不是被靶分子正在结合的具有已知生理功能的核酸。针对给定靶标的适体包括通过以下方法从候选核酸混合物中鉴别的核酸，其中适体是靶标的配体，该方法包括：(a)使候选混合物与靶标接触，其中可从候选混合物中的其余物质分配相对于候选混合物中的其它核酸来说对靶标具有较高亲和力的核酸；(b)从候选混合物的其余物质分配较高亲和力核酸；和(c)对较高亲和力核酸进行扩增以产生配体富集的核酸混合物，借此鉴别靶分子的适体。应认识到亲和力相互作用是程度的问题；然而，在本上下文中，适体对其靶标的“特异性结合亲和力”是指适体通常以比其结合混合物或样品中的其他非靶标组分高得多的亲和力程度结合其靶标。“适体”、“SOMAmer”或“核酸配体”是具有特定核苷酸序列的一种类型或种类的核酸分子的一组拷贝。适体可包括任何合适数目的核苷酸。“适体”是指多于一组这样的分子。不同的适体可具有相同或不同数目的核苷酸。适体可以是DNA或RNA，并且可以是单链、双链或者含有双链或三链区域。在一些实施方案中，使用本文所述的或本领域已知的SELEX方法来制备适体。
如本文所用，“SOMAmer”或缓慢解离速率修饰的适体是指具有改善的解离速率特性的适体。可使用标题为“Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国专利7,947,447中所描述的改进的SELEX方法来产生SOMAmer。
如本文所用，包含两种不同类型的5-位修饰的嘧啶或C-5修饰的嘧啶的适体可被称为“双重修饰的适体”、具有“两个经修饰的碱基(two modified bases)”的适体、具有“两种碱基修饰”或“两个经修饰的碱基(two bases modified)”的适体、具有“双重修饰的碱基”的适体，所有这些都可互换使用。适体的文库(A library of aptamers)或适体文库(aptamer library)也可使用相同的术语。因此，在一些实施方案中，适体包含两个不同的5位修饰的嘧啶，其中所述两个不同的5位修饰的嘧啶选自NapdC和NapdU、NapdC和PPdU、NapdC和MOEdU、NapdC和TyrdU、NapdC和ThrdU、PPdC和PPdU、PPdC和NapdU、PPdC和MOEdU、PPdC和TyrdU、PPdC和ThrdU、NapdC和2NapdU、NapdC和TrpdU、2NapdC和NapdU、以及2NapdC和2NapdU、2NapdC和PPdU、2NapdC和TrpdU、2NapdC和TyrdU、PPdC和2NapdU、PPdC和TrpdU、PPdC和TyrdU、TyrdC和TyrdU、TrydC和2NapdU、TyrdC和PPdU、TyrdC和TrpdU、TyrdC和TyrdU以及TyrdC和TyrdU。在一些实施方案中，适体包含至少一种经修饰的尿苷和/或胸苷和至少一种经修饰的胞苷，其中所述至少一种经修饰的尿苷和/或胸苷在5-位被选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分的部分修饰，并且其中所述至少一种修饰的胞苷在5-位被选自萘基部分、酪氨酰基部分和苄基部分的部分修饰。在某些实施方案中，所述部分经由包含选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头的基团的接头共价连接至所述碱基的5-位。关于可用于将部分共价连接至嘧啶的5-位的示例性接头的其他实例，参见图1。
如本文所用，“疏水性基团”和“疏水性部分”在本文中可互换使用，并且是指不带电荷的任何基团或部分，所述基团或部分的大多数原子是氢和碳，所述基团或部分具有小偶极子和/或所述基团或部分倾向于从水中排斥。这些基团或部分可包含芳族烃或平面芳族烃。用于确定疏水性或分子(或基团或部分)是否为疏水性的方法是本领域众所周知的，并且包括根据经验得出的方法以及计算方法。示例性方法描述于Zhu Chongqin等人(2016)Characterizing hydrophobicity of amino acid side chains in a proteinenvironment via measuring contact angle of a water nanodroplet on planarpeptide network.Proc.Natl.Acad.Sci.,113(46)第12946-12951页中。如本文所公开，示例性的疏水性部分包括但不限于图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI。其他示例性疏水性部分包括图3的那些(例如，Bn、Nap、PE、PP、iBu、2Nap、Try、NE、MBn、BF、BT、Trp)。
如本文所用，包含单一类型的5-位修饰的嘧啶或C-5修饰的嘧啶的适体可被称为“单一修饰的适体”、具有“单一修饰的碱基(single modified base)”的适体、具有“单碱基修饰”或“单一修饰的碱基(single bases modified)”的适体，所有这些都可互换使用。适体的文库(A library of aptamers)或适体文库(aptamer library)也可使用相同的术语。如本文所用，“蛋白质”与“肽”、“多肽”或“肽片段”同义使用。“纯化的”多肽、蛋白质、肽或肽片段基本上不含来自从其获得氨基酸序列的细胞、组织或无细胞来源的细胞物质或其他污染蛋白质，或在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。
在某些实施方案中，适体包含第一5-位修饰的嘧啶和第二5-位修饰的嘧啶，其中所述第一5-位修饰的嘧啶在所述第一5-位修饰的嘧啶的5-位包含酪氨酰部分，并且所述第二5-位修饰的嘧啶在所述第二5-位修饰的嘧啶的5-位包含萘基部分或苄基部分。在一个相关的实施方案中，所述第一5-位修饰的嘧啶是尿嘧啶。在一个相关的实施方案中，所述第二5-位修饰的嘧啶是胞嘧啶。在一个相关的实施方案中，所述适体的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的尿嘧啶在5-位被修饰。在一个相关的实施方案中，所述适体的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的胞嘧啶在5-位被修饰。
核酸杂交领域的普通技术人员将认识到，通常用于施加或控制杂交严格性的因素包括甲酰胺浓度(或其他化学变性试剂)、盐浓度(即，离子强度)、杂交温度、洗涤剂浓度、pH值和是否存在离液剂。探针/靶序列组合的最佳严格性通常通过固定几种上述严格性因子、然后确定改变单个严格性因子的效果的众所周知的技术来发现。可调节相同的严格性因子，从而控制PNA与核酸杂交的严格性，除了PNA的杂交与离子强度完全无关。可通过检查每种严格性因子来通过实验确定测定的最佳严格性，直到达到所需的区分度。
如本文所用，在核苷酸序列的上下文中，“杂交(Hybridization)”、“杂交(hybridizing)”、“结合”和类似术语可在本文中互换使用。两个核苷酸序列彼此杂交的能力是基于两个序列的互补性程度，互补性程度进而是基于匹配的互补核苷酸对的分数。给定序列中与另一个序列互补的核苷酸越多，对于杂交的条件可能越严格，并且两个序列的结合将更具特异性。通过升高温度、增加共溶剂的比例、降低盐浓度等来实现严格性的提高。通常优选微阵列上的探针和靶材料的互补性沃森/克里克碱基对的杂交，但是在杂交期间也可发生非沃森/克里克碱基配对。
常规杂交溶液和用于杂交的方法描述于以引用的方式并入本文的J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(同上)中。用于杂交的条件通常包括(1)高离子强度溶液，(2)在受控的温度下，和(3)在载体DNA以及具有二价阳离子的表面活性剂和螯合剂存在下，所有这些都是本领域已知的。
如本文所用，“生物聚合物”是一种或多种类型的重复单元的聚合物。生物聚合物通常存在于生物系统中，并且特别包括多糖(如碳水化合物)和肽(所述术语用于包括多肽和蛋白质，无论是否连接至多糖)和多核苷酸以及其类似物，如由氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团组成或含有氨基酸类似物或非氨基酸基团或核苷酸类似物或非核苷酸基团的那些化合物。因此，此术语包括其中常规主链已被非天然存在或合成的主链置换的多核苷酸，以及其中一个或多个常规碱基已被能够参与沃森-克里克型氢键合相互作用的基团(天然或合成)置换的核酸(或合成或天然存在的类似物)。多核苷酸包括单链或多链构型，其中一条或多条链可以或可以不与另一条链完全对齐。具体地，“生物聚合物”包括脱氧核糖核酸或DNA(包括cDNA)、核糖核酸或RNA以及寡核苷酸，而与来源无关。
如本文所用，“阵列”包括具有与可寻址区域相关的一个或多个特定化学部分(例如，生物聚合物，如肽核酸分子、肽或多核苷酸序列)的可所述区域的任何一维、二维或三维布置，其中所述一个或多个化学部分被固定在所述区域的表面上。“固定的”是指一个或多个部分与区域中的基底表面稳定地缔合，以使得它们在使用阵列的条件(例如，杂交和洗涤以及汽提条件)下不与所述区域分离。如本领域已知的，所述一个或多个部分可共价或非共价键合至所述区域中的表面。例如，在基底是多孔的情况下，每个区域可延伸至第三维度，而在基底是无孔的情况下，每个区域可不具有任何实质的第三维度测量值(厚度)。阵列在小于20cm或甚至小于10cm的区域中可含有多于十个、多于一百个、多于一千个、多于一万个特征或甚至多于十万个特征。例如，特征可具有在约10μm至约1.0cm范围内的宽度(即，对于圆形斑点而言，是直径)。在其他实施方案中，每个特征可具有在约1.0μm至约1.0mm，如约5.0μm至约500μm并且包括约10μm至约200μm范围内的宽度。非圆形特征可具有等于具有前述宽度(直径)范围的圆形特征的面积范围的面积范围。给定特征由与靶分子(例如，靶核酸或适体)结合(例如杂交)的化学部分(例如，肽核酸分子、肽、核酸)组成，以使得给定特征对应于特定靶标。
在阵列的情况下，“靶标”将被称为由在各个区域结合至基底的探针(“靶探针”)来检测的流动相中的部分(通常是流体)。然而，“靶标”或“靶探针”中的任一者可以是将通过另一者检测的一者。在一些实施方案中，所述靶标是寡核苷酸或适体。在一些实施方案中，探针是肽核酸分子、肽、蛋白质、寡核苷酸或适体。
术语“生物样品”、“样品”和“测试样品”在本文可互换地用于指从个体获得或以其他方式得到的任何材料、生物流体、组织或细胞，以及环境、动物或食物样品。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆以及血清)、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、呼吸、尿、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物(例如，支气管肺泡灌洗液)、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。这还包括所有前述物质的实验分离的部分。例如，可将血液样品分级分离为血清、血浆或含有诸如红细胞或白细胞(white blood cell)(白细胞(leukocyte))的特定类型的血细胞的级分。在一些实施方案中，样品可以是来自个体的样品的组合，如组织和流体样品的组合。术语“生物样品”还包括含有均质化固体材料的材料，如例如来自粪便样品、组织样品或组织活组织检查的材料。术语“生物样品”还包括源自于组织培养或细胞培养的材料。用于获得生物样品的任何适合的方法都可以采用；示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如，口腔拭子)以及细针抽吸活组织检查程序。易于进行细针抽吸的示例性组织包括淋巴结、肺、肺洗液、BAL(支气管肺泡灌洗液)、甲状腺、乳房、胰腺和肝脏。还可例如通过显微解剖(例如，激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱冲洗、涂片(例如，PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或得到的“生物样品”包括在从个体获得之后已经以任何合适的方式进行加工的任何这种样品。
短语“结合至固体载体表面的寡核苷酸”或“结合至固体载体的探针”或“结合至固体载体的靶标”是指固定在固体基底表面上的肽核酸分子、寡核苷酸、适体(例如PNA(肽核酸酸))、LNA(锁核酸)或UNA(解锁核酸)分子，其中所述基底可具有多种构型，例如薄片、珠粒、颗粒、载玻片、晶片、网、纤维、管、毛细管、微流体通道或储库或其他结构。在某些实施方案中，本文采用的寡核苷酸或靶标元件的集合存在于同一平面载体的表面上，例如呈阵列的形式。应理解，术语“探针”和“靶标”是相对术语，并且在某些测定中被视为探针的分子可在其他测定中充当靶标。寡核苷酸在基底或表面上的固定可通过众所周知的技术来完成，所述技术通常可在文献中获得。参见例如，A.C.Pease,等人,Proc.Nat.Acad.Sci,USA,91:5022-5026(1994)；Z.Guo,等人,Nucleic Acids Res,22,5456-65(1994)；以及M.Schena,等人,Science,270,467-70(1995)，所述文献各自以引用的方式并入本文。
多核苷酸的合成的前述化学详细描述于例如Caruthers,Science 230:281–285,1985；Itakura等人,Ann.Rev.Biochem.53:323–356；Hunkapillar等人,Nature 310:105–110,1984；以及“Synthesis of Oligonucleotide Derivatives in Design and TargetedReaction of Oligonucleotide Derivatives”,CRC Press,Boca Raton,Fla.,第100页以及下列等等；美国专利第4,458,066、4,500,707、5,153,319、5,869,643号、EP 0294196以及其他中。最广泛使用亚磷酰胺和亚磷酸三酯方法，但是其他方法包括磷酸二酯方法、磷酸三酯方法和H-膦酸酯方法。通常将基底官能化以结合至第一沉积的单体。用此类连接部分使基底官能化的合适技术描述于例如Southern,E.M.,Maskos,U.和Elder,J.K.,Genomics,13,1007–1017,1992中。在阵列制造的情况下，在任何一个循环期间，不同的单体和活化剂可沉积在基底上的不同地址处，以使得完整阵列的不同特征将具有不同的所需生物聚合物序列。在每个循环中可能需要一个或多个中间的其他步骤，如在原位制造多核苷酸阵列的情况下的常规氧化、加帽和洗涤步骤(再次，这些步骤可在注入过程中进行)。
多重测定
基于溶液的靶标相互作用和分离步骤中的多重适体测定描述于例如美国专利第7,855,054和7,964,356号以及PCT申请PCT/US2013/044792中。在一个实施方案中，多重测定在本文的实施例1中进行了描述。
在通过多种捕获试剂测量多个靶蛋白的多重测定形式中，不同靶蛋白的丰度的自然变化可限制某些捕获试剂测量某些靶蛋白的能力(例如，高丰度靶蛋白可能使测定饱和并防止或降低所述测定测量低丰度靶蛋白的能力)。为了解决生物样品中的这种变化，可基于生物样品中它们各自的蛋白质靶标的丰度将适体试剂分为至少两个不同的组(用于DIL1的捕获试剂和用于DIL2的捕获试剂)，优选三个不同的组(A3-用于DIL1的捕获试剂；A2-用于DIL2的捕获试剂和A1-用于DIL3的捕获试剂)。捕获试剂组A1、A2和A3中的每一者各自具有一组不同的适体，所述适体对靶蛋白具有特异性亲和力。将生物样品稀释成两个(稀释液1或DIL1和稀释液2或DIL2)、优选三个不同的稀释液组(稀释液1或DIL1；稀释液2或DIL2和稀释液3或DIL3)，以基于待通过它们的捕获试剂检测的蛋白质靶标的相对浓度创建单独的测试样品。因此，将生物样品稀释成高、中等和低丰度靶蛋白稀释液组，其中在最低稀释度组中测量丰度最低的蛋白质靶标，并且在最大稀释度组中测量丰度最高的蛋白质靶标。将用于它们的相应稀释液组的捕获试剂一起孵育(例如，将A3组适体与稀释液1或DIL1的测试样品一起孵育；将A2组适体与稀释液2或DIL2的测试样品一起孵育，并且将A1组适体与稀释液3或DIL3的测试样品一起孵育)。A1、A2和A3的适体总数可以是4,000；4,500；5,000或更多个适体。
图5提供生物样品的稀释液组、其相应稀释液的相应捕获试剂组的示例性概览，以及双捕获系统(catch-1和catch-2)的总体概览。可从生物样品创建三个不同的稀释液组，包括生物样品的Z％稀释液或DIL3、生物样品的Y％稀释液或DIL2和生物样品的X％稀释液或DIL1，其中Z大于Y，并且Y大于X(或Z是比Y稀释度更大的稀释度，并Y稀释度是比X稀释度更大的稀释度)。每种稀释液均具有与一组特定蛋白质结合的其自己的一组相应的捕获试剂(对于DIL1为A3、对于DIL2为A2且对于DIL3为A1)。
图4提供生物样品的稀释液组、其相应稀释液的相应捕获试剂组的示例性概览，以及双捕获系统(catch-1和catch-2)的总体概览。可从生物样品创建两个不同的稀释液组，包括生物样品的Z％稀释液或DIL4和生物样品的X％稀释液或DIL1，其中Z大于X(或Z是比X稀释度更大的稀释度)。每种稀释液均具有与一组特定蛋白质结合的其自己的一组相应的捕获试剂(对于DIL1为A3且对于DIL4为A1)。
图7提供生物样品的稀释液组、其相应稀释液的相应捕获试剂组的示例性概览，以及顺序双捕获系统(catch-1和catch-2)的总体概览。可从生物样品创建三个不同的稀释液组，包括生物样品的Z％稀释液或DIL3、生物样品的Y％稀释液或DIL2和生物样品的X％稀释液或DIL1，其中Z大于Y，并且Y大于X(或Z是比Y稀释度更大的稀释度，并Y稀释度是比X稀释度更大的稀释度)。每种稀释液均具有与一组特定蛋白质结合的其自己的一组相应的捕获试剂(对于DIL1为A3、对于DIL2为A2且对于DIL3为A1)。
