KR100895256B1 - Ａｔｍ／ａｔｒ을 이용한 세포사멸 조절제 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 세포사멸을 활성화시키는 ATM/ATR 단백질 및 이 단백질의 발현을 억제할 수 있는 작은 간섭 RNA를 이용한 세포사멸 억제제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 사멸 수용체 의존성 세포사멸 활성화제인 ATM/ATR 단백질은 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 유발되는 각종 암 및 자가 면역 질환 등을 예방 또는 치료하는데 유용하며, 이러한 단백질의 발현을 선택적으로 차단할 수 있는 siRNA를 이용한 세포사멸 억제제는 비정상적인 세포사멸에 의한 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

ATM/ATR, 사멸 수용체 의존성 세포사멸, 암, 자가면역질환, 퇴행성 질환

Description

ＡＴＭ／ＡＴＲ을 이용한 세포사멸 조절제 스크리닝 방법{The Screening Method of Apoptotic Regulator by Controling of ATM/ATR}

본 발명은 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 세포사멸을 활성화시키는 ATM/ATR 단백질 및 이 단백질의 발현을 억제할 수 있는 작은 간섭 RNA를 이용한 세포사멸 억제제로서의 용도에 관한 것이다.

세포성장-사멸의 가역적 제어기술(Cell Survival-Death Reversible Controlling Technology)은 세포사멸 조절요법(Apoptosis Modulating Therapy) 개발을 위한 차세대 핵심 기술이다. 최근 연구 결과에 의하면, 다양한 질병에 있어서 그 발병 원인이 근본적으로 세포사멸 신호전달 기구의 비정상적인 기능에 의해 발생하는 것으로 밝혀지고 있으며(Nicholson, D.W., Nature, 407, 810-816, 2000), 이러한 세포사멸 조절요법은 세포사멸을 유도하거나 또는 억제함으로써 비정상적인 세포의 사멸에 의한 질병의 진행을 차단 및 비정상적인 세포를 정상세포로 전환시켜 근본적으로 질병을 치료하는데 유용하다.

전 세계에서 경쟁적으로 개발되고 있는 세포사멸 조절요법의 적용 질환으로는 백혈병을 비롯한 암, 치매, 파킨슨병, AIDS 및 노화현상 등의 각종 노인성 및 퇴행성 질환 등이 있다. 또한, 최근 연구 결과에 의하면 대부분의 질병에 있어서 그 발병이 궁극적으로 세포사멸 신호전달 기구의 비정상적인 기능에 의한 것으로 밝혀짐에 따라, 세포사멸 조절요법은 더욱 다양한 영역의 질병 치료에 유용한 기반 기술로 각광받고 있다.

한편, 세포사멸 조절요법은 병리학적 특성을 가진 세포(병리 세포)의 성장을 차단 및 자발적인 세포사멸을 유도함으로써 질병 치료에 사용될 수 있다. 기존의 광범위한 세포괴사(necrosis) 약물요법은 병리 세포를 죽임과 동시에 병리 세포가 괴사됨으로써 유출되는 세포독성을 지닌 많은 효소들(예를 들면, 리소자임 등)을 방출시키기 때문에 주변에 있는 정상세포까지 세포독성을 나타냄으로써 그 부작용이 심각하다. 반면, 세포사멸 조절요법은 병리 세포의 자발적인 사멸을 유도하기 때문에, 세포독성을 가진 세포내의 여러 물질들은 세포사멸 동안 카스파제(caspase)라는 효소들에 의해 대부분 절단되고, 그 기능을 상실하며 동시에 세포사멸체(apoptotic body)에 의해 둘러싸여 대식세포(macrophage)에 의한 식세포작용(phagocytosis) 과정을 거치게 된다. 이로 인해, 세포독성 물질들은 외부로 유출되지 않으며 주변 세포에 대한 독성을 나타내지 않게 된다.

세포사멸(apoptosis)은 진핵세포에서 나타나는 세포의 파괴 또는 자살을 의미하며(Kerr, et al., British Journal of Cancer, 26, 239-257, 1972), 동물의 정상적인 발생조절 및 불필요하거나, 비정상적으로 손상된 세포의 제거 등 개체의 항 상성(homeostasis) 유지를 위해 에너지를 필요로 할 뿐 아니라 특징적인 세포 형태를 가지고 있다(Thompson, C. B, Science, 267, 1456-1462, 1995; 및 Raff. M, Nature, 396, 119-122, 1998). 이러한 세포사멸은 세포가 수축(shrinkage)되면서 접하고 있던 주변세포와 떨어지게 되고, 세포막의 기포형성(blebbing)으로 변하게 되며, 더 나아가 핵이 응축(condensation)되고 핵 내에 있는 DNA가 작은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 절편으로 잘려져 세포사멸체(apoptotic body)를 형성하게 된다. 이렇게 형성된 세포사멸체가 대식세포에 의해 식세포작용과 같은 일련의 과정을 거치면서 세포사멸이 일어나게 된다. 대부분의 형태학적 변화는 세포사멸 과정에서 활성화 효소인 아스파라긴산 특이적 시스테인 프로테아제(aspartic acid-specific cysteine protease; caspase)들에 의해 이루어진다(Hengartner, M. O., Nature, 407, 770-776, 2000; Nicholson, D. W. 및 Thornberry. N. A., Trends. Biochem. Sci., 22, 290-306, 1997; Budihardjo. I., et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 15, 269-290, 1999; 및 Degterev. A., et al., Oncogene, 22, 8543-8567, 2003).

세포사멸은 크게 두 가지 경로, 즉 세포 내부로부터 기인한 세포사멸 경로(내인성 경로, intrinsic pathway)와 세포 외부로부터 사멸 수용체를 경유하는 세포사멸 경로(외인성 경로, extrinsic pathway)로 나눌 수 있다. 첫 번째 경로로 알려진 세포 내부의 결손에 의한 세포사멸 경로(내인성 경로)는 종양 단백질, 직접적인 DNA 손상 및 저산소증 등과 같은 세포 내부의 스트레스에 의해 활성화되는 경로이다. 예를 들어, 자외선에 의해 세포 내의 DNA가 손상을 받게 되면, ATM(ataxia-telangiectasia, mutated) 인산화효소가 활성화되어 Chk2를 인산화시키고, 세포 내 스트레스 센서인 p53이 ATM 인산화효소에 의해 인산화되어 안정화되는데, 이 단백질은 세포사멸을 촉진시키는 Bax, PUMA, Bak 또는 Noxa와 같은 단백질의 유전자 전사를 촉진시켜 세포사멸이 활성화된다(Jonstone, R. W., et al., Cell, 108, 153-164, 2002). 이때, p53 단백질은 세포사멸 촉진 단백질의 전사를 촉진하여 세포사멸을 증가시킬 뿐 아니라 유전자의 전사와 상관없이 세포사멸을 촉진시키기도 한다.

