KR20010113088A

KR20010113088A - Ａｓｋ１과 결합하는 ｃａｄ의 선택적인 저해제로서아폽토시스를 억제하는 신규한 마우스 ｃｉａ 단백질,ｃｉａ 유전자 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20010113088A
Application number: KR1020000033195A
Authority: KR
Inventors: 최의주; 조쌍구; 이용희; 김진우; 지성욱
Original assignee: 최의주
Priority date: 2000-06-16
Filing date: 2000-06-16
Publication date: 2001-12-28
Also published as: AU2000255753A1; US6987089B1; KR100399982B1; WO2001096550A1

Abstract

본 발명은 아폽토시스(apoptosis)를 억제하는 신규한 CIA(CAD inhibitor interacting with ASK1) 단백질, CIA 유전자 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 효모 2-혼성 스크리닝(yeast 2-hybrid screeening)에 의해 마우스로부터 분리한 캐스페이즈 활성-DNase CAD(caspase activated-DNase, CAD/DFF40/CPAN) 및 아폽토시스 신호-조절 카이네이즈 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)과 결합하여 아폽토시스를 억제하는 신규한 CIA 단백질, CIA 유전자 및 그 용도에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 마우스 CIA 단백질 또는 CIA 유전자는 CAD 및 ASK1에 의해 매개되는 아폽토시스에 대한 선택적인 저해제로 사용하거나 치매 등의 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중, 면역계 질환 등의 치료, 예방, 진단 또는 그 연구 과정 등에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

ＡＳＫ１과 결합하는 ＣＡＤ의 선택적인 저해제로서 아폽토시스를 억제하는 신규한 마우스 ＣＩＡ 단백질, ＣＩＡ 유전자 및 그의 용도{Novel mouse CIA protein and CIA gene having anti-apoptotic activity as a selective inhibitor of CAD interacting with ASK1 and use thereof}

본 발명은 아폽토시스(apoptosis)를 억제하는 신규한 CIA(CAD inhibitor interacting with ASK1) 단백질, CIA 유전자 및 그 용도에 관한 것으로, 구체적으로 효모 2-혼성 스크리닝(yeast 2-hybrid screeening)에 의해 마우스로부터 분리한 캐스페이즈 활성-DNase CAD(caspase activated-DNase, CAD/DFF40/CPAN) 및 아폽토시스 신호-조절 카이네이즈 ASK1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)과 결합하여 아폽토시스를 억제하는 신규한 CIA 단백질, CIA 유전자 및 그 용도에 관한 것이다.

아폽토시스(apoptosis) 또는 프로그램화 세포 사멸(programmed cell death, PCD)은 광범위한 생물학적 체계에서 손상되었거나 원치않는 세포를 자발적으로 자기-제거(self-elimination)하기 위한 기본적인 세포내 과정으로서, 기관 발달, 조직 재형성, 세포내 항상성 유지 및 비정상적이고 손상된 세포의 제거에 필수적인 기작이다. 이와 같이, 생물체내에서 중요한 역할을 담당하는 아폽토시스 과정은 반드시 정해진 프로그램에 따라 정교하게 조절되어야 하는데, 만약 아폽토시스가 부적절하게 진행되면 암, 자가면역질환(autoimmune disease) 및 다양한 신경퇴행성 질환(neurodegenerative diseases)과 같은 질병을 유도하게 된다(Kerr et al.,Br. J. Cancer, 26, 239-257, 1972). 아폽토시스가 진행되는 초기의 세포는 세포 연합(cell junctions)의 손상, 세포막의 물집형성(blebbing) 및 세포 수축(shrinkage) 등과 같은 현상이 유도되고 후기로 진행되면서 크로마틴응집(chromatin aggregation), 세포질 및 핵 농축(cytoplasm and nuclei condensation), 마이토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential)의 손실, 원형질막 조성의 변화 및 아폽토시스 체(apoptotic body) 형성 등이 유도되어 전체적으로 형태학적 및 생화학적 변화를 거친다. 아폽토시스의 최종 결과로서 나타나는 올리고뉴클레오좀(oligonucleosome) 형태의 DNA 절편화(DNA fragmentation)는 아폽토시스를 겪는 세포의 생화학적 특징이다(Green D. R., and Reed, J. C.,Science, 281, 1309-1312, 1998).

현재 많은 연구자들에 의하여 아폽토시스에 관여하는 주요한 역할자(key players)와 기작이 다양한 생물체에서 밝혀지고 있다.Carnorhabdtis elegans와 같은 선충(nematode)에서는 CED-3, CED-4 및 CED-9의 세개 분자가 선충의 발달과정 동안에 야기되는 아폽토시스 기작을 조절하는데 중요한 역할을 담당함이 보고되었다. CED-3와 CDE-4는 모두 세포사멸을 유도하는데 필수적으로 작동하는 반면, 포유동물에서의 Bcl-2 계열과 아미노산 서열의 상동성을 나타내는 CED-9는 포유동물에서의 Apaf-1과 동일한 작용을 하는 CED-4의 억제제로서 작용한다. 특히, CED-3는 포유동물 세포에서 세포성 시스테인 프로테아제(cystein protease)의 일종인 캐스페이즈와 상동성을 가지며 아폽토시스에 관여하는 것으로 알려져 있다.

캐스페이즈(caspase)는 아폽토시스를 유발하는 다양한 자극에 의해 활성화되어 폴리(ADP-라이보스)중합효소(poly(ADP-ribose) polymerase, RARP), 라민(lamine), 사이토케라틴(cytokeratins) 및 캐스페이즈-활성화 DNase억제제(ICAD) 등과 같은 세포성 단백질들을 분해함으로써 아폽토시스 형성을 유도한다(Cryns, V., and Yuan,J., Genes Dev., 12, 1551-1570, 1998). 캐스페이즈는 수용체-매개성 신호 전달기작(receptor-mediated signal transduction), 성장인자의 결핍(depletion of growth factors), 산화적 스트레스(oxidative stress), DNA 손상 및 세포-세포(cell-cell) 또는 세포-기질(cell-matrix interaction) 결합의 붕괴 등을 포함하는 다양한 조건하에서 활성화되어 아폽토시스를 유발시킬 수 있다. 활발한 연구에 의하여 지금까지 최소한 14개의 서로 다른 부류에 속하는 케스페이즈가 포유동물에서 밝혀졌으며, 상기의 캐스페이즈들이 아폽토시스의 개시와 실행에 중추적인 역할을 하는 아스파르트산(aspartic acid) 잔기 이후의 펩타이드 기질을 절단함으로써 아폽토시스를 유발함이 보고되었다(Nunez et al.,Oncogene,17, 3237-3245, 1998).

또한, 캐스페이즈 활성은 아폽토시스에서 가장 중요하고 비가역적인 사건중의 하나인 핵 DNA 절편화와 매우 밀접하게 연관되어 있다. 아폽토시스가 진행중인 세포의 DNA는 내생적 엔도뉴클리아제(endogenous endonuclease)에 의해 절단되어 180 내지 200 bp 정도의 DNA 절편을 다수 형성하게 되는데, 이러한 DNA 절편들을 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하면 사다리 모양의 양상(ladder-like pattern)을 나타낸다. 상기의 엔도뉴클리아제와 동일한 역할을 하는 CAD(caspase activated DNase)는 캐스페이즈-활성 뉴클리아제(caspase activated nuclease, CPAN) 및 DNA 절편화 인자(DNA fragmentation factor, DFF40)라고도 불리며 최근에 인간 및 마우스로부터 분리되었다(Liu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95, 1841-1846,1998; Liu et al.,Cell,89, 175-184, 1997). CAD/DFF40은 원래 고유의 엔도뉴클리아제 활성을 가지고 있으나, 성장하는 세포에서는 자신의 억제제인 ICAD와 결합하여 불활성화 형태로 존재한다. 이와 같이 CAD와 결합하여 CAD의 엔도뉴클리아제 활성을 억제하는 전장형태의 ICAD(full length form, ICAD-L)는 331개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 인간 HeLa 세포로부터 분리되어 45 kDa 크기의 DNA 절편화 인자로 일려진 DFF45의 마우스 카운터 파트(counter part)로 알려져 있다. 또한, ICAD-L의 1-261 아미노산과 ICAD-S에만 특이적으로 존재하는 4개의 C-말단 아미노산으로 구성된 단장형태의 ICAD(short length form, ICAD-S)가 마우스 림프종 세포(lymphonoma cell)에서 발현됨이 보고되었다(Sakahira et al.,J. Biol. Chem., 274, 15740-15744, 1998).

