KR100740342B1 - Ｐｋｃ 델타의 ｈｓｐｂ1 결합부위를 포함하는 암 치료용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 암 치료용 조성물을 제공한다.

HSPB1, PKC

Description

ＰＫＣ 델타의 ＨＳＰＢ1 결합부위를 포함하는 암 치료용 조성물{A composition for the treatment of cancer comprising the HSPB1 binding site of PKC delta}

도 1은 다양한 형태의 PKCδ가 발현되는 세포에 산화적 스트레스를 제공한 경우의 세포사멸의 정도를 나타내는 도면이다.

도 2는 인체 폐암조직에서 HSPB1의 발현양을 정상조직과 비교하여 나타낸 면역 조직화학 사진이다.

도 3a는 H460 및 H1299 세포에서의 HSPB1 발현량을 나타내는 도면이다. 도 3a는 H460 및 H1299 세포를 배양한 후 전기영동 및 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 도면이다.

도 3b는 H460 및 H1299 세포에 10 Gy의 방사선을 조사하였을 때의 세포사멸을 나타낸 그래프이다.

도 3c는 H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA를 형질전화하였을 경우의 HSPB1의 발현량의 변화를 나타낸 도면이다.

도 3d는 H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA를 형질전환시키고, 방사선 또는 시스플라틴을 처리하였을 때의 세포사멸을 나타낸 그래프이다.

도 3e는 H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA를 형질전환시키고, 세포사멸을 나 타내는 대표적인 단백질인 카스파제3, 카스파제9 및 PARP의 발현정도를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 4a는 HSPB1의 발현량이 높은 H1299 세포와 HSPB1의 발현량이 낮은 H460 세포에서, HSPB1, PKC 델타, HSPB1와 PKC 델타의 복합체 및 PKC 델타의 활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.

도 4b는 HSPB1에 대한 siRNA를 발현하는 H1299 세포에 있어서 HSPB1, PKC 델타, HSPB1와 PKC 델타의 복합체의 발현량 및 PKC 델타의 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5a는 H1299 세포에 다양한 PKC 델타의 변이체를 발현시키는 경우, HSPB1과 PKC 델타의 복합체의 발현량 및 PKC 델타의 활성을 나타내는 도면이다.

도 5b는 다양한 PKC 델타의 변이체를 발현하는 H1299 세포 및 상기 세포에 방사선 (10Gy) 또는 시스플라틴 50μM을 처리한 48시간 후의 세포사멸의 정도를 프로피디움 이오다이드 염색에 의한 FACS 분석에 의하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5c는 다양한 PKC 델타의 변이체를 발현하는 H1299 세포에 방사선 또는 시스플라틴을 처리한 경우, 세포사멸을 나타내는 대표적인 단백질인 카스파제3, 카스파제9 및 PARP의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6a는 GST를 달고 있는 pcDNA3 (Invitrogen) 벡터에 HSPB1과 결합하는 PKC 델타의 V5 영역 (서열번호 6)을 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 얻어진 재조합 벡 터를 H1299 세포에 형질전환한 다음, PKC델타-V5의 발현 양상을 조사한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6b는 PKC 델타-V5를 포함하는 pcDNA3가 도입된 H1299 세포와 빈 pcDNA3가 도입된 H1299 세포에 방사선 (상단) 및 시스플라틴 (하단)을 처리하고, 시간에 따라 재료 및 방법에 나타낸 바와 같이 세포를 파쇄하고 면역침전을 수행하고, MBP를 기질로 하여 효소 반응을 수행한 다음, 오토라디오그래피를 수행한 결과를 나타낸다.

도 6c는 GST를 달고 있는 pcDNA3 (Invitrogen) 벡터에 HSPB1과 결합하는 PKC 델타의 V5 영역 (서열번호 6)을 코딩하는 유전자, CAT 및 CAT-KR를 코딩하는 유전자를 각각 클로닝하고, 얻어진 재조합 벡터를 H1299 세포에 형질전환한 다음, 시스플라틴 (상단) 또는 방사선 (하단)의 존재 또는 부존재하에서의 세포사멸의 정도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6d는 PKC 델타-V5를 포함하는 pcDNA3가 도입된 H1299 세포와 빈 pcDNA3가 도입된 H1299 세포에 방사선 (상단) 및 시스플라틴 (하단)을 처리하고, 48시간 후 재료 및 방법에 나타낸 바와 같이 세포를 파쇄하고 전기영동한 다음 웨스턴 블롯팅 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6e는 H460 세포, 및 각각 PKC 델타-CAT, PKC 델타-CAT-KR 및 PKC 델타-V5 를 과발현시킨 H1299 세포를 누드 생쥐의 대퇴부에 이식시킨 다음 방사선을 처리하였을 때의 암세포의 크기를 비교한 것을 나타내는 도면이다.

도 7a는 PKC 델타의 V5 영역의 부분 삭제 변이체를 나타내는 도면이다.

도 7b는 PKC 델타의 V5 영역의 부분 삭제 변이체를 코딩하는 유전자와 His 태그된 HSP25를 코딩하는 유전자 도입된 L929 세포를 배양하고, 배양된 세포를 파쇄하고 항-His 항체 및 단백질 G-세파로스를 이용하여 면역침전을 수행한 후, GFP에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행하거나 (좌측 상단), 배양된 세포를 파쇄하고 항-His 항체 및 단백질 G-세파로스를 이용하여 면역침전을 수행한 후, HSP25에 대하여 웨스턴 블롯팅 (좌측 중간)을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.