두 번째 경로로 알려는 사멸 수용체를 매개로 하는 세포사멸 경로(외인성 경로)는 세포 표면의 종양 괴사 인자류(tumor necrosis factor: TNF superfamily)의 사멸 수용체를 활성화시켜 초기화할 수 있다. 이러한 세포사멸 경로는 세포막에 존재하는 사멸 수용체에 작은 분자의 리간드가 결합함으로써 자극받게 된다. 수용체에 대한 리간드로는 TNF-α, Fas 리간드, TNF 수용체 사멸-유도 리간드(TNF receptor apoptosis-inducing ligand, TRAIL) 등이 있으며, 수용체에 리간드가 결합하면 활성화되어 수용체의 중합반응이 일어나게 된다. 예를 들어, Fas의 경우, 사멸 신호가 세포질 막 안쪽의 FADD를 끌어오며 초기 활성화 카스파제(카스파제-8, -10)로 신호가 전달되면, 결국 사멸유도신호복합체(death inducing signaling complex, DISC)가 형성된다. 반면, TNFR1의 활성화는 직접적인 TNF 수용체와 연결되어 있는 사멸 도메인(TRADD)과 결합하게 되며, 추가적으로 이 수용체와 결합하고 있는 단백질(RIP)과 TNFR-활성화 인자 2(TRAF2) 단백질이 이 복합체에 결합하게 된다. TNFR1을 매개로 하는 세포사멸은 복합체의 내부로의 유입, TNFR1의 해리, FADD의 보충(recruitment) 및 카스파제-8, -10을 통한 경로로 유도된다고 보고되었다(Micheau and Tschopp, Cell, 114, 181-190, 2003).

한편, ATM(ataxia-telangiectasia, muated) 및 ATR(ATM and Rad3-related)은 다양한 개체에서 확인된 많은 인산화효소들 중 최상위 부류로서, C-말단에는 PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase) 특성화 부위를 가지고 있다(Rotman, G 및 Shiloh, Y., Oncogene, 18, 6135-6144, 1999). 이러한 단백질은 출아 효모인 사카로마이세스 세레비재(Saccharomyces cerevisiae)에서는 Tel1p와 Mec1p, 분열 효모인 스키조사카로마이세스 폼비(Schizosaccharomyces pombe)에서는 Rad3p 및 포유동물의 DNA-의존성 단백질 인산화효소의 촉매 유닛(DNA-PKcs)을 포함하고 있다. 효모에서, ATM은 텔로미어 항상성과 관련된 Tel1p 서열과 가장 유사하며, A-T(ataxia-telangiectasia) 세포에서 손상된 기능 회복을 위해 Tel1p 보체를 세포밖에서 발현시킨다(Fritz, E. et al., Mol. Biol. Cell, 11, 2605-2616, 2000). ATR(ATM and Rad3-related)은 Mec1p 및 Rad3p의 유사체로 알려져 있다.

이러한 ATM 및 ATR은 DNA 손상 회복 및 세포의 생장을 위하여 개별적 또는 조합된 방법으로 작용할 수 있다. 즉, ATM은 DNA의 이중-나선 결합(double-strand break, DSB)에만 제한적으로 반응하는데 반해, ATR은 UV 손상 및 복제과정 억제시 반응한다. 특히, DNA 손상에 의한 세포사멸의 경우, ATM 및 ATR 인산화효소는 이를 매개로 하는 하위단위인 p53 단백질의 인산화를 통한 세포사멸 신호전달 체계가 잘 알려져 있는 반면, 사멸 수용체를 매개로 하는 세포사멸의 경우, 지금까지 ATM 및 ATR 인산화효소의 기능적 역할에 대한 보고는 전무한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 각종 암 및 자가면연질환(자가면역성 관절염, 자가면역성 T면역세포 증식성 질환)등을 예방 또는 치료할 수 있는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 활성화제인 ATM/ATR 단백질이 있고 상기 단백질의 발현을 선택적으로 차단할 수 있는 siRNA를 이용한 세포사멸 억제제가 비정상적인 세포사멸에 의한 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 사멸 수용체 의존성 세포사멸 활성화제인 ATM/ATR 단백질 및 이 단백질의 발현을 억제할 수 있는 작은 간섭 RNA(siRNA)를 이용한 세포사멸 억제제 및 그 활성을 억제하는 화합물의 세포 사멸 억제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ATM(ataxia-telangiectasia, muated) 또는 ATR(ATM and Rad3-related)의 활성촉진 성분을 포함하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 촉진제를 제공한다.

또한, 본 발명은 사멸 수용체 의존성 세포사멸 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 ATM 또는 ATR의 활성억제 성분을 포함하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 억제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 사멸 수용체 의존성 세포사멸 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 ATM 또는 ATR의 활성촉진 성분을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 및 항암 치료제와 ATM 또는 ATR 활성억제 성분을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 질환 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 ATM 또는 ATR의 활성촉진 성분을 포함하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 촉진제를 제공한다.

본 발명에서는 DNA 손상시 활성화되어 DNA 손상을 복구하는 단백질로 알려진 ATM 및 ATR 인산화효소의 특징 외에 사멸 수용체를 매개로 하는 세포사멸 과정에서도 상기 효소가 세포사멸 활성화제로 작용할 수 있는지 조사하였다.

그 결과, 도 2A-F 및 도 3A-B에서와 같이, 본 발명의 ATM 및 ATR 인산화효소는 DNA 손상을 유발하지 않고 사멸 수용체에 의한 세포사멸 유도 조건 즉, 세포사멸 유도제인 TNF-α 및 TRAIL을 처리했을 경우, PARP 단편화 및 카스파제-3의 활성을 각각 증가시켰으며, ATM/ATR 인산화효소의 억제제인 카페인을 처리한 경우, TNF-α 및 TRAIL에 의해 증가된 카스파제-3 활성을 특이적으로 억제함을 관찰할 수 있었다(도 4 참조). 특히, ATM 및 ATR 인산화효소는 세포사멸 초기인 카스파제-3의 활성 이전 단계에서 활성화되었는데, 이는 사멸 수용체 의존성 세포사멸이 본 발명의 ATM 및 ATR 인산화효소의 활성화로부터 기인됨을 의미하며, 또한 지금까지 알려진 바가 없는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서도 본 발명의 ATM 및 ATR 인산화효소가 DNA 손상에 의한 세포사멸뿐 아니라 사멸 수용체 의존성 세포사멸 유도제로 이용될 수 있음을 의미한다.

사용가능한 활성촉진 성분으로는 ATM 또는 ATR 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터, 상기 재조합 발현벡터가 도입된 형질전환체 및 ATM 또는 ATR 활성촉진 화합물인 TNF-α 또는 TRAIL을 사용 하였다. 이 때, TNF-α 및 TRAIL은 사멸 수용체를 통한 세포사멸을 유도하는 펩티드로 알려져 있으며, 특히 TRAIL에 의한 세포사멸은 세포내 DNA 송상과 미토콘드리아를 통한 세포사멸과는 달리, 수용체를 매개로하여 외부 신호 의존성 세포사멸에 의해 유도되는 것으로 잘 알려져 있다. 또한, 상기 ATM 또는 ATR 세포사멸 촉진제의 대상 세포로는 자궁암 세포주, 간암 세포주, 유방암 세포주 및 폐암 세포주인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 본 발명에서는 자궁암 및 간암 세포주를 사용하였다.