ICAD/DFF45는 CAD/DFF40의 선택적인 억제제로서 작용할 뿐 아니라 CAD/DFF40 단백질의 적절한 폴딩(folding)을 유도하는 분자성 샤페론(molecular chaperone)의 역할까지 수행한다. 일반적으로, CAD/DFF40은 억제제인 ICAD/DFF45와 결합하여 불활성화 상태로 존재하다가 캐스페이즈-3가 ICAD/DFF45의 Asp117과 Asp224의 두 군데 위치를 절단하면 ICAD/DFF45가 불활성화되고 CAD/DFF40은 엔도뉴클리아제 활성을 보유하게 된다(McIlroy et al.,Oncogene,18, 4401-4408, 1999). 현재까지 밝혀진 많은 캐스페이즈들 중에서 캐스페이즈-3 및 캐스페이즈-7이 in vitro 상태에서 ICAD/DFF45를 절단하여 불활성화시킨다고 알려져 있다. 하지만, 캐스페이즈-7이 ICAD/DFF45를 절단하여 불활성화 시킬 수는 있지만 활성형의 CAD/DFF40는 형성할 수 없음이 보고되면서 캐스페이즈-3이 CAD-의존적 DNA 절편화의 주요한 활성제로 여겨지고 있다(Wolf et al.,J. Biol. Chem., 274, 30651-30656, 1999). ICAD/DFF45 이외에, CIDEs가 CAD/DFF40 및 ICAD/DFF45의 보존적 CIDE-N에 상동성을 나타내는 N-말단 CIDE-N 도메인을 포함하고 있어 CIDEs 단백질들이 CAD/DFF40 활성에 관여하는 것으로 보고되었다(Inohara et al.,Embo. J., 17, 2526-2533, 1998).

한편, 미토겐-활성화 단백질 카이네이즈(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 신호기작은 아폽토시스성 세포사멸과 밀접하게 연관되어 있다(Cobb, M. H., and Goldsmith, E. J.,J. Biol. Chem.,270, 14843-14846, 1995; Dickens et al,Science, 277, 693-696, 1997). MAPK 신호기작은 세포외 자극(extracellular stimuli)에 의해 활성화되며 세포사멸 및 생존에 관여하는 수많은 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. MAPK 신호기작에 관여하는 단백질 카이네이즈는 MAPKs, MAPK 카이네이즈(MAPKKs) 및 MAPK 카이네이즈 카이네이즈(MAPKKKs)로 세 종류의 서로 다른 구성성분으로 나누어진다. 이들의 작용기작을 살펴보면, 상기 단백질 카이네이즈 중에서 상부위치의 카이네이즈 또는 접합체 단백질(adaptor protein)에 의해 활성화되는 MAPKKKs가 MAPKKs를 인산화시켜 활성을 유도하게 되고, 이와 같이 유도된 활성형 MAPKKs가 다시 MAPKs를 활성화시키면 활성형 MAPKs가 핵으로 이동하여 다양한 전사인자들(transcriptional factor) 또는 하부위치의 카이네이즈들을 활성화시킴으로써 유전자 발현 또는 다른 세포성 사건들을 조절한다.

MAPK 신호기작과 같이 아폽토시스성 세포사멸과 관련된 신호기작으로 포유동물 세포에서 최소한 3개의 서로 다른 신호경로(signaling pathway)가 밝혀졌는데, 세포외 신호-조절 카이네이즈(extracelluar signal-regulated kinase, ERK), c-jun N-말단 카이네이즈/스트레스-활성 단백질 카이네이즈(c-jun N-terminal kinase/stress-activated protein kinase) 및 p38 MAPK가 그것이다(Boulton et al.,Cell,65, 663-675, 1991; Cobb, M. H., and Goldsmith, E. J.,J. Biol. Chem.,270, 14843-14846, 1995; Frnger et al.,Curr. Opin. Genet. Dev., 7, 67-74, 1997; Han et al.,Science,265, 808-811, 1994).

ERK 경로는 주로 인슐린(insuline), 표피 성장인자(epidermal growth factor) 및 포볼 에스테르(phorbol ester)와 같은 미토게닉 성장인자(mitogenic growth factor)에 의해 활성화되어 성장인자-매개성 활성 및 분화(growth factor-mediated activation and differentiaon)에 관여하는 것으로 알려져 있다. 반면, JNK 경로는 삽투압 및 열 자극, 자외선 및 프로염증성 싸이토카인(proinflammatory cytokines)과 같은 환경적인 스트레스 자극에 의해 우선적으로 활성화되며(Ahmed, A., and Salahuddin, A.,Indian. J. Biochem. Biophys., 31, 156-159, 1994; Derijard et al.,Science, 267, 682-685, 1994; Galcheva-Gargova et al.,Science, 265, 806-808, 1994), 효모에서 밝혀진 HOG1 카이네이즈에 매우 높은 상동성을 나타내는 p38 카이네이즈는 고삼투압, 지질다당류(lipopolysacharide), 종양괴사인자 α(tumor necrosis factor α) 및 인터류킨-1(interleukin-1)에 의해 활성이 유발된다(Han et al.,Science, 265, 808-811, 1994; Rouse et al.,Cell, 78, 1027-1037, 1994).

상기의 신호경로 중 특히 JNK 및 p38 경로가 다양한 스트레스에 의해 유도되는 아폽토시스성 세포사멸에 중요한 역할을 수행한다고 제시되고 있다(Butterfield et al.,J. Biol. Chem., 272, 10110-10116, 1997; Kawadaki et al.,J. Biol. Chem., 272, 18518-18521, 1997). 현재까지, 세 개의jnk유전자,jnk1, jnk2및jnk3가 분리되었으며(Gupta et al.,Embo. J., 15, 2760-2770, 1996; Widmann et al.,Physiol. Rev.79, 143-180, 1999), 상기의jnk유전자는 두 개의 MAPKKs, MKK4/SEK1(Derijard et al.,Cell,76, 1025-37, 1999) 및 MKK7(Holland et al.,J. Biol. Chem., 272, 24944-24948, 1997)에 의해 활성화된다고 알려져 있다. p38 카이네이즈는 p38a, p38b, p38c 및 p38d의 네 개 유전자가 분리되었으며(Goedert et al., Embo. J.,16, 3563-3571, 1997; Han et al.,Science,265, 808-811, 1994; Jiang et al.,J. Biol. Chem., 272, 30122-30128, 1997; Lee et al.,Nature, 272, 23668-23674, 1994; Wang et al.,J. Biol. Chem.,272, 23668-23674, 1997), 이들은 MKK3와 MKK6에 의해 활성화된다. 또한, JNK 및 p38 경로의 상부 활성체(upstream activator)로서 다양한 MAPKKKs가 분리되었는데, 이들 중 종양 성장인자-활성 카이네이즈(tumor growth factor-activated kinase, TAK1) 및 MEKK4/MTK1이 JNK 및 p38 경로 모두를 활성화시키며(Gerwins et al.,J. Biol. Chem.,272, 8288-8295, 1997; Takekawa et al.,Embo. J., 16, 4973-4982, 1997; Yamaguchi et al.,Science,270, 2008-2011, 1995), 아폽토시스 신호조절 카이네이즈 1(apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1)인 MAPKKK 역시 JNK 및 p38 경로 모두를 활성화시킨다고 보고되었다(Ichijo et al.,Science,275, 90-94,1997; Yamaguchi et al.,Science,270, 2008-2011, 1996).

한편, ASK1은 MAPKKK의 일종으로 SEK1-JNK 및 MKK3/6-p38 경로를 선택적으로 활성화시킨다. 이전의 보고에 따르면, ASK1이 TNFα- 및 Fas-유도성 아폽토시스에 중요한 역할을 수행한다고 알려져 있다(Hsu et al., Immunity, 4, 387-396, 1996; Rothe et al.,Cell, 83, 1243-1252, 1994; Shu et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93-13973-13978, 1996). ASK1은 TNFα와 Fas 뿐 아니라 H₂O₂, 자외선 및 다른 DNA-손상유발 제제 등을 포함하는 다양한 스트레스에 의해 유도되는 아폽토시스를 조절할 수 있는 세포성 기작에 관여한다. TNFα-와 Fas-유도성 아폽토시스에 관여하는 ASK1은 ASK1의 C-말단 비촉매 지역이 TNF-수용체인 TRAF2의 보존적인 C-말단 TRAF 도메인과 결합하여 활성화됨으로써 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(Hoeflich et al., Oncogene, 18, 5814-5820, 1999). 또한, ASK1은 Fas의 활성에 요구되는 Daxx와 결합할 수 있는데(Chang et al.,Science,281, 1860-1863, 1998), 이러한 Daxx-유도성 ASK1 활성(Daxx-induced ASK1 activation)은 JNK와 p38 경로 모두를 지극하여 아폽토시스성 세포 사멸을 유발한다(Chang et al.,Science, 281, 1860-1863, 1998; Yang et al.,Cell,89, 1067-1076, 1997). 따라서, ASK1은 TNFα- 및 Fas-유도성 세포내 신호 캐스캐이드(signal cascade)의 매개자로서 싸이토카인 유도성 아폽토시스에서 중요한 역할을 담당하므로, ASK1의 활성을 조절하는 단백질 및 분자적 기작에 관한 연구는 아폽토시스 과정을 이해하는데 매우 중요하다.

이에, 본 발명자들은 ASK1과 물리적으로 결합할 수 있는 단백질을 찾고자 연구한 결과, 마우스로부터 CAD 억제 단백질(CAD inhibitory protein)인 신규한 ASK1-결합 단백질 CIA(CAD inhibitor interacting with ASK1)를 분리하였다. 본 발명자들은 CIA가 ASK1과 직접적으로 결합하여 스트레스- 또는 싸이토카인-유도성 ASK1 활성을 억제함으로써 ASK1-유도성 아폽토시스에 의한 세포사멸을 억제할 뿐 아니라 CAD에 결합하여 CAD에 의해 유도되는 DNA 절편화를 억제하는 것을 in vivo 및 in vitro에서 모두 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명의 신규한 마우스 CIA 단백질 또는 CIA 유전자는 CAD 및 ASK1에 의해 매개되는 아폽토시스에 대한 선택적인 저해제로 사용하거나 치매 등의 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중, 면역계 질환 등의 치료, 예방, 진단 또는 그 연구 과정 등에 유용하게 이용할 수 있다.