도 8은 비오틴으로 태그된 PKC 델타의 V5 영역의 아미노산 말단에 해당하는 12개의 펩티드와 카르복시 말단에 해당하는 7개의 펩티드를 제작하여 H1299 세포에 도입시켰다. 도 8a는 FITC가 붙은 스트렙타비딘으로 염색하여 형광현미경으로 세포내 도입 정도를 확인한 도면이다.

도 8b는 배양된 세포를 파쇄하고 항 PKC 델타 및 시토크롬 C 항체 및 단백질 G-세파로스를 이용하여 면역침전을 수행한 후, HSP27에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행하거나 (상단), PKC 델타 및 HSP27에 대해 웨스턴 블롯팅 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 8c는 H1299 세포에 위의 펩티드를 도입시킨 후, 방사선 또는 시스플라틴을 처리하였을 때의 세포사멸을 나타낸 그래프이다.

도 8d는 H1299 세포를 누드 생쥐의 대퇴부에 이식시킨 다음 방사선과 펩티드를 병용처리하였을 경우을 처리하였을 때의 암세포의 크기를 비교한 것을 나타내는 도면이다.

도 9a 및 9b는 각각 pcDNA4HisMaxC와 pcDNA3를 나타낸 도면이다.

본 발명은 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

항암제 및 방사선 치료의 문제점은 치료시 의도하지 않는 정상세포의 사멸과 암세포의 내성이다.　본 연구진을 포함한 여러 연구진의 연구결과에 의하면 정상세포의 사멸과 암세포의 항암제 및 방사선 내성의 주된 원인 중의 하나가 정상세포에 그 양이 매우 적으나 암세포에서 많이 발현이 되고 있는 열충격 단백질 (Heat shock protein) 때문인 것으로 나타났다 (3,4,5,6,7,8).　

정상세포 사멸을 방지하기 위해서는 보호제가 개발되고 있으며, 암세포의 내성을 줄이기 위해서는 민감제가 개발되고 있다.

항암치료의 민감제의 개발은, 주로 세포사멸 단계에 관여하는 생체 물질들(p53 암 억제 인자, Bcl-2 족, IAP 족, 스핑고지질 족, 세포신호전달체계 등)을 그 대상으로 하고 있다. 특히, 열충격 단백질(heat shock proteins, HSP)은, 고온, 중금속, 에탄올, 산소결핍 등 세포에 대한 각종 외부 스트레스에 대하여 직접적인 저항성을 나타낼 뿐만 아니라, 세포사멸에 관여하는 중요한 기작들을 직접 또는 간접적으로 저해하여 세포사멸에 대한 저항성을 높여 주는 것으로 최근 보고되었다. 그 중, 저분자량 열충격단백질인 HSPB1 (쥐에서는 Hspb1)은 시토크롬 씨 (cytochrome C), 닥스(DAXX) 및 섬유성 액틴(F-actin) 등과 결합하여 세포사멸을 억제하는 것으로 밝혀진 바 있다.

따라서, 암세포 특이적으로 열충격 단백질들을 무력화시켜 암세포의 치료에 대한 민감도를 증가시키려는 노력들이 그동안 많이 있었다. 특히, 분자량이 90,000인 열충격단백질 (HSP90)에 대한 저해제는 이미 임상 2상에 들어가 있고, 분자량이 70,000인 열충격단백질 HSPA (HSP70)에 대한 저해제 개발도 활발히 진행되고 있다. 그러나, 저분자량 열충격단백질 (예를 들면, HSPB1 (분자량 27kD) 등)에 대한 저해제는 가능성만 생각되어 왔을 뿐, 현재 개발되고 있는 민감제가 없는 실정이다.

이와 관련하여, 암의 방사선 치료시 나타나는 암세포의 내성에 대한 정확한 분자적 기작은 불분명한 것으로 알려져 있었으나, 본 연구진의 연구결과에 의하면, 방사선 또는 항암제 치료시 정상세포의 사멸과 암세포의 방사선 또는 항암제 내성의 주된 원인 중의 하나가 정상세포에 그 양이 매우 적으나 암세포에서 많이 발현이 되고 있는 저분자량 열충격 단백질 때문인 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구진은 암세포의 저분자량 열충격 단백질에 의한 방사선 내성 기작과 그 암세포의 방사선 내성을 정량적으로 평가하고, 차후에 이를 바탕으로 방사선 민감제를 개발할 필요성을 절실히 느끼게 되어 본 발명을 수행하게 되었다.　　　

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는, 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 서열번호 1 내지 6은 각각 생쥐 PKC 델타의 668 내지 674, 661 내지 674, 644 내지 674, 631 내지 674, 618 내지 674 및 606 내지 674를 나타내는 것으로, 606 내지 674 영역은 V5 영역이라고도 한다.

본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 조성물에 있어서, 항암제를 더 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물이다.

상기 항암제는 시스플라틴, 파클리탁셀, 빈플라스틴, 캄토테신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 1-D-아라비노푸라노실 시토신, 및 플라보피리돌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 암 예방 또는 치료용 조성물은, 단독 또는 다른 항암제와 병용하여 암을 가진 개체에 투여되어 암을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 암은 비소세포폐암, 유방암, 위암, 폐암, 직장암, 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 있어서, 상기 폴리펩티드의 투여량은 예방 또는 치료하고자 하는 암의 종류, 진행 단계 및 환자의 상태 등을 고려하여, 당업자가 적당하게 조절하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 0.0001mg 내지 10g, 바람직하게는 0.001mg 내지 1g, 더욱 바람직하게는 0.01mg 내지 0.1g이 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 임의의 제형으로 제제화될 수 있다. 예 를 들면, 주사제, 정제, 캅셀제, 및 산제 등으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 조성물은 당업계에 알려진 임의의 투여 방법에 의하여 개체 투여될 수 있다. 예를 들면, 구강, 경피, 피하 및 근육을 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용되는 상기 폴리펩티드는 단백질 키나제 C 델타 (이하 PKCδ라고도 한다)의 C 말단 단편이다. 상기 폴리펩티드는 열충격단백질 B1 (이하 HSPB1이라고도 한다)에 결합한다. 상기 결합은 HSPB1이 PKCδ에 결합하는 것을 경쟁적으로 저해하여, 세포 내의 HSPB1를 격리시킨다. 그에 따라 PKCδ에 의한 세포사멸 유도를 증가시켜, 암세포의 사멸시키는데 효과가 있다.