또한, 본 발명은

1) 실험군으로 세포에 세포사멸을 유도할 수 있는 정도의 양의 세포사멸 유도 리간드 및 피검화합물을 처리하고, 대조군으로는 세포에 세포사멸을 유도할 수 있는 정도의 양의 세포사멸 유도 리간드만 처리하는 단계;

2) 상기 실험군 및 대조군의 세포를 분쇄하여 ATM 또는 ATR의 활성을 측정하는 단계; 및

3) 대조군과 비교하여 ATM 또는 ATR의 활성을 증가시키거나 감소시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 촉진제 또는 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 2에 있어서, ATM 또는 ATR의 활성 측정에 사용되는 기질로는 PHAS-1, p53 단백질 및 Chk1 또는 Chk2등이 사용될 수 있으며, 바람직하게 본 발명에서는 PHAS-1를 사용하였다.

또한, 본 발명은 ATM 및 ATR의 활성억제 성분을 포함하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 억제제를 제공한다.

본 발명에서는 상기 ATM 또는 ATR을 특이적으로 억제시켰을 때, 사멸 수용체 의존성 세포사멸이 억제되는지를 조사하였다. 이때, 사용되는 활성억제 성분으로는 ATM 또는 ATR 유전자에 상보적으로 결합하는 siRNA, ATM 또는 ATR 단백질에 대한 항체, ATM 또는 ATR 활성억제 화합물인 것이 바람직하며, 본 발명에서는 사멸 수용체 의존성 세포사멸시 ATM 또는 ATR의 활성을 억제하기 위해 발현 자체를 억제하는 siRNA를 사용하였다. 구체적으로, 상기 ATM 또는 ATR의 siRNA는 ATM 또는 ATR의 mRNA 염기서열 내에서 선택되는 센스서열, 헤어핀 루프서열 및 상기 센스서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성된다. 이 때, 상기 ATM 또는 ATR의 센스서열은 ATM 및 ATR의 mRNA 염기서열 부분에 해당하기만 하면 특별히 제한되는 것은 아니나, 각각 서열번호 3과 5 및 서열번호 7과 9의 서열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상기 헤어핀 루프서열 역시 ATM 및 ATR의 mRNA 염기서열에 해당하면 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 ATM 및 ATR의 안티센스서열은 특별히 제한되는 것은 아니나, 서열번호 4와 6 및 서열번호 8과 10인 것이 바람직하다. 그 결과, 도 5A-B에서와 같이, 본 발명의 siATM(#1, #2) 및 siATR(#1, #2)군에서는 대조군인 siCON에 비해 ATM 및 ATR 발현을 각각 현저하게 억제하였으며, 특히 siATM(#1, #2)은 자궁암 세포주(HeLa)에 형질도입시켰을 경우에도 세포사멸 활성 즉, 카스파제-3 활성을 억제하였다(도 5C 참조). 또한, 상기 각각의 siRNA를 oligofectamine으로 자궁암 세포주(HeLa)에 형질도입한 후, 사멸 수용체 의존성 세포사멸 유도제인 TNF-α를 처리하여 세포사멸을 유도했을 경우, 대조군인 siCON에 비해 상기 siATM(#2) 및 siATR(#2) 모두 카스파제-3의 활성을 현저하게 억제함을 관찰할 수 있었다(도 5D 참조). 이는, 지금까지 알려진 바가 없는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서도 본 발명의 ATM 및 ATR 인산화효소에 대한 siRNA가 DNA 손상에 의한 세포사멸뿐 아니라 사멸 수용체 의존성 세포사멸의 억제제로 이용될 수 있음을 의미한다.

아울러, 본 발명은 ATM 및 ATR을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 및 항암 치료제와 ATM 및 ATR의 간섭 RNA(siRNA)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 질환 치료제를 제공한다.

본 발명의 ATM 및 ATR을 유효성분으로 포함하는 세포사멸 활성화제는 특히, 사멸 수용체 의존성 세포사멸 활성화제로서 자가면역질환인 자가 면역성 관절염 및 자가 면역성 T면역세포 증식성질환(Autoimmune lymphproliferative syndrome; ALPS) 등의 예방 및 치료에 이용될 수 있으며(Perlman, H., et al., Curr. Mol. Med., 5, 597-608, 2001), 이외에도 세포의 비정상적인 증식에 의해 발생하는 질환인 유방암(Parton, M., et al., British Medical Journal, 322, 1528-1532, 2001), 직장암(Rampino, N., et al., Science, 275, 967-969, 1997) 및 갑상선암(Lin, J.D., British Medical Journal, 322, 1525-1527, 2001) 등의 각종 암 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

이와 함께, 본 발명의 ATM 및 ATR의 발현을 간섭하는 siRNA인 세포사멸 억제제는 세포의 이상적인 사멸에 의해 발생하는 퇴행성 질환인 알츠하이머(Graf, R.A. J. Am. Osteopath. Assoc., 101, S7-S10, 2001) 및 파킨슨 질환(Kostrzewa, R.M., Neurotox. Res. 2, 239-250, 2000)의 예방 및 치료에 이용될 수 있다.

발명의 세포사멸 활성화제는 상기 ATM 및 ATR 단백질에 추가로 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제 또는 향미제 등을 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제 및 기타 액제로 제제화될 있다. 구체적으로, 본 발명의 세포사멸 활성화제는 경구 투여를 위해서, 예를 들면 알약(troches), 정제(lozenge), 수용성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 (elixirs)로 제제화될 수 있다. 이때, 정제 및 캡슐로 제제화하기 위해서는 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 첨가할 수 있다. 또한, 캡슐제로 제제화할 경우, 상기에서 언급된 물질 이외에도 약제학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나의 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있 다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 세포에 특이적인 항체 또는 기타 리간드를 상기의 담체와 함께 결합시켜 사용할 수 있다. 덧붙여, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 세포사멸 활성화제 및 억제제는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구로 투여할 경우, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용으로 제제화하기 위해서는 상기 세포사멸 활성화제 또는 억제제를 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조할 수 있고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 선택하는 것이 바람직하며, 본 발명의 세포사멸 활성화제 또는 억제제는 성인의 체중 1㎏ 당 0.1 내지 100 ㎎, 바람직하게는 1 내지 10 ㎎의 투여양으로 매일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 사멸 수용체 의존성 세포사멸 활성화제인 ATM/ATR 단백질은 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 유발되는 각종 암 및 자가면역질환 등을 예방 또는 치료하는데 유용하며, 이러한 단백질의 발현을 선택적으로 차단할 수 있는 siRNA를 이용한 세포사멸 억제제는 비정상적인 세포사멸에 의한 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> DNA 손상에 의한 세포사멸 과정에서의 ATM 인산화효소 활성 측정

본 발명자들은 DNA 손상에 의한 세포사멸을 유도할 경우, ATM 인산화효소의 활성 변화가 어떤 양상을 나타내는지 조사하였다. 즉, DNA 손상을 통한 세포사멸 유도제인 자외선(UVC) 및 탁솔(Taxol, Sigma, USA)을 각각 사람의 자궁암 세포주에 처리한 후 시간에 따른 세포의 변화를 관찰하였다. 이때, 자외선은 DNA에 직접적인 손상을 줌으로써 ATM 인산화효소의 활성화에 의해 p53 단백질의 안정화가 일어나 사멸신호전달에 의해 세포사멸을 유도할 수 있는 대표적인 물질이며, 탁솔은 마이크로튜블(microtuble)의 조합을 안정화시켜 세포분열 과정을 차단함으로써 세포사멸을 유발하는 물질이다.