본 발명의 목적은 다양한 종류의 스트레스에 의하여 유발되는 아폽토시스 활성을 조절할 수 있는 신규한 물질을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 마우스 CIA 단백질 및 이를 코딩하는 cDNA를 제공한다.

또한, 본 발명은 마우스 CIA 유전자 또는 마우스 CIA 단백질을 탐침으로 이용하여, CIA 단백질과 상호작용하는 핵산 또는 단백질; CIA 유전자의 유사체 (analogs); 또는 CIA 단백질의 유사체를 탐색하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 마우스 CIA 유전자를 포함하는 유전자 콘스트럭트(gene construct)를 유효성분으로 하는 유전자 치료제를 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 마우스 CIA 단백질을 포함하는 아폽토시스 활성 저해제 및 세포사멸 관련 질병의 치료제를 제공한다.

도 1은 마우스 CIA 단백질의 아미노산 서열 및 이에 상동성을 나타내는 인간 및 효모의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 2는 다중 조직 노던 블럿 분석(multiple tissue northern blot analysis)을 이용하여 마우스 CIA 전사체의 조직내 분포양상을 나타낸 것이고,

도 3은 항-CIA 항혈청을 사용한 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)을 이용하여 CIA가 다양한 포유동물 세포주 및 마우스 뇌조직으로부터 발현되는 것을 확인한 결과이고,

도 4는 CIA의 다양한 결실 돌연변이체들을 이용한 CIA와 ASK1의 in vitro 결합 분석을 이용하여 CIA의 C-말단부위가 ASK1의 N-말단부위에 결합하는 것을 확인한 결과이고,

도 5는 항-Flag 항체를 이용한 면역침강분석(immunoprecipitation)을 이용하여 CIA가 ASK1의 카이네이즈 활성을 억제하는 것을 확인한 결과이고,

도 6은 293 세포에서의 CIA의 이소성 발현이 ASK1의 카이네이즈 활성을 억제하는 것을 나타낸 것이고,

도 7은 면역복합체 카이네이즈 분석(immunocomplex kinase analysis)을 이용하여 CIA가 ASK1에 의해 유도된 JNK의 효소활성을 억제하는 것을 확인한 결과이고,

도 8은 루시퍼레이즈 활성(luciferase actuvuty)을 측정하여 CIA가 ASK1에 의해 유도된 c-JUN 전사인자의 활성을 억제하는 것을 확인한 결과이고,

도 9는 CIA와 CAD의 in vitro 결합분석을 통하여 CAD의 N-말단부위가 CAD의 CIDE-N 도메인과 결합하는 것을 확인한 결과이고,

도 10은 CIA가 in vitro CAD 뉴클리아제 활성을 억제함을 나타낸 것이고,

도 11은 CIA가 293 세포에서 발현되어 캐스페이즈-3에 의해 유도되는 DNA 절편화를 억제한다는 것을 확인한 결과이고,

도 12는 293 세포에 형질감염된 CIA가 세포내에서 안정적으로 발현되는 것을 나타낸 것이고,

도 13은 CIA가 형질감염된 293 세포가 다양한 스트레스에 의해 유도되는 아폽토시스에 대해 내성을 가짐을 나타낸 것이고,

도 14는 CAI가 형질감염된 293 세포가 ASK1의 활성에 의해 유도되는 아폽토시스에 대해 내성을 가짐을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은서열번호 3으로 기재되는 마우스 CIA 유전자, 그 상동형 유전자(homologs) 및 그 변이형 유전자(variants)를 제공한다. 또한, 본 발명은서열번호 4로 기재되는 마우스 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질(variants)을 제공한다.

상기 마우스 CIA 유전자의 "상동형 유전자(homologs)"는서열번호 4로 기재되는 마우스 CIA 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 유전자를 뜻한다. 따라서, 상기 상동형 유전자의 범주에는 발현시서열번호 4로 기재되는 마우스 CIA 단백질을 생산할 수 있는 모든 종류의 유전자가 포함된다.

상기 마우스 CIA 단백질의 "변이형 단백질(variants)"은서열번호 4로 기재되는 마우스 CIA 단백질 중 하나 이상의 아미노산 잔기를 결실, 부가, 삽입 또는 치환시킨 것을 의미한다. 단, 상기 변이형 단백질은서열번호 4의 N-말단의 1번부터 79번 아미노산 잔기에 해당하는 부분과 C-말단의 174번부터 221번 아미노산 잔기에 해당하는 부분에서 부분적으로 적어도 90 % 이상의 상동성(homology)을 가지고, 전체적으로는 80 % 이상의 상동성을 가지는 것으로 정의된다.

상기 마우스 CIA 유전자의 "변이형 유전자(variants)"는 마우스 CIA 단백질의 변이형 단백질을 코딩하는 모든 유전자를 의미한다.

본 발명자들은 아폽토시스의 음성 조절자(negative regulator)로서 작용하는 신규한 단백질을 탐색하기 위하여, ASK1을 이용한 효모 2-융합 시스템(yeast two-hybrid system)을 사용하여 ASK1과 반응하는 캐스페이즈 활성-DNase 억제제(caspase activated-DNase inhibotor, CIA)인 ASK1 결합단백질을 코딩하는 신규한 마우스 CIA 유전자를 분리하였다. 마우스는 형질전환동물(transgenic animals)의 생산 및 유전자 표적법(gene targeting)에 의한 돌연변이 연구에 빈번히 사용되므로 본 발명의 마우스 CIA 유전자는 상기 연구에 용이하게 사용될 수 있다.

마우스에서 아폽토시스를 유도하는 ASK1과 특이적으로 결합할 수 있는 신규한 단백질을 분리하기 위해, 전장의 ASK1을 사용하여 마우스의 뇌신경계 cDNA 라이브러리로부터 준비한 2 ×10⁶개의 파지 플라크(phage plagues)를 검색하여 0.9 Kb 크기의 단백질을 암호화하는 신규한 마우스 cDNA 클론을 선별하고 상기 클론이 ASK1과 특이적으로 반응함을 확인하였다.

5' 지역이 완전한 마우스 cDNA 클론을 확보하기 위하여, 마우스의 뇌신경계 cDNA를 주형으로 삼아 5'-RACE(5'-rapid amplification of cDNA ends)를 시행함으로써 930 bp의 CIA cDNA 클론을 확보하고 상기 클론이 완전한 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)를 포함하고 있음을 확인하였다. 상기 마우스 cDNA 클론을 ASK1과 결합하는 CAD 억제제(CAD inhibitor interacting with ASK1), 즉 CIA(서열번호 3)라고 명명하였다. CIA cDNA 클론은 666개의 뉴클레오티드를 갖는 ORF를 포함하여서열번호 3으로 기재되는 920개의 염기서열로 구성되며, 이로부터 얻은 아미노산 서열은서열번호 4로 기재되는 221개의 아미노산으로 구성되어 있다. 염기서열 분석 결과, 마우스 CIA의 5'-비번역 지역(5'-untranslated region) 내에는 어떠한 인-프레임 정지 코돈(in-frame dtop codon)도 발견되지 않았다.

마우스 CIA 단백질의 아미노산 서열을 기준으로 RT-PCR을 사용하여 인간 CIA클론을 분리하였다. 인간 CIA 유전자는서열번호 7로 기재되며, 이로부터 얻은서열번호 8로 기재되는 아미노산 서열을 상기의 마우스 CIA 아미노산 서열과 비교한 결과 서로 99% 이상의 상동성을 나타내었다(도 1참조). 블라스트 프로그램(BLAST Program)을 이용하여 마우스 CIA의 아미노산 서열을 비교한 결과, 아라비돕시스 쌀리아나(Arabidopsis thaliana)의 추정성 단백질과는 35%의 상동성을 가지고 싸카로마이쎄스 세레비지에 VPS28(Sachharomyces serevisiaeVPS28) 및 쉬조싸카로마이세스 팜비 VPS(Schizoachharomyces pombeVPS)와는 28% 정도의 상동성을 나타내었으며, 지금까지 보고된 어떠한 단백질 도메인 모티프도 가지고 있지 않았다(도 2참조).

또한, 본 발명에서는 상기 마우스의 CIA 유전자, 그 상동형 유전자, 그 변이형 유전자, 마우스 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질을 탐침으로 이용하여, CIA 단백질과 상호작용하는 핵산 또는 단백질, CIA 유전자의 유사체(analogs) 또는 CIA 단백질의 유사체를 탐색하는 방법을 제공한다.