본 발명의 조성물은, 바람직하게는 PKCδ에 의한 세포사멸을 유도하는 방사선 또는 항암제와 병용하여 사용하도록 되어 있는 것이다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 세포 내의 HSPB1의 발현 수준이 높아 방사선 또는 항암제에 대하여 내성이 강한 암을 예방 또는 치료하는데 효과적이다.

본 발명자들은 인체 폐암조직은 정상조직에 비하여, HSPB1의 발현량이 높다는 것을 발견하였다. 또한, HSPB1의 발현량이 높은 폐암 세포 (예, NCI-H1299)가 낮은 폐암 세포 (예, NCI-H460)에 비하여 항암제 또는 방사선에 대한 내성이 높다는 것을 발견하였다.

또한, 본 발명자들은 암세포에서 HSPB1의 발현량이 증가함으로써 암세포가 방사성 또는 항암제에 대하여 내성을 가지는 기작을 밝히고자, HSPB1의 발현을 차 단한 결과 PKCδ와의 상호작용이 감소하는 것을 발견하였다. 더욱이, PKCδ에 있어서 HSPB1과의 결합 부위를 결실 변이체를 이용하여 밝혔으며, 상기 결합 부위는 서열번호의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 필수적으로 필요하다는 것을 발견하였다. 상기 결합 부위는 PKCδ의 C 말단에 위치한다.

HSPB1가 PKCδ에 결합하면, PKCδ에 의한 인산화 활성이 감소하여, PKCδ 경로에 의한 세포사멸의 유도가 감소하게 된다.

본 발명에서 사용되는 "저분자량 열충격단백질"이라 함은, 열충격이나 다른 자극에 의해 유도되는 저분자량 단백질로서, 열충격 같은 자극에 의해 단백질 구조에 이상이 생긴 다른 단백질에 결합하여 그 단백질을 안정화시키고 원래의 구조로 돌아가게 도와주거나 구조이상이 심한 단백질을 분해시키도록 도와주는 단백질을 말한다.

본 발명에서 사용되는 "HSPB1"은, 저분자량 열충격 단백질들 중에서 인간에서는 열충격 단백질27 (Heat shock protein 27: HSP27)을 의미하며, 쥐에서는 열충격 단백질25(Heat shock protein 25:HSP25)를 의미한다. 뒤에 붙은 숫자 27과 25는 분자량을 의미하는데, 종에 따라 그 분자량에는 차이가 있지만 기능과 유전자 구성으로 보았을 때 서로 같은 유전자이기 때문에 개념의 통일성을 위해 HSPB1과 HspB1로 표기하는 관례를 따른다.

본 발명에서 사용되는 "PKC"는 프로틴 키나아제 C (Protein Kinase C)를 의미하며, 고전적으로는 칼슘(Ca^{2 +}) 의존형 단백질 인산화 효소로 발견되었으나, 이후 에 새로운 타입(type)의 칼슘 비의존형 타입이 발견되었다. PKC는 외부 자극에 대한 세포의 사멸과 생존을 결정하는 신호 전달체계에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. "PKCδ"는 새로운 노블 타입(novel type)의 PKC로 칼슘 비의존형 인산화 효소이며, 주로 외부자극에 의한 세포의 사멸을 유도하는데 관여하는 것으로 보고되고 있다. 노블 타입의 PKC들의 아미노산 서열을 비교하여 보았을 때, 네 개의 보존되어 있는 부분 (conserved region C1, C2, C3 그리고 C4)과 변화가 있는 부분 (Variable region V1, V2, V3, V4 그리고 V5)으로 나눌 수 있는데, 이 때 "PKCδ V5"는 변화가 있는 부분인 V5 부분을 의미한다.

본 발명에서는 인체 폐암조직에서 정상조직에 비해 HSPB1의 발현량이 높음을 확인하였으며, 발현량이 높은 폐암세포 (NCI-H1299)가 발현량이 낮은 폐암세포(NCI-H460)에 비해 항암제 및 방사선에 대한 내성이 높음을 관찰하였다. 이러한 내성이 높은 HSPB1에 의한 것임을 확인하기 위하여 HSPB1의 단백질 발현을 차단하는 siRNA를 세포 내에 발현시켰을 경우, PKC 델타와의 결합력이 감소하여 PKC 델타 인산화 효소 활성은 증가함으로써 항암제 및 방사선에 대한 내성이 떨어짐을 관찰할 수 있었다. H1299 세포주에 HSPB1과 결합량이 높은 PKC 델타 활성부위 (CAT)를 발현시켰을 경우, 항암제 및 방사선에 대한 세포사멸이 증가함을 관찰하였다. 또한, HSPB1과 결합하기에 충분한 PKC 델타의 카복시 말단인 V5 영역을 세포 내에 발현시켰을 경우, HSPB1와의 결합이 감소되어 세포 내 PKC 델타 인산화 효소 활성을 회복시킴으로써 항암제 및 방사선에 대한 세포사멸이 증가함을 관찰하였다. 본 발 명은 HSPB1의 높은 발현량에 의한 항암제 및 방사선에 대한 내성을 HSPB1과 결합하기에 충분한 PKC 델타의 카르복시 말단인 V5 영역을 세포 내에 발현시킴으로써, 세포 내에 존재하는 PKC 델타 인산화 효소 활성을 증가시켜 항암제 또는 방사선의 치료 효과를 증진시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시에는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 방법 및 재료

이하의 실시예에서는 달리 언급이 없으면, 다음과 같은 실험 방법 및 재료를 사용하였다.