구체적으로, 서울대 의과대학부속 암연구소로부터 분양받은 사람의 자궁암 세포주(HeLa)를 100 ㎜ 플레이트에 1x10⁶의 세포수로 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 24시간 동안 배양한 다음, 1 mJ/cm²의 자외선(UVC)과 80 nM의 탁솔을 각각 상기 세포에 처리한 후 시간에 따라 세포를 수취하였다. 이때, 각각의 물질은 5% 혈청이 첨가된 배지에서 세포사멸을 유도하였고, 수취한 세포는 400 ul의 분쇄 용액(lysis buffer)을 처리한 후 BCA용액을 이용하여 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질에 항-ATM 항체(Santa Cruz, USA)와 protein A 비드를 가하여 ATM 단백질을 수득한 후, PHAS-1 기질 및 ³²P-ATP을 첨가하여 ATM 인산화 반응을 실시하였다(도 1의 A 및 D). 반응 산물은 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 필름에 노출시켜 방사능 사진촬영법(autoradiography)으로 인산화 정도를 측정하였다. 또한, 정량한 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 항-PARP 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 1의 B 및 E). 이때, PARP는 카스파제-3의 전형적인 기질로서, PARP의 절편은 세포사멸 유도의 척도가 된다. 또한, 세포사멸 과정에서 효과자(effector)인 카스파제-3의 활성이 세포사멸의 척도가 되기 때문에 상기 세포를 수취한 후 분쇄용액(0.5% Triton X-100, 29 mM Tris, pH 7.5, 2 mM MgCl2, 1 mM TT, 1mM EGTA, 50mM beta-glycerophosphoate, 25 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 2ug/ml leupeptin, 2 ug/ml pepstatin A, 100ug/ml PMSF, 1 ug/ml antipain)으로 세포막을 분쇄하여 세포내의 단백질을 추출한 후 카스파제-3 활성을 확인하였다. 구체적으로, 각각의 세포로부터 추출한 50 ㎍의 단백질과 200 nM의 Ac-DEVD-AFC[N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AFC(7-amino-4-trifluoromethyl-coumarin)(BD Pharmigen, USA); 카스파제-3의 형광성 기질로서 절단되기 전에는 발광하지 않지만 카스파제에 의해 절단되면 형광을 방출하는 특징을 가짐]를 반응 용액[20 mM Hepes(pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 0.1% CHAPS, 10% 수크로스)에 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 방출 파장 535 ㎚(여기 파장 405 ㎚)에서 형광도를 측정하였다.

그 결과, 자외선 및 탁솔에 의한 세포사멸 과정에서 효과자인 카스파제-3가 활성화됨을 확인하였다(도 1의 C 및 F). 상기 결과를 종합해보면, 카스파제-3는 각각 자외선 조사 후 2-4 시간대에서, 탁솔을 처리한 후 6-9시간대에서 활성화된 반면, ATM 인산화효소는 각각 자외선 조사 후 1-2시간대에서, 탁솔을 처리한 후 9시간대에서, 즉, ATM 인산화 효소는 카스파제-3가 활성화되기 바로 전 시간대에서 활성화됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터, DNA 손상에 의한 세포사멸 과정은 세포사멸 초기인 카스파제-3의 활성화 이전 단계인 ATM 인산화효소의 활성화로 인해 발생함을 알 수 있었다(도 1A-D).

< 실시예 2> 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서의 ATM 인산화효소 활성 측정

본 발명자들은 DNA 손상이 아닌, 외부 신호와 사멸 수용체에 의한 세포사멸 유도 조건하에서도 ATM 인산화효소가 활성화되는지 조사하기 위하여, 사멸 수용체 의존성 세포사멸 유도제로 TNF-α 및 TRAIL을 처리한 후 세포사멸 유도를 측정하였 다. 이때, TNF-α 및 TRAIL[Tumor necrosis factor(TNF)-related apoptosis inducing ligand)은 사멸 수용체(death receptor; DR4, DR5)를 통한 세포사멸을 유도하는 펩티드로 알려져 있으며, 특히 TRAIL에 의한 세포사멸은 세포내 DNA 손상과 미토콘드리아를 통한 세포사멸과는 달리, 수용체를 매개로하여 외부 신호 의존성 세포사멸에 의해 유도되는 것으로 잘 알려져 있다.

상기 <실시예 1>과 같은 방법으로 세포를 배양한 후, 5 ng/ml의 TNF-α와 5 ug/ml의 사이클로헥사마이드(cycloheximide, CHX, Sigma, USA) 및 43 uM의 TRAIL(Calbiochem, USA)을 사람의 자궁암 세포주 및 간암 세포주(서울대학교 암 연구소)에 각각 처리하였다. 이때, 각각의 물질은 5% 혈청이 첨가된 배지에서 세포사멸을 유도하였다. 또한, TNF-α 단독으로는 사람의 자궁암 세포에서 세포사멸을 유도할 수 없기 때문에 CHX를 동시에 처리하였고, 수취한 세포들은 분쇄 용액(lysis buffer)을 처리한 후 Bradford 용액을 이용하여 단백질을 정량하였다. 구체적으로, 도 2의 A와 D에서는 동량의 단백질을 항-ATM 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 ATM 단백질만을 protein A-비드로 수취하여 효소로서 이용하였고, PHAS-1 및 ³²P-ATP 기질을 첨가하여 ATM 인산화 반응을 실시하였다(도 2의 A 및 D). 반응 산물은 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 필름에 노출시켜 인산화 정도를 방사능 사진촬영법(autoradiography)으로 측정하였다. 또한, 정량한 단백질을 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 항-PARP 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다(도 2의 B 및 E). 이때, PARP는 카스파제-3의 전형적인 기질 로서 PARP의 절편은 세포사멸 유도의 척도가 된다. 또한, 세포사멸 과정에서 효과자(effector)인 카스파제-3의 활성이 세포사멸의 척도가 되기 때문에 상기 세포를 수취한 후 IP용 분쇄용액으로 세포막을 분쇄하여 세포내의 단백질을 추출한 후 카스파제-3 활성을 측정하였다. 구체적으로, 각각의 세포로부터 추출한 50 ㎍의 단백질과 200 nM의 Ac-DEVD-AFC[N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AFC(7-amino-4-trifluoromethyl-coumarin); 카스파제-3의 형광성 기질로서 절단되기 전에는 발광하지 않지만 카스파제에 의해 절단되면 형광을 방출하는 특징을 가짐]를 반응 용액[20 mM Hepes(pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 0.1% CHAPS, 10% 수크로스)에 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 방출 파장 535 ㎚(여기 파장 405 ㎚)에서 형광도를 측정하였다. 그 결과, TNF-α 및 TRAIL에 의한 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 효과자인 카스파제-3가 활성화됨을 확인하였다(도 2의 C 및 F)

상기 결과를 종합해보면, 카스파제-3는 각각 TNF-α와 CHX 처리 후 4시간대에서, TRAIL 처리 후 2-4시간대에서 활성화된 반면, ATM 인산화효소는 각각 TNF-α와 CHX 처리 및 TRAIL 처리 후 2-4시간대에서 활성화됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정은 세포사멸 초기인 카스파제-3의 활성화 이전 단계인 ATM 인산화효소의 활성화로 인해 발생함을 알 수 있었다(도 2A-D).