상기 "유사체"는,서열번호 3으로 기재되는 CIA 유전자 또는서열번호 4로 기재되는 CIA 단백질과 비교할 때, 임의로 선택된 30 bp 또는 10 아미노산 잔기에서 80% 이상의 서열 상동성을 보이는 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 또한 상기 "상호작용하는"이란 표현은 CIA 단백질과 직접적 또는 간접적으로 물리적인 결합을 할 수 있는 상태를 의미한다. 상기 "탐침(probe)"이라는 용어는 통상의 서던 블럿 분석, 노던 블럿 분석, 웨스턴 블럿 분석, 파 웨스턴 블럿(far Western blot) 분석, 젤 이동성 변화(gel mobility shift) 분석, 라이브러리 탐색(library screening), 친화 크로마토그래피(affinity chromatography) 등에 사용될 수 있는 탐침 뿐만 아니라 자동화된 기기를 이용한 DNA 칩 등에 사용될 수 있는 탐침과 중합효소 연쇄반응(PCR)에 이용되는 특이적 프라이머 등을 포함한다. 즉, 핵산-핵산, 단백질-단백질, 단백질-핵산 간의 상호작용을 그 원리로 이용하는 모든 분석에서 사용되는 탐침을 지칭한다. 상기 탐침은 방사성 동위원소, 형광물질 등으로 표지하여 사용할 수도 있다.

따라서, 상기 핵산 또는 단백질의 탐색 방법은 상기에서 제시한 분석 방법또는 탐색 방법대로 수행한다. 예를 들면, 본 발명의 CIA 유전자 중 특이적인 일부 염기서열을 이용하여 PCR을 수행하고 이로부터 얻은 DNA 절편을 다시 탐침으로 이용하여 cDNA 라이브러리 탐색을 수행하여 CIA 유전자의 유사체를 클로닝할 수 있다. 또다른 예로는, 본 발명의 CIA 단백질을 친화 크로마토그래피 칼럼의 레진에 고정시켜 특정한 조건에서 CIA 단백질과 물리적으로 결합할 수 있는 단백질 등을 탐색할 수 있다.

또한, 본 발명은 마우스 CIA 유전자를 포함하는 유전자 콘스트럭트(gene construct)를 유효성분으로 하는 유전자 치료제를 제공한다.

상기 유전자 콘스트럭트는 이에 포함되는 CIA 유전자, 그 상동형 유전자 또는 그 변이형 유전자를 효율적으로 발현시키기 위한 수단으로서, 유전자 치료의 구체적인 목적에 따라 그 구성 성분을 변형할 수 있다. 예를 들어, 내생적인 (endogenous) CIA 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키기 위한 목적으로 유전자 치료를 수행하는 경우, 상기 유전자 콘스트럭트는 CIA 유전자 주위에 동형 재조합을 위한 트랜스포존(transposon) 서열을 포함시켜 제조할 수 있다. 다른 예로 외생적인(exogenous) 마우스 CIA 유전자를 효율적으로 발현시키기 위해, 상기 마우스의 CIA 유전자, 그 상동형 유전자 또는 그 변이형 유전자에 강력한 프로모터를 연결하여 제조한 유전자 콘스트럭트를 사용할 수 있다. 한편, 상기 유전자 콘스트럭트의 구성은 구체적인 유전자 치료 수단에 따라서도 변형될 수 있는데, 이를 테면 재조합 바이러스를 이용하여 유전자 치료를 수행하는 경우, 레트로바이러스 등의 바이러스 게놈으로부터 유래된 공지의 벡터를 이용하여 본 발명의 유전자 치료제를 구성할 수 있다.

상기 유전자 치료제는 선천적 또는 후천적인 유전적 결함에 의해 아폽토시스 활성의 조절이 잘못되어 발생하는 질환의 치료뿐만 아니라, 암, 퇴행성 뇌신경계 질환, 중풍, 면역계 질환, 염증 등 세포사멸 과정의 조절이 잘못되어 발생하는 질환의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서는 CIA 유전자를 고발현하는 포유동물 세포주에서 CAD 및 ASK1의 활성이 저하됨을 확인함으로써, 본 발명의 유전자 치료제가 상기 질환에 유용함을 확인하였다.

또한, 본 발명은 마우스 CIA 단백질을 포함하여 CAD 및 ASK1에 의한 아폽토시스 활성을 선택적으로 억제하는 저해제 및 세포사멸 관련 질병의 치료제를 제공한다.

상기 CIA 활성의 저해제는 마우스 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질을 유효 성분으로 포함하므로 CAD 및 ASK1에 의한 아폽토시스 활성을 선택적으로 저해할 수 있으며, CAD 및 ASK1 활성이 관여하는 신호전달 과정을 선택적으로 저해하기 위한 목적으로도 이용될 수 있다.

상기 세포사멸 관련 질병은 세포사멸(apoptosis) 과정의 조절이 비정상적으로 일어남으로써 발생하는 질병이며, 그 예로는 암, 퇴행성 뇌신경계 질환, 중풍, 면역계질환 및 다양한 염증 등이 있다.

상기 CIA 활성의 저해제 및 세포사멸 관련 질병의 치료제는서열번호 4로 기재되는 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질을 유효성분으로 포함한다.

상기 저해제 및 치료제는 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 특히 비경구 주사 투여가 바람직하다. 즉, 상기 저해제 및 치료제는 실제 임상투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 혼합하여 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

마우스 CIA 단백질 및 그 변이형 단백질의 유효용량은 1 ∼ 10 mg/kg 이고, 바람직하기로는 1 ∼ 5 mg/kg 이다.

본 발명의 실시예에서는, 마우스의 CIA 유전자 및 CIA 단백질의 생물학적 특성을 밝힘으로써 상기 유전자 및 단백질의 바람직한 용도를 확인하였다.

본 발명자들은 ASK1과 결합하는 CAD 억제제 단백질로서 분리된 CIA가 in vitro 및 in vivo 모두에서 ASK1의 N-말단과 직접적으로 결합하여 ASK1의 활성을 억제할 뿐 아니라 CAD와 직접 결합하는 CAD 억제제로서 작용하여 아폽토시스에 의한 세포사멸 및 DNA 절편화를 저해함으로써 아폽토시스 초기에는 ASK1의 활성을 억제하고 후기에는 CAD 뉴클리아제 활성을 억제하는 항-아폽토시스성 단백질로서 작용함을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 물리적 결합에 의해 ASK1의 활성을 조절하는 단백질을 찾기 위하여 효모 2-혼성 스크리닝 방법을 수행한 결과, 마우스 뇌 cDNA 라이브러리로부터 ASK1과 결합하는 CIA 클론을 선별하였다. 마우스 CIA 유전자의 발현양상을 마우스 다중 조직 노던블럿 분석으로 확인한 결과, CIA의 전사체는 심장, 뇌, 간 및 정소 등의 다양한 마우스 기관에서 검출되었다(도 2및도 3참조).

CIA의 GST-융합 결실 돌연변이체를 이용한 CIA와 ASK1의 in vitro 결합 분석 결과, CIA는 ASK1의 N-말단 부위에 자신의 C-말단 부위가 물리적으로 결합하여 스트레스성- 또는 싸이토카인-유도성 ASK1 활성을 억제하였다(도 4참조).

또한, CIA는 in vivo 및 in vitro 실험 모두에서 자외선 또는 TRAF2 등의 스트레스에 의해 활성이 유도된 ASK1의 카이네이즈 활성을 억제하는 ASK1의 억제제로 작용하였으며(도 6및도 7참조), CIA의 이소성 발현(ectopic expression)은 ASK1의 효소활성 및 발현을 억제함으로써 ASK1의 하부지역에 존재하는 JNK1 등의 신호조절 단백질들의 발현 및 카이네이즈 활성도 억제하였다(도 8및도 9참조).

아울러, 본 발명자들은 DNA 절편화에 관여하는 CAD와 물리적으로 결합할 수 있는 단백질을 분리하기 위하여 효모 2-혼성 스크리닝 방법을 수행한 결과, 마우스와 인간의 뇌 cDNA 라이브러리로부터 분리한 양성클론이 본 발명의 ASK1-반응성 단백질로서 분리된 CIA와 동일한 염기서열을 갖고 있음을 확인하고, ASK1의 활성을 저해하는 억제제로 작용하는 본 발명의 CIA가 DNA 절편화에 관여하는 CAD와도 물리적으로 반응하여 아폽토시스를 조절할 수 있음을 확인하였다.

CIA의 결실 돌연변이체를 이용한 CIA와 CAD의 in vitro 결합 분석 결과, CIA 단백질은 자신의 N-말단 부위를 통하여 CAD/DFF40 및 CIDE 내에 보존적인 N-말단 CIDE-N 도메인과 직접적으로 결합하여 CAD의 활성을 억제하였다(도 10참조).

또한, in vivo 및 in vitro 실험 결과, CAD에 대한 CIA의 분자간 결합은 CAD의 뉴클리에이즈 활성을 억제하고 캐스페이즈-3 활성 CAD에 의해 유도되는 DNA 절편화를 억제하였다(도 11및도 12참조). CAD의 결합부위인 N-말단이 결실된 CIA 절편은 CAD의 뉴클리아제 활성을 억제하지 못하였는데, 이는 CIA에 의한 CAD의 억제효과가 직접적인 단백질-단백질 결합(direct protein-protein interaction)에 의해 획득됨을 나타낸다.