(1) 사용된 세포주

인간 비소세포성 폐암 (Non-Small-Cell Lung Cancer) 세포인, NCI-H460, NCI-H596 및 NCI-H1299 (ATCC CRL-5803) 세포주는 열처리한 10% 소 태아 혈청 (FBS, GIBCO)이 보충된 RPMI 1640 배지에 첨가하여 섭씨 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

(2) 유전자 재조합

쥐의 저분자량 열충격단백질인 Hspb1 유전자 (Genbank 등록번호 XM_124655)를, 아미노 말단에 His-tag을 달고 있는 벡터 pcDNA4HisMaxC (Invitrogen, V864- 20)에 통상의 방법으로 클로닝하였다. 쥐의 PKCδ 유전자 (Genbank 등록번호 AY545076)를 HA-tag 또는 GST를 달고 있는 벡터 pcDNA3 (Invitrogen, V790-20)에 통상의 방법으로 클로닝하였다. 도 9a 및 9b는 각각 pcDNA4HisMaxC와 pcDNA3를 나타낸 도면이다. GFP가 태킹된 단백질을 코딩하는 재조합 벡터는 부분 삭제 단백질에 해당되는 프라이머를 제작하여 PCR을 수행한 뒤 아미노 말단에 GFP-태그를 달고 있는 벡터 pcDNA3에 통상의 방법으로 클로닝하였다.

두 번의 연속된 PCR을 이용하여 부분 삭제 단백질을 세포 내에서 발현할 수 있도록 재조합 벡터를 제조하여 세포에 형질전환시켰다. 재조합에 사용되는 유전자는 야생형 PKCδ를 코딩하는 유전자의 우성-음성 유전자 (WT-KR) (2-674 (K376R), 야생형 PKCδ의 촉매부위 (CAT)(334-674), 야생형 PKCδ의조절부위 (REG) (2-333) 및 상기 야생형 PKCδ의 촉매부위 (CAT)의 우성-음성 유전자 (CAT-KR)(334-674 (K676R))이었다. siRNA는 Ambion # 16706에서 구입하여 사용하였다.

(3) 방사선 조사 및 항암제 처리

세포를 3.5cm, 6cm 및 10cm 배양 접시에 1x10⁴ cell/cm² 깔아서 37℃, CO₂ 배양기에서 70-80% 정도 자랄 때까지 키운 뒤 감마선 (¹³⁷Cs) (Atomic Energy of Canada, Ltd., Canada)을 3.81 Gy/min 선량률로 조사하였다. 달리 언급이 없으면, 총 10 Gy를 조사하였다. 또한, 항암제, 예를 들면 시스플라틴 처리는 NCI-H1299 세포가 70-80% 컨플루언시까지 성장하였을 때, 정해진 농도 예를 들면, 50μM 농도로 배지 중에 처리한 다음 48시간 후에 프로피디움 이오다이드 염색에 의한 FACS 분석 및 전기영동 및 면역반응 분석하였다. 세포사멸의 정도는 프로피디움 이오다이드 염색에 의한 FACS 분석을 통하여 측정하였다.

(4) 전기영동과 면역반응을 이용한 단백질 분석

시료 속의 단백질을 분석하기 위하여 우선 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)를 수행한 후, 웨스턴 블롯 (Western blot)을 수행하였다. 실험하고자 하는 세포들을 우선 용해용액 (120 mM NaCl, 40 mM Tris (pH 8.0), 0.1% NP40)에 현탁하여 세포들을 터뜨린 다음, 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE를 통해 분자량별로 분리한 다음, 단백질들을 니트로셀룰로스 멤브레인에 옮긴 다음 면역 블로팅을 이용하여 분석하였다.

(5) PKC 활성 측정

탈인산화효소 저해제 (1 mM NaF, 0.1 mM Na₃VO₄, 그리고 10 mM 베타-글리세로포스페이트)와 단백질분해효소 저해제 (10 ㎍/ml 아프로티닌, 10 ㎍/ml 류펩틴, 및 0.1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드)를 첨가한 PKC 추출 버퍼 (50mM HEPES (pH 7.5), 150mM NaCl, 0.1% Tween 20, 1mM EDTA, 2.5mM EGTA, 및 10% 글리세롤)에 세포를 넣어 으깬 다음, 많은 단백질 중에서 HA-tagged PKC 단백질을 3㎍ 항-HA 항체와 30㎕ 단백질 G-세파로스를 이용하여 4℃에서 3시간 동안 면역침전시켰다. 면역침전된 단백질을 PKC 추출 버퍼로 두 번 씻은 후, PKC 반응 버퍼 (50mM HEPES (pH7.5), 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 2.5mM EGTA, 1mM NaF, 0.1mM Na₃VO₄, 및 10mM 베타-글리세로포스페이트)에 현탁하였다. PKC의 인산화효소 활성 측정 반응은 그 반응 기질인 10㎍의 MBP (Upstate #13-104)와 5 μCi 의 [γ-³²P] ATP가 녹아 있는 40μl의 PKC 반응 버퍼를 첨가함으로써 시작하였다. 30℃에서 30분간 진행하였으며, 반응의 종료는 SDS 시료 버퍼를 넣고 5분간 끊임으로써 이루어졌다. 그 반응물은 SDS-PAGE를 거친 다음 오토라디오그래피를 통해 분석하였다. 기질인 재조합 GST-MARCKS 단백질은 대장균 BL21 (DE3)/LysS에서 만들어진 다음 글루타치온 S-세파로스 비드(Pharmacia)를 통해 순수하게 분리하였다.