本公开描述了进行基于适体和光适体的多重测定以便定量测试样品中可能存在的一种或多种靶分子的改进的方法，其中可使用任何合适的核酸检测方法来使适体(或光适体)与适体-靶标亲和力复合物(或光适体-靶标共价复合物)分离以便进行最终检测，因为本文中所述的材料和方法可以用于改进整体测定性能。光适体是包含使适体能够共价结合或“光交联”其靶分子的光反应性官能团的适体。
本文所述的改进的基于适体和光适体的多重测定可用适体和光适体进行，包括但不限于表1中所列的出版物中所描述的那些适体和光适体。
表1
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Figure BDA0002944357280000181
在过去，两个意料之外的限制出现在进行基于适体的单一和多重测定(包括多重蛋白质组适体亲和力测定)中。首先，适体/适体相互作用被鉴别为测定背景的主要来源且可能限制多重测定能力(multiplex capacity)。其次，发现样品基质(主要是血清和血浆)抑制生物素化的适体在经链霉亲和素取代的基质上的固定。
对如Gold等人,(PLoS One(2010)5￡12):el5005)中所描述的测定的改进包括在Catch-2步骤的一些洗涤缓冲液中使用有机溶剂来减小介质的介电常数。添加这些洗涤缓冲液有效地强化了适体的相邻磷酸二酯主链的同种电荷排斥力，因而促进引起背景的相互作用适体的解离。
所述方法中的另一个改进涉及向测定的Catch-2步骤中使用的一些洗涤缓冲液中添加有机溶剂，它还能抵消适体相互作用的倾向，并且因而减少背景且增加多重测定能力。然而，其主要优势在于抵消生物素化的适体对链霉亲和素基质吸附的基质依赖性抑制。这种抑制即使在5％v/v血浆或血清下也能容易地检测，并且将可行的测定浓度限制为5％-10％血浆或血清浓度。这种限制进而限制了测定灵敏度。
对多重测定的又另一个改进包括在与测试溶液一起孵育(称为“Catch-0”)之前对固体载体基质上的经标记适体进行预固定。然后与结合的适体一起在它们自身的加工容器中进行与测试溶液的孵育。如本文中仅出于说明目的所描述，将生物素化的适体预固定在链霉亲和素珠粒基质上，并且与珠粒结合的适体一起进行与测试溶液的孵育。这个预固定步骤使得能够在适体相互作用趋势被减小的条件下进行固定，并且还使得能够在孵育之前进行非常严格的洗涤(使用碱和使用离液盐)，从而破坏相互作用适体并且通过非常强的生物素-链霉亲和素相互作用去除所有未结合的适体。这就减少了横贯所述测定的适体“簇”–即在一定的可检测频率下保留生物素部分或在测定中被生物素化的簇的数目。值得注意的是，辐照裂解适体的大部分但并非所有的光可裂解生物素部分，同时，一些适体经由意在“标记”蛋白质的NHS-生物素处理变得生物素化。在Catch-2步骤捕获的生物素化的适体通过与本体光裂解适体相互作用产生背景，然后在洗脱后被释放。还应注意，预固定形式将有可能支持非常高的多重测定能力，因为适体小组可被单独地固定，然后以珠粒结合形式组合，因而避免了适体可能相互作用并且成簇的条件。
因而，预固定避免了在存在分析物溶液的情况下对适体吸附的需要，因而即使在测定分析物溶液的抑制浓度时也能确保定量固定。这使得能够使用高得多的浓度，高达且包括至少40％v/v血浆或血清，而不是如先前所述方法的10％最高浓度(Gold等人,(2010年12月)PLoS One 5(12):el5005)或所述方法的最近版本中所使用的5％最高浓度，从而使灵敏度增加大约4至8倍，以及增加测定的总体稳健性。
对整个方法的另一个改进包括在如下文详细描述的Catch-2步骤期间在约中性pH值下使用离液盐进行洗脱。现有方法包括在高pH值(10)下使用氯化钠，这会破坏DNA杂交和适体/适体相互作用以及蛋白质/适体相互作用。如上文所指出，DNA杂交和适体/适体相互作用有助于测定背景。离液盐，包括但不限于高氯酸钠、氯化锂、氯化钠和氯化镁，在中性pH值下支持DNA杂交和适体/适体相互作用，同时破坏适体/蛋白质相互作用。净结果是显著减少(约10倍)的背景，伴随测定敏感性升高。
如本文中所使用，“Catch-1”是指对适体-靶标亲和力复合物或适体-靶标共价复合物进行分配。Catch-1的目的在于基本上除去所有未与适体缔合的测试样品组分。除去大多数所述组分将通过从用于Catch-2捕获的靶标标记步骤除去非靶标分子而通常提高靶标标记效率，并且可导致测定背景降低。在一个实施方案中，在测定之前、在测定准备期间或在测定期间通过将标签随附于适体而将标签连接于适体。在一个实施方案中，标签是可释放标签。在一个实施方案中，可释放标签包含可裂解接头和标签。如上文所描述，经标记的适体可被捕获在固体载体上，其中固体载体包括适用于标签的捕获元件。然后可在用测试样品平衡之前如本文中所描述洗涤固体载体以除去任何不想要的材料(Catch-0)。
如本文中所使用，“Catch-2”是指基于靶分子的捕获对适体-靶标亲和力复合物或适体-靶标共价复合物进行分配。Catch-2步骤的目的在于在检测和任选定量之前从测试样品中除去游离的或未复合的适体。从样品中除去游离的适体允许通过任何合适的核酸检测技术来检测适体-靶标亲和力或适体-靶标共价复合物。当使用Q-PCR进行检测和任选的定量时，需要除去游离的适体以便对靶分子进行精确检测和定量。
在一个实施方案中，靶分子是蛋白质或肽，且使用可掺入蛋白质(和肽)和包括蛋白质(或肽)的复合物(举例来说，诸如适体-靶标亲和力(或共价)复合物)中的试剂从适体-靶标亲和力(或共价)复合物(和测试样品的其余物质)分配游离的适体。经标记的蛋白质(或肽)和适体-靶标亲和力(或共价)复合物可固定在固体载体上，从而使得能够从游离适体分配蛋白质(或肽)和适体-靶标亲和力(或共价)复合物。这种标记可包括例如能掺入蛋白质或肽中的生物素部分。
在一个实施方案中，在测定之前、在测定准备期间或在测定期间通过将标签化学连接于靶标而将Catch-2标签连接于蛋白质(或肽)。在一个实施方案中，Catch-2标签是可释放标签。在一个实施方案中，可释放标签包含可裂解接头和标签。然而，通常不必要从Catch-2固体载体释放蛋白质(或肽)。如上文所描述，经标记的靶标可被捕获在第二固体载体上，其中固体载体包括适用于靶标标签的捕获元件。然后用各种缓冲溶液洗涤固体载体，所述缓冲溶液包括包含有机溶剂的缓冲溶液和包含盐和/或含盐清洁剂和/或清洁剂的缓冲溶液。
在洗涤第二固体载体之后，然后对适体-靶标亲和力复合物进行解离步骤，其中破坏复合物以产生游离适体，同时靶分子通过捕获元件与靶标捕获标签的结合相互作用而一般保持与固体载体结合。可通过破坏适体或靶标的结构的任何方法从适体-靶标亲和力复合物释放适体。这可通过在解离非共价结合的适体-靶标复合物的高盐缓冲液中洗涤载体结合的适体-靶标亲和力复合物来实现。收集并检测所洗脱的游离适体。在另一个实施方案中，使用高或低pH来破坏适体-靶标亲和力复合物。在另一个实施方案中，使用高温来解离适体-靶标亲和力复合物。在另一个实施方案中，可使用任何上述方法的组合。在另一个实施方案中，使用对适体-靶标亲和力复合物的蛋白质部分的蛋白水解消化来释放适体组分。
在适体-靶标共价复合物的情况下，使用适体构建体中的可裂解接头来实现释放适体以用于随后定量。在另一个实施方案中，靶标中的可裂解接头将引起适体-靶标共价复合物的释放。
举例来说，蛋白质组亲和力测定(多重测定)可如下进行：
Catch-0：将lxSB17,Tw(40mM HEPES、102mM NaCl、1mM EDTA、5mM MgCl2、5mM KCl、0.05％Tween-20)中的133 7.5％链霉亲和素-琼脂糖浆液添加至过滤板(0.45μιηMillipore HV板(Durapore，目录号MAHVN4550))的多个孔中。将适当的l.lx适体混合物(所有适体都在5'端上含有Cy3荧光团和光可裂解生物素部分)解冻，随后涡旋。然后使l.lx适体混合物沸腾10分钟，涡旋30秒，并且在水浴中冷却到20℃维持20分钟。然后通过离心(l000x g，1分钟)除去过滤板中含有链霉亲和素琼脂糖浆液的液体。将100μL适体混合物添加至过滤板的多个孔中(自动地)。在25℃下，在设定在850rpm的振荡器上将混合物避光孵育20分钟。
Catch-0洗涤：在20分钟孵育后，经由真空过滤除去溶液。添加190lx CAPS适体预洗涤缓冲液(50mM CAPS、1mM EDTA、0.05％Tw-20，pH 11.0)并且在振荡的同时将混合物孵育1分钟。然后经由真空过滤除去CAPS洗涤溶液。然后将CAPS洗涤重复一次。添加190μL lxSX17-Tween，并在振荡的同时将混合物孵育1分钟。然后经由真空过滤除去lx SB17-Tween。再添加190μL lx SX17-Tw，并且在振荡的同时将混合物孵育1分钟。然后通过离心(1分钟，l000x g)除去lx SB17-Tw。除去lx SB17,Tw之后，添加150μL Catch-0储存缓冲液(150mMNaCl、40mM HEPES、1mM EDTA、0.02％叠氮化钠、0.05％Tween-20)，并且仅在板周边小心地密封过滤板，且在4℃下在暗处储存直到使用。
样品制备：将七十五(75)微升40％样品稀释液在40％样品板中(最终40％样品含有：20μM Z-block、1mM苯甲脒、1mM EGTA、40mM HEPES、5mM MgCl2、5mM KCl、1％Tween-20)析出(plated out)。将一百九十五(195)微升lx SB17-Tw在1％样品板中析出。将九十(90)微升lx SB17-Tw在1:10稀释板中析出。将一百三十三(133)微升lx SB17-Tw在0.005％样品板中析出。在机架式解冻站(Rack Thawing Station)上在25℃孵育箱中将样品解冻10分钟，然后涡旋，并且在l000x g下离心1分钟。取掉管子的盖子。混合样品(5次，50μL)，并且将50μL 100％样品转移到含有样品稀释液的40％样品板。然后在样品板上通过上下吸移对40％样品进行混合(110μL，10次)。然后将五(5)μL 40％样品转移到含有lx SB17-Tw的1％样品板。再次通过上下吸移对此样品进行混合(120μL，10次)。在混合之后，将10μL 1％样品转移到含有lx SB17-Tw的1:10稀释板，通过上下吸移对所述样品进行混合(75μL，10次)。从1:10稀释板将七(7)微升0.1％样品转移至含有lx SB17-Tw的0.005％样品板中，并且通过上下吸移进行混合(110μL，10次)。
在孵育之前进行板准备：经由真空过滤从过滤板中除去Catch-0储存溶液。然后添加一百九十(190)微升lx SB17-Tw，随后经由真空过滤将其从过滤板中除去。然后再向过滤板中添加190μL lx SB17-Tw。
孵育：通过离心(1分钟，l000x g)从过滤板中除去lx SB17-Tw缓冲液。将一百(100)微升适当的样品稀释液添加至过滤板(三个过滤板，各自针对40％或20％、1％或0.005％的各样品稀释度)。仅在板周边小心地密封过滤板，从而避免对孔加压。压力将在孵育期间造成泄露。然后在28℃下，在设定在850rpm的恒温振荡器上将板避光孵育3.5小时。
过滤板处理：在孵育之后，将过滤板放到真空歧管上并且通过真空过滤除去样品。添加一百九十(190)微升生物素洗涤液(含100μM生物素的lx SB17-Tw)，并且通过真空过滤除去液体。然后用190μL lx SB17-Tw将样品洗涤5次(真空过滤)。添加一百(100)微升含1mMNHS-生物素的lx SB17-Tw(新制)且在吸附垫上将过滤板吸干，并且在振荡下将混合物孵育5分钟。通过真空过滤除去液体。添加一百二十五(125)微升含20mM甘氨酸的lx SB17-Tw，并且通过真空过滤除去液体。再次添加125μL含20mM甘氨酸的lx SB17-Tw，并且通过真空过滤除去液体。
随后用190μL lx SB17-Tw将样品洗涤6次，通过真空过滤除去液体。然后向各过滤板中添加八十五(85)微升光裂解缓冲液(含2μM Z-block的lx SB17-Tw)。
光裂解：在吸附垫上将过滤板吸干，并且在振荡(800rpm，25℃)下用BlackRay紫外灯辐照6分钟。将板旋转180度，并且在BlackRay光源下再辐照6分钟。将40％过滤板放到空的96孔板上。将1％过滤板堆叠在40％过滤板顶部，并且将0.005％过滤板堆叠在1％过滤板顶部。使板组合件以l000x g离心1分钟。将含有所洗脱的样品的96孔板放到自动机器平台(robot deck)上。将含六十(60)％甘油的lx SB17-Tw从37℃孵育箱中放到自动机器平台上。
Catch-2：在测定设定期间，将50μL 10mg/mL MyOne SA珠粒(500μg)添加至ABgeneOmni-tube 96孔板以便进行Catch-2，并且放在Cytomat下。使Catch-2 96孔珠粒板悬浮90秒，放在磁体块上60秒，并且除去上清液。同时或顺序地，将来自每个稀释液组的Catch-1洗脱液转移至Catch-2珠粒板，并且在Peltier恒温振荡器上孵育(1350rpm，5分钟，25℃)。将板转移到25℃磁体上维持2分钟，并且除去上清液。接下来，添加75μL lx SB17-Tw，并将样品在37℃下在Peltier振荡器上以1350rpm孵育1分钟。然后添加含75μL 60％甘油的lxSB17-Tw(加热至37℃)，并将样品再次在37℃下在Peltier振荡器上以1350rpm孵育1分钟。将板转移至加热至37℃的磁体并孵育2分钟，然后除去上清液。将这个37℃lx SB17-Tw和甘油洗涤循环再重复两次。然后在Peltier振荡器上(1350rpm，1分钟，25℃)用150μL lxSB17-Tw洗涤样品以除去残余甘油，随后在25℃磁体块上1分钟。除去上清液并且添加150μL经0.5M NaCl取代的lx SB17-Tw，并且在1350rpm下孵育1分钟(25℃)，随后在25℃磁体块上1分钟。除去上清液并且添加75μL高氯酸盐洗脱缓冲液(1.8M NaClC-4、40mM PIPES、1mMEDTA、0.05％Triton X-100，lx杂交对照，pH＝6.8)，随后在Peltier振荡器上孵育10分钟(25℃，1350rpm)。之后，将板转移到磁性分离器且孵育90秒，并且回收上清液。
杂交：自动向空的96孔板添加二十(20)微升洗脱的样品。自动向洗脱的样品添加五(5)微升含有第二组杂交对照的10x Agilent封闭缓冲液。然后将25μL 2x AgilentHiRPM杂交缓冲液手动添加至各孔。将四十(40)微升杂交混合物负载至Agilent垫片式载玻片上。将Agilent 8×15k阵列添加到垫片式载玻片上，并且用夹钳拧紧夹层结构。然后在55℃下旋转(20rpm)孵育夹层结构，持续19小时。
杂交后洗涤：在Little Dipper Processor(SciGene，目录号1080-40-1)上进行杂交后载玻片加工。将大约750mL洗涤缓冲液1(Oligo aCGH/ChlP-on-chip洗涤缓冲液1，Agilent Technologies)放到一个玻璃染色皿中。将大约750mL洗涤缓冲液1(Oligo aCGH/ChlP-on-chip洗涤缓冲液1，Agilent Technologies)放到Little Dipper Processor的1号浴中。将加热至37℃的大约750mL洗涤缓冲液2(Oligo aCGH/ChlP-on-chip洗涤缓冲液1，Agilent Technologies)放到Little Dipper Processor的2号浴中。将两个浴的磁力搅拌速度设置为5。未打开1号浴的温度控制器，同时将2号浴的温度控制器设置为37℃。将多达十二个载玻片/垫片组件顺序地拆卸到含有洗涤缓冲液1的第一染色皿中，然后将载玻片放进载玻片架中，同时仍浸入洗涤缓冲液1中。一旦所有载玻片/垫片组件被拆卸，就将载玻片架迅速转移至Little Dipper Processor的1号浴中，并开始自动洗涤方案。Little DipperProcessor在1号浴中以250的速度将载玻片孵育300秒，随后转移至含有Agilent Wash 2(Oligo aCGH/ChlP-on-chip洗涤缓冲液2，Agilent Technologies)的37℃2号浴，并且在100的速度下孵育300秒。之后，Little Dipper Processor将载玻片架转移到内设离心机，在此使载玻片以速度690自旋300秒。
微阵列成像：用微阵列扫描仪(Agilent G2565CA微阵列扫描仪系统，AgilentTechnologies)在Cy3通道中在100％PMT设定下以5μm分辨率对微阵列载玻片进行成像，且在0.05下激活XRD选项。使用Agilent特征提取软件10.7.3.1版，利用GEl_107_Sep09方案处理所得tiff格式图像。
如本文中所使用，“可释放”或“可裂解”元件、部分或接头是指可断裂以产生两种单独组分的分子结构。可释放(或可裂解)元件可包含其中化学键可断裂的单一分子(在本文中称为“链内可裂解接头”)，或其可包含其中非共价相互作用可被断裂或破坏的两个或更多个分子(在本文中称为“杂交接头”)。
在一些实施方案中，有必要在空间上分隔某些官能团与其它官能团以防止干扰个别官能度。举例来说，在光可裂解基团附近存在吸收某些波长的光的标记可能干扰光裂解效率。因此，需要用例如能提供足以恢复全部光裂解活性的空间分隔的非干扰性部分来分隔所述基团。在一些实施方案中，已经用标记和光裂解官能度将“间隔接头”引入到适体中。