< 실시예 3> 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서의 ATR 인산화효소 활성 측정

상기 <실시예 2>로부터 사멸 신호와 사멸 수용체에 의한 세포사멸 유도 조건하에서 ATM 인산화효소가 활성화됨을 확인한 후, 본 발명자들은 또 다른 DNA 손상을 인식하는 인산화효소인 ATR 또한 활성화되는지 조사하기 위하여, 사멸 수용체 의존성 세포사멸 유도제로 TNF-α 및 TRAIL을 처리한 후 세포사멸 유도를 측정하였다.

항 ATR 항체(Santa Cruz, USA)를 이용하여, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 인산화 반응을 실시한 후 방사능 사진활영법으로 측정한 결과, TNF-α 및 TRAIL에 의한 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 효과자인 카스파제-3가 활성화되기 바로 전 시간대에서 ATR 인산화효소가 활성화됨을 관찰할 수 있었다. 즉, 카스파제-3는 각각 TNF-α와 CHX 처리 후 4시간대에서(도 2C), TRAIL 처리 후 2-4시간대에서 활성화된 반면(도 2F), ATR 인산화효소는 ATM 인산화효소와 같이, 각각 TNF-α와 CHX 처리 및 TRAIL 처리 후 2-4시간대에서 활성화됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과로부터, 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서, ATR 인산화효소의 활성화는 ATM 인산화효소의 활성화와 유사하게 세포사멸 초기에서 발생함을 알 수 있었다(도 3A 및 3B).

< 실시예 4> 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서의 ATM / ATR 인산화효소 억제제에 의한 세포사멸 억제 효능

상기 <실시예 2> 및 <실시예 3>으로부터 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 ATM 및 ATR 인산화효소가 모두 활성화됨을 확인한 후, 본 발명자들은 그 억제 제를 처리한 경우, 사멸 수용체에 의한 세포사멸이 억제되는지 조사하기 위하여, ATM/ATR 인산화효소T억제제인 카페인을 처리하여 TNF-α에 의한 세포사멸에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.

상기 < 실시예 1>과 같은 방법으로 세포를 배양한 후, ATM/ATR 억제제인 카페인 또는 워티만인을 반응 물질 처리 1시간 전에 처리한 다음 상기 < 실시예 2>와 동일한 방법으로 형광을 발하는 기질을 이용하여 형광도를 측정한 결과, 도 4에서와 같이 TNF-α에 의한 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 ATM/ATR 억제제인 카페인에 의해 세포사멸이 약 34% 정도 감소함을 관찰할 수 있었으며 워트만인의 경우 세포 사멸이 약 68% 정도 감소함을 관찰하였다. 즉, TNF-α와 CHX를 처리한 경우, 카스파제-3 활성이 4시간대에서 약 33500 RFU의 수치를 보인 반면, 억제제인 카페인을 전-처리한 경우, 카스파제-3 활성은 약 22000 RFU로 감소하는 것을 확인하였다. 또한 워트만인을 전처리하여 TNF-α와 CHX를 처리한 경우, 카스파제-3 활성이 4시간대에서 카스파제-3 활성은 약 34000 RFU에서 약 11000 RFU로 감소하는 것을 확인하였다. 이는, 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 ATM/ATR 인산화효소를 억제할 경우, 세포사멸이 억제된다는 것을 의미한다(도 4A 및 4B).

< 실시예 5> ATM / ATR 인산화효소의 발현을 저해할 수 있는 siRNA 를 이용한 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서의 세포사멸 억제 효능

상기 <실시예 4>로부터 ATM/ATR의 화학적 억제제인 카페인에 의해 세포사멸이 억제됨을 확인한 후, 본 발명자들은 이러한 세포사멸 효과가 ATM/ATR의 활성 억 제에 의한 것인지 아니면 간접적인 다른 효과에 의한 것인지 확인하기 위하여, ATM 및 ATR 인산화효소의 발현을 저해할 수 있는 siRNA를 이용하여 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서의 세포사멸 억제 효과를 조사하였다.

서울대 의과대학부속 암연구소로부터 분양받은 사람의 자궁암 세포주(HeLa)를 6 웰 플레이트에 1.5x10⁵개의 세포를 분주한 후 37℃, 이산화탄소 5% 조건하에서 24시간 동안 배양하였다. 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 ATM siRNA를 siATM #1군으로, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 ATM siRNA를 siATM #2군으로, 서열번호 7 및 서열번호 8로 기재되는 ATR siRNA을 siATR #1군으로, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 ATR siRNA를 siATR #2군으로 각각 명명한 후, oligofectamine(Invitrogen, USA)을 이용하여 상기 세포에 각각 형질도입시킨 다음 24시간 동안 배양하였다. 이때, 형질도입에 의한 비특이적인 효과를 제거하기 위하여, 상기 siRNA에 대한 대조군으로 무작위 siRNA(siCON)를 사용하였다. 수취한 세포들은 분쇄 용액(lysis buffer)을 처리한 후 Bradford 용액을 이용하여 단백질을 정량하였다. 구체적으로, 도 5의 A와 B에서는 상기와 같이 형질도입된 세포로부터 수취한 동량의 단백질을 SDS-PAGE를 통해 전기영동시킨 후 이를 항-ATM, 항-ATR (Santa Cruz, USA) 및 항-Actin 항체(Sigma,USA)를 이용하여 각각 웨스턴 블랏을 실시하였다. 그 결과, 대조군인 siCON에 비해 siATM #2군은 ATM 발현이 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었고(도 5A), siATR #1군 및 siATR #2군 역시 대조군인 siCON에 비해 ATR 발현을 현저하게 억제시켰다(도 5B).

도 5C에서는 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 ATM siRNA를 siATM #1군으로, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 ATM siRNA를 siATM #2군으로 하여, 각각의 상기 siRNA를 oligofectamine을 이용하여 세포에 형질도입시킨 후 54 시간 동안 배양하였다. 이어, 장시간 배양에 따라 나타나는 세포독성에 의한 세포사멸 효과에 있어서, siATM #1 및 #2에 의한 ATM 발현 억제시 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. 또한, 형질도입에 의한 비특이적인 효과를 제거하기 위하여, 상기 siRNA에 대한 대조군으로 무작위 siRNA(siCON)를 사용하였다. 이어, 상기 세포를 수취한 후 IP용 분쇄용액으로 세포막을 분쇄하여 세포내의 단백질을 추출한 후 동량의 단백질 양을 사용하였다. 즉, 카스파제-3에 의해 절단될 경우 형광을 발하는 기질을 이용하여 형광도를 측정함으로써 카스파제-3 활성을 측정하였다. 구체적으로, 각각의 세포로부터 추출한 50 ㎍의 단백질과 200 nM의 Ac-DEVD-AFC[N-acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-AFC(7-amino-4-trifluoromethyl-coumarin)]를 반응 용액[20 mM Hepes(pH 7.4), 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 0.1% CHAPS, 10% 수크로스)에 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 방출 파장 535 ㎚(여기 파장 405 ㎚)에서 형광도를 측정하였다.

그 결과, 대조군인 siCON에 비해 siATM #1군과 siATM #2군 모두 카스파제-3활성 억제 효과를 보였다(도 5C). 특히, siATM #2군은 siATM #1군에 비해 상대적으로 높은 ATM 발현 억제를 보였는데, 이는 도 5A의 ATM 발현 억제 효과와 유사한 결과를 나타내었다.

