JP2000325086A - リン酸化酵素活性の測定方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】p53をリン酸化するリン酸化酵素の簡便な活性
測定方法の提供。 【解決手段】本発明は、DNA依存性プロテインキナーゼ
(DNA-PK)、ATM、およびATRによってリン酸化される基質
ペプチドのリン酸化を、リン酸化状態を識別しうる抗体
によって免疫学的な手法により評価し、基質ペプチドに
対するリン酸化（または脱リン酸化）酵素活性を測定す
る方法を提供する。この測定方法を応用し、これらの酵
素活性を調整する化合物のスクリーニングが可能。
測定方法の提供。 【解決手段】本発明は、DNA依存性プロテインキナーゼ
(DNA-PK)、ATM、およびATRによってリン酸化される基質
ペプチドのリン酸化を、リン酸化状態を識別しうる抗体
によって免疫学的な手法により評価し、基質ペプチドに
対するリン酸化（または脱リン酸化）酵素活性を測定す
る方法を提供する。この測定方法を応用し、これらの酵
素活性を調整する化合物のスクリーニングが可能。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リン酸化状態を識
別する抗体を利用した、リン酸化酵素活性、あるいは脱
リン酸化酵素活性の測定方法、リン酸化酵素あるいは脱
リン酸化酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング
方法、並びにこれら測定およびスクリーニングのための
キットに関する。
別する抗体を利用した、リン酸化酵素活性、あるいは脱
リン酸化酵素活性の測定方法、リン酸化酵素あるいは脱
リン酸化酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング
方法、並びにこれら測定およびスクリーニングのための
キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】DNA依存性プロテインキナーゼ（以下DNA
-PKと省略する）、ATM(AT mutated)、およびATR(ATM an
d rad3 related）は、いずれもガン抑制遺伝子の発現産
物であるp53のリン酸化を通じて細胞周期に密接に関連
するセリン／トレオニンリン酸化酵素である。細胞は増
殖する際、そのゲノムDNAを複製し、娘細胞へ均等に分
配した後に分裂するという過程を周期的に繰り返す。こ
のような周期は細胞周期と呼ばれている。細胞周期はG1
期（DNA合成準備期）、S期（DNA合成期）、G2期（分裂
準備期）、Ｍ期（分裂期）に分けることができ、各段階
を順番に経て細胞は分裂する。
-PKと省略する）、ATM(AT mutated)、およびATR(ATM an
d rad3 related）は、いずれもガン抑制遺伝子の発現産
物であるp53のリン酸化を通じて細胞周期に密接に関連
するセリン／トレオニンリン酸化酵素である。細胞は増
殖する際、そのゲノムDNAを複製し、娘細胞へ均等に分
配した後に分裂するという過程を周期的に繰り返す。こ
のような周期は細胞周期と呼ばれている。細胞周期はG1
期（DNA合成準備期）、S期（DNA合成期）、G2期（分裂
準備期）、Ｍ期（分裂期）に分けることができ、各段階
を順番に経て細胞は分裂する。
【０００３】紫外線照射、電離放射線照射、薬剤などに
よりDNAが損傷を受けると、その損傷を修復するため
に、哺乳動物細胞は通常G1期,Ｓ期またはG2/M期で停止
する。この現象はチェックポイントと呼ばれ、その情報
伝達経路は図１のように示すことができる。DNA損傷に
応答してp53は転写活性化され、p21CIP1/WAF1や14-3-3
σを発現誘導する(S.J.Elledge .Science Vol 274,p166
4,1996、Paul Nurse.CellVol 91,p865,1997)。p21CIP1/
WAF1はG1期の進行に必要なCyclin E-Cdk2、CyclinD-Cdk
4、6と結合してそのタンパク質リン酸化酵素としての活
性を阻害する(S.J.Elledge .Science Vol 274,1996、D.
O.Morgan .Nature Vol 374,p131,1995)。この機構によ
ってG1期阻止が達成される。一方14-3-3σは、Chk1また
はChk2によりリン酸化されたCdc25C（フォスフォセリン
216)に結合し、核外移行させることによりCdc25Cを不活
性化する(Paul Nurse.Cell Vol 91,p865,1997)。G2/M期
の進行に必要な活性型Cyclin B-Cdc2複合体はWee1キナ
ーゼによりリン酸化されて不活性化され、不活性型Cycl
in B-Cdc2（フォスフォチロシン15）はCdc25Cプロテイ
ンフォスファターゼにより脱リン酸化されて活性化され
る(Paul Nurse .Cell Vol 91,p865,1997)。したがっ
て、14-3-3σタンパク質の発現誘導によりG2期阻止が達
成される。また、S期阻止はDNA損傷に伴って活性化され
たChk2キナーゼを経て達成される(S.Matsuoka et al.Sc
ience Vol 282,p1893,1998)。
よりDNAが損傷を受けると、その損傷を修復するため
に、哺乳動物細胞は通常G1期,Ｓ期またはG2/M期で停止
する。この現象はチェックポイントと呼ばれ、その情報
伝達経路は図１のように示すことができる。DNA損傷に
応答してp53は転写活性化され、p21CIP1/WAF1や14-3-3
σを発現誘導する(S.J.Elledge .Science Vol 274,p166
4,1996、Paul Nurse.CellVol 91,p865,1997)。p21CIP1/
WAF1はG1期の進行に必要なCyclin E-Cdk2、CyclinD-Cdk
4、6と結合してそのタンパク質リン酸化酵素としての活
性を阻害する(S.J.Elledge .Science Vol 274,1996、D.
O.Morgan .Nature Vol 374,p131,1995)。この機構によ
ってG1期阻止が達成される。一方14-3-3σは、Chk1また
はChk2によりリン酸化されたCdc25C（フォスフォセリン
216)に結合し、核外移行させることによりCdc25Cを不活
性化する(Paul Nurse.Cell Vol 91,p865,1997)。G2/M期
の進行に必要な活性型Cyclin B-Cdc2複合体はWee1キナ
ーゼによりリン酸化されて不活性化され、不活性型Cycl
in B-Cdc2（フォスフォチロシン15）はCdc25Cプロテイ
ンフォスファターゼにより脱リン酸化されて活性化され
る(Paul Nurse .Cell Vol 91,p865,1997)。したがっ
て、14-3-3σタンパク質の発現誘導によりG2期阻止が達
成される。また、S期阻止はDNA損傷に伴って活性化され
たChk2キナーゼを経て達成される(S.Matsuoka et al.Sc
ience Vol 282,p1893,1998)。
【０００４】ヒトの遺伝病として知られるAT(毛細管拡
張性運動失調：ataxia telangiectasia)の原因遺伝子AT
M(AT mutated)は細胞が電離放射線照射を受けた際に活
性化され、p53のSer15をリン酸化する(S.Banin et al.S
cience Vol 281,p1674,1998、C.E.Canman et al.Scienc
e Vol 281,p1677,1998)。また、細胞の紫外線照射によ
り活性化されるATR(ATM and rad3 related）もp53のSer
15をリン酸化する(C.E.Canman et al.Science Vol 281,
p1677,1998)。DNA二本鎖切断によって活性化されるDNA-
PKはp53のSer15およびSer37をリン酸化する(S.P.LEES-M
ILLER et al.Mol.Cell.Biol.Vol 12,p5041,1992)。DNA-
PK、ATM、およびATRというセリン/トレオニンタンパク
質リン酸化酵素による癌抑制遺伝子p53の15番目のセリ
ン残基のリン酸化は、p53からのMdm2の解離を引き起こ
す(S.Shieh et al.Cell Vol 91,p325,1997)。Mdm2タン
パク質を介したユビキチン-プロテアソーム系による分
解が妨げられる結果、15番目のセリン残基のリン酸化に
よりp53タンパク質の半減期が延び、上記のようなDNA損
傷に伴うp53を介したチェックポイントシグナルが伝達
される。
張性運動失調：ataxia telangiectasia)の原因遺伝子AT
M(AT mutated)は細胞が電離放射線照射を受けた際に活
性化され、p53のSer15をリン酸化する(S.Banin et al.S
cience Vol 281,p1674,1998、C.E.Canman et al.Scienc
e Vol 281,p1677,1998)。また、細胞の紫外線照射によ
り活性化されるATR(ATM and rad3 related）もp53のSer
15をリン酸化する(C.E.Canman et al.Science Vol 281,
p1677,1998)。DNA二本鎖切断によって活性化されるDNA-
PKはp53のSer15およびSer37をリン酸化する(S.P.LEES-M
ILLER et al.Mol.Cell.Biol.Vol 12,p5041,1992)。DNA-
PK、ATM、およびATRというセリン/トレオニンタンパク
質リン酸化酵素による癌抑制遺伝子p53の15番目のセリ
ン残基のリン酸化は、p53からのMdm2の解離を引き起こ
す(S.Shieh et al.Cell Vol 91,p325,1997)。Mdm2タン
パク質を介したユビキチン-プロテアソーム系による分
解が妨げられる結果、15番目のセリン残基のリン酸化に
よりp53タンパク質の半減期が延び、上記のようなDNA損
傷に伴うp53を介したチェックポイントシグナルが伝達
される。
【０００５】癌治療では放射線療法、化学療法、免疫療
法が行われているが、放射線療法において癌細胞のDNA
損傷のチェックポイントを欠如または機能低下させる薬
剤が存在すれば、癌細胞を選択的に殺すことが可能にな
ると推定される。また、正常細胞のチェックポイントを
機能上昇させる薬剤も、放射線治療の際に有効であると
考えられる。AT患者は電離放射線照射に対する感受性が
正常の人の3-4倍高いことが知られている(C.H.Westphal
et al.Nat.Genet.Vol 16,p397,1997)。AT患者由来の細
胞（AT細胞）では電離放射線照射に伴うG1期,Ｓ期また
はG2/M期での停止は認められない(K.Savitsky et al.Sc
ience Vol 268,p1749,1995、W.A.Cliby et al.EMBO J.V
ol 17,p159,1998)。しかしながら、AT細胞は紫外線照射
に対して高感受性を示さない(W.A.Cliby et al.EMBO J.
Vol 17,p159 ,1998)。これらのことは、ATMに真に特異
的な阻害剤は、細胞の電離放射線に対する感受性を著し
く高め、紫外線照射によるチェックポイントには影響の
ない薬剤となることを示唆している。ATMに真に特異的
な阻害剤があれば、低線量での放射線治療も可能になる
ことが予想される。リン酸化活性の測定系はATMに対す
る薬剤のスクリーニングに有用なだけでなく、ATRおよ
びDNA-PKに対する薬剤開発においても有効なスクリーニ
ング系を提供することになる。DNA-PK、ATR、あるいはA
TMといったリン酸化酵素は、p53をはじめとして、c-Ab
l、PHAS-I、IκBα、RPA、およびc-Junといった他のタ
ンパク質のリン酸化を行うことが知られている。c-Abl
は、慢性骨髄性白血病の90%以上で活性化が観察される
ガン原遺伝子の一つである。PHAS-I(phosphorylated he
at and acid stable protein regulated by insulin)
は、MAPKの基質となる翻訳調節因子である。IκBαは、
転写調節因子であるNF-κBの活性制御に関与するタンパ
ク質である。RPA(replication protein A)は、１本鎖DN
A結合タンパク質でDNAの修復や組み換えに関与してい
る。そしてc-Junは、転写因子AP1の構成成分となる核内
ガン遺伝子である。したがって、ATM、ATR、あるいはDN
A-PKのリン酸化酵素活性を把握することができる簡便な
測定原理は、細胞周期を解明する研究において重要な意
味を持つ。
法が行われているが、放射線療法において癌細胞のDNA
損傷のチェックポイントを欠如または機能低下させる薬
剤が存在すれば、癌細胞を選択的に殺すことが可能にな
ると推定される。また、正常細胞のチェックポイントを
機能上昇させる薬剤も、放射線治療の際に有効であると
考えられる。AT患者は電離放射線照射に対する感受性が
正常の人の3-4倍高いことが知られている(C.H.Westphal
et al.Nat.Genet.Vol 16,p397,1997)。AT患者由来の細
胞（AT細胞）では電離放射線照射に伴うG1期,Ｓ期また
はG2/M期での停止は認められない(K.Savitsky et al.Sc
ience Vol 268,p1749,1995、W.A.Cliby et al.EMBO J.V
ol 17,p159,1998)。しかしながら、AT細胞は紫外線照射
に対して高感受性を示さない(W.A.Cliby et al.EMBO J.
Vol 17,p159 ,1998)。これらのことは、ATMに真に特異
的な阻害剤は、細胞の電離放射線に対する感受性を著し
く高め、紫外線照射によるチェックポイントには影響の
ない薬剤となることを示唆している。ATMに真に特異的
な阻害剤があれば、低線量での放射線治療も可能になる
ことが予想される。リン酸化活性の測定系はATMに対す
る薬剤のスクリーニングに有用なだけでなく、ATRおよ
びDNA-PKに対する薬剤開発においても有効なスクリーニ
ング系を提供することになる。DNA-PK、ATR、あるいはA
TMといったリン酸化酵素は、p53をはじめとして、c-Ab
l、PHAS-I、IκBα、RPA、およびc-Junといった他のタ
ンパク質のリン酸化を行うことが知られている。c-Abl
は、慢性骨髄性白血病の90%以上で活性化が観察される
ガン原遺伝子の一つである。PHAS-I(phosphorylated he
at and acid stable protein regulated by insulin)
は、MAPKの基質となる翻訳調節因子である。IκBαは、
転写調節因子であるNF-κBの活性制御に関与するタンパ
ク質である。RPA(replication protein A)は、１本鎖DN
A結合タンパク質でDNAの修復や組み換えに関与してい
る。そしてc-Junは、転写因子AP1の構成成分となる核内
ガン遺伝子である。したがって、ATM、ATR、あるいはDN
A-PKのリン酸化酵素活性を把握することができる簡便な
測定原理は、細胞周期を解明する研究において重要な意
味を持つ。
【０００６】しかしこれまでは、タンパク質リン酸化酵
素の活性測定においては、放射性同位元素である32Pで
標識されたγ-32P-ATPを用いるため、実施にあたっては
特殊な設備が必要とされていた。また、PI3Kファミリー
に属するDNA-PK、ATM、およびATRは一次構造が類似した
セリン／トレオニンリン酸化酵素であるため、従来はこ
れらの酵素活性を区別して測定することはできなかっ
た。したがって、簡便なリン酸化酵素活性測定系の開発
が求められていた。
素の活性測定においては、放射性同位元素である32Pで
標識されたγ-32P-ATPを用いるため、実施にあたっては
特殊な設備が必要とされていた。また、PI3Kファミリー
に属するDNA-PK、ATM、およびATRは一次構造が類似した
セリン／トレオニンリン酸化酵素であるため、従来はこ
れらの酵素活性を区別して測定することはできなかっ
た。したがって、簡便なリン酸化酵素活性測定系の開発
が求められていた。
【０００７】他方、リン酸化酵素活性の簡便な測定方法
として、PKAやPKCの活性測定方法が実用化されている。
この方法は、PSペプチドと呼ばれる合成ペプチドを基質
として用い、その酵素的なリン酸化を、リン酸化された
PSペプチドを認識する抗体によって検出することによっ
て、リン酸化酵素活性を測定している(T.Yano et al.Pe
ptide Chemistry A.Suzuki(Ed): 293-298,1991)。しか
しこの方法において基質ペプチドとなるPSペプチドは、
p53のリン酸化酵素であるDNA-PK、ATM、あるいはATRの
基質とならない。更に、この方法で用いられているリン
酸化の程度を検出するための抗体は、リン酸化されたp5
3を認識するものではないためp53のリン酸化酵素活性の
測定には利用することができない。リン酸化p53を認識
する抗体は公知(C.E.Canman et al.Science,Vol.281,16
77,1998)であるが、これらの抗体を用いてp53のリン酸
化酵素活性が測定可能なことは知られていない。
として、PKAやPKCの活性測定方法が実用化されている。
この方法は、PSペプチドと呼ばれる合成ペプチドを基質
として用い、その酵素的なリン酸化を、リン酸化された
PSペプチドを認識する抗体によって検出することによっ
て、リン酸化酵素活性を測定している(T.Yano et al.Pe
ptide Chemistry A.Suzuki(Ed): 293-298,1991)。しか
しこの方法において基質ペプチドとなるPSペプチドは、
p53のリン酸化酵素であるDNA-PK、ATM、あるいはATRの
基質とならない。更に、この方法で用いられているリン
酸化の程度を検出するための抗体は、リン酸化されたp5
3を認識するものではないためp53のリン酸化酵素活性の
測定には利用することができない。リン酸化p53を認識
する抗体は公知(C.E.Canman et al.Science,Vol.281,16
77,1998)であるが、これらの抗体を用いてp53のリン酸
化酵素活性が測定可能なことは知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、p53等をリ
ン酸化する酵素であるDNA-PK、ATM、およびATRの活性測
定方法、あるいはこれらのリン酸化酵素の作用によって
リン酸化されたp53等に対する脱リン酸化酵素活性の測
定方法の提供を課題とする。また、本発明は、DNA-PK、
ATM、およびATRのリン酸化酵素活性を制御することがで
きる化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。
更に本発明は、単にこれらのリン酸化酵素活性を測定す
ることのみならず、複数のリン酸化酵素が共存する試料
における各リン酸化酵素の活性を個別に把握することが
できる測定方法の提供を課題とする。加えて本発明は、
これら測定方法やスクリーニング方法のためのキットの
提供を課題とする。
ン酸化する酵素であるDNA-PK、ATM、およびATRの活性測
定方法、あるいはこれらのリン酸化酵素の作用によって
リン酸化されたp53等に対する脱リン酸化酵素活性の測
定方法の提供を課題とする。また、本発明は、DNA-PK、
ATM、およびATRのリン酸化酵素活性を制御することがで
きる化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。
更に本発明は、単にこれらのリン酸化酵素活性を測定す
ることのみならず、複数のリン酸化酵素が共存する試料
における各リン酸化酵素の活性を個別に把握することが
できる測定方法の提供を課題とする。加えて本発明は、
これら測定方法やスクリーニング方法のためのキットの
提供を課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、DNA-PK、ATM、およびATRによってリ
ン酸化される基質ペプチドを用い、基質ペプチドのリン
酸化のレベルの変化を、免疫学的に測定することによっ
てリン酸化酵素活性の把握が可能なのではないかと考え
た。そしてp53等のSQモチーフ、あるいはSQEモチーフを
構成するセリン残基がこれらのリン酸化酵素によるリン
酸化および脱リン酸化の標的になることに着目し、鋭意
研究を行った。その結果、リン酸化p53に対する抗体を
利用することにより、簡便に基質ペプチドのリン酸化レ
ベルの評価が可能であることを見出した。さらに、本発
明者らは、該抗体を利用することにより、酵素作用によ
る基質ペプチドのリン酸化や脱リン酸化を阻害もしくは
促進する化合物のスクリーニングが可能であることを見
出し、本発明を完成した。
を解決するために、DNA-PK、ATM、およびATRによってリ
ン酸化される基質ペプチドを用い、基質ペプチドのリン
酸化のレベルの変化を、免疫学的に測定することによっ
てリン酸化酵素活性の把握が可能なのではないかと考え
た。そしてp53等のSQモチーフ、あるいはSQEモチーフを
構成するセリン残基がこれらのリン酸化酵素によるリン
酸化および脱リン酸化の標的になることに着目し、鋭意
研究を行った。その結果、リン酸化p53に対する抗体を
利用することにより、簡便に基質ペプチドのリン酸化レ
ベルの評価が可能であることを見出した。さらに、本発
明者らは、該抗体を利用することにより、酵素作用によ
る基質ペプチドのリン酸化や脱リン酸化を阻害もしくは
促進する化合物のスクリーニングが可能であることを見
出し、本発明を完成した。
【００１０】すなわち本発明は、以下のリン酸化酵素活
性測定方法、脱リン酸化酵素活性測定方法、ならびにこ
れらの測定方法に基づくリン酸化酵素や脱リン酸化酵素
の活性を調整する化合物のスクリーニング方法に関す
る。 〔１〕次の工程を含む、試料中のタンパク質リン酸化酵
素活性の測定方法であって、タンパク質リン酸化酵素
が、DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択さ
れることを特徴とする方法。 (a)前記リン酸化酵素によってリン酸化される基質ペプ
チドと試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に必
要な条件下で接触させる工程 (b)基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基質
ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の
変化に基づいて検出する工程 〔２〕以下の工程を含む、タンパク質リン酸化酵素活性
を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法で
あって、タンパク質リン酸化酵素が、DNA-PK、ATM、お
よびATRで構成される群から選択されることを特徴とす
る方法。 (a)DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択さ
れるいずれかのリン酸化酵素、およびこのリン酸化酵素
によってリン酸化される基質ペプチドとを、被検化合物
の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させイン
キュベートする工程 (b)基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基質
ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の
変化に基づいて検出する工程 (c)被検化合物の非存在下における基質ペプチドのリン
酸化のレベルと比較して、基質ペプチドのリン酸化のレ
ベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択する
工程 〔３〕以下の工程を含む、試料中のリン酸化されたタン
パク質の脱リン酸化酵素活性の測定方法であって、前記
リン酸化されたタンパク質が、DNA-PK、ATM、およびATR
で構成される群から選択されるリン酸化酵素によってリ
ン酸化されたものである方法。 (a)リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸化部
位を含む基質ペプチドと試料とを、脱リン酸化反応に必
要な条件下で接触させインキュベートする工程 (b)基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基質
ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の
変化に基づいて検出する工程 〔４〕以下の工程を含む、リン酸化されたタンパク質に
対する脱リン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合
物のスクリーニング方法であって、前記リン酸化された