“固体载体”是指具有分子可通过共价键或非共价键直接或间接地连接的表面的任何物质。固体载体可包括能够为连接于表面的捕获元件或探针提供物理支持的任何物质材料。所述材料通常能够耐受进行测定期间所遇到的与捕获元件或探针连接到表面和任何后续处理、处置或加工相关的条件。所述材料可以是天然存在的、合成的或天然存在的材料的修饰。合适的固体载体材料可包括独自或结合其它材料一起使用的硅、硅晶片芯片(silicon wafer chip)、石墨、镜面、层压物、膜、陶瓷、塑料(包括聚合物，诸如，例如聚(氯乙烯)、环烯烃共聚物、琼脂糖凝胶或珠粒、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚(对苯二甲酸乙二酯)、聚四氟乙烯(PTFE或
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)、尼龙、聚(丁酸乙烯酯))、锗、砷化镓、金、银、朗缪尔-布劳杰特膜(LangmuirBlodgett films)、导流芯片等。可考虑其它刚性材料，诸如包括二氧化硅的玻璃，并且还包括例如可作为生物玻璃的玻璃。可采用的其它材料包括多孔材料，诸如，例如受控孔隙玻璃珠粒、珠粒状交联
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或琼脂糖树脂，或交联双丙烯酰胺与氮杂内酯的共聚物。其它珠粒包括纳米颗粒、聚合物珠粒、固体核心珠粒、顺磁性珠粒或微珠。还涵盖本领域中已知的能够具有一个或多个例如掺入在其表面上的官能团(诸如氨基、羧基、硫醇或羟基官能团中的任一个)的任何其它材料。
用于固体载体的材料可呈从简单到复杂范围内的多种构型中的任一种。固体载体可具有许多形状中的任一种，包括条、板、盘、杆、颗粒、珠粒、管、孔(微量滴定法)等。固体载体可以是多孔或非多孔的、磁性的、顺磁性或非磁性的、多分散或单分散的、亲水性或疏水性的。固体载体还可呈紧密包装的凝胶或浆液(如呈列矩阵形式)或松散包装颗粒的形式。
在一个实施方案中，将连接有捕获元件的固体载体用于从测试混合物中捕获经标记的适体-靶标亲和力复合物或适体-靶标共价复合物。在一个特定实例中，当标签为生物素部分时，固体载体可以是经链霉亲和素涂覆的珠粒或树脂，诸如Dynabeads M-280链霉亲和素、Dynabeads MyOne链霉亲和素、Dynabeads M-270链霉亲和素(Invitrogen)、链霉亲和素琼脂糖树脂(Pierce)、链霉亲和素超联树脂、MagnaBind链霉亲和素珠粒(ThermoFisherScientific)、BioMag链霉亲和素、ProMag链霉亲和素、二氧化硅链霉亲和素(BangsLaboratories)、高效链霉亲和素琼脂糖(Streptavidin Sepharose High Performance)(GE Healthcare)、
链霉亲和素聚苯乙烯微球体(Microspheres-Nanospheres)、链霉亲和素涂覆的聚苯乙烯颗粒(Spherotech)或本领域技术人员常用于捕获生物素标记的分子的任何其它链霉亲和素涂覆的珠粒或树脂。
如上所述，本发明的一个目的是将蛋白质信号转化为适体信号。因此，所收集/检测的适体的量指示所结合的靶分子的量和样品中靶分子的量，且可能与所结合的靶分子的量和样品中靶分子的量成正比。可在Catch-2分配之后采用许多检测方案，而不从第二固体载体上洗脱适体-靶标亲和力或适体-靶标共价复合物。除以下检测方法实施方案以外，本领域技术人员应已知其它检测方法。
许多检测方法需要在检测前将明确标签掺入适体中。在这些实施方案中，可在合成期间或合成后使用核酸合成标准技术将诸如例如荧光或化学发光染料的标记物掺入适体中。可在合成期间或合成后使用标准酶反应与适当的试剂一起掺入放射性标记物。标记还可在Catch-2分配和通过使用合适的酶促技术进行洗脱之后发生。举例来说，使用具有上述标记的引物，PCR将标记物掺入到所洗脱的适体的扩增产物中。当使用凝胶技术进行定量时，也可使用PCR掺入不同尺寸的质量标记物。这些质量标记物还可掺入不同的荧光或化学发光染料以获得额外的多重测定能力。可通过使用在合成期间或合成后掺入适体中的特异性标签和之后添加与标签缔合且携带标签的探针而将标记间接地添加至适体。标记包括上文描述的那些标记以及标准测定中用于例如比色读数的酶。这些酶与酶底物组合起作用，且包括诸如例如辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)的酶。标记还可包括为用于电化学检测的电化学官能团的材料或化合物。
举例来说，可在接触测试样品之前用诸如32P的放射性同位素如上文所描述来标记适体。采用如上文所讨论的四种基本测定及其变型中的任一种，可通过在测定结束时对第二固体载体进行放射性定量而简单地实现适体检测。放射性计数将与原始测试样品中靶标的量成正比。类似地，在接触测试样品之前如上文所描述用荧光染料标记适体允许对第二固体载体直接进行简单的荧光读数。化学发光标记物或量子点可类似地用于从第二固体载体直接读数，而不需要进行适体洗脱。
通过从第二固体载体洗脱适体或释放光适体-靶标共价复合物，除上述那些方案以外，还可采用其它检测方案。举例来说，所释放的适体、光适体或光适体-靶标共价复合物可在PAGE胶上跑胶，并且用诸如SYBR Gold的核酸染色剂进行检测且任选地定量。或者，所释放的适体、光适体或光适体共价复合物可使用毛细管凝胶电泳(CGE)，使用如上文所述的掺入适体中的荧光标记物来进行检测和定量。另一个检测方案采用定量PCR，使用例如SYBRGreen来检测和定量所洗脱的适体。或者，可采用
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DNA测定来检测和定量所洗脱的适体。另一种替代检测方案采用下一代测序。
在另一个实施方案中，在复制过程中使用“分子信标”来测定适体-靶标亲和力复合物(或适体-靶标共价复合物)的量或浓度(参见例如Tyagi等人,Nat.Biotech.J_6:4953,1998；美国专利第5,925,517号)。分子信标是折叠成发夹环并且在发夹结构的一端上含有荧光团且在发夹结构的另一端上含有淬灭基团，使得当形成发夹时荧光团几乎不产生或不产生信号的特异性核酸探针。环序列对靶多核苷酸序列具有特异性，且在与适体序列杂交后，发夹展开并且从而产生荧光信号。
关于仍与第二固体载体结合的少量适体的多重检测，可采用具有不同的激发/发射光谱的荧光染料来检测并定量两个或三个或五个或多达十个单独适体。
类似地，可采用不同尺寸的量子点用于多重读出。可在从第二固体载体分配游离适体之后引入量子点。通过使用连接于独特量子点的适体特异性杂交序列，可对2、3、5和多达10个适体进行多重读数。用诸如32P、3H、113JC和3J5JS的可单独检测的不同的放射性同位素标记不同的抗体也可用于进行受限多重读出。
为了对从Catch-2第二固体载体释放的适体进行多重检测，可以将如上文所描述掺入各适体中的单一荧光染料用于允许鉴别适体序列以及定量适体水平的定量方法。方法包括但不限于DNA芯片杂交、微珠杂交、下一代测序和CGE分析。
在一个实施方案中，使用标准DNA杂交阵列或芯片来使各适体或光适体与固定在载片或芯片上的独特或一系列独特探针杂交，诸如Agilent阵列、Illumina BeadChip阵列、NimbleGen阵列或定制印刷阵列。各独特探针与适体上的序列互补。互补序列可以是掺入适体中的独特杂交标签，或适体序列的一部分，或整个适体序列。将从Catch-2固体载体释放的适体加入到适当的杂交缓冲液中，且使用标准杂交方法进行处理。举例来说，在约60℃下将适体溶液与DNA杂交阵列一起孵育12小时，以确保杂交严格度。洗涤阵列，然后在荧光载片扫描仪中进行扫描，从而产生就阵列各特征的适体杂交强度的图像。图像分段和定量是使用诸如ArrayVision的图像处理软件来实现的。在一个实施方案中，多重适体测定可以使用多达25个适体、多达50个适体、多达100个适体、多达200个适体、多达500个适体、多达1000个适体和多达10,000个适体进行检测。
在一个实施方案中，将如上文所描述的具有与适体互补的独特DNA探针的可寻址微珠用于杂交。微珠可以用独特荧光染料(诸如Luminex珠粒技术)或使用条形码标记(如在Illumina VeraCode技术中)或激光驱动应答器来寻址。在一个实施方案中，将从Catch-2固体载体释放的适体加入到适当的杂交缓冲液中，且使用标准微珠杂交方法进行处理。举例来说，在约60℃下将适体溶液与一组微珠一起孵育两小时，以确保杂交严格度。然后将溶液在Luminex仪器上进行处理，所述仪器可对个别珠粒类型进行计数并量化适体荧光信号。在另一个实施方案中，使VeraCode珠粒与适体溶液接触且在约60℃下杂交两小时，然后沉积在栅格化表面上并且使用用于鉴定和荧光定量的载片扫描仪进行扫描。在另一个实施方案中，将应答器微珠与适体样品一起在约60℃下孵育，然后使用适用于应答器微珠的装置进行定量。在一个实施方案中，多重适体测定可以通过与微珠杂交，使用多达25个适体、多达50个适体、多达100个适体、多达200个适体和多达500个适体对多重适体测定进行检测。
可处理含有所洗脱的适体的样品以掺入如上文所述的独特质量标签以及荧光标记物。然后将质量标记的适体注入CGE仪器(实质上为DNA测序器)中，且通过其独特质量鉴别适体并且使用来自于标记反应期间所掺入的染料的荧光进行定量。AltheaTechnologies已经开发出了该技术的一个示例性实例。
在上文所描述的许多种方法中，可在定量之前扩增适体溶液并且任选地标记。标准PCR扩增可用于从Catch-2固体载体洗脱的适体溶液。所述扩增可在DNA阵列杂交、微珠杂交和CGE读出之前使用。
在另一个实施方案中，使用Q-PCR对适体-靶标亲和力复合物(或适体-靶标共价复合物)进行检测和/或定量。如本文中所使用，“Q-PCR”是指以测定结果是定量结果(即，测定能够对测试样品中所存在的适体的量或浓度进行定量)的方式且在这样的控制条件下进行的PCR反应。
在一个实施方案中，使用
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PCR来测定测试样品中的适体-靶标亲和力复合物(或适体-靶标共价复合物)的量或浓度。这种技术一般依赖于从靶序列产生信号的寡核苷酸复制酶的5'-3'核酸外切酶活性。TaqMan探针是基于欲定量的适体的序列加以选择的，且通常包括5'端荧光团(诸如6-羧基荧光素)和3'端淬灭基团(诸如，例如6-羧基四甲基荧光素)以便在使用聚合酶链式反应(PCR)扩增适体序列时产生信号。因为聚合酶拷贝适体序列，所以核酸外切酶活性从探针释放荧光团，所述探针在PCR引物下游退火，从而产生信号。PCR产物的量取决于所进行的复制循环数以及适体的起始浓度。
在另一个实施方案中，在复制过程期间使用插入的荧光染料来测定适体-靶标亲和力复合物(或适体-靶标共价复合物)的量或浓度。与在单链DNA存在下产生的荧光信号相比，插入的染料(诸如例如
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green)在双链DNA存在下产生了较大荧光信号。由于在PCR期间形成了双链DNA产物，所以由染料产生的信号增加。所产生的信号的强度取决于PCR循环数和适体的起始浓度。
在另一个实施方案中，使用质谱法对适体-靶标亲和力复合物(或适体-靶标共价复合物)进行检测和/或定量。可使用上文所描述的酶促技术来引入独特质量标签。对于质谱法读出来说，不需要检测标记物，而是基于质谱法分析期间产生的位置和质量峰下面积，使用质量本身来进行鉴别和使用本领域技术人员常用的技术进行定量。使用质谱法的一个实例是由Sequenom开发的
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系统。
可使用计算机程序来进行本文中所公开的任何方法的一个或多个步骤。本公开的另一个方面是一种包括上面存储有计算机程序的计算机可读取存储介质的计算机程序产品，其在加载到计算机中时执行或辅助执行本文中所公开的任何方法。
本公开的一个方面是本文中所公开的任何方法的产物，即测定结果，其可在测试场所加以评估，或可将它运到另一个场所以便评估和在需要时传递给远程位置的相关方。如本文中所使用，“远程位置”是指物理上不同于获得结果的位置的位置。因此，可将结果发送到不同的房间、不同的建筑、城市的不同部分、不同的城市等。可通过任何手段传输数据，诸如，例如传真、邮件、隔夜送达、电子邮件、ftp、语音邮件等。
“传递”信息是指代表所述信息的数据作为电子信号经过合适传递渠道(例如，私人网络或公共网络)的传输。“转发”物品是指不论是通过物理输送物品还是其它方式(在可能的情况下)使所述物品从一个位置到下一个位置的任何手段，并且包括，至少在数据的情况下，物理输送携带数据的介质或传递数据。
经修饰的核苷酸
在某些实施方案中，本公开提供了包含两种不同类型的碱基修饰的核苷酸的寡核苷酸，如适体。在一些实施方案中，寡核苷酸包含两种不同类型的5-位修饰的嘧啶。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少一种C5修饰的胞苷和至少一种C5修饰的尿苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含两种不同的C5修饰的胞苷。在一些实施方案中，寡核苷酸包含两种不同的C5-修饰的尿苷。非限制性的示例性C5修饰的尿苷和胞苷例如在图1中示出。某些非限制性的示例性C5修饰的尿苷在图2中示出，并且某些非限制性的示例性C5修饰的胞苷在图3中示出。
寡核苷酸的制备
寡脱氧核苷的自动合成是许多实验室的常规实践(参见例如Matteucci,M.D.和Caruthers,M.H.,(1990)J.Am.Chem.Soc.,103:3185-3191，其内容特此以引用的方式整体并入)。寡核糖核苷的合成也是众所周知的(参见例如Scaringe,S.A.,et al.,(1990)Nucleic Acids Res.18:5433-5441，其内容特此以引用的方式整体并入)。如本文所述，亚磷酰胺可用于通过化学合成将经修饰的核苷掺入寡核苷酸，并且三磷酸酯可用于通过酶促合成将经修饰的核苷掺入寡核苷酸。(参见例如，Vaught,J.D.等人(2004)J.Am.Chem.Soc.,126:11231-11237；Vaught,J.V.,等人(2010)J.Am.Chem.Soc.132,4141-4151；Gait,M.J.“Oligonucleotide Synthesis a practical approach”(1984)IRL Press(Oxford,UK)；Herdewijn,P.“Oligonucleotide Synthesis”(2005)(Humana Press,Totowa,N.J.(其各自以引用的方式整体并入本文)。
“靶标”或“靶分子”或“靶标”在本文中是指核酸可以所需或预期方式作用于其上的任何化合物。靶分子的可以是但不限于蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原体、毒性物质、底物、代谢物、转变态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织、前述中的任一种的任何部分或片段等。实质上，任何化学或生物效应物可以是合适的靶标。任何大小的分子都可充当靶标。还可以某些方式修饰靶标以增强靶标与核酸之间的相互作用的可能性或强度。靶标还可包括特定化合物或分子的任何微小变化，如在蛋白质的情况下，例如氨基酸序列的微小变化、二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与基本上不改变分子的身份的标记组分缀合。“靶分子”或“靶标”是能够与适体结合的一种类型或种类的分子或多分子结构的一组拷贝。“靶分子”或“靶标”是指多于一组此类分子。其中靶标是肽的SELEX方法的实施方案描述于题为“Modified SELEX Processes Without Purified Protein”的美国专利第6,376,190号中。在一些实施方案中，靶标是蛋白质。
如本文中所用，“竞争物分子”和“竞争物”可互换用于指可与非靶分子形成非特异性复合物的任何分子。在本文中，非靶分子包括游离的适体，其中例如竞争物可用于抑制适体非特异性地结合(重新结合)至另一非靶分子。“竞争物分子”或“竞争物”是一种类型或种类的分子的一组拷贝。“竞争物分子”或“竞争物”是指多于一组此类分子。竞争物分子包括但不限于寡核苷酸、聚阴离子(例如，肝素、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA、tRNA、硫酸葡聚糖、葡聚糖、非碱性磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸酯)。在各种实施方案中，可使用一种或多种竞争物的组合。
如本文中所用，“非特异性复合物”是指两个或更多个除适体以外的分子与其靶分子之间的非共价缔合。非特异性复合物代表分子类别之间的相互作用。非特异性复合物包括在适体与非靶分子、竞争物与非靶分子、竞争物与靶分子以及靶分子与非靶分子之间形成的复合物。
在另一个实施方案中，在缓慢解离速率富集过程中使用聚阴离子竞争物(例如，硫酸葡聚糖或另一种聚阴离子材料)，以促进鉴定难以存在聚阴离子的适体。在本上下文中，“聚阴离子不耐性适体(polyanionic refractory aptamer)”是能够形成适体/靶标复合物的适体，与包含非聚阴离子不耐性适体的适体/靶标复合物相比，所述适体/靶标复合物在还含有聚阴离子不耐性材料的溶液中离解的可能性较小。以这种方式，聚阴离子不耐性适体可用于执行分析方法以检测样品中靶标的存在、量或浓度，其中检测方法包括使用适体对其而言不耐的聚阴离子材料(例如硫酸葡聚糖)。