(6) 동물 실험

NCI-H460 및 NCI-H1299 세포를 누드 생쥐의 대퇴부에 이식시킨 다음, 종양 크기가 120cm³ 내지 150cm³ 크기에 이르면 방사선을 조사하였다. 대조군과 방사선 병용처리군에 각각 3일 간격으로 종양의 부피를 측정하였다.

실시예 1: 세포자가사에 있어서 PKC δ의 기능의 확인

본 실시예에서는 세포자가사 경로에 있어서, PKCδ의 기능을 확인하였다. 이를 위하여 다양한 형태의 PKCδ를 코딩하는 변이 유전자를 제조하고, 이들을 세포에 형질도입하여 상기 다양한 형태의 PKCδ가 세포내에서 발현되도록 하였다. 다음으로, 상기 세포들에 산화적 스트레스를 가하고, 그로부터 발생하는 세포자가사의 정도를 측정하였다.

야생형 PKCδ를 코딩하는 유전자 (WT), 상기 야생형 PKCδ를 코딩하는 유전자의 우성-음성 유전자 (WT-KR) (2-674 K376R), 야생형 PKCδ의 촉매부위 (CAT)(334-674), 야생형 PKCδ의조절부위 (REG) (2-333) 및 상기 야생형 PKCδ의 촉매부위 (CAT)의 우성-음성 유전자 (CAT-KR)(334-674 K376R)를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 세포에 형질도입하였다. 상기 세포를 배지 중에서 배양한 다음, 과산화수소를 처리하였다 .

도 1은 다양한 형태의 PKCδ가 발현되는 세포에 산화적 스트레스를 제공한 경우의 세포사멸의 정도를 나타내는 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 야생형 PKCδ를 코딩하는 유전자의 우성-음성 유전자 (WT-KR)를 발현하는 세포에 산화적 스트레스를 가하면, 야생형 PKCδ를 발현하는 세포에 비하여 세포자가사가 감소하였다. 또한, PKCδ의 활성이 없는 WT-KR, CAT-KR, 및 REG 변이체를 발현하는 세포에 산화적 스트레스를 가하였을 경우, 세포자가사 비율은 대조군에 비하여 감소하였다. 이는 산화적 스트레스에 의한 세포자가사 경로에 있어서, 야생형 PKCδ가 세포자가사를 촉진하는 역할을 한다는 것을 나타낸다. 도 1에서, 대조군은 야생형 PKCδ를 코딩하는 유전자가 없는 빈 벡터만을 형질도입한 세포를 사용하였다.

도 2는 인체 폐암조직에서 HSPB1의 발현양을 정상조직과 비교하여 나타낸 면역 조직화학 사진이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, HSPB1은 정상조직에 비하여 폐암 조직에서 과발현되는 것을 알 수 있다.

실시예 2: HSPB1 이 암세포의 방사선 또는 항암제 내성에 미치는 영향의 확인

본 실시예에서는 HSPB1이 암세포의 방사선 또는 항암제 내성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, HSPB1의 발현량이 높은 H1299 세포와 발현량이 낮은 H460 세포에서의 방사선 또는 항암제에 의한 세포사멸의 정도를 확인하였다.

그 결과, HSPB1의 발현량이 높은 H1299 세포는 HSPB1의 발현량이 H460 세포에 비하여 세포사멸의 정도가 낮았다. 이는 HSPB1이 방사선 또는 항암제에 대한 내성을 부여한다는 것을 나타내는 것이다.

본 실시예에서는 또한, HSPB1이 방사선 또는 항암제에 대한 내성을 부여한다는 것을 추가적으로 확인하기 위하여, H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA (5'-GGCAGGACGAACAUGGCUAtt-3') (서열번호 7)를 형질전환시키고, HSPB1의 발현량 및 방사선 또는 항암제에 대한 내성을 확인하였다.

그 결과, HSPB1에 대한 siRNA를 발현시키는 경우, H1299 세포에서 HSPB1 발현량은 감소하였으며, 방사선 또는 시스플라틴에 대한 세포사멸의 내성이 감소하였으며, 세포사멸을 나타내는 대표적인 단백질인 카스파제 3, 카스파제 9 및 PARP의 활성화가 증가됨을 관찰할 수 있었다.

도 3a는 H460 및 H1299 세포에서의 HSPB1 발현량을 나타내는 도면이다. 도 3a는 H460 및 H1299 세포를 배양한 후 전기영동 및 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, H1299 세포에서 H460 세포에 비하여 HSPB1의 발현량이 높았다.

도 3b는 H460 및 H1299 세포에 10 Gy의 방사선을 조사하였을 때의 세포사멸을 나타낸 그래프이다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 세포사멸은 H1299에 비하여 H460 세포가 2배 이상 높았다.

도 3c는 H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA를 형질전화하였을 경우의 HSPB1의 발현량의 변화를 나타낸 도면이다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, H1299 세포에서 siRNA를 발현시킨 경우, HSPB1의 발현량은 현저하게 감소하였다. 도 3에서 siRNA 대조군은 벡터 Ambion #4850을 나타낸다.