タンパク質が、DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群
から選択されるリン酸化酵素によってリン酸化されたも
のである方法。 (a)前記リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化
酵素、およびリン酸化されたタンパク質の少なくともリ
ン酸化部位を含む基質ペプチドを、被検化合物の存在
下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュ
ベートする工程 (b)基質ペプチドの脱リン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 (c)被検化合物の非存在下における基質ペプチドの脱リ
ン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドの脱リン酸化
のレベルの変化を低下もしくは増加させる化合物を選択
する工程 〔５〕基質ペプチドが、SQモチーフ、またはSQEモチー
フを構成するアミノ酸配列を含むものである〔１〕−
〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔６〕リン酸化状態を識別することができる抗体が、そ
のリン酸化部位を識別しうるものであり、異なる部位を
リン酸化する複数のリン酸化酵素が共存する試料に含ま
れるリン酸化酵素の活性を個別に測定する〔１〕の方
法。 〔７〕リン酸化酵素が、ATMまたはATRであり、抗体がp5
3の15位セリンを含むSQEモチーフのリン酸化状態を識別
しうるものである〔６〕の方法。 〔８〕リン酸化酵素が、DNA-PKであり、抗体がp53の37
位セリンを含むSQモチーフのリン酸化状態を識別しうる
ものである〔６〕の方法。
性測定方法、脱リン酸化酵素活性測定方法、ならびにこ
れらの測定方法に基づくリン酸化酵素や脱リン酸化酵素
の活性を調整する化合物のスクリーニング方法に関す
る。 〔１〕次の工程を含む、試料中のタンパク質リン酸化酵
素活性の測定方法であって、タンパク質リン酸化酵素
が、DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択さ
れることを特徴とする方法。 (a)前記リン酸化酵素によってリン酸化される基質ペプ
チドと試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に必
要な条件下で接触させる工程 (b)基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基質
ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の
変化に基づいて検出する工程 〔２〕以下の工程を含む、タンパク質リン酸化酵素活性
を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法で
あって、タンパク質リン酸化酵素が、DNA-PK、ATM、お
よびATRで構成される群から選択されることを特徴とす
る方法。 (a)DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択さ
れるいずれかのリン酸化酵素、およびこのリン酸化酵素
によってリン酸化される基質ペプチドとを、被検化合物
の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させイン
キュベートする工程 (b)基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基質
ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の
変化に基づいて検出する工程 (c)被検化合物の非存在下における基質ペプチドのリン
酸化のレベルと比較して、基質ペプチドのリン酸化のレ
ベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択する
工程 〔３〕以下の工程を含む、試料中のリン酸化されたタン
パク質の脱リン酸化酵素活性の測定方法であって、前記
リン酸化されたタンパク質が、DNA-PK、ATM、およびATR
で構成される群から選択されるリン酸化酵素によってリ
ン酸化されたものである方法。 (a)リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸化部
位を含む基質ペプチドと試料とを、脱リン酸化反応に必
要な条件下で接触させインキュベートする工程 (b)基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基質
ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の
変化に基づいて検出する工程 〔４〕以下の工程を含む、リン酸化されたタンパク質に
対する脱リン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合
物のスクリーニング方法であって、前記リン酸化された
タンパク質が、DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群
から選択されるリン酸化酵素によってリン酸化されたも
のである方法。 (a)前記リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化
酵素、およびリン酸化されたタンパク質の少なくともリ
ン酸化部位を含む基質ペプチドを、被検化合物の存在
下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュ
ベートする工程 (b)基質ペプチドの脱リン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 (c)被検化合物の非存在下における基質ペプチドの脱リ
ン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドの脱リン酸化
のレベルの変化を低下もしくは増加させる化合物を選択
する工程 〔５〕基質ペプチドが、SQモチーフ、またはSQEモチー
フを構成するアミノ酸配列を含むものである〔１〕−
〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔６〕リン酸化状態を識別することができる抗体が、そ
のリン酸化部位を識別しうるものであり、異なる部位を
リン酸化する複数のリン酸化酵素が共存する試料に含ま
れるリン酸化酵素の活性を個別に測定する〔１〕の方
法。 〔７〕リン酸化酵素が、ATMまたはATRであり、抗体がp5
3の15位セリンを含むSQEモチーフのリン酸化状態を識別
しうるものである〔６〕の方法。 〔８〕リン酸化酵素が、DNA-PKであり、抗体がp53の37
位セリンを含むSQモチーフのリン酸化状態を識別しうる
ものである〔６〕の方法。
〔９〕以下の工程を含む、DNA-PK活性の測定方法。 (a)２本鎖DNAの不存在下で〔１〕の方法を実施すること
によって、試料中のリン酸化酵素活性を測定する工程 (b)２本鎖DNAの存在下で〔１〕の方法を実施することに
よって試料中のリン酸化酵素活性を測定する工程 (c)(a)と(b)の結果を比較することによって、DNA-PKに
由来するリン酸化酵素活性を求める工程 〔１０〕抗体が、リン酸化されていない基質ペプチドよ
りも、リン酸化された基質ペプチドとの反応性が高いも
のである〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１１〕抗体が、リン酸化された基質ペプチドよりも、
リン酸化されていない基質ペプチドとの反応性が高いも
のである〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１２〕基質ペプチドが標識されている、〔１〕−
〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１３〕基質ペプチドが固相化されている、〔１〕−
〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１４〕抗体が標識されている、〔１〕−〔４〕のいず
れかに記載の方法。 〔１５〕基質ペプチドのリン酸化レベルの評価をELISA
法により行う、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方
法。 〔１６〕〔２〕に記載のスクリーニング方法により単離
することができる、DNA依存性プロテインキナーゼ、AT
M、およびATRからなる群から選択されるタンパク質リン
酸化酵素の活性を調整する化合物。 〔１７〕〔４〕に記載のスクリーニング方法により単離
することができる、DNA依存性プロテインキナーゼ、AT
M、およびATRからなる群から選択されるタンパク質リン
酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質に対する脱
リン酸化酵素の活性を調整する化合物。 〔１８〕天然由来である、〔１６〕または〔１７〕のい
ずれかに記載の化合物。 〔１９〕〔１〕−〔４〕に記載のいずれかの方法に用い
るための、基質ペプチドのリン酸化状態を識別する抗
体。 〔２０〕基質ペプチドのリン酸化状態を識別する抗体を
含む、〔１〕−〔４〕に記載のいずれかの方法のための
キット。
によって、試料中のリン酸化酵素活性を測定する工程 (b)２本鎖DNAの存在下で〔１〕の方法を実施することに
よって試料中のリン酸化酵素活性を測定する工程 (c)(a)と(b)の結果を比較することによって、DNA-PKに
由来するリン酸化酵素活性を求める工程 〔１０〕抗体が、リン酸化されていない基質ペプチドよ
りも、リン酸化された基質ペプチドとの反応性が高いも
のである〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１１〕抗体が、リン酸化された基質ペプチドよりも、
リン酸化されていない基質ペプチドとの反応性が高いも
のである〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１２〕基質ペプチドが標識されている、〔１〕−
〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１３〕基質ペプチドが固相化されている、〔１〕−
〔４〕のいずれかに記載の方法。 〔１４〕抗体が標識されている、〔１〕−〔４〕のいず
れかに記載の方法。 〔１５〕基質ペプチドのリン酸化レベルの評価をELISA
法により行う、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方
法。 〔１６〕〔２〕に記載のスクリーニング方法により単離
することができる、DNA依存性プロテインキナーゼ、AT
M、およびATRからなる群から選択されるタンパク質リン
酸化酵素の活性を調整する化合物。 〔１７〕〔４〕に記載のスクリーニング方法により単離
することができる、DNA依存性プロテインキナーゼ、AT
M、およびATRからなる群から選択されるタンパク質リン
酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質に対する脱
リン酸化酵素の活性を調整する化合物。 〔１８〕天然由来である、〔１６〕または〔１７〕のい
ずれかに記載の化合物。 〔１９〕〔１〕−〔４〕に記載のいずれかの方法に用い
るための、基質ペプチドのリン酸化状態を識別する抗
体。 〔２０〕基質ペプチドのリン酸化状態を識別する抗体を
含む、〔１〕−〔４〕に記載のいずれかの方法のための
キット。
【００１１】なお、本発明において「ペプチド」とは、
２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合
物を指し、その鎖長は問わない。従って、タンパク質も
また本発明における「ペプチド」に含まれる。本発明で
測定の対象としているリン酸化酵素は、DNA-PK、ATM、
およびATRで構成される群から選択される。測定対象
は、ヒト組織に由来する天然の酵素の他、それをコード
する遺伝子を適当な発現系で発現させることによって得
ることができるリコンビナントであっても良い。また、
酵素の由来は、ヒトに限定されず、他の脊椎動物や、微
生物におけるホモログであることができる。更に、天然
の酵素タンパク質と同一のアミノ酸配列を持つ酵素のみ
ならず、その酵素活性の発現を支える領域（キナーゼ領
域）のみで構成される変異体、あるいはこの領域を他の
タンパク質と融合させた融合タンパク質等、本質的に同
じ酵素活性を持つ酵素タンパク質は、いずれも本発明に
よるリン酸化酵素活性の測定方法の対象とすることがで
きる。
２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合
物を指し、その鎖長は問わない。従って、タンパク質も
また本発明における「ペプチド」に含まれる。本発明で
測定の対象としているリン酸化酵素は、DNA-PK、ATM、
およびATRで構成される群から選択される。測定対象
は、ヒト組織に由来する天然の酵素の他、それをコード
する遺伝子を適当な発現系で発現させることによって得
ることができるリコンビナントであっても良い。また、
酵素の由来は、ヒトに限定されず、他の脊椎動物や、微
生物におけるホモログであることができる。更に、天然
の酵素タンパク質と同一のアミノ酸配列を持つ酵素のみ
ならず、その酵素活性の発現を支える領域（キナーゼ領
域）のみで構成される変異体、あるいはこの領域を他の
タンパク質と融合させた融合タンパク質等、本質的に同
じ酵素活性を持つ酵素タンパク質は、いずれも本発明に
よるリン酸化酵素活性の測定方法の対象とすることがで
きる。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は、第一にDNA-PK、ATM、
およびATRによってリン酸化される基質ペプチドに特異
的に結合する抗体を利用したリン酸化酵素活性の測定方
法に関する。より具体的には、次の工程（ａ）および
（ｂ）を含む測定方法である。 （ａ）前記リン酸化酵素によってリン酸化される基質ペ
プチドと試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に
必要な条件下で接触させる工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 本発明に用いる基質ペプチドは、DNA-PK、ATM、およびA
TRによってリン酸化されるペプチドであれば特に制限は
ない。具体的には、たとえば以下のアミノ酸配列からな
るSQモチーフを含むペプチドは、これらのリン酸化酵素
によってリン酸化されるセリン残基(S)を持つことが知
られている。 SQモチーフ： X-n ...X-4 X-3 X-2 X-1 S Q X+2 X+3 X+4 ...X+n ここで、リン酸化部位のセリン残基を０としたとき、そ
れよりもn個アミノ末端側の任意のアミノ酸残基X
をX-n、n個カルボキシル末端側のアミノ酸残基をX+n、
と表記する。このモチーフを含むペプチドは、一般にS
の位置においてリン酸化を受けるとされている。Xのア
ミノ酸の違いによってリン酸化酵素とのKmが変動するの
で、よりKmの低いアミノ酸配列を持った基質ペプチドを
利用すれば、より高い感度でリン酸化酵素の測定を行う
ことができる。たとえばATMおよびATRでは、SQモチーフ
の中でも、特にX+2の位置がEである場合にはリン酸化を
受けやすいと推定されている。SQEモチーフと呼ばれる
このようなアミノ酸配列は、ATMやATRの活性測定を目的
とする場合に望ましい基質ペプチドとなる。 SQEモチーフ： X-n ...X-4 X-3 X-2 X-1 S Q E X+3 X+4 X+5 ...X+n
およびATRによってリン酸化される基質ペプチドに特異
的に結合する抗体を利用したリン酸化酵素活性の測定方
法に関する。より具体的には、次の工程（ａ）および
（ｂ）を含む測定方法である。 （ａ）前記リン酸化酵素によってリン酸化される基質ペ
プチドと試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に
必要な条件下で接触させる工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 本発明に用いる基質ペプチドは、DNA-PK、ATM、およびA
TRによってリン酸化されるペプチドであれば特に制限は
ない。具体的には、たとえば以下のアミノ酸配列からな
るSQモチーフを含むペプチドは、これらのリン酸化酵素
によってリン酸化されるセリン残基(S)を持つことが知
られている。 SQモチーフ： X-n ...X-4 X-3 X-2 X-1 S Q X+2 X+3 X+4 ...X+n ここで、リン酸化部位のセリン残基を０としたとき、そ
れよりもn個アミノ末端側の任意のアミノ酸残基X
をX-n、n個カルボキシル末端側のアミノ酸残基をX+n、
と表記する。このモチーフを含むペプチドは、一般にS
の位置においてリン酸化を受けるとされている。Xのア
ミノ酸の違いによってリン酸化酵素とのKmが変動するの
で、よりKmの低いアミノ酸配列を持った基質ペプチドを
利用すれば、より高い感度でリン酸化酵素の測定を行う
ことができる。たとえばATMおよびATRでは、SQモチーフ
の中でも、特にX+2の位置がEである場合にはリン酸化を
受けやすいと推定されている。SQEモチーフと呼ばれる
このようなアミノ酸配列は、ATMやATRの活性測定を目的
とする場合に望ましい基質ペプチドとなる。 SQEモチーフ： X-n ...X-4 X-3 X-2 X-1 S Q E X+3 X+4 X+5 ...X+n
【００１３】このほか基質ペプチドとして利用可能な生
体に由来するタンパク質としては、例えば以下のタンパ
ク質を示すことができる。 p53(L.J.Ko and C.Prives.Genes and Dev.Vol 10,p105
4,1996、A.L.Levine.CellVol.88,p323,1997) c-Abl(S.Kharbanda et al.Science Vol 386,p732,1997) PHAS-I(C.Hu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol 91,p3
730,1994、G.J.Brunn etal.Science Vol 277,p99,199
7、S.Banin et al.Science Vol 281,p1674,1998) IκBα(A.A.Beg and A.S.Baldwin Jr.Genes & Dev.Vol
7,p2064) RPA(R.G.Shao et al.EMBO J.Vol 18,p1397,1999) c-Jun(T.Smeal et al.Mol.Cell.Biol.Vol 12,p3507,199
2) 基質ペプチドは、天然のもの、遺伝子組換え技術を利用
して調製されたもの、合成ペプチドのいずれであること
もできる。ペプチドの精製を容易にする目的で他のペプ
チド(例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ)と
融合されていてもよい。基質ペプチドは、予想される酵
素活性に対して十分な量で使用する。たとえばある基質
濃度でリン酸化反応を行ったときに、基質ペプチドの大
部分がリン酸化されるような場合は、基質ペプチドが不
足する心配がある。このようなケースでは、基質濃度を
高める、あるいは試料の希釈等によって、基質ペプチド
の相対濃度を上げることが望まれる。
体に由来するタンパク質としては、例えば以下のタンパ
ク質を示すことができる。 p53(L.J.Ko and C.Prives.Genes and Dev.Vol 10,p105
4,1996、A.L.Levine.CellVol.88,p323,1997) c-Abl(S.Kharbanda et al.Science Vol 386,p732,1997) PHAS-I(C.Hu et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol 91,p3
730,1994、G.J.Brunn etal.Science Vol 277,p99,199
7、S.Banin et al.Science Vol 281,p1674,1998) IκBα(A.A.Beg and A.S.Baldwin Jr.Genes & Dev.Vol
7,p2064) RPA(R.G.Shao et al.EMBO J.Vol 18,p1397,1999) c-Jun(T.Smeal et al.Mol.Cell.Biol.Vol 12,p3507,199
2) 基質ペプチドは、天然のもの、遺伝子組換え技術を利用
して調製されたもの、合成ペプチドのいずれであること
もできる。ペプチドの精製を容易にする目的で他のペプ
チド(例えば、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ)と
融合されていてもよい。基質ペプチドは、予想される酵
素活性に対して十分な量で使用する。たとえばある基質
濃度でリン酸化反応を行ったときに、基質ペプチドの大
部分がリン酸化されるような場合は、基質ペプチドが不
足する心配がある。このようなケースでは、基質濃度を
高める、あるいは試料の希釈等によって、基質ペプチド
の相対濃度を上げることが望まれる。
【００１４】本発明において、基質ペプチドは前記リン
酸化酵素によるリン酸化が可能な条件下で試料と接触さ
せられる。リン酸化が可能な条件とは、目的とするリン
酸化酵素の活性の維持に必要なpHを与える反応媒体中
で、基質ペプチドとともに反応に必要な成分の存在下、
適切な反応温度でインキュベートすることを意味する。
反応に必要な成分としては、リン酸化反応に必要なリン
酸基を供給する基質、リン酸化反応物を保護する目的で
添加するフォスファターゼ阻害剤等が挙げられる。リン
酸基を供給する基質には、一般にアデノシン３リン酸
（以下ATPと省略する）等が用いられ、フォスファター
ゼ阻害剤としてはβ-グリセロリン酸等が用いられる。
この他、DNA-PKのリン酸化酵素活性を測定する場合に
は、基質ペプチド以外の成分として断片化２本鎖DNAが
挙げられ、ATMまたはATRのリン酸化酵素活性を測定する
場合には、Mnイオンが挙げられる。本発明において用い
られるリン酸化反応のための緩衝液として、次の組成か
らなるATM/ATR用反応バッファーを示すことができる。 ATM/ATR用反応バッファー： 10mM HEPES（pH7.5) 50mM β-グリセロリン酸 50mM NaCl、10mM MgCl2 10mM MnCl2 5mM ATP 1mM DTT DNA-PK反応バッファー： 25mM HEPES pH7.5 75mM KCl 10mM MgCl2 1mM DTT 0.2mM EGTA 0.25mM ATP 10μg/ml超音波処理２本鎖DNA 50mM β-グリセロリン酸
酸化酵素によるリン酸化が可能な条件下で試料と接触さ
せられる。リン酸化が可能な条件とは、目的とするリン
酸化酵素の活性の維持に必要なpHを与える反応媒体中
で、基質ペプチドとともに反応に必要な成分の存在下、
適切な反応温度でインキュベートすることを意味する。
反応に必要な成分としては、リン酸化反応に必要なリン
酸基を供給する基質、リン酸化反応物を保護する目的で
添加するフォスファターゼ阻害剤等が挙げられる。リン
酸基を供給する基質には、一般にアデノシン３リン酸
（以下ATPと省略する）等が用いられ、フォスファター
ゼ阻害剤としてはβ-グリセロリン酸等が用いられる。
この他、DNA-PKのリン酸化酵素活性を測定する場合に
は、基質ペプチド以外の成分として断片化２本鎖DNAが
挙げられ、ATMまたはATRのリン酸化酵素活性を測定する
場合には、Mnイオンが挙げられる。本発明において用い
られるリン酸化反応のための緩衝液として、次の組成か
らなるATM/ATR用反応バッファーを示すことができる。 ATM/ATR用反応バッファー： 10mM HEPES（pH7.5) 50mM β-グリセロリン酸 50mM NaCl、10mM MgCl2 10mM MnCl2 5mM ATP 1mM DTT DNA-PK反応バッファー： 25mM HEPES pH7.5 75mM KCl 10mM MgCl2 1mM DTT 0.2mM EGTA 0.25mM ATP 10μg/ml超音波処理２本鎖DNA 50mM β-グリセロリン酸
【００１５】望ましいインキュベーション条件を与えれ
ば、試料中に基質ペプチドに対するリン酸化酵素が存在
する場合、その活性に応じて基質ペプチドはリン酸化さ
れる。ここで、特定の成分が各酵素のリン酸化反応を支
えていることを利用して、それぞれに特異的な活性測定
法を構築することができる。たとえばDNA-PKは、活性発
現に２本鎖DNA断片を要求する(T. Carter et al., Mol.