因此，在一个实施方案中，提供了一种用于产生聚阴离子不耐性适体的方法。在此实施方案中，在使候选核酸混合物与靶标接触之后。使所述靶标和候选混合物中的核酸达到平衡。引入聚阴离子竞争物，并使其在溶液中孵育足够的时间段，以确保候选混合物中的大多数快速解离速率适体与靶分子解离。此外，候选混合物中可能在聚阴离子竞争物存在下解离的适体将从靶分子中释放。将混合物分配以分离仍与靶分子缔合的高亲和力、缓慢解离速率适体并从溶液中除去任何未复合的材料。然后可使适体从靶分子释放并分离。分离的适体也可被扩增，并且施加另外的选择轮次以提高所选适体的总体性能。如果不需要为特定的应用选择缓慢解离速率适体，则这种方法也可与最短的孵育时间一起使用。
盐
可方便或可期望制备、纯化和/或处理化合物的对应盐，例如药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的实例在Berge等人(1977)“Pharmaceutically Acceptable Salts”J.Pharm.Sci.66:1-19中进行了讨论。
例如，如果化合物为阴离子或具有可为阴离子的官能团(例如，-COOH可为-COO-)，则盐可用合适的阳离子形成。合适的无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子，如Na+和K+；碱土金属阳离子，如Ca2+和Mg2+；以及其它阳离子，如Al+3。合适的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即，NH4 +)和取代的铵离子(例如，NH3RX+、NH2RX 2 +、NHRX 3 +、NRX 4 +)。一些合适的取代的铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇、以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见季铵离子的实例是N(CH3)4 +。
如果化合物为阳离子或具有可为阳离子的官能团(例如，-NH2可为-NH3 +)，则盐可用合适的阴离子形成。适合的无机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸以及亚磷酸。
合适的有机阴离子的实例包括但不限于来源于以下有机酸的那些：2-乙酰氧基苯甲酸、乙酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯甲酸、樟脑磺酸、肉桂酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、延胡索酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、草酰乙酸、羟基萘羧酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、甲烷磺酸、粘液酸、油酸、草酸、棕榈酸、扑酸、泛酸、苯基乙酸、苯基磺酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、对氨基苯磺酸、酒石酸、甲苯磺酸和缬草酸。合适的聚合有机阴离子的实例包括但不限于衍生自以下聚合酸的那些：鞣酸、羧甲基纤维素。
除非另有规定，否则提及特定化合物也包括其盐形式。
其它实施方案
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)使第一测试样品与第一组适体接触以形成第一混合物，其中所述第一测试样品是生物样品的Z％稀释液，其中Z是生物样品的5％至39％(或5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)稀释液，并且所述第一组适体中存在至少A3个不同的适体；b)使第二测试样品与第二组适体接触以形成第二混合物，其中所述第二测试样品是所述生物样品的Y％稀释液，其中Y小于Z，并且其中所述第二组适体中存在至少A2个不同的适体；c)使第三测试样品与第三组适体接触以形成第三混合物，其中所述第三测试样品是所述生物样品的X％稀释液，其中X小于Y，并且在所述第三组适体中存在至少A1个不同的适体；d)孵育所述第一混合物、第二混合物和第三混合物以允许形成适体-蛋白质复合物，并除去大部分不形成适体-蛋白质复合物的适体；e)通过使适体-蛋白质复合物解离来从所述适体-蛋白质复合物收集适体；f)检测或定量所收集的适体；其中，所述第一组适体、第二组适体和第三组适体中的大多数适体各自对所述测试样品中的不同靶蛋白具有亲和力，并且能够与其靶蛋白形成适体-蛋白质复合物，并且其中A3大于A2，并且A2大于A2；并且其中A1、A2和A3的和是至少4,000。
在一个方面，Z是10％至30％、或15％至25％、或约20％。
在一个方面，Y是0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)或0.1％至0.8％、或0.2％至0.75、或约0.5％。
在一个方面，X是0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)或0.002％至0.008％、或0.003％至0.007％、或约0.005％。
在一个方面，A1、A2和A3的和是至少4,500或5,000。
在一个方面，A3是A1、A2和A3的和的50％至90％(或50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％)；或A1、A2和A3的和的60％至85％；或A1、A2和A3的和的约80％或81％。
在一个方面，A2是A1、A2和A3的和的10％至49％(或10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或49％)；或A1、A2和A3的和的12％至35％；或A1、A2和A3的和的15％至30％；或A1、A2和A3的和的约15％或16％。
在一个方面，A1是A1、A2和A3的和的1％至9％(或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或9％)；或A1、A2和A3的和的2％至7％；或A1、A2和A3的和的3％至6％；或A1、A2和A3的和的约3％或4％。
在一个方面，A3是至少400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4200、4270、4500、5000(或900至16,500、或2000至15,000、或3,000至12,000、或4,000至10,000)。
在一个方面，A2是至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、820、900(或500至3500、或700至2500、或800至2000)。
在一个方面，A1是至少100、110、120、130、140、150、160、170、173(或是100至700或100至650)。
在一个方面，将第一混合物、第二混合物和第三混合物彼此分开孵育。
在一个方面，本文的方法还包括在孵育所述混合物以允许适体-蛋白质复合物形成之后将所述第一混合物、第二混合物和第三混合物合并在一起。
在一个方面，本文的方法还包括在孵育所述混合物以允许适体-蛋白质复合物形成之后将所述第一混合物、第二混合物和第三混合物顺序地合并在一起。
在一个方面，以选自以下的顺序进行顺序合并：i)第一混合物，随后第二混合物，随后第三混合物；ii)第一混合物，随后第三混合物，随后第二混合物；iii)第二混合物，随后第一混合物，随后第三混合物；iv)第二混合物，随后第三混合物，随后第一混合物；v)第三混合物，随后第二混合物，随后第一混合物；以及vi)第三混合物，随后第一混合物，随后第二混合物。
在一个方面，所述测试样品选自血液、血浆、血清、痰、呼气、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物和脑脊髓液。
在一个方面，通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行检测或定量。
在一个方面，所述至少A3个不同的适体彼此的区别在于至少一种核苷酸差异和/或至少一种核苷酸修饰。
在一个方面，所述至少A2个不同的适体彼此的区别在于至少一种核苷酸差异和/或至少一种核苷酸修饰。
在一个方面，所述至少A1个不同的适体彼此的区别在于至少一种核苷酸差异和/或至少一种核苷酸修饰。
在一个方面，所述至少A3个不同的适体、所述至少A2个不同的适体和所述至少A1个不同的适体彼此的区别在于至少一种核苷酸差异和/或至少一种核苷酸修饰。
如前述段落中任一项的方法，其中所述第一组、第二组和第三组适体中的一个或多个适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在一个方面，所述部分是疏水性部分。
在一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)使第一测试样品与至少一个第一适体接触以形成第一混合物，其中所述第一测试样品是测试样品的至少X％稀释液；b)使第二测试样品与至少一个第二适体接触以形成第二混合物，其中所述第二测试样品是所述测试样品的Y％稀释液，其中X小于Y；c)使第三测试样品与至少一个第三适体接触以形成第三混合物，其中所述第三测试样品是所述测试样品的Z％稀释液，其中Y小于Z；d)孵育所述第一、第二和第三混合物以形成适体-蛋白质复合物，并除去大部分不形成适体-蛋白质复合物的适体；e)通过使适体-蛋白质复合物解离来从所述适体-蛋白质复合物收集适体；f)检测或定量所收集的适体；其中，所述至少一个第一适体、至少一个第二适体和至少一个第三适体各自对不同的蛋白质具有亲和力，并且当所述蛋白质存在于相应的测试样品中时能够形成适体-蛋白质复合物；其中，所述第一、第二和第三测试样品是同一测试样品的不同稀释液。
在一个方面，Z％是5％至39％(或5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)或10％至30％、或15％至25％、或约20％。
在一个方面，Y％是0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)或0.1％至0.8％、或0.2％至0.7％、或约0.5％。
在一个方面，X％是0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)或0.002％至0.008％、或0.003％至0.007％、或约0.005％。
在一个方面，所述第一混合物包含多个适体。
在一个方面，所述第一混合物包含至少100、110、120、130、140、150、160、170、173(或100至700、或100至650)个不同的适体。
在一个方面，所述第二混合物包含多个适体。
在一个方面，所述第二混合物包含至少200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、820、900(或500至3500、或700至2500、或800至2000)个不同的适体。
在一个方面，所述第三混合物包含多个适体。
在一个方面，所述第三混合物包含至少400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4200、4270、4500、5000(或900至16,500、或2000至15,000、或3,000至12,000、或4,000至10,000)个不同的适体。
在一个方面，将第一混合物、第二混合物和第三混合物彼此分开孵育。
在一个方面，本文公开的方法还包括在孵育所述混合物以允许适体-蛋白质复合物形成之后将所述第一混合物、第二混合物和第三混合物合并在一起。
在一个方面，本文公开的方法还包括在孵育所述混合物以允许适体-蛋白质复合物形成之后将所述第一混合物、第二混合物和第三混合物顺序地合并在一起。
在一个方面，以选自以下的顺序进行顺序合并：i)第一混合物，随后第二混合物，随后第三混合物；ii)第一混合物，随后第三混合物，随后第二混合物；iii)第二混合物，随后第一混合物，随后第三混合物；iv)第二混合物，随后第三混合物，随后第一混合物；v)第三混合物，随后第二混合物，随后第一混合物；以及vi)第三混合物，随后第一混合物，随后第二混合物。
在一个方面，所述测试样品选自血液、血浆、血清、痰、呼气、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物和脑脊髓液。
在一个方面，通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行检测或定量。
如前述段落中任一项的方法，其中所述至少一个第一适体、所述至少一个第二适体、所述至少一个第三适体和所述多个适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，其中所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在一个方面，其中所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在一个方面，其中所述部分是疏水性部分。
在一个方面，其中所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在一个方面，其中所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
如前述段落中任一项的方法，其中所述适体彼此的区别在于至少一种核苷酸差异和/或至少一种核苷酸修饰。
在一些实施方案中，公开了一种系统，所述系统包括：a)具有第一混合物的第一容器，所述第一混合物包含具有第一组适体的第一测试样品，其中所述第一测试样品是测试样品的Z％稀释液，并且所述第一组适体中存在至少A3个不同的适体；b)具有第二混合物的第二容器，所述第二混合物包含具有第二组适体的第二测试样品，其中所述第二测试样品是所述测试样品的Y％稀释液，其中Y小于Z，并且所述第二组适体中存在至少A2个不同的适体；c)具有第三混合物的第三容器，所述第三混合物包含具有第三组适体的第三测试样品，其中所述第三测试样品是所述测试样品的X％稀释液，其中X小于Y，并且所述第三组适体中存在至少A1个不同的适体；并且其中，所述第一组适体、第二组适体和第三组适体中的大多数适体对所述测试样品中的蛋白质具有亲和力，并且能够形成适体-蛋白质复合物，并且其中A3大于A2且A2大于A1；并且其中A1、A2和A3的和是至少4,000；并且其中，所述系统用于检测所述测试样品中的蛋白质，并且所述第一测试样品、第二测试样品和第三测试样品是同一测试样品的不同稀释液。
在一个方面，Z％是5％至39％(或5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)或10％至30％、或15％至25％、或约20％。
在一个方面，Y％是0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)或0.1％至0.8％、或0.2％至0.7％、或约0.5％。
在一个方面，X％是0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)或0.002％至0.008％、或0.003％至0.007％、或约0.005％。
在一些实施方案中，公开了一种系统，所述系统包括：a)具有第一混合物的第一容器，所述第一混合物包含具有至少一个第一适体的第一测试样品，其中所述第一测试样品是测试样品的Z％稀释液；b)具有第二混合物的第二容器，所述第二混合物包含具有至少一个第二适体的第二测试样品，其中所述第二测试样品是所述测试样品的Y％稀释液，其中Y小于Z；c)具有第三混合物的第三容器，所述第三混合物包含具有至少一个第三适体的第三测试样品，其中所述第三测试样品是所述测试样品的X％稀释液，其中X小于Y；其中，所述至少一个第一适体、至少一个第二适体和至少一个第三适体各自对不同的蛋白质具有亲和力，并且当所述蛋白质存在于生物样品中时能够形成适体-蛋白质复合物；并且其中，所述系统用于检测所述测试样品中的蛋白质，并且所述第一测试样品、第二测试样品和第三测试样品是同一测试样品的不同稀释液。
在一个方面，Z％是5％至39％(或5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)或10％至30％、或15％至25％、或约20％。
在一个方面，Y％是0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)或0.1％至0.8％、或0.2％至0.7％、或约0.5％。
在一个方面，X％是0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)或0.002％至0.008％、或0.003％至0.007％、或约0.005％。
在一些实施方案中，公开了一种制剂，所述制剂包含第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，其中所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物在测试样品的约0.005％稀释液中形成，所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物在所述测试样品的约0.5％稀释液中形成，并且所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物在所述测试样品的约20％稀释液中形成。
在一个方面，独立地，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物的第一捕获试剂、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物的第二捕获试剂和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物的第三捕获试剂选自适体或抗体。