CIA를 포유동물 세포에 형질감염시켜 이들의 발현을 조사한 결과, CIA는 포유동물 세포에서 안정적으로 발현하였으며, 실제적으로 ASK1과 CAD의 활성을 억제하여 다양한 스트레스 및 JNK/SAPK 경로의 활성제에 의해 유도되는 아폽토시스를억제하였다(도 13및도 14). 이러한 결과는 CIA가 아폽토시스의 후기에 야기되는 CAD의 뉴클리아제 활성에 의한 DNA 절편화 뿐 아니라 아폽토시스 초기에 활성화되는 JNK/SAPK 신호기작을 조절할 수 있는 항-아폽토시스성 유전자 산물임을 암시한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> ASK1과 특이적으로 결합하는 마우스 CIA 단백질의 탐색

<1-1> 효모 2-혼성 스크리닝

아폽토시스를 유발하는 ASK1과 특이적으로 결합할 수 있는 마우스 단백질을 분리하기 위하여, 본 발명자들은 전장의 ASK1을 사용하여 효모 이중-혼성 스크리닝 (yeast 2-hybrid screening)방법을 수행하였다.

구체적으로, 전장의 ASK1 cDNA를 pLexA 베이트 플라스미드(pLexA bait plasmid, Clonetech) 내 LexA DNA 결합 도메인에 융합시킨 후 상기 융합 콘스트럭트를 효모 싸카로마이쎄스 세레비지에 EGY48 [p8op-lacZ](Saccharomyces cerevisiaeEGY48 [p8op-lacZ], Clonetech)에 형질전환시켰다. 상기 효모 형질전환체로 pB42AD 프레이 플라스미드(pB42AD prey plasmid, Clonetech) 내 클로닝되어 있는 마우스 뇌 람다 ZAPⅡ cDNA 라이브러리(mouse brain Lambda ZAPⅡ cDNAlibrary, Stratagene)를 탐색하여 약 2 ×10⁶클론을 스크리닝하였다. 효모 2-혼성 스크리닝에 의해 분리된 CIA cDNA 클론을 프라임-잇 Ⅱ 랜덤 프라이머 라벨링 키트(Prime-It Ⅱ random primer labeling kit, Stratagene)를 사용하여 램덤 프라이밍 방법에 의해³²P 방사성 동위원소를 표지하여 탐침으로 사용하였다. 마우스 뇌의 cDNA 라이브러리 파지 플라크를 찍은 필터를 60℃의 전혼성화 완충액(prehybridization buffer: 5 ×SSPE, 5 ×Denhardt's solution, 0.15% SDS, 50% formamide 및 100 ㎍/㎖ denatured salmon sperm DNA)에 2시간 동안 담궈둔 후 12시간 이상 동안 42℃에서 상기 탐침과 함께 혼성화하였다. 상기 필터를 세척한 후 -70℃에서 인텐시파잉 스크린(intensifying screen)을 사용하여 X-선 필름에 현상하여 양성 파지 클론을 분리하였다. 이와 같이 분리된 양성 cDNA 삽입부를 in vivo 상태에서 pBluescript SK(-)(Stratagene) 패이지미드의 제한효소 EcoRI 부위에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 본 발명자들은 마우스 뇌의 cDNA 라이브러리로부터 0.9 kb의 단백질을 암호화하는 CIA cDNA를 확보하였으며, 상기의 cDNA 클론을 탐침으로 사용하여 마우스 성체 뇌로부터 분리한 전체 RNA에 대하여 노던 블럿 분석을 수행하여 약 1.0 kb의 혼성화 mRNA 밴드가 검출됨을 확인하였다.

<1-2> 5'-RACE

5' 지역의 CIA cDNA를 얻기 위하여, 본 발명자들은 마우스 뇌조직에서 분리한 전체 mRNA에 대하여 상기의 cDNA 클론을 주형으로 삼아 5'-RACE(5'-rapid amplification of cDNA ends, Boeriger Menheim)를 수행하였다. 이때, 프라이머는서열번호 1로 기재되는 CIA-GSP와서열번호 2로 기재되는 CIA-Bam을 사용하였고 상기 프라이머 세트를 이용하여 얻은 PCR 산물을 pBluescript SK(-) 플라스미드에 클로닝한 후 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 본 발명자들은 930 bp의 CIA cDNA 클론을 얻었으며 상기 클론이 완전한 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)를 포함하고 있음을 확인하였다. 상기 클론은 666 bp의 ORF를 갖는서열번호 3으로 기재되는 920개의 염기서열로 구성되어 있으며, 5'-비번역 서열에 인-프레임 정지 코돈(in-frame stpo codon)이 존재하지 않음을 확인하였다. 상기 cDNA 염기서열이 포함한 ORF의 분석 결과 ORF는서열번호 4로 기재되는 221개의 아미노산으로 구성된 마우스 CIA 단백질을 코딩하였다.

<1-3> 인간 CIA 클론의 분리

본 발명자들은 마우스 CIA의 카운터파트로서 인간 CIA 클론을 분리하기 위하여, 상기 염기서열에 매우 높은 상동성을 나타내는 EST 클론으로부터서열번호 5로 기재되는 CIA-H1 프라이머와서열번호 6으로 기재되는 CIA-H2 프라이머를 제작하였다. 상기 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR을 통하여 인간 태아 뇌의 전체 RNA로부터 인간 CIA 클론을 분리하여 염기서열을 분석한 결과,서열번호 7로 기재되는 913개의 뉴클레오티도로 구성되어 있음을 확인하였다. 이로부터 얻어지는서열번호 8로 기재되는 인간 CIA 단백질의 아미노산 서열을 마우스 CIA 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과 서로 99% 이상의 상동성을 나타내었다(도 1).

<1-4> 마우스 CIA의 아미노산 서열분석

서열번호 4로 기재되는 마우스 CIA의 아미노산 서열을 블라스트 프로그램으로 분석한 결과, 마우스 CIA는 아라비돕시스 쌀리아나(Arabidopsis thaliana)의 추정성 단백질의 아미노산 서열과는 35%의 상동성을 가지고 싸카로마이쎄스 세레비지에 VPS28(Saccharomyces cerevisiaeVPS28) 및 쉬조싸카로마이쎄스 팜비 추정성 VPS(Schizosaccharomyces pombe putativeVPS)와는 28%의 상동성을 나타내었으며, 지금까지 알려진 어떠한 단백질 도메인 모티프도 가지고 있지 않음이 확인되었다(도 1).

<실시예 2> 마우스 CIA 유전자의 조직내 발현 및 분포양상

<2-1> 다중조직 노던블럿 분석

상기 실시예 1로부터 분리한 마우스 CIA 유전자의 발현양상을 조사하기 위하여, 다중 조직 노던 블럿 분석(multiple tissue northern blot, Clontech)을 수행하였다.

구체적으로, 마우스 CIA cDNA를 프라임-잇 Ⅱ 랜덤 프라이머 라벨링 키트를 사용하여 램덤 프라이밍 방법에 의해³²P 방사성 동위원소로 표지한 후 이를 탐침으로 사용하여 다양한 마우스 조직으로부터 분리한 poly(A)⁺RNA(각각 2 ㎍씩)를 포함하고 있는 마우스 다중 조직 블럿에 대하여 혼성화하였다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 약 1 kb 정도의 마우스 CIA mRNA 전사체는 심장, 뇌, 간 및 신장을 포함하는 다양한 조직에서 특이적으로 강하게 발현된 반면, 비장, 폐 및 근육조직에서는 그 발현 수준이 매우 낮았다.

<2-2> 웨스턴 블럿 분석

본 발명자들은 CIA 단백질의 발현 수준을 확인하기 위하여, 항-CIA 항혈청(anti-CIA anti-serum)을 사용하여 웨스턴 블럿 분석(western blot analysis)을 수행하였다.

구체적으로, 상기 실시예 1로부터 얻은 마우스 CIA cDNA를 pTrcHisC(Invitrogen)에 서브클로닝한 후 상기 발현벡터를 대장균 DH5α에 형질전환시켜 히스6-표지 CIA 단백질(His6-tagged CIA protein)을 발현시켰다. 상기 대장균 형질전환체로부터 29kDa 크기의 히스6-표지 CIA 단백질을 분리·정제하여 이를 토끼에 주사하여 면역화시킴으로써 히스6-표지 단백질에 대한 폴리클로날 항체,항-CIA 항혈청을 얻었다. 마우스의 뇌와 다양한 포유동물 세포주로부터 얻은 세포 라이세이트 분획(aliquots, 30 ㎍ of protein)을 전기영동한 후 상기의 항-CIA 항체를 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.

그 결과, 분자량이 약 25 kDa 정도인 CIA 단백질이 마우스 뇌 조직 및 L929,NIH3T3, H4, HeLa 및 COS-7 등을 포함하는 다양한 포유동물 세포주로부터 검출되었다(도 3).

<실시예 3> CIA와 ASK1의 in vitro 결합 분석

본 발명자들은 CIA 단백질의 어느 위치가 ASK1과 결합하는지를 조사하기 위하여, 다양한 CIA의 결실 돌연변이체의 GST-융합 재조합 단백질들을 제조하였다.