Cel.Biol. Vol 10, p6460-6471(1990))ので、反応液中
の２本鎖DNA断片の有無によるリン酸化酵素活性の違い
に基づいて、DNA-PKに由来するリン酸化酵素活性を知る
ことができる。本発明では、リン酸化された基質ペプチ
ドは、基質ペプチドのリン酸化状態を識別することがで
きる抗体との免疫学的な反応によって、そのリン酸化の
レベルが評価される。本発明において、リン酸化のレベ
ルとは、基質ペプチドに占めるリン酸化ペプチドの割合
のみならず、基質ペプチド分子上のリン酸化の程度を意
味する用語として用いる。したがって、たとえば基質ペ
プチドのリン酸化レベルの上昇とは、リン酸化ペプチド
の割合が増大する状態、あるいは基質ペプチド上のリン
酸化部位が増大する状態のいずれをも意味する。一方本
発明に用いるリン酸化状態を識別しうる抗体とは、リン
酸化の有無により基質ペプチドとの反応性が変化する抗
体を意味する。具体的には、リン酸化された基質ペプチ
ドに対する反応性が、リン酸化されていない基質ペプチ
ドに対する反応性よりも大きい（または小さい）抗体を
示すことができる。たとえばDNA-PKによってリン酸化さ
れたp53を特異的に認識する抗体は公知である(S-Y.Shie
het al.Cell Vol 91,p325,1997)。同様の抗体は、当業
者に公知の方法（例えば、細胞工学 別冊 抗ペプチド
抗体実験プロトコール １９９４年 秀潤社、B.M.Turner
and G.Fellows,Eur.J.Biochem.179,131-139,1989、S.M
uller et al.Molecular Immunology Vol 24,779-789,19
87、Pfeffer,U.,Ferrari,N.and Vidali,G.J.Bio.Chem.2
61,2496-2498,1986）により調製することができる。抗
体としては、モノクローナル抗体であっても、ポリクロ
ーナル抗体であってもよい。
ば、試料中に基質ペプチドに対するリン酸化酵素が存在
する場合、その活性に応じて基質ペプチドはリン酸化さ
れる。ここで、特定の成分が各酵素のリン酸化反応を支
えていることを利用して、それぞれに特異的な活性測定
法を構築することができる。たとえばDNA-PKは、活性発
現に２本鎖DNA断片を要求する(T. Carter et al., Mol.
Cel.Biol. Vol 10, p6460-6471(1990))ので、反応液中
の２本鎖DNA断片の有無によるリン酸化酵素活性の違い
に基づいて、DNA-PKに由来するリン酸化酵素活性を知る
ことができる。本発明では、リン酸化された基質ペプチ
ドは、基質ペプチドのリン酸化状態を識別することがで
きる抗体との免疫学的な反応によって、そのリン酸化の
レベルが評価される。本発明において、リン酸化のレベ
ルとは、基質ペプチドに占めるリン酸化ペプチドの割合
のみならず、基質ペプチド分子上のリン酸化の程度を意
味する用語として用いる。したがって、たとえば基質ペ
プチドのリン酸化レベルの上昇とは、リン酸化ペプチド
の割合が増大する状態、あるいは基質ペプチド上のリン
酸化部位が増大する状態のいずれをも意味する。一方本
発明に用いるリン酸化状態を識別しうる抗体とは、リン
酸化の有無により基質ペプチドとの反応性が変化する抗
体を意味する。具体的には、リン酸化された基質ペプチ
ドに対する反応性が、リン酸化されていない基質ペプチ
ドに対する反応性よりも大きい（または小さい）抗体を
示すことができる。たとえばDNA-PKによってリン酸化さ
れたp53を特異的に認識する抗体は公知である(S-Y.Shie
het al.Cell Vol 91,p325,1997)。同様の抗体は、当業
者に公知の方法（例えば、細胞工学 別冊 抗ペプチド
抗体実験プロトコール １９９４年 秀潤社、B.M.Turner
and G.Fellows,Eur.J.Biochem.179,131-139,1989、S.M
uller et al.Molecular Immunology Vol 24,779-789,19
87、Pfeffer,U.,Ferrari,N.and Vidali,G.J.Bio.Chem.2
61,2496-2498,1986）により調製することができる。抗
体としては、モノクローナル抗体であっても、ポリクロ
ーナル抗体であってもよい。
【００１６】たとえばリン酸化ペプチド特異的なポリク
ローナル抗体は、リン酸化ペプチドで免疫することによ
って得た抗血清から、非リン酸化ペプチドカラム（非特
異反応抗体吸収用カラム）やリン酸化ペプチドカラム
（特異抗体精製用カラム）を用いて精製することが可能
である。あるいはリン酸化ペプチドで免疫した動物の抗
体産生細胞から樹立したハイブリドーマから、特異抗体
を産生するものをスクリーニングすることによって、モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニ
ングすることができる。スクリーニングは、培養上清の
非リン酸化ペプチドやリン酸化ペプチドに対する反応性
をELISA法により調べ、リン酸化ペプチドに対して反応
性の高いクローンを選択することにより行う。クローニ
ングされたハイブリドーマを培養すれば、必要なモノク
ローナル抗体を培養上清や腹水から精製することができ
る。
ローナル抗体は、リン酸化ペプチドで免疫することによ
って得た抗血清から、非リン酸化ペプチドカラム（非特
異反応抗体吸収用カラム）やリン酸化ペプチドカラム
（特異抗体精製用カラム）を用いて精製することが可能
である。あるいはリン酸化ペプチドで免疫した動物の抗
体産生細胞から樹立したハイブリドーマから、特異抗体
を産生するものをスクリーニングすることによって、モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニ
ングすることができる。スクリーニングは、培養上清の
非リン酸化ペプチドやリン酸化ペプチドに対する反応性
をELISA法により調べ、リン酸化ペプチドに対して反応
性の高いクローンを選択することにより行う。クローニ
ングされたハイブリドーマを培養すれば、必要なモノク
ローナル抗体を培養上清や腹水から精製することができ
る。
【００１７】本発明の望ましい実施態様においては、単
にリン酸化状態を識別しうるのみならず、基質ペプチド
を構成するアミノ酸配列までも含めた構造の相違を認識
することができる抗体に基づいた測定方法が提供され
る。リン酸化酵素は、必ずしも基質ペプチドの同じ部分
をリン酸化するわけではない。たとえば、DNA-PKがp53
をリン酸化する場合、15位と37位の２ヵ所のセリン残基
を中心としてリン酸化が進行する。一方、ATMやATRは同
じp53のリン酸化であっても、主たるリン酸化部位は15
位のセリン残基である。したがって、これらリン酸化さ
れるセリン残基を含むアミノ酸配列を認識する抗体を利
用すれば、DNA-PKによるリン酸化と、ATMやATRによるリ
ン酸化とを区別して評価することができる。すなわち本
発明は、複数のリン酸化酵素が共存する可能性のある試
料を用い、個々のリン酸化酵素活性を独立して把握する
ことができる測定方法を提供する。
にリン酸化状態を識別しうるのみならず、基質ペプチド
を構成するアミノ酸配列までも含めた構造の相違を認識
することができる抗体に基づいた測定方法が提供され
る。リン酸化酵素は、必ずしも基質ペプチドの同じ部分
をリン酸化するわけではない。たとえば、DNA-PKがp53
をリン酸化する場合、15位と37位の２ヵ所のセリン残基
を中心としてリン酸化が進行する。一方、ATMやATRは同
じp53のリン酸化であっても、主たるリン酸化部位は15
位のセリン残基である。したがって、これらリン酸化さ
れるセリン残基を含むアミノ酸配列を認識する抗体を利
用すれば、DNA-PKによるリン酸化と、ATMやATRによるリ
ン酸化とを区別して評価することができる。すなわち本
発明は、複数のリン酸化酵素が共存する可能性のある試
料を用い、個々のリン酸化酵素活性を独立して把握する
ことができる測定方法を提供する。
【００１８】基質ペプチドと抗体との反応は、公知のイ
ムノアッセイの原理を利用して検出することができる。
一般的には、基質ペプチドと抗体のいずれかを固相化し
た状態で用いることにより、未反応成分との分離を容易
に行うことができる。基質ペプチドや抗体を固相化する
方法は公知である。たとえば基質ペプチドや抗体は、化
学結合や物理吸着によって固相に直接固定できる。また
基質ペプチドをビオチン化しておけば、ストレプトアビ
ジンを感作した固相に捕捉し間接的に固相化することが
できる。一般的に、基質ペプチドを固定化する場合に
は、タンパク質の担体への吸着が飽和する条件で行われ
る。この場合、ビオチン化した基質ペプチドの固相化
は、試料との接触前、接触後、あるいは接触と同時等、
任意のタイミングで行うことができる。更に、互いに親
和性を有する組み合わせであれば、アビジン−ビオチン
系以外でも本発明に適用することができる。たとえば、
基質ペプチドを適当な抗原性物質との接合体としてお
き、この抗原性物質に対する抗体を感作した固相を利用
して基質ペプチドの捕捉が可能である。本発明におい
て、基質ペプチドや抗体を固定化するための固相として
は、反応容器の内壁、粒子状担体、あるいはビーズ状担
体など、一般的に固相として利用されているものを利用
することができる。その素材についても、一般にタンパ
ク質の物理吸着や化学結合に利用されているものを利用
することができる。具体的には、ポリスチレン製のマイ
クロタイタープレート等が利用される。本発明におい
て、リン酸化のレベルの変化をイムノアッセイの原理に
基づいて評価するとき、基質ペプチドと抗体とは、その
いずれかを標識しておくことにより、簡便な操作を実現
できる。標識としては、検出可能な感度を有すれば特に
制限はなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラク
トシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース-6
-リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼなど
の酵素標識、デルフィニウムなどの蛍光標識、放射標識
などを用いることが可能である。また直接標識のみなら
ず、該抗体と特異的に結合する物質、例えば、二次抗
体、プロテインＡ、プロテインＧ，プロテインＡ／Ｇ
（ＡとＧの融合タンパク質）などを標識する、いわゆる
間接標識系を利用することもできる。基質ペプチドのリ
ン酸化レベルの評価は、抗体の特異性と上記標識に応じ
て当業者に公知の方法で行うことができる（例えば、超
高感度酵素免疫測定法 石川榮治著 学会出版センター
(1993) 参照）。すなわち、リン酸化された基質ペプ
チドとの反応性を持つ抗体を標識した基質ペプチドと組
み合わせて利用する場合には、抗体と反応した標識基質
ペプチドに由来するシグナルの大きさがリン酸化活性に
比例する。逆に、リン酸化されない基質ペプチドとの反
応性を持つ抗体を用いれば、シグナルの大きさはリン酸
化活性と逆比例することになる。リン酸化レベルは、リ
ン酸化レベルが判明している基質ペプチドを標準試料と
して予め作成した検量線に基づいて定量化することがで
きる。あるいは、リン酸化酵素活性フリーの試料を対照
として、定性的な比較を行うこともできる。
ムノアッセイの原理を利用して検出することができる。
一般的には、基質ペプチドと抗体のいずれかを固相化し
た状態で用いることにより、未反応成分との分離を容易
に行うことができる。基質ペプチドや抗体を固相化する
方法は公知である。たとえば基質ペプチドや抗体は、化
学結合や物理吸着によって固相に直接固定できる。また
基質ペプチドをビオチン化しておけば、ストレプトアビ
ジンを感作した固相に捕捉し間接的に固相化することが
できる。一般的に、基質ペプチドを固定化する場合に
は、タンパク質の担体への吸着が飽和する条件で行われ
る。この場合、ビオチン化した基質ペプチドの固相化
は、試料との接触前、接触後、あるいは接触と同時等、
任意のタイミングで行うことができる。更に、互いに親
和性を有する組み合わせであれば、アビジン−ビオチン
系以外でも本発明に適用することができる。たとえば、
基質ペプチドを適当な抗原性物質との接合体としてお
き、この抗原性物質に対する抗体を感作した固相を利用
して基質ペプチドの捕捉が可能である。本発明におい
て、基質ペプチドや抗体を固定化するための固相として
は、反応容器の内壁、粒子状担体、あるいはビーズ状担
体など、一般的に固相として利用されているものを利用
することができる。その素材についても、一般にタンパ
ク質の物理吸着や化学結合に利用されているものを利用
することができる。具体的には、ポリスチレン製のマイ
クロタイタープレート等が利用される。本発明におい
て、リン酸化のレベルの変化をイムノアッセイの原理に
基づいて評価するとき、基質ペプチドと抗体とは、その
いずれかを標識しておくことにより、簡便な操作を実現
できる。標識としては、検出可能な感度を有すれば特に
制限はなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラク
トシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース-6
-リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼなど
の酵素標識、デルフィニウムなどの蛍光標識、放射標識
などを用いることが可能である。また直接標識のみなら
ず、該抗体と特異的に結合する物質、例えば、二次抗
体、プロテインＡ、プロテインＧ，プロテインＡ／Ｇ
（ＡとＧの融合タンパク質）などを標識する、いわゆる
間接標識系を利用することもできる。基質ペプチドのリ
ン酸化レベルの評価は、抗体の特異性と上記標識に応じ
て当業者に公知の方法で行うことができる（例えば、超
高感度酵素免疫測定法 石川榮治著 学会出版センター
(1993) 参照）。すなわち、リン酸化された基質ペプ
チドとの反応性を持つ抗体を標識した基質ペプチドと組
み合わせて利用する場合には、抗体と反応した標識基質
ペプチドに由来するシグナルの大きさがリン酸化活性に
比例する。逆に、リン酸化されない基質ペプチドとの反
応性を持つ抗体を用いれば、シグナルの大きさはリン酸
化活性と逆比例することになる。リン酸化レベルは、リ
ン酸化レベルが判明している基質ペプチドを標準試料と
して予め作成した検量線に基づいて定量化することがで
きる。あるいは、リン酸化酵素活性フリーの試料を対照
として、定性的な比較を行うこともできる。
【００１９】本発明によるリン酸化酵素活性の測定方法
は、DNA-PK、ATM、およびATRの存在が疑われるあらゆる
試料を対象とすることができる。代表的な試料として
は、ヒトや非ヒト動物に由来する組織、各種培養細胞の
抽出液およびその抽出物、細胞の培養上清、血液、尿、
体液、汗、唾液、母乳などの分泌物等を示すことができ
る。特にDNA-PKでは、核抽出液中に含まれるDNA-PKのリ
ン酸化酵素活性を先に述べた２本鎖DNA断片の有無を利
用して測定することにより、細胞周期や免疫機能と関連
する様々な事象とDNA-PKとの関連を明らかにする上で有
用な情報を提供するものと期待される。マウスにおける
DNA-PKの欠損はSCIDマウスと呼ばれる免疫不全個体とな
ることが知られており、機能的にDNA-PKの活性は免疫と
いう生体防御と密接な関係がある。免疫担当細胞の分化
の場である胸腺、骨髄でのDNA-PK活性を測定すること
は、移植後におきる拒絶力を推定したり、何らかの理由
で免疫抑制剤を投与された患者の予後の回復力を推定す
るのに役立つものと考えられる。さらにDNA-PKは、DNA
末端に他のタンパク質とともに結合し、細胞周期チェッ
クポイントやDNA修復にも関与していることが知られて
いる。このため、放射線治療に先立ち、照射を受ける患
者の放射線に対する抵抗力を知るためにDNA-PKの活性測
定をATMとともに行うことは、重要な検査項目となる可
能性が考えられる。このときの検査試料は、患者の皮膚
などから培養された細胞や、ガンなどの病巣を用いるこ
とができ、放射線照射前後における活性を測定する。
は、DNA-PK、ATM、およびATRの存在が疑われるあらゆる
試料を対象とすることができる。代表的な試料として
は、ヒトや非ヒト動物に由来する組織、各種培養細胞の
抽出液およびその抽出物、細胞の培養上清、血液、尿、
体液、汗、唾液、母乳などの分泌物等を示すことができ
る。特にDNA-PKでは、核抽出液中に含まれるDNA-PKのリ
ン酸化酵素活性を先に述べた２本鎖DNA断片の有無を利
用して測定することにより、細胞周期や免疫機能と関連
する様々な事象とDNA-PKとの関連を明らかにする上で有
用な情報を提供するものと期待される。マウスにおける
DNA-PKの欠損はSCIDマウスと呼ばれる免疫不全個体とな
ることが知られており、機能的にDNA-PKの活性は免疫と
いう生体防御と密接な関係がある。免疫担当細胞の分化
の場である胸腺、骨髄でのDNA-PK活性を測定すること
は、移植後におきる拒絶力を推定したり、何らかの理由
で免疫抑制剤を投与された患者の予後の回復力を推定す
るのに役立つものと考えられる。さらにDNA-PKは、DNA
末端に他のタンパク質とともに結合し、細胞周期チェッ
クポイントやDNA修復にも関与していることが知られて
いる。このため、放射線治療に先立ち、照射を受ける患
者の放射線に対する抵抗力を知るためにDNA-PKの活性測
定をATMとともに行うことは、重要な検査項目となる可
能性が考えられる。このときの検査試料は、患者の皮膚
などから培養された細胞や、ガンなどの病巣を用いるこ
とができ、放射線照射前後における活性を測定する。
【００２０】本発明は、リン酸化酵素活性のみならず、
DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択される
リン酸化酵素によってリン酸化された基質ペプチドに対
する脱リン酸化酵素活性の測定方法をも提供する。本発
明に基づく脱リン酸化酵素活性の測定方法は、以下の工
程（ａ）および（ｂ）を含む。 （ａ）リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸化
部位を含む基質ペプチドと試料とを、脱リン酸化反応に
必要な条件下で接触させインキュベートする工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 基質ペプチドとしては、リン酸化酵素活性の測定のため
に用いたものと同じ基質ペプチドを予めリン酸化して利
用することができる。基質ペプチドのリン酸化は、前記
リン酸化が可能な条件下で、DNA-PK、ATM、およびATRで
構成される群から選択されるリン酸化酵素によって基質
ペプチドを処理することによって得ることができる。脱
リン酸化酵素活性の測定に必要なリン酸化基質ペプチド
には、酵素的に合成されたもののみならず、同じ構造を
持つものであれば化学的に合成されたものを用いること
もできる。脱リン酸化酵素活性の測定に用いる、基質ペ
プチドのリン酸化状態を識別しうる抗体とは、先に述べ
たものと同じ抗体を利用することができる。また、イム
ノアッセイに基づく基質ペプチドのリン酸化レベルの評
価方法も、先に述べたのと同様の原理に基づいて実施す
ることができる。ただし、脱リン酸化酵素活性における
標識基質ペプチド（あるいは標識抗体）に由来するシグ
ナルの大きさと、測定すべき酵素活性の大きさの関係が
逆になる点のみが相違する。現在のところ、ヒトの生体
内でDNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択さ
れるリン酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質の
脱リン酸化酵素として機能しているタンパク質は同定さ
れていない。しかし組織抽出液、細胞抽出液中等に含ま
れるトータルプロテインフォスファターゼ活性を測定す
るという測定系となりうる。本発明の脱リン酸化酵素活
性の測定方法は、リン酸化酵素活性の測定方法と同様
に、その存在が疑われるあらゆる試料を測定対象とする
ことができる。たとえば、抽出液中に含まれる脱リン酸
化酵素の精製を試みようとする場合、各画分に見出され
る脱リン酸化酵素活性は、酵素の精製の指標として有用
である。
DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択される