在一个方面，所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
在一个方面，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物中的每一者的靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
在一个方面，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物是非共价复合物。
在一个方面，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物中的每一者在它们相应的测试样品稀释液中形成，然后合并在所述制剂中。
在一个方面，所述适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在一个方面，所述部分是疏水性部分。
在一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在一些实施方案中，公开了一种制剂，所述制剂包含多种第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、多种第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和多种第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，其中所述多种第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物在测试样品的约0.005％稀释液中形成，所述多种第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物在所述测试样品的约0.5％稀释液中形成，并且所述多种第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物在所述测试样品的约20％稀释液中形成。
在一个方面，独立地，所述多种第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物的多种第一捕获试剂、所述多种第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物的多种第二捕获试剂和所述多种第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物的多种第三捕获试剂选自适体或抗体。
在一个方面，所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
在一个方面，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物中的每一者的靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
在一个方面，所述多种第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述多种第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述多种第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物是非共价复合物。
在一个方面，所述多种第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述多种第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述多种第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物在它们相应的测试样品稀释液中形成，然后合并在所述制剂中。
在一个方面，所述适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在一个方面，所述部分是疏水性部分。
在一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在一个方面，所述多种第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物的多种第一捕获试剂是约100、110、120、130、140、150、160、170或173；或100至700；或100至650种捕获试剂。
在一个方面，所述多种第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物的多种第二捕获试剂是约200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、820或900；或500至3500；或约700至2500；或800至2000；或约828种捕获试剂。
在一个方面，所述多种第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物的多种第三捕获试剂是约400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950，1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4200、4270、4500或5000；或约900至16,500；或约2000至15,000；或约3,000至12,000；或约4,000至10,000；或约4271种捕获试剂。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)将第一稀释液组与第二稀释液组顺序地合并，其中所述第一稀释液组是测试样品的X％稀释液并且包含第一捕获试剂结合至第一靶蛋白，从而形成第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物，所述第二稀释液组是所述测试样品的Y％稀释液并且包含第二捕获试剂结合至第二靶蛋白结，从而形成第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物，并且其中所述第一靶蛋白和第二靶蛋白是不同的蛋白质，并且其中X小于Y；b)使所述捕获试剂从它们相应的捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物解离；以及c)检测解离的捕获试剂的存在或测定解离的捕获试剂的水平。
在本文公开的方法的一些方面，所述方法还包括顺序合并第三稀释液组与所述第一稀释液组和第二稀释液组，其中所述第三稀释液组是所述测试样品的Z％稀释液并且包含第三捕获试剂结合至第三靶蛋白，从而形成第三捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物，其中所述第三靶蛋白不同于所述第一靶蛋白和第二靶蛋白，其中Y小于Z。
在一个方面，所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂是适体或抗体。
在一个方面，所述第一稀释液组和所述第二稀释液组是同一测试样品的稀释液。
在一个方面，所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
在一个方面，所述第三稀释液组是同一测试样品的不同稀释液，和/或其中所述第三捕获试剂是适体或抗体。
在一个方面，所述第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物是非共价复合物。
在一个方面，所述第一稀释液组是测试样品的0.001％至0.009％的稀释液(或其中X％是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或X％是0.002％至0.008％，或X％是0.003％至0.007％，或X％是约0.005％。
在一个方面，所述第二稀释液组是所述测试样品的0.01％至1％的稀释液(或其中Y％是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或Y％是0.1％至0.8％，或Y％是0.2％至0.75％，或Y％是约0.5％。
在一个方面，所述第三稀释液组是所述测试样品的5％至39％的稀释液(或Z％是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或Z％是15％至30％，或Z％是15％至25％，或Z％是约20％。
在一个方面，所述第一稀释液组还包含多种第一捕获试剂。
在一个方面，所述第二稀释液组还包含多种第二捕获试剂。
在一个方面，所述第三稀释液组还包含多种第三捕获试剂。
在一个方面，所述第一稀释液组还包含多种第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物。
在一个方面，所述第二稀释液组还包含多种第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物。
在一个方面，所述第三稀释液组还包含多种第三捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物。
在一个方面，所述第一稀释液组与第二稀释液组的顺序合并还包括在合并所述第一稀释液组和第二稀释液组之后的洗涤步骤。
在一个方面，所述第三稀释液组与所述第一稀释液组和第二稀释液组的顺序合并还包括在合并所述第一稀释液组、第二稀释液组和第三稀释液组之后的洗涤步骤。
在一个方面，所述多种第一捕获试剂是约100、110、120、130、140、150、160、170或173；或100至700；或100至650种捕获试剂。
在一个方面，所述多种第二捕获试剂是约200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、820或900；或500至3500；或约700至2500；或800至2000；或约828种捕获试剂。
在一个方面，所述多种第三捕获试剂是约400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950，1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4200、4270、4500或5000；或约900至16,500；或约2000至15,000；或约3,000至12,000；或约4,000至10,000；或约4271种捕获试剂。
在一个方面，在所述第一稀释液组和第二稀释液组的顺序合并之前，将所述第一稀释液组的第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物和所述第二稀释液组的第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物各自固定在它们相应的稀释液组中的第一固体载体上，并从所述第一固体载体释放以顺序地合并。
在一个方面，在所述第三稀释液组与所述第一稀释液组和第二稀释液组的顺序合并之前，将所述第三稀释液组的第三捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物固定在其相应的稀释液组中的第一固体载体上，并且从所述第一固体载体释放以顺序地合并。
在一个方面，通过使所述捕获试剂与所述固体载体缔合来将所述第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物固定在其第一固体载体上。
在一个方面，通过使所述捕获试剂与所述固体载体缔合来将所述第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物固定在其第一固体载体上。
在一个方面，通过使所述捕获试剂与所述固体载体缔合来将所述第三捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物固定在其第一固体载体上。
在一个方面，检测所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的存在或测定所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的水平通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行。
在一个方面，所述适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
在一个方面，所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
在一个方面，所述部分是疏水性部分。
在一个方面，所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
在一个方面，所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
在一个方面，所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
在一个方面，所述适体的长度是35-100个核苷酸。
在一个方面，所述适体包含共有蛋白结合结构域。
在一个方面，所述适体包含编号3-20的5-位修饰的嘧啶。
在一个方面，所述稀释液组的顺序合并的顺序选自将所述第一稀释液组与所述第二稀释液组合并，随后所述第三稀释液组；将所述第一稀释液组与所述第三稀释液组合并，随后第二稀释液组；将所述第二稀释液组与所述第三稀释液组合并，随后所述第一稀释液组；将所述第二稀释液组与所述第一稀释液组合并，随后第三稀释液组；将所述第三稀释液组与所述第一稀释液组合并，随后所述第二稀释液组；以及将所述第三稀释液组与所述第二稀释液组合并，随后所述第一稀释液组。
在一个方面，所述稀释液组的顺序合并的顺序选自将所述第一稀释液组与所述第二稀释液组合并以及将所述第二稀释液组与所述第一稀释液组合并。
在一个方面，检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平是检测靶蛋白的存在或测定靶蛋白的水平的替代。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)从第一固体载体释放第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至第一混合物；b)从第二固体载体释放第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至所述第一混合物，从而将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物合并在所述第一混合物中；c)将第一标签连接至所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物的靶分子上；d)使所述标记的第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物与一个或多个第三固体载体接触，以使得所述标签将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物固定至所述一个或多个第三固体载体；e)使所述捕获试剂与所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；f)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；其中，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物各自在同一测试样品的不同稀释液中形成。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)使固定在第一固体载体上的第一捕获试剂与第一稀释液接触以形成第一混合物，并使固定在第二固体载体上的第二捕获试剂与第二稀释液接触以形成第二混合物，并且其中所述第一捕获试剂和第二捕获试剂中的每一者均能够结合至靶分子；b)分别孵育所述第一混合物和第二混合物，其中如果所述第一混合物中存在所述第一捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第一混合物中形成第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，并且其中如果所述第二混合物中存在所述第二捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第二混合物中形成第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；c)从所述第一固体载体释放所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至第三混合物；d)从所述第二固体载体释放所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；e)在步骤c)之后，将所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至所述第三混合物，从而将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物合并在所述第三混合物中；f)将第一标签连接至所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物的靶分子；g)使所述标记的第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物与第三固体载体接触，以使得所述标签将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物固定至所述第三固体载体；h)使所述捕获试剂与它们相应的捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离，以及i)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；其中，所述第一稀释液和所述第二稀释液是测试样品的不同稀释液。