도 3d는 H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA를 형질전환시키고, 방사선 또는 시스플라틴을 처리하였을 때의 세포사멸을 나타낸 그래프이다. 도 3d에 나타낸 바와 같이, H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA를 발현하는 세포는 그렇지 않은 세포에 비하여 방사선 또는 시스플라틴를 처리한 경우, 세포사멸의 정도가 현저하게 증가하였다.

도 3e는 H1299 세포에 HSPB1에 대한 siRNA를 형질전환시키고, 세포사멸을 나타내는 대표적인 단백질인 카스파제3, 카스파제9 및 PARP의 발현정도를 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3e는 H1299에 siRNA를 발현시키고, 방사선 또는 항암제를 처리하고, 48시간 후에 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 도면이다. 도 3e에 나타낸 바와 같이, 방사선 또는 시스플라틴 단독으로 처리한 경우에 비하여, 각각 HSPB1에 대한 siRNA를 동시에 처리하여 준 경우, 세포사멸을 나타내는 단백질의 발현이 현저하게 감소하였다.

실시예 3: HSPB1 의 발현량이 PKC 델타의 활성에 미치는 영향의 확인

본 실시예에서는 HSPB1의 발현량이 높은 H1299 세포와 HSPB1의 발현량이 낮은 H460 세포에서, HSPB1, PKC 델타, HSPB1와 PKC 델타의 복합체 및 PKC 델타의 활성을 조사하였다. 또한, HSPB1에 대한 siRNA를 발현하는 H1299 세포에 있어서 HSPB1, PKC 델타, HSPB1와 PKC 델타의 복합체 및 PKC 델타의 활성을 조사하였다.

도 4a는 HSPB1의 발현량이 높은 H1299 세포와 HSPB1의 발현량이 낮은 H460 세포에서, HSPB1, PKC 델타, HSPB1와 PKC 델타의 복합체 및 PKC 델타의 활성을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4a에 있어서, 위로부터 첫 번째 겔 사진은 세포 추출물을 전기영동한 후 HSP27에 대하여 면역침전 (이하 IP라고도 함)시킨 후, PKC 델타에 대하여 웨스턴 블롯팅 (이하 WB라고도 함)한 결과를 나타내는 도면이다. 따라서, HSP27과 PKC 델타의 복합체를 검출할 수 있다. 위로부터 두 번째 겔은 재료 및 방법의 (5)에서 기재한 바와 같이, H460 세포와 H1299 세포로부터 PKC 델타를 분리한 다음, MBP (myelin basic protein) (Upstate #13-104) 기질의 존재하에서 효소 반응을 수행한 후, PKC 델타에 대하여 면역침전 (IP)시킨 후, 오토라디오그래피를 수행한 결과를 나타내는 것이다. 위로부터 3번째 및 4번째는 겔은 각각 HSP27 및 PKC 델타에 대하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 것이다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, H1299 및 H460에 있어서, PKC 델타의 발현량은 유사하였으나 (위로부터 4번째 겔), HSP27의 발현량은 H1299 세포에서 더 높았다 (위로부터 3번째 겔). 또한, HSP27 및 PKC 델타의 복합체는 H1299 세포에서 H460 세포보다 더 많이 검출되었으나 (위로부터 첫 번째 겔), 인산화 활성은 H460 세포에서 H1299 세포보다 더 높게 검출되었다 (위로부터 2번째 겔). 이러한 실험 결과는, HSP27는 PKC 델타와 복합체를 형성하여 PKC 델타의 인산화 활성을 저해하는 것으로 해석된다.

도 4b는 HSPB1에 대한 siRNA를 발현하는 H1299 세포에 있어서 HSPB1, PKC 델타, HSPB1와 PKC 델타의 복합체의 발현량 및 PKC 델타의 활성을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 4b에 있어서, 위로부터 첫 번째 및 두 번째 겔은 각각 대조군 siRNA 및 HSP27 siRNA를 형질전환시킨 H1299 세포로부터 단백질을 추출하고, 전기 영동한 다음 각각 HSP27 및 PKC 델타에 대하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 도면이다. 또한, 위로부터 2번째 겔 사진은 세포 추출물을 전기영동한 후 HSP27에 대하여 면역침시킨 후, PKC 델타에 대하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 도면이다. 따라서, HSP27과 PKC 델타의 복합체를 검출할 수 있다. 위로부터 4번째 겔은 재료 및 방법의 (5)에서 기재한 바와 같이, 상기 H1299 세포로부터 PKC 델타를 분리한 다음, MBP (myelin basic protein) 기질의 존재하에서 효소 반응을 수행한 후, PKC 델타에 대하여 면역침전시킨 후, 오토라디오그래피를 수행한 결과를 나타내는 것이다.

도 4b에 나타낸 바와 같이, HSPB1에 대한 siRNA를 발현하는 H1299 세포에서는 그렇지 않은 세포에 비하여 HSPB1의 발현량이 감소하였으나 (위로부터 첫 번째 겔), PKC 델타의 발현량 (위로부터 2번째 겔)은 유사하였다. 또한, HSPB1과 PKC 델타의 복합체의 발현량은 HSPB1에 대한 siRNA를 발현하는 H1299 세포에서 그렇지 않은 세포에 비하여 감소하였으나 (위로부터 3번째 겔), PKC 델타의 활성은 HSPB1에 대한 siRNA를 발현하는 H1299 세포에서 더 높았다.

실시예 4: PKC 델타의 변이체가 HSPB1 와의 결합 및 세포사멸에 미치는 영향

본 실시예에서는 PKC 델타의 변이체를 제조한 다음 이들이 HSPB1과 결합하는지 여부 및 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였다.