リン酸化酵素によってリン酸化された基質ペプチドに対
する脱リン酸化酵素活性の測定方法をも提供する。本発
明に基づく脱リン酸化酵素活性の測定方法は、以下の工
程（ａ）および（ｂ）を含む。 （ａ）リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸化
部位を含む基質ペプチドと試料とを、脱リン酸化反応に
必要な条件下で接触させインキュベートする工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 基質ペプチドとしては、リン酸化酵素活性の測定のため
に用いたものと同じ基質ペプチドを予めリン酸化して利
用することができる。基質ペプチドのリン酸化は、前記
リン酸化が可能な条件下で、DNA-PK、ATM、およびATRで
構成される群から選択されるリン酸化酵素によって基質
ペプチドを処理することによって得ることができる。脱
リン酸化酵素活性の測定に必要なリン酸化基質ペプチド
には、酵素的に合成されたもののみならず、同じ構造を
持つものであれば化学的に合成されたものを用いること
もできる。脱リン酸化酵素活性の測定に用いる、基質ペ
プチドのリン酸化状態を識別しうる抗体とは、先に述べ
たものと同じ抗体を利用することができる。また、イム
ノアッセイに基づく基質ペプチドのリン酸化レベルの評
価方法も、先に述べたのと同様の原理に基づいて実施す
ることができる。ただし、脱リン酸化酵素活性における
標識基質ペプチド（あるいは標識抗体）に由来するシグ
ナルの大きさと、測定すべき酵素活性の大きさの関係が
逆になる点のみが相違する。現在のところ、ヒトの生体
内でDNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択さ
れるリン酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質の
脱リン酸化酵素として機能しているタンパク質は同定さ
れていない。しかし組織抽出液、細胞抽出液中等に含ま
れるトータルプロテインフォスファターゼ活性を測定す
るという測定系となりうる。本発明の脱リン酸化酵素活
性の測定方法は、リン酸化酵素活性の測定方法と同様
に、その存在が疑われるあらゆる試料を測定対象とする
ことができる。たとえば、抽出液中に含まれる脱リン酸
化酵素の精製を試みようとする場合、各画分に見出され
る脱リン酸化酵素活性は、酵素の精製の指標として有用
である。
【００２１】本発明に基づくリン酸化酵素、あるいは脱
リン酸化酵素活性の測定方法は、それぞれリン酸化酵
素、あるいは脱リン酸化酵素の阻害剤もしくは促進剤の
スクリーニングに利用することができる。すなわち本発
明は、リン酸化酵素、あるいは脱リン酸化酵素の活性を
阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法に関
する。本発明において、これらの酵素活性を阻害、ある
いは促進する化合物を総称して酵素活性を調整する化合
物と呼ぶ。
リン酸化酵素活性の測定方法は、それぞれリン酸化酵
素、あるいは脱リン酸化酵素の阻害剤もしくは促進剤の
スクリーニングに利用することができる。すなわち本発
明は、リン酸化酵素、あるいは脱リン酸化酵素の活性を
阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法に関
する。本発明において、これらの酵素活性を阻害、ある
いは促進する化合物を総称して酵素活性を調整する化合
物と呼ぶ。
【００２２】本発明に基づくリン酸化酵素活性を阻害も
しくは促進する化合物のスクリーニング方法は、以下の
工程（ａ）−（ｃ）を含む。 （ａ）DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択
されるいずれかのリン酸化酵素、およびこのリン酸化酵
素によってリン酸化される基質ペプチドとを、被検化合
物の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させイ
ンキュベートする工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 （ｃ）被検化合物の非存在下における基質ペプチドのリ
ン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドのリン酸化の
レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程 リン酸化酵素と基質ペプチドとの接触、および基質ペプ
チドのリン酸化レベルの評価は、上記のリン酸化酵素活
性の測定方法と同様に行うことができる。その結果、被
検化合物の非存在下で基質ペプチドのセリン残基に結合
しているリン酸基の検出量が低下すれば、スクリーニン
グに用いた被検化合物は、リン酸化酵素の活性を促進す
ると判定される。
しくは促進する化合物のスクリーニング方法は、以下の
工程（ａ）−（ｃ）を含む。 （ａ）DNA-PK、ATM、およびATRで構成される群から選択
されるいずれかのリン酸化酵素、およびこのリン酸化酵
素によってリン酸化される基質ペプチドとを、被検化合
物の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させイ
ンキュベートする工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 （ｃ）被検化合物の非存在下における基質ペプチドのリ
ン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドのリン酸化の
レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程 リン酸化酵素と基質ペプチドとの接触、および基質ペプ
チドのリン酸化レベルの評価は、上記のリン酸化酵素活
性の測定方法と同様に行うことができる。その結果、被
検化合物の非存在下で基質ペプチドのセリン残基に結合
しているリン酸基の検出量が低下すれば、スクリーニン
グに用いた被検化合物は、リン酸化酵素の活性を促進す
ると判定される。
【００２３】本発明によるスクリーニングに用いるリン
酸化酵素には、天然のDNA-PK、ATM、あるいはATRのみな
らず、リコンビナントとして得られる酵素タンパク質を
利用することができる。また天然の酵素と同じアミノ酸
配列を持つもののみならず、そのキナーゼ領域のみから
なる酵素断片を用いることもできる。キナーゼ領域のみ
を用いることにより、発現生成物を小さくすることがで
き、その結果としてリコンビナントとしてより多量の酵
素タンパク質を容易に得ることができる。たとえば、ヒ
トATMでは全長アミノ酸3056残基のうち2695番目から305
6番目(配列番号：２）のみで、またヒトATRでは全長ア
ミノ酸2644残基のうち2305番目から2644番目(配列番
号：３）のみでリン酸化活性を発現することが明らかに
されている。ヒトDNA-PKでは、全長アミノ酸4127残基の
うち3730番目から4127番目のアミノ酸配列が、ヒトATM
やATRのキナーゼ領域のアミノ酸配列と相同性が高く、
この領域(配列番号：１）がキナーゼ領域に相当してい
ると推測される。
酸化酵素には、天然のDNA-PK、ATM、あるいはATRのみな
らず、リコンビナントとして得られる酵素タンパク質を
利用することができる。また天然の酵素と同じアミノ酸
配列を持つもののみならず、そのキナーゼ領域のみから
なる酵素断片を用いることもできる。キナーゼ領域のみ
を用いることにより、発現生成物を小さくすることがで
き、その結果としてリコンビナントとしてより多量の酵
素タンパク質を容易に得ることができる。たとえば、ヒ
トATMでは全長アミノ酸3056残基のうち2695番目から305
6番目(配列番号：２）のみで、またヒトATRでは全長ア
ミノ酸2644残基のうち2305番目から2644番目(配列番
号：３）のみでリン酸化活性を発現することが明らかに
されている。ヒトDNA-PKでは、全長アミノ酸4127残基の
うち3730番目から4127番目のアミノ酸配列が、ヒトATM
やATRのキナーゼ領域のアミノ酸配列と相同性が高く、
この領域(配列番号：１）がキナーゼ領域に相当してい
ると推測される。
【００２４】一方、本発明に基づく脱リン酸化酵素活性
を阻害する、もしくは促進する化合物のスクリーニング
方法は、以下の工程（ａ）−（ｃ）を含む。 （ａ）前記リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸
化酵素、およびリン酸化されたタンパク質の少なくとも
リン酸化部位を含む基質ペプチドを、被検化合物の存在
下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュ
ベートする工程 （ｂ）基質ペプチドの脱リン酸化レベルの変化を、前記
基質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応
性の変化に基づいて検出する工程 （ｃ）被検化合物の非存在下における基質ペプチドの脱
リン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドの脱リン酸
化のレベルを低下もしくは増加させる化合物を選択する
工程 これらのスクリーニング方法において用いられる被検化
合物としては、例えば、ペプチド（タンパク質を含
む）、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞抽出物、
細胞培養上清などが用いられるが、これらに制限されな
い。また、脱リン酸化酵素としては、例えば、大腸菌ア
ルカリフォスファターゼ、牛小腸アルカリフォスファタ
ーゼ、ならびにヒトCdc25、Cdc14等のプロテインフォス
ファターゼ等を用いることができる。脱リン酸化酵素と
リン酸化された基質ペプチドとの接触、および基質ペプ
チドのリン酸化レベルの評価は、上記の脱リン酸化酵素
活性の検出方法と同様に行うことができる。その結果、
被検化合物の非存在下で基質ペプチドのセリン残基に結
合しているリン酸基を検出した場合（対照）と比較し
て、基質ペプチドのセリン残基に結合しているリン酸基
の検出量が増加していれば、スクリーニングに用いた被
検化合物は、脱リン酸化酵素の活性を阻害すると判定さ
れる。逆に、基質ペプチドのセリン残基に結合している
リン酸基の検出量が低下していれば、スクリーニングに
用いた被検化合物は、脱リン酸化酵素の活性を促進する
と判定される。これら本発明のスクリーニング方法にお
いて、被検化合物として、動植物や細菌の細胞抽出物、
細胞培養上清などを用いた場合には、当業者に公知の方
法（例えば、各種クロマトグラフィー）によりこれらを
分画して、それぞれ検出を行うことにより、リン酸化
（または脱リン酸化）酵素の活性を阻害する単一の化合
物を最終的に特定することが可能である。これらスクリ
ーニングにより単離されたリン酸化酵素および脱リン酸
化酵素の活性を阻害もしくは促進する化合物は、特に、
癌治療薬や抗真菌抗生物質の候補化合物として有用であ
る。
を阻害する、もしくは促進する化合物のスクリーニング
方法は、以下の工程（ａ）−（ｃ）を含む。 （ａ）前記リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸
化酵素、およびリン酸化されたタンパク質の少なくとも
リン酸化部位を含む基質ペプチドを、被検化合物の存在
下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュ
ベートする工程 （ｂ）基質ペプチドの脱リン酸化レベルの変化を、前記
基質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応
性の変化に基づいて検出する工程 （ｃ）被検化合物の非存在下における基質ペプチドの脱
リン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドの脱リン酸
化のレベルを低下もしくは増加させる化合物を選択する
工程 これらのスクリーニング方法において用いられる被検化
合物としては、例えば、ペプチド（タンパク質を含
む）、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞抽出物、
細胞培養上清などが用いられるが、これらに制限されな
い。また、脱リン酸化酵素としては、例えば、大腸菌ア
ルカリフォスファターゼ、牛小腸アルカリフォスファタ
ーゼ、ならびにヒトCdc25、Cdc14等のプロテインフォス
ファターゼ等を用いることができる。脱リン酸化酵素と
リン酸化された基質ペプチドとの接触、および基質ペプ
チドのリン酸化レベルの評価は、上記の脱リン酸化酵素
活性の検出方法と同様に行うことができる。その結果、
被検化合物の非存在下で基質ペプチドのセリン残基に結
合しているリン酸基を検出した場合（対照）と比較し
て、基質ペプチドのセリン残基に結合しているリン酸基
の検出量が増加していれば、スクリーニングに用いた被
検化合物は、脱リン酸化酵素の活性を阻害すると判定さ
れる。逆に、基質ペプチドのセリン残基に結合している
リン酸基の検出量が低下していれば、スクリーニングに
用いた被検化合物は、脱リン酸化酵素の活性を促進する
と判定される。これら本発明のスクリーニング方法にお
いて、被検化合物として、動植物や細菌の細胞抽出物、
細胞培養上清などを用いた場合には、当業者に公知の方
法（例えば、各種クロマトグラフィー）によりこれらを
分画して、それぞれ検出を行うことにより、リン酸化
（または脱リン酸化）酵素の活性を阻害する単一の化合
物を最終的に特定することが可能である。これらスクリ
ーニングにより単離されたリン酸化酵素および脱リン酸
化酵素の活性を阻害もしくは促進する化合物は、特に、
癌治療薬や抗真菌抗生物質の候補化合物として有用であ
る。
【００２５】加えて本発明は、上記測定方法、またはス
クリーニングに用いる、リン酸化状態を識別することが
できる抗体を含むキットに関する。本発明のキットは、
リン酸化酵素活性の検出に用いる場合には、前記抗体以
外に、例えば基質ペプチドや緩衝液等で構成される。ま
た、脱リン酸化酵素活性の検出に用いる場合には、前記
抗体以外に、リン酸化された基質ペプチドや緩衝液で構
成される。これら酵素の活性を阻害もしくは促進する化
合物のスクリーニングに用いる場合には、さらにリン酸
化酵素（あるいは脱リン酸化酵素）を組み合わせる。基
質ペプチド、あるいは前記抗体のいずれかは、上記のよ
うな標識を付与することができ、他方を固相化しておく
ことができる。
クリーニングに用いる、リン酸化状態を識別することが
できる抗体を含むキットに関する。本発明のキットは、
リン酸化酵素活性の検出に用いる場合には、前記抗体以
外に、例えば基質ペプチドや緩衝液等で構成される。ま
た、脱リン酸化酵素活性の検出に用いる場合には、前記
抗体以外に、リン酸化された基質ペプチドや緩衝液で構
成される。これら酵素の活性を阻害もしくは促進する化
合物のスクリーニングに用いる場合には、さらにリン酸
化酵素（あるいは脱リン酸化酵素）を組み合わせる。基
質ペプチド、あるいは前記抗体のいずれかは、上記のよ
うな標識を付与することができ、他方を固相化しておく
ことができる。
【００２６】キットには、リン酸化酵素（あるいは脱リ
ン酸化酵素）の活性や、測定系そのものの検定のため
に、酵素標品や基質ペプチド標品を組み合わせることが
できる。これらの標品や、前記抗体には、安定化などの
ための他の成分を加えることができる。例えば、１％程
度のBSA、および終濃度0.2〜10％（好ましくは１％）の
シュークローズ、フルクトースなどのポリオール類を、
標品中に凍結乾燥後のタンパク質変性防止剤として添加
することができる。以下、実施例に基づいて本発明を更
に詳細に説明する。
ン酸化酵素）の活性や、測定系そのものの検定のため
に、酵素標品や基質ペプチド標品を組み合わせることが
できる。これらの標品や、前記抗体には、安定化などの
ための他の成分を加えることができる。例えば、１％程
度のBSA、および終濃度0.2〜10％（好ましくは１％）の
シュークローズ、フルクトースなどのポリオール類を、
標品中に凍結乾燥後のタンパク質変性防止剤として添加
することができる。以下、実施例に基づいて本発明を更
に詳細に説明する。
【００２７】
【実施例】［実施例１]抗リン酸化ペプチド抗体の作製 1)免疫原の作製 1. ペプチドの作製 リン酸化部位として報告されたヒトp53のアミノ酸15番
目、33番目と37番目のセリン残基をそれぞれ含む以下の
6本のペプチドを、ペプチド合成機を用いて作製した。 フォスフォp53-S15 ：SVEPPLS(p)QETFSDC（配列番号：
４） p53-S15 ：SVEPPLSQETFSDC（配列番号：５） フォスフォp53-S33：PENNVLS(p)PLPSQAC（配列番号：
６） p53-S33：PENNVLSPLPSQAC（配列番号：７） フォスフォp53-S37：VLSPLPS(p)QAMDDLC（配列番号：
８） p53-S37：VLSPLPSQAMDDLC（配列番号：９） 上記のペプチド配列は一文字表記で、アミノ末端からカ
ルボキシ末端方向に記した。S(p)はリン酸化セリン残基
を示す。90％以上の純度であることがHPLCにより確認さ
れた。フォスフォp53-S15とp53-S15はヒトp53の9番目か
ら21番目までの、フォスフォp53-S33とp53-S33は27番目
から39番目までの、そしてフォスフォp53-S37とp53-S37
は31番目から43番目までのアミノ酸配列に相当する。全
てのペプチドのカルボキシ末端のシステイン残基は、ペ
プチドをキャリアータンパク質に共有結合させるために
導入した。
目、33番目と37番目のセリン残基をそれぞれ含む以下の
6本のペプチドを、ペプチド合成機を用いて作製した。 フォスフォp53-S15 ：SVEPPLS(p)QETFSDC（配列番号：
４） p53-S15 ：SVEPPLSQETFSDC（配列番号：５） フォスフォp53-S33：PENNVLS(p)PLPSQAC（配列番号：
６） p53-S33：PENNVLSPLPSQAC（配列番号：７） フォスフォp53-S37：VLSPLPS(p)QAMDDLC（配列番号：
８） p53-S37：VLSPLPSQAMDDLC（配列番号：９） 上記のペプチド配列は一文字表記で、アミノ末端からカ
ルボキシ末端方向に記した。S(p)はリン酸化セリン残基
を示す。90％以上の純度であることがHPLCにより確認さ
れた。フォスフォp53-S15とp53-S15はヒトp53の9番目か
ら21番目までの、フォスフォp53-S33とp53-S33は27番目
から39番目までの、そしてフォスフォp53-S37とp53-S37
は31番目から43番目までのアミノ酸配列に相当する。全
てのペプチドのカルボキシ末端のシステイン残基は、ペ
プチドをキャリアータンパク質に共有結合させるために
導入した。
【００２８】2. ペプチドのキャリアータンパク質への
結合 免疫原とするため、リン酸化ペプチド（フォスフォp53-
S15、-S33、または-S37）をそれぞれキャリアータンパ
ク質であるキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ke
yhole limpet hemocyanin：KLH）と共有結合させた。こ
れらのペプチドとKLHとの結合にはm-マレイミドベンゾ
イル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル(MBS)を架橋物
質として用いた。等量のKLHとぺプチドを架橋した。こ
のペプチド-KLHを免疫原として使用した。
結合 免疫原とするため、リン酸化ペプチド（フォスフォp53-
S15、-S33、または-S37）をそれぞれキャリアータンパ
ク質であるキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ke
yhole limpet hemocyanin：KLH）と共有結合させた。こ
れらのペプチドとKLHとの結合にはm-マレイミドベンゾ
イル-N-ヒドロキシスクシニミドエステル(MBS)を架橋物
質として用いた。等量のKLHとぺプチドを架橋した。こ
のペプチド-KLHを免疫原として使用した。
【００２９】3. 免疫原の調製と免疫方法 キャリアータンパク質KLHとそれに結合したペプチド
（ペプチド-KLH）20μg（100μl)をウサギの、10μg（1
00μl)をマウスの１回あたりの免疫原として用いた。1.