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)从第一固体载体释放第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至第一混合物；b)从第二固体载体释放第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至所述第一混合物，从而将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物合并；c)从第三固体载体释放第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至所述第一混合物，从而将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物合并；d)将第一标签连接至所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物的靶分子上；e)使所述标记的第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物与一个或多个第四固体载体接触，以使得所述标签将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物固定至所述一个或多个第四固体载体；f)使所述捕获试剂与所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；以及g)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；其中，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物各自在同一测试样品的不同稀释液中形成。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)从第一固体载体释放第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至第一混合物；b)从第二固体载体释放第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至所述第一混合物，从而将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物合并在所述第一混合物中；c)使所述捕获试剂与所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；以及f)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；其中，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物各自在同一测试样品的不同稀释液中形成。
在一些实施方案中，公开了一种方法，所述方法包括：a)从第一固体载体释放第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至第一混合物；b)从第二固体载体释放第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至所述第一混合物，从而将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物合并在所述第一混合物中；c)从第三固体载体释放第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物并将所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物转移至第一混合物，从而将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物合并在所述第一混合物中；e)使所述捕获试剂与所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；以及f)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；其中，所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物各自在同一测试样品的不同稀释液中形成。
在本文所述的方法、制剂和系统中的任一者中，所述方法、制剂和/或系统还包含竞争物分子。
在本文所述的方法、制剂和系统中的任一者中，所述方法、制剂和/或系统，所述竞争物分子的浓度是约10μM至约120μM(或10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120μM)；或约15μM至约80μM；或约20μM；或约30μM或约60μM。
在本文所述的方法、制剂和/或系统中的任一者中，所述方法、制剂和/或系统，所述竞争物分子选自寡核苷酸、聚阴离子、肝素、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA、tRNA、硫酸葡聚糖、葡聚糖、非碱性磷酸二酯聚合物、dNTP和焦磷酸酯。
在本文所述的方法、制剂和系统中的任一者中，所述方法、制剂和/或系统，所述竞争物分子是包含核苷酸序列(A-C-BndU-BndU)7AC的寡核苷酸。
在本文所述的方法、制剂和系统中的任一者中，所述方法、制剂和/或系统，所述竞争物分子对于测试样品的浓度是约30μM，其中所述测试样品是血浆。
在本文所述的方法、制剂和系统中的任一者中，所述方法、制剂和/或系统，所述竞争物分子对于测试样品的浓度是约60μM，其中所述测试样品是血清。
实施例
提出以下实施例以便更完全地说明本发明的一些实施方案。然而，这些实施例决不应当解释为对本发明的广泛范围的限制。本领域的普通技术人员可在不背离本发明的精神的情况下，容易地采用本发现的基本原理来设计各种化合物。
实施例1.样品的多重适体分析
此实施例描述用于分析样品和对照的多重适体测定。
多重适体测定方法
除非另外指出，否则多重适体测定的所有步骤均在室温下进行。
适体主混合物溶液的制备。
将5272种适体分组为三种独特的混合物，Dil1、Dil2和Dil3，并且分别对应于20％、0.5％和0.005％的血浆或血清样品稀释液。通过测定匹配的血浆和血清样品与每种适体的稀释系列并鉴定给出最大线性信号范围的样品稀释液来凭经验确定将适体分配至混合物。适体的分离以及与血浆或血清样品的不同稀释液(20％、0.5％或0.005％)的混合使得所述测定跨越107倍范围的蛋白质浓度。以每种适体4nM在HE-Tween缓冲液(10mMHepes(pH 7.5)、1mM EDTA、0.05％Tween 20)中制备适体主混合物的储备溶液，并冷冻储存在-20℃。将4271种适体混合在Dil1混合物中，将828种适体混合在Dil2混合物中，并且将173种适体混合在Dil3混合物中。在使用前，将储备溶液于HE-Tween缓冲液中稀释至每种适体0.55nM的工作浓度，并等分成单独使用的等分试样。在将适体主混合物用于Catch-0板制备之前，将工作溶液加热冷却，以在使用之前通过在95℃下孵育10分钟、然后在25℃下孵育至少30分钟来重新折叠适体。
Catch-0板制备。
将60μL的链霉亲和素Mag Sepharose 10％浆液(GE Healthcare，28-9857)与100μL的热冷却适体主混合物合并。将混合物用175μL测定缓冲液(40mM HEPES(pH 7.5)、100mMNaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、1mM EDTA、0.05％Tween-20)洗涤一次，然后分配至96孔板(Thermo Scientific，AB-0769)的每个孔。在25℃下将板在ThermoMixer C振荡器(Eppendorf)上在850rpm下振荡孵育30分钟。在孵育30分钟后，将6μL MB封闭缓冲液(50mMTris-HCl(pH 8)中的50mM D-生物素，0.01％Tween)添加至板的每个孔，并在振荡下将板进一步孵育2分钟。然后将板用175μL的测定缓冲液洗涤，在ThermoMixer C上以850rpm振荡1分钟的洗涤周期，随后在磁体上分离30秒。在除去洗涤溶液后，将珠粒重悬于175μL的测定缓冲液中，并储存在-20℃直至使用。
Catch-2珠粒制备。
在开始测定的自动处理之前，将用于多重适体测定的Catch-2步骤的MyOne链霉亲和素C1珠粒(Dynabeads，零件号35002D，Thermo Scientific)的10mg/mL珠粒浆液在MB制备型缓冲液(10mM Tris-HCl(pH8)，1mM EDTA，0.4％SDS)中批量洗涤一次持续5分钟，随后用测定缓冲液洗涤两次。在最后一次洗涤后，将珠粒以10mg/mL的浓度重新悬浮，并将75μL的珠粒浆液分配至Catch-2板的每个孔中。在测定开始时，将Catch-2板放在铝适配器中，并放在Fluent平台上的适当位置。
样品解冻和稀释。
通过在室温下孵育十分钟，将100％血浆或血清样品的65μL等分试样储存在-80℃的Matrix管中。为了便于解冻，将管放在风扇单元的顶部，所述风扇单元使空气循环通过Matrix管架。在解冻后，将样品以1000×g离心1分钟，并且放在Fluent自动机器平台上用于样品稀释。通过将35μL解冻的样品转移至含有140μL适当样品稀释剂的96孔板中来制备20％样品溶液。用于血浆的样品稀释剂是50mM Hepes(pH 7.5)、100mM NaCl、8mM MgCl2、5mM KCl、1.25mM EGTA、1.2mM苯甲脒、37.5μM Z-Block和1.2％Tween-20。血清样品稀释剂含有75μM Z-block，其他组分与血浆样品稀释剂中的浓度相同。在Fluent自动机器上使用系列稀释液，将要制成0.5％和0.005％的稀释液样品的随后稀释液制成测定缓冲液。为了制备0.5％样品稀释液，通过将45μL的20％样品与180μL的测定缓冲液混合来将20％样品的中间稀释液制成4％，然后通过将25μL的4％稀释液样品与175μL测定缓冲液混合来制成0.5％样品。为了制备0.005％样品，通过将20μL的0.5％样品与180μL的测定缓冲液混合来制备0.05％的中间稀释液，然后通过将20μL的0.05％样品与180μL的测定缓冲液混合来制备0.005％样品。
样品结合步骤。
如上所述通过将适体混合物固定在链霉亲和素磁性琼脂糖凝胶珠粒上来制备Catch-0板。将冷冻的板在25℃下解冻30分钟，并用175μL的测定缓冲液洗涤一次。将100μL的每种样品稀释液(20％、0.5％和0.005％)添加至含有具有三种不同适体主混合物(分别是Dil1、Dil2和Dil3)的珠粒的板中。然后将Catch-0板用铝箔密封件(Microseal'F'Foil，Bio-Rad)密封，并置于设定在850rpm，28℃的4板旋振荡器(PHMP-4，Grant Bio)中。使样品结合步骤进行3.5小时。
Fluent自动机器上的多重适体测定处理。
样品结合步骤完成后，将Catch-0板放入铝板适配器中并放在自动机器平台上。使用温控板进行磁珠洗涤步骤。对于所有自动处理步骤，将板设置在25℃的温度，除了如下所述的Catch-2洗涤。将板用175μL的测定缓冲液洗涤4次，每个洗涤循环被编程为以1000rpm振荡板至少1分钟，然后在缓冲液抽吸之前将磁珠分离至少30秒。在最后的洗涤周期中，通过将100x标签试剂(EZ-Link NHS-PEG4-生物素，零件号21363，Thermo，在无水DMSO中制备的100mM溶液)1:100稀释于测定缓冲液中来制备标签试剂并倒入自动机器平台上的槽中。将100μL标签试剂添加至板中的每个孔中，并在1200rpm振荡下孵育5分钟，以使捕获在珠粒表面上的蛋白质生物素化。通过向每个孔中添加175μL淬灭缓冲液(测定缓冲液中的20mM甘氨酸)来淬灭生物素化反应。将板静态孵育3分钟，然后用175μL测定缓冲液洗涤4次，在与如上所述的相同条件下进行洗涤。
光裂解和动力学激发。
在最后一次洗涤板后，将90μL光裂解缓冲液(测定缓冲液中的2μM寡核苷酸竞争物；竞争物具有核苷酸序列5′-(AC-Bn-Bn)7-AC-3′，其中Bn表示5-位苄基取代的脱氧尿苷残基)添加至板的每个孔中。将板移至Fluent平台上的光裂解分台(substation)。所述分台由BlackRay光源(UVP XX系列台灯，365nm)和三个Bioshake 3000-T振荡器(QInstruments)组成。在1000rpm振荡下将板辐照20分钟。
Catch-2珠粒捕获。
在光裂解过程结束时，经由磁力分离从Catch-2板除去缓冲液，用100μL测定缓冲液将板洗涤一次。从稀释3板开始，从每个Catch-0板除去含有适体-蛋白质复合物的光裂解的洗脱液。首先将所有90μL的溶液转移至带有凸起磁体的振荡器上的Catch-1洗脱板中，以捕获可能已被吸出的任何链霉亲和素磁性琼脂糖凝胶珠粒。之后，将溶液转移至Catch-2板，并将板在25℃下在1400rpm振荡下孵育3分钟。孵育3分钟后，将磁珠分离90秒，从板中除去溶液，并将光裂解的Dil2板溶液添加至板。按照相同的过程，添加来自Dil1板的溶液并孵育3分钟。3分钟孵育结束时，将6μL MB封闭缓冲液添加至磁珠悬浮液中，并将珠粒在25℃下在1200rpm振荡下孵育2分钟。孵育后，将板转移至预设为38℃的温度的不同振荡器中。将磁珠分离2分钟，然后除去溶液。然后，将Catch-2板用175μL MB洗涤缓冲液(测定缓冲液中的20％甘油)洗涤4次，每个洗涤循环被编程为以1200rpm振荡珠粒1分钟，并使珠粒在磁体上分配3.5分钟。在最后的珠粒分离步骤中，将振荡器温度设置为25℃。然后将珠粒用175μL的测定缓冲液洗涤一次。对于此洗涤步骤，将珠粒以1200rpm振荡1分钟，然后使其在磁体上分离2分钟。在洗涤步骤后，使用洗脱缓冲液(1.8M NaClO4、40mM PIPES(pH 6.8)、1mM EDTA、0.05％Triton X-100)将适体从纯化的适体-蛋白质复合物中洗脱。在25℃下，使用75μL洗脱缓冲液将洗脱进行10分钟，以1250rpm振荡珠粒。将70μL洗脱液转移至存档板，并在磁体上分离，以分隔可能已被吸出的任何磁珠。将10μL洗脱的物质转移至黑色半面积板中，在测定缓冲液中1:5稀释，并用于测量作为内部测定QC监测的花菁3荧光信号。将20μL洗脱的物质转移至含有5μL杂交封闭溶液(Oligo aCGH/ChIP-on-chip杂交试剂盒，大容量，AgilentTechnologies 5188-5380，含有与Agilent阵列上的角标记物探针互补的花菁3标记的DNA序列的掺杂物)的板上。将此板从自动机器平台移除，并进一步处理以进行杂交(参见下文)。使用铝箔将带有剩余洗脱溶液的存档板加热密封，并在-20℃储存。
杂交。
将25μL的2x Agilent杂交缓冲液(Oligo aCGH/ChIP-on-chip杂交试剂盒，Agilent Technologies，零件号5188-5380)手动吸移至含有洗脱样品和封闭缓冲液的板的每个孔中。将40μL的此溶液手动吸移至杂交垫片载玻片的每个“孔”中(杂交垫片载玻片-每个载玻片格式8个微阵列，Agilent Technologies)。根据制造商的方案，将定制SurePrintG38x60kAgilent微阵列载玻片(每个阵列含有与每个适体互补的10个探针)放置在垫片载玻片上。将每个组件(Hybridization Chamber Kit-SureHyb enabled，AgilentTechnologies)紧紧夹住，并在55℃下在20rpm旋转下负载到杂交箱中19个小时。
杂交后洗涤。
使用Little Dipper Processor(型号650C，Scigene)进行载玻片洗涤。将大约700mL洗涤缓冲液1(Oligo aCGH/ChIP-on-chip洗涤缓冲液1，Agilent Technologies)放到大的玻璃染色皿中并用于使微阵列载玻片与垫片载玻片分离。一旦拆卸，就将载玻片迅速转移至在Little Dipper上含有洗涤缓冲液1的浴中的载玻片架中。将载玻片在洗涤缓冲液1中洗涤五分钟，同时经由磁力搅拌棒混合。然后将载玻片架转移至装有37℃洗涤缓冲液2(Oligo aCGH/ChIP-onchip洗涤缓冲液2，Agilent Technologies)的浴中，并在搅拌下孵育五分钟。将载玻片架从第二浴中缓慢移除，然后转移至含有乙腈的浴中，并在搅拌下孵育五分钟。
微阵列成像。
用微阵列扫描仪(Agilent G4900DA微阵列扫描仪系统，Agilent Technologies)在花菁3-通道中在100％PMT设定下以3μm分辨率对微阵列载玻片进行成像，且激活20-位选项。使用Agilent特征提取软件(10.7.3.1版或更高)，利用GE1_1200_Jun14方案处理所得tiff格式图像。