먼저, 야생형 PKC 델타를 발현하는 유전자 (WT), PKC 델타의 인산화 효소 활성이 증가된 촉매 활성부위를 코딩하는 유전자 (CAT) 및 인산화 활성이 없는 변이 단백질 (CAT-KR)을 코딩하는 유전자를 각각 포함하는 재조합 벡터를 제조하였다. 제조된 각 벡터를 H1299 세포에 형질전환시킨 다음, 세포를 배양하고 세포 추출물로부터 PKC 델타를 분리하고 HSPB1와 PKC 델타의 복합체, HSPB1의 활성 및 세포 사멸의 정도를 분석하였다. 대조군으로는, 빈 벡터인 pcDNA3를 사용한 것으로 제외하고는 동일하게 실험하였다.

도 5a는 H1299 세포에 다양한 PKC 델타의 변이체를 발현시키는 경우, HSPB1과 PKC 델타의 복합체의 발현량 및 PKC 델타의 활성을 나타내는 도면이다. 도 5a에서, 위로부터 첫번째 겔은 각 세포를 파쇄한 다음, HA-태그된 PKC 델타를 항-HA 및 단백질 G-세파로스를 이용하여 면역침전시키고, HSP27에 대하여 웨스턴 블롯팅한 결과를 나타내는 것이다. 또한, 위로부터 두 번째 겔은 재료 및 방법의 (5)에 따라 PKC 델타의 활성을 측정한 결과이며, 3번째 및 4번째 겔은 각각 HA (hemmaglutinin) 및 β-액틴 (양성 대조군)에 대한 웨스턴 블롯팅 결과이다. 도 5a에 나타낸 바와 같이, PKC 델타의 인산화 효소 활성이 제일 높은 PKC 델타의 활성부위(CAT)가 HSPB1와의 결합 정도가 제일 높음을 확인하였다.

도 5b는 다양한 PKC 델타의 변이체를 발현하는 H1299 세포 및 상기 세포에 방사선 (10Gy) 또는 시스플라틴 50μM을 처리한 48시간 후의 세포사멸의 정도를 FACS 분석에 의하여 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5b에 나타낸 바와 같이, 시스플라틴 (상단) 또는 방사선 (하단)을 처리한 경우, 세포사멸의 정도는 야생형 H1299와 유사한 수준이었다. PKC 인산화 활성이 있는 WT, CAT이 대조군보다 시스플라틴 또는 방사선처리시 세포사멸이 증가하였으며, WT와 CAT의 세포사멸 정도가 비 슷하게 나온 것은 세포 내 유입된 효율 정도의 차이인 것으로 여겨진다.

도 5c는 다양한 PKC 델타의 변이체를 발현하는 H1299 세포에 방사선 또는 시스플라틴을 처리한 경우, 세포사멸을 나타내는 대표적인 단백질인 카스파제 3, 카스파제 9 및 PARP의 발현을 웨스턴 블롯팅을 통하여 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, 방사선 또는 시스플라틴을 처리하였을 경우, 세포사멸을 나타내는 대표적인 단백질인 카스파제3, 카스파제9 및 PARP의 발현이 증가하였다. 도 5c에서 좌측 4개 레인은 대조군으로서 방사선 또는 시스플라틴을 처리하지 않은 경우이고, 우측 4개 레인은 처리한 경우이다.

실시예 5: PKC 델타의 카복시 말단 아미노산 606-674 부분 ( V5 )이 HSPB1 와의 결합에 충분한지 여부의 확인

본 실시예에서는, PKC 델타의 카복시 말단 아미노산 606-674을 갖는 폴리펩티드 (V5 영역) (서열번호 6)가 PKC 델타와 HSPB1과의 결합에 충분한 것인지 여부 및 방사선 또는 항암제 내성에 미치는 영향을 조사하였다.

도 6a는 GST를 달고 있는 pcDNA3 (Invitrogen) 벡터에 HSPB1과 결합하는 PKC 델타의 V5 영역 (서열번호 6)을 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 얻어진 재조합 벡터를 H1299 세포에 형질전환한 다음, PKC델타-V5의 발현 양상을 조사한 결과를 나타내는 도면이다. 대조군으로는 빈 벡터가 도입된 H1299 세포를 사용하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, PKC델타-V5와 HSPB1의 결합이 대조군에 비하여 현저하게 증가하였음을 알 수 있다 (위로부터 첫번째 겔).

도 6b는 PKC 델타-V5를 포함하는 pcDNA3가 도입된 H1299 세포와 빈 pcDNA3가 도입된 H1299 세포에 방사선 (상단) 및 시스플라틴 (하단)을 처리하고, 시간에 따라 재료 및 방법에 나타낸 바와 같이 세포를 파쇄하고 면역침전을 수행하고, MBP를 기질로 하여 효소 반응을 수행한 다음, 오토라디오그래피를 수행한 결과를 나타낸다. 도 6b에 나타낸 바와 같이, 실험군 (V5로 표시)에 있어서의 인산화 활성은 대조군 (GST로 표시)의 인산화 활성보다 높았다.

도 6c는 GST를 달고 있는 pcDNA3 (Invitrogen) 벡터에 HSPB1과 결합하는 PKC 델타의 V5 영역 (서열번호 6)을 코딩하는 유전자, CAT 및 CAT-KR를 코딩하는 유전자를 각각 클로닝하고, 얻어진 재조합 벡터를 H1299 세포에 형질전환한 다음, 시스플라틴 (상단) 또는 방사선 (하단)의 존재 또는 부존재하에서의 세포사멸의 정도를 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 대조군으로는 빈 벡터가 도입된 H1299 세포를 사용하였다. 도 6c에 나타낸 바와 같이, PKC 델타-V5 또는 CAT를 세포 내에 발현시킴으로써, 시스플라틴 또는 방사선에 의한 세포사멸을 현저하게 증가시킬 수 있었다.