5mlチューブで、100μlのフロイント完全アジュバント
とペプチド-KLH（各100μl）を1mlシリンジと21ゲージ
注射針を用いて、完全にエマルジョン化するまで混合し
た。マウス（Balb/c）に対し、腹腔にフォスフォp53-S1
5-KLHまたはフォスフォp53-S33-KLHとアジュバントのエ
マルジョンを26ゲージ注射針を使用して注射した（免
疫）。免疫は１週間ごとに１回、合計4回行った。4回目
の免疫の際、抗体力価をチェックするため、マウスの眼
下静脈蒼より50〜100 μl採血し、ELISA法により抗体力
価の確認を行った。また、フォスフォp53-S37-KLHとア
ジュバントのエマルジョンをウサギ(Japanese white)の
背後部皮下に7から8ケ所に分け、26ゲージ注射針を使用
して免疫した。免疫は１週間ごとに１回、合計5回行っ
た。5回目の免疫の際、抗体力価をチェックするため、
ウサギの耳朶静脈より数ml採血し、ELISA法により抗体
力価を確認した。
（ペプチド-KLH）20μg（100μl)をウサギの、10μg（1
00μl)をマウスの１回あたりの免疫原として用いた。1.
5mlチューブで、100μlのフロイント完全アジュバント
とペプチド-KLH（各100μl）を1mlシリンジと21ゲージ
注射針を用いて、完全にエマルジョン化するまで混合し
た。マウス（Balb/c）に対し、腹腔にフォスフォp53-S1
5-KLHまたはフォスフォp53-S33-KLHとアジュバントのエ
マルジョンを26ゲージ注射針を使用して注射した（免
疫）。免疫は１週間ごとに１回、合計4回行った。4回目
の免疫の際、抗体力価をチェックするため、マウスの眼
下静脈蒼より50〜100 μl採血し、ELISA法により抗体力
価の確認を行った。また、フォスフォp53-S37-KLHとア
ジュバントのエマルジョンをウサギ(Japanese white)の
背後部皮下に7から8ケ所に分け、26ゲージ注射針を使用
して免疫した。免疫は１週間ごとに１回、合計5回行っ
た。5回目の免疫の際、抗体力価をチェックするため、
ウサギの耳朶静脈より数ml採血し、ELISA法により抗体
力価を確認した。
【００３０】2) 抗フォスフォp53-S15モノクローナル
抗体および抗フォスフォp53-S33モノクローナル抗体の
作成 1. ハイブリドーマの作成 十分な抗体力価の確認後、マウスより脾臓を摘出し、ポ
リエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と細胞融
合させた。ハイブリドーマの選別はHAT（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン：hypoxanthine、aminop
terin、thymidine）選択で行った。ハイブリドーマの培
養上清を用いたELISA法により、非リン酸化ペプチド（p
53-S15、p53-S33）よりもリン酸化ペプチド（フォスフ
ォp53-S15、フォスフォp53-S33）に対して反応性の高い
クローンのスクリーニングを行った。
抗体および抗フォスフォp53-S33モノクローナル抗体の
作成 1. ハイブリドーマの作成 十分な抗体力価の確認後、マウスより脾臓を摘出し、ポ
リエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と細胞融
合させた。ハイブリドーマの選別はHAT（ヒポキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン：hypoxanthine、aminop
terin、thymidine）選択で行った。ハイブリドーマの培
養上清を用いたELISA法により、非リン酸化ペプチド（p
53-S15、p53-S33）よりもリン酸化ペプチド（フォスフ
ォp53-S15、フォスフォp53-S33）に対して反応性の高い
クローンのスクリーニングを行った。
【００３１】2. 腹水の取得と抗体の精製 限界希釈法により得られたハイブリドーマクローンを75
cm2フラスコで培養した後、マウスの腹腔に注射した。
ハイブリドーマを注射する10日前に1mlの、3日前に0.5m
lのプリスタン（Sigma）をマウスに注射しておいた。１
〜２週間後にマウスの状態を見ながら腹水の採取を行っ
た。腹水に終濃度50 %になるように硫安を添加し、4℃
で一時間以上攪拌した。高速遠心によりその沈澱を回収
した。最小限の純水で沈澱を完全に溶解後、透析膜を用
いてPBSに対して透析した。完全にPBSに平衡化させた
後、protein Aセファロース（ファルマシア社製）と複
合体を形成させた。最後にprotein Aセファロースから
抗体を溶出させた。
cm2フラスコで培養した後、マウスの腹腔に注射した。
ハイブリドーマを注射する10日前に1mlの、3日前に0.5m
lのプリスタン（Sigma）をマウスに注射しておいた。１
〜２週間後にマウスの状態を見ながら腹水の採取を行っ
た。腹水に終濃度50 %になるように硫安を添加し、4℃
で一時間以上攪拌した。高速遠心によりその沈澱を回収
した。最小限の純水で沈澱を完全に溶解後、透析膜を用
いてPBSに対して透析した。完全にPBSに平衡化させた
後、protein Aセファロース（ファルマシア社製）と複
合体を形成させた。最後にprotein Aセファロースから
抗体を溶出させた。
【００３２】3）抗フォスフォp53-S37ポリクローナル抗
体の作成 1. ウサギからの本採血 十分な抗体力価の確認後、翌週より1週間ごと採血、休
息、免疫の計3週間を1サイクルとして、それを4回繰り
返した。採血は抗体力価の確認の際と同様に、耳朶静脈
より行われた。１回の採血あたり、おおよそ60〜70 ml
の血液を採取した。5サイクル目の採血において、カテ
ーテルを用いて心臓より可能なかぎりの血液を回収し
た。
体の作成 1. ウサギからの本採血 十分な抗体力価の確認後、翌週より1週間ごと採血、休
息、免疫の計3週間を1サイクルとして、それを4回繰り
返した。採血は抗体力価の確認の際と同様に、耳朶静脈
より行われた。１回の採血あたり、おおよそ60〜70 ml
の血液を採取した。5サイクル目の採血において、カテ
ーテルを用いて心臓より可能なかぎりの血液を回収し
た。
【００３３】2. ウサギ血清の回収、保存及び抗体分画
の分離 採取した血液を4℃に一晩静置し凝固させ、血清を分離
した。分離回収された血清に終濃度0.1 %になるようア
ジ化ナトリウムを添加し、4℃で保存した。抗体分画を
分離、濃縮するため、回収した血清に終濃度50 %になる
ように硫安を添加し、4℃で一時間以上、攪拌した。高
速遠心によりその沈澱を回収した。最小限の純水で沈澱
を完全に溶解後、透析膜を用いてPBSに対して透析し
た。完全にPBSに平衡化した後、この抗体分画をカラム
にかけ、抗体の精製を行った。
の分離 採取した血液を4℃に一晩静置し凝固させ、血清を分離
した。分離回収された血清に終濃度0.1 %になるようア
ジ化ナトリウムを添加し、4℃で保存した。抗体分画を
分離、濃縮するため、回収した血清に終濃度50 %になる
ように硫安を添加し、4℃で一時間以上、攪拌した。高
速遠心によりその沈澱を回収した。最小限の純水で沈澱
を完全に溶解後、透析膜を用いてPBSに対して透析し
た。完全にPBSに平衡化した後、この抗体分画をカラム
にかけ、抗体の精製を行った。
【００３４】3. 特異化カラム及び吸収用カラムの作製 5〜10 mlの0.1M炭酸バッファー中で1〜2 gのCNBr活性化
セファロース4Bとペプチド1 mgをローテーターを用い
て、4℃、O/Nで混和することによって、セファロース4B
にペプチドを結合させた。翌日、セファロース4Bをカラ
ムに充填し、カラム体積の4〜10倍量のPBSでセファロー
ス4Bを洗浄した。洗浄後、1M Tris-HCl (pH7.0)でカラ
ムを平衡化し、セファロース4B表面に残っている活性基
をブロッキングするため、そのまま1時間以上30℃に放
置した。ブロッキング後、PBSで洗浄、平衡化し使用し
た。特異化カラム作製にはフォスフォp53-S37を、吸収
用カラム作製にはp53-S37をそれぞれ用いた。
セファロース4Bとペプチド1 mgをローテーターを用い
て、4℃、O/Nで混和することによって、セファロース4B
にペプチドを結合させた。翌日、セファロース4Bをカラ
ムに充填し、カラム体積の4〜10倍量のPBSでセファロー
ス4Bを洗浄した。洗浄後、1M Tris-HCl (pH7.0)でカラ
ムを平衡化し、セファロース4B表面に残っている活性基
をブロッキングするため、そのまま1時間以上30℃に放
置した。ブロッキング後、PBSで洗浄、平衡化し使用し
た。特異化カラム作製にはフォスフォp53-S37を、吸収
用カラム作製にはp53-S37をそれぞれ用いた。
【００３５】4. 特異化カラム及び吸収用カラムによる
抗フォスフォp53-S37抗体の精製 抗リン酸化ペプチド抗体を精製するため、抗フォスフォ
p53-S37抗体分画を特異化カラムに通した。PBS-0.1% Tw
een 20で洗浄後、カラムに吸着している抗リン酸化ペプ
チド抗体を0.1M グリシン-HCl (pH3.0)で溶出した。特
異化カラムより溶出された抗フォスフォp53-S37抗体分
画を、吸収用カラム、p53-S37セファロース 4Bカラムに
通した。吸収用カラムに通すことにより、抗体画分中に
存在する非リン酸化ペプチドとも反応する抗体を吸収用
カラムに吸収させた。抗リン酸化ペプチド特異抗体はカ
ラムに吸着せず、カラムを素通りする。吸収用カラムは
PBS-0.1%Tween 20で洗浄され、カラムに吸着している抗
非リン酸化ペプチド抗体は0.1M グリシン-HCl (pH3.0)
で溶出された。溶出後、カラムは再びPBS-0.1% Tween 2
0で平衡化された。非リン酸化ペプチド抗体がほぼ完全
に吸収されるまで、抗体分画を繰り返し吸収用カラムに
通した。吸収の進み具合は非リン酸化ペプチド感作プレ
ートを用いたELISA法によって確認された。吸収用カラ
ムで吸収した抗体（抗リン酸化ペプチド特異抗体）をPB
Sに対して透析した後、リン酸化ペプチド感作プレート
を用いたELISA法によって、そのリン酸化ペプチドに対
する特異性を最終的に確認した。
抗フォスフォp53-S37抗体の精製 抗リン酸化ペプチド抗体を精製するため、抗フォスフォ
p53-S37抗体分画を特異化カラムに通した。PBS-0.1% Tw
een 20で洗浄後、カラムに吸着している抗リン酸化ペプ
チド抗体を0.1M グリシン-HCl (pH3.0)で溶出した。特
異化カラムより溶出された抗フォスフォp53-S37抗体分
画を、吸収用カラム、p53-S37セファロース 4Bカラムに
通した。吸収用カラムに通すことにより、抗体画分中に
存在する非リン酸化ペプチドとも反応する抗体を吸収用
カラムに吸収させた。抗リン酸化ペプチド特異抗体はカ
ラムに吸着せず、カラムを素通りする。吸収用カラムは
PBS-0.1%Tween 20で洗浄され、カラムに吸着している抗
非リン酸化ペプチド抗体は0.1M グリシン-HCl (pH3.0)
で溶出された。溶出後、カラムは再びPBS-0.1% Tween 2
0で平衡化された。非リン酸化ペプチド抗体がほぼ完全
に吸収されるまで、抗体分画を繰り返し吸収用カラムに
通した。吸収の進み具合は非リン酸化ペプチド感作プレ
ートを用いたELISA法によって確認された。吸収用カラ
ムで吸収した抗体（抗リン酸化ペプチド特異抗体）をPB
Sに対して透析した後、リン酸化ペプチド感作プレート
を用いたELISA法によって、そのリン酸化ペプチドに対
する特異性を最終的に確認した。
【００３６】4）抗体の検定 1. 抗体力価及び抗体の特異化検定用ELISA法プレート
の作製及び使用 ペプチドを10 μg/mlになるようにPBSに溶かし、ELISA
法用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50μlず
つ分注して、4℃で一晩感作した。感作後、ペプチド溶
液を除き、1 % BSA-0.1% Tween 20-PBSを1ウェルあたり
200μlずつ分注して、室温で1時間以上ブロッキングを
おこなった。上記のようにして調製したリン酸化ペプチ
ド（フォスフォp53-S15、フォスフォp53-S33、またはフ
ォスフォp53-S37）感作プレートは、抗体力価の測定、
抗リン酸化セリン残基特異抗体の吸収、抗リン酸化ペプ
チド抗体の特異性の確認に用いた。また、非リン酸化ペ
プチド（p53-S15、p53-S33、またはp53-S37）感作プレ
ートはカラムによる非特異抗体の吸収の確認に用いた。
血清や抗体を0.1% Tween 20-PBSで必要に応じて希釈し
た。希釈したそれらのサンプルを感作プレート1ウェル
あたり100μl添加し、室温に1時間静置した（一次反
応）。一次反応後、洗浄瓶を用いて、各ウェルをPBSで4
回以上、十分に洗浄した。0.1% Tween 20-PBSで3000倍
希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Hors
eradish Peroxidase：HRP）標識ヤギ抗ウサギIgG(H+L)
抗体(MBL社製458)を各ウェルに100μlずつ分注し、室温
に1時間静置した（二次反応）。二次反応後、同様に、P
BSで洗浄した後、0.8 mM TMB（テトラメチルベンジジ
ン：Tetramethylbenzidine）溶液を1ウェルあたり100μ
l添加し、30℃で5〜20分間発色させた（発色反応）。1.
5N H3PO4を１ウェルあたり100μlずつ加えて発色反応を
停止させ、マイクロタイタープレートリーダーを用い
て、450nmにおける吸光度を測定した。
の作製及び使用 ペプチドを10 μg/mlになるようにPBSに溶かし、ELISA
法用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50μlず
つ分注して、4℃で一晩感作した。感作後、ペプチド溶
液を除き、1 % BSA-0.1% Tween 20-PBSを1ウェルあたり
200μlずつ分注して、室温で1時間以上ブロッキングを
おこなった。上記のようにして調製したリン酸化ペプチ
ド（フォスフォp53-S15、フォスフォp53-S33、またはフ
ォスフォp53-S37）感作プレートは、抗体力価の測定、
抗リン酸化セリン残基特異抗体の吸収、抗リン酸化ペプ
チド抗体の特異性の確認に用いた。また、非リン酸化ペ
プチド（p53-S15、p53-S33、またはp53-S37）感作プレ
ートはカラムによる非特異抗体の吸収の確認に用いた。
血清や抗体を0.1% Tween 20-PBSで必要に応じて希釈し
た。希釈したそれらのサンプルを感作プレート1ウェル
あたり100μl添加し、室温に1時間静置した（一次反
応）。一次反応後、洗浄瓶を用いて、各ウェルをPBSで4
回以上、十分に洗浄した。0.1% Tween 20-PBSで3000倍
希釈したホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（Hors
eradish Peroxidase：HRP）標識ヤギ抗ウサギIgG(H+L)
抗体(MBL社製458)を各ウェルに100μlずつ分注し、室温
に1時間静置した（二次反応）。二次反応後、同様に、P
BSで洗浄した後、0.8 mM TMB（テトラメチルベンジジ
ン：Tetramethylbenzidine）溶液を1ウェルあたり100μ
l添加し、30℃で5〜20分間発色させた（発色反応）。1.