구체적으로, CIA의 야생형 및 이의 결실 돌연변이체, CIA-WT, CIA-△N, CIA-△C, 및 CIA-CEN들을 제조하기 위하여, CIA 단백질 전장형태(full-length form)의 CIA-WT, N-말단부위의 1번부터 79번까지의 아미노산이 결실된 CIA-△N, C-말단부위의 174번부터 221번까지의 아미노산이 결실된 CIA-△C 및 양쪽 말단이 결실되어 79번부터 174번까지의 아미노산만을 포함하는 CIA-CEN을 코딩하는 각각의 DNA 단편을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 증폭한 후 각 단편을 벡터 pGEX-4T-1(Pharmacia)에 클로닝하여 각각의 DNA에 대한 발현벡터를 제조하였다. 상기 DNA 단편 C 말단에 GST 잔기를 연결시켜 GST-표지(GST-tag)를 만든 다음 상기 발현벡터 각각을 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시킨 후 대장균 형질전환체를 1 mM IPTG가 첨가된 배지에서 배양하여 각 DNA 단편에 대한 재조합 단백질의 발현을 유도시킨 후 원심분리로 배양액을 제거하였다. 배양액이 제거된 각각의 유도체에 대한 형질전환체 균체를 세포용해 완충용액(cell lysis buffer, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF 및 0.5 mM DTT)에 현탁시킨 후 초음파처리를 하여 세포를 파쇄하였다. 이 과정을 5회 반복한 후 원심분리로 상등액을 분리하고 이 상등액을 글루타치온-아가로오스(glutathione-agarose)를 사용하여 분리·정제하였다.

한편, ASK1과 그의 돌연변이체들, ASK1-WT, N-말단부위 1번부터 649번까지의 아미노산이 결실된 ASK1-△N, C-말단부위 936번부터 1375번까지의 아미노산이 결실된 ASK1-△C 및 N-말단부위 1번부터 656번까지의 아미노산을 포함하는 ASK1-NT의 재조합 단백질을 상기와 같이 제조하고³⁵S-메싸이오닌(³⁵S-methionine)으로 표지한 후 TNT 레티큘로싸이트 라이세이트 시스템(TNT reticulocyte lysate system, Promega)을 사용하여 in vitro 전사시켰다.

상기와 같이 분리·정제된 GST-CIA-WT 및 그의 결실 돌연변이체 재조합 단백질들을 글루타치온-아가로오스 비드(glutathione-agarose beads) 상에 고정시킨 후 in vitro 전사된[³⁵S]메싸이오닌-표지 ASK1 또는 ASK1의 돌연변이체 재조합 단백질들을 완충용액(50 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.1% NP-40 및 5 ㎎/㎖ BSA로 구성된)에서 각각의 CIA GST-융합 단백질과 4℃에서 3 시간 동안 반응시켰다. 반응을 종결시킨 후 세척 완충용액(50 mM Hepes[pH 7.5], 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.1% Tween 20)으로 세 번 세척하고 각각의 글루타치온-아가로오스 비드로부터³⁵S-표지된 단백질들을 용출하여 SDS-폴리아미드 겔 전기영동을 수행하여 분석하였다.

그 결과, 전장형태의 야생형 재조합 단백질 CIA-WT 및 N-말단이 결실된 재조합 단백질 CIA-△N은 in virto 전사된³⁵S-표지 ASK1과 물리적으로 결합하였으나, C-말단이 결실된 CIA-△C, N-말단부위만 포함하고 있는 CIA-NT 및 양쪽 말단이 결실된 CIA-CEN은 ASK1과 상호작용하지 못하였다(도 4).

또한, CIA는 전장형태의 ASK1, N-말단부위만 포함하는 ASK1-NT 및 C-말단이 결실된 ASK1-△C와는 결합할 수 있으나 N-말단이 결실된 ASK1-△N과는 결합하지 못하였다(도 4).

따라서, CIA가 ASK1과 물리적으로 결합하기 위해서는 CIA의 C-말단 부위와 ASK1의 N-말단 부위가 서로 상호작용해야 함을 알 수 있다.

<실시예 4> CIA의 ASK1 카이네이즈 활성 억제효과

<4-1> ASK1의 신규한 억제제 CIA

일반적으로, JNK/SAPK와 p38 신호기작에서 MAPK 카이네이즈 카이네이즈(MAPKKK)로 작용하는 ASK1은 다양한 스트레스에 세포가 노출됨에 의해 활성화된다고 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 상기 실시예 3에서 CIA가 ASK1에 직접적으로 결합함을 확인하고 CIA가 ASK1의 카이네이즈 효소활성을 억제하는지 여부를 조사하였다.

구체적으로, 포유동물 세포주인 293 세포에 ASK1의 cDNA클론(일본 동경대학의 Hidenori Ichijo 박사로부터 제공받음)을 pcDNA3-flag(Invitrogen) 벡터의 EcoRI/XbaI 제한효소 부위에 클로닝하여 제작된 pcDNA3-ASK1-flag 발현벡터를 형질감염시킨 후 자외선을 60 J/m²로 조사하여 ASK1의 카이네이즈 활성을 유도하였다. 상기 형질감염 세포를 완충용액 A(20 mM Tris-HCl[pH 7.4], 150 mM sodium chloride, 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 12 mM β-glycerphosphate, 10 mM sodium florids, 5mM EGTA 및 1 mM PMSF)를 사용하여 용혈시킨 후 12,000 g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 침전물을 제거하고 얻은 라이세이트를 항-Flag 마우스 단일클론 항체(Boehringer Mannheim Inc.)를 사용하여 면역침강(immunoprecipitation)시켰다. 상기 반응액에 단백질 G-세파로오스^TM비드(Protein G sepharose^TMbead, Pharmacia)를 첨가한 후 4℃에서 1시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 이로부터 얻은 면역복합체(immunocomplexes)를 완충용액 A로 3회 세척한 후 최종 면역침강물을 SDS-폴리아미드 겔에 전기영동(SDS-polyamide gel electrophoresis)하여 상기의 겔에 화학발광 검출 시스템(chemiluminescence detection system, Amersham)을 사용하여 마우스 항-Flag 단일클론 항체(Sigma)로 면역 블럿 분석을 수행하였다. ASK1의 활성은 His-CIA의 존재하에 분리된 GST-MKK6(K82A)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, HIS-CIA 재조합 단백질이 첨가되지 않은 경우에는 자외선에 의해 활성화된 ASK1의 카이네이즈 활성에 의해 그 기질인 GST-MKK6의 인산화가 강하게 유도되는 반면, His-CIA 재조합 단백질이 첨가된 경우에는 in vitro에서 자외선 조사에 의해 활성화된 ASK1의 카이네이즈 활성이 억제되어 GST-MKK6의 인산화가 현저하게 감소되었다(도 5).

따라서, CIA 단백질은 ASK1에 의해 인산화되지 않으면서 ASK1의 신규한 억제제로서 작용함을 알 수 있다.

<4-2> 세포내 ASK1의 활성에 미치는 이소성 CIA(ectopic CIA)의 효과

CIA의 ASK1에 대한 억제효과를 포유동물 세포에서 조사하기 위하여, ASK1-flag, CIA 및 TRAF-2를 암호화하는 발현벡터(미국 Tularik Inc.의 David Goeddel 박사로부터 제공받음)를 포유동물 세포주인 293 세포에 동시에 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간이 경과된 상기 세포에 60 J/m²의 자외선을 조사 또는 조사하지 않았다. 상기 세포들을 용해시키고 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 마우스 항-Flag 단일클론 항체를 사용하여 면역침강을 수행한 후 상기 면역침전물의 ASK1 활성을 분석하기 위하여 면역복합체 카이네이즈 분석을 수행하였다.

그 결과, 상기 실시예 <4-1>의 결과와 마찬가지로 CIA의 동시발현은 형질감염된 세포에서 자외선 조사 또는 TNF 수용체인 TRAF-2의 농도-의존성 발현에 의해 활성화된 ASK1의 카이네이즈 활성을 억제함으로써 GST-MKK6의 인산화를 현저하게 감소시켰다(도 6).

따라서, 상기 결과들을 통하여 CIA가 in vitro와 in vivo 모두에서 ASK1의 억제제로서 작용함을 확인하였다.

<4-3> CIA의 ASK1-매개성 JNK/SAPK 활성 억제 효과

ASK1의 주된 하부지역 신호중의 하나는 c-jun의 전사활성을 촉진시키는 JNK/SAPK의 활성이다. 본 발명자들은 ASK1의 억제제로서 작용하는 CIA가 JNK/SAPK 활성에 어떠한 영항을 미치는지를 조사하였다. 우선, JNK1의 카이네이즈 활성에 대한 CIA의 작용을 조사하기 위하여, ASK1, HA-SAPKβ(Shimet al., Nature 381, 804-806, 1996) 또는 CIA를 발현하는 각각의 발현벡터를 포유동물 세포주인 293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 경과된 세포를 용해시켜 얻은 라이세이트를 상기 실시예 <4-1>과 동일한 방법으로 항-HA 항체를 사용하여 면역침강 반응을 수행하였다. 이로부터 얻은 면역침전물의 SAPKβ 활성을 측정하기 위하여 면역복합체 카이네이즈 분석을 수행하였다.