도 5D에서는 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 ATM siRNA(siATM#2)과 서열번호 9 및 서열번호 10으로 기재되는 ATR siRNA(siATR #2)을 각각 oligofectamine을 이용하여 세포에 형질도입시킨 후 24시간 동안 배양하였다. 이때, 형질도입에 의한 비특이적인 효과를 제거하기 위하여, 상기 siRNA에 대한 대조군으로 무작위 siRNA를 사용하였다. 24시간 후, TNF-α를 4시간 처리하여 세포사멸을 유도했을 경우, ATM siRNA 및 ATR siRNA에 의한 상기 세포사멸이 억제되는지 조사하기 위하여 카스파제-3 활성도를 측정하였다. 이때, 사용된 단백질은 상기 세포를 수취한 후 IP용 분쇄용액으로 세포막을 분쇄하여 세포내의 단백질을 추출한 후 동량의 단백질 양을 사용하였고, 측정방법은 도 5C와 같다.

그 결과, 도 5D에서와 같이 TNF-α 처리에 의해 약 50,000 RFU까지 증가한 카스파제-3 활성도는 ATM 발현 억제(siATM #2)에 의해 약 30,000 RFU 정도, ATR 발현 억제(siATR #2)에 의해 약 25,000 RFU 정도 억제됨을 확인하였다.

따라서, 간접적인 다른 효과에 의한 것이 아닌 ATM/ATR 발현, 즉 직접적인 활성 억제에 의한 것이다.

도 1은 DNA 손상에 따른 세포사멸 과정에서 나타나는 ATM 인산화효소의 활성을 나타낸 도면이다:

A : 자외선(UVC) 처리 후 시간에 따른 ATM 인산화효소의 활성도,

B : 자외선 처리 후 시간에 따른 카스파제(caspase)-3의 기질인 PARP의 절단 양상,

C : 자외선 처리 후 시간에 따른 카스파제-3의 활성도,

D : 탁솔(Taxol) 처리 후 시간에 따른 ATM 인산화효소의 활성도,

E : 탁솔 처리 후 시간에 따른 카스파제-3의 그 기질인 PARP의 절단 양상, 및

F : 탁솔 처리 후 시간에 따른 카스파제-3의 활성도.

도 2는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 나타나는 ATM 인산화효소의 활성을 나타낸 도면이다:

A : TNF-α와 사이클로헥사마이드(cycloheximde, CHX) 처리 후 시간에 따른 ATM 인산화효소의 활성도,

B : TNF-α와 CHX 처리 후 시간에 따른 카스파제-3의 기질인 PARP의 절단 양상,

C : TNF-α와 CHX 처리 후 시간에 따른 카스파제-3의 활성도,

D : TRAIL 처리 후 시간에 따른 ATM 인산화효소의 활성도,

E : TRAIL 처리 후 시간에 따른 카스파제-3의 기질인 PARP의 절단 양상, 및

F : TRAIL 처리 후 시간에 따른 카스파제-3의 활성도.

도 3은 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 나타나는 ATR 인산화효소의 활성을 나타낸 도면이다:

A : TNF-α와 CHX 처리 후 시간에 따른 ATR 인산화효소의 활성도, 및

B : TRAIL 처리 후 시간에 따른 ATR 인산화효소의 활성도.

도 4는 ATM/ATR 인산화효소의 억제제인 카페인(Caffeine) 또는 워트만인(Wortmannin) 전처리 후 TNF-α와 CHX 처리하여 시간에 따라 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 나타나는 세포사멸 억제 효과를 나타낸 그래프이다.

A : 카페인을 1시간 전처리한 후, TNF-α와 CHX 처리하고 시간에 따른 카스파제 3의 활성도

B : 워트만인을 1시간 전처리한 후, TNF-α와 CHX 처리하고 시간에 따른 카스파제 3의 활성도

도 5는 ATM/ATR 인산화효소의 발현을 저해할 수 있는 siRNA를 처리한 후 사멸 수용체 의존성 세포사멸 과정에서 나타나는 세포사멸 억제 효과를 나타낸 도면이다:

A : ATM 인산화효소의 siRNA[#1, #2, #1+#2]를 처리한 후 나타나는 ATM 발현 양상,

B : ATR 인산화효소의 siRNA [#1, #2, #1+#2]를 처리한 후 나타나는 ATR 발현 양상,

C : ATM 인산화효소의 siRNA #1과 #2를 각각 처리한 후 ATM 발현 억제에 의한 세포사멸 억제 효능을 나타내는 카스파제-3의 활성도, 및

D : ATM 및 ATR 인산화효소의 siRNA #2를 각각 처리한 후 (TNF-α+CHX)에 의한 세포사멸이 억제됨을 카스파제-3의 활성도로 나타낸 그래프.