5N H3PO4を１ウェルあたり100μlずつ加えて発色反応を
停止させ、マイクロタイタープレートリーダーを用い
て、450nmにおける吸光度を測定した。
【００３７】2. 特異性の確認 抗フォスフォp53-S15特異抗体、抗フォスフォp53-S33特
異抗体及び抗フォスフォp53-S37特異抗体を希釈し、各
ペプチド感作プレートを用いてそれらの特異性を確認し
た（図２−４）。
異抗体及び抗フォスフォp53-S37特異抗体を希釈し、各
ペプチド感作プレートを用いてそれらの特異性を確認し
た（図２−４）。
【００３８】［実施例２]リコンビナントATM及びATRの
作製 1）PCR法によるATM及びATRのcDNA単離 1. ATM及びATR増幅用プライマーの設定 ヒトATMのキナーゼ領域（2695番目から3056番目、配列
番号：２）をコードするcDNA配列を増幅するため、以下
に示すhATM-F1とhATM-R1プライマーを設定した。同じく
ヒトATRのキナーゼ領域（2305番目から2644番目、配列
番号：３）をコードするcDNA配列を増幅するため、以下
に記すhATR-F1とhATR-R1プライマーを設定した。 ＜ATM増幅用プライマー＞ フォワードプライマー(hATM-F1) ;5'-GCG AAT TCA GGT
GTA AAT TTA CCA AAA ATA-3'（配列番号：１０）（5'側
2つの塩基(GC)は制限酵素処理を円滑におこなわせるた
めのもの。5'側3番目から8番目(GAATTC)は制限酵素EcoR
I部位。） リバースプライマー(hATM-R1) ; 5'-GCG CTC GAG CAC C
CA AGC TTT CCA TCC TGG-3'（配列番号：１１）（5'側3
つの塩基(GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせるた
めのもの。5'側4番目から9番目(CTCGAG)は制限酵素XhoI
部位。） ＜ATR増幅用プライマー＞ フォワードプライマー(hATR-F1) ；5'-GCG GGA TCC TCT
CTT CAG AAA CCA AAG AAG-3'（配列番号：１２）（5'
側3つの塩基(GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせる
ためのもの。5'側4番目から9番目(GGATCC)は制限酵素Ba
mHI部位。） リバースプライマー(hATR-R1)；5'-GCG CTC GAG CAT AT
A TGG AGT CCA ACC AAG-3'（配列番号：１３）（5'側3
つの塩基(GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせるた
めのもの。5'側4番目から9番目(CTCGAG)は制限酵素XhoI
部位。）
作製 1）PCR法によるATM及びATRのcDNA単離 1. ATM及びATR増幅用プライマーの設定 ヒトATMのキナーゼ領域（2695番目から3056番目、配列
番号：２）をコードするcDNA配列を増幅するため、以下
に示すhATM-F1とhATM-R1プライマーを設定した。同じく
ヒトATRのキナーゼ領域（2305番目から2644番目、配列
番号：３）をコードするcDNA配列を増幅するため、以下
に記すhATR-F1とhATR-R1プライマーを設定した。 ＜ATM増幅用プライマー＞ フォワードプライマー(hATM-F1) ;5'-GCG AAT TCA GGT
GTA AAT TTA CCA AAA ATA-3'（配列番号：１０）（5'側
2つの塩基(GC)は制限酵素処理を円滑におこなわせるた
めのもの。5'側3番目から8番目(GAATTC)は制限酵素EcoR
I部位。） リバースプライマー(hATM-R1) ; 5'-GCG CTC GAG CAC C
CA AGC TTT CCA TCC TGG-3'（配列番号：１１）（5'側3
つの塩基(GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせるた
めのもの。5'側4番目から9番目(CTCGAG)は制限酵素XhoI
部位。） ＜ATR増幅用プライマー＞ フォワードプライマー(hATR-F1) ；5'-GCG GGA TCC TCT
CTT CAG AAA CCA AAG AAG-3'（配列番号：１２）（5'
側3つの塩基(GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせる
ためのもの。5'側4番目から9番目(GGATCC)は制限酵素Ba
mHI部位。） リバースプライマー(hATR-R1)；5'-GCG CTC GAG CAT AT
A TGG AGT CCA ACC AAG-3'（配列番号：１３）（5'側3
つの塩基(GCG)は制限酵素処理を円滑におこなわせるた
めのもの。5'側4番目から9番目(CTCGAG)は制限酵素XhoI
部位。）
【００３９】2. 鋳型DNAの調製 ATM及びATR遺伝子のキナーゼ領域をPCR法で増幅するた
めの鋳型として、ヒト乳癌由来のZR75-1細胞のcDNAを用
いた。まず、cDNAを作製するため、ZR75-1細胞よりフェ
ノール-チオシアン酸グアニジン法（ニッポンジーン、I
SOGEN）を用いて全RNAを抽出、精製した。抽出した全RN
AをもとにオリゴdTまたはオリゴランダムプライマーを
用いてcDNAを合成した（逆転写反応）。
めの鋳型として、ヒト乳癌由来のZR75-1細胞のcDNAを用
いた。まず、cDNAを作製するため、ZR75-1細胞よりフェ
ノール-チオシアン酸グアニジン法（ニッポンジーン、I
SOGEN）を用いて全RNAを抽出、精製した。抽出した全RN
AをもとにオリゴdTまたはオリゴランダムプライマーを
用いてcDNAを合成した（逆転写反応）。
【００４０】3. PCR反応の条件 PCR反応は以下の３段階の条件で行った。 １；95℃ 5分間（変性）、52℃ 1分間（アニール）、72
℃ 2分間（伸長）を1サイクル ２；94℃ 30秒間（変性）、62℃ 30秒間（アニール）、
72℃ 2分間（伸長）を35サイクル ３；72℃ 10分を1サイクル
℃ 2分間（伸長）を1サイクル ２；94℃ 30秒間（変性）、62℃ 30秒間（アニール）、
72℃ 2分間（伸長）を35サイクル ３；72℃ 10分を1サイクル
【００４１】4. 発現ベクターへのクローニング hATM-F1、hATM-R1プライマーセットで増幅されたPCR産
物をEcoRIおよびXhoIで、hATR-F1,hATR-R1プライマーセ
ットで増幅されたPCR産物をBamHIとXhoIでそれぞれ消化
した。制限酵素消化DNAはアガロースゲル電気泳動に供
した後、Geneclean（BIO101社製）で精製した。精製DNA
を、予めPCR産物の両末端と同じ制限酵素BamHIあるいは
EcoRIとXhoIにより消化された発現ベクターpcDNA3-6myc
へライゲーションした。発現ベクターpcDNA3-6mycベク
ターではN末端側に6xmyc tagを付与するので6myc-ATMま
たは6myc-ATRタンパク質として細胞内で発現する。ライ
ゲーション後は「Molecular Cloning(Sambrook et al.,
第二版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor,NY)」の方法に従って大腸菌（DH5
α）株を形質転換し、複数のシングルコロニーを取得し
た。
物をEcoRIおよびXhoIで、hATR-F1,hATR-R1プライマーセ
ットで増幅されたPCR産物をBamHIとXhoIでそれぞれ消化
した。制限酵素消化DNAはアガロースゲル電気泳動に供
した後、Geneclean（BIO101社製）で精製した。精製DNA
を、予めPCR産物の両末端と同じ制限酵素BamHIあるいは
EcoRIとXhoIにより消化された発現ベクターpcDNA3-6myc
へライゲーションした。発現ベクターpcDNA3-6mycベク
ターではN末端側に6xmyc tagを付与するので6myc-ATMま
たは6myc-ATRタンパク質として細胞内で発現する。ライ
ゲーション後は「Molecular Cloning(Sambrook et al.,
第二版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor,NY)」の方法に従って大腸菌（DH5
α）株を形質転換し、複数のシングルコロニーを取得し
た。
【００４２】5. 塩基配列の確認 「Molecular Cloning（前記）」の方法に従い、各シン
グルコロニーからプラスミドDNAを精製した。そのイン
サートDNAの塩基配列をサンガー法に基づき、オートシ
ークエンサーで決定した。インサートDNAの配列とデー
タベース上に公開されている配列とを比較し、ATMおよ
びATRのcDNA配列であることを確認した。
グルコロニーからプラスミドDNAを精製した。そのイン
サートDNAの塩基配列をサンガー法に基づき、オートシ
ークエンサーで決定した。インサートDNAの配列とデー
タベース上に公開されている配列とを比較し、ATMおよ
びATRのcDNA配列であることを確認した。
【００４３】2）cDNAクローンがコードするATM、ATRタ
ンパク質の酵素活性の測定 1. 活性測定用基質の作製 ATMおよびATRはヒトp53の15番目のセリン残基をリン酸
化することが知られている。そこで、ヒトp53のアミノ
酸1番目から99番目をコードするcDNA配列を発現ベクタ
ーpGEXに組み込み、大腸菌内に形質転換した。この大腸
菌で発現されるグルタチオン-s-トランスフェラーゼ（G
ST）との融合タンパク質GST-p53(1-99)を、ATMおよびAT
Rの活性測定用基質として使用した。pGEXベクターでは
リコンビナントタンパク質はGSTとの融合タンパク質と
して作られる。このGST酵素がグルタチオン（GSH）に対
してアフィニティーを持っていることを利用して、リコ
ンビナントタンパク質の精製を行った。リコンビナント
タンパク質の発現を確認した後、その菌体を1% Tween 2
0 - PBSに懸濁後、超音波処理により菌体を破砕した。
高速遠心後、上清をリコンビナントタンパク質を含む可
溶性分画とした。この可溶性分画をGSH - セファロース
4B カラム（Pharmacia社製）に通し、GST-p53(1-99)タ
ンパク質をカラムに吸着させた。カラムをWEバッファー
(10 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM MgCl2、20 mM T
ris-HClpH7.5)で洗浄後、リコンビナントタンパク質をG
バッファー(10 mM GSH、50 mM Tris-HCl pH9.6)を用い
て溶出した。溶出されたGST-p53(1-99)タンパク質はPBS
に対して透析した。
ンパク質の酵素活性の測定 1. 活性測定用基質の作製 ATMおよびATRはヒトp53の15番目のセリン残基をリン酸
化することが知られている。そこで、ヒトp53のアミノ
酸1番目から99番目をコードするcDNA配列を発現ベクタ
ーpGEXに組み込み、大腸菌内に形質転換した。この大腸
菌で発現されるグルタチオン-s-トランスフェラーゼ（G
ST）との融合タンパク質GST-p53(1-99)を、ATMおよびAT
Rの活性測定用基質として使用した。pGEXベクターでは
リコンビナントタンパク質はGSTとの融合タンパク質と
して作られる。このGST酵素がグルタチオン（GSH）に対
してアフィニティーを持っていることを利用して、リコ
ンビナントタンパク質の精製を行った。リコンビナント
タンパク質の発現を確認した後、その菌体を1% Tween 2
0 - PBSに懸濁後、超音波処理により菌体を破砕した。
高速遠心後、上清をリコンビナントタンパク質を含む可
溶性分画とした。この可溶性分画をGSH - セファロース
4B カラム（Pharmacia社製）に通し、GST-p53(1-99)タ
ンパク質をカラムに吸着させた。カラムをWEバッファー
(10 mM 2-メルカプトエタノール、2 mM MgCl2、20 mM T
ris-HClpH7.5)で洗浄後、リコンビナントタンパク質をG
バッファー(10 mM GSH、50 mM Tris-HCl pH9.6)を用い
て溶出した。溶出されたGST-p53(1-99)タンパク質はPBS
に対して透析した。
【００４４】2. ヒト293T細胞へのトランスフェクショ
ンと活性測定 ATMまたはATRをインサートに持つプラスミドDNAをTrans
IT-LT1（Mirus社製）を用いてヒト293T細胞へトランス
フェクトした。その２日後、氷冷PBSで洗った細胞をHGN
バッファー［10mM HEPES (pH7.5)、10% グリセリン、15
0mM NaCl 1% Tween20、10mM β-グリセロリン酸、1mM N
aF、0.1mM NaVO4、2μg/ml ペプスタチンA、5μg/ml ロ
イペプチン、10μg/ml アプロチニン、2mM ベンズアミ
ジン、1mM PMSF、1mM DTT］に懸濁した。遠心分離後の
上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液をSDS-ポリアクリ
ルアミド電気泳動（PAGE)に供した後、ウエスタンブロ
ットを行ない、抗myc tag抗体（MBL社製）でタンパク質
の発現を確認した。細胞抽出液に抗myc tag抗体とプロ
テインAセファロース（Pharmacia社製）を加えて6myc-A
TMタンパク質または6myc-ATRタンパク質を免疫沈降し
た。免疫沈降物は100mM Tris（pH7.5）、0.5M LiClで洗
った後、さらに1ｘATM/ATR反応用バッファー［10mM HEP
ES（pH7.5）、50mM β-グリセロリン酸、50mM NaCl、10
mM MgCl2、10mM MnCl2、5mM ATP、1mM DTT］で洗った。
洗浄後の免疫沈降物を370kBqのγ-32P-ATP、1μgのGST-
p53(1-99)を添加したキナーゼ反応バッファー中に30℃3
0分間保温した。反応液をSDS-PAGEに供し、乾燥ゲルの
オートラジオグラフをとることで基質に用いたGST-p53
(1-99)に32Pが取り込まれたことを確認した。
ンと活性測定 ATMまたはATRをインサートに持つプラスミドDNAをTrans
IT-LT1（Mirus社製）を用いてヒト293T細胞へトランス
フェクトした。その２日後、氷冷PBSで洗った細胞をHGN
バッファー［10mM HEPES (pH7.5)、10% グリセリン、15
0mM NaCl 1% Tween20、10mM β-グリセロリン酸、1mM N
aF、0.1mM NaVO4、2μg/ml ペプスタチンA、5μg/ml ロ
イペプチン、10μg/ml アプロチニン、2mM ベンズアミ
ジン、1mM PMSF、1mM DTT］に懸濁した。遠心分離後の
上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液をSDS-ポリアクリ
ルアミド電気泳動（PAGE)に供した後、ウエスタンブロ
ットを行ない、抗myc tag抗体（MBL社製）でタンパク質
の発現を確認した。細胞抽出液に抗myc tag抗体とプロ
テインAセファロース（Pharmacia社製）を加えて6myc-A
TMタンパク質または6myc-ATRタンパク質を免疫沈降し
た。免疫沈降物は100mM Tris（pH7.5）、0.5M LiClで洗
った後、さらに1ｘATM/ATR反応用バッファー［10mM HEP
ES（pH7.5）、50mM β-グリセロリン酸、50mM NaCl、10
mM MgCl2、10mM MnCl2、5mM ATP、1mM DTT］で洗った。
洗浄後の免疫沈降物を370kBqのγ-32P-ATP、1μgのGST-
p53(1-99)を添加したキナーゼ反応バッファー中に30℃3
0分間保温した。反応液をSDS-PAGEに供し、乾燥ゲルの
オートラジオグラフをとることで基質に用いたGST-p53
(1-99)に32Pが取り込まれたことを確認した。
【００４５】3）Spodoptera frugiperda (Sf9)細胞から
のリコンビナントタンパク質の精製 1. リコンビナントバキュロウイルス液の調製 GST-p53(1-99)を32P標識したcDNAクローンについて、そ
のインサートをATMについてはEcoRIとXhoIで、ATRにつ
いてはBamHIとXhoIで切り出し、pFASTBACHTベクター（G
IBCO BRL社製）にサブクローニングした。pFASTBACHTの
プラスミドクローンを大腸菌(DH10BAC株）へトランスフ
ォーメーションし、ルリア寒天プレート(Luria agar pl
ate)[10g/L ペプトン、5g/L 酵母エキストラクト、10g/
L NaCl、12g/L 寒天、200μg/ml X-Gal、40μg/ml IPT
G、10μg/ml テトラサイクリン、7μg/ml ゲンタマイシ
ン、50μg/ml カナマイシン]上で生育させた。DH10BAC
内では部位特異的トランスポジションによって、pFASTB
ACHT内の発現カセットがbacmid DNAへ転移する。転移の
起きたシングルの白色コロニーからリコンビナントbacm
id DNAを精製した。リコンビナントbacmid DNAをCELLFE
CTIN (GIBCO BRL)を用いてSf9細胞に形質転換した。リ
コンビナントバキュロウイルスは培養液中に産生される
ので、約1週間後に培養液を遠心分離し、その上清をウ
イルス液とした。以上の操作は基本的にBAC-TO-BAC Bac
ulovirus Expression System（GIBCO BRL社製）により
行った。
のリコンビナントタンパク質の精製 1. リコンビナントバキュロウイルス液の調製 GST-p53(1-99)を32P標識したcDNAクローンについて、そ
のインサートをATMについてはEcoRIとXhoIで、ATRにつ
いてはBamHIとXhoIで切り出し、pFASTBACHTベクター（G
IBCO BRL社製）にサブクローニングした。pFASTBACHTの
プラスミドクローンを大腸菌(DH10BAC株）へトランスフ
ォーメーションし、ルリア寒天プレート(Luria agar pl
ate)[10g/L ペプトン、5g/L 酵母エキストラクト、10g/
L NaCl、12g/L 寒天、200μg/ml X-Gal、40μg/ml IPT
G、10μg/ml テトラサイクリン、7μg/ml ゲンタマイシ
ン、50μg/ml カナマイシン]上で生育させた。DH10BAC
内では部位特異的トランスポジションによって、pFASTB
ACHT内の発現カセットがbacmid DNAへ転移する。転移の
起きたシングルの白色コロニーからリコンビナントbacm
id DNAを精製した。リコンビナントbacmid DNAをCELLFE
CTIN (GIBCO BRL)を用いてSf9細胞に形質転換した。リ
コンビナントバキュロウイルスは培養液中に産生される
ので、約1週間後に培養液を遠心分離し、その上清をウ
イルス液とした。以上の操作は基本的にBAC-TO-BAC Bac
ulovirus Expression System（GIBCO BRL社製）により
行った。
【００４６】2. リコンビナントタンパク質の精製 Sf9細胞を75cm2のフラスコにほぼコンフルエントな状態
にまで培養し、その培養液にリコンビナントバキュロウ
イルス液を加えた。感染後3〜４日目に細胞を氷冷PBSに
懸濁し、遠心洗浄を行った。細胞をHGNバッファー（-DT
T）に懸濁し、氷冷しながら超音波処理を行った。続い
て遠心分離を行い、得られた上清を可溶性画分として精
製に用いた。pFASTBACHTベクターの発現カセットではN
末端側に6つのHis残基（6xHis)が付加される。抽出液の
一部を用いてウエスタンブロットを行った後、抗5xHis
抗体（GIAGEN社製）によりタンパク質の発現を確認し
た。可溶性分画をNi-キレーティングセファロースカラ
ム(Pharmacia社製）に通し、6xHis-Tagを介して組換え
タンパク質をカラムに吸着させた。6xHis-TagはNi2+と
錯体を形成するため、カラムのNi2+にリコンビナントタ
ンパク質が吸着する。カラムをHGNバッファー(-DTT)で
洗浄した後、リコンビナントタンパク質を溶出バッファ
ー(50 mM 〜1 M イミダゾール、0.5 M NaCl、20 mM Tri
s-HCl pH7.9)で溶出した。その際のイミダゾールの濃度
は10mM、25mM、50 mM、100 mM、250 mM、500mM、1 Mと
段階的に変化させて溶出を行った。各イミダゾール画分
について、ウエスタンブロットで抗5xHis抗体により検
出されるリコンビナントタンパク質が存在する画分を透
析液［50mM HEPES (pH7.5)、1mM DTT、1mM EDTA (pH8.