또한, JNK1의 발현에 미치는 CIA의 작용을 조사하기 위하여, pFR-Luc(Clonetech), pFA2-c-jun(Clonetech), pcDNA3-CIA, pcDNA3-ASK1 및 pcDNA3-β-gal(Invitrogen)을 발현하는 발현벡터를 포유동물 세포주인 293 세포에 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간 경과된 세포들을 용혈시킨 후 루시퍼레이즈 분석 키트(luciferase assay kit, Promega)를 사용하여 수용성 분획의 루시퍼레이즈 활성을 분석하였다. 형질감염 세포의 루시퍼레이즈 활성은 동일한 세포의 β-갈락토시데이즈(β-galactosidase)의 활성을 기준으로 하여 분석하였다.

그 결과, CIA의 이소성 발현(ectopic expression)은 ASK1의 효소활성 및 발현을 억제함으로써 ASK1의 하부지역에 존재하는 JNK1의 카이네이즈 활성도 억제하였다(도 7). 또한, 루시퍼레이즈 활성으로 측정한 c-Jun의 전사 효율도 ASK1에 의해 상당히 증가하였다가 CIA가 동시발현됨에 따라 억제되었다(도 8). 따라서, CIA는 ASK1의 활성억제를 통해 ASK1의 하부지역에 위치하는 신호조절 단백질들의 발현 및 카이네이즈 활성도 억제함을 알 수 있다.

<실시예 5> CAD-반응성 단백질로서의 CIA

인간 DFF40 단백질의 마우스 카운터파트인 캐스페이즈-활성 DNase(caspase-activated deoxyribonuclease, CAD)는 아폽토시스에 의해 유발되는 DNA 절편화에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 CAD와 결합할 수 있는 단백질을 분리하기 위하여, 마우스 CAD 유전자를 탐침으로 사용하는 효모 2-혼성 스크리닝 방법에 의해 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 인간 태아와 마우스 성체 뇌의 cDNA 라이브러리를 탐색하였다.

그 결과, 인간 태아 뇌의 cDNA 라이브러리로부터 얻은 형질전환체에서는 8 개의 양성클론이, 마우스 성체 뇌의 cDNA 라이브러리로부터 얻은 형질전환체에서는 9 개의 양성클론이 선별되었는데, 염기서열 분석 및 Gene Bank 분석결과 상기 클론들은 앞선 실시예에서 ASK1-반응성 단백질로서 분리된 CIA와 동일한 염기서열을 갖는 클론임이 확인되었다. 이러한 결과는 ASK1의 활성을 저해하는 억제제로서 작용하는 본 발명의 CIA가 DNA 절편화에 관여하는 CAD와도 물리적으로 반응하여 아폽토시스를 조절할 수 있음을 암시한다.

<실시예 6> CIA 단백질의 CAD 결합능 조사

본 발명자들은 CIA 단백질의 어느 위치가 CAD와 결합하는지를 조사하기 위하여, 다양한 CAD의 GST-융합 재조합 단백질들을 제조하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4에서 제조한 CIA의 야생형 및 이의 결실 돌연변이체, CIA-WT, CIA-△N, CIA-△C, 및 CIA-CEN 재조합 단백질을 글루타치온-아가로오스 비드 상에 고정시킨 후 in vitro 전사된[³⁵S]메싸이오닌-표지 CAD에 적용시켰다. 한편, 야생형 CAD 및 CAD의 결실 돌연변이체, 전장형태의 CAD-WT(1-345), N-말단이 결실된 CAD-△N(△1-83), N-말단쪽 절반부위만을 포함하는 CAD-NT(△162-345) 및 C-말단이 결실된 CAD-△C(△290-345)를 PCR을 사용하여 제조한 후 pLexA 벡터(Clontech)에 클로닝하였다. 상기 발현벡터가 형질전환된 대장균 형질전환체로부터 분리·정제한 CAD-WT, CAD-△N, CAD-NT 및 CAD-△C 재조합 단백질을³⁵S 방사성 동위원소로 표지한 후 GST-CIA가 고정된 글루타치온-아가로오스 비드에 적용시켰다. 각각의 글루타치온-아가로오스 비드에 결합한 단백질들을 용출한 후 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수행하여 분리하였다.

그 결과, 전장형태의 CIA-WT, C-말단이 결실된 CIA-△C 및 N-말단부위만을 포함하는 CIA-NT 재조합 단백질들은 물리적으로 in vitro 전사된³⁵S-표지 CAD와 결합하였지만, N-말단이 결실된 CIA-△N 및 양쪽 말단이 결실되어 중앙부위만을 포함하는 CIA-CEN 재조합 단백질은³⁵S-표지 CAD와 결합하지 못하였다(도 9). 반면, GST-융합 CIA 단백질들은 in vitro 전사된³⁵S-표지 CAD과는 결합하지 못하였다. 이러한 결과는 재조합 CIA 단백질들이 CAD와 직접적으로 결합할 수 있으며 CIA의N-말단 부위가 CAD와의 결합에 관여함을 암시한다.

일반적으로, 보존적 CIDE-N 도메인과 상동성을 갖는 CAD N-말단부위의 1번부터 83번까지의 아미노산 잔기는 ICAD와의 결합을 매개하고 C-말단부위의 290번부터 345번까지의 잔기는 CAD의 뉴클리아제 활성을 위해 요구된다고 알려져 있다. 이러한 사실은 CAD의 야생형 및 결실 돌연변이체 재조합 단백질을 이용한 결합분석 결과에서도 확인되었는데, GST-융합 CAD-WT, N-말단쪽 절반부위만을 포함하고 있는 CAD-NT 및 C-말단부위가 결실된 CAD-△C는 [³⁵S]메싸이오닌-표지 CIA 클론과 결합하였으나, N-말단이 결실된 CAD-△N은 결합하지 못하였다(도 9).

따라서, CIA는 CAD의 N-말단에 CIA의 N-말단이 특이적으로 결합함으로써 CAD의 활성을 억제함을 확인하였다.

<실시예 7> CIA의 CAD 활성 및 DNA 절편화 억제효과

<7-1> CIA의 in vitro CAD 뉴클리아제 활성 억제효과

CIA의 in vitro CAD 뉴클리아제 활성에 대한 억제효과를 확인하기 위하여, 대장균 BL21(DE3)로부터 분리·정제된 His-CAD/T7-ICAD 재조합 단백질을 사용하였다. 상기 재조합 단백질을 분리·정제하기 위하여, pET23b 벡터(Novagene)의 EcoRI/NotI 제한효소 부위에 ICAD를 클로닝한 후 다시 XbaI 제한효소 부위에 CAD를 클로닝하여 CAD의 N-말단에 His-표지와 ICAD의 C-말단에 T7-표지를 나타내는 유전자 컨스트럭트를 제조하였다. 상기 유전자 컨스트럭트를 대장균 BL21(DE-3)(Pharmacia)에 형질전환시킨 후 대장균 형질전환체를 1 mM IPTG의 존재하에서 3시간 동안 배양하여 상기 혼합 단백질의 발현을 유도하였다. 대장균 형질전환체로부터 생산된 재조합 단백질은 NiNTA 컬럼(Quiagen)을 이용하여 분리한 후 하기의 실험에 사용하였다.

상기와 같이 분리·정제된 His-CAD/T7-ICAD 재조합 단백질(1 ㎍)을 재조합 캐스페이즈-3(200 ng)가 첨가 또는 첨가되지 않은 각각의 뉴클리아제 완충용액(10 mM HEPES[pH 7.5], 1 mM EGTA, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 ㎎/㎖ bovine serum albumin)에 용해시킨 GST-융합 CIA 또는 그의 결실 돌연변이체 재조합 단백질(2 ㎍)과 함께 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 시료들을 2% 아가로오스 겔에 전기영동을 수행한 후 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였다.

그 결과, GST-CIA는 CAD 재조합 단백질의 뉴클리아제 활성을 억제하였으며 특히, CAD와 반응하여 CAD의 뉴클리아제 활성을 유도하는 캐스페이즈-3의 존재시에도 CAD 활성을 억제한 반면, GST-ICADL은 캐스페이즈-3의 존재시에도 CAD의 뉴클리아제 활성을 억제하지 못하였다. 또한, CIA의 야생형 및 결실 돌연변이체의 재조합 단백질을 이용한 in vitro 뉴클리아제 분석에서도 GST-CIA-WT 및 GST-CIA-△C는 CAD의 뉴클리아제 활성을 강하게 억제하였지만 GST-CIA-△N과 GST-CIA-CEN은 전혀 억제 효과를 나타내지 못하였다(도 10). 이러한 결과는 CIA가 자신의 N-말단을 통하여 CAD와 직접적으로 결합함으로써 CAD의 뉴클리아제 활성을 억제함을 암시한다.

<7-2> CIA의 DNA 절편화 억제효과

포유동물 세포주인 293 세포에서 CIA의 DNA 절편화 억제효과를 조사하기 위하여, HA-표지 CIA 클론 혹은 그의 결실 돌연변이체들을 293 세포에 캐스페이즈-3가 첨가 또는 첨가되지 않은 상태에서 CAD-Flag 또는 ICADL과 동시에 형질감염시켜 동시발현을 유도하였다. 상기의 형질감염 세포들을 48시간 동안 배양한 후 각각의 염색체 DNA를 추출하여 2% 아가로오스 겔 전기영동을 수행하여 에티디움 브로마이드로 염색하였다.