<110> Seoul National University <120> THE SCREENING METHOD OF APOPTOTIC REGULATORBY CONTROLING OF ATM/ATR <130> 8p-04-45 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3056 <212> PRT <213> apoptotic activator of ataxia telangiectasia mutated (ATM) <400> 1 Met Ser Leu Val Leu Asn Asp Leu Leu Ile Cys Cys Arg Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Asp Arg Ala Thr Glu Arg Lys Lys Glu Val Glu Lys Phe Lys Arg 20 25 30 Leu Ile Arg Asp Pro Glu Thr Ile Lys His Leu Asp Arg His Ser Asp 35 40 45 Ser Lys Gln Gly Lys Tyr Leu Asn Trp Asp Ala Val Phe Arg Phe Leu 50 55 60 Gln Lys Tyr Ile Gln Lys Glu Thr Glu Cys Leu Arg Ile Ala Lys Pro 65 70 75 80 Asn Val Ser Ala Ser Thr Gln Ala Ser Arg Gln Lys Lys Met Gln Glu 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Val Lys Tyr Phe Ile Lys Cys Ala Asn Arg Arg Ala 100 105 110 Pro Arg Leu Lys Cys Gln Glu Leu Leu Asn Tyr Ile Met Asp Thr Val 115 120 125 Lys Asp Ser Ser Asn Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Asp Cys Ser Asn Ile 130 135 140 Leu Leu Lys Asp Ile Leu Ser Val Arg Lys Tyr Trp Cys Glu Ile Ser 145 150 155 160 Gln Gln Gln Trp Leu Glu Leu Phe Ser Val Tyr Phe Arg Leu Tyr Leu 165 170 175 Lys Pro Ser Gln Asp Val His Arg Val Leu Val Ala Arg Ile Ile His 180 185 190 Ala Val Thr Lys Gly Cys Cys Ser Gln Thr Asp Gly Leu Asn Ser Lys 195 200 205 Phe Leu Asp Phe Phe Ser Lys Ala Ile Gln Cys Ala Arg Gln Glu Lys 210 215 220 Ser Ser Ser Gly Leu Asn His Ile Leu Ala Ala Leu Thr Ile Phe Leu 225 230 235 240 Lys Thr Leu Ala Val Asn Phe Arg Ile Arg Val Cys Glu Leu Gly Asp 245 250 255 Glu Ile Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Ile Trp Thr Gln His Arg Leu Asn 260 265 270 Asp Ser Leu Lys Glu Val Ile Ile Glu Leu Phe Gln Leu Gln Ile Tyr 275 280 285 Ile His His Pro Lys Gly Ala Lys Thr Gln Glu Lys Gly Ala Tyr Glu 290 295 300 Ser Thr Lys Trp Arg Ser Ile Leu Tyr Asn Leu Tyr Asp Leu Leu Val 305 310 315 320 Asn Glu Ile Ser His Ile Gly Ser Arg Gly Lys Tyr Ser Ser Gly Phe 325 330 335 Arg Asn Ile Ala Val Lys Glu Asn Leu Ile Glu Leu Met Ala Asp Ile 340 345 350 Cys His Gln Val Phe Asn Glu Asp Thr Arg Ser Leu Glu Ile Ser Gln 355 360 365 Ser Tyr Thr Thr Thr Gln Arg Glu Ser Ser Asp Tyr Ser Val Pro Cys 370 375 380 Lys Arg Lys Lys Ile Glu Leu Gly Trp Glu Val Ile Lys Asp His Leu 385 390 395 400 Gln Lys Ser Gln Asn Asp Phe Asp Leu Val Pro Trp Leu Gln Ile Ala 405 410 415 Thr Gln Leu Ile Ser Lys Tyr Pro Ala Ser Leu Pro Asn Cys Glu Leu 420 425 430 Ser Pro Leu Leu Met Ile Leu Ser Gln Leu Leu Pro Gln Gln Arg His 435 440 445 Gly Glu Arg Thr Pro Tyr Val Leu Arg Cys Leu Thr Glu Val Ala Leu 450 455 460 Cys Gln Asp Lys Arg Ser Asn Leu Glu Ser Ser Gln Lys Ser Asp Leu 465 470 475 480 Leu Lys Leu Trp Asn Lys Ile Trp Cys Ile Thr Phe Arg Gly Ile Ser 485 490 495 Ser Glu Gln Ile Gln Ala Glu Asn Phe Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ile 500 505 510 Gln Gly Ser Leu Val Glu Val Asp Arg Glu Phe Trp Lys Leu Phe Thr 515 520 525 Gly Ser Ala Cys Arg Pro Ser Cys Pro Ala Val Cys Cys Leu Thr Leu 530 535 540 Ala Leu Thr Thr Ser Ile Val Pro Gly Thr Val Lys Met Gly Ile Glu 545 550 555 560 Gln Asn Met Cys Glu Val Asn Arg Ser Phe Ser Leu Lys Glu Ser Ile 565 570 575 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Val Leu Lys His Asp Asp Gln His Thr Ile Asn Thr Gln Asp 1555 1560 1565 Ile Ala Ser Asp Leu Cys Gln Leu Ser Thr Gln Thr Val Phe Ser Met 1570 1575 1580 Leu Asp His Leu Thr Gln Trp Ala Arg His Lys Phe Gln Ala Leu Lys 1585 1590 1595 1600 Ala Glu Lys Cys Pro His Ser Lys Ser Asn Arg Asn Lys Val Asp Ser 1605 1610 1615 Met Val Ser Thr Val Asp Tyr Glu Asp Tyr Gln Ser Val Thr Arg Phe 1620 1625 1630 Leu Asp Leu Ile Pro Gln Asp Thr Leu Ala Val Ala Ser Phe Arg Ser 1635 1640 1645 Lys Ala Tyr Thr Arg Ala Val Met His Phe Glu Ser Phe Ile Thr Glu 1650 1655 1660 Lys Lys Gln Asn Ile Gln Glu His Leu Gly Phe Leu Gln Lys Leu Tyr 1665 1670 1675 1680 Ala Ala Met His Glu Pro Asp Gly Val Ala Gly Val Ser Ala Ile Arg 1685 1690 1695 Lys Ala Glu Pro Ser Leu Lys Glu Gln Ile Leu Glu His Glu Ser Leu 1700 1705 1710 Gly Leu Leu Arg Asp Ala Thr Ala Cys Tyr Asp Arg Ala Ile Gln Leu 1715 1720 1725 Glu Pro Asp Gln Ile Ile His Tyr His Gly Val Val Lys Ser Met Leu 1730 1735 1740 Gly Leu Gly Gln Leu Ser Thr Val Ile Thr Gln Val Asn Gly Val His 1745 1750 1755 1760 Ala Asn Arg Ser Glu Trp Thr Asp Glu Leu Asn Thr Tyr Arg Val Glu 1765 1770 1775 Ala Ala Trp Lys Leu Ser Gln Trp Asp Leu Val Glu Asn Tyr Leu Ala 1780 1785 1790 Ala Asp Gly Lys Ser Thr Thr Trp Ser Val Arg Leu Gly Gln Leu Leu 1795 1800 1805 Leu Ser Ala Lys Lys Arg Asp Ile Thr Ala Phe Tyr Asp Ser Leu Lys 1810 1815 1820 Leu Val Arg Ala Glu Gln Ile Val Pro Leu Ser Ala Ala Ser Phe Glu 1825 1830 1835 1840 Arg Gly Ser Tyr Gln Arg Gly Tyr Glu Tyr Ile Val Arg Leu His Met 1845 1850 1855 Leu Cys Glu Leu Glu His Ser Ile Lys Pro Leu Phe Gln His Ser Pro 1860 1865 1870 Gly Asp Ser Ser Gln Glu Asp Ser Leu Asn Trp Val Ala Arg Leu Glu 1875 1880 1885 Met Thr Gln Asn Ser Tyr Arg Ala Lys Glu Pro Ile Leu Ala Leu Arg 1890 1895 1900 Arg Ala Leu Leu Ser Leu Asn Lys Arg Pro Asp Tyr Asn Glu Met Val 1905 1910 1915 1920 Gly Glu Cys Trp Leu Gln Ser Ala Arg Val Ala Arg Lys Ala Gly His 1925 1930 1935 His Gln Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Leu Asn Ala Gly Glu Ser Arg Leu 1940 1945 1950 Ala Glu Leu Tyr Val Glu Arg Ala Lys Trp Leu Trp Ser Lys Gly Asp 1955 1960 1965 Val His Gln Ala Leu Ile Val Leu Gln Lys Gly Val Glu Leu Cys Phe 1970 1975 1980 Pro Glu Asn Glu Thr Pro Pro Glu Gly Lys Asn Met Leu Ile His Gly 1985 1990 1995 2000 Arg Ala Met Leu Leu Val Gly Arg Phe Met Glu Glu Thr Ala Asn Phe 2005 2010 2015 Glu Ser Asn Ala Ile Met Lys Lys Tyr Lys Asp Val Thr Ala Cys Leu 2020 2025 2030 Pro Glu Trp Glu Asp Gly His Phe Tyr Leu Ala Lys Tyr Tyr Asp Lys 2035 2040 2045 Leu Met Pro Met Val Thr Asp Asn Lys Met Glu Lys Gln Gly Asp Leu 2050 2055 2060 Ile Arg Tyr Ile Val Leu His Phe Gly Arg Ser Leu Gln Tyr Gly Asn 2065 2070 2075 2080 Gln Phe Ile Tyr Gln Ser Met Pro Arg Met Leu Thr Leu Trp Leu Asp 2085 2090 2095 Tyr Gly Thr Lys Ala Tyr Glu Trp Glu Lys Ala Gly Arg Ser Asp Arg 2100 2105 2110 Val Gln Met Arg Asn Asp Leu Gly Lys Ile Asn Lys Val Ile Thr Glu 2115 2120 2125 His Thr Asn Tyr Leu Ala Pro Tyr Gln Phe Leu Thr Ala Phe Ser Gln 2130 2135 2140 Leu Ile Ser Arg Ile Cys His Ser His Asp Glu Val Phe Val Val Leu 2145 2150 2155 2160 Met Glu Ile Ile Ala Lys Val Phe Leu Ala Tyr Pro Gln Gln Ala Met 2165 2170 2175 Trp Met Met Thr Ala Val Ser Lys Ser Ser Tyr Pro Met Arg Val Asn 2180 2185 2190 Arg Cys Lys Glu Ile Leu Asn Lys Ala Ile His Met Lys Lys Ser Leu 2195 2200 2205 Glu Lys Phe Val Gly Asp Ala Thr Arg Leu Thr Asp Lys Leu Leu Glu 2210 2215 2220 Leu Cys Asn Lys Pro Val Asp Gly Ser Ser Ser Thr Leu Ser Met Ser 2225 2230 2235 2240 Thr His Phe Lys Met Leu Lys Lys Leu Val Glu Glu Ala Thr Phe Ser 2245 2250 2255 Glu Ile Leu Ile Pro Leu Gln Ser Val Met Ile Pro Thr Leu Pro Ser 2260 2265 2270 Ile Leu Gly Thr His Ala Asn His Ala Ser His Glu Pro Phe Pro Gly 2275 2280 2285 His Trp Ala Tyr Ile Ala Gly Phe Asp Asp Met Val Glu Ile Leu Ala 2290 2295 2300 Ser Leu Gln Lys Pro Lys Lys Ile Ser Leu Lys Gly Ser Asp Gly Lys 2305 2310 2315 2320 Phe Tyr Ile Met Met Cys Lys Pro Lys Asp Asp Leu Arg Lys Asp Cys 2325 2330 2335 Arg Leu Met Glu Phe Asn Ser Leu Ile Asn Lys Cys Leu Arg Lys Asp 2340 2345 2350 Ala Glu Ser Arg Arg Arg Glu Leu His Ile Arg Thr Tyr Ala Val Ile 2355 2360 2365 Pro Leu Asn Asp Glu Cys Gly Ile Ile Glu Trp Val Asn Asn Thr Ala 2370 2375 2380 Gly Leu Arg Pro Ile Leu Thr Lys Leu Tyr Lys Glu Lys Gly Val Tyr 2385 2390 2395 2400 Met Thr Gly Lys Glu Leu Arg Gln Cys Met Leu Pro Lys Ser Ala Ala 2405 2410 2415 Leu Ser Glu Lys Leu Lys Val Phe Arg Glu Phe Leu Leu Pro Arg His 2420 2425 2430 Pro Pro Ile Phe His Glu Trp Phe Leu Arg Thr Phe Pro Asp Pro Thr 2435 2440 2445 Ser Trp Tyr Ser Ser Arg Ser Ala Tyr Cys Arg Ser Thr Ala Val Met 2450 2455 2460 Ser Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu Gly Asp Arg His Gly Glu Asn 2465 2470 2475 2480 Ile Leu Phe Asp Ser Leu Thr Gly Glu Cys Val His Val Asp Phe Asn 2485 2490 2495 Cys Leu Phe Asn Lys Gly Glu Thr Phe Glu Val Pro Glu Ile Val Pro 2500 2505 2510 Phe Arg Leu Thr His Asn Met Val Asn Gly Met Gly Pro Met Gly Thr 2515 2520 2525 Glu Gly Leu Phe Arg Arg Ala Cys Glu Val Thr Met Arg Leu Met Arg 2530 2535 2540 Asp Gln Arg Glu Pro Leu Met Ser Val Leu Lys Thr Phe Leu His Asp 2545 2550 2555 2560 Pro Leu Val Glu Trp Ser Lys Pro Val Lys Gly His Ser Lys Ala Pro 2565 2570 2575 Leu Asn Glu Thr Gly Glu Val Val Asn Glu Lys Ala Lys Thr His Val 2580 2585 2590 Leu Asp Ile Glu Gln Arg Leu Gln Gly Val Ile Lys Thr Arg Asn Arg 2595 2600 2605 Val Thr Gly Leu Pro Leu Ser Ile Glu Gly His Val His Tyr Leu Ile 2610 2615 2620 Gln Glu Ala Thr Asp Glu Asn Leu Leu Cys Gln Met Tyr Leu Gly Trp 2625 2630 2635 2640 Thr Pro Tyr Met <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> siRNA#1 of apoptotic activator of ATM sense <400> 3 gaauguugcu uucugaauuu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> antisense sequence <400> 4 aauucagaaa gcaacauucu u 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> siRNA#2 of apoptotic activator of ATM sense <400> 5 uauaucaccu guuuguuagu u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> antisense sequence <400> 6 cuaacaaaca ggugauauau u 21 <210> 7 <211> 21 <212> RNA <213> siRNA#1 of apoptotic activator of ATR sense <400> 7 gaacaacacu gcugguuugu u 21 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> antisense sequence <400> 8 cuaacaaaca ggugauauau u 21 <210> 9 <211> 21 <212> RNA <213> siRNA #2 of apoptotic activator of ATR sense <400> 9 gcaacucgcc uaacagauau u 21 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> antisense sequence <400> 10 uaucuguuag gcgaguugcu u 21