0)、50% グリセリン］に対して一晩透析した。透析後の
サンプルをMonoQカラム(Pharmacia社製)に通した。FPLC
(Pharmacia社製)を用いて吸着されたタンパク質を、0〜
1M NaClを含む10mM Tris-HCl (pH7.5)、1mM DTT、10%
グリセリンで濃度勾配をかけながら溶出させた。ウエス
タンブロットで抗5xHis抗体により検出されたリコンビ
ナントタンパク質が存在する画分について透析液に対し
て透析を行った。
にまで培養し、その培養液にリコンビナントバキュロウ
イルス液を加えた。感染後3〜４日目に細胞を氷冷PBSに
懸濁し、遠心洗浄を行った。細胞をHGNバッファー（-DT
T）に懸濁し、氷冷しながら超音波処理を行った。続い
て遠心分離を行い、得られた上清を可溶性画分として精
製に用いた。pFASTBACHTベクターの発現カセットではN
末端側に6つのHis残基（6xHis)が付加される。抽出液の
一部を用いてウエスタンブロットを行った後、抗5xHis
抗体（GIAGEN社製）によりタンパク質の発現を確認し
た。可溶性分画をNi-キレーティングセファロースカラ
ム(Pharmacia社製）に通し、6xHis-Tagを介して組換え
タンパク質をカラムに吸着させた。6xHis-TagはNi2+と
錯体を形成するため、カラムのNi2+にリコンビナントタ
ンパク質が吸着する。カラムをHGNバッファー(-DTT)で
洗浄した後、リコンビナントタンパク質を溶出バッファ
ー(50 mM 〜1 M イミダゾール、0.5 M NaCl、20 mM Tri
s-HCl pH7.9)で溶出した。その際のイミダゾールの濃度
は10mM、25mM、50 mM、100 mM、250 mM、500mM、1 Mと
段階的に変化させて溶出を行った。各イミダゾール画分
について、ウエスタンブロットで抗5xHis抗体により検
出されるリコンビナントタンパク質が存在する画分を透
析液［50mM HEPES (pH7.5)、1mM DTT、1mM EDTA (pH8.
0)、50% グリセリン］に対して一晩透析した。透析後の
サンプルをMonoQカラム(Pharmacia社製)に通した。FPLC
(Pharmacia社製)を用いて吸着されたタンパク質を、0〜
1M NaClを含む10mM Tris-HCl (pH7.5)、1mM DTT、10%
グリセリンで濃度勾配をかけながら溶出させた。ウエス
タンブロットで抗5xHis抗体により検出されたリコンビ
ナントタンパク質が存在する画分について透析液に対し
て透析を行った。
【００４７】3. 精製リコンビナントタンパク質のタン
パク質リン酸化酵素としての純度検定 リコンビナントタンパク質を含む透析後の画分について
タンパク質リン酸化酵素活性を測定した。透析後の濃縮
サンプルのうち2〜5mlを用いて、0.5 mM ペプチド、0.1
mM ATP（185 kBqのγ-32P-ATPを含む）を含む1ｘATM/AT
R反応用バッファーを調製し、30℃に10分間保温した。
次に、その反応液をP81フォスフォセルロース濾紙（Wha
tman社製)上にスポットし、濾紙を75mM H3PO4中で洗浄
した。20分間の洗浄を3回行った後、濾紙を乾燥させ、
ペプチドに取り込まれた32Pの放射能をシンチレーショ
ンカウンター（Beckman社製）を用いてチェレンコフ法
で測定した。ATM、ATRの活性測定にはDNA-PKペプチド(P
romega社製）を、PKAの活性測定用にはKemptide(Promeg
a社製）、カゼイン・キナーゼIIの活性測定にはCasein
Kinase II Peptide（NEB社製）を用いた。その結果、精
製リコンビナントATM、ATRにPKAとカゼイン・キナーゼI
Iの活性は認められなかった。
パク質リン酸化酵素としての純度検定 リコンビナントタンパク質を含む透析後の画分について
タンパク質リン酸化酵素活性を測定した。透析後の濃縮
サンプルのうち2〜5mlを用いて、0.5 mM ペプチド、0.1
mM ATP（185 kBqのγ-32P-ATPを含む）を含む1ｘATM/AT
R反応用バッファーを調製し、30℃に10分間保温した。
次に、その反応液をP81フォスフォセルロース濾紙（Wha
tman社製)上にスポットし、濾紙を75mM H3PO4中で洗浄
した。20分間の洗浄を3回行った後、濾紙を乾燥させ、
ペプチドに取り込まれた32Pの放射能をシンチレーショ
ンカウンター（Beckman社製）を用いてチェレンコフ法
で測定した。ATM、ATRの活性測定にはDNA-PKペプチド(P
romega社製）を、PKAの活性測定用にはKemptide(Promeg
a社製）、カゼイン・キナーゼIIの活性測定にはCasein
Kinase II Peptide（NEB社製）を用いた。その結果、精
製リコンビナントATM、ATRにPKAとカゼイン・キナーゼI
Iの活性は認められなかった。
【００４８】4. リコンビナントATM、ATRのリン酸化部
位特異性の確認 上記精製リコンビナントATMまたはATRおよびGST-p53（1
-99）を含む1x ATM/ATR反応用バッファーを30℃に保温
し、経時的にその反応液の一部を当量の2 x SDS化バッ
ファーと混合して反応を停止した。その経時的な反応物
をSDS-PAGEに供し、ウエスタンブロットを行った。一次
抗体（抗フォスフォp53-S15モノクローナル抗体、抗フ
ォスフォp53-S33モノクローナル抗体またはフォスフォp
53-S37モノクローナル抗体）は0.5 μg/mlとなるよう抗
体希釈用バッファー（1% BSA、0.1%NaN3）で希釈して使
用した。一次抗体反応後、メンブレンを0.05％Triton X
100-PBSで洗浄した。0.05％Triton X100-PBSで3000倍に
希釈したHRP標識ヤギ抗マウス抗体(MBL社製)または2000
倍に希釈したHRP標識ヤギ抗ウサギ抗体(MBL社製)を室温
で1時間抗原抗体反応させた（二次反応）。0.05％Trito
n X100-PBSでメンブレンを洗浄後、ECL検出キット（Ame
rsham社製）でリン酸化部位の検出を行った。その結
果、リコンビナントATMおよびATRはGST-p53（1-99）のS
15残基をリン酸化するが、S33残基とS37残基をリン酸化
しないことが確認された。このことから、リコンビナン
トATMおよびATRは、SQE配列を部位特異的にリン酸化す
ることが確認された。
位特異性の確認 上記精製リコンビナントATMまたはATRおよびGST-p53（1
-99）を含む1x ATM/ATR反応用バッファーを30℃に保温
し、経時的にその反応液の一部を当量の2 x SDS化バッ
ファーと混合して反応を停止した。その経時的な反応物
をSDS-PAGEに供し、ウエスタンブロットを行った。一次
抗体（抗フォスフォp53-S15モノクローナル抗体、抗フ
ォスフォp53-S33モノクローナル抗体またはフォスフォp
53-S37モノクローナル抗体）は0.5 μg/mlとなるよう抗
体希釈用バッファー（1% BSA、0.1%NaN3）で希釈して使
用した。一次抗体反応後、メンブレンを0.05％Triton X
100-PBSで洗浄した。0.05％Triton X100-PBSで3000倍に
希釈したHRP標識ヤギ抗マウス抗体(MBL社製)または2000
倍に希釈したHRP標識ヤギ抗ウサギ抗体(MBL社製)を室温
で1時間抗原抗体反応させた（二次反応）。0.05％Trito
n X100-PBSでメンブレンを洗浄後、ECL検出キット（Ame
rsham社製）でリン酸化部位の検出を行った。その結
果、リコンビナントATMおよびATRはGST-p53（1-99）のS
15残基をリン酸化するが、S33残基とS37残基をリン酸化
しないことが確認された。このことから、リコンビナン
トATMおよびATRは、SQE配列を部位特異的にリン酸化す
ることが確認された。
【００４９】［実施例３]DNA-PK、ATM、およびATRの活
性測定系 1）ATMまたはATRの活性測定用ELISA法の構築 1. GST-p53(1-99)感作プレートの作製 GST-p53(1-99)を20 μg/mlになるようにPBSに溶かし、E
LISA法用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50
μlずつ分注して、4℃で一晩感作した。感作後、GST-p5
3(1-99)溶液を除き、1% BSA - 0.1% Tween 20 - PBSを1
ウェルあたり200μlずつ分注して、室温で1時間以上ブ
ロッキングした。
性測定系 1）ATMまたはATRの活性測定用ELISA法の構築 1. GST-p53(1-99)感作プレートの作製 GST-p53(1-99)を20 μg/mlになるようにPBSに溶かし、E
LISA法用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50
μlずつ分注して、4℃で一晩感作した。感作後、GST-p5
3(1-99)溶液を除き、1% BSA - 0.1% Tween 20 - PBSを1
ウェルあたり200μlずつ分注して、室温で1時間以上ブ
ロッキングした。
【００５０】2. リコンビナントATMまたはATRの活性測
定手順 リコンビナントタンパク質GST-p53(1-99)を固相化した
ウェル中でタンパク質リン酸化反応を行った後、同じウ
ェルで連続してELISA法を行った。リコンビナントATMま
たはATRを含む1xATM/ATR反応用バッファーを調製し、50
μlずつGST-p53(1-99)感作プレートのウェルに添加した
（タンパク質リン酸化反応）。30℃で一定時間保温した
後、200μlの75mM H3PO4溶液を各ウェルに添加して反応
を停止した。各ウェルをPBSで4回以上十分に洗浄した。
一次抗体（抗フォスフォp53-S15モノクローナル抗体）
を0.5 μg/mlとなるよう抗体希釈用バッファー（1% BS
A、0.1% NaN3）で希釈し、洗浄後の各ウェルに100 μl
ずつ添加して室温で1時間静置した（一次反応）。一次
反応後、同様にPBSで洗浄した。0.05％Triton X100-PBS
で3000倍に希釈したHRP標識ヤギ抗マウス抗体(MBL社製)
を各ウェルに100 μlずつ添加し、さらに室温で1時間静
置した（二次反応）。PBSで洗浄後、各ウェルにHRP基質
液を100 μlずつ添加し、37℃で発色させた。1.5N H3PO
4を100 μlずつ加え発色反応を停止させ、マイクロタイ
タープレートリーダーを用いて、450 nmにおける吸光度
を測定した。
定手順 リコンビナントタンパク質GST-p53(1-99)を固相化した
ウェル中でタンパク質リン酸化反応を行った後、同じウ
ェルで連続してELISA法を行った。リコンビナントATMま
たはATRを含む1xATM/ATR反応用バッファーを調製し、50
μlずつGST-p53(1-99)感作プレートのウェルに添加した
（タンパク質リン酸化反応）。30℃で一定時間保温した
後、200μlの75mM H3PO4溶液を各ウェルに添加して反応
を停止した。各ウェルをPBSで4回以上十分に洗浄した。
一次抗体（抗フォスフォp53-S15モノクローナル抗体）
を0.5 μg/mlとなるよう抗体希釈用バッファー（1% BS
A、0.1% NaN3）で希釈し、洗浄後の各ウェルに100 μl
ずつ添加して室温で1時間静置した（一次反応）。一次
反応後、同様にPBSで洗浄した。0.05％Triton X100-PBS
で3000倍に希釈したHRP標識ヤギ抗マウス抗体(MBL社製)
を各ウェルに100 μlずつ添加し、さらに室温で1時間静
置した（二次反応）。PBSで洗浄後、各ウェルにHRP基質
液を100 μlずつ添加し、37℃で発色させた。1.5N H3PO
4を100 μlずつ加え発色反応を停止させ、マイクロタイ
タープレートリーダーを用いて、450 nmにおける吸光度
を測定した。
【００５１】3. 測定結果 上記ELISA法を用いて、リコンビナントATM、ATRのタン
パク質リン酸化酵素活性を測定した結果を示した（図
５、図６）。
パク質リン酸化酵素活性を測定した結果を示した（図
５、図６）。
【００５２】2)DNA-PK活性測定用ELISA法の構築 1.DNA-PKのリン酸化部位特異性の確認 DNA-PK（Promega社製）およびGST-p53（1-99）を含む1x
DNA-PK反応バッファー（25 mM HEPES pH7.5、75 mM KC
l、10 mM MgCl2、1mM DTT、0.2 mM EGTA、0.25 mM AT
P、10μg/ml 超音波処理2本鎖DNA、50mM β-グリセロリ
ン酸）を30℃に保温し、経時的にその反応液の一部を当
量の2 x SDS化バッファーと混合して反応を停止した。
その経時的な反応物をSDS-PAGEに供し、ウエスタンブロ
ットを行った。一次抗体（抗フォスフォp53-S15モノク
ローナル抗体、抗フォスフォp53-S33モノクローナル抗
体またはフォスフォp53-S37モノクローナル抗体）は0.5
μg/mlとなるよう抗体希釈用バッファー（PBS、1% BS
A、0.1% NaN3）で希釈して使用した。一次抗体反応後、
メンブレンを0.05％Triton X100-PBSで洗浄した。0.05
％Triton X100-PBSで3000倍に希釈したHRP標識ヤギ抗マ
ウス抗体(MBL社製)または2000倍に希釈したHRP標識ヤギ
抗ウサギ抗体(MBL社製)を室温で1時間抗原抗体反応させ
た（二次反応）。0.05％Triton X100-PBSでメンブレン
を洗浄後、ECL検出キット（Amersham社製）でリン酸化
部位の検出を行った。その結果、DNA-PKはGST-p53（1-9
9）のS15残基とS37残基をリン酸化するが、S33残基はリ
ン酸化しないことが確認された。このことから、DNA-PK
はSQ配列を部位特異的にリン酸化することが確認され
た。
DNA-PK反応バッファー（25 mM HEPES pH7.5、75 mM KC
l、10 mM MgCl2、1mM DTT、0.2 mM EGTA、0.25 mM AT
P、10μg/ml 超音波処理2本鎖DNA、50mM β-グリセロリ
ン酸）を30℃に保温し、経時的にその反応液の一部を当
量の2 x SDS化バッファーと混合して反応を停止した。
その経時的な反応物をSDS-PAGEに供し、ウエスタンブロ
ットを行った。一次抗体（抗フォスフォp53-S15モノク
ローナル抗体、抗フォスフォp53-S33モノクローナル抗
体またはフォスフォp53-S37モノクローナル抗体）は0.5
μg/mlとなるよう抗体希釈用バッファー（PBS、1% BS
A、0.1% NaN3）で希釈して使用した。一次抗体反応後、
メンブレンを0.05％Triton X100-PBSで洗浄した。0.05
％Triton X100-PBSで3000倍に希釈したHRP標識ヤギ抗マ
ウス抗体(MBL社製)または2000倍に希釈したHRP標識ヤギ
抗ウサギ抗体(MBL社製)を室温で1時間抗原抗体反応させ
た（二次反応）。0.05％Triton X100-PBSでメンブレン
を洗浄後、ECL検出キット（Amersham社製）でリン酸化
部位の検出を行った。その結果、DNA-PKはGST-p53（1-9
9）のS15残基とS37残基をリン酸化するが、S33残基はリ
ン酸化しないことが確認された。このことから、DNA-PK
はSQ配列を部位特異的にリン酸化することが確認され
た。
【００５３】2. GST-p53(1-99)感作プレートの作製 GST-p53(1-99)を20 μg/mlになるようにPBSに溶かし、E
LISA法用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50
μlずつ分注して、4℃で一晩感作した。感作後、GST-p5
3 Nter溶液を除き、1% BSA - 0.1% Tween 20 - PBSを1
ウェルあたり200μlずつ分注して、室温で1時間以上ブ
ロッキングした。
LISA法用マイクロタイタープレートに1ウェルあたり50
μlずつ分注して、4℃で一晩感作した。感作後、GST-p5
3 Nter溶液を除き、1% BSA - 0.1% Tween 20 - PBSを1
ウェルあたり200μlずつ分注して、室温で1時間以上ブ
ロッキングした。
【００５４】3. DNA-PKの活性測定手順 リコンビナントタンパク質GST-p53(1-99)を固相化した
ウェル中でタンパク質リン酸化反応を行った後、同じウ
ェルで連続してELISA法を行った。DNA-PKを含む1x DNA-
PKキナーゼ反応バッファーを調製し、50 μlずつGST-p5
3Nter感作プレートのウェルに添加した（タンパク質リ
ン酸化反応）。30℃で一定時間保温した後、200μlの75
mM H3PO4溶液を各ウェルに添加して反応を停止した。各
ウェルをPBSで4回以上十分に洗浄した。一次抗体（抗フ
ォスフォp53-S15モノクローナル抗体または抗フォスフ
ォp53-S37ポリクローナル抗体）を0.5 μg/mlとなるよ
う抗体希釈用バッファー（1% BSA、0.1% NaN3）で希釈
し、洗浄後の各ウェルに100 μlずつ添加して室温で1時
間静置した（一次反応）。一次反応後、同様にPBSで洗
浄した。0.05％Triton X100-PBSで3000倍に希釈したHRP
標識ヤギ抗マウス抗体(MBL社製)または2000倍に希釈し
たHRP標識ヤギ抗ウサギ抗体(MBL社製)を各ウェルに100
μlずつ添加し、さらに室温で1時間静置した（二次反
応）。PBSで洗浄後、各ウェルにHRP基質液を100 μlず
つ添加し、37℃で発色させた。1.5N H3PO4を100 μlず
つ加え発色反応を停止させ、マイクロタイタープレート
リーダーを用いて、450 nmにおける吸光度を測定した。
ウェル中でタンパク質リン酸化反応を行った後、同じウ
ェルで連続してELISA法を行った。DNA-PKを含む1x DNA-
PKキナーゼ反応バッファーを調製し、50 μlずつGST-p5
3Nter感作プレートのウェルに添加した（タンパク質リ
ン酸化反応）。30℃で一定時間保温した後、200μlの75
mM H3PO4溶液を各ウェルに添加して反応を停止した。各
ウェルをPBSで4回以上十分に洗浄した。一次抗体（抗フ
ォスフォp53-S15モノクローナル抗体または抗フォスフ
ォp53-S37ポリクローナル抗体）を0.5 μg/mlとなるよ
う抗体希釈用バッファー（1% BSA、0.1% NaN3）で希釈
し、洗浄後の各ウェルに100 μlずつ添加して室温で1時
間静置した（一次反応）。一次反応後、同様にPBSで洗
浄した。0.05％Triton X100-PBSで3000倍に希釈したHRP
標識ヤギ抗マウス抗体(MBL社製)または2000倍に希釈し
たHRP標識ヤギ抗ウサギ抗体(MBL社製)を各ウェルに100
μlずつ添加し、さらに室温で1時間静置した（二次反
応）。PBSで洗浄後、各ウェルにHRP基質液を100 μlず
つ添加し、37℃で発色させた。1.5N H3PO4を100 μlず
つ加え発色反応を停止させ、マイクロタイタープレート
リーダーを用いて、450 nmにおける吸光度を測定した。
【００５５】4. 測定結果 上記ELISA法を用いて、DNA-PKのタンパク質リン酸化酵
素活性を測定した（図７）。
素活性を測定した（図７）。
【００５６】
【発明の効果】実施例に示したように、抗リン酸化ペプ
チド特異抗体を用いたELISA法によって、DNA-PK、ATM、
およびATRのタンパク質リン酸化酵素活性を測定するこ
とができた。これまではタンパク質リン酸化酵素の活性
測定では、放射性同位元素32Pで標識されたγ-32P-ATP
を用いるために、廃液の処理といった手続きや特別な施
設等を必要とした。しかし、実施例に示した活性測定系
では放射性同位元素を使用しないため、これらの測定系
の酵素反応中に各種の化学合成物質や細胞及び細菌抽出
液、培養上清などを添加することによって、簡便で迅速
な阻害物質の検索を通常の実験室で行うことが可能であ
る。
チド特異抗体を用いたELISA法によって、DNA-PK、ATM、
およびATRのタンパク質リン酸化酵素活性を測定するこ
とができた。これまではタンパク質リン酸化酵素の活性
測定では、放射性同位元素32Pで標識されたγ-32P-ATP
を用いるために、廃液の処理といった手続きや特別な施
設等を必要とした。しかし、実施例に示した活性測定系
では放射性同位元素を使用しないため、これらの測定系
の酵素反応中に各種の化学合成物質や細胞及び細菌抽出
液、培養上清などを添加することによって、簡便で迅速
な阻害物質の検索を通常の実験室で行うことが可能であ
る。
【００５７】また、DNA-PK、ATM、およびATRは一次構造
が類似したセリン/トレオニンタンパク質リン酸化酵素
であり、ともにPI3Kファミリーに属するが、実施例に示
したようにp53のSer15のリン酸化、p53のSer37のリン酸
化を調べることで、DNA-PK、ATM、およびATRの酵素活性
を区別することが可能である。本実施例により各酵素の
モレキュラープローブを生み出す機会を提供することが
可能である。
が類似したセリン/トレオニンタンパク質リン酸化酵素
であり、ともにPI3Kファミリーに属するが、実施例に示
したようにp53のSer15のリン酸化、p53のSer37のリン酸
化を調べることで、DNA-PK、ATM、およびATRの酵素活性
を区別することが可能である。本実施例により各酵素の
モレキュラープローブを生み出す機会を提供することが