그 결과, HA-CIA가 동시에 형질감염되지 않은 세포에서의 CAD/ICADL 및 캐스페이즈-3의 과발현은 염색체 DNA의 뚜렷한 절편화를 유도한 반면, HA-CIA 클론이 형질감염되어 CIA가 동시발현된 세포에서는 CAD/ICADL 및 캐스페이즈-3에 의해 유도되는 DNA 절편화가 억제되었다(도 11). 또한, CIA의 결실 돌연변이체들을 각각 세포에 형질감염시켜 동시발현시킨 결과, CAD의 DNA 절편화 활성은 CAD와의 직접적인 결합에 관여하는 N-말단부위를 포함하고 있는 돌연변이체인 HA-CIA-△C 및 HA-CIA-CEN에 의해서 억제되었다(도 12).

따라서, CIA는 CIA의 N-말단을 이용하여 CAD에 직접적으로 결합함으로써 CAD의 뉴클리아제 활성 및 DNA 절편화 활성을 억제하는 CAD의 억제제이다.

<실시예 8> 293-CIA 세포에서의 아폽토시스 및 DNA 절편화 활성 감소

<8-1> CIA의 293 세포내 형질감염

상기 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 CIA가 n vitro에서 ASK1과 결합하는 CAD의 억제제로서 작용하여 아폽토시스 및 DNA 절편화 활성을 억제함을 확인하고, 이러한 CIA가 포유동물 세포내에서도 실제적으로 항-아폽토시스성 조절자(anti-apototic regulator)로서 작용할 수 있는지를 조사하기 위하여 CIA 클론을 포유동물 세포주인 293 세포에 형질감염시켰다.

구체적으로, 인간 배아 신장 세포 유래의 293 세포를 10% 열-비활성 태아 소 혈청(heat-inactivated fetal bovune serum) 및 100 U/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, Gibco BRL)이 포함된 DMEM(Dulbeco's modified Eagle's medium) 배지에 접종한 후 보습 배양기에서 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다. 상기 세포에 HA-CIA를 전기천공법(electrophoration)에 의해 형질감염시키기 위하여, 1 ×10⁷cells/plate 농도의 세포를 500 ㎕ HEPES 완충용액에 용해시킨 후 적당한 양의 HA-CIA DNA와 혼합하였다. 상기 혼합액에 제조사의 지침에 따라 Gene Pluser Ⅱ(BioRad Inc. USA)를 사용하여 전기충격을 가한 후 HA-CIA를 발현하는 세포를 G418과 함께 배양하여 선별하였다. 선별된 각각의 콜로니로부터 HA에 대한 단일클론 항체를 이용한 면역블럿 분석을 수행하여 HA-CIA의 발현을 조사하였다.

그 결과,도 12에 나타난 바와 같이, CIA의 내생적인 발현수준이 낮았던 293 세포에서 HA-표지 CIA가 안정적으로 발현되었다. 본 발명자들은 CIA 발현수준이 가장 높은 클론 #4와 CIA 발현수준이 가장 낮은 클론 #6을 선택하여 하기의 실험을수행하였다.

<8-2> 293-CIA 세포의 스트레스-유도성 아폽토시스에 대한 저항성 측정

293-CIA 세포내에서 다양한 스트레스에 의해서 유도되는 아폽토시스성 세포사멸에 CIA가 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여, 293 세포, 293-CIA#4 세포 및 293-CIA#6 세포에 10 ㎍/㎖ 싸이클로헥사마이드(cyclohexamide)가 첨가된 20 ng/㎖ TNF(TNF/CHX) 또는 1 μM 스타우로스포린(staurosporine, STS)을 처리하거나 80 J/m²의 자외선을 조사하여 아폽토시스를 유발하였다. 상기와 같이 처리된 세포들을 각각 12시간, 12시간, 또는 24시간 동안 배양한 후 70% 에탄올을 얼음 상태에서 처리하여 1시간 동안 고정하였다. 고정된 세포를 50 ㎍/㎖ 포피디움 아이오다이드(popidium iodide, PI)로 염색한 후 하이포플로이드(hypoploid) 세포분획을 FACS(FacsCalibur, Becton-Dickinson)로 분석하였다.

그 결과, CIA의 발현수준이 낮은 293 세포와 293-CIA#6 세포는 TNF/CHX, STS 및 자외선에 의해 아폽토시스가 자극되어 하이포플로이드 세포 분획이 대조군에 비하여 전체적으로 5배 내지 8배 정도 증가한 반면, 293-CIA#4 세포는 CIA의 발현으로 인하여 상기의 스트레스에 의해 유도되는 아폽토시스가 억제됨으로써 상대적으로 하이포플로이드 세포 분획이 감소하였다(도 13). 따라서, 본 발명의 CIA를 형질감염시킨 세포는 스트레스성 자극에 의해 유도되는 아폽토시스에 대하여 저항성을 갖게 됨을 확인하였다.

<8-3> 293-CIA 세포의 ASK1-매개성 아폽토시스에 대한 저항성 측정

상기 실시예 <4-3>에서 CIA가 ASK1의 카이네이즈 활성을 억제하여 ASK1-매개성 JNK/SAPK 경로를 불활성화시킴으로써 세포사멸과 DNA 절편화를 억제함을 확인하였다. 이에, 본 발명자들은 CIA가 실제적으로 세포내에서 ASK1에 의해 매개되는 아폽토시스를 억제하는지를 조사하기 위하여, 293 및 293-CIA#4 세포에 발현벡터 pcDNA3-Daxx(498-740)(성균관대학교 김성훈 박사로부터 제공받음), pCMV2-Flag-△MEKK1(미국 샌디에고 소재 캘리포니아주립대 Michael Karin 박사로부터 제공받음) 또는 pcDNA3-ASK1△N-Flag(PCR로 분리한 ASK1 절편을 pcDNA3-flag 벡터의 EcoRI/Xba I 제한효소 부위에 클로닝하여 제작)를 2 ㎍씩 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 48시간 동안 배양한 후 70% 에탄올로 얼음 상태에서 1시간 동안 고정하였다. 고정된 세포를 50 ㎍/㎖ PI로 염색한 후 하이포플로이드 세포분획을 FACS로 분석하였다.

그 결과, Daxx를 발현하는 발현벡터가 형질감염된 293 세포에서는 Daxx의 과발현에 의해 ASK1-매개성 아폽토시스가 활성화되어 하이포플로이드 세포분획이 증가한 반면, 293-CIA#4 세포에서는 동시발현된 CIA가 Daxx에 의해 활성화되는 JNK/SAPK 경로를 불활성화시킴으로써 아폽토시스가 억제되어 하이포플로이드 세포분획이 감소하였다(도 14). 이러한 결과는 CIA가 CAD-매개성 DNA 절편화 뿐 아니라 ASK1 및 이에 따르는 JNK/SAPK 활성을 저해함으로써 아폽토시스를 억제함을 암시한다.

본 발명의 신규한 마우스 CIA 단백질 및 이를 코딩하는 유전자는 아폽토시스의 음성 조절자(negative regulator)로서 CAD 및 ASK1에 선택적으로 결합하여 아폽토시스성 세포사멸 및 DNA 절편화를 억제하므로, CIA 단백질은 CAD 및 ASK1 단백질을 선택적으로 억제하거나 세포사멸 관련 과정이 관여하는 질병을 치료하는데 있어 유용하게 사용될 수 있으며 CAI 유전자는 상기 질병 등에 대한 유전자요법에 사용될 수 있다.

Claims

서열번호 3으로 기재되는 마우스 CIA(CAD inhibitor interacting with ASK1) 유전자, 그 상동형 유전자(homologs) 또는 그 변이형 유전자(variants).
서열번호 4로 기재되는 마우스 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질(variants).
제 2항에 있어서, 변이형 단백질은서열번호 4의 N-말단의 1번부터 79번 아미노산 잔기에 해당하는 부분과 C-말단의 174번부터 221번 아미노산 잔기에 해당하는 부분에서 부분적으로 적어도 90 % 이상의 상동성(homology)을 가지고, 전체적으로는 80 % 이상의 상동성을 가지는 것을 특징으로 하는 마우스 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질.
제 1항의 유전자 또는 제 2항의 단백질을 탐침으로 이용하여, CIA 단백질과 상호작용하는 핵산 또는 단백질; CIA 유전자의 유사체(analogs); 또는 CIA 단백질의 유사체를 탐색하는 방법.
제 1항의 마우스 CIA 유전자, 그 상동형 유전자 또는 그 변이형 유전자를 포함하는 유전자 콘스트럭트(gene construct)를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료제.
제 2항의 마우스 CIA 단백질 또는 그 변이형 단백질을 유효성분으로 포함하는 ASK1 및 CAD 활성 저해제.
제 2항의 단백질을 포함하는 세포사멸 관련 질병 치료제.
제 7항에 있어서, 세포사멸 관련 질병은 퇴행성 뇌신경계 질환, 뇌졸중, 암, 면역계 질환 또는 염증인 것을 특징으로 하는 세포사멸 관련 질병 치료제.