实施例2：多重测定中的非特异性靶分子捕获
此实施例提供多捕获多重测定中非特异性靶分子捕获和残留的描述。
一般来说，许多测定形式的灵敏度和特异性因检测方法在测定期间从由于非特异性缔合产生的信号中解析真信号(其产生不想要的可检测信号(假阳性或测定“噪声”))的能力而受到影响。对于多重测定尤其如此。已经观察到，非特异性结合的主要来源之一是非预期捕获试剂-靶分子相互作用的功能。此实施例描述非特异性捕获试剂-靶分子相互作用如何在测定中产生不想要的信号或“噪音”。
对于此实施例，使用具有双捕获系统的基于适体的多重测定和测试样品的多种稀释液来模拟非特异性靶分子(例如，蛋白质)捕获和由于非预期适体-靶分子相互作用所致的残留，其产生落在测定的动态范围之外的测定信号并降低测定的灵敏度和特异性。
简言之，通过将固定至第一固体载体(例如，使用试剂上的生物素的链霉亲和素珠粒)的适体试剂与生物样品(例如血清或血浆)一起孵育并使生物样品中的蛋白质结合至它们的同源适体(称为“catch-1”)来进行基于适体的测定。然后将标签连接至蛋白质，并且然后从第一固体载体释放适体-蛋白质靶标复合物，并暴露于第二固体载体，从而经由标签将适体-靶蛋白复合物固定在蛋白质上(称为“catch-2”)。然后洗涤复合物以从catch-2除去任何未结合的适体和蛋白质。洗涤后，将适体从第二固体载体上的适体-靶蛋白复合物中释放并捕获用于检测目的(例如，杂交阵列)。适体的定量用作生物样品中的蛋白质量的替代。基于适体的测定可与单一适体试剂或多种适体试剂(或多重形式)一起使用。
对于本实施例，制备了血浆样品的三个不同的稀释液组(对血清也进行了相同的“蛋白质残留研究”，并且结果与血清的结果平行；数据未示出)。图6提供所制备的三个不同的血浆稀释液组的概览：0.005％稀释液(DIL1)、0.5％稀释液(DIL2)和20％稀释液(DIL3)，其中分别测量了相对高丰度蛋白质、中等丰度蛋白质和低丰度蛋白质。此外，DIL1、DIL2和DIL3中的每一者的适体组分别是A1、A2和A3。对于总计5,272种不同的适体，A3组适体具有4,271种不同的适体(或适体总数的约81％)，A2组具有828种不同的适体(或适体总数的约16％)，并且A1组具有173种不同的适体(适体总数的约3％)。
测试了五种不同的条件，以确定在多重测定中是否存在蛋白质残留效应。这些条件在以下表2中示出。
表2.
Figure BDA0002944357280000401
如上所述，用双捕获系统对每种条件进行基于适体的多重测定。所述条件的不同在于是否存在生物样品(例如血浆)或空白，空白是没有生物样品且因此没有蛋白质的测定缓冲液。每个稀释液组(无论是否存在稀释的生物样品或空白)都与其相应的适体组一起孵育(A1与DIL1或空白1；A2与DIL2或空白2；A3与DIL3或空白3)。在每种情况下，将来自每个适体组的适体预先固定在第一固体载体上，然后与它们的相应稀释液或空白一起孵育(catch-1)。孵育后，然后将标签连接至蛋白质(如果存在)上，并且然后从三种单独稀释液和/或空白中的第一固体载体释放适体-蛋白质靶标复合物(如果存在)，并同时合并为单一混合物，然后暴露于第二固体载体，从而经由标签将所述适体-靶蛋白复合物(如果存在)固定在蛋白质上(称为“catch-2”)。然后洗涤复合物以从catch-2除去任何未结合的适体和蛋白质。洗涤后，将适体从第二固体载体上的适体-靶蛋白复合物中释放并捕获用于经由杂交阵列的检测目的。经由相对荧光单位(RFU)对适体的定量用作生物样品中的蛋白质的量的替代。
将条件1血浆稀释成三个稀释液组(0.005％稀释度的DIL1；0.5％稀释度的DIL2和20％稀释度的DIL3)，将它们与它们的相应适体组(A1、A2和A3)一起孵育。条件2具有DIL1血浆稀释液(0.005％)和分别代替DIL2和DIL3的空白1和空白2，将它们与它们的相应适体组(A1、A2和A3)一起孵育。条件3具有DIL2血浆稀释液(0.5％)和分别代替DIL1和DIL3的空白1和空白3，将它们与它们的相应适体组(A1、A2和A3)一起孵育。条件4具有DIL3血浆稀释液(20％)和分别代替DIL1和DIL2的空白1和空白2，将它们与它们的相应适体组(A1、A2和A3)一起孵育。最后，条件5没有血浆稀释液，并且具有所有空白(空白1、空白2和空白3)，将它们与它们的相应适体组(A1、A2和A3)一起孵育。对每种条件进行实施例1中所述的catch-1和catch-2测定，由此在从catch-1中释放后将稀释液和/或空白全部合并在一起以移至测定的catch-2部分。
为了定量任何蛋白质残留，绘制条件1(即所有三个稀释液组DIL1、DIL2和DIL3)的适体信号与条件2、3和4各自的适体信号的比率的累积分布函数(CDF)(其中仅存在一个稀释液组和空白)(参见图10)。适体信号的比率由源自杂交阵列的相对荧光单位(RFU)表示。图10示出，对于条件4(其中仅存在血浆样品的20％稀释液(DIL3))，条件1中的适体与条件4中的相同适体的RFU值的比率是约1。相比之下，对于条件3(其中仅存在血浆样品的0.5％稀释液(DIL2))，条件1的适体相对于条件3中的相同适体的RFU值的比率是约1至6，其中条件1的约45％或更多的适体以是条件3的相同适体的约2至6倍进行信号传导。在相对于条件1观察条件3下单个适体的信号传导(例如，结合蛋白ASM3A的适体是与DIL2稀释液一起孵育的A2组适体的一部分)时，条件1中的ASM3A适体是条件3的5倍。对于条件2(其中仅存在血浆样品的0.005％稀释液(DIL1))，条件1的适体相对于条件2中的相同适体的RFU值的比率也是约1至6倍，其中条件1的约20％或更多的适体以是条件2的相同适体的约2至6倍进行信号传导。与结合至ApoE蛋白的适体(其是A1适体组的一部分并与DIL1稀释液一起孵育)相比，这种适体在条件1中具有为条件2的200倍的RFU值，在条件1中具有为条件4的80倍的RFU值，并且在条件1中具有为条件3的600倍的RFU值。
这些数据表明，对于0.5％血浆稀释液样品(DIL2)和0.005％血浆稀释液样品(DIL1)，当在测定的catch-2阶段同时合并所有三个稀释液样品时，在测定中检测到的信号来自20％血浆稀释液样品(DIL3)的蛋白质残留。这种蛋白质残留很可能是由于在测定的catch-1阶段，20％血浆稀释液样品(DIL3)中与A3适体组中的适体非特异性结合的蛋白质通过例如从第一固体载体光裂解(catch-1)而释放至溶液中，并且转移至测定的catch-2阶段，其中所有三个稀释液组和适体组同时合并。在测定的这一阶段，当添加竞争物以防止非特异性适体-蛋白质相互作用时，允许从20％血浆稀释液非特异性残留的蛋白质与来自A2适体和A1适体组的未结合的适体相互作用，并且随后遇到它们的同源适体以形成稳定的复合物。然后将这些蛋白质残留物:适体复合物破坏，并在杂交阵列上检测到适体为阳性信号，从技术上讲这是假阳性信号或“噪音”。用血清作为生物样品观察到这些相同数据(数据未示出)。
这些数据表明需要蛋白质残留减轻策略来确保多重测定保持在测定的动态范围内，并且测定的灵敏度和特异性达到最大。
实施例3：减少多重测定中的非特异性靶分子捕获的减轻策略
此实施例提供用于减少多捕获多重测定中的非特异性靶分子捕获和残留的示例性减轻策略的描述。
实施例1提供了如何从测定中的非特异性靶分子捕获和残留及其来源中获得多捕获多重测定中的阳性信号。为了减轻这种多捕获多重测定中不想要的蛋白质残留，在从测定的catch-1阶段转移至测定的catch-2阶段的过程中进行生物样品的稀释液样品以及相应的适体组的顺序释放和捕获。图9和图7中分别示出两种稀释液和三种稀释液顺序捕获形式的概述。
对于此实施例，如实施例1中所述，制备了血浆的同一三个不同的稀释液组(DIL3、DIL2和DIL1)以及相同的适体组(A1、A2和A3)(参见图8)。另外，使用与实施例1的表2中描述的相同的条件。根据实施例1，遵循与针对所述测定的catch-1阶段所描述的相同方法；然而，对于此实施例，将不同的稀释液组或空白分别释放并顺序(代替根据实施例1的同时)转移至测定的catch-2阶段(参见图8)。更具体地，对于条件1，使与适体组A1一起孵育的DIL1组(DIL1-A1组)从catch-1释放，并固定在第二固体载体(catch-2)上，并洗涤。接下来，将与适体组A2一起孵育的DIL2组从catch-1释放，与已经固定在catch-2上的DIL1-A1组合并，然后固定至第二固体载体(catch-2)上。并且，将与适体组A3一起孵育的DIL3组从catch-1释放，并固定在第二固体载体(catch-1)中，并洗涤。使如在表2中概述的包括空白(空白1、2和/或3)代替稀释的生物样品的剩余条件(条件2、3、4和5)进行相同的顺序捕获方法。
为了定量任何蛋白质残留，绘制条件1(即所有三个稀释液组DIL1、DIL2和DIL3)的适体信号与条件2、3和4各自的适体信号的比率的累积分布函数(CDF)(其中仅存在一个稀释液组和空白)(参见图11)。适体信号的比率由源自杂交阵列的相对荧光单位(RFU)表示。与多重测定的非顺序形式相似，图11示出，对于条件4(其中仅存在血浆样品的20％稀释液(DIL3))，条件1中的适体与条件4中的相同适体的RFU值的比率是约1。对于条件3(其中仅存在血浆样品的0.5％稀释液(DIL2))，条件1的适体相对于条件3中的相同适体的RFU值的比率是约1至6；然而，条件1的仅少于约5％的适体以是条件3的相同适体的约2至6倍进行信号传导(相对于测定的非顺序catch-2形式中的45％)。此外，对于条件2(其中仅存在血浆样品的0.005％稀释液(DIL1))，条件1的适体相对于条件2中的相同适体的RFU值的比率也是约1至6倍；然而，条件1的仅少于约10％的适体以是条件2的相同适体的约2至6倍进行信号传导(相对于测定的非顺序catch-2形式的20％)。用血清作为生物样品观察到这些相同数据(数据未示出)。
这些数据表明，在具有两个或更多个样品稀释液组的双捕获多重测定中，可通过将两个或更多个稀释的生物样品组及其相应的孵育捕获试剂从测定的第一捕获阶段顺序转移至测定的第二捕获阶段来减轻蛋白质残留。这种顺序转移方法确保多重测定保持在测定的动态范围内，使测定的灵敏度和特异性最大化，并且减少测定中的潜在假阳性信号或“噪声”。
实施例4：在多重测定中使线性范围内具有最高中值信号与背景比的分析物数量最大化的生物样品的稀释液选择
此实施例提供选择生物样品的稀释水平的描述，所述选择使线性范围内的分析物数量最大化、同时在多重测定中仍保持最大的中值信号与背景信号比。
在其中通过多种捕获试剂测量多个靶蛋白的多重测定形式中，不同靶蛋白的丰度的自然变化可限制某些捕获试剂测量某些靶蛋白的能力(例如，高丰度靶蛋白可能使测定饱和并防止或降低所述测定测量低丰度靶蛋白的能力)。为了解决生物样品中的这种变化，基于生物样品中它们的相应蛋白质靶标的丰度，将适体试剂分为至少两个不同的组，优选三个不同的组。将生物样品稀释成至少两个、优选三个不同的稀释液组中，以基于待由它们的捕获试剂检测的蛋白质靶标的相对浓度来产生单独的测试样品。因此，将生物样品稀释成高、中等和低丰度靶蛋白稀释液组，其中在最低稀释度组中测量丰度最低的蛋白质靶标，并且在最大稀释度组中测量丰度最高的蛋白质靶标。过去，对于基于适体的多捕获多重测定，生物样品的三个稀释液组是40％稀释液、1％稀释液和0.005％稀释液。
对于此实施例，重新考察了40％稀释液组，以确定不同的稀释液是否将为多捕获多重测定提供更大的益处(例如，使测定的线性范围内的分析物数量最大化和/或提高中值信号与背景信号比)。与单独的缓冲液相比，这个稀释液组表现出一些非特异性结合、信号非线性和来自阴性对照的更高信号。
简言之，由来自三个不同受试者的血浆制成几个稀释液组(40％、20％、10％和5％稀释液组)。将一组903种适体与来自所有三个受试者的不同稀释液组一起孵育，并用于本文所述的双捕获多重测定中。
确定如通过杂交阵列中的适体测量的每种稀释液(40％、20％、10％和5％)的线性范围内的分析物数量。对于40％稀释液，246种分析物在线性范围内；对于20％稀释液，388种分析物在线性范围内；对于10％稀释液，517种分析物在线性范围内；并且对于5％稀释液，585种分析物在线性范围内。903种中的其余259种没有线性范围。因此，这些数据表明，随着样品稀释度增加，线性范围内的分析物数量也增加(即，稀释度越高的样品在线性范围内提供的分析物数量越大)。
每种稀释液(40％、20％、10％和5％)表现出不同的中值信号与背景信号比(或中值S/B)。对于40％稀释液，中值S/B是10；对于20％稀释液，中值S/B是7.8；对于10％稀释液，中值S/B是5.4；并且对于5％稀释液，中值S/B是3.7。因此，这些数据表明随着样品进一步稀释，中值S/B降低。
以上数据表明，线性范围内的分析物数量与和样品稀释度有关的中值S/B之间存在张力。在平衡观察到的线性范围内的分析物数量的改进(其中稀释度越高，中值S/B值越高)与较低的稀释度时，针对生物样品的“最佳”稀释度选择了“中间立场”用于双捕获多重适体测定。图12是对于40％、20％、10％和5％的稀释度中的每一者，线性范围内的分析物数量连同中值S/B的图形表示。根据图12，在生物样品的20％稀释度下，观察到线性范围内具有最大中值S/B的最大分析物数量(其中两条线相交)。因此，在多捕获多重适体测定中使用的三种稀释液中，靶向“低丰度”蛋白的适体更适合与生物样品的20％稀释液而非40％稀释液一起孵育。
总之，本文实施例部分中描述的多重测定使用20％、0.5％和0.005％的样品稀释形式。此外，血清中较高的竞争物分子浓度导致来自同一个体的血清和血浆的测量结果之间具有更好的相关性(数据未示出)。此外，较高的竞争物分子浓度(30μM或60μM相比20μM)和较低的样品浓度(例如，40％相比20％)导致增加的掺杂和回收，即线性范围内的分析物数量增加和较少的非特异性结合。样品稀释剂中竞争物分子(Z-block；具有序列((A-C-BndU-BndU)7AC的寡核苷酸)的浓度对于血清样品为60μM，并且对于血浆样品为30μM。对于血清和血浆，先前的测定形式使用20μM Z-block。血清中较高的竞争物分子浓度导致来自同一个体的血清和血浆的测量结果之间具有更好的相关性(数据未示出)。减少的非特异性结合应产生光裂解后可用于复合物形成的蛋白质量减少。

Claims (75)

1.一种方法，所述方法包括：
a)使第一稀释液样品与第一适体接触，其中如果所述第一稀释液样品中存在靶分子，则通过所述第一适体与其靶分子的相互作用形成第一适体亲和力复合物；
b)使第二稀释液样品与第二适体接触，其中如果所述第二稀释液样品中存在靶分子，则通过所述第二适体与其靶分子的相互作用形成第二适体亲和力复合物；
c)分别孵育所述第一稀释液样品和所述第二稀释液样品以允许适体亲和力复合物形成；
d)将具有所述第一适体亲和力复合物的所述第一稀释液样品转移至第一混合物，其中所述第一适体亲和力复合物被捕获在所述第一混合物中的固体载体上；
e)在步骤d)之后，将所述第二稀释液样品转移至所述第一混合物以形成第二混合物，其中所述第二稀释液的所述第二适体亲和力复合物被捕获在所述第二混合物中的固体载体上；
f)检测所述第一适体亲和力复合物和所述第二适体亲和力复合物的所述第一适体和所述第二适体的存在或测定所述第一适体亲和力复合物和所述第二适体亲和力复合物的所述第一适体和所述第二适体的水平，或一种或多种第一适体亲和力复合物和第二适体亲和力复合物的存在或量；
其中，所述第一稀释液和所述第二稀释液是同一测试样品的不同稀释液。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述第一适体-靶分子亲和力复合物和所述第二适体-靶分子亲和力复合物是非共价复合物。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
11.如权利要求1所述的方法，其中检测所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的存在或测定所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的水平通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述第一适体和/或所述第二适体独立地包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在所述嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述部分是疏水性部分。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
18.如权利要求12所述的方法，其中所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
19.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括使第三稀释液样品与第三适体接触，其中如果所述第三稀释液样品中存在靶分子，则通过所述第三适体与其靶分子的相互作用形成第三适体亲和力复合物；
20.如权利要求19所述的方法，其中将所述第三稀释液样品与所述第一稀释液样品和所述第二稀释液样品分开孵育以允许所述第三适体与其靶分子的适体亲和力复合物形成。
21.如权利要求20所述的方法，所述方法还包括将所述第三稀释液样品转移至所述第二混合物以形成第三混合物，其中所述第三稀释液的第三适体亲和力复合物被捕获在所述第三混合物中的固体载体上。
22.如权利要求21所述的方法，所述方法还包括检测所述第三适体亲和力复合物的所述第三适体的存在或测定所述第三适体亲和力复合物的所述第三适体的水平，或所述第三适体亲和力复合物的存在或量；