도 6d는 PKC 델타-V5를 포함하는 pcDNA3가 도입된 H1299 세포와 빈 pcDNA3가 도입된 H1299 세포에 방사선 (상단) 및 시스플라틴 (하단)을 처리하고, 48시간 후 재료 및 방법에 나타낸 바와 같이 세포를 파쇄하고 전기영동한 다음 웨스턴 블롯팅 분석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 6d에 나타낸 바와 같이, PKC 델타-V5를 세포 내에 발현시킴으로써, 방사선 (상단) 또는 시스플라틴 (하단)에 의한 세포사멸을 나타내는 PARP 및 카스파제3의 발현이 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다.

도 6b, 6c 및 6d의 결과로부터, 세포 내에서 PKC 델타-V5 또는 CAT가 발현됨에 따라 HSPB1과 결합하고, 그에 따라 PKC 델타와 결합하는 HSPB1의 양이 감소하여 PKC 델타의 인산화 활성이 증가하여, 세포사멸이 증가하는 것을 알 수 있다.

도 6e는 H460 세포, 및 각각 PKC 델타-CAT, PKC 델타-CAT-KR 및 PKC 델타-V5 를 과발현시킨 H1299 세포를 누드 생쥐의 대퇴부에 이식시킨 다음 방사선을 처리하였을 때의 암세포의 크기를 비교한 것을 나타내는 도면이다. 도 6e에 나타낸 바와 같이, PKC 델타-CAT와 PKC 델타-V5를 과발현시킴으로써 종양의 크기를 현저하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다. 특히, PKC 델타-V5를 과발현시킴으로써 방사선에 대하여 민감한 세포주인 H460 보다 더 빠른 속도로 종양의 성장을 저해할 수 있었다.

실시예 6: HSPB1 과 결합하는 PKC 델타의 필수적 영역의 확인

본 실시예에서는 PKC 델타의 V5 영역의 부분 삭제 변이체를 제조하고, 이들을 코딩하는 유전자 및 His 태그된 HSP25를 코딩하는 유전자 도입된 L929 세포를 배양하고, 배양된 세포를 파쇄하고 니켈-니트릴로아세트산-아가로즈 비드를 이용하여 면역침전을 수행한 후, GFP에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행하거나, 배양된 세포를 파쇄하고 항-His 항체 및 단백질 G-세파로스를 이용하여 면역침전을 수행한 후, HSP25에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.

도 7a는 PKC 델타의 V5 영역의 부분 삭제 변이체를 나타내는 도면이다. 상기 변이체는 PKC 델타의 V5 영역 (606 내지 674), 618 내지 674, 631 내지 674, 644 내지 674, 661 내지 674, 668 내지 674 영역이며, 이들은 각각 서열번호 6 내지 1 에 나타내었다. 상기 변이체를 코딩하는 유전자는 각각 GFP에 태깅되어 있으며, 이들을 포함하는 벡터를 각각 pV5-GFP, p618-GFP, p631-GFP, p644-GFP, p661-GFP 및 p658-GFP라고 한다.

도 7b는 PKC 델타의 V5 영역의 부분 삭제 변이체를 코딩하는 유전자와 His 태그된 HSP25를 코딩하는 유전자 도입된 L929 세포를 배양하고, 배양된 세포를 파쇄하고 니켈-니트릴로아세트산-아가로즈 비드를 이용하여 면역침전을 수행한 후, GFP에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행하거나 (좌측 상단), 배양된 세포를 파쇄하고 항-His 항체 및 단백질 G-세파로스를 이용하여 면역침전을 수행한 후, HSP25에 대하여 웨스턴 블롯팅 (좌측 중간)을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.

도 7b에 나타낸 바와 같이, HSPB1과 결합하는 PKC 델타의 최소 단위는 668 내지 674 영역인 것으로 밝혀졌다.

도 8은 비오틴으로 태그된 PKC 델타의 V5 영역의 아미노산 말단에 해당하는 12개의 펩티드와 카르복시 말단에 해당하는 7개의 펩티드를 제작하여 H1299 세포에 도입시켰다. 도 8a는 FITC가 붙은 스트렙타비딘으로 염색하여 형광현미경으로 세포내 도입 정도를 확인한 도면이다.

도 8b는 배양된 세포를 파쇄하고 항 PKC 델타 및 시토크롬 C 항체 및 단백질 G-세파로스를 이용하여 면역침전을 수행한 후, HSP27에 대하여 웨스턴 블롯팅을 수행하거나 (상단), PKC 델타 및 HSP27에 대해 웨스턴 블롯팅 분석한 결과를 나타내는 도면이다.

도 8c는 H1299 세포에 위의 펩티드를 도입시킨 후, 방사선 또는 시스플라틴 을 처리하였을 때의 세포사멸을 나타낸 그래프이다.

도 8d는 H1299 세포를 누드 생쥐의 대퇴부에 이식시킨 다음 방사선과 펩티드를 병용처리하였을 경우을 처리하였을 때의 암세포의 크기를 비교한 것을 나타내는 도면이다.

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본 발명에 따른 조성물에 의하면, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 방사선 또는 항암제와 병용하여 사용되는 경우, 암의 예방 또는 치료 효과를 상승적으로 증진시킬 수 있다.

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Claims (5)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 암 치료용 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 항암제를 더 포함하는 것인, 암 치료용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴, 파클리탁셀, 빈플라스틴, 캄토테신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 1-D-아라비노푸라노실 시토신, 및 플라보피리돌로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 암 치료용 조성물.
5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 비소세포폐암, 유방암, 위암, 폐암, 직장암, 및 전립선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 암 치료용 조성물.

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