可能である。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING SEQUENCE LISTING <110> Medical & Biological Laboratories co., Ltd. <120> Method for Determining of Protein Kinase Activity. <130> M3-103 <140> <141> <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Arg Arg Pro Lys Arg Ile Ile Ile Arg Gly His Asp Glu Arg 1 5 10 15 Glu His Pro Phe Leu Val Lys Gly Gly Glu Asp Leu Arg Gln Asp Gln 20 25 30 Arg Val Glu Gln Leu Phe Gln Val Met Asn Gly Ile Leu Ala Gln Asp 35 40 45 Ser Ala Cys Ser Gln Arg Ala Leu Gln Leu Arg Thr Tyr Ser Val Val 50 55 60 Pro Met Thr Ser Arg Leu Gly Leu Ile Glu Trp Leu Glu Asn Thr Val 65 70 75 80 Thr Leu Lys Asp Leu Leu Leu Asn Thr Met Ser Gln Glu Glu Lys Ala 85 90 95 Ala Tyr Leu Ser Asp Pro Arg Ala Pro Pro Cys Glu Tyr Lys Asp Trp 100 105 110 Leu Thr Lys Met Ser Gly Lys His Asp Val Gly Ala Tyr Met Leu Met 115 120 125 Tyr Lys Gly Ala Asn Arg Thr Glu Thr Val Thr Ser Phe Arg Lys Arg 130 135 140 Glu Ser Lys Val Pro Ala Asp Leu Leu Lys Arg Ala Phe Val Arg Met 145 150 155 160 Ser Thr Ser Pro Glu Ala Phe Leu Ala Leu Arg Ser His Phe Ala Ser 165 170 175 Ser His Ala Leu Ile Cys Ile Ser His Trp Ile Leu Gly Ile Gly Asp 180 185 190 Arg His Leu Asn Asn Phe Met Val Ala Met Glu Thr Gly Gly Val Ile 195 200 205 Gly Ile Asp Phe Gly His Ala Phe Gly Ser Ala Thr Gln Phe Leu Pro 210 215 220 Val Pro Glu Leu Met Pro Phe Arg Leu Thr Arg Gln Phe Ile Asn Leu 225 230 235 240 Met Leu Pro Met Lys Glu Thr Gly Leu Met Tyr Ser Ile Met Val His 245 250 255 Ala Leu Arg Ala Phe Arg Ser Asp Pro Gly Leu Leu Thr Asn Thr Met 260 265 270 Asp Val Phe Val Lys Glu Pro Ser Phe Asp Trp Lys Asn Phe Glu Gln 275 280 285 Lys Met Leu Lys Lys Gly Gly Ser Trp Ile Gln Glu Ile Asn Val Ala 290 295 300 Glu Lys Asn Trp Tyr Pro Arg Gln Lys Ile Cys Tyr Ala Lys Arg Lys 305 310 315 320 Leu Ala Gly Ala Asn Pro Ala Val Ile Thr Cys Asp Glu Leu Leu Leu 325 330 335 Gly His Glu Lys Ala Pro Ala Phe Arg Asp Tyr Val Ala Val Ala Arg 340 345 350 Gly Ser Lys Asp His Asn Ile Arg Ala Gln Glu Pro Glu Ser Gly Leu 355 360 365 Ser Glu Glu Thr Gln Val Lys Cys Leu Met Asp Gln Ala Thr Asp Pro 370 375 380 Asn Ile Leu Gly Arg Thr Trp Glu Gly Trp Glu Pro Trp Met 385 390 395 <210> 2 <211> 362 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Val Asn Leu Pro Lys Ile Ile Asp Cys Val Gly Ser Asp Gly Lys 1 5 10 15 Glu Arg Arg Gln Leu Val Lys Gly Arg Asp Asp Leu Arg Gln Asp Ala 20 25 30 Val Met Gln Gln Val Phe Gln Met Cys Asn Thr Leu Leu Gln Arg Asn 35 40 45 Thr Glu Thr Arg Lys Arg Lys Leu Thr Ile Cys Thr Tyr Lys Val Val 50 55 60 Pro Leu Ser Gln Arg Ser Gly Val Leu Glu Trp Cys Thr Gly Thr Val 65 70 75 80 Pro Ile Gly Glu Phe Leu Val Asn Asn Glu Asp Gly Ala His Lys Arg 85 90 95 Tyr Arg Pro Asn Asp Phe Ser Ala Phe Gln Cys Gln Lys Lys Met Met 100 105 110 Glu Val Gln Lys Lys Ser Phe Glu Glu Lys Tyr Glu Val Phe Met Asp 115 120 125 Val Cys Gln Asn Phe Gln Pro Val Phe Arg Tyr Phe Cys Met Glu Lys 130 135 140 Phe Leu Asp Pro Ala Ile Trp Phe Glu Lys Arg Leu Ala Tyr Thr Arg 145 150 155 160 Ser Val Ala Thr Ser Ser Ile Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp 165 170 175 Arg His Val Gln Asn Ile Leu Ile Asn Glu Gln Ser Ala Glu Leu Val 180 185 190 His Ile Asp Leu Gly Val Ala Phe Glu Gln Gly Lys Ile Leu Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Thr Val Pro Phe Arg Leu Thr Arg Asp Ile Val Asp Gly Met 210 215 220 Gly Ile Thr Gly Val Glu Gly Val Phe Arg Arg Cys Cys Glu Lys Thr 225 230 235 240 Met Glu Val Met Arg Asn Ser Gln Glu Thr Leu Leu Thr Ile Val Glu 245 250 255 Val Leu Leu Tyr Asp Pro Leu Phe Asp Trp Thr Met Asn Pro Leu Lys 260 265 270 Ala Leu Tyr Leu Gln Gln Arg Pro Glu Asp Glu Thr Glu Leu His Pro 275 280 285 Thr Leu Asn Ala Asp Asp Gln Glu Cys Lys Arg Asn Leu Ser Asp Ile 290 295 300 Asp Gln Ser Phe Asp Lys Val Ala Glu Arg Val Leu Met Arg Leu Gln 305 310 315 320 Glu Lys Leu Lys Gly Val Glu Glu Gly Thr Val Leu Ser Val Gly Gly 325 330 335 Gln Val Asn Leu Leu Ile Gln Gln Ala Ile Asp Pro Lys Asn Leu Ser 340 345 350 Arg Leu Phe Pro Gly Trp Lys Ala Trp Val 355 360 <210> 3 <211> 340 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Leu Gln Lys Pro Lys Lys Ile Ser Leu Lys Gly Ser Asp Gly Lys 1 5 10 15 Phe Tyr Ile Met Met Cys Lys Pro Lys Asp Asp Leu Arg Lys Asp Cys 20 25 30 Arg Leu Met Glu Phe Asn Ser Leu Ile Asn Lys Cys Leu Arg Lys Asp 35 40 45 Ala Glu Ser Arg Arg Arg Glu Leu His Ile Arg Thr Tyr Ala Val Ile 50 55 60 Pro Leu Asn Asp Glu Cys Gly Ile Ile Glu Trp Val Asn Asn Thr Ala 65 70 75 80 Gly Leu Arg Pro Ile Leu Thr Lys Leu Tyr Lys Glu Lys Gly Val Tyr 85 90 95 Met Thr Gly Lys Glu Leu Arg Gln Cys Met Leu Pro Lys Ser Ala Ala 100 105 110 Leu Ser Glu Lys Leu Lys Val Phe Arg Glu Phe Leu Leu Pro Arg His 115 120 125 Pro Pro Ile Phe His Glu Trp Phe Leu Arg Thr Phe Pro Asp Pro Thr 130 135 140 Ser Trp Tyr Ser Ser Arg Ser Ala Tyr Cys Arg Ser Thr Ala Val Met 145 150 155 160 Ser Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg His Gly Glu Asn 165 170 175 Ile Leu Phe Asp Ser Leu Thr Gly Glu Cys Val His Val Asp Phe Asn 180 185 190 Cys Leu Phe Asn Lys Gly Glu Thr Phe Glu Val Pro Glu Ile Val Pro 195 200 205 Phe Arg Leu Thr His Asn Met Val Asn Gly Met Gly Pro Met Gly Thr 210 215 220 Glu Gly Leu Phe Arg Arg Ala Cys Glu Val Thr Met Arg Leu Met Arg 225 230 235 240 Asp Gln Arg Glu Pro Leu Met Ser Val Leu Lys Thr Phe Leu His Asp 245 250 255 Pro Leu Val Glu Trp Ser Lys Pro Val Lys Gly His Ser Lys Ala Pro 260 265 270 Leu Asn Glu Thr Gly Glu Val Val Asn Glu Lys Ala Lys Thr His Val 275 280 285 Leu Asp Ile Glu Gln Arg Leu Gln Gly Val Ile Lys Thr Arg Asn Arg 290 295 300 Val Thr Gly Leu Pro Leu Ser Ile Glu Gly His Val His Tyr Leu Ile 305 310 315 320 Gln Glu Ala Thr Asp Glu Asn Leu Leu Cys Gln Met Tyr Leu Gly Trp 325 330 335 Thr Pro Tyr Met 340 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> PHOSPHORYLATION <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide. <400> 4 Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide. <400> 5 Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Thr Phe Ser Asp Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide. <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 6 Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide. <400> 7 Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide. <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> PHOSPHORYLATION <400> 8 Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Peptide. <400> 9 Val Leu Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence. <400> 10 gcgaattcag gtgtaaattt accaaaaata 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence. <400> 11 gcgctcgagc acccaagctt tccatcctgg 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence. <400> 12 gcgggatcct ctcttcagaa accaaagaag 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence. <400> 13 gcgctcgagc atatatggag tccaaccaag 30
【図１】 DNA損傷チェックポイントによる細胞周期の
制御を示す図である。
制御を示す図である。
【図２】 抗フォスフォp53-S15の反応性を示す図であ
る。
る。
【図３】 抗フォスフォp53-S33の反応性を示す図であ
る。
る。
【図４】 抗フォスフォp53-S37の反応性を示す図であ
る。
る。
【図５】 抗フォスフォp53-S15抗体により検出される
組換えATMのリン酸化酵素活性を示す図である。
組換えATMのリン酸化酵素活性を示す図である。
【図６】 抗フォスフォp53-S15抗体により検出される
組換えATRのリン酸化酵素活性を示す図である。
組換えATRのリン酸化酵素活性を示す図である。
【図７】 抗フォスフォp53部位特異的抗体により検出
されるDNA-PKのリン酸化酵素活性を示す図である。
されるDNA-PKのリン酸化酵素活性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢野 実 長野県伊那市大字手良沢岡字大原1063− 103 株式会社医学生物学研究所内 (72)発明者 玉井 克之 長野県伊那市大字手良沢岡字大原1063− 103 株式会社医学生物学研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA12 BA10 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 GA18 HA01 HA15 4B050 CC03 DD11 FF05E FF09E LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ03 QQ27 QR48 QR82 QS15 QS33 QX02 4H045 AA30 CA40 DA75 DA76 EA51 FA72 GA05 GA10 GA26
Claims (20)
- 【請求項１】次の工程を含む、試料中のタンパク質リン
酸化酵素活性の測定方法であって、タンパク質リン酸化
酵素が、DNA依存性プロテインキナーゼ、ATM、およびAT
Rで構成される群から選択されることを特徴とする方
法。 （ａ）前記リン酸化酵素によってリン酸化される基質ペ
プチドと試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に
必要な条件下で接触させる工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 - 【請求項２】以下の工程を含む、タンパク質リン酸化酵
素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング
方法であって、タンパク質リン酸化酵素が、DNA依存性
プロテインキナーゼ、ATM、およびATRで構成される群か
ら選択されることを特徴とする方法。 （ａ）DNA依存性プロテインキナーゼ、ATM、およびATR
で構成される群から選択されるいずれかのリン酸化酵
素、およびこのリン酸化酵素によってリン酸化される基
質ペプチドとを、被検化合物の存在下、リン酸化反応に
必要な条件下で接触させインキュベートする工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 （ｃ）被検化合物の非存在下における基質ペプチドのリ
ン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドのリン酸化の
レベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択す
る工程 - 【請求項３】以下の工程を含む、試料中のリン酸化され
たタンパク質の脱リン酸化酵素活性の測定方法であっ
て、前記リン酸化されたタンパク質が、DNA依存性プロ
テインキナーゼ、ATM、およびATRで構成される群から選
択されるリン酸化酵素によってリン酸化されたものであ
る方法。 （ａ）リン酸化されたタンパク質の少なくともリン酸化
部位を含む基質ペプチドと試料とを、脱リン酸化反応に
必要な条件下で接触させインキュベートする工程 （ｂ）基質ペプチドのリン酸化レベルの変化を、前記基
質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性
の変化に基づいて検出する工程 - 【請求項４】以下の工程を含む、リン酸化されたタンパ
ク質に対する脱リン酸化酵素活性を阻害もしくは促進す
る化合物のスクリーニング方法であって、前記リン酸化
されたタンパク質が、DNA依存性プロテインキナーゼ、A
TM、およびATRで構成される群から選択されるリン酸化
酵素によってリン酸化されたものである方法。 （ａ）前記リン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸
化酵素、およびリン酸化されたタンパク質の少なくとも
リン酸化部位を含む基質ペプチドを、被検化合物の存在
下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュ
ベートする工程 （ｂ）基質ペプチドの脱リン酸化レベルの変化を、前記
基質ペプチドのリン酸化状態を識別しうる抗体との反応
性の変化に基づいて検出する工程 （ｃ）被検化合物の非存在下における基質ペプチドの脱
リン酸化のレベルと比較して、基質ペプチドの脱リン酸
化のレベルの変化を低下もしくは増加させる化合物を選
択する工程 - 【請求項５】基質ペプチドが、SQモチーフ、またはSQE
モチーフを構成するアミノ酸配列を含むものである請求
項１−４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】リン酸化状態を識別することができる抗体
が、そのリン酸化部位を識別しうるものであり、異なる
部位をリン酸化する複数のリン酸化酵素が共存する試料
に含まれるリン酸化酵素の活性を個別に測定する請求項
１の方法。 - 【請求項７】リン酸化酵素が、ATMまたはATRであり、抗
体がp53の15位セリンを含むSQEモチーフのリン酸化状態
を識別しうるものである請求項６の方法。 - 【請求項８】リン酸化酵素が、DNA依存性プロテインキ
ナーゼであり、抗体がp53の37位セリンを含むSQモチー
フのリン酸化状態を識別しうるものである請求項６の方
法。 - 【請求項９】以下の工程を含む、DNA依存性プロテイン
キナーゼ活性の測定方法。 （ａ）２本鎖DNAの不存在下で請求項１の方法を実施す
ることによって、試料中のリン酸化酵素活性を測定する
工程 （ｂ）２本鎖DNAの存在下で請求項１の方法を実施する
ことによって試料中のリン酸化酵素活性を測定する工程 （ｃ）（ａ）と（ｂ）の結果を比較することによって、
DNA依存性プロテインキナーゼに由来するリン酸化酵素
活性を求める工程 - 【請求項１０】抗体が、リン酸化されていない基質ペプ
チドよりも、リン酸化された基質ペプチドとの反応性が
高いものである請求項１−４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１１】抗体が、リン酸化された基質ペプチドよ
りも、リン酸化されていない基質ペプチドとの反応性が
高いものである請求項１−４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】基質ペプチドが標識されている、請求項
１−４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１３】基質ペプチドが固相化されている、請求
項１−４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】抗体が標識されている、請求項１−４の
いずれかに記載の方法。 - 【請求項１５】基質ペプチドのリン酸化レベルの評価を
ELISA法により行う、請求項１−４のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１６】請求項２に記載のスクリーニング方法に
より単離することができる、DNA依存性プロテインキナ
ーゼ、ATM、およびATRからなる群から選択されるタンパ
ク質リン酸化酵素の活性を調整する化合物。 - 【請求項１７】請求項４に記載のスクリーニング方法に
より単離することができる、DNA依存性プロテインキナ
ーゼ、ATM、およびATRからなる群から選択されるタンパ
ク質リン酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質に
対する脱リン酸化酵素の活性を調整する化合物。 - 【請求項１８】天然由来である、請求項１６または１７
のいずれかに記載の化合物。 - 【請求項１９】請求項１−４に記載のいずれかの方法に
用いるための、基質ペプチドのリン酸化状態を識別する
抗体。 - 【請求項２０】基質ペプチドのリン酸化状態を識別する
抗体を含む、請求項１−４に記載のいずれかの方法のた
めのキット。
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