23.如权利要求19所述的方法，其中所述第三稀释液是与同一测试样品的所述第一稀释液和所述第二稀释液不同的稀释液。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述第三稀释液是所述测试样品的选自5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)、15％至30％、15％至25％、约20％；0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)、0.1％至0.8％、0.2％至0.75％、约0.5％；以及0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)、或0.002％至0.008％、0.003％至0.007％、约0.005％的稀释液。
25.如权利要求19所述的方法，其中所述第三适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在所述嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述部分是疏水性部分。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
31.如权利要求25所述的方法，其中所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
32.一种方法，所述方法包括：
a)使第一捕获试剂与第一稀释液接触以形成第一混合物，并使第二捕获试剂与第二稀释液接触以形成第二混合物，其中所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂中的每一者各自被固定在固体载体上，并且其中所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂中的每一者对不同的靶分子具有亲和力；
b)分别孵育所述第一混合物和所述第二混合物，其中如果所述第一混合物中存在所述第一捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第一混合物中形成第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，其中如果所述第二混合物中存在所述第二捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第二混合物中形成第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；
c)以选自以下的顺序将所述亲和力复合物顺序地释放并合并在第四混合物中：(i)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，和(ii)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；
d)将第一标签连接至所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物的所述靶分子；
e)使所述标记的第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物与一个或多个固体载体接触，以使得所述标签将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物固定至所述一个或多个固体载体；
f)使所述捕获试剂从所述捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；
g)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；
其中，所述第一稀释液和所述第二稀释液是测试样品的不同稀释液。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物是非共价复合物。
35.如权利要求32所述的方法，其中所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂独立地选自适体或抗体。
36.如权利要求32所述的方法，其中所述靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
37.如权利要求32所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
38.如权利要求32所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
39.如权利要求32所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
40.如权利要求32所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
41.如权利要求32所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
42.如权利要求32所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
43.如权利要求32所述的方法，其中检测所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的存在或测定所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的水平通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行。
44.如权利要求32所述的方法，所述方法还包括使第三捕获试剂与第三稀释液接触以形成第三混合物，其中所述第三捕获试剂被固定在固体载体上，并且其中所述第三捕获试剂对与所述第一捕获试剂和所述第二捕获试剂的所述靶分子不同的靶分子具有亲和力。
45.如权利要求44所述的方法，所述方法还包括将所述第三混合物与所述第一混合物和所述第二混合物分开孵育，其中如果所述第三混合物中存在所述第三捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第三混合物中形成第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物。
46.如权利要求45所述的方法，所述方法还包括以选自以下的顺序将所述第三捕获试剂-靶分子亲和力与所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物顺序地释放并合并在所述第四混合物中：(i)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(ii)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iii)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iv)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(v)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；以及(vi)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物。
47.如权利要求45所述的方法，其中所述第三稀释液是与同一测试样品的所述第一稀释液和所述第二稀释液不同的稀释液。
48.如权利要求45所述的方法，其中所述第三稀释液是测试样品的选自5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)、15％至30％、15％至25％、约20％；0.01％至1％(或0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)、0.1％至0.8％、0.2％至0.75％、约0.5％；以及0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)、或0.002％至0.008％、0.003％至0.007％、约0.005％的稀释液。
49.如权利要求46所述的方法，所述方法还包括检测所述第三适体亲和力复合物的所述第三适体的存在或测定所述第三适体亲和力复合物的所述第三适体的水平，或所述第三适体亲和力复合物的存在或量。
50.如权利要求32至49所述的方法，其中所述适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在所述嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述部分是疏水性部分。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
55.如权利要求53所述的方法，其中所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
56.如权利要求50所述的方法，其中所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
57.一种方法，所述方法包括：
a)使第一捕获试剂与第一稀释液接触以形成第一混合物，使第二捕获试剂与第二稀释液接触以形成第二混合物，并使第三捕获试剂与第三稀释液接触以形成第三稀释液混合物，其中所述第一捕获试剂、所述第二捕获试剂和所述第三捕获试剂中的每一者各自被固定在固体载体上，并且其中所述第一捕获试剂、所述第二捕获试剂和所述第三捕获试剂中的每一者对不同的靶分子具有亲和力；
b)分别孵育所述第一混合物、所述第二混合物和所述第三混合物，其中如果所述第一混合物中存在所述第一捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第一混合物中形成第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，其中如果所述第二混合物中存在所述第二捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第二混合物中形成第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，并且其中如果所述第三混合物中存在所述第三捕获试剂对其具有亲和力的靶分子，则在所述第三混合物中形成第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；
c)以选自以下的顺序将所述亲和力复合物顺序地释放并合并在第四混合物中：(i)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(ii)所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iii)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(iv)所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物；(v)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物；以及(vi)所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物，随后所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物；
d)将第一标签连接至所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物的所述靶分子；
e)使所述标记的第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物与一个或多个固体载体接触，以使得所述标签将所述第一捕获试剂-靶分子亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶分子亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶分子亲和力复合物固定至所述一个或多个固体载体；
f)使所述捕获试剂从所述捕获试剂-靶分子亲和力复合物解离；
g)检测所述解离的捕获试剂的存在或测定所述解离的捕获试剂的水平；
其中，所述第一稀释液、所述第二稀释液和所述第三稀释液是测试样品的不同稀释液。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述测试样品选自血浆、血清、尿液、全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、痰、眼泪、粘液、鼻洗液、鼻抽吸物、精液、唾液、腹膜冲洗物、腹水、囊液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、支气管刷检物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊髓液。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述第一捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物、所述第二捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物和所述第三捕获试剂-靶蛋白亲和力复合物是非共价复合物。
60.如权利要求57所述的方法，其中所述第一捕获试剂、所述第二捕获试剂和所述第三捕获试剂独立地选自适体或抗体。
61.如权利要求57所述的方法，其中所述靶分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、细菌、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞以及组织。
62.如权利要求57所述的方法，其中检测所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的存在或测定所述解离的第一捕获试剂和第二捕获试剂的水平通过PCR、质谱、核酸测序、下一代测序(NGS)或杂交来进行。
63.如权利要求60所述的方法，其中所述适体包含至少一个5-位修饰的嘧啶。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述至少一个5-位修饰的嘧啶包含在所述嘧啶的5-位的接头和连接至所述接头的部分。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述接头选自酰胺接头、羰基接头、丙炔基接头、炔烃接头、酯接头、脲接头、氨基甲酸酯接头、胍接头、脒接头、亚砜接头和砜接头。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述部分是疏水性部分。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述部分选自图1的组I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、XI、XII、XIII、XV和XVI的部分。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述部分选自萘基部分、苄基部分、氟苄基部分、酪氨酰基部分、吲哚部分、吗啉代部分、异丁基部分、3,4-亚甲基二氧基苄基部分、苯并苯硫基部分和苯并呋喃基部分。
69.如权利要求63所述的方法，其中所述5-位修饰的嘧啶的嘧啶是尿苷、胞苷或胸苷。
70.如权利要求57所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
71.如权利要求57所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
72.如权利要求57所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
73.如权利要求57所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液。
74.如权利要求57所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液。
75.如权利要求57所述的方法，其中所述第一稀释液是所述测试样品的5％至39％(或是5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％或39％)，或是15％至30％，或是15％至25％，或是约20％的稀释液；所述第二稀释液是所述测试样品的0.001％至0.009％(或是0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％、0.008％或0.009％)，或是0.002％至0.008％，或是0.003％至0.007％，或是约0.005％的稀释液；并且所述第三稀释液是所述测试样品的0.01％至1％(或是0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％)，或是0.1％至0.8％，或是0.2％至0.75％，或是约0.5％的稀释液。
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