Claims (4)

1) 실험군으로 세포에 세포사멸을 유도할 수 있는 정도의 양의 TNF-α 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 세포사멸 유도 펩티드 및 피검화합물을 처리하고, 대조군으로는 세포에 세포사멸을 유도할 수 있는 정도의 양의 상기 세포사멸 유도 펩티드만 처리하는 단계;

2) 상기 실험군 및 대조군의 세포를 분쇄하여 ATM 또는 ATR의 활성을 측정하는 단계; 및

3) 대조군과 비교하여 ATM 또는 ATR의 활성을 증가시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 촉진제의 스크리닝 방법.

제 1항의 단계 2)에 있어서, ATM 또는 ATR 활성 측정은 기질에 대한 ATM 또는 ATR 단백질의 인산화 정도를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 사멸 촉진제의 스크리닝 방법.

1) 실험군으로 세포에 세포사멸을 유도할 수 있는 정도의 양의 TNF-α 및 TRAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 세포사멸 유도 펩티드 및 피검화합물을 처리하고, 대조군으로는 세포에 세포사멸을 유도할 수 있는 정도의 양의 상기 세포사멸 유도 펩티드만 처리하는 단계;

2) 상기 실험군 및 대조군의 세포를 분쇄하여 ATM 또는 ATR의 활성을 측정하는 단계; 및

3) 대조군과 비교하여 ATM 또는 ATR의 활성을 억제시킨 피검 화합물을 선별하는 단계를 포함하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 억제제의 스크리닝 방법.

제 3항의 단계 2)에 있어서, ATM 또는 ATR 활성 측정은 기질에 대한 ATM 또는 ATR 단백질의 인산화 정도를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 사멸 수용체 의존성 세포사멸 억제제의 스크리닝 방법.

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